JPH0349699A - 細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 - Google Patents
細菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法Info
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- JPH0349699A JPH0349699A JP18568489A JP18568489A JPH0349699A JP H0349699 A JPH0349699 A JP H0349699A JP 18568489 A JP18568489 A JP 18568489A JP 18568489 A JP18568489 A JP 18568489A JP H0349699 A JPH0349699 A JP H0349699A
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- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
[産業上の利用分野 ]
本発明は、臨床検査、殊に食中毒検査、または食品検査
において ウェルシュ@ ( Clostrldium
perfrlBens)を検出する. 〔 従来の技術と問題点 〕 検査材料が患者の嘔吐物、糞便,食品または拭き取り材
料の場合、ウェルシュ薗と同定するまでには、増菌培養
、確認培養に至る操作を行わなければならない.各培賛
段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間
にすると約2日間となり、長時間を要する.確認培養で
は、好気培養仏 下 体色 試験、運動性試験、ゼラチン液化試験、炭水化物分解試
験、レシチナーゼ反応抑制試験ならびに牛乳凝固消化!
iC験を行う必要があり,時間的、コスト的に負担が大
きい。さらに、ウェルシュ菌の腸炎起病性、すなわち、
食中毒を起こさせるenterotoχjaが産生され
ているかどうかを調べる必要がある, entero
toxlnの検査法としては、ウサギ結さつ腸管反応、
マウス致死反応、モルモットあるいはウサギ皮肉反応、
培!IAI胞致死括性などの生物学的な方法、およびゲ
ル内沈降反応、カウンター免疫電気泳動法、ラテックス
凝集反応、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法など
の免疫学的な方法とがある.ラテックス凝集反応の1つ
で逆受身ラテックス凝集反応で直接検出する方法がこれ
まで最も有効な方法であったが、結果を得るまでに20
〜24時間を要する. 最近では,オリゴヌクレオチドを用いたDNA1ロープ
法あるいはハイプリダイゼーション法が試みられるよう
になってきた.しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾
した1ロープにより膜上,あるいは他の支持体上でハイ
ブリダイゼーションを行い、これを検出する場合、m菌
検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい
.[ 発明の目的 】 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりウェルシュ
菌のenterotoxlr+遺伝子を検出するもので
、食中毒検査において簡便、迅速かつ高感度なウェルシ
ュ菌についての検出法を提供することにある.
において ウェルシュ@ ( Clostrldium
perfrlBens)を検出する. 〔 従来の技術と問題点 〕 検査材料が患者の嘔吐物、糞便,食品または拭き取り材
料の場合、ウェルシュ薗と同定するまでには、増菌培養
、確認培養に至る操作を行わなければならない.各培賛
段階に要する時間は、18〜24時間であり総所要時間
にすると約2日間となり、長時間を要する.確認培養で
は、好気培養仏 下 体色 試験、運動性試験、ゼラチン液化試験、炭水化物分解試
験、レシチナーゼ反応抑制試験ならびに牛乳凝固消化!
iC験を行う必要があり,時間的、コスト的に負担が大
きい。さらに、ウェルシュ菌の腸炎起病性、すなわち、
食中毒を起こさせるenterotoχjaが産生され
ているかどうかを調べる必要がある, entero
toxlnの検査法としては、ウサギ結さつ腸管反応、
マウス致死反応、モルモットあるいはウサギ皮肉反応、
培!IAI胞致死括性などの生物学的な方法、およびゲ
ル内沈降反応、カウンター免疫電気泳動法、ラテックス
凝集反応、ELISA法、ラジオイムノアッセイ法など
の免疫学的な方法とがある.ラテックス凝集反応の1つ
で逆受身ラテックス凝集反応で直接検出する方法がこれ
まで最も有効な方法であったが、結果を得るまでに20
〜24時間を要する. 最近では,オリゴヌクレオチドを用いたDNA1ロープ
法あるいはハイプリダイゼーション法が試みられるよう
になってきた.しかし、オリゴヌクレオチドを標識修飾
した1ロープにより膜上,あるいは他の支持体上でハイ
ブリダイゼーションを行い、これを検出する場合、m菌
検査において十分な検出感度と選択性を得るのが難しい
.[ 発明の目的 】 本発明は、オリゴヌクレオチドを核酸合成反応のプライ
マーとして機能させた遺伝子増幅技術によりウェルシュ
菌のenterotoxlr+遺伝子を検出するもので
、食中毒検査において簡便、迅速かつ高感度なウェルシ
ュ菌についての検出法を提供することにある.
