JPH078279A - コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Abstract
ンテロトキシン(コレラ毒素、CT)の遺伝子(以下、
ctx 遺伝子) を遺伝子を検出することを目的とする。 【構成】 コレラ菌の産生するctx 遺伝子と選択的にハ
イブリダイズするオリゴヌクレオチド(配列番号1〜
4)を作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こすコレラ菌の
ctx 遺伝子のみを選択的に検出することを特徴としてい
る。
Description
定伝染病にかかる検査、あるいは検疫業務におけるコレ
ラ菌、およびctx 遺伝子の検出に関するものである。
患者の糞便、食品、または患者の周辺環境から採取され
た水(飲料水、河川水、および海水等)および底泥であ
る。これらの検体からコレラ菌を検出し、同定しようと
する場合、一次増菌培養、二次増菌培養、分離培養を経
て抗 V. cholerae O1 血清による凝集反応試験、および
確認培養に至る操作を行う必要がある。
養段階に要する時間は、それぞれ18〜24時間であ
り、総所要時間にすると約4日間となり、非常に長時間
である。確認培養における生化学試験では、オキシダー
ゼ試験陽性、インドール試験陽性、運動性試験、リジン
脱炭酸試験陽性等の諸性状を調べる必要がある。これら
の試験は操作も煩雑で、時間や費用もかかり、結果の判
定が困難な場合もある。
ロトキシン産生性を試験することが、防疫対策上、行政
処置を行うためには必要な処置である。しかし、市販の
簡便試薬キットを使用しても、結果を得るまで18〜2
0時間を要し、迅速性に欠け、実効的でもない。
いたDNAプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、あるい
は他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これ
を検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選
択性を得るのが難しい。
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、コレラ菌の ctx遺伝子を検出するもので、
臨床検査、とりわけ伝染病にかかる検査における、簡
便、迅速、かつ高感度なコレラ菌の検査法を提供するこ
とにある。
tx遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用いて、コレラ症状の原因物質である
エンテロトキシンを産生するコレラ菌のみを選択的に検
出することを特徴としている。
以下の配列群の少なくとも連続した10塩基以上 (5’)d−TGATGAAATAAAGCAGTCAGGT−(3’)・ ・・(a:配列番号1) (5’)d−ACAGAGTGAGTACTTTGACC−(3’)・・・ ・・(b:配列番号2) (5’)d−GGCACTTCTCAAACTAATTGAG−(3’)・ ・・(c:配列番号3) (5’)d−ATACCATCCATATATTTGGGAG−(3’)・ ・・(d:配列番号4) または対応する相補的配列からなることを特徴とする。
Polymerase Chain Reaction 法(以下、PCR法と略す
る;Science 230, 1350(1985) )をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域(本発明
の場合は、コレラ菌の ctx遺伝子)を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は+鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により1本鎖状態にした
試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した2本鎖核酸を再び1
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで、2つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をPCRの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればPCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCRを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るコレラ菌の ctx遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、50塩基から2, 000塩基、望ましくは、
100塩基から1, 000塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性DNAポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については90〜9
5℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。熱変性の温度は90〜95℃、プライマーをハ
イブリダイズさせるアニーリング操作の温度は37〜6
5℃、重合反応は50〜75℃で、これを1サイクルと
したPCRを20から42サイクル行って増幅させる。
検出はPCRを終えた反応液をそのままアガロースゲル
電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片
の存在、およびその長さを確認できる。その結果から検
体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌクレオチ
ドが存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままctx 遺伝子をもつコレラ菌の有無を判
定するものとなる。
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記配列の1つを有するオリゴヌクレオチド
をプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持
体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出しても良
い。
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
いて、コレラ症状の原因物質であるエンテロトキシンを
産生するコレラ菌のみを選択的に検出する。
ッポン)、港湾および河川水等の環境水から由来したも
ので、総計622株を用いた。これらの菌株の血清型、
生物型の判別および菌株数内訳は、表1に示すとおりで
ある。
エクストラクト、および1%塩化ナトリウム)に接種
し、37℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行っ
た。各菌株培養液を10mMトリス−塩酸緩衝液pH
7. 5(以下TE緩衝液)で10倍に希釈し、95℃で
10分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。
(Lockman, H. and J.B. Kaper:J. Biol. Chem. 258, 1
3722-13726(1983) )から、請求項第1項に示した(a)
から(d) までの各配列を選び、それと同じ配列を持つオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイク
ロンプラスDNA合成装置(ミリジェン/バイオリサー
チ社製)を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト
法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製は
C18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで
行った。
μl、10x反応用緩衝液3μl,dNTP溶液4. 8
μl、プライマー(1) 1. 0μl、プライマー(2) 1.
