JPH08296A - 核酸結合用粒子担体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 特定の制限酵素の切断末端をもつ核酸断片の
結合、回収あるいはＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を
容易に、かつ精度良く行うことができる特定の制限酵素
の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化
された粒子担体を提供すること。 【構成】 有機高分子を主成分とする粒子の表面に、特
定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオ
チドが固定化された核酸結合用粒子担体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、核酸結合用粒子担体に
関し、さらに詳しくは遺伝子工学、クローニング、ゲノ
ム核酸解析等の分野における特定の制限酵素切断末端を
もつ核酸断片の結合、回収あるいはＤＮＡ結合性蛋白質
の分離、抽出、特に生植物のゲノム核酸の解読に行われ
る制限酵素ランドマークの一次スクリーニングに有効な
粒子担体に関する。

【０００２】

【従来の技術】一本鎖オリゴヌクレオチドがプローブと
して固定化された水不溶性固相担体と、プローブと相補
的な塩基配列とを相補的な結合で結合させることによっ
て形成される特定の制限酵素の認識部位を有する担体を
用いて、標的核酸（またはその断片）を結合させ、特定
の塩基配列を抽出、分離する試みは以前から行われてき
た。従来の水不溶性固相担体にオリゴヌクレオチドを固
定化する技術としては、例えばオリゴヌクレオチドの末
端部位にアーム、スペーサー等の物質を介して水不溶性
固相担体の表面に存在する所望の官能基に結合する方
法、スペーサー等を介することなく、オリゴヌクレオチ
ドの末端塩基を化学的に修飾することによって水不溶性
固相担体の表面の官能基に結合する方法、オリゴヌクレ
オチドの末端塩基をそのまま水不溶性固相担体の表面の
官能基に結合する方法等を挙げることができる（特開昭
６１−１３０３０５号、特開昭６１−２４６２０１号、
特開昭６３−２７０００号、特開平１−１７１４９９
号、特開平３−１４７８００号、Ｃｅｌｌ ５，３０１
（１９７５）等）。しかしながら、いずれの場合におい
ても一本鎖オリゴヌクレオチドの末端を選択的に固相担
体表面に固定化する技術であり、二本鎖オリゴヌクレオ
チドの固定化には利用できない。また、一般に知られて
いる化学反応あるいはビオチン／アビジン反応のような
生化学的な反応も一本鎖オリゴヌクレオチドの固相表面
への固定化には利用することができるが、二本鎖オリゴ
ヌクレオチドの固定化には利用できない。従って、それ
らの反応により一本鎖オリゴヌクレオチドが固定化され
た担体は、ハイブリタイゼーション法を用いた特定の核
酸、プローブ核酸またはターゲット核酸の捕捉、検出等
への利用に限られていた。

