JPH0827021A - 医薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 血管系疾患に適用される新規な医薬組成物。 【構成】 ミッドカインファミリーに属するポリペプチ
ドあるいはその断片ペプチド等を有効成分とする。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規な、血管病変、血管
系疾患などに対する医薬、診断薬に関するものである。
更に詳しくいえば、狭心症、心筋梗塞、脳硬塞、血栓、
血管狭窄、血流不全、血小板異常症、播種性血管内凝固
症候群、深部静脈血栓症、肺塞栓症、動脈硬化症、経皮
的冠動脈再建術（ＰＴＣＡ）後の冠動脈再潅流後におこ
る血管再狭窄・再閉塞、再梗塞などに対する予防・治療
剤として期待されるミッドカイン（Ｍｉｄｋｉｎｅ，Ｍ
Ｋ）ポリペプチドあるいはその断片ペプチド、又はそれ
らと同様の生理活性を有するそれらの類似体を有効成分
として含む医薬組成物に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】狭心症また急性心筋梗塞などにおける冠
動脈血栓に対して、今日ウロキナーゼ（以下ｕ−ＰＡ）
や組織プラスミノーゲンアクチベーター（以下、ｔ−Ｐ
Ａ）などによる血栓溶解の薬物療法ならびにＰＴＣＡが
施行されている。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】急性心筋梗塞の発症
後、可能な限り早い時期にｔ−ＰＡなどを患者に投与し
て、血栓溶解を行い、梗塞巣の広がりを抑えることによ
り心筋の壊死を防護することができるが、血栓を溶解す
るという主たる目的は達成するものの、同時に脳や心臓
等の血管からの出血傾向も惹起される。特に、高齢者や
血圧の高い患者または糖尿病や腎障害をわずらう患者へ
のｔ−ＰＡ等の投与は慎重を要する。

【０００４】またｔ−ＰＡ治療の有効率は７０〜８０％
と言われ、なお２０〜３０％の有効率の向上が期待され
ており、たとえば血小板過多の患者等における、ｔ−Ｐ
Ａ単独では効果の出にくい症例においては、抗凝固剤や
抗血栓剤の併用投与が試みられている。

【０００５】このような血液成分の異常、さらにまた血
管における、たとえば各組織部位細胞における血液凝固
−線維素溶解系カスケードに属する各タンパク質の相互
作用による調節機構が異変をおこすことにより生ずる血
管病変、血管疾患のより効果的な予防・治療のために
は、これら調節機構のより深い理解が必須である。

【０００６】またｔ−ＰＡ治療の有効率の向上、あるい
はＰＴＣＡ後に発生する、冠動脈再潅流障害である血管
の各種傷害による、血管再狭窄・再閉塞、再梗塞など、
ヘパリン投与によっては抑制できない晩発障害さらに慢
性的な動脈硬化症などの有効な治療のためには、それ自
身単独で、血栓溶解作用がある、新たなタンパク質また
は合成医薬の開発、あるいは生体内におけるｔ−ＰＡお
よびｕ−ＰＡの生合成を内因的に高めるタンパク質また
は合成医薬の開発が望まれる。さらにそれらタンパク質
や合成医薬が開発された際には、ｔ−ＰＡ等と併用する
ことが考えられる。

【０００７】このような考察のもとに、本発明者らは生
体由来のタンパク質の中に、血液凝固−線維素溶解系カ
スケードとのかかわりがこれまで知られておらず、実は
この調節機構に深くかかわっているタンパク質があるの
ではないかと考え、生体由来のタンパク質につき鋭意、
検討したところ、本発明者らが既に単離し、遺伝子配
列、アミノ酸一次配列を決定した神経栄養因子様活性を
有する新規なタンパク質ミッドカイン（ＭＫ）（特開平
５−９１８８０）が上記のような、生体内におけるｔ−
ＰＡおよびｕ−ＰＡの生合成を内因的に高める目的に合
致した作用を有する、タンパク質であることを発見する
に及び、本発明を完成するに至った。

【０００８】即ち本発明の目的は、ＭＫポリペプチドあ
るいはその断片ペプチド又はそれらと同様の生理活性を
有するそれらの類似体を有効成分とする、心筋梗塞、血
栓、血管狭窄、血流不全、動脈硬化症等の予防・治療剤
を提供することである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは先に、レチ
ノイン酸支配下において、細胞の分化・増殖をコントロ
ールする因子として、マウス由来ＭＫポリペプチド（Ｋ
ａｄｏｍａｔｓｕ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（ＢＢＲ
Ｃ），１５１，１３１２（１９８８）およびＴｏｍｏｍ
ｕｒａ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，２６５，１０７６５（１９９０））およびヒト由
来ＭＫポリペプチド（特開平５−９１８８０）を見出し
てきた。

【００１０】そしてＭＫが神経細胞の生存および神経突
起伸長の２つの活性を持つ神経栄養因子であること、ま
たＭＫが発癌、アルツハイマー病発症とのかかわりがあ
ることがその後の研究により明らかにされた（村松
喬：レチノイン酸応答性のヘパリン結合性成長因子、ミ
ッドカイン（ＭＫ）−発生分化、がん、神経とのかかわ
りで−；生化学第６５巻第１２号、１４９４〜１５０４
頁、１９９３年１２月。特開平６−１７２２１８）。

