JPH06502534A - 微生物を分析する方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 微生物を分析する方法及びキット 本発明は、試料中の微生物を分析する方法及びキットに関する。

臨床検査における試料（例えば、尿、大便、唾液、痰、血清、血液、生検試料等 ）又は食物には、少数の病原性の可能性が高い菌種が多数の他の微生物種の中に 混在し得る。これらの病原性の可能性が高い細菌は選択培地により分析する。

例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌を分析する典型的な方法は、サ ルモネラ／シゲラ（Ｓｈ　ｉｇｅ　ｌ　Ｉａ）寒天培地における培養及びセレナ イトに富む寒天培地上で増面の後、生化学的及び血清学的な同定を行うものであ る。この典型的な方法には実質的な欠点、特に長時間の集中的な労働を要すると いう欠点があった。

米国特許第４．６７７，０５５号は、上記の典型的方法のバリエーションを開示 しており、その中で分析すべき微生物をまず試料から単離している。この方法に よると、特定の抗原決定基を有する病原菌が存在する生物学的培地に上記の抗原 決定基に対する抗体が結合している磁性ゲルを接触させる。

次にこの磁性粒子を磁石棒で取り出し寒天培地上に植えつけて断面が約１ｃｍの スポットを形成させる。この寒天培地を上記のスポットと同じ大きさのコロニー が形成するようにインキュベートした後、例えば典型的な細菌学的方法によりコ ロニー中の菌を同定することができる。

また、臨床検査用試料又は食物中の、サルモネラ菌のような特定な型の細菌の存 在をポリクローナル又はモノクローナル抗体を用いるエンザイムイムノアッセイ やＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏ＋ｂｅｎ＋　ａ ｓｓａｙ）により分析する方法も開発されている。このような分析は１〜２日以 内で実施できるが、実際の分析を始める前に試料中の微生物をまず増殖培地中で 増やさなくてはならない。その上、このような免疫化学的検出には、目的の微生 物と抗血清との区別が困難であり１０６細胞／　ｍ　Ｑより高い感度は実現でき ないという欠点がある。

上記の米国特許第４，６７７．０５５号はまた、細菌の特徴を分析する免疫学的 技術も開示している。この目的のために、寒天培地上のコロニーのすぐ近くに凹 部を設け、これを特異的抗血清で満たし、コロニーを溶解する。コロニーからの 抗原の拡散と抗血清で満たした凹部からの抗体の拡散により免疫沈降物が生じ、 次いでこの沈降物を染色する。この操作には約２日を要する。

これに代わって、現代のＤＮＡ技術を用いる新たな微生物の分析法が提案されて いる。分析の速さと感度の点から、特定の微生物（特定の属、種又は株）に特異 的なプライマーを用いるＰＣＲ（ｐｏｌｙ［ｏｅｒｘｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａ ｃｔｉｏｎ）によるＤＮＡ配列の増幅が有望と考えられる。しかし、ＰＣＲ技術 には、多量に混在するＤＮＡにより目的ＤＮＡの増幅が阻害されるという実質的 な欠点がある。

ジャンセン（Ｊａｎｓｅｎ）ら（ＰＮＡＳ　ＵＳＡ　８７．１９９０．２８６７ −２８７１）は、Ａ型肝炎ウィルス（ＨＡＶ）の分析システムを開示している。

この分析システムでは、１　、５　ｍ　Ｈのエツベノドルフチューブを抗ＨＡＶ モノクローナル抗体でコートし、ＨＡＶを含有する大使試料をチューブに入れ１ 晩インキユベートの後、懸濁液を洗浄除去し適切な緩衝液を加え、ＲＮＡから（ ＨＡＶはＲＮＡウィルスである）ＤＮＡへの逆転写を行い、このＤＮＡを他の緩 衝液中でＰＣＲにかける。この操作には約２４時間かかる。このシステムの長所 としては、抗体段階での特異性、ＰＣＲの感度及びＰＣＲ産生物の特異性の簡単 な確認が組み合わさっていることがある。しかし、この方法にも実質的な短所、 即ちサルモネラ菌等の病原菌の分析には使用できないという短所があった。細菌 感染とは異なり、ウィルス感染では近縁の微生物種の存在が問題となることはほ とんどないか或いは全くない。また、細菌が混在するサンプルをＰＣＲに適する ような状態に戻す操作は、実際に不可能である。

一方、単一株の培養液についてのＰＣＲのプロトコールは幾つかある。例えば、 細菌を遠心分離によりベレットにし、水を加え９５℃で１０分加熱の後プロトコ −ルＫを加え５５℃で１０分インキュベートする。プロトコ−ルを９５℃で１５ 分加熱することにより不活化した後ＲＮａｓｅを加え３７℃で１５分インキュベ ートする。これらの操作の後に初めてＰＣＲを行う［バリー（Ｂａｒｒｙ）　ら 、ＢｉｏＩｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　８，１９９０、２３３〜２３６］。

