JPH03262500A - Inspection of dysentery bacillus and/or intestinally intruding colibacillus and primer suitable for same inspection - Google Patents
Inspection of dysentery bacillus and/or intestinally intruding colibacillus and primer suitable for same inspectionInfo
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
[産業上の利用分野]
本発明は新規なプライマーを使用した赤痢菌及び/又は
腸内侵入性大腸菌検査方性に関する。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Field of Application] The present invention relates to a method for testing Shigella and/or enteroinvasive Escherichia coli using novel primers.
また本発明は上記検査方法に好適に使用される新規なプ
ライマーにも関する。The present invention also relates to a novel primer suitably used in the above testing method.
赤痢菌や腸内侵入性大腸菌に起因する下痢症は広く全世
界で発生しており、特に発展途上国ではいま尚重要な伝
染病である。本症状は非常に烈しいため迅速な診断と治
療が必要である。また、前記細菌による食品汚染も問題
になっており、伝染を予防する目的や伝染源を特定する
目的で前記細菌に対する食品検査が必要とされている。Diarrheal diseases caused by Shigella and enteroinvasive Escherichia coli occur widely throughout the world, and are still important infectious diseases, especially in developing countries. This symptom is extremely severe and requires prompt diagnosis and treatment. Food contamination by the bacteria has also become a problem, and food testing for the bacteria is required for the purpose of preventing infection and identifying the source of infection.
この場合にもまた、迅速で感度の良い方法が望まれてい
る。Again, a rapid and sensitive method is desired.
[従来の技術]
前記の細菌を検出する従来方法としては、モルモットを
用いるセレニーテスト(Sereny、 B、 、 A
cta。[Prior Art] A conventional method for detecting the above-mentioned bacteria is the Sereny test using guinea pigs (Sereny, B., A.
cta.
Microbiol、Acad、Sci、Hung、
2.293−2961955年)や培養細胞を用いる検
査法がある。また、本庄の病原性に関与する140メガ
ダルトンプラスミド由来の抗原に対する特異抗体を用い
たEIA法(伊藤健一部、中村防子、渡辺治雄他 日本
細菌学雑誌 41巻 414頁1986年)も開発され
ている。また、最近開発されたDNAプローブ注として
は特開昭61−44000とU、S、patent A
pplication No、 888194がある。Microbiol, Acad, Sci, Hung,
2.293-2961955) and testing methods that use cultured cells. In addition, an EIA method using a specific antibody against the antigen derived from the 140 megadalton plasmid involved in the pathogenicity of Honjo (Kenichi Ito, Moriko Nakamura, Haruo Watanabe et al., Japanese Journal of Bacteriology, Vol. 41, p. 414, 1986) was developed. ing. In addition, recently developed DNA probes include Japanese Patent Application Laid-open No. 61-44000 and U.S. patent A.
There is application No. 888194.
前者は細胞侵入に係わる多くの遺伝子を含む約27キロ
ベース(kb)以下のBam1(I断片をプローブとし
てハイブリダイゼーションを行い検査する方法である。The former is a method of testing by hybridization using a Bam1 (I fragment) of approximately 27 kilobases (kb) or less, which contains many genes involved in cell invasion, as a probe.
後者はそのBamHI断片中に含まれている1paB遺
伝子断片、1paC遺伝子断片、1paD遺伝子断片を
プローブとしている。The latter uses the 1paB gene fragment, 1paC gene fragment, and 1paD gene fragment contained in the BamHI fragment as probes.