(実施例l〉
挾JLljL製
ウェルシュ薗は表1の縦の見出しに示した11株を用い
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、40℃、嫌気的
条件下で一晩1t112を行い、その培地,1.5ml
から遠心操作により菌体を回収した. 10mMl−
リスー塩酸Mll液(pH7. 5)で1回洗浄後,
同M衝液にリゾチームをlmg/m1となるように溶か
した液,0.5mlで懸濁させ、37℃、 10分で溶
菌させた.溶菌液に前記MfR液で飽和させたフェノー
ルを同容量加え、よく攪はんした.遠心後.上層液を回
収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ
、その沈澱物を前記MfR液、lmlに溶かして、これ
を検体とした. + . ム ウェルシュ菌のenterotoxln遺伝子のヌクレ
オチド配列に関する情報は、enterotoxinの
アミノ酸配列( Rlchardson 14.and
(iranum P.E. ;FHBS Lett−
Crs 182:479−484(1985>)より逆
翻訳して得られた情報を用い,特許請求範囲第2項に示
した配列を遍び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した.化学合戒は島津DNA合成機NS
−1を用い、トリエステル法により行った.合成したオ
リゴヌクレオチド断片の精製はCI8逆相カラムを用い
て行った. L立上 前記検体液を3μ!を用いそれに滅菌蒸留水16.05
μ1、IOX反応用パツファ−3μ!、dNTP溶液4
.8μl、プライマ−(1)1.5μl、プライマー(
2>1.5μ!そして耐熱性DNAポリメラーゼ0、
15μ1を加え、30μlの反応液を!Il製した.
この反応液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA
社製)を50μ1加え反応液上に重層する.各添加され
た液の内容を下記に示す. tOX反応用バッフ7 : 500mM KCI
,100mM Tris−HCI(PH8. 3)
,15mM MgCl*,0.1%(W/V)ゼラチ
ン. dNTP溶液: dATP, dCTP, dG
TP,dTTPを混合させたもので各終濃度が1,25
mM. プライマ−(1)および(2): 前述した化学合成N
製品の各水溶液(50Dυ/ml)プライマーの組合せ
は、特許請求範囲第2項に示した配列((五)〜(C)
》より、次の組合せを用いた. マー + マー (a−) +
(b)(直) +
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ: Taq D
NAポリメラーゼ( 5 unit/ ml; Pe
rkln Elmer Cetus社製)2 反応条件は、次の通りである. 熱変性: 94℃ 1分 アニーリング: 37℃ 1分 重合反応:60’CI分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を1
サイクル(5.7分〉とし、これを42サイクル《総所
要時間約4時間》行った.これらの操作は、 Perk
in Elmer Cetus社製 D?lA The
rmalCyclerに上記反応条件を7口グラムする
ことで行った. 撞二出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った. アガロースゲルはゲル濃度2%(W/V)とし、臭化エ
チジウム(0.5μg/ml)を含むものを用いた.泳
動の電気的条件は、定電圧1 0 0 V.時間は30
分行った.操作方法ならびに他の条件は14inlaN
s等、Molecular Clonin!(1982
)に記載されている技法で行った.反応液の他に分子量
マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較によ
りヌクレオ,チド断片の長さを算出した.級1 前述したように、逆W4訳したウェルシュ菌のente
rotoxin遺伝子のヌクレオチド配列から、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCR
により、増幅されてくるヌクレオナドの大きさは推定で
きる.それによると、プライマー(a)と(b)では、
728塩基、 (a)と(c)では、 602塩基の
長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである.表1