成る場合には、溶菌及びプロトコ−ルに処理の後、まずフェノール抽出及び場合 によっては塩化セシウム勾配を行うことにより精製したＤＮＡを出発物質として 用いている［バーネット（Ｂｅｒｎｅ＋）ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、帽ｃｒｏｂｉｏ １．２７．１９８９．２４９２−２４９６；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）　ら、 Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、帽ｃｒｏｂｉｏ１．２８゜１９９０、１９４２−＋９４６；ブ リ力イティス（ｐ＋１ｈａｙ＋１ｓ）ら、Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌ、　２８．１９９０．１９１３−１９１７１゜上記の方法に類似するものとし て、ＤＮＡ精製をフェノール抽出及び塩化セシウム勾配により行うプロトコール に従って、生検試料、血清又は血液からウィルスＤＮＡを抽出する方法がある［ カネコ（Ｋａｎｅｋｏ＞　ら、ＰＮＡＳυＳＡ　１１６．１１８９，３１２−３ １６：メイトランド（Ｍａｉｔｌａｎｄ）　ら、Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅ ｒ　５９．１９８９、６９８−７０３を参照」。

大便を介する腸内細菌（ｅｎｔｅ＋ｏｂａｃ＋ｅ＋１ａｃｅａｅ）の感染が起き ている可能性がある水については、ごく少数の粒子と他の細菌が存在することか ら試料を比較的簡単な方法で調製することができる。即ち、２回の遠心分離又は 濾過操作で十分である。次いで、得た細胞から溶菌用緩衝液を用いてＤＮＡを遊 離させ、これらの細胞に５０ｍＭ　ＫＣＩ、　１０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　 （ｐＨａ、ｔ３）、１．５　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．０．０１％ゼラチン、０．０５ 　Ｈ／ｍｌプロテイナーゼＫ、　２０　ｍＭジチオスレイトール、及ヒ１．８　 μＭ　ＳＤＳを加える。１５秒のボルテンクヌにかけた後、混合物を３７℃で１ 〜１．５時間インキュベートし、次に８０℃で５分加熱することによりプロテイ ナーゼＫを不活化して、ＰＣＲを行う［アトラス（Ａｔｌａｓ）とベジ（Ｂｅｉ ）著、インニス（Ｉｎｎｉｓ）　、シェルフアンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）　、スニ ンスキー（Ｓｎｉｎｓｋｙ）及びホワイト（Ｗｈｉｔｅ）編集、サンディエゴ市 所在のアカデミツクブレス社出版の“ＰＣＲプロトコール一方法と応用のための ガイド（ＰＣＲｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　；　ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄ ｓ　ａｎｄａｐｐｌ　１ｃａｌｉｏｎｓ）、　３９９−４０６、を参照］。

また、汚物試料から細菌を単離するために、混合及び遠心分離操作を何度か行っ た後、溶菌及びとりわけ塩化セシウム勾配によるＤＮＡ精製が行われている［ス デファン（Ｓｌｅｌｆａｎ）とアトラス（Ａｔｌａｓ）　、　Ａｐｐｌ、　Ｅｎ ＋＋ｉｒｏｎｍ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　５４゜１９８８、２１８５−２１９ １１゜ 本発明は、全ての先行技術とは異なり、種々の試料中の細菌、菌類及び酵母を、 速かに、特異的及び感度の良いやり方で、検出可能にする方法及びキットを提供 する。

本発明の第１の態様によれば、試料中の微生物を分析する方法にして、検出すべ き微生物に対し特異的親和性を有する抗体及びこれらの抗体の固体支持体を用い て該試料からこれらの微生物を単離し、次いで単離した微生物のＤＮＡを、分析 すべき該微生物に特異的なプライマーを用いてＰＣＲにかけることを包含する方 法が提供される。

本発明の第２の態様によれば、検出すべき微生物に対し特異的親和性を有する抗 体を含む、試料中の微生物分析用キットにして、該抗体がそれらの固体支持体に 結合しているか、或いは１分析すべき微生物に特異的なＰＣＲ用ブラプライマー ントと同様に更に該キットに備えであるところの抗体用固体支持体に結合するこ とのできる試薬と共に提供されることを特徴とするキットが提供される。

本発明の方法は特に、特定の属、種或いは株の細菌、菌類又は酵母よりなる微生 物の分析に適している。これらの検出すべき微生物を試料から単離するような、 この微生物に対し特異的親和性を有する抗体の使用と、これらの微生物自体のＤ ＮＡを増幅するような、分析すべき微生物に対し特異的なＰＣＲ用ブラプライマ ーットの使用との組み合わせにより、例えば細菌について異なる属、異なる種、 また異なる株でさえも区別することができる。

本発明は、臨床検査における試料（尿、大便、痰、唾液、血清、血液、生検試料 等）又は食物における病原菌の分析法に限定されるのではなく、パン、ビール、 ワイン、チーズ、ヨーグルト等の消費産物の作製に用いる酵母及び／又は菌類等 の同定法をも包含する。しかし１本発明は、従来の方法では満足のいくやり方で は出来なかった病原菌の分析に利用するのが好ましい。例えば、本発明は特にサ ルモネラ、クレブシェラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）又はリステリア（Ｌｉｓｔｅ ｒｉａ）属の中の１つの属の細菌よりなる微生物の分析に適している。一つには 、本発明の用途として細菌の分析が好ましいことから、以後は便宜上しばしば細 菌を参照して記述するが、本発明はこれに限定されるものではない。

