JPH078279A - Oligonucleotide for detection of vibriocholerae and detection thereby - Google Patents

Abstract

PURPOSE:To provide a detection method of the enterotoxin-producing gene (ctx gene) produced by Vibriocholerae. CONSTITUTION:An oligonucleotide (arrangement number 1-4) which selectively hybridizes with ctx gene produced by Vibriocholerae is prepared. Ctx genes of Vibriocholerae which cause alimentary intoxication are selectively detected by the use of the oligonucleotide as a primer for the gene amplification.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ法
定伝染病にかかる検査、あるいは検疫業務におけるコレ
ラ菌、およびctx 遺伝子の検出に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to the detection of cholera and ctx genes in clinical tests, particularly tests related to legal infectious diseases, or quarantine work.

【０００２】[0002]

【従来の技術】コレラ菌にかかる検査では、検査材料は
患者の糞便、食品、または患者の周辺環境から採取され
た水（飲料水、河川水、および海水等）および底泥であ
る。これらの検体からコレラ菌を検出し、同定しようと
する場合、一次増菌培養、二次増菌培養、分離培養を経
て抗 V. cholerae O1 血清による凝集反応試験、および
確認培養に至る操作を行う必要がある。2. Description of the Related Art In the test for cholera bacteria, test materials are feces of the patient, food, or water (drinking water, river water, seawater, etc.) and bottom mud collected from the environment surrounding the patient. When detecting and identifying Vibrio cholerae from these specimens, the operations including primary enrichment culture, secondary enrichment culture, isolation culture, agglutination test with anti- V. Cholerae O1 serum, and confirmation culture are performed. There is a need.

【０００３】[0003]

【発明が解決しようとする課題】ところが、これらの培
養段階に要する時間は、それぞれ１８〜２４時間であ
り、総所要時間にすると約４日間となり、非常に長時間
である。確認培養における生化学試験では、オキシダー
ゼ試験陽性、インドール試験陽性、運動性試験、リジン
脱炭酸試験陽性等の諸性状を調べる必要がある。これら
の試験は操作も煩雑で、時間や費用もかかり、結果の判
定が困難な場合もある。However, the time required for each of these culture steps is 18 to 24 hours, and the total required time is about 4 days, which is a very long time. In the biochemical test in confirmation culture, it is necessary to examine various properties such as oxidase test positive, indole test positive, motility test, lysine decarboxylation test positive and the like. These tests are cumbersome to operate, time-consuming and expensive, and it may be difficult to judge the results.

【０００４】また、コレラ菌の場合、分離菌株のエンテ
ロトキシン産生性を試験することが、防疫対策上、行政
処置を行うためには必要な処置である。しかし、市販の
簡便試薬キットを使用しても、結果を得るまで１８〜２
０時間を要し、迅速性に欠け、実効的でもない。In the case of Vibrio cholerae, it is necessary to test the isolated strain for enterotoxin productivity in order to take administrative measures in terms of epidemic prevention measures. However, even if a commercially available simple reagent kit is used, it takes 18 to 2
It takes zero hours, lacks swiftness, and is not effective.

【０００５】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより、膜上、あるい
は他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これ
を検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選
択性を得るのが難しい。On the other hand, recently, a DNA probe method or a hybridization method using an oligonucleotide has been tried. However, it is difficult to obtain sufficient detection sensitivity and selectivity in a bacterial test when hybridization is carried out on a membrane or on another support by using a probe labeled with an oligonucleotide and detected.

【０００６】そこで、本発明は、オリゴヌクレオチドを
核酸合成反応のプライマーとして機能させる遺伝子増幅
技術により、コレラ菌の ctx遺伝子を検出するもので、
臨床検査、とりわけ伝染病にかかる検査における、簡
便、迅速、かつ高感度なコレラ菌の検査法を提供するこ
とにある。Therefore, the present invention detects the ctx gene of Vibrio cholerae by a gene amplification technique in which an oligonucleotide functions as a primer for a nucleic acid synthesis reaction.
It is to provide a simple, rapid, and highly sensitive test method for cholera bacteria in clinical tests, particularly tests for infectious diseases.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明は、コレラ菌の c
tx遺伝子と選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオ
チドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマーと
して遺伝子増幅に用いて、コレラ症状の原因物質である
エンテロトキシンを産生するコレラ菌のみを選択的に検
出することを特徴としている。The present invention is directed to the c . Of Vibrio cholerae.
It is characterized by producing an oligonucleotide that selectively hybridizes with the tx gene and using this oligonucleotide as a primer for gene amplification to selectively detect only the cholera bacterium that produces enterotoxin that is the causative agent of cholera symptoms. I am trying.

