JPH06502534A - 微生物を分析する方法及びキット - Google Patents
微生物を分析する方法及びキットInfo
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- JPH06502534A JPH06502534A JP4500542A JP50054292A JPH06502534A JP H06502534 A JPH06502534 A JP H06502534A JP 4500542 A JP4500542 A JP 4500542A JP 50054292 A JP50054292 A JP 50054292A JP H06502534 A JPH06502534 A JP H06502534A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
微生物を分析する方法及びキット
本発明は、試料中の微生物を分析する方法及びキットに関する。
臨床検査における試料(例えば、尿、大便、唾液、痰、血清、血液、生検試料等
)又は食物には、少数の病原性の可能性が高い菌種が多数の他の微生物種の中に
混在し得る。これらの病原性の可能性が高い細菌は選択培地により分析する。
例えば、サルモネラ(Salmonella)菌を分析する典型的な方法は、サ
ルモネラ/シゲラ(Sh ige l Ia)寒天培地における培養及びセレナ
イトに富む寒天培地上で増面の後、生化学的及び血清学的な同定を行うものであ
る。この典型的な方法には実質的な欠点、特に長時間の集中的な労働を要すると
いう欠点があった。
米国特許第4.677,055号は、上記の典型的方法のバリエーションを開示
しており、その中で分析すべき微生物をまず試料から単離している。この方法に
よると、特定の抗原決定基を有する病原菌が存在する生物学的培地に上記の抗原
決定基に対する抗体が結合している磁性ゲルを接触させる。
次にこの磁性粒子を磁石棒で取り出し寒天培地上に植えつけて断面が約1cmの
スポットを形成させる。この寒天培地を上記のスポットと同じ大きさのコロニー
が形成するようにインキュベートした後、例えば典型的な細菌学的方法によりコ
ロニー中の菌を同定することができる。
また、臨床検査用試料又は食物中の、サルモネラ菌のような特定な型の細菌の存
在をポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いるエンザイムイムノアッセイ
やELISA(enzyme−1inked immunoso+ben+ a
ssay)により分析する方法も開発されている。このような分析は1〜2日以
内で実施できるが、実際の分析を始める前に試料中の微生物をまず増殖培地中で
増やさなくてはならない。その上、このような免疫化学的検出には、目的の微生
物と抗血清との区別が困難であり106細胞/ m Qより高い感度は実現でき
ないという欠点がある。
上記の米国特許第4,677.055号はまた、細菌の特徴を分析する免疫学的
技術も開示している。この目的のために、寒天培地上のコロニーのすぐ近くに凹
部を設け、これを特異的抗血清で満たし、コロニーを溶解する。コロニーからの
抗原の拡散と抗血清で満たした凹部からの抗体の拡散により免疫沈降物が生じ、
次いでこの沈降物を染色する。この操作には約2日を要する。
これに代わって、現代のDNA技術を用いる新たな微生物の分析法が提案されて
いる。分析の速さと感度の点から、特定の微生物(特定の属、種又は株)に特異
的なプライマーを用いるPCR(poly[oerxse chain rea
ction)によるDNA配列の増幅が有望と考えられる。しかし、PCR技術
には、多量に混在するDNAにより目的DNAの増幅が阻害されるという実質的
な欠点がある。
ジャンセン(Jansen)ら(PNAS USA 87.1990.2867
−2871)は、A型肝炎ウィルス(HAV)の分析システムを開示している。
この分析システムでは、1 、5 m Hのエツベノドルフチューブを抗HAV
モノクローナル抗体でコートし、HAVを含有する大使試料をチューブに入れ1
晩インキユベートの後、懸濁液を洗浄除去し適切な緩衝液を加え、RNAから(
HAVはRNAウィルスである)DNAへの逆転写を行い、このDNAを他の緩
衝液中でPCRにかける。この操作には約24時間かかる。このシステムの長所
としては、抗体段階での特異性、PCRの感度及びPCR産生物の特異性の簡単
な確認が組み合わさっていることがある。しかし、この方法にも実質的な短所、
即ちサルモネラ菌等の病原菌の分析には使用できないという短所があった。細菌
感染とは異なり、ウィルス感染では近縁の微生物種の存在が問題となることはほ
とんどないか或いは全くない。また、細菌が混在するサンプルをPCRに適する
ような状態に戻す操作は、実際に不可能である。
