JPH06165681A - メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キット - Google Patents
メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キットInfo
- Publication number
- JPH06165681A JPH06165681A JP32324092A JP32324092A JPH06165681A JP H06165681 A JPH06165681 A JP H06165681A JP 32324092 A JP32324092 A JP 32324092A JP 32324092 A JP32324092 A JP 32324092A JP H06165681 A JPH06165681 A JP H06165681A
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- methicillin
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 直接的で簡便、迅速かつ確実な黄色ブドウ球
菌のメチシリン耐性の判定法に用いる新規なオリゴヌク
レオチドを提供することである。 【構成】 配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号
７、または配列番号８に示す核酸配列を有するか、また
はそれらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌
検出用オリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチド
を標識化した標識オリゴヌクレオチド、および該オリゴ
ヌクレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを使用す
るメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬
キット。
菌のメチシリン耐性の判定法に用いる新規なオリゴヌク
レオチドを提供することである。 【構成】 配列表・配列番号１、配列番号２、配列番号
３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号
７、または配列番号８に示す核酸配列を有するか、また
はそれらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌
検出用オリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチド
を標識化した標識オリゴヌクレオチド、および該オリゴ
ヌクレオチドまたは該標識オリゴヌクレオチドを使用す
るメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬
キット。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はメチシリン耐性ブドウ球
菌検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたメチシリン
耐性ブドウ球菌の検出法およびその試薬キットに関し、
さらに詳細には臨床診断にてメチシリン耐性ブドウ球菌
を迅速かつ簡便に検出ならびに判定することに関する。
菌検出用オリゴヌクレオチド、これを用いたメチシリン
耐性ブドウ球菌の検出法およびその試薬キットに関し、
さらに詳細には臨床診断にてメチシリン耐性ブドウ球菌
を迅速かつ簡便に検出ならびに判定することに関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、ＭＲＳＡ（メチシリン耐性黄色ブ
ドウ球菌）とよばれる、メチシリンをはじめとするβラ
クタム薬全般に耐性を示す黄色ブドウ球菌の出現が問題
になっている。黄色ブドウ球菌は、皮膚軟部組織感染症
と総称される疾患の原因となる代表的な化膿菌である。
しかし、膿胸や黄色ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群など
といった重症感染症を起こすこともあり、食中毒の原因
にもなり得るなど、多様な症状を示す。そのため、起因
菌がＭＲＳＡであることを知らずに、通常の抗生物質の
投与のみに頼ると、重篤な状態に陥ることがある。この
ことは特に、免疫不全状態の患者や高度熱傷、未熟児等
に顕著で、生命の危険にさらされることが多い。それゆ
え、分離菌がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡ（メチシリン感
受性黄色ブドウ球菌）であるかの判定は非常に重要とな
る。
ドウ球菌）とよばれる、メチシリンをはじめとするβラ
クタム薬全般に耐性を示す黄色ブドウ球菌の出現が問題
になっている。黄色ブドウ球菌は、皮膚軟部組織感染症
と総称される疾患の原因となる代表的な化膿菌である。
しかし、膿胸や黄色ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群など
といった重症感染症を起こすこともあり、食中毒の原因
にもなり得るなど、多様な症状を示す。そのため、起因
菌がＭＲＳＡであることを知らずに、通常の抗生物質の
投与のみに頼ると、重篤な状態に陥ることがある。この
ことは特に、免疫不全状態の患者や高度熱傷、未熟児等
に顕著で、生命の危険にさらされることが多い。それゆ
え、分離菌がＭＲＳＡであるかＭＳＳＡ（メチシリン感
受性黄色ブドウ球菌）であるかの判定は非常に重要とな
る。
【０００３】従来、薬剤耐性の判定にはディスク法、液
体希釈法、寒天スクリーン法などの感受性試験がある。
これらの方法は細菌の増殖状態を判定の基準としている
ため、判定までに少なくとも２４時間以上を要し、測定
条件に充分留意していないと再現性が悪い結果になる。
しかも、ＭＲＳＡの耐性機構は誘導耐性であるため、こ
れらの感受性試験では判定が難しい場合があり、誤りを
生じ易い。このため、正確な判定を下すには数日を要す
ることもあり、迅速な判定を求められる場面に対応でき
ない。ＭＲＳＡにおけるメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃ
Ａ遺伝子）は既に配列が決定されており（FEBS Lett.;2
21巻167 頁1987年、Gene;94 巻137 頁1990年）、この遺
