JPH0822232B2 - Method for producing L-isoleucine - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、酵素法によるＬ−イソロイシンの製造法に
関するものである。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing L-isoleucine by an enzymatic method.

本発明によれば高収量で効率よくＬ−イソロイシンを
製造することができる。According to the present invention, L-isoleucine can be efficiently produced in high yield.

Ｌ−イソロイシンは必須アミノ酸として、人間および
動物の栄養上重要な役割りをするアミノ酸であり、医
薬、食品、飼料添加剤等としてその需要が近年急激に増
加しつつある。As an essential amino acid, L-isoleucine is an amino acid that plays an important role in nutrition of humans and animals, and the demand thereof as a drug, a food, a feed additive, etc. has been rapidly increasing in recent years.

公知技術 Ｌ−イソロイシンの工業的製造法としては、他のアミ
ノ酸の場合と同様に立体異性体が存在する為、化学合成
法ではＬ体のみの製造は困難であり、主に醗酵法により
生産が行われている。醗酵法としてはDL−α−アミノ酪
酸、スレオニン等のＬ−イソロイシンの前駆物質を使用
する方法（特公昭43−8709号、同40−2880号公報等）、
前駆物質を特に加えない所謂直接醗酵法（特公昭38−70
91号、特開昭49−93586号公報等）がある。一方酵素法
としては、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外
のＬ−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−、Ｌ−、
またはDL−α−ケト−β−メチルバレリアン酸からＬ−
イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29789号公
報）、アンモニウムイオンまたはイソロイシン以外のＬ
−若しくはDL−アミノ酸の存在下に、Ｄ−イソロイシン
あるいはＤ−アロイソロイシンの単独もしくは混合物、
又はこれらとその光学異性体との適宜混合物に作用させ
てＬ−イソロイシンを製造する方法（特公昭46−29788
号公報）、セラチア（Serratia）属細菌の固定化物を用
いてグルコースとＤ−スレオニンからＬ−イソロイシン
を製造する方法（日本醗酵工学会大会講演要旨集p.47〜
48昭和52年度）等が報告されている。しかしながらこれ
らの方法は、原料費が嵩むとか収率が低い課題を抱えて
いる。2. Description of the Related Art As an industrial method for producing L-isoleucine, it is difficult to produce only the L-isomer by a chemical synthesis method because stereoisomers exist as in the case of other amino acids. Is being done. As a fermentation method, DL-α-aminobutyric acid, a method using a precursor of L-isoleucine such as threonine (Japanese Patent Publication No. 43-8709, 40-2880, etc.),
The so-called direct fermentation method without adding any precursors (Japanese Patent Publication No. 38-70)
No. 91, JP-A-49-93586, etc.). On the other hand, as an enzymatic method, D-, L-, in the presence of L- or DL-amino acid other than ammonium ion or isoleucine,
Or from DL-α-keto-β-methylvaleric acid to L-
Method for producing isoleucine (JP-B-46-29789), ammonium ion or L other than isoleucine
-Or in the presence of DL-amino acid, D-isoleucine or D-alloisoleucine, alone or in a mixture,
Alternatively, a method for producing L-isoleucine by reacting these with an appropriate mixture of these and optical isomers thereof (Japanese Patent Publication No. 29788/46).
Japanese Unexamined Patent Application Publication), a method for producing L-isoleucine from glucose and D-threonine using an immobilization product of Serratia spp.
48 (Showa 52), etc. have been reported. However, these methods have problems that the raw material cost is high and the yield is low.

発明の要旨 本発明は、ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体の存在下、α−ケ
ト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有する
水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソロイシン
を生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法を提供するも
のである。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a biotin-requiring Brevibacterium (Br
[alpha] -ketobutyric acid or a salt thereof in the presence of a microbial cell belonging to the genus evibacterium) is enzymatically reacted with an aqueous solution containing at least ethanol to produce L-isoleucine in the solution, and L-isoleucine is collected from this. The present invention provides a method for producing L-isoleucine, which comprises:

発明の効果 本発明によれば、α−ケト酪酸又はその塩から、高収
率で効率よくＬ−イソロイシンが製造できる。本発明の
方法において、酵素反応時の水溶液として好ましく用い
られるエタノールを含有する完全合成培地は、発酵法の
場合に用いられる培地の滅菌等煩雑な操作が必要でない
ので、生産管理は容易である。Effect of the Invention According to the present invention, L-isoleucine can be efficiently produced in high yield from α-ketobutyric acid or a salt thereof. In the method of the present invention, the completely synthetic medium containing ethanol, which is preferably used as an aqueous solution at the time of the enzyme reaction, does not require complicated operations such as sterilization of the medium used in the fermentation method, and therefore production management is easy.