[発明が解決しようとする課題]
前記の従来方法ではセレニーテストや培養細胞を用いる
方法は時間と経費を要し、EIA法は抗血清の調製方法
が複雑で時間を要し、検査自体にも約20時間を要した
。また以上の従来法は動物を用いるため、その飼育も大
変であった。またプローブを用いる方法においてはプロ
ーブの作製が困難である上、菌培養やハイブリダイゼー
ションなどの操作に長時間を要し、さらには感度が低い
ため放射性同位体(R1)を使用しなければならず放射
能汚染防止や放射能管理等の問題がある。[Problems to be Solved by the Invention] Among the conventional methods described above, the Seleny test and the method using cultured cells require time and expense, and the EIA method requires a complicated and time-consuming preparation method for antiserum, and the test itself requires approximately It took 20 hours. Furthermore, since the above conventional methods use animals, it is difficult to raise them. In addition, in methods using probes, it is difficult to prepare probes, and operations such as bacterial culture and hybridization take a long time, and furthermore, radioactive isotopes (R1) must be used due to low sensitivity. There are issues such as prevention of radioactive contamination and management of radioactivity.
本発明の課題は赤痢菌及び/又は腸内侵入性大腸菌の検
査方法であって、従来法よりも感度の良い、さらにはよ
り簡便であり、迅速な検査方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide a method for testing Shigella and/or enteroinvasive Escherichia coli, which is more sensitive than conventional methods, and is also simpler and faster.
さらに本発明のもう1つの課題は、上記検査方法におい
て好適に用いられる相補的なプライマーを提供すること
にある。Furthermore, another object of the present invention is to provide complementary primers that can be suitably used in the above testing method.
[課題を解決するための手段及び作用]上記課題を解決
するために、請求項1の発明は、赤痢菌及び/又は腸内
侵入性大腸菌の検査方法を提供するものであって、その
検査方法は赤痢菌及び腸内侵入性大腸菌に特異的に存在
している遺伝子に対して相補的なプライマーであって、
センスストランド用プライマー及びアンチセンスストラ
ンド用プライマーから成る組合せを、検査すべき細胞の
DNA系に用いて、該遺伝子の一部分を含むDNA断片
を酵素的方法により増幅させ、該増幅されたDNA断片
を検出することを特徴とする請求項lにおいて、特異的
に存在している遺伝子とは、赤痢菌及び腸内侵入性大腸
菌に共通して存在する遺伝子(以下、特異的遺伝子とい
う)を意味し、たとえば1paB、 1paC,1pa
D、 invE、 1nvG。[Means and effects for solving the problem] In order to solve the above problem, the invention of claim 1 provides a method for testing Shigella and/or enteroinvasive Escherichia coli. is a primer complementary to a gene specifically present in Shigella and enteroinvasive Escherichia coli,
A combination of a sense strand primer and an antisense strand primer is used in the DNA system of the cell to be tested, a DNA fragment containing a portion of the gene is amplified by an enzymatic method, and the amplified DNA fragment is detected. In claim 1, which is characterized in that 1paB, 1paC, 1pa
D, invE, 1nvG.
1nvJ又は1nvKなどである。特にinvEの塩基
配列はWatanabeらにより究明されている(Wa
tanabe、 H,。Such as 1nvJ or 1nvK. In particular, the nucleotide sequence of invE has been determined by Watanabe et al.
tanabe, H.
Arakawa、E、、 Ito、に、、 Kato、
J、、 Nakamura、A、、 J。Arakawa, E., Ito, Kato,
J., Nakamura, A., J.
urnal of Bacteriology 172
巻619−629頁1990年)。この遺伝子(inv
E)は細胞侵入に係わる表面抗原(jpaB、 1pa
C又はjpaD)を正に制御しており、本遺伝子が存在
していない細菌は細胞に侵入して発症せしめることがで
きない。Urnal of Bacteriology 172
Volume 619-629 1990). This gene (inv
E) Surface antigens (jpaB, 1pa) involved in cell invasion
C or jpaD), and bacteria lacking this gene cannot invade cells and cause symptoms.
前記相補的なプライマーとは前記特異的遺伝子の一部分
に相補的な一重鎖DNAであり、好ましくは2〜100
ヌクレオチド、さらに好ましくは10〜40ヌクレオチ
ドのオリゴヌクレオチドである。The complementary primer is a single-stranded DNA complementary to a part of the specific gene, and preferably has a length of 2 to 100
It is a nucleotide, more preferably an oligonucleotide of 10 to 40 nucleotides.