伝子の制限酵素断片を用いて核酸プローブを作製するこ
とは可能である。しかし、この制限酵素断片の調製には
多大な労力が必要であり、且つ困難である。さらにこれ
らのプローブはクローニングしたベクターのＤＮＡを含
んでいる場合があり、特異性に問題がある。また、長い
プローブを用いた場合、ハイブリダイゼーションに長時
間（１０時間以上）を要し、測定に時間がかかるという
欠点もある。オリゴヌクレオチドであれば、容易に化学
合成でき、プローブとして使用したときにハイブリダイ
ゼーションに要する時間を飛躍的に短縮することができ
る。しかし、その配列は充分な反応性と、他の核酸には
反応しない特異性をもっていなければならない。
体希釈法、寒天スクリーン法などの感受性試験がある。
これらの方法は細菌の増殖状態を判定の基準としている
ため、判定までに少なくとも２４時間以上を要し、測定
条件に充分留意していないと再現性が悪い結果になる。
しかも、ＭＲＳＡの耐性機構は誘導耐性であるため、こ
れらの感受性試験では判定が難しい場合があり、誤りを
生じ易い。このため、正確な判定を下すには数日を要す
ることもあり、迅速な判定を求められる場面に対応でき
ない。ＭＲＳＡにおけるメチシリン耐性遺伝子（ｍｅｃ
Ａ遺伝子）は既に配列が決定されており（FEBS Lett.;2
21巻167 頁1987年、Gene;94 巻137 頁1990年）、この遺
伝子の制限酵素断片を用いて核酸プローブを作製するこ
とは可能である。しかし、この制限酵素断片の調製には
多大な労力が必要であり、且つ困難である。さらにこれ
らのプローブはクローニングしたベクターのＤＮＡを含
んでいる場合があり、特異性に問題がある。また、長い
プローブを用いた場合、ハイブリダイゼーションに長時
間（１０時間以上）を要し、測定に時間がかかるという
欠点もある。オリゴヌクレオチドであれば、容易に化学
合成でき、プローブとして使用したときにハイブリダイ
ゼーションに要する時間を飛躍的に短縮することができ
る。しかし、その配列は充分な反応性と、他の核酸には
反応しない特異性をもっていなければならない。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、直接
的で簡便、迅速かつ確実な黄色ブドウ球菌のメチシリン
耐性の判定法に用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供
することである。
的で簡便、迅速かつ確実な黄色ブドウ球菌のメチシリン
耐性の判定法に用いる新規なオリゴヌクレオチドを提供
することである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｍｅｃＡ
遺伝子に関して種々の検討を重ねた結果、メチシリン耐
性の判定に適当なオリゴヌクレオチドを得、それを用い
た判定方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
遺伝子に関して種々の検討を重ねた結果、メチシリン耐
性の判定に適当なオリゴヌクレオチドを得、それを用い
た判定方法を確立し、本発明を完成させるに至った。
【０００６】すなわち本発明は配列表・配列番号１、配
列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号７または配列番号８（但し、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）に示される核酸配列を有するか、また
はそれらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌
検出用オリゴヌクレオチドである。
列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列
番号６、配列番号７または配列番号８（但し、Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表
す。また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換され
ていてもよい。）に示される核酸配列を有するか、また
はそれらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌
検出用オリゴヌクレオチドである。
【０００７】また本発明は上記メチシリン耐性ブドウ球
菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化したメチシリン耐
性ブドウ球菌検出用標識オリゴヌクレオチドである。
菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化したメチシリン耐
性ブドウ球菌検出用標識オリゴヌクレオチドである。
【０００８】本発明は上記メチシリン耐性ブドウ球菌検
出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識プローブを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体
の標識を測定することを特徴とする試料中のメチシリン
耐性ブドウ球菌の検出法である。
出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識プローブを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑した結合体
の標識を測定することを特徴とする試料中のメチシリン
耐性ブドウ球菌の検出法である。
【０００９】また本発明は上記メチシリン耐性ブドウ球
菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマー
とするか、あるいは標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させて、増幅反応を行い、さらに必要により標識プロー
ブを使用して、交雑した結合体の標識を測定することを
特徴とする試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法
である。
菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマー
とするか、あるいは標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させて、増幅反応を行い、さらに必要により標識プロー
