JPH04320675A - 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、臨床検査、とりわけ食
中毒にかかる検査、あるいは食品検査での易熱性腸内毒
素（ＬＴ）を産生する大腸菌の検出に関するものである
。

【０００２】

【従来の技術】検査材料が患者の嘔吐物、糞便、食品、
または拭き取り材料の場合、毒素原性大腸菌と同定する
までには、増菌培養、分離培養を経て、純培養、および
確認培養を行わなければならない。さらに引き続いて、
血清学的検査、腸内毒素産生試験、その他の生化学的試
験を行うことで、はじめて毒素原性大腸菌と同定される
。　　各培養段階に要する時間は、１８〜２４時間であ
り、その後の検査にかかる時間を合計すると１週間もの
長時間を要する。

【０００３】易熱性腸内毒素（以下、ＬＴ）を検出する
目的であれば、逆受身ラテックス凝集反応を利用した腸
内毒素検出用キットも市販されているが、コレラ菌腸内
毒素（以下、ＣＴ）とＬＴとは互いに免疫学的に抗原共
通性を有することが知られており、このためＣＴとＬＴ
とを区別して検出することが困難である。

【０００４】また、検体としては、純培養され、さらに
、ある程度菌種の同定に関して、絞り込みが行われたも
のを必要としている。この絞り込みの段階までの操作が
煩雑であり、長時間を要する。しかも、このキットにか
かる時間だけでも２０〜２４時間も必要とする。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記したように、従来
の方法はいずれも、毒素原性大腸菌と同定するまでには
非常に複雑な操作と長時間を要し、迅速性を要求される
臨床検査等に向かなかった。

【０００６】一方、最近では、オリゴヌクレオチドを用
いたＤＮＡプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより膜上、あるいは
他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これを
検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選択
性を得るのが難しい。

【０００７】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成
反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によ
り毒素原性大腸菌由来の核酸を検出するもので、簡便、
迅速かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供す
ることを目的とする。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、毒素原性大腸
菌由来の核酸と選択的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす毒素原
性大腸菌のみを選択的に検出することを特徴としている
。

【０００９】本発明で用いるオリゴヌクレオチドは、検
体中に存在する毒素原性大腸菌の産生する易熱性腸内毒
素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｔｏｘｉｎ，　ＬＴ）遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列群、（５’）ｄ−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡ
ＡＣＧＴ−（３’）・・・・（ａ）　（５’）ｄ−ＣＣ
ＴＧＡＧＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣ−（３’）・・・
・（ｂ）　（５’）ｄ−ＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧ
ＴＣＡＧＡＴＡＴ−（３’）・（ｃ）　（５’）ｄ−Ｇ
ＴＴＡＴＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−（３’
）・（ｄ）　（５’）ｄ−ＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧ
ＡＡＡＴＣＴＧＡ−（３’）・・（ｅ）　または対応す
る相補的配列からなることを特徴とする。

【００１０】ここで、遺伝子増幅は、Ｓａｉｋｉ　らが
開発したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃ
ｔｉｏｎ　法（以下、略してＰＣＲ法；Ｓｃｉｅｎｃｅ
　２３０，１３５０（１９８５））をもとに行っている
。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域（本発
明の場合は毒素原性大腸菌のＬＴ遺伝子）を検出する場
合、その領域の両端の一方は＋鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により１本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した２本鎖核酸を再
び１本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。こ
の一連の操作を繰り返すことで２つのプライマーに挟ま
れた領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。

【００１１】検体としては、臨床検査材料、例えば、糞
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。

【００１２】これら材料をＰＣＲの試料として用いるに
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればＰＣＲは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでＰＣＲを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。

【００１３】本発明でプライマーとして用いられるオリ
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、１０塩基以上、望ましくは１５塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。

【００１４】プライマーが規定している腸炎ビブリオ菌
の特定遺伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、
５０塩基から２，０００塩基、望ましくは、１００塩基
から１，０００塩基となればよい。

【００１５】鋳型依存性ヌクレオチド重合反応には、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については９０〜９５℃、プライマーをハイブリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は３７〜６５℃、重合
反応は５０〜７５℃で、これを１サイクルとしたＰＣＲ
を２０から４２サイクル行って増幅させる。

【００１６】検出はＰＣＲを終えた反応液をそのままア
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのままＬＴを産出する大腸菌
の有無を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィ
ー、ＤＮＡプロ−ブ法も有効である。

【００１７】

【作用】本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌由来のＬＴを検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出ができる。