本発明の方法は、従来このような酵素法によるＬ−イ
ソロイシンの生産は、報告が無く又実施されてもいな
く、本発明は新規な方法である。In the method of the present invention, the production of L-isoleucine by such an enzymatic method has not been reported or practiced, and the present invention is a novel method.

発明の具体的説明 本発明に使用される微生物は、ビオチン要求性のブレ
ビバクテリウム（Brevibacterium）属に属するものであ
り、好ましくはエタノール資化性のものである。このな
かにはＬ−イソロイシン生産菌が含まれる。本発明に使
用される微生物菌体としては例えば、ブレビバクテリウ
ム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM
BP−1497）、ブレビバクテリウム・フラバム（Breviba
cterium flavum）MJ−233−AB−41（FERM BP−1498）、
ブレビバクテリウム・フラバム（Brevibacterium flavu
m）MJ−233−ABT−11（FERM BP−1500）及びブレビバク
テリウム・フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233
−ABD−21（FERM BP−1499）等であり、これらの菌が本
発明に好適に用いられる。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The microorganism used in the present invention belongs to the genus Brevibacterium that requires biotin, and is preferably ethanol-assimilating. Among these, L-isoleucine-producing bacteria are included. Examples of the microbial cells used in the present invention include Brevibacterium flavum MJ-233 (FERM).
BP-1497), Brevibacterium flavum (Breviba)
cterium flavum) MJ-233-AB-41 (FERM BP-1498),
Brevibacterium flavu
m) MJ-233-ABT-11 (FERM BP-1500) and Brevibacterium flavum MJ-233
-ABD-21 (FERM BP-1499), and such bacteria are suitably used in the present invention.

なお、上記の（FERM BP−1498）は、（FERM BP−149
7）を親株としてDL−α−アミノ酪酸耐性を積極的に付
与されたエタノール資化性微生物である（特公昭59−28
398号公報３〜４欄参照）。（FERM BP−1500）は、（FE
RM BP−1497）を親株としたＬ−α−アミノ酪酸トラン
スアミナーゼ高活性変異株である（特願昭60−190609号
明細書３〜５頁参照）。また、（FERM BP−1499）は（F
ERM BP−1497）を親株としたＤ−α−アミノ酪酸デアミ
ナーゼ高活性変異株である（特開昭61−177993号公報参
照）。In addition, the above (FERM BP-1498) is (FERM BP-149
7) is an ethanol-assimilating microorganism positively imparted with DL-α-aminobutyric acid resistance using the parent strain as a parent strain (JP-B-59-28).
No. 398, columns 3-4). (FERM BP-1500) is (FEM
RM BP-1497) as a parent strain, which is a highly active mutant of L-α-aminobutyric acid transaminase (see Japanese Patent Application No. 60-190609, pages 3 to 5). Also, (FERM BP-1499) is (F
ERM BP-1497) is a parent strain of D-α-aminobutyrate deaminase highly active mutant strain (see JP-A-61-177993).

これらの微生物菌体の他にブレビバクテリウム・アン
モニアゲネス（Brevibacterium ammoniagenes）ATCC 6
871、同ATCC 13745、同ATCC 13746、ブレビバクテリ
ウム・デバリカタム（Brevibacterium divaricatum）AT
CC 14020等を用いることもできる。In addition to these microbial cells, Brevibacterium ammoniagenes ATCC 6
871, ATCC 13745, ATCC 13746, Brevibacterium divaricatum AT
CC 14020 or the like can also be used.

本発明に用いられるビオチン要求性のブレビバクテリ
ウム属に属する微生物菌体は、微生物菌体そのままで用
いることもできるし、又これらを公知の手法で固定化し
た固定化物を使用することもできる。この固定化手法と
しては、菌体をアクリルアミド等の重合性モノマーを用
いたり、アルギン酸塩あるいはカラギーナン等の適当な
担体に不溶化させる等がある。The biotin-requiring microbial cell belonging to the genus Brevibacterium used in the present invention can be used as it is, or an immobilized product obtained by immobilizing these by a known method can be used. Examples of the immobilization method include using a polymerizable monomer such as acrylamide or insolubilizing the cells in a suitable carrier such as alginate or carrageenan.