【０００３】一方、一本鎖オリゴヌクレオチドを固定化
した固相担体を、特定の制限酵素によって処理した核酸
断片の回収、接続あるいはＤＮＡ結合蛋白質との結合に
用いる場合には、一本鎖オリゴヌクレオチドに相補鎖を
アニールし、前記特定の制限酵素の認識部位を形成させ
ることが必要である。そこで、例えば固定化された一本
鎖オリゴヌクレオチドを一旦、相補鎖過剰の条件でアニ
ーリングさせて固定化された二本鎖オリゴヌクレオチド
を形成し、さらにその末端に特定の制限酵素認識部位を
形成させた後、余分な相補鎖を除去することによって調
製される特定の制限酵素認識部位を末端にもつ二本鎖オ
リゴヌクレオチドが固定化された担体を、前記制限酵素
で切断されたＤＮＡ断片の分離、抽出に使用する方法が
挙げられる（特開平３−１４７８００号）。しかし上記
方法において固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドを
形成させるには過剰な相補鎖と長時間とを必要とし、ま
た固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドの結合が数十
ベース長の塩基による水素結合のみであるために、アニ
ーリングの効率の悪さによって満足に制限酵素認識部位
を末端に形成させられないという欠点がある。さらに、
得られる固定化された二本鎖オリゴヌクレオチドは、保
存安定性が悪く、二本鎖形成時の条件で保存しなければ
ならず、使用上および保存上、効率的であるとはいえな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、特定
の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離、抽出あるい
はＤＮＡ結合性蛋白質の分離、抽出を容易に、かつ精度
よく行うことができる特定の制限酵素の認識部位を有す
る二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒子担体を
提供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】前記課題は、有機高分子
を主成分とする粒子の表面に、特定の制限酵素の認識部
位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された核
酸結合用粒子担体であって、（１）該粒子は、表面にカ
ルボキシル基を有しており、かつ平均粒子径が０．１〜
１５μｍであり、（２）該二本鎖オリゴヌクレオチド
は、その塩基数が５〜８０であり、片方の末端が互いに
相補性がない塩基数１〜３０の一本鎖オリゴヌクレオチ
ドＡ１およびＡ２から構成され、さらに他方の末端が少
なくとも末端に特定酵素の認識部位を有する二本鎖オリ
ゴヌクレオチドＢから構成されており、（３）該二本鎖
オリゴヌクレオチドと該粒子とは、該二本鎖オリゴヌク
レオチドを構成する一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およ
びＡ２の塩基にそれぞれ少なくとも１つ存在するアミノ
基と該粒子表面に存在するカルボキシル基とのアミド結
合により固定化されている、ことを特徴とする核酸結合
用粒子担体、によって達成される。

【０００６】以下に本発明を詳細に説明する。これによ
り、本発明の目的、構成および効果がより明確になるで
あろう。本発明に用いる粒子は、有機高分子を主成分と
する水不溶性の粒子である。ここで主成分となる有機高
分子としては、例えばスチレン、クロルスチレン、クロ
ロメチルスチレン、α−メチルスチレン、ジビニルベン
ゼン、スチレンスルホン酸ナトリウム、（メタ）アクリ
ル酸、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸
エチル、（メタ）アクリル酸−ｎ−ブチル、（メタ）ア
クリル酸−２−ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸
ポリオキシエチレン、（メタ）アクリル酸グリシジル、
エチレングリコール−ジ−（メタ）アクリル酸エステ
ル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニル、トリブロ
モプロピルアクリレート、（メタ）アクリロニトリル、
（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、メチ
レンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプ
レン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ−ビニルピロリ
ドン、塩化ビニル、臭化ビニル等の芳香族ビニル化合
物、α，β−不飽和カルボン酸のエステル類もしくはア
ミド類、α，β−不飽和ニトリル化合物、ハロゲン化ビ
ニル化合物、共役ジエン化合物、ならびに低級脂肪酸ビ
ニルエステルからなるビニル系単量体の１種以上を重合
して得られる水不溶性の有機高分子を挙げることができ
る。さらに他の有機高分子としては、アガロース、デキ
ストラン、セルロース、カルボキシメチルセルロース等
の多糖類の架橋体やメチル化アルブミン、ゼラチン、コ
ラーゲン、カゼイン等の蛋白質の架橋体を挙げることが
できる。

【０００７】これらの粒子は、乳化重合、懸濁重合、溶
液沈澱重合等によって製造することができる。また、有
機高分子を非溶媒中に分散し架橋したり、または溶媒を
揮散させることなどによって該粒子を得ることができる
が、粒子の製造方法はこれらに限定されるものではな
い。

【０００８】なお、これらの粒子には必要に応じて粒子
の内部、または表面に有機染料、顔料、蛍光色素を含有
または被覆させてもよいし、無機物質からなる充填剤、
例えばマグネタイト、ヘマタイト、ニッケル等の金属あ
るいは金属化合物のような磁性もしくは超常磁性を有す
る物質を含浸させ、粒子を複合化させてもよい。