前記特異的遺伝子がinvEである場合には、前記相補
的なプライマーは、請求項10の発明である次の5種の
オリゴヌクレオチドプライマー5°−ATATCTCT
ATTTCCAATCGCGT−3’、5°−AAAA
GGCTAATGAATCTCTTAG−3°、5°−
CCTTGATACAAATTTGCCCCCG−3°
、3’ −GGGAAGCGATTTTCAACTG−
5°又は3’ −GCCCTATATTAAAGAGC
GGTAG−5゜(式中においてA、 C,G及びTは
それぞれアデニンシトシン、グアニン及びチミン塩基を
有するデオキシリボヌクレオチドを意味する。以下同様
である。)
又はこれらと同等の相補性を有するプライマーを意味す
る。ここで同等の相補性を有するプライマーとは、相補
性を妨げない限度で上記の塩基配列と比較しである塩基
を欠いていたり、多少余分な塩基を有していたり、多少
塩基配列が異なるプライマーを指し、このプライマーも
前記の相補的なプライマーに含まれる。前記プライマー
は必ずしも精製する必要はないが、後記の如くプローブ
として用いる場合には精製を行う方が検査の精度上より
好ましい。When the specific gene is invE, the complementary primer is the following five oligonucleotide primers 5°-ATATCTCT of the invention of claim 10.
ATTTCCAATCGCGT-3', 5°-AAAA
GGCTAATGAATCTCTTAG-3°, 5°-
CCTTGATACAAATTTGCCCCCG-3°
,3'-GGGAAGCGATTTTCAACTG-
5° or 3' -GCCCTATATTAAAGAGC
GGTAG-5゜ (in the formula, A, C, G, and T mean deoxyribonucleotides having adenine cytosine, guanine, and thymine bases, respectively. The same shall apply hereinafter.) or a primer having equivalent complementarity thereto. do. Here, primers with equivalent complementarity are primers that lack a certain base, have some extra bases, or have a slightly different base sequence compared to the base sequence above, as long as the complementarity is not hindered. This primer is also included in the above-mentioned complementary primers. The primers do not necessarily need to be purified, but when used as probes as described later, it is preferable to purify them in terms of test accuracy.
前記相補的なプライマーの組合せとは、前記特異的遺伝
子のmRNAと相同である鎖を伸長させるためのセンス
ストランド用プライマー及び前記特異的遺伝子のm R
N Aと相補的である鎖を伸長させるためのアンチセン
スストランド用プライマーの各々を少なくとも1つずつ
含んでなる組合せである。この組合せにおいて、センス
ストランド用プライマーとアンチセンスストランド用プ
ライマーとが相補性を有する場合にはプライマーのダイ
マーができ、目的とする特異的DNA断片の増幅効率が
悪くなるので、センスストランド用プライマーとアンチ
センスストランド用プライマーとが相補性を有していな
いことが好ましい。The combination of complementary primers is a sense strand primer for elongating a strand homologous to the mRNA of the specific gene, and the mR of the specific gene.
This combination includes at least one of each of the antisense strand primers for extending a strand that is complementary to NA. In this combination, if the sense strand primer and the antisense strand primer have complementarity, primer dimers will be formed and the amplification efficiency of the desired specific DNA fragment will be reduced. It is preferable that the sense strand primer has no complementarity.
本発明方法において前記プライマー及びその組合せの選
定は非常に重要であり、もし特異性の低いオリゴヌクレ
オチドをプライマーとして使用したならば目的とする部
分以外のDNA断片も増幅してしまうことがあるし、ル
ープ構造やGCリッチ(rich)な部分が存在すれば
全く増幅されないこともある。また前記のようにプライ
マーの組合せが悪いとプライマーのダイマーができ、目
的とする特異的DNA断片の増幅効率が悪くなる。In the method of the present invention, the selection of the primers and their combinations is very important; if oligonucleotides with low specificity are used as primers, DNA fragments other than the target portion may also be amplified. If a loop structure or a GC-rich portion exists, the signal may not be amplified at all. Furthermore, as described above, if the combination of primers is incorrect, primer dimers will occur, and the efficiency of amplifying the specific DNA fragment of interest will deteriorate.