本発明の方法に使用される上記のビオチン要求性のブ
レビバクテリウム属に属する微生物菌体の調製に使用す
る培地は、特に限定されるものではなく一般の微生物に
使用されるものでよい。中でも好ましいものは、エタノ
ールを主炭素源とする培地である。The medium used for preparing the above-mentioned biotin-requiring microorganism belonging to the genus Brevibacterium used in the method of the present invention is not particularly limited and may be one used for general microorganisms. Of these, a medium containing ethanol as a main carbon source is preferable.

本発明に使用する微生物菌体の調整に使用する培地の
窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化ア
ンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等を単独若しくは
混合して用いることが出来る。Ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea and the like can be used alone or in combination as a nitrogen source of a medium used for preparing the microbial cells used in the present invention.

無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他
に菌の生育及びＬ−イソロイシン生成に必要であれば、
ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、カザミノ酸、各種ビタミン等の栄養素を培地に添
加し用いる。As the inorganic salt, potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate and the like are used. In addition to this, if necessary for the growth of the bacteria and the production of L-isoleucine,
Nutrients such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, and various vitamins are added to the medium and used.

培養は通気撹拌、振盪等の好気的条件下で行い、培養
温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃で行う。培養途中
のpHは５〜10、好ましくは７〜８付近にて行い、培養中
のpHの調整には酸、アルカリを添加して行う。Culturing is carried out under aerobic conditions such as aeration and stirring, and the cultivation temperature is 20 to 40 ° C, preferably 25 to 35 ° C. The pH during the culturing is 5 to 10, preferably around 7 to 8. The pH during the culturing is adjusted by adding an acid or an alkali.

培養開始時のエタノール濃度は好ましくは１〜５容量
％、更に好ましくは２〜３容量％が適する。培養期間は
２〜９日間、最適期間は４〜７日間である。The ethanol concentration at the start of culture is preferably 1 to 5% by volume, more preferably 2 to 3% by volume. The culture period is 2 to 9 days, and the optimum period is 4 to 7 days.

このようにして得られた培養物から菌体を集めて、水
又は適当な緩衝液で洗浄し、本発明の方法の酵素反応に
使用する。The cells are collected from the thus obtained culture, washed with water or an appropriate buffer and used in the enzymatic reaction of the method of the present invention.

本発明の方法においては、上記で調製された微生物菌
体（ここには、その固定化物も含まれる）の存在下、α
−ケト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有
する水溶液にて酵素反応させる。ここで該水溶液に添加
されるエタノールの濃度は0.5〜40容量％、好ましくは
１〜20容量％である。In the method of the present invention, αα is added in the presence of the microbial cells prepared above (including the immobilized product thereof).
-Ketobutyric acid or a salt thereof is enzymatically reacted in an aqueous solution containing at least ethanol. Here, the concentration of ethanol added to the aqueous solution is 0.5 to 40% by volume, preferably 1 to 20% by volume.

該水溶液は、上記の様にエタノールを含有する水ある
いはリン酸又はトリス塩酸等の緩衝液を用いることもで
きるが、好ましくはエタノールを含有する完全合成培地
が用いられる。ここで完全合成培地とは、化学構造が公
知の無機窒素源及び無機塩を含有する水溶液である。本
発明に用いられる完全合成培地の無機窒素源としては、
アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝
酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等が例示でき、ま
た無機塩としては、リン酸一水素カリウム、リン酸二水
素カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、硫酸鉄
等が例示される。これらの無機窒素源、無機塩は、単独
でも２種以上混合しても用いることもできる。As the aqueous solution, water containing ethanol or a buffer solution such as phosphoric acid or tris-hydrochloric acid may be used as described above, but a completely synthetic medium containing ethanol is preferably used. Here, the completely synthetic medium is an aqueous solution containing an inorganic nitrogen source and an inorganic salt having a known chemical structure. As the inorganic nitrogen source of the completely synthetic medium used in the present invention,
Ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium phosphate and the like can be exemplified, and examples of the inorganic salt include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, iron sulfate and the like. These inorganic nitrogen sources and inorganic salts may be used alone or in admixture of two or more.