最も信頼できる結果を得るためには、所望の微生物の単離に用いる抗体（好まし くはモノクローナル抗体）が生きている細菌と反応できること、即ち生きている 細菌に対する特異的親和性を有し結合できることが必要である。特にＤＮＡを含 有するのが生きている細菌であることから、本発明においては最終的な検出は該 細菌のＤＮＡを用いて行う。

従って、本発明によれば、分析すべき微生物を試料から単離するために、生きて いる該微生物に対して作製したモノクローナル抗体を用いること、即ち該抗体を 産生ずる試験動物（大抵はネズミ）を生きている細菌（少なくともこの条件に近 いもの）を用いて免疫していることが好ましい。ヒトに感染するがネズミに対し ては病原性を有さないＨＡＶのようなウィルスの場合は、このことはそれほど問 題にはならないが、マウスに対しても病原性を有するサルそネラ菌等の場合は、 そのような免疫処置は不可能と考えられる。

これまでに発表されているサルモネラ菌に対するモノクローナル抗体は死菌のみ と反応するものであり、このことば菌を含む試料をまず＃、ｓしなくてはならな いことを意味する。

これは一般に、サルモネラ菌の検出用に現在用いられている全ての免疫学的アッ セイに当てはまる。しかし、菌を煮沸することにより細胞が溶解しＤＮＡを含ま なくなってしまうので、ＰＣＲはもはや不可能となってしまう。

従って、生きている病原菌に対するモノクローナル抗体を得ようとする場合は、 従来の免疫方法は用いることはできない。これには２つの明らかな理由がある。

第１に、免疫応答を得るためにアジュバントを用いる方法があるが、この方法に は、アジュバント中の生物が本来有する蛋白が変性して多数のエピトープが破壊 されるという欠点がある。従って、アジュバントを用いる処理又はアジュバント 中への取り込みの後でも構造の変わらない蛋白部位と反応するモノクローナル抗 体が特に得られている［リュク（Ｌｕｋ）ら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔ ｈ、　＋２９．１９９０．２４３−２５０；メイソンスミス（Ｍａｓｏｎ　Ｓｍ １ｔｈ）及びボッター（Ｐｏ＋１６ｒ）、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１１４．　 ＋９７５．　ｌｌ１ｆ４７−１８５０；フェンダ（Ｆｅｎｇ）ら、Ｊ、　Ｇｅｎ 、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　１３６．１９９０．３３７−３４２を参照コ。

第２に、免疫すべき動物に対し病原性を有する天然の生物の場合は、その生物を 用いる免疫は基本的に不可能である。

この問題を避けるために、実際に免疫する際に該生物蛋白質を単離した形でしば しば用いるが、慎重に単離した蛋白を大抵はアジュバントと同時に注射するため に非常に弱い免疫応答しか示さない［サダラー（Ｓａｄａｌｌａｈ）ら、Ｊ、　 Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｄｉｓ。

＋６１．１９９０．５９−６４を参照］。生物又は単離した蛋白の完全な変性の 結果、抗原はより高い免疫原性を有するようになるが、アジュバントを用いる処 理又は他の変性方法のために、多数の３次元構造のエピトープがなくなってしま う。従って、刺激された該免疫系はこのようなエピトープに対し何ら免疫応答を 示さない。しかし生きている細菌上では、３次元構造のエピトープは生物の食物 供給及び移動に係ることがら特に多く存在する。

本発明により、上記の課題の解決法が幾つか判明した。天然のエピトープに対す る免疫応答を得るために、本発明では生きている細菌又はこの条件に最も近い細 菌を用いる免疫を行う。１つの方法によれば、細菌を抗生物質と共に実験動物に 注射する。その結果、生じる静細菌性効果（ｂａｃ＋ｅｒｉｏｓｔａ＋ｉｃ　ｅ ｆｆｅｃ＋）により増殖は阻害されているがまだ生きている菌が免疫系に侵入す るようになる。生きている菌に対して免疫応答を得るための第２の方法によれば 、該菌株を低濃度のホルマリンで処理する。あり得る結果として、食細胞による 細菌の取り込み（病原菌はしばしば食細胞に取り込まれて、免疫系に対し細胞内 にまた不可視的に生存し続ける）が阻害されるが、その程度は該菌の免疫系の細 胞への侵入が起きるような程度である。

従って、本発明によれば、上記のモノクローナル抗体の作製のために、細菌の増 殖を阻害する量の抗生物質と組み合わせて上記の生きている該微生物を用いて免 疫を行なうか、細菌の増殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生きている該微− 生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うか、又は該抗生物質或いは食 細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホルムアルデヒドを用いて生きている 該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うことが好ましい。