前記特異的遺伝子がinvEである場合には、前記セン
スストランド用プライマーとしては次の塩基配列である
3種のオリゴヌクレオチドプライマー5′−ATATC
TCTATTTCCAATcGcGT−3′5’−AA
AAGGCTAATGAATCTCTTAG−3°又は
5’ −CCTTGATACAAATTTGCCCCC
G−3’又はこれらと同等の相補性を有するプライマー
から少なくともlっを任意に選び、かつ、アンチセンス
ストランド用プライマーとしては次の塩基配列を有する
2種のオリゴヌクレオチドプライマー3°−GGGAA
GCGATTTTCAACTG−5’ 又は3’ −G
CCCTATATTAAAGAGCGGTAG−5’又
はこれらと同等の相補性を有するプライマーから少なく
とも1つを任意に選んで、前記相補的なプライマーの組
合せとなし得る。すなわち、たとえば具体的には以下に
示す(I)〜(VI)の6種類の組合せがある。When the specific gene is invE, the sense strand primers include three types of oligonucleotide primers 5'-ATATC having the following base sequences.
TCTATTTCCAATcGcGT-3'5'-AA
AAGGCTAATGAATCTCTTAG-3° or 5'-CCTTGATACAAAATTTGCCCCCC
G-3' or at least one primer having the same complementarity as these, arbitrarily selected, and two types of oligonucleotide primers 3°-GGGAA having the following base sequences as antisense strand primers.
GCGATTTTCAACTG-5' or 3'-G
At least one of CCCTATATTAAAGAGCGGTAG-5' or primers having equivalent complementarity thereto can be arbitrarily selected to form the complementary primer combination. That is, for example, specifically, there are six types of combinations (I) to (VI) shown below.
(I ’) 5’−ATATCTCTATTTCCAA
TCGCGT−3’と795 816
3’ −GGGAAGCGATTTTCAACTG−5
’1010 1028
(■)5°−ATATCTCTATTTCCAATCG
CGT−3’と795 816
3’ −GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G−5’1155 1176
(I[[) 5’−AAAAGGCTAATGAATC
TCTTAG−3’と871 892
3’ −GGGAAGCGATTTTCAACTG−5
’1010 1028
(■)5°−AAAAGGCTAATGAATCTCT
TAG−3’と871 892
3’ −GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G−5゜11551176
(■)5°−CCTTGATACAAATTTGCCC
CCG−3’と929 9
503’ −GGGAAGCGATTTTCAACTG
−5’1010 1028又は
、
(W) 5’−CCTTGATACAAATTTGCC
CCCG−3’と929 950
3’ −GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G−5゜1155 1176
上記塩基配列に下記した番号は、プライマーが相補性を
有している部分のinvE遺伝子の塩基配列番号と対応
している。なおinvE遺伝子は約1600塩基からな
り、その塩基配列番号はpEA151の欠損末端を+1
としている(前記文献、Journalof Bact
eriology 172巻619−629頁 199
0年)。(I') 5'-ATATCTCTATTTCCAA
TCGCGT-3' and 795 816 3' -GGGAAGCGATTTTCAACTG-5
'1010 1028 (■) 5°-ATATCTCTATTTCCAATCG
CGT-3' and 795 816 3' -GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G-5'1155 1176 (I[[) 5'-AAAAGGCTAATGAATC
TCTTAG-3' and 871 892 3' -GGGAAGCGATTTTCAACTG-5
'1010 1028 (■)5°-AAAAGGCTAATGAATCTCT
TAG-3' and 871 892 3' -GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G-5゜11551176 (■)5゜-CCTTGATACAAATTTGCC
CCG-3' and 929 9
503'-GGGAAGCGATTTTCAACTG
-5'1010 1028 or (W) 5'-CCTTGATACAAAATTTGCC
CCCG-3' and 929 950 3' -GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G-5゜1155 1176 The numbers listed below in the above base sequence correspond to the base sequence numbers of the invE gene in the portion to which the primers have complementarity. The invE gene consists of approximately 1600 bases, and its base sequence number is +1 from the deleted end of pEA151.