【００１１】またＭＫに引き続いてＭＫと５０％のアミ
ノ酸相同性を有するｈｅｐａｒｉｎｂｉｎｄｉｎｇ ｇ
ｒｏｗｔｈ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ
（ＨＢ−ＧＡＭ）（Ｍｅｒｅｎｍｉｅｓ，Ｊ．＆ Ｒａ
ｕｖａｌａ，Ｈ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６
５，１６７２１−１６７２４，（１９９０））あるいは
プレイオトロピン，ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ（ＰＴ
Ｎ）（Ｌｉ，Ｙ．−Ｓ．，Ｍｉｌｎｅｒ，Ｐ．Ｇ．，Ｇ
ｈａｕｈａｎ，Ａ．Ｋ．，Ｗａｔｓｏｎ，Ｍ．Ａ．，Ｈ
ｏｆｆｍａｎ，Ｒ．Ｍ．，Ｋｏｄｎｅｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｍ
ｉｌｂｒａｎｄｔ，Ｊ．，＆ Ｄｅｕｅｌ，Ｔ．Ｆ．：
Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５０，１６９０−１６９４，（１９
９０））、またＭＫと６５％のアミノ酸相同性を有する
ｒｅｔｉｎｏｉｃ ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｈｅｐ
ａｒｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲＩ−Ｈ
Ｂ）（Ｕｒｉｏｓ ｅｔ ａｌ．，ＢＢＲＣ，１７５，
６１７−６２４（１９９１））と呼ばれる分子が発見さ
れ、ＭＫファミリーポリペプチド（蛋白質）に属するも
のであることが、わかってきた。ＨＢ−ＧＡＭ／ＰＴＮ
は神経突起伸長作用を持つ他、内皮細胞の増殖刺激作用
を有することが報告されている（Ｒａｕｖａｌａ，
Ｈ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，８，２９３３−２９４１（１９
８９）．Ｗｅｌｌｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７，２５８２−２５８
７（１９９２）．Ｃｏｕｒｔｙ，Ｊ．ｅｔａｌ．ＢＢＲ
Ｃ，１８０，１４５−１５１（１９９０））。

【００１２】一方、血管内皮細胞が線維素溶解系のまた
抗血栓性の各種因子を生産し、これら因子によるカスケ
ードが線溶系の正常な維持を司っていることが明らかに
されてきている。血管内皮細胞は、２つの免疫学的に異
なるプロテアーゼであるプラスミノーゲン活性化因子
（アクチベーター）（ＰＡ）を生産・放出し、プラスミ
ノーゲンをプラスミンに変換する。１つは組織型ＰＡ
（ｔ−ＰＡ）であり、もう１つはウロキナーゼ型ＰＡ
（ｕ−ＰＡ）である（Ｓａｋｓｅｌａ、Ｏ． ａｎｄＲ
ｉｆｋｉｎ，Ｄ．Ｂ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１
１０，７６７−７７５（１９９０）．佐藤 靖史、線溶
系の新展開（松尾 理編、学際企画）ｐｐ１４１−１５
３（１９９２））。

【００１３】このＰＡの生産にレチノイドが促進的に作
用するという報告がある（Ｉｎａｄａ，Ｙ．ｅｔ ａ
ｌ，ＢＢＲＣ，１３０，１８２−１８７（１９８
５））。即ち、レチノイドが血管内皮細胞に作用する
と、ＰＡ及び蛋白質間の架橋結合を司る酵素のトランス
グルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ：
ＴＧａｓｅ）の生産を高めること、次いでＴＧＦ−β
（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔ
ｏｒ−β）の生産がレチノイド処理により高まること、
さらに不活性型分子として生産されるＴＧＦ−βの活性
型分子への変換反応（ＴＧＦ−βの活性化）にＰＡとＴ
Ｇａｓｅが働くことを明らかにされ、内皮細胞において
レチノイド処理により活性のあるＴＧＦ−βが生成して
レチノイドのメディエーターとして働いていることが報
告されている。

【００１４】そこで本発明者らはレチノイン酸によって
発現が誘導される遺伝子の産物として発見されたＭＫや
あるいはプレイオトロピンなどが、線溶系プロテアーゼ
であるＰＡの生産にもなんらかの関与をし、ＰＡ生産の
制御を行っている可能性が大いにあると想到し、これを
明らかにすべく鋭意検討を進めた。

【００１５】そして本発明者らの製造したレコンビナン
トＭＫ、および化学合成ＭＫが、培養血管内皮細胞のＰ
Ａ生産をどう変化させるかを試験したところ、ｍＲＮＡ
レベルでも、蛋白活性レベルでも、これらＭＫがＰＡ生
産を増強することが明らかにされ、またＰＡを阻害する
線溶系カスケードの因子であるＰＡ ｉｎｈｉｂｉｔｏ
ｒ（ＰＡＩ−１）蛋白レベルでもｍＲＮＡレベルで抑制
することが示された。本発明は上記の考察とこれら知見
に基づいて到達したものであり、以下により詳細に記述
する。ＰＡの生産をみる血管内皮細胞はウシ大動脈由来
内皮細胞やＳＶ−４０によりトランスフォームされたウ
シ内皮細胞などが用いられるが、ヒツジ、ヤギ、ブタ、
イヌ、ウサギ、ラット、マウスあるいはヒトの内皮細胞
であってもよい。

【００１６】上記の試験に供し、また本発明の医薬組成
物の有効成分の対象となるＭＫファミリーに属するポリ
ペプチドあるいはその断片ペプチド、又はそれらと同様
の生理活性を有するそれらの類似体としては、１２１ア
ミノ酸残基よりなるヒトミッドカイン（ＭＫ）、ＭＫの
断片ペプチドであるＮ−ｈａｌｆ（１−５９配列）Ｍ
Ｋ、Ｃ−ｈａｌｆ（６０−１２１）ＭＫ、Ｃ−ｈａｌｆ
（６２−１０４）ＭＫ、ＭＫの１０４−１２１残基断片
ペプチドやその他の、合成中間体断片ペプチド、またプ
レイオトロピン（ＰＴＮ）、ＰＴＮの断片ペプチドであ
るＮ−ｈａｌｆ（１−６６配列）ＰＴＮ、Ｃ−ｈａｌｆ
（６７−１３６）ＰＴＮ、Ｃ−ｈａｌｆ（６７−１０
９）ＰＴＮやその他の、合成中間体断片ペプチド、およ
び上記の個々の断片ペプチドと同様の生理活性を有する
それらの類似体があげられる。