【０００８】ここで、使用するオリゴヌクレオチドは、
以下の配列群の少なくとも連続した１０塩基以上 （５’）ｄ−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴ−（３’）・ ・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣ−（３’）・・・ ・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とする。The oligonucleotide used here is
At least 10 consecutive bases of the following sequence group or more (5 ') d-TGATGAAATAAAAGCAGTCAGGT- (3') ... (a: SEQ ID NO: 1) (5 ') d-ACAGAGTGAGACTTTTGACC- (3') ... (B: SEQ ID NO: 2) (5 ′) d-GGCACTTTCTCAAACTTAATTGAG- (3 ′) ··· (c: SEQ ID NO: 3) (5 ′) d-ATACCATCCATATAATTTGGGAG- (3 ′) ··· (d: SEQ ID NO: 4 ) Or corresponding complementary sequences.

【０００９】また、遺伝子増幅は、Saiki らが開発した
Polymerase Chain Reaction 法（以下、ＰＣＲ法と略す
る；Science 230, 1350(1985) ）をもとに行っている。
この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発明
の場合は、コレラ菌の ctx遺伝子）を検出する場合、そ
の領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれぞれ認
識してハイブリダイゼーションするようなオリゴヌクレ
オチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態にした
試料核酸に対し、鋳型依存性ヌクレオチド重合反応のプ
ライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再び１
本鎖に分離し、再び同様な反応を起こさせる。この一連
の操作を繰り返すことで、２つのプライマーに挟まれた
領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。Gene amplification was developed by Saiki et al.
It is performed based on the Polymerase Chain Reaction method (hereinafter abbreviated as PCR method; Science 230, 1350 (1985)).
When detecting a specific nucleotide sequence region (in the present invention, the ctx gene of Vibrio cholerae), this method recognizes a + strand on one side and a strand on the other side, and hybridizes. To prepare a double-stranded nucleic acid, which is used as a primer for a template-dependent nucleotide polymerization reaction with respect to a sample nucleic acid that has been converted into a single-stranded state by heat denaturation.
It separates into main chains and the same reaction occurs again. By repeating this series of operations, the number of copies in the region between the two primers increases before it can be detected.

【００１０】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。これら材料をＰＣＲの試料としてもちいる
には、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる
操作が前処理として必要となる。 しかし、プライマー
がハイブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上
存在すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界
面活性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを
進行させるに十分な核酸量を持った試料液が調製でき
る。The specimen may be a clinical test material such as feces, urine, blood, tissue homogenate, or a food material. In order to use these materials as a PCR sample, an operation of releasing nucleic acid components from the bacterial cells present in the materials is required as a pretreatment. However, PCR will proceed if the nucleic acid to which the primer can hybridize exists from several molecules to several tens of molecules or more, so that simply treating the test material with a lytic enzyme, a surfactant, an alkali, etc. for a short time is sufficient for the PCR to proceed. A sample solution having an amount of nucleic acid can be prepared.

【００１１】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。プライマーが規定してい
るコレラ菌の ctx遺伝子のヌクレオチド配列における増
幅領域は、５０塩基から２, ０００塩基、望ましくは、
１００塩基から１, ０００塩基となればよい。鋳型依存
性ヌクレオチド重合反応には、耐熱性ＤＮＡポリメラー
ゼを用いているが、この酵素の起源については９０〜９
５℃の温度で活性を保持していれば、どの生物種由来で
もよい。熱変性の温度は９０〜９５℃、プライマーをハ
イブリダイズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６
５℃、重合反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルと
したＰＣＲを２０から４２サイクル行って増幅させる。
検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままアガロースゲル
電気泳動にかけることで、増幅されたヌクレオチド断片
の存在、およびその長さを確認できる。その結果から検
体中にプライマーが認識すべき配列を持ったヌクレオチ
ドが存在しているかどうか判定することができる。この
判定は、そのままctx 遺伝子をもつコレラ菌の有無を判
定するものとなる。The oligonucleotide used as a primer in the present invention is a nucleotide fragment having a length of 10 bases or more, preferably 15 bases or more, in view of selectivity, detection sensitivity and reproducibility. either will do. Further, the primer does not have to be labeled particularly for detection. The amplification region in the nucleotide sequence of the ctx gene of Vibrio cholerae defined by the primer is 50 to 2,000 bases, preferably
It may be 100 bases to 1,000 bases. A thermostable DNA polymerase is used in the template-dependent nucleotide polymerization reaction, and the origin of this enzyme is 90 to 9
It may be derived from any species as long as it retains its activity at a temperature of 5 ° C. The temperature of heat denaturation is 90 to 95 ° C, and the temperature of the annealing operation for hybridizing the primers is 37 to 6
The polymerization reaction is carried out at 5 ° C. and 50 to 75 ° C., and PCR is performed for 20 to 42 cycles with this as one cycle for amplification.
For detection, the presence of the amplified nucleotide fragment and its length can be confirmed by subjecting the reaction solution after completion of PCR to agarose gel electrophoresis as it is. From the result, it can be determined whether or not a nucleotide having a sequence to be recognized by the primer is present in the sample. This determination directly determines the presence or absence of V. cholerae having the ctx gene.

