JPH04364195A - リン脂質誘導体およびそれを用いたリポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、安定かつ生体適合性に優れたリボソームの製
造に有用なリン脂質誘導体およびそれを用いて製造した
リボソームに関するものである。

（従来の技術） 近年、医学、薬学の分野においてリボソームに水溶性物
質を保持させて薬物運搬体や診断薬として利用しようと
する試みが多数なされている（例えば、砂本ら、バイオ
サイエンスとインダストリー、第４７巻、４７５頁、１
９８９年）。しかしリボソームを薬物担体として利用す
るには、未だ未解決の問題が山積している。すなわち、
非共有結合性分子集合体であるという宿命ゆえのリボソ
ームの不安定性、および内包物の漏れ減少である。

従って、リボソームを始めとする脂質２分子膜の構造強
化、機能付与は従来きわめて重要な問題となっていた。

まず構造強化に関しては、多糖で被覆したリボソーム（
特開昭６１−６９８０１号）や、水素結合によって構造
強化することのできるリン脂質（日本化学会誌、５６９
頁、１９８７年）が開発されている。また従来から天然
由来のステロイドを脂質２分子膜に混合すると、膜が強
化されるということはよく知られている事実である。し
かしこのような方法は全脂質量の半分近くもステロイド
類（たとえばコレステロール）を膜に混合するのが普通
であり、実際に人間に対して診断薬として用いるにはコ
レステロール量が多すぎ、非現実的であるといえよう。

また表面修飾に関しても、これまで数多くの研究がなさ
れている。一般に蛋白質を始めとする機能性化合物をリ
ボソームのような脂質２分子膜に導入する方法としては
、非共有結合によるものと、共有結合を用いる方法が知
られているが、結合の強度や膜の安定性等を考慮すると
、共有結合を用いる方法が有利である。

共有結合を利用する方法は基本的に、脂質２分子内膜の
表面と共有結合の相手となる分子を２価の架橋剤を用い
て連結するというものであり、具体的には蛋白質中のア
ミノ基やＳＨ基、あるいは糖鎖などが結合にあずかる官
能基として利用される。

ＳＨ基を用いる方法としては、Ｍａｌｅｉｎｉｍｉｄｏ
基を架橋剤としてこのものに対するマイケル付加反応に
より結合する方法（Ｂｉｏｃｈｉｍａｃａ　ｅｔ　Ｂｉ
ｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ９４３巻５３頁１９８８年）
、Ｎ−ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉ
ｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎｙｌｐｈｏｓｐｈ
ａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅとＮ−ｓｕｃｃ
ｉｎｉｍｉｄｙｌ−３−（２−ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈ
ｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅで活性化した抗体と結合す
る方法（Ｎａｔｕｒｅ、２８８巻、６０２頁、１９８０
年）、またα−ハロケトン基を架橋剤としてこのものに
対する求核置換反応により結合する方法（ヨーロッパ特
許第０、３１２、２１２号）等が知られている。

糖鎖を利用する方法としては、脂質２分子膜側に糖脂質
を組込んでおき、このものを過ヨウ素酸で切断して生成
するアルデヒドを、アミノ基と反応させる方法（Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ、２１０巻、５３９頁、１９８０年）が報告さ
れている。

しかしながらこれらの方法はいずれもかなりの反応工程
数を要し、また厳密な不活性気体下で反応を行わなくて
はならない、さらにある特定の反応しか行うことが出来
ないため汎用性に乏しいといった欠点を有している。

これに対し、比較的合成の容易な１本鎖型の脂質膜構造
体を用いてリボソームを始めとする脂質２分子膜側の機
能付与を行う例（例えば特開昭６１−１１２０２１号、
特開昭６２−２０１８６４号、特開昭６２−２０９０９
２号、特開平１−２７６３７号）も報告されているが、
このような１本鎖型の脂質膜構造体は疎水部に対して観
水部がかさ高い、いわゆる逆コーン型分子であるため、
膜構成成分から離脱しやすいという欠点を有しており、
また生体適合性が悪いため膜毒となる恐れもある。