【００１７】これらポリペプチドあるいは断片ペプチド
を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有無血清
培地に各濃度に溶かして、コンフルエントの状態の血管
内皮細胞を各時間、培養処理した後に、０．５％Ｔｒｉ
ｔｏｎＸ−１００による細胞抽出液を調製して、そのＰ
Ａ活性レベルを測定すると、ポリペプチドあるいは断片
ペプチドの濃度および処理時間に依存してＰＡ活性レベ
ルが上昇することが明らかにされた。

【００１８】この細胞抽出液中のＰＡは、主として細胞
表面上に存在するＰＡであり、ＰＡレベルが亢進するこ
とによって細胞表面上のプラスミンレベルが高まると考
えられる。

【００１９】そこで別のアッセイ系として、フィブリン
膜を用意し、膜上で、内皮細胞を血清添加もしくは０．
１％ＢＳＡ添加無血清培地にて培養し、ポリペプチドあ
るいは断片ペプチドを加えると、フィブリン膜の溶解が
細胞表面プラスミンによって起こったが、コントロール
の細胞に比べて顕著に溶解が起こることが明らかにされ
た。

【００２０】また細胞表面のプラスミンを抽出し、その
レベルを測定すると、これらポリペプチドあるいは断片
ペプチドの添加処理によってプラスミンレベルが高まる
ことが示された。

【００２１】またＰＡおよびＰＡレセプターのｍＲＮＡ
レベルも、これらポリペプチドあるいは断片ペプチドの
添加処理後の内皮細胞では増大していることがわかっ
た。

【００２２】他方ＰＡＩ−１は蛋白レベルでも（たとえ
ば１０ｎｇ／ｍｌのＭＫ存在下半減した、ｍＲＮＡレベ
ルでも減少すること（たとえばＵ−ＰＡのｍＲＮＡレベ
ルが１．５倍になったのに対し、ＰＡＩ−１のｍＲＮＡ
は４０％も減少）が明らかにされ、更にレチノールがＵ
−ＰＡとＵ−ＰＡレセプターのｍＲＮＡレベルのみなら
ず、同時にＰＡＩ−１のｍＲＮＡレベルも上昇させたこ
とから本発明のポリペプチドあるいは断片ペプチドはＰ
Ａを選択的に誘導する、臨床的に価値ある特異な因子・
薬物であることが認識された。

【００２３】またウシ大動脈由来細胞内皮細胞のコント
ロール培養系に抗−ＭＫ抗体を加えたところ、細胞のＰ
Ａ活性レベルが減少し、ＰＡＩ−１の活性レベルは増加
した。そして抗−ＭＫ抗体の存在下、レチノールのＰＡ
活性増強活性は５０％まで落ち、一方ＰＡＩ−１活性レ
ベルは２倍に増加したことから、ＭＫが血管内皮細胞か
ら生産され、その生産がレチノールによって増強される
ことが示唆された。

【００２４】これらの知見は、ＭＫ、ＰＴＮ等ＭＫファ
ミリーポリペプチドあるいはその断片ペプチドが、レチ
ノール等とは異なり、ＰＡを選択的に生産・誘導させる
薬物であることを示し、レチノールの如き、高用量投与
により人体に様々な副作用を発現させる薬物とは異な
り、使い易く安全な薬物として、人体にまた長期にわた
って適応することが期待される。

【００２５】本発明のポリペプチドあるいはその断片ペ
プチド、又はそれらと同様の生理活性を有するそれらの
類似体を有効成分として医薬組成物を調製し、心筋梗
塞、血栓、血管狭窄、血流不全、動脈硬化症等の予防・
治療剤として用いる際、ポリペプチドあるいは断片ペプ
チドの原末そのもののみを投与することもできるが、薬
剤として使用可能な生理食塩水、アルブミン、ゼラチ
ン、デキストリン、デキストロース、グルコース、マン
ニトール、キシリトール、ガラクトース、マンノース、
フラクトース、マルトース、サッカロース、ソルビトー
ル、乳糖、蔗糖、などの糖類、デキストラン硫酸、コン
ドロイチン硫酸、ヘパリン、アミノ酸、有機酸、Ｔｗｅ
ｅｎ ８０などのポリソルベート系の非イオン界面活性
剤、脂肪酸アルコールエステル、ポリグルコールエーテ
ル等の担体と混合して投与することもできる。

【００２６】更に、本発明の医薬用組成物は、製薬的に
許容される担体等の添加剤として、上記の例示物の他
に、充填剤、結合剤、滑択剤、湿潤剤、崩壊剤、乳濁お
よび懸濁液、保存剤、希釈剤、甘味剤、あるいは芳香剤
等として作用する各種物質を含有し得る。

【００２７】これらの添加剤の例としては、とうもろこ
し澱粉、結晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシ
ウム、アルジネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロ
ース、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラ
チン、シロップ、メチルセルロース、カルボキシメチル
セルロース、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロ
ピルヒドロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン
酸マグネシウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が
挙げられる。

【００２８】なお、本発明の医薬組成物は、投薬の後の
活性成分の放出速度が所望に応じて制御されるように処
方しても良い。

【００２９】これら医薬組成物は、任意の投与方法、た
とえば経口投与、あるいは静脈内投与、筋肉内投与、皮
下投与、直腸内投与、鼻内投与、舌下投与、局所投与な
どによって投与することができる。

【００３０】本発明の医薬組成物の投与量は、患者の年
齢、疾患の状態、程度、体重、投与経路などによって異
なるが、一般的には０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇの範囲
にあり、一日あたり１回ないし数回、ｂｏｌｕｓにある
いは点滴などにより連続的に投与される。