(The above-mentioned document, Journal of Bact
eriology vol. 172 pp. 619-629 199
0 years).
そして上記(I)〜(VI)中のプライマーの1つ以上
がその各々と同等の相補性を有するプライマーで置換さ
れていても良い。また、上記(I)〜(VI)の組合せ
を用いるとプライマーの種類が少なくてすみ、経済上好
ましいが、請求項IOの発明である他の5種のプライマ
ー又はそれらと同等の相補性を有するプライマーから1
つ以上を選んで(I)〜(VI)の組合せに加えて、前
記相補的プライマーの組合せとしてもよい。この場合に
は後述するように前記増幅されたDNA断片の種類が複
数になる。One or more of the primers (I) to (VI) above may be replaced with a primer having the same complementarity as each of the primers. Furthermore, when the combinations (I) to (VI) above are used, the number of types of primers can be reduced and it is economically preferable, but it is also preferable to use the other five types of primers according to the invention of claim IO or the same complementarity as them. 1 from primer
In addition to the combinations (I) to (VI), one or more primers may be selected as a combination of the complementary primers described above. In this case, as will be described later, there are multiple types of the amplified DNA fragments.
前記検査すべき細胞とは、たとえば、赤痢菌及び/又は
腸内侵入性大腸菌が存在すると思われる下痢便や食品な
どの細胞及びそれらに付着している細菌の細胞であり、
その細胞のDNA系とは、上記の細胞のDNAを含む系
を意味する。このDNAは加熱処理やプロテイナーゼK
を用いる方法など通常の方法で検査すべき細胞から調製
しつる。The cells to be tested are, for example, cells in diarrheal stools or foods in which Shigella bacteria and/or enteroinvasive E. coli are thought to exist, and bacterial cells attached to them;
The DNA system of the cell means a system containing the DNA of the above cell. This DNA can be heated or treated with proteinase K.
The vines are prepared from the cells to be tested using conventional methods, such as those using
このDNAは必ずしも精製されている必要はない。This DNA does not necessarily need to be purified.
たとえば検査すべき細胞が細菌培養液である場合、培地
成分も存在したままの細菌培養液を熱処理等でDNAを
調製したものを精製せずにそのまま後述のポリメラーゼ
連鎖反応法(以下、PCR法という)等の酵素的方法に
用いうる。ただし血液が検査すべき細胞に存在する場合
にはポルフィリンが後述のPCR法等を阻害するので、
通常の方法にてポルフィリンを除去したものをその細胞
のDNA系とする。For example, when the cells to be tested are bacterial culture fluids, DNA is prepared by heat treatment of the bacterial culture fluid in which the culture medium components are still present, and then the DNA is prepared by the polymerase chain reaction method (hereinafter referred to as PCR method) described below without purification. ) and other enzymatic methods. However, if blood is present in the cells to be tested, porphyrin will inhibit the PCR method described below.
The DNA system of the cell is obtained by removing porphyrin using a conventional method.
本発明中の酵素的方法とは酵素を用いて特定のDNAを
増幅する方法を意味し、たとえば5aiki。In the present invention, the enzymatic method refers to a method of amplifying specific DNA using an enzyme, such as 5aiki.