【０００９】以上のようにして得られる粒子の表面は、
非多孔質であることが望ましい。ここで、粒子の表面が
「非多孔質」であるとは、長径が０．０１μｍ以上であ
る孔を粒子の表面に有しないことを意味する。粒子の表
面が非多孔質でないと、すなわち、長径で０．０１μｍ
以上である孔が粒子の表面に存在すると、核酸の検出法
等で用いられる制限酵素切断末端をもつ核酸断片が粒子
の内部に捕捉される等の原因により感度や精度の問題を
生ずる場合がある。なお、このように、粒子の表面は非
多孔質であることが望ましいが、粒子の内部には独立気
泡等が存在してもよい。

【００１０】粒子の平均粒子径は、０．１〜１５μｍで
あり、好ましくは０．３〜５μｍである。平均粒子径が
０．１μｍ未満であると遠心分離等の簡便な操作で粒子
を回収しにくくなる。一方１５μｍを超えると粒子の単
位体積当たりの表面積が小さくなり、かつ核酸断片の分
離、抽出等において粒子が均一に分散しなくなるため
に、高い分離率、抽出率等を達成できない恐れがある。

【００１１】さらに、本発明において使用する粒子は、
後述するように一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ
２中の塩基のアミノ基とのアミド結合を形成させるため
に、その表面にアミド結合の形成に関与するカルボキシ
ル基を有する必要がある。従って、粒子がその表面にカ
ルボキシル基を有しない場合には、表面に予めカルボキ
シル基を導入する必要がある。カルボキシル基は粒子表
面積１ｎｍ²当たり少なくとも平均１個存在することが
好ましく、より好ましくは３個以上、さらに好ましくは
５個以上である。このようなカルボキシル基を表面に有
する前記有機高分子からなる粒子としては、例えばイム
テックスＳＳＭ−６０、ＳＳＭ−５８、ＳＳＭ−５７、
Ｇ０１０１、Ｇ０３０３、Ｇ０３０２、Ｇ０３０１、Ｇ
０２０１、Ｇ０２０２、Ｇ０５０１、Ｌ０１０１、Ｌ０
１０２、ＤＲＢ−Ｆ１、ＤＲＢ−Ｆ２、ＤＲＢ−Ｆ３等
の商品名（日本合成ゴム（株））で市販しているものが
挙げられる。前記の表面にカルボキシル基を有する粒子
は、酵素反応に支障なく使用でき、かつ１００℃までの
耐熱性を有するものである。また、カルボキシル基を有
しない粒子の表面にカルボキシル基を導入するには、従
来より知られている種々の方法を利用することができ
る。

【００１２】次に本発明に用いる二本鎖オリゴヌクレオ
チド（以下、「特定二本鎖オリゴヌクレオチド」とい
う。）について説明する。特定二本鎖オリゴヌクレオチ
ドは、片方の末端が互いに相補性がない塩基数１〜３０
の一本鎖オリゴヌクレチドＡ１およびＡ２から構成さ
れ、さらに他方の末端が少なくとも末端に特定の制限酵
素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢから
構成されており、その全塩基数は５〜８０塩基（一本鎖
当たり）であり、好ましくは１０〜５０塩基（一本鎖当
たり）である。ここで、全塩基数が５塩基未満であると
制限酵素の認識部位を形成することが困難となったり、
あるいは酵素反応が非効率的となり、８０塩基を超える
と特定二本鎖オリゴヌクレオチドの合成効率が低下し、
かつ特定の制限酵素切断末端をもつ核酸断片の分離が非
効率的となる。

【００１３】前記二本鎖オリゴヌクレオチドＢは、その
末端および必要に応じてその相補鎖中に同一もしくは異
なる種類の特定の制限酵素（例えばEcoR I、Not I、Sca
I等）の認識部位を一つ以上有し、該認識部位は特定の
制限酵素切断末端をもつ核酸断片とリガーゼ等の作用に
より結合する働きか、特定の制限酵素により切断される
働きをもつものである。ここで二本鎖オリゴヌクレオチ
ドＢの末端の制限酵素の認識部位は、塩基数の異なる接
着末端型であっても良いし、塩基数の揃った平滑末端型
であってもよい。なお、二本鎖オリゴヌクレオチドＢが
特定の制限酵素の認識部位を二つ以上有する場合、二本
鎖オリゴヌクレオチドＢが特定の制限酵素切断末端をも
つ核酸断片と結合した後、該結合部位とは別の部位の特
定の制限酵素で切り出し、クローニング等に直接用いる
ことが可能となる。