一方、単一株の培養液についてのPCRのプロトコールは幾つかある。例えば、
細菌を遠心分離によりベレットにし、水を加え95℃で10分加熱の後プロトコ
−ルKを加え55℃で10分インキュベートする。プロトコ−ルを95℃で15
分加熱することにより不活化した後RNaseを加え37℃で15分インキュベ
ートする。これらの操作の後に初めてPCRを行う[バリー(Barry) ら
、BioIechnology 8,1990、233〜236]。
成る場合には、溶菌及びプロトコ−ルに処理の後、まずフェノール抽出及び場合
によっては塩化セシウム勾配を行うことにより精製したDNAを出発物質として
用いている[バーネット(Berne+)ら、J、 Cl1n、帽crobio
1.27.1989.2492−2496;ウィルソン(Wilson) ら、
J、 Cl1n、帽crobio1.28゜1990、1942−+946;ブ
リ力イティス(p+1hay+1s)ら、J、 Cl1n、 Microbio
l、 28.1990.1913−19171゜上記の方法に類似するものとし
て、DNA精製をフェノール抽出及び塩化セシウム勾配により行うプロトコール
に従って、生検試料、血清又は血液からウィルスDNAを抽出する方法がある[
カネコ(Kaneko> ら、PNASυSA 116.1189,312−3
16:メイトランド(Maitland) ら、Br1t、 J、 Cance
r 59.1989、698−703を参照」。
大便を介する腸内細菌(ente+obac+e+1aceae)の感染が起き
ている可能性がある水については、ごく少数の粒子と他の細菌が存在することか
ら試料を比較的簡単な方法で調製することができる。即ち、2回の遠心分離又は
濾過操作で十分である。次いで、得た細胞から溶菌用緩衝液を用いてDNAを遊
離させ、これらの細胞に50mM KCI、 10 mM Tris−HCI
(pHa、t3)、1.5 mM MgCl2.0.01%ゼラチン、0.05
H/mlプロテイナーゼK、 20 mMジチオスレイトール、及ヒ1.8
μM SDSを加える。15秒のボルテンクヌにかけた後、混合物を37℃で1
〜1.5時間インキュベートし、次に80℃で5分加熱することによりプロテイ
ナーゼKを不活化して、PCRを行う[アトラス(Atlas)とベジ(Bei
)著、インニス(Innis) 、シェルフアンド(Gelfand) 、スニ
ンスキー(Sninsky)及びホワイト(White)編集、サンディエゴ市
所在のアカデミツクブレス社出版の“PCRプロトコール一方法と応用のための
ガイド(PCRprotocols ; a guide to method
s andappl 1calions)、 399−406、を参照]。
また、汚物試料から細菌を単離するために、混合及び遠心分離操作を何度か行っ
た後、溶菌及びとりわけ塩化セシウム勾配によるDNA精製が行われている[ス
デファン(Slelfan)とアトラス(Atlas) 、 Appl、 En
++ironm、 Microbiol、 54゜1988、2185−219
11゜
本発明は、全ての先行技術とは異なり、種々の試料中の細菌、菌類及び酵母を、
速かに、特異的及び感度の良いやり方で、検出可能にする方法及びキットを提供
する。
本発明の第1の態様によれば、試料中の微生物を分析する方法にして、検出すべ
き微生物に対し特異的親和性を有する抗体及びこれらの抗体の固体支持体を用い
て該試料からこれらの微生物を単離し、次いで単離した微生物のDNAを、分析
すべき該微生物に特異的なプライマーを用いてPCRにかけることを包含する方
法が提供される。
本発明の第2の態様によれば、検出すべき微生物に対し特異的親和性を有する抗
体を含む、試料中の微生物分析用キットにして、該抗体がそれらの固体支持体に
結合しているか、或いは1分析すべき微生物に特異的なPCR用ブラプライマー
ントと同様に更に該キットに備えであるところの抗体用固体支持体に結合するこ
とのできる試薬と共に提供されることを特徴とするキットが提供される。
本発明の方法は特に、特定の属、種或いは株の細菌、菌類又は酵母よりなる微生
物の分析に適している。これらの検出すべき微生物を試料から単離するような、
この微生物に対し特異的親和性を有する抗体の使用と、これらの微生物自体のD
NAを増幅するような、分析すべき微生物に対し特異的なPCR用ブラプライマ
ーットの使用との組み合わせにより、例えば細菌について異なる属、異なる種、
また異なる株でさえも区別することができる。
本発明は、臨床検査における試料(尿、大便、痰、唾液、血清、血液、生検試料
等)又は食物における病原菌の分析法に限定されるのではなく、パン、ビール、
ワイン、チーズ、ヨーグルト等の消費産物の作製に用いる酵母及び/又は菌類等
の同定法をも包含する。しかし1本発明は、従来の方法では満足のいくやり方で
は出来なかった病原菌の分析に利用するのが好ましい。例えば、本発明は特にサ
