JPH04320675A - 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
中毒にかかる検査、あるいは食品検査での易熱性腸内毒
素(LT)を産生する大腸菌の検出に関するものである
。
または拭き取り材料の場合、毒素原性大腸菌と同定する
までには、増菌培養、分離培養を経て、純培養、および
確認培養を行わなければならない。さらに引き続いて、
血清学的検査、腸内毒素産生試験、その他の生化学的試
験を行うことで、はじめて毒素原性大腸菌と同定される
。 各培養段階に要する時間は、18〜24時間であ
り、その後の検査にかかる時間を合計すると1週間もの
長時間を要する。
目的であれば、逆受身ラテックス凝集反応を利用した腸
内毒素検出用キットも市販されているが、コレラ菌腸内
毒素(以下、CT)とLTとは互いに免疫学的に抗原共
通性を有することが知られており、このためCTとLT
とを区別して検出することが困難である。
、ある程度菌種の同定に関して、絞り込みが行われたも
のを必要としている。この絞り込みの段階までの操作が
煩雑であり、長時間を要する。しかも、このキットにか
かる時間だけでも20〜24時間も必要とする。
の方法はいずれも、毒素原性大腸菌と同定するまでには
非常に複雑な操作と長時間を要し、迅速性を要求される
臨床検査等に向かなかった。
いたDNAプローブ法あるいはハイブリダイゼーション
法が試みられるようになってきた。しかし、オリゴヌク
レオチドを標識修飾したプローブにより膜上、あるいは
他の支持体上でハイブリダイゼーションを行い、これを
検出する場合、細菌検査において十分な検出感度と選択
性を得るのが難しい。
反応のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術によ
り毒素原性大腸菌由来の核酸を検出するもので、簡便、
迅速かつ高感度な検出法を食中毒菌検査において提供す
ることを目的とする。
菌由来の核酸と選択的にハイブリダイズするオリゴヌク
レオチドを作製し、このオリゴヌクレオチドをプライマ
ーとして遺伝子増幅に用い、食中毒症状を起こす毒素原
性大腸菌のみを選択的に検出することを特徴としている
。
体中に存在する毒素原性大腸菌の産生する易熱性腸内毒
素(heat−labile toxin, LT)遺
伝子をコードするヌクレオチド配列を標的とし、そのヌ
クレオチド配列と相補的となるように化学合成されたオ
リゴヌクレオチドであって、合成ヌクレオチドが以下の
配列群、(5’)d−CCCAGATGAAATAAA
ACGT−(3’)・・・・(a) (5’)d−CC
TGAGATATATTGTGCTC−(3’)・・・
・(b) (5’)d−ACAAACCGGCTTTG
TCAGATAT−(3’)・(c) (5’)d−G
TTATATATGTCAACCTCTGAC−(3’
)・(d) (5’)d−ACCGGTATTACAG
AAATCTGA−(3’)・・(e) または対応す
る相補的配列からなることを特徴とする。
開発したPolymerase Chain Reac
tion 法(以下、略してPCR法;Science
230,1350(1985))をもとに行っている
。この方法は、ある特定のヌクレオチド配列領域(本発
明の場合は毒素原性大腸菌のLT遺伝子)を検出する場
合、その領域の両端の一方は+鎖を、他方は−鎖をそれ
ぞれ認識してハイブリダイゼーションするようなオリゴ
ヌクレオチドを用意し、それを熱変性により1本鎖状態
にした試料核酸に対し鋳型依存性ヌクレオチド重合反応
のプライマーとして機能させ、生成した2本鎖核酸を再
び1本鎖に分離し、再び、同様な反応を起こさせる。こ
の一連の操作を繰り返すことで2つのプライマーに挟ま
れた領域は検出できるまでにコピー数が増大してくる。
便、尿、血液、組織ホモジェネートなど、また、食品材
料でもよい。
は、材料中に存在する菌体から核酸成分を遊離させる操
作が前処理として必要となる。しかし、プライマーがハ
イブリダイズできる核酸が数分子から数十分子以上存在
すればPCRは進むので、検査材料を溶菌酵素、界面活
性剤、アルカリ等で短時間処理するだけでPCRを進行
させるに十分な核酸量を持った試料液が調製できる。
ゴヌクレオチドは、選択性や検出感度および再現性から
考えて、10塩基以上、望ましくは15塩基以上の長さ
を持ったヌクレオチド断片で、化学合成あるいは天然の
どちらでもよい。また、プライマーは、特に検出用とし
て標識されていなくてもよい。
の特定遺伝子のヌクレオチド配列における増幅領域は、
50塩基から2,000塩基、望ましくは、100塩基
から1,000塩基となればよい。
熱性DNAポリメラーゼを用いているが、この酵素の起
源については90〜95℃、プライマーをハイブリダイ
ズさせるアニーリング操作の温度は37〜65℃、重合
反応は50〜75℃で、これを1サイクルとしたPCR
を20から42サイクル行って増幅させる。
ガロースゲル電気泳動にかけることで、増幅されたヌク
レオチド断片の存在、およびその長さが確認できる。そ