ブを使用して、交雑した結合体の標識を測定することを
特徴とする試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法
である。
【００１０】さらに本発明は上記メチシリン耐性ブドウ
球菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プ
ローブを含有することを特徴とするメチシリン耐性ブド
ウ球菌検出用試薬キットである。
球菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核酸プ
ローブを含有することを特徴とするメチシリン耐性ブド
ウ球菌検出用試薬キットである。
【００１１】さらに本発明は上記メチシリン耐性ブドウ
球菌検出用オリゴヌクレオチドをそのままプライマーと
して含有するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを標識
化した標識核酸プライマーとして含有することを特徴と
するメチシリン耐性ブドウ球菌検出用試薬キットであ
る。
球菌検出用オリゴヌクレオチドをそのままプライマーと
して含有するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを標識
化した標識核酸プライマーとして含有することを特徴と
するメチシリン耐性ブドウ球菌検出用試薬キットであ
る。
【００１２】本発明の配列表・配列番号１、配列番号
２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、または配列番号８（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてい
てもよい。）に示される核酸配列を有するか、またはそ
れらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌検出
用オリゴヌクレオチドとはｍｅｃＡ遺伝子に特異的なオ
リゴヌクレオチドまたはそれの相補的配列である。該オ
リゴヌクレオチドは化学合成により調製できるので、ク
ローン化したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドに比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌク
レオチドを得ることが可能である。
２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号
６、配列番号７、または配列番号８（但し、Ａはアデニ
ン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。
また、任意の位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されてい
てもよい。）に示される核酸配列を有するか、またはそ
れらの相補配列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌検出
用オリゴヌクレオチドとはｍｅｃＡ遺伝子に特異的なオ
リゴヌクレオチドまたはそれの相補的配列である。該オ
リゴヌクレオチドは化学合成により調製できるので、ク
ローン化したオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチ
ドに比べ、容易、大量且つ安価に一定品質のオリゴヌク
レオチドを得ることが可能である。
【００１３】本発明のオリゴヌクレオチドはデオキシリ
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位
置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであって
もよい。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるい
は置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっ
てもよい。
ボ核酸（ＤＮＡ）でもリボ核酸（ＲＮＡ）でもよい。リ
ボ核酸の場合はチミジン残基（Ｔ）をウリジン残基
（Ｕ）と読み替えることは言うまでもない。また合成に
際して任意の位置のＴをＵに変えて合成を行ない、ウリ
ジン残基を含むＤＮＡであってもよい。同様に任意の位
置のＵをＴに変えたチミジン残基を含むＲＮＡであって
もよい。またオリゴヌクレオチド中に欠失、挿入あるい
は置換といった点突然変異や、修飾ヌクレオチドがあっ
てもよい。
【００１４】標識物としては放射性物質や酵素、蛍光物
質、発光物質など公知の標識をもちいることができる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配
列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素標識化することができる（Nucleic Acids Resear
ch;14 巻6115頁1986年) 。その一例として５位にリンカ
ーアームを有するウリジンを特開昭60-500717号公報に
開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成
し、上記オリゴヌクレオチドに導入することもできる。
質、発光物質など公知の標識をもちいることができる。
標識の仕方は末端標識でも、配列の途中に標識してもよ
い。また糖、リン酸基、塩基部分への標識であってもよ
い。例えば、リンカーアームを有するヌクレオチドを配
列のオリゴヌクレオチドの一員として置換することによ
り酵素標識化することができる（Nucleic Acids Resear
ch;14 巻6115頁1986年) 。その一例として５位にリンカ
ーアームを有するウリジンを特開昭60-500717号公報に
開示された合成法によりデオキシウリジンから化学合成
し、上記オリゴヌクレオチドに導入することもできる。
【００１５】本発明における試料とは、喀啖、血液など
の各種臨床材料、そこから単離、培養された菌体などを
指すが、これらより分離、精製された核酸なども含まれ
る。また、増幅された核酸でもよい。本発明は上記メシ
チリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌオチドを標識化し