これら無機窒素源及び／又は無機塩の水溶液としての
濃度は、通常の微生物菌体の培養に使用される培地と同
程度の範囲でよく、特に限定されない。The concentration of the inorganic nitrogen source and / or the inorganic salt as an aqueous solution may be in the same range as that of a medium used for usual culture of microbial cells, and is not particularly limited.

完全合成培地の一例を示すと、（NH₄）₂SO₄ 2g/;K
H₂PO₄ 0.5g/;K₂HPO₄ 0.5g/;MgSO₄・7H₂O 0.5g/
;FeSO₄・7H₂O 20ppm/MnSO₄・４〜6H₂O 20ppm含有す
るpH7.6の水溶液がある。An example of a complete synthetic medium is (NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2g /; K
_{H 2 PO 4 0.5g /; K} 2 HPO 4 0.5g /; MgSO 4 · 7H 2 O 0.5g /
There is an aqueous solution of pH 7.6 containing 20ppm of FeSO ₄・ 7H ₂ O / MnSO ₄・ 4-6H ₂ O.

上述の様に、本発明に使用される完全合成培地には、
ビオチン又はビオチンを含む天然物は含有されない。ビ
オチンの含有されないことの明らかな化学構造公知のア
ミノ酸、ビタミン、糖類等は添加することはできる。As mentioned above, the complete synthetic medium used in the present invention includes:
It does not contain biotin or natural products containing biotin. Amino acids, vitamins, saccharides and the like, which are known to have no chemical structure and have no known biotin, can be added.

本発明の方法においては、α−ケト酪酸又はその塩の
酵素反応時の濃度には特に制限はないが、一般には0.1
〜20％（wt/vol）、好ましくは0.5〜10％（wt/vol）の
濃度範囲で使用するのが適当である。又、該菌体の使用
量も特に制限されるものではないが、一般に１〜50％
（wt/vol）の濃度で使用することが出来る。In the method of the present invention, the concentration of α-ketobutyric acid or a salt thereof during the enzyme reaction is not particularly limited, but is generally 0.1.
It is suitable to use in a concentration range of -20% (wt / vol), preferably 0.5-10% (wt / vol). The amount of the bacterial cells used is not particularly limited, but is generally 1 to 50%.
It can be used at a concentration of (wt / vol).

本発明において、酵素反応は、約20〜約50℃、好まし
くは約30〜約40℃の温度で、通常約10〜約72時間行われ
る。In the present invention, the enzymatic reaction is carried out at a temperature of about 20 to about 50 ° C, preferably about 30 to about 40 ° C, usually for about 10 to about 72 hours.

上記酵素反応は、反応に用いられるエタノールを含有
する水溶液、好ましくは上述のエタノールを含有する完
全合成培地、中の溶存酸素濃度が0.05ppm以上、8ppm以
下となる様に、反応系中に空気もしくは酸素を、連続又
は間歇的に供給して行うのが好ましい。The enzyme reaction is an aqueous solution containing ethanol used in the reaction, preferably a completely synthetic medium containing ethanol as described above, so that the concentration of dissolved oxygen in the reaction mixture is 0.05 ppm or more and 8 ppm or less, air or air in the reaction system. It is preferable to supply oxygen continuously or intermittently.

上記のような反応方法によつて得られる反応液中に生
成したＬ−イソロイシンの分離・精製は、公知のイオン
交換樹脂処理法あるいは、沈殿法等により行うことがで
きる。Separation and purification of L-isoleucine produced in the reaction solution obtained by the above reaction method can be performed by a known ion exchange resin treatment method or a precipitation method.

実施例 以下の実験例において、Ｌ−イソロイシンの定性は、
ペーバークロマトグラフのRf値、電気泳動法の移動度、
微生物定量法による生物活性値により確認した。定量は
ロイコノストツク・メセンテロイデス（Leuconostoc me
senteroides）ATCC 8042を用いるマイクロバイオアツ
セイ法と高速液体クロマトグラフイー（島津LC−5A）と
を併用して行つた。また、下記の実験例において％と表
したのは重量％を意味する。Examples In the following experimental examples, the qualitative characteristics of L-isoleucine are as follows.
Rf value of paver chromatograph, mobility of electrophoresis method,
It was confirmed by the biological activity value by the microorganism determination method. Quantification was performed using Leuconostoc mesenroides
The microbioassay method using ATCC 8042 and high performance liquid chromatography (Shimadzu LC-5A) were used together. Further, in the following experimental examples, "%" means "% by weight".