に示した数値は、上記方法で増輻されてきたヌクレオチ
ドの長さを測定した結果で, 単位はキロ塩基対である. 同表では(5)、 (l1)の株を除き、 各プライマーの組合せとも、 (7》、 推 定されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらの
株にはenterotoxin 遺伝子が存在し、 標的 としている領域を正しく増幅してきていることを示して
いる. 菌株名 Clostrldium Clostrldlum Clostridlum Clostrldluii Clostrldlus 表 1 プライマーの組合せ (a)+ (b) (a)+ (c) perfrlngens(1) perfrlBens (2) p@rfrlngens(3) perfrlBens(4) perfrlngens(5) 0.73 0.73 0.73 0.73 0.60 0.60 0.60 0,60 Clostrldlum perfrlngens(
9) 0.73Clostrldlum pe
rfrlngens(10) 0.73Clost
rldlum perfrlngens(11)
0.300.60 0、60 (1)から(11)までのウェルシュ菌( Clost
rldlus+ P 21,(8)A丁Cは2922,(9)ATCは292
4.(10)^TCは2925:Amerlcan
Type Culture Collection
,(11)JCl43816:埋化字研究所 (実施例2) 実施例1で得られた結果が、ウェルシュ菌に対し選択的
なものかどうか確かめるため、臨床検査においてウェル
シュ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討
した. 方法は、実MA例1に示したものと同じであるが、(6
)、(7)、(9)は嫌気的条件下、40℃で、それ以
外の株は好気的条件下、37℃で一晩培養を行った.検
体の調製において培養した菌は、表2の縦の見出しに示
した10i!1株である.また,ヒト胎盤由来DNAは
1μg/mlの濃度のものをy4製し、これも同様にP
CRを行わせた. 結果を表2に示す.表1と同様、潤内の数値の単位はキ
ロ塩基対である.一部の菌種においてPCR反応の副次
的産物とみられる増幅されたヌクレオチドが検出された
が、 どれもenterotoxin遺伝子の塩基配列
から推定されるヌクレオチドの長さとは異なっている.
ウェルシュ菌と同じenterotoxin遺伝子をこ
れらのmNが持っていれば実施例lの結果と同じ長さの
ヌクレオチドがはずである.従って、こhら菌種由来の
増幅されたヌクレオチドはenterolxin遺伝子
を!! !l Lて生成されたものではないことが明か
であり、ウェルシュ菌とは容易に区別し検出できること
がわかる.なお、本発明の実施例に用いているアガロー
ス電気泳動を前述の泳動条件で行えば100塩基対以下
の範囲であれば5から10塩基対、 lOOから500
垣基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチ
ドの長さの違いを区別することができる.さらに、アク
リルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオチドの長
さの測定の精度を向上させれば、選択的検出における信
頼度はさらに高まるものと考えられる. c以下余白) 表 2 菌株名 ブライマーの組合せ (a)” (b) (a) + (c)はostrI
dium perfBngens O.7
3 0.60(ATCは2917) Bacillus cereus(1)
0.20Salmonel
la typhlmurlum(2) 0.6
0 −Stapylococcus a
ureus(3) 0.45 0.
35Escherichla col1(4)
0.60 0.65Vibrlo
parahaemolyticus(5) 0
.45 −Campylobacter
JeJuni(6) 0.35Bict
eroides vulgatus(7)
0.45Enterococcus faecal
ls(8> 0.45Lactobacill
us acldophllus(9) 0.45
−Yersinia enteroco
litica(10) 0.Hl −
Hu+san plasenta(11)(1)JC
M2152.(3)JCM2413.(4)JCM16
49.(6)JCM2013,(7)JCM5826.