【００１４】前記一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１および
Ａ２は、その塩基数が１〜３０塩基であり、好ましくは
５〜１５塩基である。ここで、一本鎖オリゴヌクレオチ
ドＡ１およびＡ２の塩基数は、後述する粒子との固定化
反応の効率およびオリゴヌクレオチドの対象性を考慮す
ると、塩基数が近いことが好ましいが、必ずしも同じ塩
基数である必要はない。また、前記一本鎖オリゴヌクレ
オチドＡ１およびＡ２は、互いに相補性がなく、アニー
ル後も常に一本鎖状態を維持する。そこで前記一本鎖オ
リゴヌクレオチドＡ１およびＡ２は、互いの相補性を回
避するために一種類単独の塩基、例えばデオキシアデニ
ル酸（ｄＡ）、デオキシチジル酸（ｄＣ）またはデオキ
シグアニル酸（ｄＧ）のいずれかから構成されることが
好ましい。

【００１５】本発明に用いられる特定二本鎖オリゴヌク
レオチドは、塩基数１〜３０塩基の一本鎖オリゴヌクレ
オチドＡ１およびＡ２となり得る塩基配列と、アニール
後に特定の制限酵素の認識部位を形成する二本鎖オリゴ
ヌクレオチドＢとなり得る塩基配列とを有する全塩基数
５〜８０の一本鎖オリゴヌクレオチドを、通常のアニー
リング条件でアニールさせることにより容易に形成する
ことができる。アニール後の特定二本鎖オリゴヌクレオ
チドは、二本鎖オリゴヌクレオチドＢの塩基配列中に存
在するアミノ基がアニーリングにより水素結合で束縛さ
れ、一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基中
にあるアミノ基のみがフリーな状態となるため、一本鎖
オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２が特異的に粒子表面
に固定化される。従って、前記特定二本鎖オリゴヌクレ
オチドを用いれば一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１および
Ａ２の特定部位を特別な化学的修飾をすることなく、特
異的に、かつ高い効率で粒子表面に固定化することがで
きる。なお、上記アニーリングにより得られた特定二本
鎖オリゴヌクレオチドは、市販されているハイドロキシ
アパタイトカラムを通し、未反応の特定一本鎖オリゴヌ
クレオチドを除去することにより精製することができ
る。

【００１６】特定二本鎖オリゴヌクレオチドを粒子に固
定化させるためには、操作の簡便さ、固定化効率の高さ
および精度を考慮すると、粒子表面のカルボキシル基と
一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２中の塩基のア
ミノ基とをアミド結合によって固定化させることが必要
である。

【００１７】上記固定化のための反応は、例えば適当な
大きさの反応容器に、表面にカルボキシル基を有する粒
子と前記特定二本鎖オリゴヌクレオチドとを仕込んだ
後、脱水縮合剤を添加することにより行う。ここで脱水
縮合剤としては、例えば１−エチル−３−（Ｎ，Ｎ’−
ジメチルアミノ）プロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル
−５−フェニルイソキサゾリウム−３’−スルホネー
ト、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−
ジヒドロキノリン等の水溶性の脱水縮合剤が好ましいも
のとして挙げられるが、油溶性の脱水縮合剤も使用する
ことができる。これらの脱水縮合剤は、使用する粒子が
表面に有するカルボキシル基１グラム当量に対して、通
常、１〜２０モル、好ましくは２〜１０モル使用する。
粒子の使用量は、特定二本鎖オリゴヌクレオチド１ミリ
モル当たり、通常、０．５〜５００ｇ、好ましくは５〜
５０ｇである。上記反応は、通常、ｐＨ３〜１１程度の
水溶性媒体中、例えば水中、４〜７０℃において、５分
ないし一夜行えばよい。上述のようにして得られる本発
明の担体を用いて目的の特定の制限酵素の認識部位をも
つ核酸断片と結合反応するとき、粒子担体は通常、水溶
性媒体に分散させた状態で用いられる。この際の分散液
の濃度は、通常、０．０５〜２５重量％であり、より好
ましくは０．１〜１５重量％である。粒子濃度が０．０
５重量％未満であると、特定の制限酵素の認識部位をも
つ核酸断片と効率的に結合することができず、２５重量
％を超えると制限酵素が粒子表面に付着して有効に働か
ない。