【００３１】また、本発明のポリペプチドあるいは断片
ペプチドはｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡあるいはストレプトキナ
ーゼなどの血栓溶解剤と同時に、あるいは時差をおいて
又は交互に間隔をおいて併用投与することができる。

【００３２】本発明の医薬組成物に有効成分として使用
されるポリペプチドあるいは断片ペプチドは、遺伝子組
換え技術あるいは全化学合成法また一部酵素合成法を併
用した合成法によって調製できる。

【００３３】以下本発明を実施例、参考例、実験例をも
って、更に具体的に説明するが、もとより本発明はこれ
ら記載に限られるものではない。 ［実施例１］ＭＫ１００ｍｇ、コンドロイチン硫酸ナト
リウム１０ｍｇ、乳糖５００ｍｇを５ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）２５ｍｌに溶解し、濾過滅菌して得た溶
液を２．５ｍｌずつバイアルビンに充填した。これを凍
結乾燥してミッドカイン製剤を製造した。 ［実施例２］Ｃ−ｈａｌｆ（６０−１２１）ＭＫを実施
例１のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行っ
た。 ［実施例３］Ｃ−ｈａｌｆ（６２−１０４）ＭＫを実施
例１のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行っ
た。 ［実施例４］Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）ＭＫを実施例１
のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行った。 ［実施例５］Ｃ−ｈａｌｆ（６７−１３６）ＰＴＮを実
施例１のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行
った。 ［実施例６］Ｃ−ｈａｌｆ（６７−１０９）ＰＴＮを実
施例１のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行
った。 ［実施例７］Ｎ−ｈａｌｆ（１−６６）ＰＴＮを実施例
１のＭＫのかわりに用いる他は実施例１と同様に行っ
た。 ［実施例８］Ｃ−ｈａｌｆ（６２−１０４）ＭＫ１００
ｍｇおよびｔ−ＰＡ５０ｍｇを実施例１のＭＫ１００ｍ
ｇのかわりに用いる他は実施例１と同様に行った。 ［実施例９］ヘパリン１ｍｇを実施例１のコンドロイチ
ン硫酸ナトリウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施例
１と同様に行なった。 ［実施例１０］ヘパリン１ｍｇを実施例２のコンドロイ
チン硫酸ナトリウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施
例２と同様に行なった。 ［実施例１１］ヘパリン１ｍｇを実施例３のコンドロイ
チン流酸ナトリウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施
例３と同様に行なった。 ［実施例１２］ヘパリン１ｍｇを実施例４のコンドロイ
チン硫酸ナトリウム１０ｍｇのかわりに用いる他は実施
例４と同様に行なった。

【００３４】参考例としてＣ−ｈａｌｆ ＭＫなどの合
成法、物性を簡単に示す。 参考例１ ヒト型ｈ−Ｍｉｄｋｉｎｅの合成 保護ペプチド（１−１２１）の合成はアミノ酸１２１個
からなるペプチドを液相法にて図１および図２に示すよ
うに、１３個のフラグメント（１−１１）（１２−２
２）（２３−３１）（３２−４０）（４１−５１）（５
２−５９）（６０−７０）（７１−７７）（７８−８
３）（８４−９３）（９４−１０３）（１０４−１１
２）（１１３−１２１）に分割、合成した。各フラグメ
ントの純度はＴＬＣ，ＨＰＬＣ，アミノ酸分析により確
認した。この後Ｎ−ｈａｌｆ（１−５９）［ｈＭＫ−Ｎ
と略す。］とＣ−ｈａｌｆ（６０−１２１［ｈＭＫ−Ｃ
と略す。］を合成するべくそれぞれＣ末から順次縮合し
た。各フラグメントの合成およびフラグメント縮合には
全てＷＳＣＩ／ＨＯＢｔ法またはＷＳＣＩ／ＨＯＯＢｔ
法を用いた。（ＷＳＣＩ：１−ｅｔｈｙｌ−３，（３−
ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂ
ｏｄｉｉｍｉｄｅ，ＨＯＢｔ：１−ｈｙｄｒｏｘｙｂｅ
ｎｚｏｔｒｉａｚｏｌｅ，ＨＯＯＢｔ：３，４−ｄｉｈ
ｙｄｒｏ−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−ｏｘｏ−１，２，
３−ｂｅｎｚｏｔｒｉａｚｉｎｅ）。アミノ酸のＮ末は
Ｂｏｃ基で保護し、アミノ酸側鎖保護基にはそれぞれＡ
ｓｐ（ＯｃＨｅｘ），Ｇｌｕ（ＯｃＨｅｘ），Ｓｅｒ
（Ｂｚｌ），Ｔｈｒ（Ｂｚｌ），Ｌｙｓ（ＣｌＺ），Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ），Ｔｙｒ（ＢｒＺ），Ｔｒｐ（Ｆｏ
ｒ），そしてＣｙｓの保護基にはＡｃｍ基を用いた。そ
の他Ｃ末保護基にはＢｚｌ基、各フラグメントのＣ末に
はＰａｃ基を用いて合成した。（ＣＨｅｘ：ｃｙｃｌｏ
ｈｅｘｙｌ），（Ｂｚｌ：ｂｅｎｚｙｌ），（ＣｌＺ：
ｚ−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙ
ｌ），（Ｔｏｓ：ｔｏｓｙｌ），（ＢｒＺ：２−ｂｒｏ
ｍｏｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ），Ｆｏｒ
（ｆｏｒｍｙｌ），Ａｃｍ（ａｃｅｔａｍｉｄｏｍｅｔ
ｈｙｌ），（Ｐａｃ：Ｐｈｅｎａｃｙｌ ｅｓｔｅ
ｒ）。