<8>JCM5803. (9)JCM1132:理
化学研究所, (2)IFO12529, (5)IF
O12711:発酵研究所. (10)^TCC961
0:^g+erican Type Cultur
e Collection,(11)I{uman
placental DNA:Onco社製(cA
施例3) 実施例1で用いたウェルシュ閉(Clostridiu
mpcrfrlngens) 1 1株についてent
erotoxinの産生能について検討した. 友二法 ラテックス凝集法を用いた市販のenterotoxi
n検出用キット ( PET−RPLA:デンカ生研) により、 のマニュアルに従って各ウェルシュ菌についてのent
erotoxln 活性を調べた. 結二果 表3はその結果である. −の判定は、 同マ ニュアルの判定基準に則って行った. なお、 P C Rによる結果は、 実施例1と同じ方法によるもの である. 菌株名 ラテックス凝集法 PCR反応での C.perfringens(5) C.perfrlBens(6) C.perfrlngens(7) C.perfringens (8) C,perfr1ngens(9) C.perfrlngens (10)C.perfr
ingens(11) 0.73 0.73 0.73 0、73 0.30 0,60 0,60 0.60 0.60 の株番号および入手先は表1 を参照. 表に示した結果から明らかなように、市販キットによる
ラテックス11集法で十とでている株については、PC
R法でも正確な長さのヌクレオチド断片が生成されてい
る.−となった株については、PCR反応による増幅ヌ
クレオチド断片が生成されないか、生成しても長さが大
きく異なっている.このように、市販キットによるラテ
ックスa2集法と本発明の方法と結果は一致しており、
このことは、ウェルシュ菌のenterotoxin産
生能がenterotoxin遺伝子の有無で検査でき
ることを示している.したがって、enterotox
ln遺伝子の存在を直接,検出することは、enter
otoxin産生能を持ったウェルシュ菌を検出してい
ることと同じ意味を持つ・ 本発明は、ウェルシュ菌
のenterotoxin遺伝子を直接、検出すること
で食中毒菌としてのウェルシュ菌の検出を行うもので、
以上の結果は、本発明の目的に添うものである. [ 発明の効果] 本発明では、PCR法を用いたことで、遺伝子増幅作用
による高い検出感度と、2つあるいは、それ以上のプラ
イマーで反応が規定されることによる高い選択性を実現
することができる.また、高い検出感度のため多量の検
体を必要とせず,検体の前処理が簡便で済む.しかも、
反応時間が短く、検出も簡単な機材だけで済み、操作も
容易なため同定までの時間を大幅に短縮でき、検査の効
率化を図ることができる.以下の実施例に示すが、反応
時間が4時間、検出にががる操作が30分である.また
、検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによ
る核酸染色法を用いることで、1ライマー等に標識せず
に検出が行え,しがち、核酸の長さが確1Σできるので
結果の信頼性が高いものとなる. 1ライマーが標的とするヌクレオチド配列にウェルシュ
菌のenterotoxln遺伝子を用いたことによる
効果は、次の通りである. ウェルシュ菌にはent
erotoxlnを産生する株と産生しない株があり,
前者のenterotoxln’産生株が、食中S原因
菌となっている.また、ヒトの糞便中にはentero
toxln非産生の常在性ウェルシュ薗がいる.特に、
糞便を検体として食中毒検査を行う場合、entero
toxinを産生しているか否かが重要となる.従って
、enterotoxln遺伝子を標的とすることで食
中llM因薗としてのウェルシュ菌を選択的に検出する
ことができる.
てそれぞれを適当な増菌培地に接種し、40℃、嫌気的
条件下で一晩1t112を行い、その培地,1.5ml
から遠心操作により菌体を回収した. 10mMl−
リスー塩酸Mll液(pH7. 5)で1回洗浄後,
同M衝液にリゾチームをlmg/m1となるように溶か
した液,0.5mlで懸濁させ、37℃、 10分で溶
菌させた.溶菌液に前記MfR液で飽和させたフェノー
ルを同容量加え、よく攪はんした.遠心後.上層液を回
収し、エタノール沈澱処理を行って核酸成分を沈澱させ
、その沈澱物を前記MfR液、lmlに溶かして、これ
を検体とした. + . ム ウェルシュ菌のenterotoxln遺伝子のヌクレ
オチド配列に関する情報は、enterotoxinの
アミノ酸配列( Rlchardson 14.and
(iranum P.E. ;FHBS Lett−
Crs 182:479−484(1985>)より逆
翻訳して得られた情報を用い,特許請求範囲第2項に示
した配列を遍び、それと同じ配列を持つオリゴヌクレオ
チドを化学合成した.化学合戒は島津DNA合成機NS
−1を用い、トリエステル法により行った.合成したオ
リゴヌクレオチド断片の精製はCI8逆相カラムを用い
て行った. L立上 前記検体液を3μ!を用いそれに滅菌蒸留水16.05
μ1、IOX反応用パツファ−3μ!、dNTP溶液4
.8μl、プライマ−(1)1.5μl、プライマー(
2>1.5μ!そして耐熱性DNAポリメラーゼ0、
15μ1を加え、30μlの反応液を!Il製した.