た標識プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法である。そ
の交雑条件としては、ManiatisらのMolecular Cloning
（1982年）などに記載された一般的な条件の他、サンド
イッチハイブリダイゼーションなど様々な方法が考えら
れる。
の各種臨床材料、そこから単離、培養された菌体などを
指すが、これらより分離、精製された核酸なども含まれ
る。また、増幅された核酸でもよい。本発明は上記メシ
チリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌオチドを標識化し
た標識プローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑さ
せ、交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする
試料中のメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法である。そ
の交雑条件としては、ManiatisらのMolecular Cloning
（1982年）などに記載された一般的な条件の他、サンド
イッチハイブリダイゼーションなど様々な方法が考えら
れる。
【００１６】本発明のオリゴヌクレオチドは固相担体に
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。またオリゴヌクレオチド
をビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後アビジ
ン結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセ
イにおいてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチ
ドを用いれば、本オリゴヌクレオチドで特異的な測定が
可能となり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干
低くてもなんら問題はない。
結合して、捕捉プローブとして用いることもできる。こ
の場合、捕捉プローブと標識プローブの組合せでサンド
イッチアッセイ（特開昭58-40099号公報参照）を行って
もよいし、標的核酸を標識して捕捉する方法（特開昭62
-265999 号公報参照）もある。またオリゴヌクレオチド
をビオチンで標識し、ハイブリダイゼーション後アビジ
ン結合担体で捕捉する方法もある。サンドイッチアッセ
イにおいてはどちらか一方に本発明のオリゴヌクレオチ
ドを用いれば、本オリゴヌクレオチドで特異的な測定が
可能となり、他方のオリゴヌクレオチドの特異性は若干
低くてもなんら問題はない。
【００１７】また本発明は上記メチシリン耐性ブドウ球
菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマー
とするか、あるいは標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させ、次いで必要により増幅反応を行い、さらに必要に
より標識プローブを使用して、交雑した結合体の標識を
測定することを特徴とする試料中のメシチリン耐性ブド
ウ球菌の検出法である。本発明における検出とは、ｍｅ
ｃＡ遺伝子を存在を検出することにより、メチシリン耐
性ブドウ球菌の存在を調べることである。これには、単
離された菌のメチシリン耐性の判定なども含まれる。
菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プライマー
とするか、あるいは標識化した標識核酸プライマーを試
料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、プライマー伸長
させ、次いで必要により増幅反応を行い、さらに必要に
より標識プローブを使用して、交雑した結合体の標識を
測定することを特徴とする試料中のメシチリン耐性ブド
ウ球菌の検出法である。本発明における検出とは、ｍｅ
ｃＡ遺伝子を存在を検出することにより、メチシリン耐
性ブドウ球菌の存在を調べることである。これには、単
離された菌のメチシリン耐性の判定なども含まれる。
【００１８】本発明のオリゴヌクレオチドをプライマー
として使用する場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝
子増幅（ＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）を行うこと
によりｍｅｃＡ遺伝子に特異的な配列のみを増幅するこ
とができる。ＰＣＲに際しては、反応時に放射性標識ヌ
クレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動
により分画して特異なバンドを検出することで容易にｍ
ｅｃＡ遺伝子を検出することができる。また前述の標識
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産
物を直接検出することも可能である。
として使用する場合、ＤＮＡポリメラーゼ等による遺伝
子増幅（ＰＣＲ；特開昭60-281号公報参照）を行うこと
によりｍｅｃＡ遺伝子に特異的な配列のみを増幅するこ
とができる。ＰＣＲに際しては、反応時に放射性標識ヌ
クレオチドを取り込ませる方法や、増幅産物を電気泳動
により分画して特異なバンドを検出することで容易にｍ
ｅｃＡ遺伝子を検出することができる。また前述の標識
オリゴヌクレオチドをプライマーとして用いれば増幅産
物を直接検出することも可能である。
【００１９】ＰＣＲには耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用
い、９４℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒の変性工
程、４０〜６０℃で３０〜１２０秒、好ましくは１２０
秒のアニーリング工程、７２〜７５℃で０〜９０秒の伸
長工程の繰り返しによって増幅が達成される。
い、９４℃で３０〜６０秒、好ましくは６０秒の変性工
程、４０〜６０℃で３０〜１２０秒、好ましくは１２０
秒のアニーリング工程、７２〜７５℃で０〜９０秒の伸
長工程の繰り返しによって増幅が達成される。
【００２０】
【実施例】以下に、本発明を実施例により具体的に説明
する。 実施例１ （１）メチシリン耐性ブドウ球菌判定、検出用ＰＣＲプ