【００１８】

【実施例】（実験例１）検体の調製 毒素原性大腸菌の検索には、表１〜表１３の縦の見出し
に示した下痢症患者から分離した大腸菌４９２株を用い
た。これらの菌株は京都大学医学部微生物学教室（主任
、竹田美文教授）から分与された。それぞれの菌株を適
当な増菌培地に接種し、３７　　℃、好気的条件下で終
夜培養を行い、その培地１．　５ｍｌから遠心操作によ
り菌体を回収した。１０ｍｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．　５）で１回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを１ｍ
ｇ／ｍｌとなるように溶かした液０．　５ｍｌで懸濁さ
せ、３７　　℃、１０分で溶菌させた。前記緩衝液で飽
和させたフェノールおよびクロロフォルムからなる混合
液（混合比１：１）を溶菌液に加え、よく撹はんした。 遠心後、上層液を回収し、エタノール処理を行って、核
酸成分を沈澱させた。その沈澱物を前記緩衝液１ｍｌに
溶かして、これを検体とした。

【００１９】プライマーの合成 易熱性腸内毒素を産生する大腸菌のＬＴ遺伝子の塩基配
列（Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．，　Ｔ．Ｔａｍｕｒａ　ａ
ｎｄ　Ｔ．Ｙｏｋｏｔａ　（１９８４）：Ｐｒｉｍａｒ
ｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌ
ｅ　ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ　ｐｒｏｄｕｃｅｄ　ｂｙ
　Ｅｓｃｈｅｌｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｐａｔｈｏｇｅ
ｎｉｃ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎｓ．　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　
Ｃｈｅｍ．，　２５９：５０３７−５０４４　　および
　Ｙａｍａｍｏｔｏ，　Ｔ．，　Ｔ．Ｇｏｊｏｂｏｒｉ
　ａｎｄ　Ｔ．Ｙｏｋｏｔａ　（１９８７）：Ｅｖｏｌ
ｕｔｉｏｎａｒｙ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇ
ｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　ｉｎ　ｅｎｔｅ
ｒｏｔｏｘｉｇｅｎｉｃ　Ｅｓｈｅｌｉｃｈｉａ　ｃｏ
ｌｉａｎｄ　Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　Ｏ１．
　Ｊ．　Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，　１６９：１３５２−１
３５７　）から請求項第１項に示した配列（（ａ）　、
（ｂ）　、（ｃ）　、（ｄ）　、および（ｅ）　）を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成はサイクロンプラスＤＮＡ合成装置（
ミリジェン／バイオリサーチ社製）を用い、β−シアノ
エチルフォスホアミダイト法により行った。合成したオ
リゴヌクレオチドの精製はＣ１８逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。

【００２０】ＰＣＲ 前記検体液３μｌを用い、それに滅菌水１６．　０５μ
ｌ、１０ｘ反応用緩衝液３μｌ、ｄＮＴＰ溶液４．　８
μｌ、プライマー（１　）１．　５μｌ、プライマー（
２　）１．　５μｌ、および耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
０．　１５μｌを加えて３０μｌの反応液を調製した。 この反応液の入った容器にミネラルオイル（ＳＩＧＭＡ
　社製）を５０μｌ加え、反応液上に重層した。各添加
された液の内容、およびプライマー（１　）と（２　）
の組合せを下記に示す。

【００２１】 　　１０ｘ反応緩衝液：　５００ｍＭ　ＫＣｌ，　１０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３），　１５ｍＭ
　ＭｇＣｌ２　，　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　０．１％　（Ｗ／Ｖ）　ゼラチン　　ｄＮＴ
Ｐ溶液：　ｄＡＴＰ，　ｄＣＴＰ，　ｄＧＴＰ，　ｄＴ
ＴＰ　を混合させたもので各終濃度が　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１．２５ｍＭ　　プライマー
（１　）および（２　）：　前述した化学合成精製品の
各水溶液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　（濃度　　５　ＯＤＵ／
ｍｌ）プライマーの組合せ：前述の化学合成精製品で次
のとおりに３組つくり、実験に用いた。 反応条件は、次のとおりである。

【００２２】熱変性：９４　　℃、１分アニーリング：
５５　　℃、１分 重合反応：７２　　℃、１分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を１
サイクル（所要時間５．７　分）とし、これを３５サイ
クル（総所要時間約３時間）行った。これらの操作は、
ＤＮＡサーマルサイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ
　Ｃｅｔｕｓ社製）に上記反応条件をプログラムするこ
とにより行った。