この反応液の入った容器にミネラルオイル(SIGMA
社製)を50μ1加え反応液上に重層する.各添加され
た液の内容を下記に示す. tOX反応用バッフ7 : 500mM KCI
,100mM Tris−HCI(PH8. 3)
,15mM MgCl*,0.1%(W/V)ゼラチ
ン. dNTP溶液: dATP, dCTP, dG
TP,dTTPを混合させたもので各終濃度が1,25
mM. プライマ−(1)および(2): 前述した化学合成N
製品の各水溶液(50Dυ/ml)プライマーの組合せ
は、特許請求範囲第2項に示した配列((五)〜(C)
》より、次の組合せを用いた. マー + マー (a−) +
(b)(直) +
(c)耐熱性DNAポリメラーゼ: Taq D
NAポリメラーゼ( 5 unit/ ml; Pe
rkln Elmer Cetus社製)2 反応条件は、次の通りである. 熱変性: 94℃ 1分 アニーリング: 37℃ 1分 重合反応:60’CI分 熱変性からア二一リングを経て重合反応に至る過程を1
サイクル(5.7分〉とし、これを42サイクル《総所
要時間約4時間》行った.これらの操作は、 Perk
in Elmer Cetus社製 D?lA The
rmalCyclerに上記反応条件を7口グラムする
ことで行った. 撞二出 反応液から、増幅されたヌクレオチド断片を検出するた
め、アガロース電気泳動を以下の様に行った. アガロースゲルはゲル濃度2%(W/V)とし、臭化エ
チジウム(0.5μg/ml)を含むものを用いた.泳
動の電気的条件は、定電圧1 0 0 V.時間は30
分行った.操作方法ならびに他の条件は14inlaN
s等、Molecular Clonin!(1982
)に記載されている技法で行った.反応液の他に分子量
マーカーの泳動も、同時に行い、相対移動度の比較によ
りヌクレオ,チド断片の長さを算出した.級1 前述したように、逆W4訳したウェルシュ菌のente
rotoxin遺伝子のヌクレオチド配列から、本発明
のオリゴヌクレオチド、すなわち、プライマーがPCR
により、増幅されてくるヌクレオナドの大きさは推定で
きる.それによると、プライマー(a)と(b)では、
728塩基、 (a)と(c)では、 602塩基の
長さのヌクレオチドが増幅されてくるはずである.表1
に示した数値は、上記方法で増輻されてきたヌクレオチ
ドの長さを測定した結果で, 単位はキロ塩基対である. 同表では(5)、 (l1)の株を除き、 各プライマーの組合せとも、 (7》、 推 定されたヌクレオチドの長さと一致しており、これらの
株にはenterotoxin 遺伝子が存在し、 標的 としている領域を正しく増幅してきていることを示して
いる. 菌株名 Clostrldium Clostrldlum Clostridlum Clostrldluii Clostrldlus 表 1 プライマーの組合せ (a)+ (b) (a)+ (c) perfrlngens(1) perfrlBens (2) p@rfrlngens(3) perfrlBens(4) perfrlngens(5) 0.73 0.73 0.73 0.73 0.60 0.60 0.60 0,60 Clostrldlum perfrlngens(
9) 0.73Clostrldlum pe
rfrlngens(10) 0.73Clost
rldlum perfrlngens(11)
0.300.60 0、60 (1)から(11)までのウェルシュ菌( Clost
rldlus+ P 21,(8)A丁Cは2922,(9)ATCは292
4.(10)^TCは2925:Amerlcan
Type Culture Collection
,(11)JCl43816:埋化字研究所 (実施例2) 実施例1で得られた結果が、ウェルシュ菌に対し選択的
なものかどうか確かめるため、臨床検査においてウェル
シュ菌以外で検査対象となり得る菌種について比較検討
した. 方法は、実MA例1に示したものと同じであるが、(6
)、(7)、(9)は嫌気的条件下、40℃で、それ以
外の株は好気的条件下、37℃で一晩培養を行った.検
体の調製において培養した菌は、表2の縦の見出しに示
した10i!1株である.また,ヒト胎盤由来DNAは
1μg/mlの濃度のものをy4製し、これも同様にP
CRを行わせた. 結果を表2に示す.表1と同様、潤内の数値の単位はキ
ロ塩基対である.一部の菌種においてPCR反応の副次
的産物とみられる増幅されたヌクレオチドが検出された
が、 どれもenterotoxin遺伝子の塩基配列
から推定されるヌクレオチドの長さとは異なっている.