R,K、らによって報告されたPCR法(Scienc
e 239巻487〜491頁、1988年、特開昭6
l−274697)、その変法及びその改良法(以下P
CR法等という)を意味する。これらのPCR法等によ
ると少量の試料から特定のDNA断片を増幅することが
できる。PCR法等において用いるDNAポリメラーゼ
として、DNAの解裂温度において耐熱性であるポリメ
ラーゼ、たとえばTaq、Tthポリメラーゼなどを用
いると該酵素の補充がほとんど必要とされないのでPC
R法等をより簡便、迅速な方法となし得る。PCR法等
においては、少なくとも2種類のプライマー、すなわち
前記センスストランド用プライマー及びアンチセンスス
トランド用プライマーが必要とされ、それらのプライマ
−は増幅されるべきDNAの一部分に相補的な短い一重
鎖DNAである。この2種のプライマーの組合せを過剰
に加え、増幅されるべきDNAを有する鋳型DNAと4
種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸及びDNAポリ
メラーゼを有する系において、この互いに向き合う2つ
のプライマーに挾まれた部分のみのDNAが増幅される
。すなわち、上記2つのプライマーが1重鎖の鋳型DN
Aにアニールし、DNAポリメラーゼが働き、互いに向
き合う2つのプライマーに挟まれたDNAの量が2倍に
なる。ここで始めに戻って二重鎖になった部分を加熱に
よって解き同じ操作を行うと、今度は前回と同じ反応の
ほかに前回プライマーから合成されたDNAにも、もう
一方のプライマーがアニールし、鋳型となるので両方の
プライマーに挟まれた部分は4倍に増やされる。この一
連の操作を繰り返せばプライマーに挟まれた部分のみを
指数関数的に増やすことができるのである。すなわち理
論上、プライマーに挟まれた部分のDNAは上記一連の
操作をNサイクル行うと2N倍に増幅されることになる
。そしてDNAポリメラーゼは1分間に数百から数千塩
基の合成を行えるので1サイクルを5〜7分で行うこと
ができ、たとえば25サイクルの増幅か3時間程度で終
了し、各サイクルの効率が90%であるとすれば(1+
0.9)”倍すなわち約100万(10’)倍に増幅で
きる。すなわち、短時間に特定のDNAを増幅しつる優
れた方法である。The PCR method reported by R, K. et al.
e Vol. 239, pp. 487-491, 1988, Japanese Patent Publication No. 6
l-274697), its modified method and its improved method (hereinafter referred to as P
CR method, etc.). According to these PCR methods, specific DNA fragments can be amplified from a small amount of sample. If a polymerase that is thermostable at the DNA cleavage temperature, such as Taq or Tth polymerase, is used as the DNA polymerase used in PCR methods, etc., replenishment of the enzyme is hardly required.
The R method etc. can be made into a simpler and faster method. In the PCR method, at least two types of primers are required, namely the sense strand primer and the antisense strand primer, and these primers are short single-stranded DNA complementary to a portion of the DNA to be amplified. be. The combination of these two types of primers is added in excess, and the template DNA containing the DNA to be amplified and 4
In a system containing a species of deoxyribonucleoside triphosphate and a DNA polymerase, only the portion of DNA sandwiched between the two primers facing each other is amplified. That is, the above two primers are single-stranded template DN.
It anneals to A, DNA polymerase works, and the amount of DNA sandwiched between the two primers facing each other doubles. Now, if we go back to the beginning and unravel the double-stranded part by heating and perform the same operation, this time, in addition to the same reaction as before, the other primer will also anneal to the DNA synthesized from the previous primer. Since it becomes a template, the area sandwiched between both primers is increased four times. By repeating this series of operations, it is possible to exponentially increase only the portion sandwiched between the primers. In other words, theoretically, the portion of DNA sandwiched between the primers will be amplified 2N times by performing the above series of operations N cycles. DNA polymerase can synthesize hundreds to thousands of bases per minute, so one cycle can be completed in 5 to 7 minutes.For example, 25 cycles of amplification can be completed in about 3 hours, and the efficiency of each cycle is 90%. %, then (1+
It is an excellent method for amplifying specific DNA in a short period of time.