【００１２】増幅されたヌクレオチド断片の検出には、
その他の電気泳動法やクロマトグラフィーも有効であ
る。また、上記配列の１つを有するオリゴヌクレオチド
をプローブとして機能させ、膜上、あるいはその他支持
体上の標的ヌクレオチド配列を選択的に検出しても良
い。For detection of the amplified nucleotide fragment,
Other electrophoresis methods and chromatography are also effective. Alternatively, an oligonucleotide having one of the above sequences may function as a probe to selectively detect the target nucleotide sequence on the membrane or other support.

【００１３】[0013]

【作用】本発明では、コレラ菌の ctx遺伝子と選択的に
ハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを作製し、この
オリゴヌクレオチドをプライマーとして遺伝子増幅に用
いて、コレラ症状の原因物質であるエンテロトキシンを
産生するコレラ菌のみを選択的に検出する。In the present invention, an oligonucleotide that selectively hybridizes with the ctx gene of Vibrio cholerae is produced, and this oligonucleotide is used as a primer for gene amplification to produce enterotoxin which is a causative agent of cholera symptoms. Only selectively detect.

【００１４】[0014]

【実施例】【Example】

（実施例１）検体の調製 使用したコレラ菌は、コレラ患者、海産食物（エビ、ス
ッポン）、港湾および河川水等の環境水から由来したも
ので、総計６２２株を用いた。これらの菌株の血清型、
生物型の判別および菌株数内訳は、表１に示すとおりで
ある。(Example 1) Preparation of specimen The cholera bacteria used were derived from cholera patients, marine foods (shrimp, terrapin), environmental water such as harbor and river water, and a total of 622 strains were used. Serotypes of these strains,
The biotype discrimination and the number of strains are shown in Table 1.

【００１５】[0015]

【表１】 各菌株をＬＢ培地（１％トリプトン、０. ５％イースト
エクストラクト、および１％塩化ナトリウム）に接種
し、３７℃、好気的条件下で、終夜振とう培養を行っ
た。各菌株培養液を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液ｐＨ
７. ５（以下ＴＥ緩衝液）で１０倍に希釈し、９５℃で
１０分間の加熱処理を行った後、これらを遠心し、その
上清を検体とした。[Table 1] Each strain was inoculated into LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, and 1% sodium chloride) and shake-cultured overnight at 37 ° C under aerobic conditions. 10 mM Tris-HCl buffer pH of each strain culture solution
After diluting 10 times with 7.5 (hereinafter, TE buffer solution) and performing heat treatment at 95 ° C. for 10 minutes, these were centrifuged and the supernatant was used as a sample.

【００１６】プライマーの合成 コレラ菌のコレラ毒素遺伝子（ctx 遺伝子）の塩基配列
（Lockman, H. and J.B. Kaper:J. Biol. Chem. 258, 1
3722-13726(1983) ）から、請求項第１項に示した(a)
から(d) までの各配列を選び、それと同じ配列を持つオ
リゴヌクレオチドを化学合成した。化学合成は、サイク
ロンプラスＤＮＡ合成装置（ミリジェン／バイオリサー
チ社製）を用い、β−シアノエチルフォスホアミダイト
法により行った。合成したオリゴヌクレオチドの精製は
Ｃ18逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーで
行った。 Synthesis of primer Nucleotide sequence of cholera toxin gene ( ctx gene) of Vibrio cholerae (Lockman, H. and JB Kaper: J. Biol. Chem. 258, 1
3722-13726 (1983)), and (a) shown in claim 1
Each sequence from (d) to (d) was selected, and an oligonucleotide having the same sequence was chemically synthesized. The chemical synthesis was performed by a β-cyanoethylphosphoramidite method using a cyclone plus DNA synthesizer (Milligen / Bioresearch). Purification of the synthesized oligonucleotide was performed by high performance liquid chromatography using a C18 reverse phase column.

【００１７】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌蒸留水１７. ０５
μｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ，ｄＮＴＰ溶液４. ８
μｌ、プライマー(1) １. ０μｌ、プライマー(2) １.
０μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．１５μｌ
を加えて、全量３０μｌの反応液を調製した。この反応
液の入った容器にミネラルオイル（SIGMA 社製）を５０
μｌ加え、反応液上に重層した。各使用した溶液の内
容、およびプライマー(1) と(2) の組合せは、次のとお
りである。 PCR Using 3 μl of the above-mentioned sample liquid, sterile distilled water 17.0
μl, 10 × reaction buffer 3 μl, dNTP solution 4.8
μl, primer (1) 1.0 μl, primer (2) 1.
0 μl, and thermostable DNA polymerase 0.15 μl
Was added to prepare a reaction solution having a total volume of 30 μl. 50 containers of mineral oil (SIGMA) in this reaction solution
μl was added and overlaid on the reaction solution. The contents of each solution used and the combination of primers (1) and (2) are as follows.