本発明によれば、分析すべき微生物の単離に用いる抗体は固体支持体に結合して いるか或いは結合するようにしなくてはならない（或いは、場合によっては、抗 体と固体支持体が、後に起こるカンプリングが可能なように、ビオチン／アビジ ン系、ハブテン／アンチハブテン系等によって、適切に改変しているならば、試 料中に存在する微生物との反応の後でもよい）。上記の固体支持体の性質には特 に限定はなく、例えば遠心分離により試料の残りから分離することのできる金属 、プラスチック又はガラスの不活化粒子よりなるのが好ましいが、本発明によれ ば、磁力を用いて試料から拾い出すのが非常に簡単である磁性粒子を用いるのが すこぶる好ましい。チューブの壁を抗体の固体支持体として用いる方法に較べ、 粒子（特に磁性粒子）を使用した場合は、試料との適切な接触により微生物と抗 体との最適な結合を実現するのに非常に少ない時間で済む。

従って、本発明によれば、該抗体の固体支持体として磁性粒子を用いることによ り、分析すべき該微生物を試料から単離することが非常に好ましい。また、分析 すべき微生物に対し特異的親和性を有するモノクローナル抗体が結合する磁性粒 子を試料に加え、インキュベートの後、該分析すべき微生物が存在した場合該磁 性粒子に結合したそれらの微生物を該磁性粒子から分離することにより、該分析 すべき微生物を該試料より単離するのが最も好ましい。また更に、該モノクロー ナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクローナル抗体でコート して、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベートして得られる、 該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特異的親和性を有する ようにした磁性粒子を用いることが好ましい。該モノクローナル抗体が免疫グロ ブリン、例えばネズミに由来する免疫グロブリンの場合は、該磁性粒子は例えば ネズミ免疫グロブリンに特異性を有するヤギの免疫グロブリンでコートするのが よい。

細菌やその他の微生物は、固体表面に対し特異的結合又は特異的付着効果を示す 。このことは、調べる試料が分析すべきサルモネラ菌等の微生物の他に他菌種を も含有している場合に、特に大きな問題となる。この問題は、少数の分析すべき 細菌が過剰蚊の他の微生物の中に存在する場合、例えば１００万個の大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅ＋１ｃｉａ　ｃｏｌｉ）に対し１個のサルモネラ菌が存在する場合、更 に深刻な問題となる。このような場合、米国特許第４，６７７．０５５号に開示 の方法では、サルモネラ菌に対し粒子に付着する大腸菌が完全に過剰であること から、不十分であろう。本発明は、検出法としてＰＣＲを用いることにより、上 記課題を完全に克服するものである。プライマーの適切な選択により、特異性と 高感度が確実になるが、これらの望ましい特性を得るためには、固体支持体から 分離し、溶菌（例えば６０〜１００℃に加熱して行う）及び遠心分離して得たＰ ＣＲ用上清として得るところの、菌体から遊離したＤＮＡを用いてＰＣＲを行う のが適切である。

従って、本発明によれば、該磁性粒子に結合している微生物からＤＮＡを皐離し 、該磁性粒子の非存在下で単離したＤＮＡをＰＣＨにかけることが好ましい。そ の他本発明においては、ＰＣＲ用に回収する試料は少量でよいこと、腸内細菌や リステリア菌等の分析を目的とする場合でも、溶菌用緩衝液、フェノール抽出及 び塩化セシウム勾配を必要としないということがある。

ＰＣＲの条件それ自体は、しばしば用いられるＴａｑポリメラーゼ等のＰＣＲに 適したＤＮＡポリメラーゼの種類と同様に、当業者にはよく知られている（例え ば米国特許第４゜６８３．２０２号を参照）。しかし、プライマーの選択につい ては本発明の方法に特異的であり、この選択によって、本発明の方法が特定の属 、特定の種の微生物、また特定の株の微生物についてさえも特異的であることが 確実になる。しかし、適切なプライマーを見つけるのは必ずしも簡単ではない。

例えば、サルモネラ属のような特定の属の微生物に対する特異性を確実にする場 合、即ち、サルモネラ菌に属する全ての穐及び株を本発明方法で識別する一方で 他の属の細菌は識別しないことをめる場合、プライマーの選択が問題となる。

ｒＲＮＡ配列が特定の属において非常に類似していることは知られており、この ことはすでにハイブリダイゼーションの実験において利用されている（ＥＰ−Ａ −０３５７３０６゜ＥＰ−Ａ−０２７７２３７及びＷＯ２８１０３９５７を参照 ）。ｒＲＮＡプライマーの使用はチェノ（Ｃｈｅｎ）らによりすでに発表されて いるが（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｌｅｔ＋、　５７．１９８９、１９−２４ ）　、これは通常の微生物の分析に用いられている。

ｒＲＮＡプライマーの使用は本発明が包含する１つの可能性であるが、全ての場 合に適するというわけではない。特にサルモネラ菌の場合はｒＲＮＡ配列にかな り著しい配列変異があることが分かつている。ｒＲＮＡに代わる適切な配列が細 菌染色体の“ＤＮＡ複製開始点”　（ｏ　ｒ　ｉ　Ｃ）の配列中に見い出されて おり、幾つかの腸内細菌についてｏｒｉＣ配列が知られている［コーンバーブ（ Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）著、サンフランシスコ市所在のフリーマンと＝＋　＋、（Ｆ 【ｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、）出版の”　Ｄ　Ｎ　Ａ複製についての補足（Ｓ ｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｔｏ　ＤＮＡ　＋ｅｐｌｉｃａｌｉｏｎ）”コ。このｏｒ ｉＣ配列は、腸内細菌間で保存される領域と変異可能な部分配列よりなる。しか し、これらの変異可能な部分配列はサルモネラ属等においては内部に保存される ことから、菌属に特異的なＰＣＲ用プライマーの基礎として役立つかどうかは不 明であった。