0μl、および耐熱性DNAポリメラーゼ0.15μl
を加えて、全量30μlの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA 社製)を50
μl加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl2 ,0.1%(w/V) ゼラチン dNTP溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液(濃度3.75 OD/ ml ) プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に示した組合せで使用した 。 プライマー(1) プライマー(2) (a) (c) (b) (d) 耐熱性DNAポリメラーゼ: TaqDNAポリメラーゼ
(5 unit/ml;Perkin Elmer Cetus社製)。
1サイクル(所要時間5.7 分)とし、これを35サイク
ル(総所要時間約3時間)行った。これらの操作は、D
NAサーマルサイクラー(Perkin Elmer Cetus社製)に
上記反応条件をプログラムして行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
し、臭化エチジウム( 0.5μg/ml)を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧100V、30分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第2版(1989)に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。
r, J. B., J. G. Morris, Jr.,and M. Nishibuchi.(198
8) DNA probes for pathogenic Vibrio species, 65-7
7. In F. C. Tenover(ed), DNA probes for infectious
diseases. CRCPress, Inc., Boca Raton,Fla.)を用い
て、Grunstein らの方法(Grunstein, M. and Hogness,
D., Proc. Natl. Acad. Sci, 72, 3961(1975))にした
がって行った。結果 前述したようにコレラ菌の ctx遺伝子は、すでに塩基配
列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわち、プライマーがPCRにより増幅させるヌクレオ
チドの大きさは容易に推定できる。それによるとプライ
マー(a) と(c)の組合せを用いた場合には、169塩基
(または169塩基対)の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。下に、本発明のプライマーの組合
せについて、増幅ヌクレオチドの長さ(推定値)をまと
めて記載した(各数字の単位は塩基を示す)。
した場合、各プライマーの組合せは、ctx 遺伝子中の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株は ctx遺伝子を有していると判断した。被検菌株66
2株で調べた結果を表2に示す。各プライマーの組合せ
は、コロニーハイブリダイゼーション試験で、ctx 遺伝
子陽性と判断された菌株DNAのみを増幅し、ctx 遺伝
子陰性の菌株DNAとは全く反応しなかった。
x 遺伝子をもつコレラ菌を正確に検出していることを示
している。また、表2に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。
レラ菌株の由来、血清型、および生物型の違いに関係な
く、ctx 遺伝子の有無を的確に捕捉していることをも示
している。なお、図1中の各レーンは、次の菌株の熱抽
出サンプルを鋳型DNA溶液として使用したものを示
す。
川型,コレラ毒素遺伝子陽性株)、 レーン4〜6;コレラ菌(エルトール・稲葉型,コレラ
毒素遺伝子陽性株) レーン7;コレラ菌(古典・小川型,コレラ毒素遺伝子
陽性株) レーン8;コレラ菌(古典・稲葉型,コレラ毒素遺伝子
陽性株) レーン9〜10;コレラ菌(non-O1,コレラ毒素遺伝
子陽性株) レーン11;コレラ菌(エルトール・小川型,コレラ毒
素遺伝子陰性株) レーン12;コレラ菌(エルトール・稲葉型,コレラ毒
素遺伝子陰性株) レーン13;毒素原性大腸菌(易熱性エンテロトキシン
遺伝子陽性株)
tx遺伝子をもつコレラ菌に対して、選択的なものかどう
かを確かめるため、臨床検査において検査対象となる、
コレラ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調
製法を除いて、実施例1で示したものと同じである。
し、37℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った(このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である)。各菌株培養液0. 5m
lから遠心操作により、菌体を回収し、TE緩衝液で菌
体を1回洗浄した。
5に溶解したN- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が50μg/m
l、および1mg/mlとなるように加え、37℃で1
0分間処理し、溶菌した。TE緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液(混合比