【００１８】10x 反応用緩衝液: 500mM KCl, 100mM Tri
s-HCl pH8.3, 15mM MgCl₂ ,0.1%(w/V) ゼラチン ｄＮＴＰ溶液: dATP, dCTP, dGTP, dTTPを混合させたも
ので各終濃度が1.25mM プライマー(1) および(2): 前述した化学合成精製品の
水溶液（濃度3.75 OD/ ml ） プライマーの組合せ: 前述の化学合成精製品を下表に示した組合せで使用した 。 プライマー(1) プライマー(2) (a) (c) (b) (d) 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ: ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（5 unit/ml;Perkin Elmer Cetus社製）。10x reaction buffer: 500 mM KCl, 100 mM Tri
_{s-HCl pH8.3, 15mM MgCl 2} , 0.1% (w / V) gelatin dNTP solution: dATP, dCTP, dGTP, each final concentration that is mixed with dTTP 1.25 mM Primer (1) and (2): Aqueous solution of above-mentioned chemically synthesized product (concentration: 3.75 OD / ml) Primer combination: The above chemically synthesized product was used in the combination shown in the table below. Primer (1) Primer (2) (a) (c) (b) (d) Thermostable DNA polymerase: Taq DNA polymerase (5 unit / ml; manufactured by Perkin Elmer Cetus).

【００１９】反応条件は、次のとおりである。The reaction conditions are as follows.

【００２０】熱変性：９４℃、１分 アニーリング：５５℃、１分 重合反応：７２℃、１分 熱変性からアニーリングを経て、重合反応に至る過程を
１サイクル（所要時間5.7 分）とし、これを３５サイク
ル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、Ｄ
ＮＡサーマルサイクラー（Perkin Elmer Cetus社製）に
上記反応条件をプログラムして行った。Thermal denaturation: 94 ° C., 1 minute Annealing: 55 ° C., 1 minute Polymerization reaction: 72 ° C., 1 minute The process from thermal denaturation to annealing to the polymerization reaction is one cycle (required time is 5.7 minutes). 35 cycles (total required time about 3 hours). These operations are D
An NA thermal cycler (manufactured by Perkin Elmer Cetus) was programmed with the above reaction conditions.

【００２１】検出 反応液から増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。In order to detect the amplified nucleotide fragment from the detection reaction solution, agarose gel electrophoresis was performed as follows.

【００２２】アガロースゲルはゲル濃度３％（ W/V）と
し、臭化エチジウム（ 0.5μg/ml）を含むものを用い
た。泳動の条件は定電圧１００Ｖ、３０分で行った。操
作方法ならびに他の条件は、Maniatis等著 Molecular C
loning 第２版（1989）に記載されている技法で行っ
た。反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、
相対移動度の比較によりヌクレオチド断片の長さを算出
した。The agarose gel had a gel concentration of 3% (W / V) and contained ethidium bromide (0.5 μg / ml). The electrophoresis conditions were constant voltage of 100 V and 30 minutes. The procedure and other conditions are described in Maniatis et al. Molecular C
It was performed by the technique described in loning 2nd edition (1989). In addition to the reaction solution, the migration of molecular weight markers is performed at the same time,
The length of the nucleotide fragment was calculated by comparing the relative mobilities.

【００２３】コロニーハイブリダイゼーション試験 ctx 遺伝子に特異的なポリヌクレオチドプローブ（Kape
r, J. B., J. G. Morris, Jr.,and M. Nishibuchi.(198
8) DNA probes for pathogenic Vibrio species, 65-7
7. In F. C. Tenover(ed), DNA probes for infectious
diseases. CRCPress, Inc., Boca Raton,Fla.）を用い
て、Grunstein らの方法（Grunstein, M. and Hogness,
D., Proc. Natl. Acad. Sci, 72, 3961(1975)）にした
がって行った。結果 前述したようにコレラ菌の ctx遺伝子は、すでに塩基配
列が決定されており、本発明のオリゴヌクレオチド、す
なわち、プライマーがＰＣＲにより増幅させるヌクレオ
チドの大きさは容易に推定できる。それによるとプライ
マー(a) と(c)の組合せを用いた場合には、１６９塩基
（または１６９塩基対）の長さのヌクレオチドが増幅さ
れてくるはずである。下に、本発明のプライマーの組合
せについて、増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）をまと
めて記載した（各数字の単位は塩基を示す）。 Colony Hybridization Test Polynucleotide probe (Kape
r, JB, JG Morris, Jr., and M. Nishibuchi. (198
8) DNA probes for pathogenic Vibrio species, 65-7
7. In FC Tenover (ed), DNA probes for infectious
diseases. CRCPress, Inc., Boca Raton, Fla.) using Grunstein's method (Grunstein, M. and Hogness,
D., Proc. Natl. Acad. Sci, 72, 3961 (1975)). Results As described above, the nucleotide sequence of the ctx gene of Vibrio cholerae has already been determined, and the size of the oligonucleotide of the present invention, that is, the nucleotide amplified by the primer by PCR, can be easily estimated. According to this, when the combination of the primers (a) and (c) is used, a nucleotide having a length of 169 bases (or 169 base pairs) should be amplified. The lengths (estimated values) of amplified nucleotides for the combinations of the primers of the present invention are collectively shown below (each numerical unit indicates a base).