従って本発明は、ＰＣＲにおいて、ｒ　ＲＮＡ配列の部分配列に基づくプライマ ーを用いることを包含する。このようなアプローチは、実際にリステリア菌など に有用であることが判明している。

また、本発明は、ＰＣＲにおいて、ＤＮＡの複製開始点配列の部分配列に基づく プライマーを用いることを包含する。

上記方法の第１の具体例として、サルモネラ属細菌の分析用であり、以下のオリ ゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲにおいて用いることを特徴とする方法がある 。

プライマー１：　５’−ＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣＧＣＧＣＣＡＧＧＣ−３゜ プライマー２：　５’　−ＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＴＣＡＣ−３’ 本発明の上記プライマーの使用については、具体的な実施例において更に詳述す る。

上記方法の第２の具体例として、クレブシェラ属細菌の分析用であり、以下のオ リゴヌクレオチドブライマーをＰＣＲにおいて用いることを特徴とする方法があ る。

プライマー１：　５’−ＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＡ−３’ プライマー２：　５°−ＴＣＴＴＣＴＧＴＧＧＡＴＡＡＣＴＡＴＧＣ−３’ このプライマーの組み合わせとクレブシェラ菌に特異的なモノクローナル抗体の 使用により、本発明の方法がクレブシェラ属細菌について選択的であることが実 験を通して証明されている。このことは、クレブシェラ・オキシト力（Ｋｌｅｂ ｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙ＋ｏｃａ）及びクレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓ ｉｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）については陽性の結果であり、エシェリヒ ア・フリ　（Ｅｓｃｈｅ＋１ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　、シトロバクタ−・フロイ ンデイイ（Ｃｉｔｔｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｒｅｕｎｄｉｉ）　、セラチア・マルセ ツセンス（Ｓｅｒｒａ）ｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）　、プロテウス轡ミラと リス（Ｐｒ。

ｔｅｕｓ　ｍ１ｒａｂｉｌｉｓ）　、エンテロバクタ−〇クロアケ（Ｅｎ４ｅ＋ ｏｂａｅｖｅｒ　Ｃ１ｏａｃａｅ）　、及びエンテロバクタ−・ｘｏゲネス（Ｅ ｌｅ＋ｏｂａｃｔｅｒ　ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）については陰性の結果であること を意味する。

しかし、ＰＣＲにおいていずれのプライマーも有用及び活性であるわけではない 。従って、クレブシェラ菌の分析用としてｏｒｉｃ配列に基く以下のプライマー の組み合わせが確立されている。

プライマー１：　５’　−ＣＴＴＧＴＣＴＴＧＴＧＧＡＴＡＡＧＴＣＡ−３’ プライマー２：　５′−ＡＡＧＴＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＣＣＴＧＡ−３゜ 以下の実施例においては、生きているサルモネラ菌と結合することのできるモノ クローナル抗体を使用した。これらのモノクローナル抗体を産生ずるハイブリド ーマは、以下の寄託番号の下に、１９９０年１１月２８日に英国のＥＣＡＣＣ（ Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏ［Ａｎｉｍ＠ｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ １ｔｕｒｅｓ）　＋こ寄託した： ＭＡＢ　５５−２３−Ｂ７　：　ＥＣＡＣＣ９０１１２８０７ＭＡＢ　７Ｏ−２ −２Ａ　：　ＥＣＡＣＣ９０１１２８０８ＭＡＢ　７ｌ−４０−Ａｌ　：　ＥＣ ＡＣＣ９０１１２８０９Ｘ産五 ＰＣＲ技術により、ＤＮＡの複製開始点の配列である１６０ｂｐの部分配列の増 幅を行った。この目的のため、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅ ｌｌａ　［ｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）の複製開始点に由来する配列を有するプライマ ーを用いた。これらのオリゴヌクレオチドプライマーは、フェルマシア・エルケ ービー・ジーン・アセンブラ−・プラス・シンサイザー（ｐｈａｒｍａｃｉａ　 ＬＫＢ　Ｇｅｎｅ　Ａｓｓｅｍｂｌｅｒ　Ｐｌｕｓ　５ｙｎｔｈｅｓｉｘｅｒ） を用いホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｌｅ）技術により合成 した。