ウェルシュ菌と同じenterotoxin遺伝子をこ
れらのmNが持っていれば実施例lの結果と同じ長さの
ヌクレオチドがはずである.従って、こhら菌種由来の
増幅されたヌクレオチドはenterolxin遺伝子
を!! !l Lて生成されたものではないことが明か
であり、ウェルシュ菌とは容易に区別し検出できること
がわかる.なお、本発明の実施例に用いているアガロー
ス電気泳動を前述の泳動条件で行えば100塩基対以下
の範囲であれば5から10塩基対、 lOOから500
垣基対の範囲であれば10から20塩基対のヌクレオチ
ドの長さの違いを区別することができる.さらに、アク
リルアミドなどをゲルに用いることでヌクレオチドの長
さの測定の精度を向上させれば、選択的検出における信
頼度はさらに高まるものと考えられる. c以下余白) 表 2 菌株名 ブライマーの組合せ (a)” (b) (a) + (c)はostrI
dium perfBngens O.7
3 0.60(ATCは2917) Bacillus cereus(1)
0.20Salmonel
la typhlmurlum(2) 0.6
0 −Stapylococcus a
ureus(3) 0.45 0.
35Escherichla col1(4)
0.60 0.65Vibrlo
parahaemolyticus(5) 0
.45 −Campylobacter
JeJuni(6) 0.35Bict
eroides vulgatus(7)
0.45Enterococcus faecal
ls(8> 0.45Lactobacill
us acldophllus(9) 0.45
−Yersinia enteroco
litica(10) 0.Hl −
Hu+san plasenta(11)(1)JC
M2152.(3)JCM2413.(4)JCM16
49.(6)JCM2013,(7)JCM5826.
<8>JCM5803. (9)JCM1132:理
化学研究所, (2)IFO12529, (5)IF
O12711:発酵研究所. (10)^TCC961
0:^g+erican Type Cultur
e Collection,(11)I{uman
placental DNA:Onco社製(cA
施例3) 実施例1で用いたウェルシュ閉(Clostridiu
mpcrfrlngens) 1 1株についてent
erotoxinの産生能について検討した. 友二法 ラテックス凝集法を用いた市販のenterotoxi
n検出用キット ( PET−RPLA:デンカ生研) により、 のマニュアルに従って各ウェルシュ菌についてのent
erotoxln 活性を調べた. 結二果 表3はその結果である. −の判定は、 同マ ニュアルの判定基準に則って行った. なお、 P C Rによる結果は、 実施例1と同じ方法によるもの である. 菌株名 ラテックス凝集法 PCR反応での C.perfringens(5) C.perfrlBens(6) C.perfrlngens(7) C.perfringens (8) C,perfr1ngens(9) C.perfrlngens (10)C.perfr
ingens(11) 0.73 0.73 0.73 0、73 0.30 0,60 0,60 0.60 0.60 の株番号および入手先は表1 を参照. 表に示した結果から明らかなように、市販キットによる
ラテックス11集法で十とでている株については、PC
R法でも正確な長さのヌクレオチド断片が生成されてい
る.−となった株については、PCR反応による増幅ヌ
クレオチド断片が生成されないか、生成しても長さが大
きく異なっている.このように、市販キットによるラテ
ックスa2集法と本発明の方法と結果は一致しており、
このことは、ウェルシュ菌のenterotoxin産
生能がenterotoxin遺伝子の有無で検査でき
ることを示している.したがって、enterotox
ln遺伝子の存在を直接,検出することは、enter
otoxin産生能を持ったウェルシュ菌を検出してい
ることと同じ意味を持つ・ 本発明は、ウェルシュ菌
のenterotoxin遺伝子を直接、検出すること
で食中毒菌としてのウェルシュ菌の検出を行うもので、
以上の結果は、本発明の目的に添うものである. [ 発明の効果] 本発明では、PCR法を用いたことで、遺伝子増幅作用
による高い検出感度と、2つあるいは、それ以上のプラ
イマーで反応が規定されることによる高い選択性を実現
することができる.また、高い検出感度のため多量の検
体を必要とせず,検体の前処理が簡便で済む.しかも、
反応時間が短く、検出も簡単な機材だけで済み、操作も
容易なため同定までの時間を大幅に短縮でき、検査の効
率化を図ることができる.以下の実施例に示すが、反応
時間が4時間、検出にががる操作が30分である.また
、検出にアガロースゲル電気泳動と臭化エチジウムによ
る核酸染色法を用いることで、1ライマー等に標識せず
に検出が行え,しがち、核酸の長さが確1Σできるので
結果の信頼性が高いものとなる. 1ライマーが標的とするヌクレオチド配列にウェルシュ
菌のenterotoxln遺伝子を用いたことによる
効果は、次の通りである. ウェルシュ菌にはent
erotoxlnを産生する株と産生しない株があり,
前者のenterotoxln’産生株が、食中S原因
菌となっている.また、ヒトの糞便中にはentero
toxln非産生の常在性ウェルシュ薗がいる.特に、
糞便を検体として食中毒検査を行う場合、entero
toxinを産生しているか否かが重要となる.従って
、enterotoxln遺伝子を標的とすることで食
中llM因薗としてのウェルシュ菌を選択的に検出する
ことができる.