ライマーの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号１に示される配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマーと呼
ぶ）と配列表・配列番号２に示される配列に相補的なオ
リゴヌクレオチド（以下、プライマーと呼ぶ）を合成
した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カ
ラムにて実施した。
する。 実施例１ （１）メチシリン耐性ブドウ球菌判定、検出用ＰＣＲプ
ライマーの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号１に示される配列
を有するオリゴヌクレオチド（以下、プライマーと呼
ぶ）と配列表・配列番号２に示される配列に相補的なオ
リゴヌクレオチド（以下、プライマーと呼ぶ）を合成
した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従い、各種オリゴヌ
クレオチドの脱保護はアンモニア水で５５℃一夜実施し
た。精製はファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カ
ラムにて実施した。
【００２１】（２）検体の調製 ブドウ球菌の臨床分離株１３株（黄色ブドウ球菌(S.aur
eus)６株、表皮ブドウ球菌(S.epidermidis) ７株）のコ
ロニーを楊枝などでかき取って純水１００μｌに懸濁
し、９４℃１０分加熱した。この懸濁液５μｌを５０μ
ｌのＰＣＲ反応液に加えた。 （３）ＰＣＲ 反応液組成はプライマー・プライマー各1 μM, 10m
M Tris-HCl(pH8.9), 1.5mM MgCl2, 80mM KCl, 500 μg/
ml BSA, 0.1% コール酸ナトリウム, 0.1% TritonX-10
0, それぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびTth
DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/ml である。反
応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、０．５分 アニーリング：５０℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 を３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／
シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイ
クラーを用いて行った。
eus)６株、表皮ブドウ球菌(S.epidermidis) ７株）のコ
ロニーを楊枝などでかき取って純水１００μｌに懸濁
し、９４℃１０分加熱した。この懸濁液５μｌを５０μ
ｌのＰＣＲ反応液に加えた。 （３）ＰＣＲ 反応液組成はプライマー・プライマー各1 μM, 10m
M Tris-HCl(pH8.9), 1.5mM MgCl2, 80mM KCl, 500 μg/
ml BSA, 0.1% コール酸ナトリウム, 0.1% TritonX-10
0, それぞれ0.2mM のdATP, dCTP, dGTP, dTTPおよびTth
DNA ポリメラーゼ（東洋紡製）40単位/ml である。反
応条件は次の通りである。 熱変性： ９４℃、０．５分 アニーリング：５０℃、２分 重合反応： ７５℃、１．５分 を３０回行った。これらの操作はパーキン−エルマー／
シータス(Perkin-Elmer/Cetus)社のＤＮＡサーマルサイ
クラーを用いて行った。
【００２２】（４）検出 ５μｌの反応液を１．５％アガロースゲル電気泳動し、
エチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検
出した。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、時間は
３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiatisらの
Molecular Cloning(1982) に記載の方法に従った。反応
液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の
比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出した。
プライマーとプライマーの組み合わせでは、陽性検
体で２８７塩基対の増幅産物が検出されるはずである。
エチジウムブロマイド染色した後、紫外線での蛍光を検
出した。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、時間は
３０分行った。操作方法並びに他の条件はManiatisらの
Molecular Cloning(1982) に記載の方法に従った。反応
液の他に分子量マーカーも同時に泳動し、相対泳動度の
比較により、検出されたＤＮＡ断片の長さを算出した。
プライマーとプライマーの組み合わせでは、陽性検
体で２８７塩基対の増幅産物が検出されるはずである。
【００２３】（５）結果 アガロースゲル電気泳動し、エチジウムブロマイド染色
した後、紫外線で２８７塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。表１に、実施例２の結果と共に示
す。従来の寒天スクリーン法によく一致している。一
部、寒天スクリーン法で曖昧な結果がでているが、これ
は培養条件等で結果にばらつきがでるこの方法の特質を
示しており、正確な判断を下すには複数条件、複数薬剤
の実験を繰り返す必要がある。この点において本発明に
よる判定法の優位性が示唆される。また、コロニー採取
から判定まで約４時間と、従来の方法（２４時間以上）
に比べて大幅に時間が短縮できる。
した後、紫外線で２８７塩基対の蛍光バンドが確認され
たものを陽性とする。表１に、実施例２の結果と共に示
す。従来の寒天スクリーン法によく一致している。一
部、寒天スクリーン法で曖昧な結果がでているが、これ
は培養条件等で結果にばらつきがでるこの方法の特質を
示しており、正確な判断を下すには複数条件、複数薬剤
の実験を繰り返す必要がある。この点において本発明に
よる判定法の優位性が示唆される。また、コロニー採取