合成オリゴヌクレオチドは、脱保護及び固体支持体からの切り出しの後、ＮＡＰ 　１０カラムクロマトグラフイーにより精製した。得られたプライマーは以下の 配列を有していた゛プライマー１＋　５’−ＴＴＡＴＴＡＧＧＡＴＣ’ＧＣＧＣ ＣＡＧＧＣ−３″ プライマー２：　５’　−ＡＡＡＧＡＡＴＡＡＣＣＧＴＴＧＴＴＣＡＣ−３’ 上記のプライマーのセットの、サルモネラ菌２７株及びサルモネラ菌以外の他の 腸内細菌１９株に対する特異性をＰＣＲにより調べた（表Ａ）。ＰＣＲ混合液（ 最終体積：１００ｐＱ）は、１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ（１（ｐＨ８，３） 、５０ｍ　Ｍ　Ｋ　ＣＱ、１　、５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　ＣＱ　２．０．００１％ （Ｗ／■）ゼラチン、１００μＭの各ｄＮＴＰ、０．５μＭの各プライマー、及 び１．２５ＵのＡｍｐ　ｌ　ｉ　−Ｔ　ａ　ｑポリメラーゼ（米国カリフォルニ ア州エメリーヴイル市所在のシータス社製）よりなるものを使用した。増幅は、 パーキン−エルマー・サーモサイクル（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｔｈｅ＋ｍ ｏｃｙｃｌｅ　；米国コネティカット州ノーウオーク市所在のパーキン−エルマ ー・インストルメンツ社製）を用いて２５サイクルで行った。１サイクルは、９ ４℃１分の変性段階、５０℃１分のプライマー・アニーリング段階、及び７２℃ １秒の伸長段階よりなるものとした。増幅後、試料１５μＱを１．５％アガロー スゲル電気泳動にかけ、泳動したＤＮＡをエチジウムプロミドで染色上記の各ｄ ＮＴＰと同様、独国ベイリンガ−・マンハイム社より入手した）。

増幅後、所望の長さのＤＮＡ断片がサルモネラ・ティフィムリウムばかりでなく 、調べた全てのサルモネラ菌について見つかった。一方、シゲラ、エシェリヒア ・コリ、シトロバクタ−、シュードモナス等の他の腸内細菌については増幅され た断片は見つからなかった。従って、選択したプライマーはサルモネラ菌に特異 的であることが導かれた。

本発明の方法の選択性及び特異性 ５Ｘ１０’〜５Ｘ１０２細胞／　ｍ　Ｑに段階希釈したサルモネラ・ティフィム リウム（各１００μＱ）について、本発明の方法で調べた。磁性粒子として、米 国プラウエア州つイルミントン市所在のデュポン社より入手したマグニソート（ Ｍａｇｎｉｓｏｔｌ）　Ｍ粒子（磁性の二酸化クロム）を用いた。またこれらの 粒子は、マウスのＩｇＧ及びＩｇＭに特異的なりギの免疫グロブリンでコートし た。モノクローナル抗体（サブクラ、ＫＩｇＭ）のサルモネラ菌に向けた磁性粒 子との結合は、１％ゼラチンを含むリン酸塩緩衝食塩水（ｇＰＢｓ）中で、コー トした磁性粒子と共にハイブリドーマの培養上清を３５℃で５分インキュベート することにより起こった。磁性粒子は上清を捨てた後磁石を用いて単離した。

分析用試料をｇＰＢｓに懸濁し、磁性粒子を加えた。３５℃で１５分インキュベ ートした後、磁性粒子を磁石を用いて皐離し、これをｇＰＢｓで３回洗浄した。

最後の洗浄操作の後、磁性粒子を２回蒸留して得た蒸留水に再懸濁した。

磁性粒子と共に抽出した細菌について直接ＰＣＲを行う試みにおいて、増幅が磁 性粒子により阻害されることが分かった。このため、サンプルを１００℃で５分 インキュベートすることにより菌体を破砕し、短時間遠心分離にかけた後、細菌 ＤＮＡを含む上清画分をＰＣＲにかけた。ＰＣＲは３５回のＤＮＡ増幅サイクル で、前述の方法に従って実施した。

その結果（ここには示さない）、本発明の方法によれば１０３個の細胞が検出で きることが分った。更にサルモネラ菌とモノクローナル抗体を結合した磁性粒子 との結合能を測定するために、細菌培養後に得られた上清もＰＣＲにかけたが、 目的とするＤＮＡの増幅は見られなかった。これより、サルモネラ菌と磁性粒子 上のモノクローナル抗体との結合は完全であることが導かれる。

その後の実験により、本発明の方法によれば、１０７個のサルモネラ菌以外の細 菌［エシェリヒア・コリ、シュードモナス０エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）　、クレブシェラ・オキシト力及びシトロバクタ −・フロインディイコを含む試料中の、１０３個のサルモネラ菌を分析できるこ とが示された。エシェリヒア・コリ、シュードモナス・エルジノーサ、クレブシ ェラ・オキシト力及びシトロバクタ−・フロインディイとｇＰＢＳを用いるコン トロール実験においては、検出可能な増幅は観察されなかった。