従って簡単な方法で容易にリボソーム膜の構造強化、表
面修飾を行うことができ、汎用性も大きく、かつ生体に
対して安全な脂質膜構造体を開発することはこの分野で
最も必要性の高い課題となっていた。

（発明の目的） そこで本発明の目的は、オリゴペプチド鎖でリボソーム
表面を被覆することにより安定性を向上させることが可
能であり、かつ生分解性を有し生体適合性の高いリン脂
質誘導体およびその合成法を提供することにある。また
同時にその様なリン脂質を用いたリボソームの製造法を
提供することにある。

（発明の構成） 本発明の目的は、下記一般式（Ｉ）で表わされるリン脂
質誘導体とその合成法の完成、さらに下記一般式（Ｉ）
で表わされるリン脂質誘導体をリボソームの構成脂質の
少なくとも一つとして有することを特徴とするリボソー
ムにより達成された。

式中Ｒ１、Ｒ２は炭素数８〜２４の直鎖または分岐アル
キル基またはアシル基を表わし、置換基、不飽和結合、
環状構造を有していてもよい。好ましくは炭素数は１２
〜１８である。また分岐アルキル基またはアシル基とし
ては、メチル基が分岐してるものが特に好ましい。置換
基としてはアルキルカルボニル、アリールカルボニル、
アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、ハ
ロゲン原子、アリール基、水酸基が挙げられるが、好ま
しくは、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボ
ニル、水酸基である。不飽和基としては、二重結合、三
重結合であり、同一鎖内に２つ以上を有していても良い
。好ましくは非共役シス二重結合である。環状構造とし
てはシクロプロパン環、シクロペンタン環、シクロヘキ
サン環、エポキシド等が挙げられる。好ましくはシクロ
プロパン環、エポキシドであり、環の置換様式としては
シス体のものが特に好ましい。Ｒ３ｍ、Ｒ４ｎはそれぞ
れα−アミノ酸の側鎖残基を表わす。このような側鎖を
有するアミノ酸としては、天然に通常存在するＬ−α−
アミノ酸は勿論のことＤ−α−アミノ酸やラセミ体のα
−アミノ酸であっても良い。本発明における好ましいア
ミノ酸はＬ−α−アミノ酸である（以下特に言及しない
限り、アミノ酸とはこのＬ−α−アミノ酸を表わすもの
とする）。ｍおよびｎは０〜５の整数を表わす。ただし
ｍとｎは同時に０となることはない。好ましくは、ｍお
よびｎはその和が１〜５の整数である。

グリセロール部位に存在する不斉炭素原子の立体化学に
関しては、ラセミ体でも光学活性体のいずれでもよい。

Ｍ＋はリン酸アニオンの対イオンを表わす（Ｈを含む）
。また分子内に存在するイオン性基は、適当な対イオン
と塩を形成していてもよい（分子内で塩を形成している
状態を含む）。

ただしその塩は、生理学的、薬理学的に許容されるもの
であることが好ましい。具体的には、塩酸塩、硫酸塩、
硝酸塩の様な無期酸との塩、酢酸塩、トリフルオロ酢酸
塩、乳酸塩、酒石酸塩等の有機酸との塩、さらにアンモ
ニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩
、カルシウム塩などがあげられるが、なかでも塩酸塩、
酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アンモニウム塩、ナトリ
ウム塩がとくに好ましい。その様な塩への変換は慣用手
段により行うことができる。

次に本発明の化合物の合成法について説明する。

本発明の化合物は基本的に以下の方法により合成するこ
とができる。

（１）式〔２〕で表わされるジアルキル（ジアシル）グ
リセロールの合成 （２）リン酸エステル化による保護ホスファチジルセリ
ン誘導体〔３〕の合成。

ここでＲ′はリン酸の保護基を表わす。

（３）〔３〕のＮ及びＣ末端側への保護アミノ酸の逐次
縮合 （４）保護基の除去 以下、各段階について具体的に説明する。

式〔２〕で表わされるジアルキル（ジアシル）グリセロ
ールは、公知の方法（例えばＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２　３９４（１９６３）に記載の方法）により容易に合
成することができ、また市販もされている。