【００２４】 増幅ヌクレオチドの長さ（推定値）一覧表 プライマー(1) (a) (b) プライマー(2) (c) １６９ ― (d) − ３０７ これらの推定値と増幅されたヌクレオチドの長さが一致
した場合、各プライマーの組合せは、ctx 遺伝子中の標
的としている領域を正しく増幅しており、かつ、当該菌
株は ctx遺伝子を有していると判断した。被検菌株６６
２株で調べた結果を表２に示す。各プライマーの組合せ
は、コロニーハイブリダイゼーション試験で、ctx 遺伝
子陽性と判断された菌株ＤＮＡのみを増幅し、ctx 遺伝
子陰性の菌株ＤＮＡとは全く反応しなかった。 List of Amplified Nucleotide Lengths (Estimated Values) Primer (1) (a) (b) Primer (2) (c) 169- (d) -307 These estimated values and the length of amplified nucleotides In the case where the two matched, each primer combination correctly amplified the target region in the ctx gene, and it was judged that the strain had the ctx gene. Test strain 66
Table 2 shows the results obtained by examining the two strains. Each primer combination amplified only the ctx gene-positive strain DNA in the colony hybridization test, and did not react with the ctx gene-negative strain DNA at all.

【００２５】すなわち、ctx 遺伝子を正しく増幅し、ct
x 遺伝子をもつコレラ菌を正確に検出していることを示
している。また、表２に掲載されなかった残りの組合せ
についても同様の試験結果が得られた。[0025] In other words, to properly amplify the ctx gene, ct
It shows that the cholera bacterium having the x gene is accurately detected. Also, similar test results were obtained for the remaining combinations not listed in Table 2.

【００２６】[0026]

【表２】 さらに、図１には、本発明のプライマーの組合せは、コ
レラ菌株の由来、血清型、および生物型の違いに関係な
く、ctx 遺伝子の有無を的確に捕捉していることをも示
している。なお、図１中の各レーンは、次の菌株の熱抽
出サンプルを鋳型ＤＮＡ溶液として使用したものを示
す。[Table 2] Further, FIG. 1 also shows that the primer combination of the present invention accurately captures the presence or absence of the ctx gene regardless of the origin, serotype, and biotype of the cholera strain. Each lane in FIG. 1 shows a sample obtained by using a heat-extracted sample of the following strain as a template DNA solution.

【００２７】レーン１〜３；コレラ菌（エルトール・小
川型，コレラ毒素遺伝子陽性株）、 レーン４〜６；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ
毒素遺伝子陽性株） レーン７；コレラ菌（古典・小川型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン８；コレラ菌（古典・稲葉型，コレラ毒素遺伝子
陽性株） レーン９〜１０；コレラ菌（non-Ｏ１，コレラ毒素遺伝
子陽性株） レーン１１；コレラ菌（エルトール・小川型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１２；コレラ菌（エルトール・稲葉型，コレラ毒
素遺伝子陰性株） レーン１３；毒素原性大腸菌（易熱性エンテロトキシン
遺伝子陽性株）Lanes 1 to 3; cholera bacterium (El Tor, Ogawa type, cholera toxin gene positive strain), lanes 4 to 6; cholera bacterium (El Tor, rice leaf type, cholera toxin gene positive strain) lane 7: cholera bacterium (classical Ogawa type, cholera toxin gene positive strain) Lane 8; cholera bacterium (classical / inaba type, cholera toxin gene positive strain) lanes 9 to 10; cholera bacterium (non-O1, cholera toxin gene positive strain) lane 11; cholera bacterium ( El Tor, Ogawa type, cholera toxin gene negative strain) Lane 12; Vibrio cholerae (El Tor, Inaba type, cholera toxin gene negative strain) Lane 13: Toxigenic Escherichia coli (heat-labile enterotoxin gene positive strain)

【００２８】（実施例２）実施例１で得られた結果が c
tx遺伝子をもつコレラ菌に対して、選択的なものかどう
かを確かめるため、臨床検査において検査対象となる、
コレラ菌以外の下痢症菌等の遺伝子について本発明のプ
ライマーが反応するかどうかを調べた。方法は検体の調
製法を除いて、実施例１で示したものと同じである。Example 2 The result obtained in Example 1 is c
In order to confirm whether it is selective for V. cholera having the tx gene, it will be tested in clinical tests,
It was examined whether or not the primers of the present invention react with genes such as diarrhea bacteria other than Vibrio cholerae. The method is the same as that shown in Example 1 except the method for preparing the sample.