表Ａ　サルモネラ菌と他の腸内細菌にってのＰＣＲ増幅ＰＣＲサルモネラ菌の 増幅　血清型 Ｓ、デュラッツォ（Ｓ、　ｄｕｒａｚｚｏ）　十ＡＳ、クリニカル・アイソレー トＭ十Ａ （Ｓ、　ｃｌｉｎｉｃａｌ　１ｓｏｌａｔｅ　Ｍ）Ｓ、ティフィムリウム　Ｌ　 ＋　Ａ （Ｓ、＋ｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　Ｌ） Ｓ、ティフィムリウム　１７２４　十　Ｂ（Ｓ、　＋７ｐｈｉｍｕｔｉｕｍ　＋ ７２４）ＰＣＲサルモネラ菌の 増幅　血清型 Ｓ、ティフィムリウム　１４Ｈ＋Ｂ （Ｓ、　［ｐｈｉｍｕｅｉｕｍ　１４）１）Ｓ、ブレデ＝　−（Ｓ、　ｂｔｅｄ ｅｎＹ）　十ＢＳ、デルビー（Ｓ、　ｄｅｒｂｙ）　十ＢＳ、ハイデルベルグ　 十　Ｂ （Ｓ、ｈｅｉｄｅｌｂｅ＋ｇ） Ｓ、プランデンブルグ　十　Ｂ （Ｓ、ｂｒａｎｄｅｎｂｕ＋ｇ） Ｓ、クリニカル・アイソレート１０．２＋　Ｂ（Ｓ、ｃｌｉｎｉｃａｌ　１ｓｏ ｌａｔｅ　１０．２）Ｓ、セントポール　＋　Ｂ （Ｓ、　５ａｉｎ＋ｐａｕｌ） Ｓ、バラティフィ　Ｂ　＋　Ｂ （Ｓ、　ｐａ＋ａ＋ｙｐｈｉ　Ｂ） Ｓ、アボルタスイクィ　十　Ｂ （Ｓ、　ａｂｏｒｔｕｓ　ｅｑｕｉ） Ｓ、インファンティス（Ｓ、　１ｎｆａｎ！　ｉｓ）　＋　ＣＩＳ、ニューボー ト（Ｓ、ｎｅｗｐｏ＋＋）　十Ｃ２Ｓ、ベレム（Ｓ、ｂｅｌｅｍ）　＋　Ｃ５， クリニカルアイソレート１１５９　＋　Ｃ１（Ｓ、ｃｌｉｎｉｃａｌ　１ｓｏｌ ａｔｅ　８５９）Ｓ、バラティフイ　Ｃ（Ｓ、ｐａ＋ａｔｙｐｂｉ　Ｃ）　十Ｃ ５，パナ？　（Ｓ、　ｐａｎａｍ＠）　＋　ＤＳ、タイフォーサ（５，１７Ｐｈ ｏｓａ）　＋　ＤＳ、エンテリディティス　＋　Ｄ （Ｓ、ｅｎｌｅｒｉｄｉｌｉｓ） ＰＣＲサルモネラ菌の 増幅　血清型 Ｓ、シャルガー＝　（Ｓ、ｓｈａ＋ｇａｎｉ）　＋　ＥＳ、ギヴ（Ｓ、ｇｉｖｅ ）　＋　Ｅ Ｓ、プレトリア（Ｓ、ｐ＋ｅｔｏ＋ｉａ）　十ＦＳ、アトランタ（Ｓ、ａｔｌａ ｎ＋ａ）　十ＧＳ、ウォーシントン（Ｓ、ｖｏｒ＋ｈｉｎｇｌｏｎ）　＋　Ｇエ シェリヒア・コリ　− （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）エシェリヒア・コリ　０７ＫＩ　− （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０７Ｋｌ）（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｐ ｎｅｕｍｏｎｉａ　１．８８）クレブシェラ・オキシト力　− （Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ｏｘｙｊｏｃａ）シトロバクタ−・フロインデイイ　 − （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　Ｆｔｅｕｎｄ目）シトロバクタ−・ダイパーサス　 − （Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ　ｄｉｖｅｒｓｕｓ）セラチア・リフファシェンス　 − （Ｓｅｒｒａｌｉａ　ｌ１ｑｕｆａｃｉｅｎｓ）セラチア・マルセッセンス　− （Ｓｅｒｒａｌｉａ　１ｌＩｌａｒｃｅｓｃｅｎｓ）エンテロバクタ−・アグロ メランス　−（Ｅｒ＋＋ｅ＋ｏｂａｃ＋ｅｒ　ａｇｇｌｏｍｅ＋ａｎｓ）ＰＣＲ サルモネラ菌の 増幅　血清型 エンテロバクターーエロゲネス　− （Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ＋ｅ＋　ａｅｔｏｇｅｎｅｓ）（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃ＋ｅ ＋　ｃｌｏａｃｅａｅ）プロテウス・ミラビリス　− （Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｍｉ＋ａｂｉｌｉｓ）（Ｐｒｏｔｅｕｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ ）国際調査報告 国際調査報告 ＮＬ　９１００２３０ Ｓ＾　５３６１０ フロントページの続き （８１）指定回　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＴ、　ＬＵ、　ＮＬ、　ＳＥ）、　Ｃ Ａ、ＪＰ、　ＵＳ