から判定まで約４時間と、従来の方法（２４時間以上）
に比べて大幅に時間が短縮できる。
【００２４】実施例２ （１）リンカーアームを有するメチシリン耐性ブドウ球
菌判定用オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号３〜８に示される
配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを合成した。
この際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成法に
よりデオキシウリジンから化学合成により調製した、５
位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌ
クレオチドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌク
レオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施
した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラ
ムを用いて精製した。
菌判定用オリゴヌクレオチドの合成 ＡＢＩ社ＤＮＡシンセサイザー３９２型を用いて、ホス
ホアミダイト法にて配列表・配列番号３〜８に示される
配列をそれぞれ有するオリゴヌクレオチドを合成した。
この際、特表昭60-500717 号公報に開示された合成法に
よりデオキシウリジンから化学合成により調製した、５
位にリンカーアームを有するウリジンを、上記オリゴヌ
クレオチドに導入した。合成されたリンカーオリゴヌク
レオチドはアンモニア水で５０℃、一夜脱保護処理を施
した後、ファルマシア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラ
ムを用いて精製した。
【００２５】（２）リンカーオリゴヌクレオチドの酵素
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献 (Nucleic Acids Research;14 巻6115頁1986年) に従
って行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260
を 0.2M NaHCO3 12.5 μｌに溶解し、ここへ10mg/ml ス
ベリン酸ジスクシニミジル（DSS ）25μｌを加えて室
温、２分間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH5.
0) で平衡化したSephadex G-25(ファルマシア社) カラム (1cm
φx30cm) でゲル濾過して過剰の DSS を除去した。
末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオ
チドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファター
ゼ(100mM NaHCO3, 3M NaClに溶解したもの) と室温、16
時間反応させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核
酸プローブを得た。得られた標識プローブは、ファルマ
シア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製し
た。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０
Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。（以
下、配列表・配列番号３〜８に示す配列を有するアルカ
リ性ホスファターゼ標識核酸プローブをそれぞれプロー
ブ〜プローブと呼ぶ。）
・アルカリ性ホスファターゼによる標識 上記リンカーオリゴヌクレオチドと、そのリンカーアー
ムを介してのアルカリ性ホスファターゼとの結合を、文
献 (Nucleic Acids Research;14 巻6115頁1986年) に従
って行なった。リンカーオリゴヌクレオチド1.5 A260
を 0.2M NaHCO3 12.5 μｌに溶解し、ここへ10mg/ml ス
ベリン酸ジスクシニミジル（DSS ）25μｌを加えて室
温、２分間反応させた。反応液を１mM CH3COONa (pH5.
0) で平衡化したSephadex G-25(ファルマシア社) カラム (1cm
φx30cm) でゲル濾過して過剰の DSS を除去した。
末端のアミノ基が活性化されたリンカーオリゴヌクレオ
チドを、更にモル比で２倍量のアルカリ性ホスファター
ゼ(100mM NaHCO3, 3M NaClに溶解したもの) と室温、16
時間反応させることでアルカリ性ホスファターゼ標識核
酸プローブを得た。得られた標識プローブは、ファルマ
シア社製ＦＰＬＣで陰イオン交換カラムを用いて精製し
た。標識プローブを含む画分を集め、セントリコン３０
Ｋ（アミコン社）を用いて限外濾過法により濃縮した。（以
下、配列表・配列番号３〜８に示す配列を有するアルカ
リ性ホスファターゼ標識核酸プローブをそれぞれプロー
ブ〜プローブと呼ぶ。）
【００２６】（３）菌体塗付ハイブリダイゼーション ブドウ球菌の臨床分離株１３株（黄色ブドウ球菌(S.aur
eus)６株、表皮ブドウ球菌(S.epidermidis) ７株）のコ
ロニーをようじなどでかき取ってナイロン膜に少量塗り
付け、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を固定し
た。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバック(BRL
社) に膜を移し、アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブ液を含むハイブリダイゼーションバッファー (5x
SSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5% ポリビニールピ
ロリドン、1% ドデシル硫酸ナトリウム) を加えてポリ
シーラーでシールし５０℃１５分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。膜をポリバッグから取り出し、洗浄液
１(1xSSC, 1% ドデシル硫酸ナトリウム) で５０℃、１