ルモネラ、クレブシェラ(Klebsiella)又はリステリア(Liste
ria)属の中の1つの属の細菌よりなる微生物の分析に適している。一つには
、本発明の用途として細菌の分析が好ましいことから、以後は便宜上しばしば細
菌を参照して記述するが、本発明はこれに限定されるものではない。
最も信頼できる結果を得るためには、所望の微生物の単離に用いる抗体(好まし
くはモノクローナル抗体)が生きている細菌と反応できること、即ち生きている
細菌に対する特異的親和性を有し結合できることが必要である。特にDNAを含
有するのが生きている細菌であることから、本発明においては最終的な検出は該
細菌のDNAを用いて行う。
従って、本発明によれば、分析すべき微生物を試料から単離するために、生きて
いる該微生物に対して作製したモノクローナル抗体を用いること、即ち該抗体を
産生ずる試験動物(大抵はネズミ)を生きている細菌(少なくともこの条件に近
いもの)を用いて免疫していることが好ましい。ヒトに感染するがネズミに対し
ては病原性を有さないHAVのようなウィルスの場合は、このことはそれほど問
題にはならないが、マウスに対しても病原性を有するサルそネラ菌等の場合は、
そのような免疫処置は不可能と考えられる。
これまでに発表されているサルモネラ菌に対するモノクローナル抗体は死菌のみ
と反応するものであり、このことば菌を含む試料をまず#、sしなくてはならな
いことを意味する。
これは一般に、サルモネラ菌の検出用に現在用いられている全ての免疫学的アッ
セイに当てはまる。しかし、菌を煮沸することにより細胞が溶解しDNAを含ま
なくなってしまうので、PCRはもはや不可能となってしまう。
従って、生きている病原菌に対するモノクローナル抗体を得ようとする場合は、
従来の免疫方法は用いることはできない。これには2つの明らかな理由がある。
第1に、免疫応答を得るためにアジュバントを用いる方法があるが、この方法に
は、アジュバント中の生物が本来有する蛋白が変性して多数のエピトープが破壊
されるという欠点がある。従って、アジュバントを用いる処理又はアジュバント
中への取り込みの後でも構造の変わらない蛋白部位と反応するモノクローナル抗
体が特に得られている[リュク(Luk)ら、J、 Immunol、 Met
h、 +29.1990.243−250;メイソンスミス(Mason Sm
1th)及びボッター(Po+16r)、J、 Immunol、 114.
+975. ll1f47−1850;フェンダ(Feng)ら、J、 Gen
、 Microbiol、 136.1990.337−342を参照コ。
第2に、免疫すべき動物に対し病原性を有する天然の生物の場合は、その生物を
用いる免疫は基本的に不可能である。
この問題を避けるために、実際に免疫する際に該生物蛋白質を単離した形でしば
しば用いるが、慎重に単離した蛋白を大抵はアジュバントと同時に注射するため
に非常に弱い免疫応答しか示さない[サダラー(Sadallah)ら、J、
Infect、 Dis。
+61.1990.59−64を参照]。生物又は単離した蛋白の完全な変性の
結果、抗原はより高い免疫原性を有するようになるが、アジュバントを用いる処
理又は他の変性方法のために、多数の3次元構造のエピトープがなくなってしま
う。従って、刺激された該免疫系はこのようなエピトープに対し何ら免疫応答を
示さない。しかし生きている細菌上では、3次元構造のエピトープは生物の食物
供給及び移動に係ることがら特に多く存在する。
本発明により、上記の課題の解決法が幾つか判明した。天然のエピトープに対す
る免疫応答を得るために、本発明では生きている細菌又はこの条件に最も近い細
菌を用いる免疫を行う。1つの方法によれば、細菌を抗生物質と共に実験動物に
注射する。その結果、生じる静細菌性効果(bac+eriosta+ic e
ffec+)により増殖は阻害されているがまだ生きている菌が免疫系に侵入す
るようになる。生きている菌に対して免疫応答を得るための第2の方法によれば
、該菌株を低濃度のホルマリンで処理する。あり得る結果として、食細胞による
細菌の取り込み(病原菌はしばしば食細胞に取り込まれて、免疫系に対し細胞内
にまた不可視的に生存し続ける)が阻害されるが、その程度は該菌の免疫系の細
胞への侵入が起きるような程度である。
従って、本発明によれば、上記のモノクローナル抗体の作製のために、細菌の増
殖を阻害する量の抗生物質と組み合わせて上記の生きている該微生物を用いて免
疫を行なうか、細菌の増殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生きている該微−
生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うか、又は該抗生物質或いは食