1:1)を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を1mlのTE緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来DNA(Human placen
ta DNA)は、1μg/mlの濃度のものを調製し、これ
も同様にPCRを行わせた。
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌DN
Aをはじめとする種々のDNA全てについて、それらの
DNAを増幅することはなかった。
ライマーは、ctx 遺伝子をもつコレラ菌にのみ、選択的
に反応するものと断言できる。表2に掲載されなかった
残りの各組合せについても同様な試験結果が得られた。
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、100塩基
(または100塩基対)以下の長さのヌクレオチドであ
れば、5から10塩基(塩基対)、また、100から5
00塩基(塩基対)の範囲のヌクレオチドであれば、1
0から20塩基(塩基対)のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ctx 遺伝子の選択的検出における信頼度
は、さらに高まるものと考えられる。
よびコレラの病原因子であるエンテロトキシン(コレラ
毒素)の遺伝子(ctx 遺伝子)を標的とするプライマー
を用いたことにより、ctx 遺伝子を有するコレラ菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、2
つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性とが得られる。
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間3時間、検出にかかる操作が3
0分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。
切な治療と防疫措置のために、遅滞のない正確な結果が
要求される。また、コレラの病原体とされる真性コレラ
菌であるかどうかは、病原体とみなされた菌株が、血清
型O1に該当する菌であるかどうかで判定されていた。
い菌(Vibrio cholerae non O1)においても、血清型O
1の菌と同じコレラ毒素を産生し、コレラ症状を発現さ
せていることが多数報告されてきている。このような菌
に対しては、血清型を調べることは無意味となり、その
菌株がコレラ毒素の産生能を有しているかどうかを調べ
ることこそ必要となる。本発明は、コレラの病原因子で
あるコレラ毒素をコードしている ctx遺伝子を選択的に
検出するものである。したがって、本発明により、コレ
ラの病原体としてのコレラ菌の検出を正確に行うことが
可能となる。
AGGT
CC
TGAG
TGGGAG
Claims (2)
- 【請求項1】 検体中に存在するコレラ菌(Vibrio cho
lerae )の産生するエンテロトキシン(コレラ毒素、C
T)の遺伝子(以下、ctx 遺伝子) をコードするヌクレ
オチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的
となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくとも連続
した10塩基以上 (5’)d−TGATGAAATAAAGCAGTCAGGT−(3’)・ ・・(a:配列番号1) (5’)d−ACAGAGTGAGTACTTTGACC−(3’)・・・ ・・(b:配列番号2) (5’)d−GGCACTTCTCAAACTAATTGAG−(3’)・ ・・(c:配列番号3) (5’)d−ATACCATCCATATATTTGGGAG−(3’)・ ・・(d:配列番号4) または対応する相補的配列からなることを特徴とするコ
レラ菌検出用オリゴヌクレオチド。 - 【請求項2】 請求項第1項に記載された配列のうち、
少なくとも1つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応
のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 (a) 検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、4種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b) 得られた2本鎖の標的ヌクレオチド配列を1本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (c) これら2種のプライマーによるハイブリダイゼ−シ
ョンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が
増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 (d) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでコレラ菌の検出を行う
ことを特徴とするコレラ菌の検出方法。
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JP05143180A JP3134907B2 (ja) | 1993-06-15 | 1993-06-15 | コレラ菌検出用オリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
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