請求項3の発明に係る検査方法においてはPCR法等に
て増幅されるべきDNA断片は赤痢菌及び腸内侵入性大
腸菌に特異的に存在している遺伝子の一部分を含むDN
A断片である。このDN、A断片の大きさはPCR法で
増幅できる大きさである必要があるため4000塩基対
(bp)程度以下であることが望ましい。また、小さす
ぎるとプライマーのダイマーと区別しにくくなるため、
50bp以上であることが望ましい。さらに、短時間で
効率良く増幅されるためには50〜1o00bp程度が
より好ましい大きさである。また、この増幅されるDN
A断片は本発明方法にて用いるプライマーの組合せによ
って、定まってくるものである。すなわち、用いたプラ
イマーに挾まれる部分のDNA断片が増幅されるからで
ある。たとえば赤痢菌及び侵入性大腸菌に特異的に存在
している遺伝子がinvEであり、この遺伝子に相補的
なプライマーの組合せとして前記(I)
(I ) 5’−ATATCTCTATTTCCAAT
CGCGT−3’と795 816
3’ −GGGAAGCGATTTTCAACTG−5
゜1010 1028
を選んだ場合には、795の位置番号から始まるセンス
ストランド用プライマーと1028の位置番号で終わる
アンチセンスストランド用プライマーとをPCR法等に
て用いるので、増幅されるDNA断片は塩基配列番号の
795から1028までの部分となる。In the testing method according to the invention of claim 3, the DNA fragment to be amplified by PCR method etc. is a DNA fragment containing a part of a gene that is specifically present in Shigella bacteria and enteroinvasive Escherichia coli.
This is fragment A. The size of the DNA and A fragments needs to be large enough to be amplified by PCR, so it is desirable that the size is about 4000 base pairs (bp) or less. Also, if it is too small, it will be difficult to distinguish it from the primer dimer.
It is desirable that the length is 50 bp or more. Furthermore, in order to be efficiently amplified in a short time, a more preferable size is about 50 to 1000 bp. Also, this amplified DN
The A fragment is determined by the combination of primers used in the method of the present invention. That is, the DNA fragment sandwiched by the primers used is amplified. For example, a gene specifically present in Shigella and invasive Escherichia coli is invE, and the combination of primers complementary to this gene is (I) (I) 5'-ATATCTCTATTTCCAAT.
CGCGT-3' and 795 816 3' -GGGAAGCGATTTTCAACTG-5
If ゜1010 1028 is selected, a primer for the sense strand starting from the position number 795 and a primer for the antisense strand ending at the position number 1028 are used in the PCR method, so the DNA fragment to be amplified has the base sequence. This is the part from 795 to 1028 of the number.
従って、請求項6の発明において、用いられるプライマ
ーの組合せとして(I)〜(VI)のいずれかの組合せ
に請求項10の発明である他の種類のプライマーのいず
れか1以上を加えた組合せを用いた場合には、増幅され
る特定のDNA断片か複数となる。Therefore, in the invention of claim 6, the combination of primers used is a combination of any one of (I) to (VI) plus any one or more of the other types of primers of the invention of claim 10. If used, there will be one or more specific DNA fragments to be amplified.
以上の様に本発明方法によると、分析すべき細胞に赤痢
菌及び/又は腸内侵入性大腸菌が存在している場合には
、該細菌に特異的な遺伝子の一部分を含むDNA断片か
簡便に短時間に増幅される。As described above, according to the method of the present invention, when Shigella bacteria and/or enteroinvasive Escherichia coli are present in the cells to be analyzed, a DNA fragment containing a part of a gene specific to the bacteria can be easily extracted. amplified in a short time.