細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホルムアルデヒドを用いて生きている
該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うことが好ましい。
本発明によれば、分析すべき微生物の単離に用いる抗体は固体支持体に結合して
いるか或いは結合するようにしなくてはならない(或いは、場合によっては、抗
体と固体支持体が、後に起こるカンプリングが可能なように、ビオチン/アビジ
ン系、ハブテン/アンチハブテン系等によって、適切に改変しているならば、試
料中に存在する微生物との反応の後でもよい)。上記の固体支持体の性質には特
に限定はなく、例えば遠心分離により試料の残りから分離することのできる金属
、プラスチック又はガラスの不活化粒子よりなるのが好ましいが、本発明によれ
ば、磁力を用いて試料から拾い出すのが非常に簡単である磁性粒子を用いるのが
すこぶる好ましい。チューブの壁を抗体の固体支持体として用いる方法に較べ、
粒子(特に磁性粒子)を使用した場合は、試料との適切な接触により微生物と抗
体との最適な結合を実現するのに非常に少ない時間で済む。
従って、本発明によれば、該抗体の固体支持体として磁性粒子を用いることによ
り、分析すべき該微生物を試料から単離することが非常に好ましい。また、分析
すべき微生物に対し特異的親和性を有するモノクローナル抗体が結合する磁性粒
子を試料に加え、インキュベートの後、該分析すべき微生物が存在した場合該磁
性粒子に結合したそれらの微生物を該磁性粒子から分離することにより、該分析
すべき微生物を該試料より単離するのが最も好ましい。また更に、該モノクロー
ナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクローナル抗体でコート
して、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベートして得られる、
該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特異的親和性を有する
ようにした磁性粒子を用いることが好ましい。該モノクローナル抗体が免疫グロ
ブリン、例えばネズミに由来する免疫グロブリンの場合は、該磁性粒子は例えば
ネズミ免疫グロブリンに特異性を有するヤギの免疫グロブリンでコートするのが
よい。
細菌やその他の微生物は、固体表面に対し特異的結合又は特異的付着効果を示す
。このことは、調べる試料が分析すべきサルモネラ菌等の微生物の他に他菌種を
も含有している場合に、特に大きな問題となる。この問題は、少数の分析すべき
細菌が過剰蚊の他の微生物の中に存在する場合、例えば100万個の大腸菌(E
sche+1cia coli)に対し1個のサルモネラ菌が存在する場合、更
に深刻な問題となる。このような場合、米国特許第4,677.055号に開示
の方法では、サルモネラ菌に対し粒子に付着する大腸菌が完全に過剰であること
から、不十分であろう。本発明は、検出法としてPCRを用いることにより、上
記課題を完全に克服するものである。プライマーの適切な選択により、特異性と
高感度が確実になるが、これらの望ましい特性を得るためには、固体支持体から
分離し、溶菌(例えば60〜100℃に加熱して行う)及び遠心分離して得たP
CR用上清として得るところの、菌体から遊離したDNAを用いてPCRを行う
のが適切である。
従って、本発明によれば、該磁性粒子に結合している微生物からDNAを皐離し
、該磁性粒子の非存在下で単離したDNAをPCHにかけることが好ましい。そ
の他本発明においては、PCR用に回収する試料は少量でよいこと、腸内細菌や
リステリア菌等の分析を目的とする場合でも、溶菌用緩衝液、フェノール抽出及
び塩化セシウム勾配を必要としないということがある。
PCRの条件それ自体は、しばしば用いられるTaqポリメラーゼ等のPCRに
適したDNAポリメラーゼの種類と同様に、当業者にはよく知られている(例え
ば米国特許第4゜683.202号を参照)。しかし、プライマーの選択につい
ては本発明の方法に特異的であり、この選択によって、本発明の方法が特定の属
、特定の種の微生物、また特定の株の微生物についてさえも特異的であることが
確実になる。しかし、適切なプライマーを見つけるのは必ずしも簡単ではない。
例えば、サルモネラ属のような特定の属の微生物に対する特異性を確実にする場
合、即ち、サルモネラ菌に属する全ての穐及び株を本発明方法で識別する一方で
他の属の細菌は識別しないことをめる場合、プライマーの選択が問題となる。
rRNA配列が特定の属において非常に類似していることは知られており、この
ことはすでにハイブリダイゼーションの実験において利用されている(EP−A
−0357306゜EP−A−0277237及びWO28103957を参照
)。rRNAプライマーの使用はチェノ(Chen)らによりすでに発表されて