【００２３】検出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。

【００２４】アガロースゲルはゲル濃度３％（Ｗ／Ｖ　
）とし、臭化エチジウム（０．５　μｌ／ｍｌ）を含む
ものを用いた。泳動の電気的条件は、定電圧１００Ｖ、
３０分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ等著Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（
１９８２）　に記載されている技法で行った。 反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出し
た。

【００２５】結果 前述したように、ＬＴ遺伝子は、既に塩基配列が決定さ
れており、本発明のオリゴヌクレオチオド、すなわちプ
ライマーがＰＣＲにより増幅させてくるヌクレオチドの
大きさは推定できる。それによると、プライマー（ａ　
）と（ｂ　）、（ｃ）と（ｄ　）、および（ｅ　）と（
ｄ　）の各組を用いた場合には、それぞれ５８９、５５
０および２６４塩基の長さのヌクレオチドが増幅されて
くるはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオ
チドの長さが一致した場合、各プライマーはＬＴ遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断した
。大腸菌の臨床分離株４９２株を上記方法で検討し、増
幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結果を表１
〜表１３に示す。表１〜表１３プライマー（ｐｒｉｍｅ
ｒ）欄中、＋と記入されたものは、増幅されてきたヌク
レオチドの長さが推定値と一致したもの、また−は増幅
ヌクレオチドが全く検出されなかったものである。

【００２６】同表で示されるように、各組合せのプライ
マーでＰＣＲを行うと、どれも、ＬＴ遺伝子を有する菌
株（表１〜表１３のＬＴｇｅｎｅ欄が＋、２＋、および
ｗのもの）においてのみ、ヌクレオチドを増幅させてい
る。 しかも、増幅されたヌクレオチドのすべては、推定され
たヌクレオチドの長さと一致している。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは毒素
原性大腸菌のＬＴ遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していることが明らかである。

【００２７】（実験例２）実験例１で得られた結果が、
ＬＴを産生する大腸菌に対して選択的なものかどうかを
確かめるため、臨床検査において病原大腸菌以外で検査
対象となりうる菌種について比較検討した。

【００２８】方法は、実験例１に示したものと同じであ
るが、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎ
ｓ　、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ、　
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｃｏｌｉ　、Ｂａｃｔｅ
ｒｏｉｄｅｓ　ｆｌａｇｉｌｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄ
ｅｓ　ｖｕｌｇａｔｕｓ、　　およびＬａｃｔｏｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ　　　については
嫌気的条件下、３７　　℃Ｃで終夜培養を行い、ＰＣＲ
法に適用しうる試料を調製した。検体の調製において培
養した菌は、表１４、１５の縦の見出しに示した５０菌
株である。また、ヒト胎盤由来ＤＮＡ（Ｈｕｍａｎ　ｐ
ｌａｃｅｎｔａ　ＤＮＡ）は１μｇ／ｍｌの濃度のもの
を調製し、これも同様にＰＣＲを行わせた。

【００２９】結果を表１４、１５に示す。各組合せのプ
ライマーでＰＣＲを行ったが、３組のどのプライマーを
使用した場合についても、病原大腸菌以外の各種細菌の
ＤＮＡを増幅することはなかった。したがって、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、易熱性
毒素産生性の大腸菌にのみ、選択的に反応するものと断
言できる。

【００３０】一方、本発明では、ＣＴ産生性のＶｉｂｒ
ｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａｅ　（表１５中、Ｖ．ｃｈｏｌｅ
ｒａｅＯ１ｃｔｘ＋　）とは全く交叉反応を起こさない
こともわかる。前述したように免疫学的にはＣＴとＬＴ
とは抗原共通性をもっていて免疫学的手法によっても、
これらを区別することができなかった。しかし、本発明
ではＬＴ産生性大腸菌のみを明確に検出することから、
従来法に比べて信頼性がより高くなったと考えられる。

【００３１】なお、本発明の実施例で用いているアガロ
ース電気泳動を前述の泳動条件で行えば、１００塩基対
以下のヌクレオチドであれば、５から１０塩基対、１０
０から５００塩基の範囲のヌクレオチドであれば、１０
から２０塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別可能
である。さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させること
ができ、ＬＴ遺伝子の選択的検出における信頼度は、さ
らに高まるものと考えられる。