【００１８】

【実施例】以下に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明
するが、本発明はこれらの実施例に制限されるものでは
ない。 実施例 （１）一本鎖オリゴヌクレオチドの合成および精製 ＤＮＡ合成装置（アプライド バイオシステム社モデル
ＡＢＩ３８１Ａ型）を用いてβ−シアノエチルホスホア
ミド法で、下記に示す塩基配列を有する一本鎖オリゴヌ
クレオチドＸ（＋）およびＸ（−）を合成した。なお、
下記塩基配列はアニールさせて得られる特定二本鎖オリ
ゴヌクレオチドが、片方の末端がその末端にＮｏｔＩの
認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢと塩基数
が１０塩基の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２
とから構成されるように設計した。 配列Ｘ（＋）；5'GGC CGC CTT TAG TGA GGG TTA ATG TCG ACA CCC CCC CCCC 3' 配列Ｘ（−）；3' CG GAA ATC ACT CCC AAT TAC AGC TGT CCC CCC CCCC 5' ここで、（＋）および（−）はそれぞれＤＮＡの＋鎖お
よび−鎖を、５’および３’は５’末端および３’末端
を表す。合成した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）お
よびＸ（−）をそれぞれ濃水酸化アンモニウム１０ｍｌ
で前記装置のカラムから切り出し、５５℃で一夜放置し
た後、真空乾燥した。次いで高速液体クロマトグラフィ
ーで溶出液として１５重量％アセトニトリル溶液を用
い、Ｃ１８逆相カラムにより精製した。精製した一本鎖
オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）を１８重量
％ポリアクリルアミドゲル中に電気泳動させ、該一本鎖
オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）が精製され
ていることを確認した。得られた一本鎖オリゴヌクレオ
チドＸ（＋）およびＸ（−）の溶出液から、エタノール
で沈澱させることにより一本鎖オリゴヌクレオチドＸ
（＋）およびＸ（−）をさらにを濃縮・精製した。次
に、濃縮・精製した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）
およびＸ（−）をそれぞれ５００μｌの滅菌水に溶解し
た後、２６０ｎｍにおける吸光度を測定して定量したと
ころ、約５ｍｇの一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）お
よびＸ（−）が得られた。

【００１９】（２）一本鎖オリゴヌクレオチドの末端リ
ン酸化処理 （１）で合成した一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）を
８８μｌ（３ｍｇ）また、一本鎖オリゴヌクレオチドＸ
（−）を９１μｌ（３ｍｇ）取り、それぞれにポリヌク
レオチドキナーゼ（東洋紡社製）５００ユニットおよび
アデノシン−５’三リン酸２ｎｍｏｌを混合し、１０倍
プロトレーディンエンドキナーゼ緩衝液（東洋紡社製）
５０μｌを加えてから滅菌蒸留水で５００μｌに調整し
た。これらを３７℃のウォーターバス中で２時間反応さ
せた後、９５℃で３分間放置し、エタノールを用いて沈
澱、精製した。続いて、精製した末端リン酸化処理され
た一本鎖オリゴヌクレオチドＸ（＋）およびＸ（−）各
１ｍｇをＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液（ｐ
Ｈ８）および１ｍＭエチレンジアミン四酢酸からなる緩
衝液）５００μｌに溶解した。