いるが(FEMS Microb、 Let+、 57.1989、19−24
) 、これは通常の微生物の分析に用いられている。
rRNAプライマーの使用は本発明が包含する1つの可能性であるが、全ての場
合に適するというわけではない。特にサルモネラ菌の場合はrRNA配列にかな
り著しい配列変異があることが分かつている。rRNAに代わる適切な配列が細
菌染色体の“DNA複製開始点” (o r i C)の配列中に見い出されて
おり、幾つかの腸内細菌についてoriC配列が知られている[コーンバーブ(
Kornberg)著、サンフランシスコ市所在のフリーマンと=+ +、(F
【eeman and Co、)出版の” D N A複製についての補足(S
upplement to DNA +eplicalion)”コ。このor
iC配列は、腸内細菌間で保存される領域と変異可能な部分配列よりなる。しか
し、これらの変異可能な部分配列はサルモネラ属等においては内部に保存される
ことから、菌属に特異的なPCR用プライマーの基礎として役立つかどうかは不
明であった。
従って本発明は、PCRにおいて、r RNA配列の部分配列に基づくプライマ
ーを用いることを包含する。このようなアプローチは、実際にリステリア菌など
に有用であることが判明している。
また、本発明は、PCRにおいて、DNAの複製開始点配列の部分配列に基づく
プライマーを用いることを包含する。
上記方法の第1の具体例として、サルモネラ属細菌の分析用であり、以下のオリ
ゴヌクレオチドプライマーをPCRにおいて用いることを特徴とする方法がある
。
プライマー1: 5’−TTATTAGGATCGCGCCAGGC−3゜
プライマー2: 5’ −AAAGAATAACCGTTGTTCAC−3’
本発明の上記プライマーの使用については、具体的な実施例において更に詳述す
る。
上記方法の第2の具体例として、クレブシェラ属細菌の分析用であり、以下のオ
リゴヌクレオチドブライマーをPCRにおいて用いることを特徴とする方法があ
る。
プライマー1: 5’−CTTGTCTTGTGGATAAGTCA−3’
プライマー2: 5°−TCTTCTGTGGATAACTATGC−3’
このプライマーの組み合わせとクレブシェラ菌に特異的なモノクローナル抗体の
使用により、本発明の方法がクレブシェラ属細菌について選択的であることが実
験を通して証明されている。このことは、クレブシェラ・オキシト力(Kleb
siella oxy+oca)及びクレブシェラ・ニューモニエ(Klebs
iella pneumoniae)については陽性の結果であり、エシェリヒ
ア・フリ (Esche+1chia coli) 、シトロバクタ−・フロイ
ンデイイ(Cittobacter Ireundii) 、セラチア・マルセ
ツセンス(Serra)ia marcescens) 、プロテウス轡ミラと
リス(Pr。
teus m1rabilis) 、エンテロバクタ−〇クロアケ(En4e+
obaever C1oacae) 、及びエンテロバクタ−・xoゲネス(E
le+obacter aerogenes)については陰性の結果であること
を意味する。
しかし、PCRにおいていずれのプライマーも有用及び活性であるわけではない
。従って、クレブシェラ菌の分析用としてoric配列に基く以下のプライマー
の組み合わせが確立されている。
プライマー1: 5’ −CTTGTCTTGTGGATAAGTCA−3’
プライマー2: 5′−AAGTATAACCGTTGCCTGA−3゜
以下の実施例においては、生きているサルモネラ菌と結合することのできるモノ
クローナル抗体を使用した。これらのモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド
ーマは、以下の寄託番号の下に、1990年11月28日に英国のECACC(
European Co11ection o[Anim@l Ce1l Cu
1tures) +こ寄託した:
MAB 55−23−B7 : ECACC90112807MAB 7O−2
−2A : ECACC90112808MAB 7l−40−Al : EC
ACC90112809X産五
PCR技術により、DNAの複製開始点の配列である160bpの部分配列の増
幅を行った。この目的のため、サルモネラ・ティフィムリウム(Salmone
lla [phimurium)の複製開始点に由来する配列を有するプライマ
ーを用いた。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、フェルマシア・エルケ
ービー・ジーン・アセンブラ−・プラス・シンサイザー(pharmacia
LKB Gene Assembler Plus 5ynthesixer)
を用いホスホルアミダイト(phosphoramidile)技術により合成
した。