式〔３〕で表わされる保護ホスファチジルセリン誘導体
は、式中〔４〕で表わされる２官能性リン酸化剤を用い
、まず式〔２〕で表わされる化合物、ついで式〔５〕で
表わされるセリン誘導体を塩基の存在下反応させて合成
することができる。

ここでＲ’はリン酸の保護基を表わす。リン酸の保護基
としては、通常の核酸、リン脂質合成において用いられ
る既知のもののなかから目的とする化合物の性質、脱保
護条件等を考慮して適宜選択することができる。具体的
にはフェニル基、ｏ−クロロフェニル基、ｐ−クロロフ
ェニル基、メチル基、２，２，２−トリクロロエチル基
、２，２，２−トリブロモエチル基、２−シアノエチル
基、アリル基、シクロプロピルメチル基等をあげること
が可能である。ただし試薬の入手の容易さを考慮すると
フェニル基、メチル基が好ましい。

保護アミノ酸を逐次縮合する方法は、公知の方法、例え
ば泉屋信夫ら編「ペプチド合成の基礎と実験」（丸善）
に記載の方法が有効である。縮合反応には種々の方法が
知られているが、１−ヒドロキシベンゾトリアゾールと
ＤＣＣ（ジシクロヘキシルカルボジイミド）を用いるＤ
ＣＣ−Ａｄｄｉｔｉｖｅ法が最も良い結果を与えた。

保護基の除去の条件は、用いている保護基の種類に依存
する。通常用いられる方法は、加水素分解、トリフルオ
ロ酢酸処理、ＨＦ処理、トリフルオロメタンスルホン酸
−チオアニソール混合系等であるが、保護基の種類によ
ってはさらにさまざまな方法が可能である。

以下に本発明の化合物の具体例を示すが、本発明はこれ
らに限定されるものではない。

次に一般式（Ｉ）で表わされる化合物を用いたリボソー
ムの製造方法と、その用途について説明する。本発明の
化合物はそれ単独でも、他のリン脂質と混合しても安定
なリボソームを形成することができる。混合する際のモ
ル比に関しては特に制限はないが、好ましくは本発明の
化合物の割合が０．１〜０．６、さらに好ましくは０．
１〜０．３である。リボソームを調製するのに混合する
リン脂質としては、卵黄、大豆あるいはその他の動植物
に由来するホスファチジルコリン、ホスファチジルエタ
ノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファ
チジルセリン、スフィンゴミエリンや、化学合成によっ
て得られるジパルミトイルレシチン、ジステアロイルレ
シチン、ジミリストイルレシチン等を挙げることができ
る。好ましくは、卵黄ホスファチジルコリン（ｅｇｇ　
ＰＣ）や合成ジパルミトイルレシチンである。またコレ
ステロール等のステロイド類も混合することが可能であ
るが、混合する際のモル比は全脂質量に対して０．５以
下、好ましくは０．２以下であることが望ましい。

リボソームの調製法としては、通常知られている公知の
方法、例えばＰａｐａｈａｊｏｐｏｕｌｓらによる総説
（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．，
第９巻、４６７頁、１９８０年）、野島、砂本、井上ら
による成書（リボソーム、２１〜４０頁、南江堂、１９
８８年）に記載の方法が有効である。具体的には、ボル
テックス法、超音波照射法、界面活性剤除去法、逆相蒸
発法、エタノール注入法、プレーベシクル法、エクスト
ルージョン法、凍結融解法等が挙げられるが、本発明は
これらの方法に限定されるものではなく、さらにさまざ
まな組合せが可能である。