０分間振とう洗浄した。更に洗浄液２(1xSSC, 0.5% Tri
tonX-100) で室温、１０分間振とう洗浄した。最後に洗
浄液３(1xSSC) で室温５分間振とう洗浄した。膜を新し
いハイブリダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M
Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3ｍｇ／ｍｌニト
ロブリーテトラゾリウム、0.3 ｍｇ／ｍｌブロムクロロ
インドフェリールホスフェートｐＨ７．５）を入れポリ
シーラーでシールし３７℃で１時間インキュベートし
た。
eus)６株、表皮ブドウ球菌(S.epidermidis) ７株）のコ
ロニーをようじなどでかき取ってナイロン膜に少量塗り
付け、アルカリ条件で溶菌、ナイロン膜に核酸を固定し
た。この膜を中和後ハイブリダイゼーションバック(BRL
社) に膜を移し、アルカリ性ホスファターゼ標識核酸プ
ローブ液を含むハイブリダイゼーションバッファー (5x
SSC, 0.5% ウシ血清アルブミン、0.5% ポリビニールピ
ロリドン、1% ドデシル硫酸ナトリウム) を加えてポリ
シーラーでシールし５０℃１５分間ハイブリダイゼーシ
ョンを行なった。膜をポリバッグから取り出し、洗浄液
１(1xSSC, 1% ドデシル硫酸ナトリウム) で５０℃、１
０分間振とう洗浄した。更に洗浄液２(1xSSC, 0.5% Tri
tonX-100) で室温、１０分間振とう洗浄した。最後に洗
浄液３(1xSSC) で室温５分間振とう洗浄した。膜を新し
いハイブリダイゼーションバッグに移し、基質液(0.1M
Tris-HCl, 0.1M NaCl, 0.1M MgCl2, 0.3ｍｇ／ｍｌニト
ロブリーテトラゾリウム、0.3 ｍｇ／ｍｌブロムクロロ
インドフェリールホスフェートｐＨ７．５）を入れポリ
シーラーでシールし３７℃で１時間インキュベートし
た。
【００２７】（４）結果 アルカリ性ホスファターゼにより生じる紫色色素のスポ
ットを目視により判定した。スポットの確認できたもの
を陽性とした。表１に、実施例１の結果と共に示す。プ
ローブからプローブまで全て同一の結果を示し、こ
れらのプローブが全て正常に機能していることがわか
る。これらの結果は従来の寒天スクリーン法によく一致
している。一部、寒天スクリーン法で曖昧な結果がでて
いるが、これは培養条件等で結果にばらつきがでるこの
方法の特質を示しており、正確な判断を下すには複数条
件、複数薬剤の実験を繰り返す必要がある。この点にお
いて本発明による判定法の優位性が示唆される。また、
コロニー採取から判定まで約２時間と、従来の方法（２
４時間以上）に比べて大幅に時間が短縮できる。
ットを目視により判定した。スポットの確認できたもの
を陽性とした。表１に、実施例１の結果と共に示す。プ
ローブからプローブまで全て同一の結果を示し、こ
れらのプローブが全て正常に機能していることがわか
る。これらの結果は従来の寒天スクリーン法によく一致
している。一部、寒天スクリーン法で曖昧な結果がでて
いるが、これは培養条件等で結果にばらつきがでるこの
方法の特質を示しており、正確な判断を下すには複数条
件、複数薬剤の実験を繰り返す必要がある。この点にお
いて本発明による判定法の優位性が示唆される。また、
コロニー採取から判定まで約２時間と、従来の方法（２
４時間以上）に比べて大幅に時間が短縮できる。
【００２８】スクリーンアガー（アマシャム社）はメチ
シリンを用いた寒天スクリーン法である。実施例２につ
いては、６種のプローブ（プローブ〜プローブ）に
ついて行っているが、全て同じ結果であったので一つに
まとめて表示した。陽性は＋、陰性は−、判定が困難な
ものは＋−と表示した。
シリンを用いた寒天スクリーン法である。実施例２につ
いては、６種のプローブ（プローブ〜プローブ）に
ついて行っているが、全て同じ結果であったので一つに
まとめて表示した。陽性は＋、陰性は−、判定が困難な
ものは＋−と表示した。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【発明の効果】本発明により、直接的で簡便、迅速かつ
確実なブドウ球菌のメチシリン耐性の判定が可能となっ
た。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプライマ
ーとしても、直接検出用のプローブとしても用いること
が可能であり、従来のディスク法、液体希釈法、寒天ス
クリーン法などに比べて、大幅に時間を短縮することが
でき、簡便で、且つ再現性のある結果が得られるので、
その臨床的意義は大きい。
確実なブドウ球菌のメチシリン耐性の判定が可能となっ
た。本発明のオリゴヌクレオチドは増幅反応のプライマ
ーとしても、直接検出用のプローブとしても用いること
が可能であり、従来のディスク法、液体希釈法、寒天ス
クリーン法などに比べて、大幅に時間を短縮することが
でき、簡便で、且つ再現性のある結果が得られるので、
その臨床的意義は大きい。
【００３１】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 GAACCTCTGC TCAACAAGTT 20
【００３２】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 AAATTTGAAA AAGGCATGAA 20
【００３３】配列番号：３ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 TTACAACTTC ACCAGGTTCA ACTC 24
【００３４】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..26 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGGTAAAGGT TGGCAAAAAG ATAAAT 26
【００３５】配列番号：５ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 TGGGGTGGTT ACAACGTTAC AAGAT 25
【００３６】配列番号：６ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 AGTGGTAAAT GGTAATATCG ACTT 24