の結果から、検体中にプライマーが認識すべき配列を持
ったヌクレオチドが存在しているかどうか判定すること
ができる。この判定は、そのままLTを産出する大腸菌
の有無を判定するものとなる。増幅されたヌクレオチド
断片の検出には、その他の電気泳動やクロマトグラフィ
ー、DNAプロ−ブ法も有効である。
のプライマーとして機能させた遺伝子増幅技術により毒
素原性大腸菌由来のLTを検出するもので、簡便、迅速
かつ高感度な検出ができる。
に示した下痢症患者から分離した大腸菌492株を用い
た。これらの菌株は京都大学医学部微生物学教室(主任
、竹田美文教授)から分与された。それぞれの菌株を適
当な増菌培地に接種し、37 ℃、好気的条件下で終
夜培養を行い、その培地1. 5mlから遠心操作によ
り菌体を回収した。10mmトリス−塩酸緩衝液(pH
7. 5)で1回洗浄後、同緩衝液にリゾチームを1m
g/mlとなるように溶かした液0. 5mlで懸濁さ
せ、37 ℃、10分で溶菌させた。前記緩衝液で飽
和させたフェノールおよびクロロフォルムからなる混合
液(混合比1:1)を溶菌液に加え、よく撹はんした。 遠心後、上層液を回収し、エタノール処理を行って、核
酸成分を沈澱させた。その沈澱物を前記緩衝液1mlに
溶かして、これを検体とした。
列(Yamamoto,T., T.Tamura a
nd T.Yokota (1984):Primar
y structure of heat−labil
e enterotoxin produced by
Eschelichia coli pathoge
nic for humans. J. Biol.
Chem., 259:5037−5044 および
Yamamoto, T., T.Gojobori
and T.Yokota (1987):Evol
utionary origin of pathog
enic determinants in ente
rotoxigenic Eshelichia co
liand Vibrio cholerae O1.
J. Bateriol., 169:1352−1
357 )から請求項第1項に示した配列((a) 、
(b) 、(c) 、(d) 、および(e) )を選
び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオチドを化学合
成した。化学合成はサイクロンプラスDNA合成装置(
ミリジェン/バイオリサーチ社製)を用い、β−シアノ
エチルフォスホアミダイト法により行った。合成したオ
リゴヌクレオチドの精製はC18逆相カラムを用いた高
速液体クロマトグラフィーで行った。
l、10x反応用緩衝液3μl、dNTP溶液4. 8
μl、プライマー(1 )1. 5μl、プライマー(
2 )1. 5μl、および耐熱性DNAポリメラーゼ
0. 15μlを加えて30μlの反応液を調製した。 この反応液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA
社製)を50μl加え、反応液上に重層した。各添加
された液の内容、およびプライマー(1 )と(2 )
の組合せを下記に示す。
0mM Tris−HCl(pH8.3), 15mM
MgCl2 ,
0.1% (W/V) ゼラチン dNT
P溶液: dATP, dCTP, dGTP, dT
TP を混合させたもので各終濃度が
1.25mM プライマー
(1 )および(2 ): 前述した化学合成精製品の
各水溶液
(濃度 5 ODU/
ml)プライマーの組合せ:前述の化学合成精製品で次
のとおりに3組つくり、実験に用いた。 反応条件は、次のとおりである。
55 ℃、1分 重合反応:72 ℃、1分 熱変性からアニーリングを経て重合反応に至る過程を1
サイクル(所要時間5.7 分)とし、これを35サイ
クル(総所要時間約3時間)行った。これらの操作は、
DNAサーマルサイクラー(Perkin Elmer
Cetus社製)に上記反応条件をプログラムするこ
とにより行った。
め、アガロースゲル電気泳動を以下のように行った。
)とし、臭化エチジウム(0.5 μl/ml)を含む
ものを用いた。泳動の電気的条件は、定電圧100V、
30分で行った。操作方法ならびに他の条件は、Man
iatis等著Molecular Cloning(
1982) に記載されている技法で行った。 反応液の他に分子量マーカーの泳動も同時に行い、相対
移動度の比較により、ヌクレオチド断片の長さを算出し
た。
れており、本発明のオリゴヌクレオチオド、すなわちプ
ライマーがPCRにより増幅させてくるヌクレオチドの
大きさは推定できる。それによると、プライマー(a
)と(b )、(c)と(d )、および(e )と(
d )の各組を用いた場合には、それぞれ589、55
0および264塩基の長さのヌクレオチドが増幅されて
くるはずである。これらの推定値と増幅されたヌクレオ
チドの長さが一致した場合、各プライマーはLT遺伝子
の標的としている領域を正しく増幅していると判断した
。大腸菌の臨床分離株492株を上記方法で検討し、増