以上の様に調製されるリボソームには、種々の親水性物
質を取込ませることができる。具体的な親水性物質とし
ては、カルボキシフルオレセインの様な色素類、アドリ
アマイシン、シス−プラチンに代表される抗がん剤、イ
ンターフェロン等の抗ウィルス剤、アミノ配糖体類、β
−ラクタム系（例えばペニシリン等）抗生物質、インシ
ュリン等のペプチドホルモン類、リゾチーム、アスパラ
ギナーゼ等の酵素剤、ムラミルジペプチドを始めとする
免疫賦活剤、イムノグロブリン、各種トキシン等の蛋白
質が挙げられるが、さらに他の化合物を用いることも可
能であり、本発明はこれらに限定されるものではない。

以下に実施例として本発明の例示化合物（１）の合成例
を記す。化合物（１）は以下の合成経路により合成した
。親水部、疎水部の構造の異なる他の化合物の合成方法
も、基本的な方法は同じである。

なおアミノ酸、各種保護基、試薬、溶媒は通常用いられ
る略号を用いて表わした。

実施例１　化合物（１）の合成 〔１ｃ〕の合成 文献〔シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）５０３（１９
８５）〕記載の方法により調製した〔１ａ〕１２．０ｇ
をトルエン３００ｍｌに溶かし、この溶液に粉末水酸化
カリウム１６．０ｇと臭化ｎ−テトラデシル８２ｇを加
え、反応混合物を８時間加熱還流した。反応液を室温に
なるまで放冷したのちヘキサン４００ｍｌで希釈した。

水２００ｍｌで２回洗浄後無水硫酸ナトリウムにて乾燥
した。硫酸ナトリウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮
して無色油状物を得た。このものをシリカゲルクロマト
グラフィー（溶出液　ヘキサン／酢酸エチル＝４０／１
）で精製し、〔１ｂ〕を４１．２ｇ（収率９５．５％）
得た。物性値は文献〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ）２，３９４（１９６３）〕記載のそれ
と一致した。

得られた〔１ｂ〕を酢酸エチル２５０ｍｌに溶解し、１
０％パラジウム−炭素１．５ｇを加えて、反応混合物を
水素雰囲気下８時間反応した。不溶性物質をセライト瀘
過して除き、セライト層を酢酸エチルで洗浄した。濾過
、洗液をあわせて減圧濃縮した。残渣を酢酸エチルから
再結晶して〔１ｃ〕を無色結晶として得た。物性値は文
献〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）
２，３９４（１９６３）〕記載のそれと一致した。

〔１ｄ〕の合成 文献〔シンセシス（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）９６１（１９
７９）〕記載の方法に従い、（Ｓ）−Ｎ−ｔ−ブトキシ
カルボニルセリンと臭化ベンジルから８０％の収率で得
た。

〔１ｅ〕の合成 フェニルホスホロジクロリデート（８．２ｇ）の乾燥テ
トラヒドロフラン溶液に、〔１ｃ〕（１５．８ｇ）とＮ
−メチルイミダゾール（３．２ｇ）の乾燥テトラヒドロ
フラン（５０ｍｌ）溶液を２０分かけて加えた。反応混
合物を室温で１時間撹拌したのち、〔１ｄ〕（１０．３
ｇ）とＮ−メチルイミダゾール（３．２ｇ）の乾燥テト
ラヒドロフラン（５０ｍｌ）溶液を１０分かけて加え、
室温に１４時間放置した。反応液を水２００ｍｌにあけ
、クロロホルムで抽出した。有機層をあわせて水で１回
洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥した。硫酸ナトリウム
を瀘過して除き、濾液を減圧濃縮して無色油状物を得た
。このものをシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液　
ヘキサン／酢酸エチル＝２０／１〜８／１）で精製し、
〔１ｅ〕を無色ロウ状物質として１３．６ｇ得た。