合成オリゴヌクレオチドは、脱保護及び固体支持体からの切り出しの後、NAP
10カラムクロマトグラフイーにより精製した。得られたプライマーは以下の
配列を有していた゛プライマー1+ 5’−TTATTAGGATC’GCGC
CAGGC−3″
プライマー2: 5’ −AAAGAATAACCGTTGTTCAC−3’
上記のプライマーのセットの、サルモネラ菌27株及びサルモネラ菌以外の他の
腸内細菌19株に対する特異性をPCRにより調べた(表A)。PCR混合液(
最終体積:100pQ)は、10mM Tr i 5−HC(1(pH8,3)
、50m M K CQ、1 、5 m M M g CQ 2.0.001%
(W/■)ゼラチン、100μMの各dNTP、0.5μMの各プライマー、及
び1.25UのAmp l i −T a qポリメラーゼ(米国カリフォルニ
ア州エメリーヴイル市所在のシータス社製)よりなるものを使用した。増幅は、
パーキン−エルマー・サーモサイクル(Perkin−Elmer The+m
ocycle ;米国コネティカット州ノーウオーク市所在のパーキン−エルマ
ー・インストルメンツ社製)を用いて25サイクルで行った。1サイクルは、9
4℃1分の変性段階、50℃1分のプライマー・アニーリング段階、及び72℃
1秒の伸長段階よりなるものとした。増幅後、試料15μQを1.5%アガロー
スゲル電気泳動にかけ、泳動したDNAをエチジウムプロミドで染色上記の各d
NTPと同様、独国ベイリンガ−・マンハイム社より入手した)。
増幅後、所望の長さのDNA断片がサルモネラ・ティフィムリウムばかりでなく
、調べた全てのサルモネラ菌について見つかった。一方、シゲラ、エシェリヒア
・コリ、シトロバクタ−、シュードモナス等の他の腸内細菌については増幅され
た断片は見つからなかった。従って、選択したプライマーはサルモネラ菌に特異
的であることが導かれた。
本発明の方法の選択性及び特異性
5X10’〜5X102細胞/ m Qに段階希釈したサルモネラ・ティフィム
リウム(各100μQ)について、本発明の方法で調べた。磁性粒子として、米
国プラウエア州つイルミントン市所在のデュポン社より入手したマグニソート(
Magnisotl) M粒子(磁性の二酸化クロム)を用いた。またこれらの
粒子は、マウスのIgG及びIgMに特異的なりギの免疫グロブリンでコートし
た。モノクローナル抗体(サブクラ、KIgM)のサルモネラ菌に向けた磁性粒
子との結合は、1%ゼラチンを含むリン酸塩緩衝食塩水(gPBs)中で、コー
トした磁性粒子と共にハイブリドーマの培養上清を35℃で5分インキュベート
することにより起こった。磁性粒子は上清を捨てた後磁石を用いて単離した。
分析用試料をgPBsに懸濁し、磁性粒子を加えた。35℃で15分インキュベ
ートした後、磁性粒子を磁石を用いて皐離し、これをgPBsで3回洗浄した。
最後の洗浄操作の後、磁性粒子を2回蒸留して得た蒸留水に再懸濁した。
磁性粒子と共に抽出した細菌について直接PCRを行う試みにおいて、増幅が磁
性粒子により阻害されることが分かった。このため、サンプルを100℃で5分
インキュベートすることにより菌体を破砕し、短時間遠心分離にかけた後、細菌
DNAを含む上清画分をPCRにかけた。PCRは35回のDNA増幅サイクル
で、前述の方法に従って実施した。
その結果(ここには示さない)、本発明の方法によれば103個の細胞が検出で
きることが分った。更にサルモネラ菌とモノクローナル抗体を結合した磁性粒子
との結合能を測定するために、細菌培養後に得られた上清もPCRにかけたが、
目的とするDNAの増幅は見られなかった。これより、サルモネラ菌と磁性粒子
上のモノクローナル抗体との結合は完全であることが導かれる。
その後の実験により、本発明の方法によれば、107個のサルモネラ菌以外の細
菌[エシェリヒア・コリ、シュードモナス0エルジノーサ(Pseudomon
as aeruginosa) 、クレブシェラ・オキシト力及びシトロバクタ
−・フロインディイコを含む試料中の、103個のサルモネラ菌を分析できるこ
とが示された。エシェリヒア・コリ、シュードモナス・エルジノーサ、クレブシ
ェラ・オキシト力及びシトロバクタ−・フロインディイとgPBSを用いるコン
トロール実験においては、検出可能な増幅は観察されなかった。
表A サルモネラ菌と他の腸内細菌にってのPCR増幅PCRサルモネラ菌の
増幅 血清型
S、デュラッツォ(S、 durazzo) 十AS、クリニカル・アイソレー
トM十A
(S、 clinical 1solate M)S、ティフィムリウム L
+ A
(S、+yphimurium L)
S、ティフィムリウム 1724 十 B(S、 +7phimutium +
724)PCRサルモネラ菌の
増幅 血清型
S、ティフィムリウム 14H+B
(S、 [phimueium 14)1)S、ブレデ= −(S、 bted