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．試料中の徴生物を分析する方法にして、検出すべき微生物に対し特異的親和 性を有する抗体及びこれらの抗体の固体支持体を用いて該試料からこれらの微生 物を単離し、次いで単離した微生物のＤＮＡを、分析すべき該微生物に特異的な プライマーを用いてＰＣＲにかけることを包含する方法。
2. ２．上記の分析すべき微生物が、特定の属、種或いは株の細菌、菌類又は酵母よ りなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. ３．上記の分析すべき微生物が、サルモネラ、クレブシエラ又はリステリア属の 中の１つの属の細菌よりなることを特徴とする請求項１に記載の方法。
4. ４．上記の分析すべき微生物を試料から単離するために、生きている該微生物に 対して作製したモノクローナル抗体を用いることを特徴とする請求項１に記載の 方法。
5. ５．上記のモノクローナル抗体の作製のために、細菌の増殖を阻害する量の抗生 物質と組み合わせて上記の生きている該微生物を用いて免疫を行うか、細菌の増 殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生きている該微生物を処理して得られる微 生物を用いて免疫を行うか、又は食細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホ ルムアルデヒドを用いて生きている該微生物を処理して得られる微生物を用いて 免疫を行うことを特徴とする請求項４に記載の方法。
6. ６．該抗体の固体支持体として磁性粒子を用いることにより、分析すべき該微生 物を試料から単離することを特徴とする請求項１に記載の方法。
7. ７．分析すべき微生物に対し特異的親和性を有するモノクローナル抗体が結合す る磁性粒子を試料に加え、インキュベートの後、該分析すべき微生物が存在した 場合該磁性粒子に結合したそれらの微生物を該磁性粒子から分離することにより 、該分析すべき微生物を該試料より単離することを特徴とする請求項１に記載の 方法。
8. ８．該モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクロー ナル抗体でコートして、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベー トして得られる、該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特異 的親和性を有するようにした磁性粒子を用いることを特徴とする請求項７に記載 の方法。
9. ９．該磁性粒子に結合している微生物からＤＮＡを単離し、該磁性粒子の非存在 下で単離したＤＮＡをＰＣＲにかけることを特徴とする請求項１に記載の方法。
10. １０．ＰＣＲにおいて、ｒＲＮＡ配列の部分配列に基づくプライマーを用いるこ とを特徴とする請求項１に記載の方法。
11. １１．ＰＣＲにおいて、ＤＮＡの複製開始点配列の部分配列に基づくプライマー を用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。
12. １２．サルモネラ属細菌の分析用であり、以下のオリゴヌクレオチドプライマー をＰＣＲにおいて用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。 プライマー１：【配列があります】 プライマー２：【配列があります】
13. １３．クレブシエラ属細菌の分析用であり、以下のオリゴヌクレオチドプライマ ーをＰＣＲにおいて用いることを特徴とする請求項１に記載の方法。 プライマー１：【配列があります】 プライマー２：【配列があります】
14. １４．検出すべき微生物に対し特異的親和性を有する抗体を含む、試料中の微生 物分析用キットにして、該抗体がそれらの固体支持体に結合しているか、或いは 、分析すべき微生物に特異的なＰＣＲ用プライマーのセットと同様に更に該キッ トに備えてあるところの抗体用固体支持体に結合することのできる試薬と共に提 供されることを特徴とするキット。
15. １５．生きている該微生物に対し作製した、分析すべき微生物に対し特異的親和 性を有するモノクローナル抗体を含む請求項１４に記載のキット。
16. １６．細菌の増殖を阻害する量の抗生物質と組み合わせて上記の生きている該微 生物を用いて免疫を行うか、細菌の増殖を阻害する量の該抗生物質を用いて生き ている該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うか、又は該抗生物 質或いは食細胞による細菌の取り込みを阻害する量のホルムアルデヒドを用いて 生きている該微生物を処理して得られる微生物を用いて免疫を行うことにより作 製したモノクローナル抗体を含むことを特徴とする請求項１５に記載のキット。
17. １７．該抗体の固体支持体としての磁性粒子を含むことを特徴とする請求項１４ に記載のキット。
18. １８．該モノクローナル抗体に対し特異的親和性を有する磁性粒子を該モノクロ ーナル抗体でコートして、該モノクローナル抗体を該磁性粒子と共にインキュベ ートして得られる、該モノクローナル抗体が結合して分析すべき微生物に対し特 異的親和性を有するようにした磁性粒子を含むことを特徴とする請求項１７に記 載のキット。
19. １９．ｒＲＮＡ配列の部分配列に基づくＰＣＲ用プライマーを含むことを特徴と する請求項１４に記載のキット。
20. ２０．ＤＮＡの複製開始点配列の部分配列に基づくＰＣＲ用プライマーを含むこ とを特徴とする請求項１４に記載のキット。
21. ２１．サルモネラ属細菌の分所用であり、以下のＰＣＲ用オリゴヌクレオチドプ ライマーを含むことを特徴とする請求項１４に記載のキット。 プライマー１：【配列があります】 プライマー２：【配列があります】
22. ２２．クレブシエラ属細菌の分析用であり、以下のＰＣＲ用オリゴヌクレオチド プライマーを含むことを特徴とする請求項１４に記載のキット。 プライマー１：【配列があります】プライマー２：【配列があります】発明の詳 細な説明