【００３５】保護ペプチド（１−１２１）３ｇをＨｉｇ
ｈ−ＨＦ（ＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１，０〜−５℃，
１ｈ）で次いでＬｏｗ−ＨＦ（ＨＦ／Ｂｕｔａｎｅｄｉ
ｔｉｏｌ＝７／３，０〜−５℃，３０ｍｉｎ）で処理し
１．９ｇの粗製品を得た。この粗製品１．９ｇをＨＰＬ
Ｃ逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３
０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦ
Ａを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、Ｃ
Ｈ₃ＣＮ濃度１０％から６０％までの１１０分単一濃度
勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶
出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度３０−３２．２％の画分を集
め、減圧濃縮後凍結乾燥して４２０ｍｇのペプチドを得
た。この４２０ｍｇのペプチドをＣＭセルロースのイオ
ン交換クロマトグラフィー（３．７ｘｌ７ｃｍ）に注入
しｓｔａｒｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ₄
＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ５），ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆ
ｆｅｒ０．７ＭＡｃＯＮＨ₄＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ６）
各１．２５Ｌの単一濃度勾配条件で溶出した。１５ｇず
つ分画し０．４８−０．５３Ｍ塩濃度画分（５６本目か
ら６５本目）を集め溶液のｐＨを酢酸で下げ、そのまま
逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０Ｘ２５０ｍｍ）に注
入した。前述同様溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ
₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１
４％から４４％までの１１０分単一濃度勾配法、流速２
０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃
ＣＮ濃度２８．５−２９．２％の画分を集め、減圧濃縮
後凍結乾燥して１２５ｍｇの１０Ａｃｍペプチドを得
た。

【００３６】このうち９０ｍｇを０．５ｍＭペプチド濃
度になるように５０％ＡｃＯＨで溶かし、暗所でＡｃｍ
基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡｃ）₂を加え窒素雰
囲気下室温で２時間かき混ぜた。その後Ａｃｍ基に対し
て３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを加
えさらに２時間かき混ぜた。反応液をＧ−２５のゲルろ
過クロマトグラム（１．１５ｘ７３ｃｍ）に注入し、５
％ＡｃＯＨで溶出した後ペプチドの部分を集め凍結乾燥
してＳＨペプチド６５ｍｇを得た。

【００３７】ＳＨペプチド４５ｍｇ（３．４μＭ）を１
ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄およびＧＳＨ／Ｇ
ＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯＮＨ₄
（ｐＨ７．７）の緩衝液，３．４Ｌ（１ｘ１０^-6ＭＣｏ
ｎｃ．）に溶かし５℃で４日間かき混ぜた。ＴＦＡでｐ
Ｈを３とした後、逆相のカラム（ＹＭＣ−Ｃ４，２０ｘ
２５０ｍｍ）に注入し、ＨＰＬＣ逆相クロマトグラフィ
ー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取
した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液
と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１５％から
３５％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／
ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度
２９．４−２９．８％の画分を集め減圧濃縮後凍結乾燥
して５ｍｇのペプチドを得た。

【００３８】ＳＳ結合架橋様式は、トリプシン消化後逆
相ＨＰＬＣで分取した各ピークについて質量分祈および
アミノ酸分祈により、天然型と同じであることを確認し
た。最終品の純度に関して逆相ＨＰＬＣのみならずキャ
ピラリー電気泳動の検査でもシングルピークを与えた。
またアミノ酸分祈値および質量分析値も理論値と良く一
致した。ｈＭＫはＯＤＳカラム（４．６ｘｌ５０ｍｍ）
で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．
１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１０％から４０％
までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カ
ラム温度は５０℃で溶出すると１４．３ｍｉｎに溶出し
た。 質量分祈値；１３２４１．２［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ７．５２（８），Ｔｈｒ９．５
１（１０），Ｓｅｒ２．８６（３），Ｇｌｕ１１．１２
（１１），Ｇｌｙｌ６．００（１６），Ａｌａ１０．７
３（１０），Ｃｙｓ９．１７（１０），Ｖａｌ４．８７
（５），Ｉｌｅ１．８３（２），Ｌｅｕ１．０２
（１），Ｔｙｒ２．０１（２），Ｐｈｅ３．０１
（３），Ｌｙｓ２３．３２（２３），Ｔｒｐ３．８６
（４），Ａｒｇ６．９０（７），Ｐｒｏ５．９８（６） 参考例２ ｈＭＫ−Ｎ（Ｎ−ｈａｌｆ）の合成 ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦ，
およびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３
４０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグ
ラフィー（１．３ｘ９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔ
ｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ₄（ｐＨ５），
ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ１．０ＭＡｃＯＮＨ
₄（ｐＨ６）各６００ｍｌの単一濃度勾配条件で溶出し
た。１５ｇずつ分画し０．３４−０．３８Ｍ塩濃度画分
（１４本目から１８本目）を集め溶液のｐＨをＴＦＡで
下げそのまま逆相カラム（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０Ｘ２５
０ｍｍ）に注入した。０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ
溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１５％
から４５％までの１１０分単一濃度勾配法，流速２０ｍ
ｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ
濃度２８．１−２８．９％の分画を集め減圧濃縮後、凍
結乾燥して７０ｍｇの６Ａｃｍペプチドを得た。

【００３９】ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド５０ｍｇを５０
％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶か
し、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡ
ｃ）₂を加え窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃｍ
基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎ
ｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ過
クロマトグラフィー（１．１５ｘ７３ｃｍ，５％ＡｃＯ
Ｈで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨペ
プチド４０ｍｇを得た。