実施例−１ 培地（尿素0.4％、硫酸アンモニウム1.4％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、CaCl₂・
2H₂O 2ppm、FeSO₄・7H₂O 2ppm、MnSO₄・４〜6H₂O 2pp
m、ZnSO₄・7H₂O 2ppm、NaCl 2ppm、ビオチン200μg/
、チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.1％、酵母
エキス0.1％）100mlを500ml容三角フラスコに分注、滅
菌（滅菌後pH7.0）した後ブレビバクテリウム・フラバ
ム（Brevibacterium flavum）MJ−233（FERM BP−149
7）を植菌し、無菌的にエタノールを2ml加え、30℃にて
２日間振盪培養を行つた。Example-1 medium (0.4% urea, 1.4% ammonium sulfate, KH ₂ PO _{4
0.05%, K 2 HPO 4 0.05} %, MgSO 4 · 7H 2 O 0.05%, CaCl 2 ·
_{2H 2 O 2ppm, FeSO 4 ·} 7H 2 O 2ppm, MnSO 4 · 4~6H 2 O 2pp
_{m, ZnSO 4 · 7H 2 O} 2ppm, NaCl 2ppm, biotin 200 [mu] g /
, Thiamine / HCl 100 μg /, casamino acid 0.1%, yeast extract 0.1%) 100 ml was dispensed into a 500 ml Erlenmeyer flask, sterilized (pH 7.0 after sterilization), and then Brevibacterium flavum MJ-233 ( FERM BP-149
7) was inoculated, and 2 ml of ethanol was aseptically added thereto, followed by shaking culture at 30 ° C. for 2 days.

次に、本培養培地（硫酸アンモニウム2.3％、KH₂PO₄
0.05％、K₂HPO₄ 0.05％、MgSO₄・7H₂O 0.05％、FeSO₄・
7H₂O 20ppm、MnSO₄・nH₂O 20ppm、ビオチン200μg/、
チアミン・HCl 100μg/、カザミノ酸0.3％、酵母エキ
ス0.3％）の1000mlの２容通気撹拌槽に仕込み、滅菌
（120℃、20分間）後、エタノールの20mlと前記前培養
物の20mlを添加して、回転数1000rpm、通気量1vvm、温
度33℃pH7.6にて48時間培養を行つた。Next, the main culture medium (ammonium sulfate 2.3%, KH ₂ PO ₄
0.05%, K ₂ HPO ₄ 0.05%, MgSO ₄・ 7H ₂ O 0.05%, FeSO ₄・
7H ₂ O 20ppm, MnSO ₄・ nH ₂ O 20ppm, biotin 200μg /,
Thiamine / HCl 100 μg /, casamino acid 0.3%, yeast extract 0.3%) was placed in a 1000 ml 2-volume aeration stirring tank, sterilized (120 ° C., 20 minutes), and then 20 ml of ethanol and 20 ml of the preculture were added. Then, the culture was performed for 48 hours at a rotation speed of 1000 rpm, an aeration rate of 1 vvm, and a temperature of 33 ° C and pH 7.6.

尚、エタノールは、培養中培地の温度が２容量％を越
えないように、約１〜２時間ごと断続的に添加した。In addition, ethanol was intermittently added about every 1 to 2 hours so that the temperature of the culture medium did not exceed 2% by volume.

培養終了後、培養物500mlから遠心分離にて集菌し
た。これを脱塩蒸留水にて２度洗浄して得た菌体を、反
応液〔（NH₄）₂SO₄ 2g/;KH₂PO₄ 0.5g/;KH₂PO₄ 0.5g
/;MgSO₄・7H₂O 0.5g/;FeSO₄・7H₂O、20ppm;MnSO₄・
４〜6H₂O 20ppm;チアミン−塩酸100μg/、α−ケト酪
酸ソーダ10g/（pH7.6）〕の1000mlに懸濁後、該懸濁
液を２容通気撹拌槽に仕込み、エタノール20mlを添加
して、回転数300rpm、通気量を第１表に示すように変化
させ、温度33℃、pH7.6にて15時間反応を行つた。After completion of the culture, the cells were collected from 500 ml of the culture by centrifugation. The cells were washed twice with demineralized distilled water to obtain a reaction solution [(NH ₄ ) ₂ SO ₄ 2g /; KH ₂ PO ₄ 0.5g /; KH ₂ PO ₄ 0.5g
_{/; MgSO 4 · 7H 2 O} 0.5g /; FeSO 4 · 7H 2 O, 20ppm; MnSO 4 ·
4-6H ₂ O 20 ppm; thiamine-hydrochloric acid 100 μg /, α-sodium ketobutyrate 10 g / (pH 7.6)] in 1000 ml, and then suspending the suspension in a 2-volume aeration and stirring tank, and adding 20 ml of ethanol. Then, the number of revolutions was changed to 300 rpm, the aeration amount was changed as shown in Table 1, and the reaction was carried out at a temperature of 33 ° C. and pH 7.6 for 15 hours.