【００２０】（３）特定二本鎖オリゴヌクレオチドの形
成 （２）で得られた末端リン酸化処理した一本鎖オリゴヌ
クレオチドＸ（＋）およびＸ（−）をそれぞれ６ｎｍｏ
ｌ採取し、２ｍｌのエッペンドルフチューブに入れ、１
０倍アニーリング溶液（１００ｍＭトリス塩酸塩緩衝液
（ｐＨ８）、６０ｍＭ塩化マグネシウム、６０ｍＭβ−
メルカプトエタノールおよび５００ｍＭ塩化ナトリウム
からなる緩衝液）を１０μｌ加え、滅菌蒸留水で１００
ｍｌに調整した。これを８０℃のウォーターバスにて１
０分間加温し、その後室温になるまで静置した（所要時
間４時間）。この反応により、片方の末端が塩基数がそ
れぞれ１０塩基である二本の一本鎖オリゴヌクレオチド
Ａ１およびＡ２と、他方の末端がその末端に制限酵素Ｎ
ｏｔＩの認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢ
とから構成される特定二本鎖オリゴヌクレオチドが得ら
れた。得られた特定二本鎖オリゴヌクレオチドをハイド
ロキシアパタイトカラム（バイオゲルＨＰＨＴカラム、
バイオラッド社製）を用いて０．６モルリン酸緩衝液を
溶出液として精製を行った。精製後の特定二本鎖オリゴ
ヌクレオチドを回収し、ブタノールで濃縮し、脱塩した
ところ、その収量は精製前の９１％であった。

【００２１】（４）特定二本鎖オリゴヌクレオチドの粒
子への固定化 平均粒子径が１．０μｍ、平均粒子径の標準偏差が５
％、かつ粒子表面積１ｎｍ²当たり平均５個のカルボキ
シル基を有するポリスチレン粒子イムノテックスＬ０１
０１（日本合成ゴム（株）製）の１０（Ｗ／Ｖ）％０．
１ｍＮ塩酸懸濁液を１０００μｌ、（３）で得られた特
定二本鎖オリゴヌクレオチド４ｎｍｏｌおよび１−エチ
ル−３−（Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノ）プロピルカルボ
ジイミドの０．５（Ｗ／Ｖ）％０．１ｍＮ塩酸溶液５０
０μｌをエッペンドルフ遠心管に入れ、１０℃に設定し
た恒温槽中で一晩混合することにより特定二本鎖オリゴ
ヌクレオチド中の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１および
Ａ２のｄｃの塩基配列中のアミノ基と粒子表面のカルボ
キシル基とをアミド結合させた。その後、１０，０００
ｒｐｍで２分間遠心分離して特定二本鎖オリゴヌクレオ
チドが固定化された粒子を沈澱として回収した。次に結
合用緩衝液（１０ｍＭトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ８、５
００ｍＭ 塩化ナトリウム、０．１（Ｗ／ｖ）％ドデシ
ル硫酸ナトリウムおよび１ｍＭ エチレンジアミン四酢
酸からなる緩衝液）をオリゴヌクレオチド固定化粒子に
１ｍｌ添加し再分散させた後、１０，０００ｒｐｍで３
分間遠心分離し、特定二本鎖オリゴヌクレオチドが固定
化された粒子を回収した。この操作を３回繰り返して最
終的に特定二本鎖オリゴヌクレオチドが固定化された粒
子をＴＥ緩衝液１ｍｌ（固形分１０（Ｗ／Ｖ）％）に分
散した（以下、「分散液ａ」という。）。

【００２２】（５）ＮｏｔＩ末端をもつ核酸断片の調整 プラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）（ｐＢＳII 東洋
紡社製）７５μｇ（約３８ｐＭ）、ＮｏｔＩ（１０ユニ
ット／μｌ）２００ユニット、１０倍ＨＢ緩衝液４０μ
ｌ（いずれもタカラ社製）および滅菌蒸留水２９４μｌ
を混合し、３７℃にて３時間反応させた。反応終了後、
反応混合液と等量のＰ．Ｃ．Ｉ（フェノール：クロロホ
ルム：イソアミノアルコール＝２５：２４：１（容量
比））溶液を加えて充分に混和し、１５，０００ｒｐｍ
にて１０分間遠心分離した後、上部の水層を回収した。
回収した水層に８Ｍアンモニウムアセテート１００μｌ
を加えて充分に混合をし、次いで１５，０００ｒｐｍに
て５分間遠心分離し、得られたＮｏｔＩで消化したプラ
スミドBluescriptII ＳＫ（＋）をＴＥ緩衝液２０μｌ
に分散させた。