【００４０】ＳＨペプチド４０ｍｇ（６．１８μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄） ₂ＳＯ₄およびＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯ
ＮＨ₄（ｐＨ７．７）の緩衝液６１８ｍｌ（１ｘ１０^-5
ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡ
でｐＨを３とした後逆相のカラムＨＰＬＣ逆相クロマト
グラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍ
ｍ）で分取した。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ
₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１
０％から４０％までの１２０分単一濃度勾配法、流速２
０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃
ＣＮ濃度２５．１−２５．５％の画分を集め減圧濃縮後
凍結乾燥してｈＭＫ−Ｎ１５ｍｇを得た。ｈＭＫ−Ｎは
ＯＤＳカラム（４．６ｘｌ５０ｍｍ）で溶離液に０．１
％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用
い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１０％から４０％までの２５分単一
濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃
で溶出すると１３．９ｍｉｎに溶出した。純度およびＳ
Ｓ結合架橋様式はｈＭＫの検査に準じて行い、ＳＳ結合
架橋様式が天然型と同じであり、逆相およびキャピラリ
ー電気泳動でシングルピークであることを確認した。ま
たアミノ酸分祈値、質量分析値も理論値に良く一致し
た。 質量分析値；６４７０．４［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分祈値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ２．８
８（３），Ｓｅｒ２．８１（３），Ｇｌｕ６．０８
（６），Ｇｌｙ９．００（９），Ａｌａ３．１６
（３），Ｃｙｓ５．８３（６），Ｖａｌ２．９１
（３），Ｉｌｅ０．９４（１），Ｐｈｅ２．２４
（２），Ｌｙｓ９．２６（９），Ｔｒｐ２．７８
（３），Ａｒｇ４．００（４），Ｐｒｏ４．０８（４） 参考例３ ｈＭＫ−Ｃ（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成 ｈＭＫ同様保護ペプチド５００ｍｇをＨｉｇｈ−ＨＦお
よびＬｏｗ−ＨＦ処理し粗製品３４０ｍｇを得た。３４
０ｍｇ全量をＣＭセルロースのイオン交換クロマトグラ
フィー（１．３ｘ９．５ｃｍ）に注入し、ｓｔａｒｔｉ
ｎｇ ｂｕｆｆｅｒ０．２ＭＡｃＯＮＨ₄＋３Ｍ Ｕｒｅ
ａ（ｐＨ５），ｌｉｍｉｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒｌ．０
ＭＡｃＯＮＨ₄＋３Ｍ Ｕｒｅａ（ｐＨ６）各８００ｍｌ
の単一濃度勾配条件で溶出した。２０ｇずつ分画し０．
３８−０．４２Ｍ塩濃度画分（３８本目から４２本目）
を集め、溶液のｐＨをＴＦＡで下げそのまま逆相カラム
（ＹＭＣ−ＯＤＳ，３０Ｘ２５０ｍｍ）に注入した。
０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ
水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１５％から２５％までの６０
分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度
は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度２２．０−２４．５
％の分画を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して１１０ｍｇの
４Ａｃｍペプチドを得た。

【００４１】ｈＭＫ同様Ａｃｍペプチド１１０ｍｇを５
０％ＡｃＯＨで０．５ｍＭペプチド濃度になるように溶
かし、暗所でＡｃｍ基に対して１．１当量のＨｇ（ＯＡ
ｃ） ₂を加え、窒素雰囲気下室温で２時間、その後Ａｃ
ｍ基に対して３０当量の２−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａ
ｎｏｌを加えさらに２時間かき混ぜ、Ｇ−２５のゲルろ
過クロマトグラフィー（１．１５ｘ７３ｃｍ，５％Ａｃ
ＯＨで溶出）後ペプチドの部分を集め凍結乾燥してＳＨ
ペプチド６５ｍｇを得た。

【００４２】ＳＨペプチド６５ｍｇ（９．６μＭ）を、
１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄およびＧＳＨ／
ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭ ＡｃＯＮ
Ｈ₄（ｐＨ７．７）の緩衝液９６０ｍｌ（１ｘｌ０^-5Ｍ
Ｃｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦＡで
ｐＨを３とした後逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−Ｏ
ＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶離液に
は０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦ
Ａ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１２％から２２％までの６
０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温
度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度２５．１−２５．
５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して４５ｍｇの
ペプチドを得た。ｈＭＫ−ＣはＯＤＳカラム（４．６ｘ
ｌ５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃Ｃ
Ｎ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１０
％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ
／ｍｉｎ、カラム温度は５０℃で溶出すると１３．５ｍ
ｉｎに溶出した。純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫ
の検査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じ
であり、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピ
ークであることを確認した。またアミノ酸分析値、質量
分析値も理論値に良く一致した。 質量分祈値；６７８９．９［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ４．７１（５），Ｔｈｒ６．５
９（６），Ｇｌｕ５．０４（５），Ｇｌｙ７．００
（７），Ａｌａ７．２６（７），Ｃｙｓ３．８０
（４），Ｖａｌ１．９７（２），Ｉｌｅ０．８８
（１），Ｌｅｕ０．９６（１），Ｔｙｒ１．９２
（２），Ｐｈｅ０．９９（１），Ｌｙｓ１４．００（１
４），Ｔｒｐ０．８７（１），Ａｒｇ２．８６（３），
Ｐｒｏ１．８６（２） 参考例４ ｈＭＫ（６２−１０４）（Ｃ−ｈａｌｆ）の合成 固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈ
ＭＫ（６２−１０４）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４ＭｅＢ
ｚｌを用いた以外は同じ保護基を使用した。保護ペプチ
ド樹脂１．７ｇをＨＦ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８
０／５／１５で０〜−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製
品７００ｍｇを逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤ
Ｓカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には
０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ
水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１５％から３５％までの１０
０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温
度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度２５．３−２６．
８％の画分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥して６０ｍｇの
ＳＨペプチドを得た。

【００４３】ＳＨペプチド６０ｍｇ（１２．３μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄） ₂ＳＯ₄およびＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭＡｃＯ
ＮＨ₄（ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１ｘ１０^-5
ＭＣｏｎｃ．）に溶かし、室温で一晩かき混ぜた。ＴＦ
ＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶
離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１
％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度５％から４０％まで
の６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラ
ム温度は室温で溶出した。