【００３７】配列番号：７ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..27 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGAATCATC AGATAACATT TTCTTTG 27
【００３８】配列番号：８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..25 特徴を決定した方法：S 他の特徴：ブドウ球菌の配列と相補的な配列を有する。 配列 TAGAGTAGCA CTCGAATTAG GCAGT 25
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:445） 7804−4Ｂ (72)発明者 大塚 則光 兵庫県西宮市里中町３−10−４ (72)発明者 山下 啓子 兵庫県西宮市上田町３−43−811
Claims (6)
- 【請求項１】 配列表・配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番
号７または配列番号８（但し、Ａはアデニン、Ｃはシト
シン、Ｇはグアニン、Ｔはチミンを表す。また、任意の
位置のＴはウラシル（Ｕ）と置換されていてもよい。）
に示される核酸配列を有するか、またはそれらの相補配
列を有するメチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌク
レオチド。 - 【請求項２】 請求項１に記載されるメチシリン耐性ブ
ドウ球菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化したメチシ
リン耐性ブドウ球菌検出用標識オリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 請求項１に記載されるメチシリン耐性ブ
ドウ球菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識プ
ローブを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させ、交雑
した結合体の標識を測定することを特徴とする試料中の
メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法。 - 【請求項４】 請求項１に記載されるメシチリン耐性ブ
ドウ球菌検出用オリゴヌクレオチドをそのまま核酸プラ
イマーとするか、あるいは標識化した標識核酸プライマ
ーを試料中のＤＮＡまたはＲＮＡと交雑させて、増幅反
応を行い、さらに必要により標識プローブを使用して、
交雑した結合体の標識を測定することを特徴とする試料
中のメチシリン耐性ブドウ球菌の検出法。 - 【請求項５】 請求項１に記載されるメチシリン耐性ブ
ドウ球菌検出用オリゴヌクレオチドを標識化した標識核
酸プローブを含有することを特徴とするメチシリン耐性
ブドウ球菌検出用試薬キット。 - 【請求項６】 請求項１に記載されるメチシリン耐性ブ
ドウ球菌検出用オリゴヌクレオチドをそのままプライマ
ーとして含有するか、あるいは該オリゴヌクレオチドを
標識化した標識核酸プライマーとして含有することを特
徴とするメチシリン耐性ブドウ球菌検出用試薬キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32324092A JPH06165681A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32324092A JPH06165681A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キット |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06165681A true JPH06165681A (ja) | 1994-06-14 |
Family
ID=18152571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32324092A Pending JPH06165681A (ja) | 1992-12-02 | 1992-12-02 | メチシリン耐性ブドウ球菌検出用オリゴヌクレオチド、メチシリン耐性ブドウ球菌の検出法および検出用試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06165681A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
-
1992
- 1992-12-02 JP JP32324092A patent/JPH06165681A/ja active Pending
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| JP2007125032A (ja) * | 1994-09-12 | 2007-05-24 | Infectio Diagnostic (Idi) Inc | 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8067207B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-11-29 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8182996B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-05-22 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Compositions and methods for detecting Klebsiella pneumoniae |
| US10047404B2 (en) | 1999-09-28 | 2018-08-14 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved tuf genes and their use to generate probes and primers for detection of coagulase-negative Staphylococcus |
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