【００２３】（６）³²Ｐによる標識 （５）で調整したＮｏｔＩで消化したプラスミドBluesc
riptII ＳＫ（＋）のＴＥ緩衝液にアルカリフォスフォ
ターゼ（タカラ社製）約２μｌ（酵素活性にして４０ユ
ニット）、１０倍アルカリフォスフォターゼ用緩衝液２
μｌおよび滅菌蒸留水１６μｌを加えて３７℃で２時間
反応させた後、６５℃で３０分間加熱した。この溶液に
エタノール５０μｌを加え、−８０℃にて１０分間静置
した後、１５，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得ら
れた沈澱をＴＥ緩衝液２０μｌに溶解した。この溶液に
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリンガーハイム社
製）１μｌ（酵素活性にして８ユニット）、γ−³²Ｐア
デノシン三リン酸５μｌ（放射線量にして５０μＣ
ｉ）、１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液５μｌおよ
び滅菌水１９μｌを加えて混合し、３７℃で３０分間イ
ンキュベートした。次に反応液からＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼをフェノール抽出法（”Molecular Clonin
g”，Cold Spring Harbor Laboratories,1982,458）に
よって除去した後、反応液をＴＥ緩衝液で膨潤させたセ
ファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）カラム（１
ｍｌ）を用いるゲル濾過に供した。なお、上記で用いた
１０倍濃度の５’−リン酸化用緩衝液は次の組成を有す
るものである。 組成；０．５Ｍトリス塩酸塩緩衝液、ｐＨ７．６ ０．１Ｍ塩化マグネシウム ５０ｍＭジチオスレイトール １ｍＭスペルミジン １ｍＭエチレンジアミン四酢酸 ゲル濾過による溶出液を１００μｌずつ順に分取し、各
画分の放射線量をチェレンコフカウント法によって測定
して素通り画分を判別し集めた。この結果、³²Ｐによっ
て標識したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）のＮｏ
ｔＩ消化物のＴＥ緩衝液（以下、「ＴＥ緩衝液Ｉ」とい
う。）２０μｌが得られた。

【００２４】（７）ＳｃａＩによる消化 （６）で得られたＴＥ緩衝液ＩにＳｃａＩ（１００／μ
ｌ、タカラ社製）および１０倍ＨＢ緩衝液４０μｌを加
え、滅菌水で４００μｌに調製してから３７℃で３時間
反応させた。反応終了後、等量のＰ．Ｃ．Ｉ溶液を加え
て充分に混合し、次いで１５，０００ｒｐｍで１０分間
遠心分離して上部の水層を回収した。回収した水層に８
Ｍアンモニアアセテート１００μｌおよびエタノール８
００μｌを加えて充分に混合してから１５，０００ｒｐ
ｍで５分間遠心分離し、ＳｃａＩで消化したプラスミド
BluescriptII ＳＫ（＋）の断片を１００μｌのＴＥ緩
衝液に溶解させた。（６）と同様にしてチェレンコフ−
カウント法によって放射線量を測定したところ、１μｌ
当たり４０，０００ｒｐｍのカウントの放射線量を有す
る溶液であった。また、プラスミドBluescriptII ＳＫ
（＋）の断片の濃度は０．３０ｐｍｏｌ／μｌ、Ｎｏｔ
Ｉ末端サイトは０．６ｐｍｏｌｅ／μｌであった。