幅されてきたヌクレオチドの長さを測定した結果を表1
〜表13に示す。表1〜表13プライマー(prime
r)欄中、+と記入されたものは、増幅されてきたヌク
レオチドの長さが推定値と一致したもの、また−は増幅
ヌクレオチドが全く検出されなかったものである。
マーでPCRを行うと、どれも、LT遺伝子を有する菌
株(表1〜表13のLTgene欄が+、2+、および
wのもの)においてのみ、ヌクレオチドを増幅させてい
る。 しかも、増幅されたヌクレオチドのすべては、推定され
たヌクレオチドの長さと一致している。したがって、本
発明のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは毒素
原性大腸菌のLT遺伝子の標的としている領域を正しく
増幅していることが明らかである。
LTを産生する大腸菌に対して選択的なものかどうかを
確かめるため、臨床検査において病原大腸菌以外で検査
対象となりうる菌種について比較検討した。
るが、Clostridium perfringen
s 、Campylobacter jejuni、
Campylobacter coli 、Bacte
roides flagilis、Bacteroid
es vulgatus、 およびLactobac
illus acidophilus については
嫌気的条件下、37 ℃Cで終夜培養を行い、PCR
法に適用しうる試料を調製した。検体の調製において培
養した菌は、表14、15の縦の見出しに示した50菌
株である。また、ヒト胎盤由来DNA(Human p
lacenta DNA)は1μg/mlの濃度のもの
を調製し、これも同様にPCRを行わせた。
ライマーでPCRを行ったが、3組のどのプライマーを
使用した場合についても、病原大腸菌以外の各種細菌の
DNAを増幅することはなかった。したがって、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわちプライマーは、易熱性
毒素産生性の大腸菌にのみ、選択的に反応するものと断
言できる。
io cholerae (表15中、V.chole
raeO1ctx+ )とは全く交叉反応を起こさない
こともわかる。前述したように免疫学的にはCTとLT
とは抗原共通性をもっていて免疫学的手法によっても、
これらを区別することができなかった。しかし、本発明
ではLT産生性大腸菌のみを明確に検出することから、
従来法に比べて信頼性がより高くなったと考えられる。
ース電気泳動を前述の泳動条件で行えば、100塩基対
以下のヌクレオチドであれば、5から10塩基対、10
0から500塩基の範囲のヌクレオチドであれば、10
から20塩基対のヌクレオチドの長さの違いを区別可能
である。さらに、アクリルアミドなどをゲルに用いるこ
とで、ヌクレオチドの長さの測定精度を向上させること
ができ、LT遺伝子の選択的検出における信頼度は、さ
らに高まるものと考えられる。
有する 同 (
2+): LT遺伝子を保有する 同
(w): LT遺伝子を保有す
る 同 (−)
:LT遺伝子を保有しない Primer欄
(+):増幅されたヌクレオチドの長
さが推定値と一致
したもの
同 (w):増幅されたヌクレ
オチドの長さが推定値と一致
しているが、増
幅程度が少々弱いもの 同
(−):増幅ヌクレオチドが全くみとめら
れなかったも
の表1〜13における各菌株の
入手先:京都大学医学部微生物学教室 表14、15(No.1〜39) における各菌株の入
手先:ATCC(American Type Cul
ture Collection)JCM(理化学研究
所微生物系統保存施設)IFO(発酵研究所) 表15(No.41 〜50) における菌株の入手先
:京都大学医学部微生物学教室 表15(No.51)における菌株の入手先:宝酒造株
式会社
大腸菌の検出において、遺伝子増幅作用による高い検出
感度と、2つあるいは、それ以上のプライマーで反応が
規定されることによる高い選択性を得ることができる。
要とせず、検体の前処理が簡便で済む。しかも、反応時
間が短く、検出も簡単な機材で済み、操作も容易なため
同定までの時間を大幅に短縮できる。例えば、実施例で
は、反応時間が約3時間、検出にかかる操作が30分で
ある。
化エチジウムによる核酸染色法を用いることで、プライ
マー等を標識せずに検出が行え、しかも、核酸の長さが
確認できるので、結果の信頼性が高いものとなる。
る際、LTを産生しているかどうかの確認が重要となっ
ている。他の生物種でLT産生能を持つものはないこと
から、プライマーが標的とするヌクレオチド配列にLT
遺伝子を用いることで、病原大腸菌の選択的検出が可能
となる。
Claims (2)
- 【請求項1】検体中に存在する毒素原性大腸菌の産生す
る易熱性腸内毒素(heat−labile toxi
n, LT)遺伝子をコードするヌクレオチド配列を
標的とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように
化学合成されたオリゴヌクレオチドであって、合成ヌク
レオチドが以下の配列群、 (5’)d−CCCAGATGAAATAAAACGT
−(3’)・・・・(a) (5’)d−CCTGAG
ATATATTGTGCTC−(3’)・・・・(b)
(5’)d−ACAAACCGGCTTTGTCAG
ATAT−(3’)・(c) (5’)d−GTTAT
ATATGTCAACCTCTGAC−(3’)・(d
) (5’)d−ACCGGTATTACAGAAAT
CTGA−(3’)・・(e) または対応する相補的
配列からなることを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - 【請求項2】請求項第1項に記載された配列のうち、少
なくとも1つを有するオリゴヌクレオチドを鎖長反応の
プライマーとして機能させ、標的ヌクレオチド配列を選
択的に増幅させることを特徴とする方法であって、(a
) 検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプラ
イマーをハイブリダイズさせ4種のヌクレオチドの重合
反応により鎖長反応を行わせ、(b) 得られた2本鎖
標的ヌクレオチド配列を1本鎖に分離した場合、その相
補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応の鋳型として機
能し、(c) これら2種のプライマーによる同時の鎖
長反応、プライマー鎖長生成物の鋳型からの分離、そし
て新たなプライマーによるハイブリダイゼーションを繰
り返すことにより特定のヌクレオチド配列が増幅され、
この増幅されたヌクレオチド断片を検出し、(d) そ
の結果、前記検体中に認識されるべき配列が存在してい
るか否かを判定することで毒素原性大腸菌の検出を行う
ことを特徴とする毒素原性大腸菌の検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3086424A JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP3086424A JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH04320675A true JPH04320675A (ja) | 1992-11-11 |
JPH07114720B2 JPH07114720B2 (ja) | 1995-12-13 |
Family
ID=13886516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP3086424A Expired - Lifetime JPH07114720B2 (ja) | 1991-04-18 | 1991-04-18 | 毒素原性大腸菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07114720B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0556504A2 (en) * | 1992-02-18 | 1993-08-25 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02249499A (ja) * | 1989-03-24 | 1990-10-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
-
1991
- 1991-04-18 JP JP3086424A patent/JPH07114720B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH02249499A (ja) * | 1989-03-24 | 1990-10-05 | Fujisawa Pharmaceut Co Ltd | ビブリオ・アンギュラルムの種決定オリゴヌクレオチドおよびその用途 |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0556504A2 (en) * | 1992-02-18 | 1993-08-25 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria |
EP0556504A3 (en) * | 1992-02-18 | 1994-05-18 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides for detecting bacteria |
EP1085100A1 (en) * | 1992-02-18 | 2001-03-21 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07114720B2 (ja) | 1995-12-13 |
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