【００２９】検体の調製 表３中に示した各菌株をそれぞれ適当な増菌培地に接種
し、３７℃、好気的、または嫌気的条件下で終夜培養を
行った（このうち嫌気的条件下で培養した菌株は、Clos
tridium perfringens 、Campylobacter jejuni、Bacter
oides fragilis、Bacteroides vulgatus、およびLactob
acillus acidophilus である）。各菌株培養液０. ５ｍ
ｌから遠心操作により、菌体を回収し、ＴＥ緩衝液で菌
体を１回洗浄した。 Preparation of Specimens Each strain shown in Table 3 was inoculated into an appropriate enrichment medium and cultured overnight at 37 ° C. under aerobic or anaerobic conditions (of which, anaerobic conditions were used). in cultured strains, Clos
tridium perfringens, Campylobacter jejuni, Bacter
oides fragilis , Bacteroides vulgatus , and Lactob
acillus acidophilus ). 0.5m of each culture
The cells were collected from 1 by centrifugation and washed once with TE buffer.

【００３０】この菌体に５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７.
５に溶解したＮ- アセチルムラミニダーゼ溶液、および
アクロモペプチダーゼ溶液を各終濃度が５０μｇ／ｍ
ｌ、および１ｍｇ／ｍｌとなるように加え、３７℃で１
０分間処理し、溶菌した。ＴＥ緩衝液飽和でさせたフェ
ノールおよびクロロフォルムからなる混合液（混合比
１：１）を溶菌液に加えて、よく撹拌した。遠心後、上
層液を回収し、エタノール処理を行って、核酸成分を沈
澱させた。この沈澱物を１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶かして
検体とした。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Human placen
ta DNA）は、１μｇ／ｍｌの濃度のものを調製し、これ
も同様にＰＣＲを行わせた。50 mM phosphate buffer, pH 7.
The N-acetylmuraminidase solution and the achromopeptidase solution, which had been dissolved in No. 5, were added to a final concentration of 50 μg / m 2.
1 and 1 mg / ml, and add 1 at 37 ° C.
It was treated for 0 minutes and lysed. A mixed solution of phenol and chloroform saturated with TE buffer (mixing ratio 1: 1) was added to the lysate and stirred well. After centrifugation, the upper layer liquid was collected and treated with ethanol to precipitate the nucleic acid component. This precipitate was dissolved in 1 ml of TE buffer to give a sample. In addition, human placenta-derived DNA (Human placen
ta DNA) was prepared at a concentration of 1 μg / ml, and this was also subjected to PCR in the same manner.

【００３１】結果 表３に一部のプライマーの組合せにおける試験結果を示
す。表中のプライマーの全ての組合せは、下痢症菌ＤＮ
Ａをはじめとする種々のＤＮＡ全てについて、それらの
ＤＮＡを増幅することはなかった。 Results Table 3 shows the test results for some primer combinations. All combinations of primers in the table are diarrhea bacteria DN
For all the various DNAs including A, those DNAs were not amplified.

【００３２】[0032]

【表３】 したがって、本発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプ
ライマーは、ctx 遺伝子をもつコレラ菌にのみ、選択的
に反応するものと断言できる。表２に掲載されなかった
残りの各組合せについても同様な試験結果が得られた。[Table 3] Therefore, it can be asserted that the oligonucleotide of the present invention, that is, the primer, selectively reacts only with V. cholerae having the ctx gene. Similar test results were obtained for each of the remaining combinations not listed in Table 2.

【００３３】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ースゲル電気泳動法を前述の条件で行えば、１００塩基
（または１００塩基対）以下の長さのヌクレオチドであ
れば、５から１０塩基（塩基対）、また、１００から５
００塩基（塩基対）の範囲のヌクレオチドであれば、１
０から２０塩基（塩基対）のヌクレオチドの長さの違い
を区別可能である。When the agarose gel electrophoresis method used in the examples of the present invention is carried out under the above-mentioned conditions, 5 to 10 bases (nucleotides of 100 bases (or 100 base pairs) or shorter nucleotides (or Base pairs), also 100 to 5
1 for nucleotides in the range of 00 bases (base pairs)
It is possible to distinguish between nucleotide length differences of 0 to 20 bases (base pairs).