enY) 十BS、デルビー(S、 derby) 十BS、ハイデルベルグ
十 B
(S、heidelbe+g)
S、プランデンブルグ 十 B
(S、brandenbu+g)
S、クリニカル・アイソレート10.2+ B(S、clinical 1so
late 10.2)S、セントポール + B
(S、 5ain+paul)
S、バラティフィ B + B
(S、 pa+a+yphi B)
S、アボルタスイクィ 十 B
(S、 abortus equi)
S、インファンティス(S、 1nfan! is) + CIS、ニューボー
ト(S、newpo++) 十C2S、ベレム(S、belem) + C5,
クリニカルアイソレート1159 + C1(S、clinical 1sol
ate 859)S、バラティフイ C(S、pa+atypbi C) 十C
5,パナ? (S、 panam@) + DS、タイフォーサ(5,17Ph
osa) + DS、エンテリディティス + D
(S、enleridilis)
PCRサルモネラ菌の
増幅 血清型
S、シャルガー= (S、sha+gani) + ES、ギヴ(S、give
) + E
S、プレトリア(S、p+eto+ia) 十FS、アトランタ(S、atla
n+a) 十GS、ウォーシントン(S、vor+hinglon) + Gエ
シェリヒア・コリ −
(Escherichia coli)エシェリヒア・コリ 07KI −
(Escherichia coli 07Kl)(Klebsiella p
neumonia 1.88)クレブシェラ・オキシト力 −
(Klebsiella oxyjoca)シトロバクタ−・フロインデイイ
−
(Citrobacter Fteund目)シトロバクタ−・ダイパーサス
−
(Citrobacter diversus)セラチア・リフファシェンス
−
(Serralia l1qufaciens)セラチア・マルセッセンス −
(Serralia 1lIlarcescens)エンテロバクタ−・アグロ
メランス −(Er++e+obac+er agglome+ans)PCR
サルモネラ菌の
増幅 血清型
エンテロバクターーエロゲネス −
(Enterobac+e+ aetogenes)(Enterobac+e
+ cloaceae)プロテウス・ミラビリス −
(Proteus mi+abilis)(Proteus vulgaris
)国際調査報告
国際調査報告
NL 9100230
S^ 53610
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(81)指定回 EP(AT、BE、CH,DE。
DK、 ES、 FR,GB、 GR,IT、 LU、 NL、 SE)、 C
A、JP、 US
Claims (22)
- 1.試料中の徴生物を分析する方法にして、検出すべき微生物に対し特異的親和 性を有する抗体及びこれらの抗体の固体支持体を用いて該試料からこれらの微生 物を単離し、次いで単離した微生物のDNAを、分析すべき該微生物に特異的な プライマーを用いてPCRにかけることを包含する方法。
- 2.上記の分析すべき微生物が、特定の属、種或いは株の細菌、菌類又は酵母よ りなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 3.上記の分析すべき微生物が、サルモネラ、クレブシエラ又はリステリア属の 中の1つの属の細菌よりなることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 4.上記の分析すべき微生物を試料から単離するために、生きている該微生物に 対して作製したモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項1に記載の 方法。
- 5.上記のモノクローナル抗体の作製のために、細菌の増殖を阻害する量の抗生 物質と組み合わせて上記の生きている該微生物を用いて免疫を行うか、細菌の増 殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生きている該微生物を処理して得られる微 生物を用いて免疫を行うか、又は食細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホ ルムアルデヒドを用いて生きている該微生物を処理して得られる微生物を用いて 免疫を行うことを特徴とする請求項4に記載の方法。
- 6.該抗体の固体支持体として磁性粒子を用いることにより、分析すべき該微生 物を試料から単離することを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 7.分析すべき微生物に対し特異的親和性を有するモノクローナル抗体が結合す る磁性粒子を試料に加え、インキュベートの後、該分析すべき微生物が存在した 場合該磁性粒子に結合したそれらの微生物を該磁性粒子から分離することにより 、該分析すべき微生物を該試料より単離することを特徴とする請求項1に記載の 方法。