【００４４】ＣＨ₃ＣＮ濃度３０．３−３０．６％の画
分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＭＫ（６２−１０
４）３０ｍｇを得た。ｈＭＫ（６２−１０４）はＯＤＳ
カラム（４．６ｘｌ５０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦ
Ａを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用いＣＨ₃
ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃度勾配法、
流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶出すると１
８．５ｍｉｎに溶出した。

【００４５】純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検
査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであ
り、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピーク
であることを確認した。またアミノ酸分祈値、質量分析
値も理論値に良く一致した。 質量分析値；４８３６．２［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分祈値；Ａｓｐ２．７０（３），Ｔｈｒ４．６
２（５），Ｇｌｕ５．２２（５），Ｇｌｙ４．９３
（５），Ａｌａ３．１７（３），Ｃｙｓ３．４９
（４），Ｖａｌｌ．９６（２），Ｉｌｅ０．８８
（１），Ｌｅｕｌ．０５（１），Ｔｙｒｌ．９８
（２），Ｐｈｅ０．９８（１），Ｌｙｓ６．１１
（６），Ｔｒｐ０．８６（１），Ａｒｇ３．００
（３），Ｐｒｏ０．９９（１） 参考例５ ｈＭＫ（１０４−１２１）の合成 ｈＭＫのフラグメント（１０４−１１２）と（１１３−
１２１）を縮合させて合成した保護ペプチド１００ｍｇ
をＨＦ／Ａｎｉｓｏｌ＝９／１で０〜−５℃，１ｈ処理
し、得られた粗製品８０ｍｇを逆相クロマトグラフィー
（ＹＭＣ−ＯＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取し
た。溶離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と
０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度３％から１８
％までの６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉ
ｎ、カラム温度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度１
０．２５−１１．２５％の画分を集め減圧濃縮後、凍結
乾燥してｈＭＫ（１０４−１２１）６０ｍｇを得た。ｈ
ＭＫ（１０４−１２１）はＯＤＳカラム（４．６ｘｌ５
０ｍｍ）で溶離液に０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶
液と０．１％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１％から
４０％までの２５分単一濃度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉ
ｎ、カラム温度は室温で溶出すると１０．９ｍｉｎに溶
出した。純度に関して逆相ＨＰＬＣでシングルピークで
あることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析値
も理論値に良く一致した。 質量分析値；１９６０．４［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ１．００（１），Ｔｈｒ２．０
０（２），Ｇｌｙ１．９８（２），Ａｌａ３．０１
（３），Ｃｙｓ０．６８（１），Ｌｙｓ８．０６
（８），Ｐｒｏ０．９９（１） 参考例６ ヒト型ｈ−ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ（６７−１０９）の
合成 固相合成法（Ｂｏｃ ｓｔｒａｔｅｇｙ）で合成したｈ
ＰＴＮ（６７−１０９）樹脂（Ｃｙｓの保護基に４Ｍｅ
Ｂｚｌ、Ｈｉｓの保護基にＢｏｍを用いた以外は同じ保
護基を使用した）１．５ｇにＣｙｓ３０当量を加え、Ｈ
Ｆ／ｐ−Ｃｒｅｓｏｌ／ＢＤＴ＝８０／５／１５で０〜
−５℃，１ｈ処理し、得られた粗製品１．５７ｇ（Ｃｙ
ｓを含む）を逆相クロマトグラフィー（ＹＭＣ−ＯＤＳ
カラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶離液には
０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ
水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１５％から３５％までの１０
０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温
度は室温で溶出した。ＣＨ₃ＣＮ濃度２４．５−２５．
６％の画分を集め、減圧濃縮後凍結乾燥してＳＨペプチ
ド５０ｍｇを得た。

【００４６】ＳＨペプチド５０ｍｇ（１２．３μＭ）
を、１ｍＭ ＥＤＴＡと２Ｍ（ＮＨ₄） ₂ＳＯ₄およびＧＳ
Ｈ／ＧＳＳＧ（１００／１０）を含んだ５０ｍＭ Ａｃ
ＯＮＨ₄（ｐＨ７．７）の緩衝液１．２３Ｌ（１ｘ１０
^-5ＭＣｏｎｃ．）に溶かし室温で一晩かき混ぜた。ＴＦ
ＡでｐＨを３とした後、逆相クロマトグラフィー（ＹＭ
Ｃ−ＯＤＳカラム、３０Ｘ２５０ｍｍ）で分取した。溶
離液には０．１％ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１
％ＴＦＡ水を用い、ＣＨ₃ＣＮ濃度５％から４０％まで
の６０分単一濃度勾配法、流速２０ｍｌ／ｍｉｎ、カラ
ム温度は室温で溶出した。

【００４７】ＣＨ₃ＣＮ濃度２８．５−２９．３％の画
分を集め減圧濃縮後、凍結乾燥してｈＰＴＮ（６７−１
０９）３０ｍｇを得た。ｈＰＴＮ（６７−１０９）はＯ
ＤＳカラム（４．６ｘｌ５０ｍｍ）で溶離液に０．１％
ＴＦＡを含むＣＨ₃ＣＮ溶液と０．１％ＴＦＡ水を用
い、ＣＨ₃ＣＮ濃度１％から４０％までの２５分単一濃
度勾配法、流速１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度は室温で溶
出すると１７．３ｍｉｎに溶出した。