【００３４】さらに、アクリルアミドなどをゲル材に用
いることで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させ
ることができ、ctx 遺伝子の選択的検出における信頼度
は、さらに高まるものと考えられる。Furthermore, by using acrylamide or the like as the gel material, the accuracy of measurement of nucleotide length can be improved, and the reliability in the selective detection of the ctx gene is considered to be further enhanced.

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明では、ＰＣＲ法を用いたこと、お
よびコレラの病原因子であるエンテロトキシン（コレラ
毒素）の遺伝子（ctx 遺伝子）を標的とするプライマー
を用いたことにより、ctx 遺伝子を有するコレラ菌の検
出において、遺伝子増幅作用による高い検出感度と、２
つ、あるいは、それ以上の数のプライマーで反応が規定
されることによる高い選択性とが得られる。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, a cholera having a ctx gene is used by using the PCR method and by using a primer targeting the gene ( ctx gene) of enterotoxin (cholera toxin) which is a virulence factor of cholera. In detection of bacteria, high detection sensitivity due to gene amplification action and 2
High selectivity can be obtained by defining the reaction with one or more primers.

【００３６】また、検出感度が高いので、多量の検体を
必要とせず、検体の前処理も簡便で済む。本発明におけ
る実施例では、反応時間３時間、検出にかかる操作が３
０分であった。そのうえ、検出にアガロースゲル電気泳
動法と臭化エチジウムによる核酸染色法を用いること
で、プライマー等を標識せずに検出が行える。しかも増
幅されたヌクレオチドの長さを確認できるので、試験結
果の信頼性は高いものとなる。Further, since the detection sensitivity is high, a large amount of sample is not required and the pretreatment of the sample can be simplified. In the example of the present invention, the reaction time was 3 hours, and the operation required for detection was 3 hours.
It was 0 minutes. In addition, by using the agarose gel electrophoresis method and the nucleic acid staining method with ethidium bromide for the detection, the detection can be performed without labeling the primer and the like. Moreover, since the length of the amplified nucleotide can be confirmed, the reliability of the test result is high.

【００３７】コレラ菌の検査には、発見患者の迅速・適
切な治療と防疫措置のために、遅滞のない正確な結果が
要求される。また、コレラの病原体とされる真性コレラ
菌であるかどうかは、病原体とみなされた菌株が、血清
型Ｏ１に該当する菌であるかどうかで判定されていた。Cholera test requires accurate results without delay for prompt and proper treatment of detected patients and quarantine measures. In addition, whether the strain is a true cholera bacterium that is a pathogen of cholera was determined by whether or not the strain regarded as the pathogen is a serotype O1.

【００３８】しかし、最近では、血清型Ｏ１に該当しな
い菌（Vibrio cholerae non O1）においても、血清型Ｏ
１の菌と同じコレラ毒素を産生し、コレラ症状を発現さ
せていることが多数報告されてきている。このような菌
に対しては、血清型を調べることは無意味となり、その
菌株がコレラ毒素の産生能を有しているかどうかを調べ
ることこそ必要となる。本発明は、コレラの病原因子で
あるコレラ毒素をコードしている ctx遺伝子を選択的に
検出するものである。したがって、本発明により、コレ
ラの病原体としてのコレラ菌の検出を正確に行うことが
可能となる。However, recently, even in a bacterium which does not correspond to the serotype O1 ( Vibrio cholerae non O1), the serotype O
It has been reported many times that cholera symptoms are produced by producing the same cholera toxin as that of No. 1. For such bacteria, it is meaningless to examine the serotype, and it is necessary to investigate whether or not the strain has the ability to produce cholera toxin. The present invention selectively detects the ctx gene encoding cholera toxin which is a causative agent of cholera. Therefore, according to the present invention, it is possible to accurately detect cholera bacteria as a pathogen of cholera.

【００３９】[0039]

【配列表】[Sequence list]

配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；１ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣ
ＡＧＧＴSEQ ID NO (SEQ ID NO); 1 Sequence length 22 bases Sequence type Number of nucleic acid strands Single-stranded topology Linear sequence type Genomic DNA Hypothetical sequence NO antisense NO origin Vibrio cholerae Features of sequence Determined method S sequence TGATGAAATAAAAGCAGTC
AGGT

【００４０】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；２ 配列の長さ ２０塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡ
ＣＣSEQ ID NO: (SEQ ID NO); 2 Sequence length 20 bases Sequence type Number of nucleic acid strand Single strand topology Linear sequence type Genomic DNA hypothetical sequence NO antisense NO origin Vibrio cholerae sequence CHARACTERISTICS METHOD FOR DETERMINING CHARACTERISTICS S SEQUENCE ACAGAGTGAGTACTTTGA
CC