【００２５】（８）ＮｏｔＩで消化したプラスミドBlue
scriptII ＳＫ（＋）の断片の捕獲および分離の評価 （４）で得られた分散液ａを１０μｌずつＡ−１〜Ａ−
４までの４本の遠心管に入れた。次いで（７）で調製し
たＮｏｔＩおよびＳｃａＩで消化したプラスミドBluesc
riptII ＳＫ（＋）の断片をそれぞれ１、２、４、６ｐ
ｍｏｌとなるようにＡ−１〜Ａ−４まで４本の遠心管に
加えた。これら４本の遠心管にそれぞれ１０倍のライゲ
ーション緩衝液（６６０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８）、６６ｍＭ塩化マグネシウムおよび１００ｍＭのＤ
ＴＴからなる緩衝液）５μｌ、５０ｍＭ ５’−アデノ
シン三リン酸５μｌ、５０％ポリエチレングリコール５
μｌおよび３Ｍ塩化ナトリウム５μｌを加えた。そし
て、各遠心管にさらにＴ４ＤＮＡリガーゼ（タカラ社
製、３５０ユニット／μｌ）５μｌを加えた後、滅菌蒸
留水を加えて５０μｌに調製し、１７℃にて１２時間反
応させた。反応終了後、４本の遠心管のチェレンコフカ
ウントを測定し、それぞれを各遠心管のトータルカウン
トとした。また、上記反応終了後、４本の遠心管にＭＢ
緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５）、
０．０１％ゼラチン、１００ｍＭ塩化ナトリウムおよび
１０ｍＭ塩化マグネシウムからなる緩衝液）１０００μ
ｌずつを加え、反応を停止させた。次いで４本の遠心管
を１０，０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、上清を除去
した後、ＴＥ緩衝液５０μｌに分散してチェレンコフカ
ウントを測定し、それぞれを各遠心管のカウント２とし
た。次いで、４本の遠心管にＮｏｔＩ（１００ユニット
／μｌ）４０ユニットおよび１０倍ＨＢ緩衝液（タカラ
社製）１０μｌを加え、滅菌蒸留水で１００μｌに調製
し、３７℃で３時間反応させた。続いて１０，０００ｒ
ｐｍで５分間遠心洗浄し、沈澱物をＴＥ緩衝液／０．２
５Ｍ塩化ナトリウム溶液で３回遠心洗浄した後、ＴＥ緩
衝液で５０μｌに再分散したもののチェレンコフカウン
トを測定し、これらをカウント３とした。ＮｏｔＩで消
化したプラスミドBluescriptII ＳＫ（＋）の捕獲率お
よび回収率を次式により算出し、表１に示した。

【００２６】

【数１】

【００２７】

【数２】

【００２８】

【表１】

【００２９】

【本発明の効果】本発明によれば特定の制限酵素切断末
端をもつ核酸断片の結合、回収あるいはＤＮＡ結合性蛋
白質の分離、抽出を容易に、かつ精度良く行うことがで
きる特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌ
クレオチドが固定化された粒子担体が得られる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有機高分子を主成分とする粒子の表面に、
   特定の制限酵素の認識部位を有する二本鎖オリゴヌクレ
   オチドが固定化された核酸結合用粒子担体であって、
   （１）該粒子は、表面にカルボキシル基を有しており、
   かつ平均粒子径が０．１〜１５μｍであり、（２）該二
   本鎖オリゴヌクレオチドは、その全塩基数が５〜８０で
   あり、片方の末端が互いに相補性がない塩基数１〜３０
   の一本鎖オリゴヌクレオチドＡ１およびＡ２から構成さ
   れ、さらに他方の末端が少なくとも末端に特定酵素の認
   識部位を有する二本鎖オリゴヌクレオチドＢから構成さ
   れており、（３）該二本鎖オリゴヌクレオチドと該粒子
   とは、該二本鎖オリゴヌクレオチドを構成する一本鎖オ
   リゴヌクレオチドＡ１およびＡ２の塩基にそれぞれ少な
   くとも１つ存在するアミノ基と該粒子表面に存在するカ
   ルボキシル基とのアミド結合により固定化されている、
   ことを特徴とする核酸結合用粒子担体。