〔１ｆ〕の合成 〔１ｅ〕１３．５ｇの酢酸エチル（４００ｍｌ）溶液に
５％パラジウム−炭素８．０ｇを加え、反応混合物を水
素雰囲気下８時間撹拌した。反応終了後不溶性物質をセ
ライト瀘過して除き、瀘液を減圧濃縮して〔１ｆ〕を無
色ロウ状物質として１３．３ｇ得た。

〔１ｇ〕の合成 〔１ｆ〕１３．３ｇ、グリシンベンジルエステルｐ−ト
ルエンスルホン酸塩５．８ｇ、トリエチルアミン１．８
ｇの塩化メチレン溶液に、ジジクロヘキシルカルボジイ
ミド３．６ｇを氷冷しながら加えた。反応混合物を氷冷
しながら２時間、さらに室温で終夜撹拌した。生成した
沈澱をセライト濾過して除き、セライト層を酢酸エチル
で洗浄した。有機層をあわせて水、飽和飽和塩化ナトリ
ウム水溶液で洗浄後無水硫酸ナトリウムで乾燥した。

硫酸ナトリウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。

残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液　ヘキサ
ン／酢酸エチル＝６／４）で精製し、〔１ｇ〕を無色ロ
ウ状物質として８．６ｇ得た。

〔１ｈ〕の合成 〔１ｇ〕８．６ｇの塩化メチレン（５０ｍｌ）溶液にト
リフルオロ酢酸（３０ｍｌ）を加え、反応混合物を室温
で３０分撹拌した。溶媒を減圧下濃縮したのち残渣を塩
化メチレン（１００ｍｌ）に溶解し、氷冷下トリエチル
アミン１．５ｇとＢｏｃ−グリシン無水物５．４ｇを加
えて反応混合物を室温で終夜撹拌した。反応液を水、飽
和飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄後無水硫酸ナトリウ
ムで乾燥した。

硫酸ナトリウムを濾過して除き、濾液を減圧濃縮した。

残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶出液　ヘキサ
ン／酢酸エチル＝４／６）で精製し、〔１ｈ〕を無色ロ
ウ状物質として８．８ｇ得た。

例示化合物（１）の合成 〔１ｈ〕８．８ｇの酢酸エチル（３００ｍｌ）溶液に酸
化白金１．０ｇを加え反応混合物を水素雰囲気下２０時
間撹拌した。反応終了後不溶性物質をセライト濾過して
除き、濾液を減圧濃縮して７．９ｇの脱保護体を得た。

このもののうち２００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶
解し、トリフルオロ酢酸１０ｍｌを加えて反応混合物を
室温で３０分間撹拌した。溶媒を減圧濃縮して除き、残
渣を酢酸エチルで再沈澱させ、（１）のトリフルオロ酢
酸塩を１２０ｍｇ得た。このものはさらにアンバーライ
トＩＲ−１２０Ｂ、続いてアンバーライトＩＲＡ−９３
ＺＵで処理して目的とする（１）を１２０ｍｇ得た。

実施例２　例示化合物（２）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−オクタデシルグリセロールを用いて反応を行い、目的
とする（２）を得た。

実施例３　例示化合物（３）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−ヘキサデシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１
ｇ〕に相当する段階で保護基を除去して目的とする（３
）を得た。

実施例４　例示化合物（４）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−ヘキサデシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１
ｅ〕に相当する段階でＮ末端側に保護グリシン残基を導
入した後保護基を除去し、目的とする（４）を得た。

実施例５　例示化合物（５）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−ヘキサデシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１
ｅ〕に相当する段階でＮ末端側に保護アスパラギン酸残
基を導入した後保護基を除去し、目的とする（５）を得
た。

実施例６　例示化合物（６）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−ヘキサデシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１
ｅ〕に相当する段階でＣ末端側に保護セリン残基を導入
した後保護基を除去し、目的とする（６）を得た。

実施例７　例示化合物（７）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−エイコシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１ｅ
〕に相当する段階でＮ末端側に保護リジン残基を導入し
た後保護基を除去し、目的とする（７）を得た。