【００３２】

【表１】

【００３３】

【表２】

【００３４】

【表３】

【００３５】

【表４】

【００３６】

【表５】

【００３７】

【表６】

【００３８】

【表７】

【００３９】

【表８】

【００４０】

【表９】

【００４１】

【表１０】

【００４２】

【表１１】

【００４３】

【表１２】

【００４４】

【表１３】

【００４５】

【表１４】

【００４６】

【表１５】

【００４７】なお、表中 　　　　　　ＬＴｇｅｎｅの欄（＋）：ＬＴ遺伝子を保
有する　　　　　　　　同　　　　　　　　　　　　（
２＋）：　ＬＴ遺伝子を保有する　　　　　　　　同　
　　　　　　　　　　　（ｗ）：　ＬＴ遺伝子を保有す
る　　　　　　　　同　　　　　　　　　　　　（−）
：ＬＴ遺伝子を保有しない　　　　　　Ｐｒｉｍｅｒ欄
　　　　　　　　（＋）：増幅されたヌクレオチドの長
さが推定値と一致　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　したもの　　　　　　　　
同　　　　　　　　　　　　（ｗ）：増幅されたヌクレ
オチドの長さが推定値と一致　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　しているが、増
幅程度が少々弱いもの　　　　　　　　同　　　　　　
　　　　　　（−）：増幅ヌクレオチドが全くみとめら
れなかったも　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　の表１〜１３における各菌株の
入手先：京都大学医学部微生物学教室 表１４、１５（Ｎｏ．１〜３９）　における各菌株の入
手先：ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）ＪＣＭ（理化学研究
所微生物系統保存施設）ＩＦＯ（発酵研究所） 表１５（Ｎｏ．４１　〜５０）　における菌株の入手先
：京都大学医学部微生物学教室 表１５（Ｎｏ．５１）における菌株の入手先：宝酒造株
式会社

【００４８】

【効果】本発明ではＰＣＲ法を用いたことで、毒素原性
大腸菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、２つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。

【００４９】また、高い検出感度のため多量の検体を必
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約３時間、検出にかかる操作が３０分で
ある。

【００５０】また、検出にアガロースゲル電気泳動と臭
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。

【００５１】食中毒原因菌としての病原大腸菌を同定す
る際、ＬＴを産生しているかどうかの確認が重要となっ
ている。他の生物種でＬＴ産生能を持つものはないこと
から、プライマーが標的とするヌクレオチド配列にＬＴ
遺伝子を用いることで、病原大腸菌の選択的検出が可能
となる。

【００５２】

【配列表】

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検体中に存在する毒素原性大腸菌の産生す
   る易熱性腸内毒素（ｈｅａｔ−ｌａｂｉｌｅ　ｔｏｘｉ
   ｎ，　　ＬＴ）遺伝子をコードするヌクレオチド配列を
   標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
   化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
   レオチドが以下の配列群、 （５’）ｄ−ＣＣＣＡＧＡＴＧＡＡＡＴＡＡＡＡＣＧＴ
   −（３’）・・・・（ａ）　（５’）ｄ−ＣＣＴＧＡＧ
   ＡＴＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＣ−（３’）・・・・（ｂ）
   　（５’）ｄ−ＡＣＡＡＡＣＣＧＧＣＴＴＴＧＴＣＡＧ
   ＡＴＡＴ−（３’）・（ｃ）　（５’）ｄ−ＧＴＴＡＴ
   ＡＴＡＴＧＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＡＣ−（３’）・（ｄ
   ）　（５’）ｄ−ＡＣＣＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧＡＡＡＴ
   ＣＴＧＡ−（３’）・・（ｅ）　または対応する相補的
   配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。
2. 【請求項２】請求項第１項に記載された配列のうち、少
   なくとも１つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
   プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
   択的に増幅させることを特徴とする方法であって、（ａ
   ）　検体中の１本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
   イマーをハイブリダイズさせ４種のヌクレオチドの重合
   反応により鎖長反応を行わせ、（ｂ）　得られた２本鎖
   標的ヌクレオチド配列を１本鎖に分離した場合、その相
   補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応の鋳型として機
   能し、（ｃ）　これら２種のプライマーによる同時の鎖
   長反応、プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そし
   て新たなプライマーによるハイブリダイゼーションを繰
   り返すことにより特定のヌクレオチド配列が増幅され、
   この増幅されたヌクレオチド断片を検出し、（ｄ）　そ
   の結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在してい
   るか否かを判定することで毒素原性大腸菌の検出を行う
   ことを特徴とする毒素原性大腸菌の検出方法。