Claims (7)
- (1)検体中において食中毒原因菌となるウエルシュ菌
(Clostridium perfringens)
を選択的に検出するため、ウエルシュ菌のentero
toxin遺伝子をコードするヌクレオチド配列を標的
とし、そのヌクレオチド配列と相補的となるように化学
合成されたオリゴヌクレオチドであつて、合成ヌクレオ
チドが以下の配列群、(5’)d−AATACATAT
TGTCCTGCATC(3’)…(a) (5’)d−GTAATAGATAAAGGAGATG
G(3’)…(b) (5’)d−GTAGTAGGATTTATACAAG
C(3’)…(c) または対応する相補的配列から選ばれた配列からなるこ
とを特徴とするオリゴヌクレオチド。 - (2)請求項第1項に記載された各オリゴヌクレオチド
の配列のうち、少なくとも連続した10塩基以上のオリ
ゴヌクレオチド。 - (3)請求項第1項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列のうち少なくとも1つを鎖長反応のプライマーとし
て機能させ、標的ヌクレオチド配列を選択的に増幅させ
ることを特徴とする方法であって、 (a)検体中の1本鎖状態の標的ヌクレオチド配列にプ
ライマーをハイブリダイズさせ4種のヌクレオチドの重
合反応により鎖長反応を行わせ、 (b)得られた2本鎖ヌクレオチド配列を1本鎖に分離
した場合その相補鎖は他方のプライマーによる鎖長反応
の鋳型として機能し、 (c)これら2種のプライマーによる同時の鎖長反応、
鎖長生成物の鋳型からの分離、そして新たなプライマー
によるハイブリダイゼーシヨンを繰り返すことにより特
定のヌクレオチド配列を増幅させ、それを電気泳動、ク
ロマトグラフイーで検出し、 (d)その結果、前記検体中に認識されるべきヌクレオ
チド配列を持つ核酸が存在しているか否かを判定するこ
とで、ウエルシュ菌の検出を行うことを含む方法。 - (4)請求項第3項記載の方法における反応物から電気
泳動、ないしクロマトグラフィーにより増輻されたヌク
レオチド配列を分離し、この塩基対数を決定することに
より前記検体中に認識されるべき配列が存在しているか
否かを判定することでウエルシュ菌の検出を行うことを
含む方法。 - (5)請求項第3項記載の方法における反応物からアガ
ロース電気泳動及び臭化エチジウムによる核酸染色を行
うことによる検出方法。 - (6)請求項第1項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列1つを有するオリゴヌクレオチドをプローブとして
機能させ、膜上あるいはその他支持体上の標的ヌクレオ
チド配列を選択的に検出する方法。 - (7)請求項第1項に記載されたオリゴヌクレオチドの
配列の1つを有するオリゴヌクレオチドが標識物で修飾
されていることを特徴とする請求項第6項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18568489A JPH0789959B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP18568489A JPH0789959B2 (ja) | 1989-07-18 | 1989-07-18 | ウェルシュ菌検出のためのオリゴヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0349699A true JPH0349699A (ja) | 1991-03-04 |
JPH0789959B2 JPH0789959B2 (ja) | 1995-10-04 |
Family
ID=16175056
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
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