【００４１】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；３ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴ
ＴＧＡＧSEQ ID NO: (SEQ ID NO); 3 Sequence length 22 bases Sequence type Number of nucleic acid strand Single-stranded topology Linear sequence type Genomic DNA Hypothetical sequence NO antisense NO Origin of Vibrio cholerae sequence CHARACTERISTICS METHOD FOR DETERMINING CHARACTERISTICS S SEQUENCE GGCACTTTCTCAAACTAAT
TGAG

【００４２】配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）；４ 配列の長さ ２２塩基 配列の型 核酸 鎖の数 一本鎖 トポロジー 直鎖状 配列の種類 Genomic DNA ハイポセティカル配列 ＮＯ アンチセンス ＮＯ 起源 Vibrio cholerae 配列の特徴 特徴を決定した方法 Ｓ 配列 ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴ
ＴＧＧＧＡＧSEQ ID NO: (SEQ ID NO); 4 Sequence length 22 bases Sequence type Number of nucleic acid strand Single-strand topology Linear sequence type Genomic DNA hypothetical sequence NO antisense NO origin Vibrio cholerae sequence CHARACTERISTICS METHOD FOR DETERMINING CHARACTERISTICS S SEQUENCE ATACCCATCCATATTATT
TGGGAG

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図１】アガロース電気泳動図を示す。FIG. 1 shows an agarose electropherogram.

Claims (2)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】 検体中に存在するコレラ菌（Vibrio cho
lerae ）の産生するエンテロトキシン（コレラ毒素、Ｃ
Ｔ）の遺伝子（以下、ctx 遺伝子) をコードするヌクレ
オチド配列を標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的
となるように化学合成されたオリゴヌクレオチドであっ
て、合成ヌクレオチドが以下の配列群の少なくとも連続
した１０塩基以上 （５’）ｄ−ＴＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴ−（３’）・ ・・（ａ：配列番号１） （５’）ｄ−ＡＣＡＧＡＧＴＧＡＧＴＡＣＴＴＴＧＡＣＣ−（３’）・・・ ・・（ｂ：配列番号２） （５’）ｄ−ＧＧＣＡＣＴＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＡＴＴＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｃ：配列番号３） （５’）ｄ−ＡＴＡＣＣＡＴＣＣＡＴＡＴＡＴＴＴＧＧＧＡＧ−（３’）・ ・・（ｄ：配列番号４） または対応する相補的配列からなることを特徴とするコ
レラ菌検出用オリゴヌクレオチド。1. A cholera bacterium ( Vibrio cho) present in a sample.
lerae ) -produced enterotoxin (cholera toxin, C
T) is an oligonucleotide chemically synthesized so as to be complementary to the nucleotide sequence encoding the gene (hereinafter referred to as ctx gene), and the synthetic nucleotide is at least continuous in the following sequence group. 10 bases or more (5 ') d-TGATGAAATAAAGCAGTCAGGT- (3') ... (a: SEQ ID NO: 1) (5 ') d-ACAGAGTGAGACTACTTGACC- (3') ... (b: SEQ ID NO: 2) 5 ′) d-GGCACTTTCTCAAACTAATTTGAG- (3 ′) ··· (c: SEQ ID NO: 3) (5 ′) d-ATACCATCCATATTATTTGGGAG- (3 ′) ··· (d: SEQ ID NO: 4) or the corresponding complementary sequence An oligonucleotide for detecting Vibrio cholerae characterized in that 【請求項２】 請求項第１項に記載された配列のうち、
少なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応
のプライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を
選択的に増幅させることを特徴とする方法であって、 (a) 検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ、４種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b) 得られた２本鎖の標的ヌクレオチド配列を１本鎖に
分離した場合、その相補鎖は他方のプライマーによる鎖
長反応の鋳型として機能し、 (c) これら２種のプライマーによるハイブリダイゼ−シ
ョンを繰り返すことにより、特定のヌクレオチド配列が
増幅され、増幅されたヌクレオチド断片を検出し、 (d) その結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在
しているか否かを判定することでコレラ菌の検出を行う
ことを特徴とするコレラ菌の検出方法。2. Of the sequences according to claim 1,
A method of causing an oligonucleotide having at least one to function as a primer for a chain length reaction to selectively amplify a target nucleotide sequence, comprising: (a) a target nucleotide sequence in a single-stranded state in a sample When a primer is hybridized to the above, a chain length reaction is carried out by a polymerization reaction of four kinds of nucleotides, and (b) the obtained double-stranded target nucleotide sequence is separated into single strands, its complementary strand is It functions as a template for the chain length reaction by the primers, and (c) a specific nucleotide sequence is amplified by repeating the hybridization with these two kinds of primers, and the amplified nucleotide fragment is detected, and (d) the result. , Characterized by performing the detection of Vibrio cholerae by determining whether the sequence to be recognized is present in the sample Detection method of La bacteria.