実施例８　例示化合物（８）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−オクタデシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１
ｅ〕に相当する段階でＣ末端側に保護グリシルグリシン
残基を導入した後保護基を除去し、目的とする（８）を
得た。

実施例９　例示化合物（９）の合成 実施例１に記載の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ
−デシルグリセロールを用いて反応を行い、〔１ｅ〕に
相当する段階でＮ末端側に保護グリシルグリシン残基を
導入した後保護基を除去し、目的とする（９）を得た。

実施例１０　例示化合物（１０）の合成実施例１に記載
の方法に従い、〔１ａ〕に対してイソヘキサデカノイル
クロリドを反応させてアシル化、さらに加水素分解して
ジイソヘキサデカノイルグリセロールを得た。このもの
を〔１ｃ〕の代りに用いて反応を行い、〔１ｅ〕に相当
する段階でＮ末端側に保護グリシン残基を導入した後保
護基を除去し、目的とする（１０）を得た。

実施例１１　例示化合物（１１）の合成実施例１に記載
の方法に従い、〔１ａ〕に対してヘキサデカノイルクロ
リドを反応させてアシル化、さらに加水素分解してジヘ
キサデカノイルグリセロールを得た。このものを〔１ｃ
〕の代りに用いて反応を行い、〔１ｅ〕に相当する段階
でＣ末端側に保護アスパラギン残基を導入した後保護基
を除去し、目的とする（１１）を得た。

実施例１２　例示化合物（１２）の合成実施例１に記載
の方法に従い、〔１ａ〕に対してオクタデカノイルクロ
リドを反応させてアシル化、さらに加水素分解によりベ
ンジル基を除去し、ジオクタデカノイルグリセロールを
得た。このものを〔１ｃ〕の代りに用いて反応を行い、
〔１ｅ〕に相当する段階でＣ末端側に保護アスパラギン
酸残基を導入、さらに〔１ｇ〕に相当する段階でＮ末端
側に保護リジン残基を導入した後保護基を除去し、目的
とする（１２）を得た。

実施例１３　例示化合物（１３）の合成実施例１に記載
の方法に従い、〔１ｃ〕の代りにジ−ｏ−ヘキサデシル
グリセロールを用いて反応を行い、〔１ｅ〕に相当する
段階でＮ末端側に保護フェニルアラニン残基を導入した
後保護基を除去し、目的とする（１３）を得た。

実施例１４　例示化合物（１４）の合成実施例１に記載
の方法に従い反応を行った。

〔１ａ〕に対して９，１０−シス−エポキシオクタデカ
ン酸をＤＣＣにより縮合させてアシル化、さらに加水素
分解によりベンジル基を除去し、ジアシルグリセロール
誘導体を得た。このものを〔１ｃ〕の代りに用いて反応
を行い、〔１ｅ〕に相当する段階でＣ末端側に保護アラ
ニン残基を導入した後保護基を除去し、目的とする（１
４）を得た。

実施例１５　例示化合物（１）を用いたリボソームの調
製法 例示化合物（１）１５ｍｇをクロロホルムに溶解し、減
圧濃縮して薄膜を形成した。窒素雰囲気下充分に乾燥後
、緩衝液（６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４）３
ｍｌを加え、１０分間ボルテックスミキシングを行い粗
分散させた。続いてプローブ型超音波発生装置で１５分
間ソニケーションを行い、リボソーム分散液を得た。

得られたリボソーム分散液は平均粒径を測定した結果、
直径２４０ｎｍ、また電子顕微鏡による形態観察からユ
ニラメラベシクルであることを確認した。さらに室温に
２０日間放置した後粒径を測定したが特に変化はみられ
ず、また肉眼による観察からも沈澱物等はみられなかっ
た。