【００４８】純度およびＳＳ結合架橋様式はｈＭＫの検
査に準じて行い、ＳＳ結合架橋様式が天然型と同じであ
り、逆相およびキャピラリー電気泳動でシングルピーク
であることを確認した。またアミノ酸分析値、質量分析
値も理論値に良く一致した。 質量分析値；４８４０．５［Ｍ⁺Ｈ］ アミノ酸分析値；Ａｓｐ２．９８（３），Ｔｈｒ４．７
５（５），Ｓｅｒ１．８７（２），Ｇｌｕ５．１０
（５），Ｇｌｙ２．００（２），Ａｌａ４．０６
（４），Ｃｙｓ３．６０（４），Ｖａｌ０．９７
（１），Ｉｌｅ０．９１（１），Ｌｅｕ３．９５
（４），Ｔｙｒ０．９６（１），Ｐｈｅ０．９８
（１），ＨｉｓＯ．９７（１），Ｌｙｓ５．１０
（５），Ｔｒｐ０．８５（１），Ａｒｇ１．９８
（２），Ｐｒｏ０．９７（１） ［実験例１］ 細胞内ＰＡ活性測定 ウシ大動脈由来血管内皮細胞を１０％ウシ血清（ＢＳ
Ａ）を含むαＭＥＭ内に分離し、培養した。９６穴培養
プレートに細胞をまきコンフルエントになるまで培養
後、ｐＨ７．４のリン酸緩衝生食液（ＰＢＳ）で洗い、
０．１％ＢＳＡを含む１００μｌの無血清αＭＥＭ（α
ＭＥＭ−ＢＳＡ）中で培養を行った。

【００４９】この１００μｌの培地中に種々の濃度のＭ
Ｋポリペプチドや断片ペプチドまた対照のレチノールを
添加し、それら薬剤によるＰＡ生産・誘導能を測定し
た。

【００５０】各培養時間ごとに、培養上清をアスピレー
トし、培養細胞をＰＢＳで洗い、細胞内ＰＡを０．５％
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む０．１Ｍトリス−ＨＣｌ
（ｐＨ８．１）緩衝液１００μｌ中に抽出し、抽出液中
のＰＡレベルは¹²⁵Ｉ−ラベルフィブリンプレート（Ｇ
ｒｏｓｓ．，Ｊ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉ
ｏｌ．，９５，９７４−９８１（１９８２））を用いて
測定した。

【００５１】ＰＡ活性はサンプル中のｍｇタンパクあた
りのＵＫ単位（Ｕ）で表わした。蛋白濃度はＢＳＡを標
準として、マイクロタイタープレートＢＣＡ（Ｐｉｅｒ
ｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）により測定し
た。１８時間培養後、未添加の対照に対してレチノール
２μＭの添加で１．５倍のＰＡ活性レベルとなった。レ
コンビナントＭＫ、化学合成ＭＫ、Ｃ−ｈａｌｆ ＭＫ
などは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの濃度で、対照に比べ
て、３倍から１５倍のＰＡ活性が見られた。他方ＭＫ自
身はプラスミン活性を持たないことおよびプラスミノー
ゲンを直接に活性化することはないことがわかった。 ［実験例２］体重４００ｇ前後のＳＤラットを麻酔後、
大腿動脈よりカテーテルを、左総頸動脈に挿入しバルー
ンを直径４ｍｍほどふくらませ、総頸動脈を全長にわた
り傷害した。

【００５２】このラットにＭＫポリペプチドあるいはそ
の断片ペプチドなどを、傷害の前後から連日投与し、バ
ルーン傷害後２０日ないし１００日に頸動脈を摘出し、
組織の標本を作成し、血管の最大肥厚部の内膜／中膜の
面積比を算出し、内膜肥厚度とした。

【００５３】ＭＫポリペプチドあるいはその断片ペプチ
ドなどの投与群においては、対照の生食投与群のラット
と比較して、内膜肥厚度が顕著に低く、ＭＫポリペプチ
ドあるいはその断片ペプチドなどが、ＰＴＣＡ後の血管
再狭窄や再閉塞、再梗塞、動脈硬化などの予防に有効で
あろうことが示された。 ［実験例３］ＭＫポリペプチドあるいはその断片ペプチ
ドなどの単回静脈投与毒性をラットを用いて調べた。Ｍ
Ｋポリペプチドあるいはその断片ペプチドなどの５０ｍ
ｇ／ｋｇ投与では、死亡するラットはいなかった。

【図面の簡単な説明】

【図１】保護されたミッドカイン（１−５９）の合成図

【図２】保護されたミッドカイン（６０−１２１）の合
成図

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 38/00 ＡＢＸ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＳ ＡＢＸ (72)発明者 村松 寿子 愛知県名古屋市天白区天白町大字島田字黒 石3785−3391シティコーポしまだＢ−205 (72)発明者 粟屋 昭 神奈川県横浜市戸塚区矢部町4978 (72)発明者 ▲榊▼原 俊平 大阪府吹田市藤白台２丁目23番３号 (72)発明者 木村 ▲皓▼俊 兵庫県西宮市苦楽園二番丁10−６

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ミッドカイン（ＭＫ）ファミリーに属す
   るポリペプチドあるいはその断片ペプチド、又はそれら
   と同様の生理活性を有するそれらと相同的な変異体また
   はそれらの類似体を有効成分とする、心筋梗塞、血栓、
   血管狭窄、血流不全、動脈硬化症等の予防・治療剤。
2. 【請求項２】 請求項１記載のミッドカイン（ＭＫ）フ
   ァミリーに属するポリペプチドがミッドカイン（ＭＫ）
   ポリペプチドである心筋梗塞、血栓、血管狭窄、血流不
   全、動脈硬化症等の予防・治療剤。
3. 【請求項３】 請求項１記載のミッドカイン（ＭＫ）フ
   ァミリーに属するポリペプチドがプレイオトロピン（ｐ
   ｌｅｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）ポリペプチドである心筋梗
   塞、血栓、血管狭窄、血流不全、動脈硬化症等の予防・
   治療剤。