反応終了後、遠心分離（4000rpm、15分間、４℃）に
て除菌した上清液中のＬ−イソロイシンを定量した。結
果を第１表に示した。After the completion of the reaction, L-isoleucine in the supernatant liquid was removed by centrifugation (4000 rpm, 15 minutes, 4 ° C.), and the amount was determined. The results are shown in Table 1.

実施例−２ 実施例−１と同様の条件にて、ブレビバクテリウム・
フラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−AB−41
（FERM BP−1498）を培養し、また実施例−１と同様の
条件にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定
量した。結果を第２表に示した。 Example 2 Under the same conditions as in Example 1, Brevibacterium
Flavum (Brevibacterium flavum) MJ-233-AB-41
(FERM BP-1498) was cultured and reacted under the same conditions as in Example 1, and then L-isoleucine in the supernatant was quantified. The results are shown in Table 2.

実施例−３ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABT−11（F
ERM BP−1500）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。結果を第３表に示した。 Example 3 Under the same conditions as in Example 1, Brevibacterium flavum MJ-233-ABT-11 (F
ERM BP-1500) was cultured and reacted under the same conditions as in Example-1, and then L-isoleucine in the supernatant was quantified. The results are shown in Table 3.

実施例−４ 実施例−１と同様の条件にてブレビバクテリウム・フ
ラバム（Brevibacterium flavum）MJ−233−ABD−21（F
ERM BP−1499）を培養し、また実施例−１と同様の条件
にて反応させた後上清液中のＬ−イソロイシンを定量し
た。結果を第４表に示した。 Example-4 Under the same conditions as in Example-1, Brevibacterium flavum MJ-233-ABD-21 (F
ERM BP-1499) was cultured and reacted under the same conditions as in Example-1, and then L-isoleucine in the supernatant was quantified. The results are shown in Table 4.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 小浜 恵子 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 (72)発明者 湯川 英明 茨城県稲敷郡阿見町中央８丁目３番１号 三菱油化株式会社中央研究所内 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (72) Keiko Obama 3-3-1 Chuo, Ami-cho, Inashiki-gun, Ibaraki Prefecture Central Research Laboratory, Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd. (72) Hideaki Yukawa 8 Chuo, Ami-cho, Inashiki-gun, Ibaraki Prefecture 3-1-1, Central Research Laboratory, Mitsubishi Petrochemical Co., Ltd.

Claims (3)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ビオチン要求性のブレビバクテリウム（Br
evibacterium）属に属する微生物菌体の存在下、α−ケ
ト酪酸又はその塩を、少なくともエタノールを含有する
水溶液にて酵素反応させて該溶液中にＬ−イソロイシン
を生成せしめ、これからＬ−イソロイシンを採取するこ
とを特徴とするＬ−イソロイシンの製造法。1. A Brevibacterium which requires biotin.
[alpha] -ketobutyric acid or a salt thereof in the presence of a microbial cell belonging to the genus evibacterium) is enzymatically reacted with an aqueous solution containing at least ethanol to produce L-isoleucine in the solution, and L-isoleucine is collected from this. A method for producing L-isoleucine, which comprises: 【請求項２】少なくともエタノールを含有する水溶液
が、エタノールを含有する完全合成培地である特許請求
の範囲第１項記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the aqueous solution containing at least ethanol is a completely synthetic medium containing ethanol. 【請求項３】酵素反応を該水溶液中の溶存酸素濃度が0.
05ppm以上となる様に保持して行うことを特徴とする特
許請求の範囲第１項又は第２項記載の方法。3. The enzymatic reaction is carried out at a dissolved oxygen concentration of 0.
The method according to claim 1 or 2, characterized in that the method is carried out while maintaining the concentration to be at least 05 ppm.