実施例１６　ジパルミトイルホスファチジルコリンと例
示化合物（５）の混合系でのカル ボキシフルオレセイン内包リボソーム の調製法 ジパルミトイルホスファチジルコリン２０ｍｇと例示化
合物（５）１０ｍｇをクロロホルムに溶解し、減圧濃縮
して薄膜を形成した。窒素雰囲気下充分に乾燥後、カル
ボキシフルオレセインのＢｕｆｆｅｒ溶液（２００ｍＭ
／６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ
　ＮａＣｌ含有）３ｍｌを加え、１５分間ボルテックス
ミキシングを行い粗分散させた。続いてプローブ型超音
波発生装置で１０分間ソニケーションを行い、リボソー
ムの分散液を得た。ゲル瀘過クロマトグラフィーで内包
されなかったカルボキシフルオレセインを除去し、カル
ボキシフルオレセイン内包リボソームのフラクンョンを
得た。

得られたフラクションはリボソームの粒径を測定の後、
平均粒径２００〜３００ｎｍの部分を選び、１５０ｍＭ
　ＮａＣｌ含有の６ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐ
Ｈ７．４）を用いて脂質濃度を２×１０−４Ｍに調製し
、３７℃で内包したカルボキシフルオレセインの漏出を
蛍光測定により追跡した。

同様の方法により、例示化合物（１）〜（４）について
もジパルミトイルホスファチジルコリンとの混合系を用
い、カルボキシフルオレセイン内包リボソームを得た。

これらリボソームの粒径測定、３７℃での内包したカル
ボキシフルオレセインの漏出の結果を表１に示す。

（発明の効果） 本発明の化合物は、リボソームの安定化の重要な要因と
なる膜表面の水素結合体に作用し、分子間でより強固に
水素結合を行わせることができる。

従って脂質を水中に分散させた時に形成されるリボソー
ムの内包物の漏出を減少させ、また同時にリボソームの
保存安定性を向上させるのに非常に有効な化合物である
。表１からも明らかなように、本発明の化合物を用いる
ことによりリボソーム内包物の漏出が大幅に減少するこ
とがわかる。本発明の化合物の種類や量をかえても同様
の傾向が得られた。また本化合物はその構成要素がアミ
ノ酸、ペプチド、脂質残基であり、生体内に普遍的に存
在するものであるため生体適合性にも優れている。

さらに本発明の化合物は脂質の親水部に連結するアミノ
酸残基の種類、特に電荷、親疎水性のバランスを変化さ
せることにより、リボソーム膜の表面を自由に修飾する
ことが可能である。また分子の親水部がリボソーム表面
からある程度の長さを有しているため、このものにさら
に表面修飾を行う場合、反応効率が向上することも利点
として挙げることができる。これは反応点の立体障害が
減少しているためと説明できる。

また各種の生理活性を有するオリゴペプチド（あるいは
その活性断片）を親水部に連結することにより、脂質の
新たな機能を引出すことも可能である。

【図面の簡単な説明】

表１はジパルミトイルホスファチジルコリンと例示化合
物５種からなるリボソームの平均粒径と、３７℃、１時
間後におけるリボソームからの内包物（カルボキシフル
オレセイン）の漏出の程度をまとめたものである。対照
としてジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ
）単独、卵黄ホスファチジルコリン（ｅｇｇ　ＰＣ）単
独系を用いた。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記一般式（Ｉ）で表わされるリン脂質誘
   導体。 式中Ｒ１、Ｒ２は炭素数８〜２４の直鎖または分岐アル
   キル基またはアシル基を表わし、置換基、不飽和結合、
   環状構造を有していてもよい。Ｒ３ｍ、Ｒ４ｎはそれぞ
   れα−アミノ酸の側鎖残基を表わす。 ｍおよびｎは０〜５の整数を表わす。ただしｍとｎは同
   時に０となることはない。Ｍ＋はリン酸アニオンの対イ
   オンを表わす（Ｈを含む）。また分子内に存在するイオ
   ン性基は、適当な対イオンと塩を形成していてもよい（
   分子内で塩を形成している状態を含む）。
2. 【請求項２】特許請求項（１）に記載の化合物をリボソ
   ームの構成脂質の少なくとも一つとして有することを特
   徴とするリボソーム。