- 8.該モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクロー ナル抗体でコートして、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベー トして得られる、該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特異 的親和性を有するようにした磁性粒子を用いることを特徴とする請求項7に記載 の方法。
- 9.該磁性粒子に結合している微生物からDNAを単離し、該磁性粒子の非存在 下で単離したDNAをPCRにかけることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 10.PCRにおいて、rRNA配列の部分配列に基づくプライマーを用いるこ とを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 11.PCRにおいて、DNAの複製開始点配列の部分配列に基づくプライマー を用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。
- 12.サルモネラ属細菌の分析用であり、以下のオリゴヌクレオチドプライマー をPCRにおいて用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。 プライマー1:【配列があります】 プライマー2:【配列があります】
- 13.クレブシエラ属細菌の分析用であり、以下のオリゴヌクレオチドプライマ ーをPCRにおいて用いることを特徴とする請求項1に記載の方法。 プライマー1:【配列があります】 プライマー2:【配列があります】
- 14.検出すべき微生物に対し特異的親和性を有する抗体を含む、試料中の微生 物分析用キットにして、該抗体がそれらの固体支持体に結合しているか、或いは 、分析すべき微生物に特異的なPCR用プライマーのセットと同様に更に該キッ トに備えてあるところの抗体用固体支持体に結合することのできる試薬と共に提 供されることを特徴とするキット。
- 15.生きている該微生物に対し作製した、分析すべき微生物に対し特異的親和 性を有するモノクローナル抗体を含む請求項14に記載のキット。
- 16.細菌の増殖を阻害する量の抗生物質と組み合わせて上記の生きている該微 生物を用いて免疫を行うか、細菌の増殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生き ている該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うか、又は該抗生物 質或いは食細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホルムアルデヒドを用いて 生きている該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うことにより作 製したモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項15に記載のキット。
- 17.該抗体の固体支持体としての磁性粒子を含むことを特徴とする請求項14 に記載のキット。
- 18.該モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクロ ーナル抗体でコートして、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベ ートして得られる、該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特 異的親和性を有するようにした磁性粒子を含むことを特徴とする請求項17に記 載のキット。
- 19.rRNA配列の部分配列に基づくPCR用プライマーを含むことを特徴と する請求項14に記載のキット。
- 20.DNAの複製開始点配列の部分配列に基づくPCR用プライマーを含むこ とを特徴とする請求項14に記載のキット。
- 21.サルモネラ属細菌の分所用であり、以下のPCR用オリゴヌクレオチドプ ライマーを含むことを特徴とする請求項14に記載のキット。 プライマー1:【配列があります】 プライマー2:【配列があります】
- 22.クレブシエラ属細菌の分析用であり、以下のPCR用オリゴヌクレオチド プライマーを含むことを特徴とする請求項14に記載のキット。 プライマー1:【配列があります】プライマー2:【配列があります】発明の詳 細な説明
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