そしてこの増幅されたDNA断片を検出する方法として
は種々の従来方法を用いうるが、検査対象たる特定のD
NA断片が増幅されているので、R■を用いる必要は特
になく、たとえば電気泳動法でDNAの大きさにより検
出する方法や、非R1で標識(ラベル)された特異的プ
ローブを用いて検出する方法等により増幅されたDNA
断片の検出、すなわち赤痢菌及び/又は腸内侵入性大腸
菌の検出が可能である。特異的プローブを用いて検出す
る方法において該プローブとして、PCR法等に用いつ
るプライマーであって、増幅されるDNA断片に含まれ
るプライマーを通常の方法により修飾したものを1つ以
上用いることができる。Various conventional methods can be used to detect this amplified DNA fragment, but
Since the NA fragment has been amplified, there is no particular need to use R. For example, it can be detected by electrophoresis based on the size of the DNA, or by using a specific probe labeled with non-R1. DNA amplified by methods etc.
Detection of fragments, ie Shigella and/or enteroinvasive E. coli, is possible. In the method of detection using a specific probe, one or more primers used in PCR methods etc. that are modified by a conventional method to the primer contained in the DNA fragment to be amplified can be used as the probe. .
たとえば、invE遺伝子の一部分を含むDNA断片を
増幅する際、請求項10の発明である5種のプライマー
の内
5°−CCTTGATACAAATTTGCCCCCG
−3°と929 950
3’ −GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
G〜5′11.55 1176
を前記プライマーの組合せとした場合には、増幅される
DNA断片は塩基配列番号929〜1176までの部分
である。従ってプローブとして用い得るプライマーは請
求項10の発明である5種のプライマーの内上記塩基配
列番号929〜1176に含まれる5“−CCTTGA
TACAAATTTGCCCCCG−3’929
950
3°−GGGAAGCGATTTTCAACTG−5°
又は1010 1028
3°−GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
−5’1155 1176
又は上記3種のプライマーと同等の相補性を有するプラ
イマーを修飾したものの少なくとも1つ以上をプローブ
として用いることができる。For example, when amplifying a DNA fragment containing a part of the invE gene, 5°-CCTTGATACAAAATTTGCCCCCG of the five types of primers according to the invention of claim 10 is used.
-3° and 929 950 3' -GCCCTATATTAAAGAGCGGTA
When G~5'11.55 1176 is used as the primer combination, the DNA fragment to be amplified is from base sequence number 929 to base sequence number 1176. Therefore, the primer that can be used as a probe is 5''-CCTTGA contained in the above base sequence number 929 to 1176 among the five types of primers according to the invention of claim 10.
TACAAATTTGCCCCCG-3'929
950 3°-GGGAAGCGATTTTCAACTG-5°
or 1010 1028 3°-GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
-5'1155 1176 or at least one modified primer having complementarity equivalent to the above three types of primers can be used as a probe.
本発明方法においては検出されるべきDNA断片が増幅
されているので、プローブの修飾も、RIを用いてラベ
ルする必要は特になく、たとえばジゴキシゲニン−11
−dUTPでラベルすることによっても検出されるべき
DNA断片を感度良く検出することができる。従ってR
I法に付随する放射能汚染の問題を生ぜず、また特別な
設備、熟練者等を必要としない利点がある。そして本発
明に係るプライマーは約3時間でDNA合威台底自動的
に合成でき精製も約3時間で容易に行うことができる。In the method of the present invention, since the DNA fragment to be detected is amplified, there is no particular need to modify the probe or label it using RI, such as digoxigenin-11.
The DNA fragment to be detected can also be detected with high sensitivity by labeling with -dUTP. Therefore R
This method has the advantage of not causing the radioactive contamination problem associated with method I, and does not require special equipment or skilled personnel. Furthermore, the primers of the present invention can automatically synthesize DNA in about 3 hours, and can be easily purified in about 3 hours.
従って入手容易なプローブとなしうる。Therefore, it can be used as an easily available probe.
以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが本発
明はこれに限定されるべきものではない。EXAMPLES The present invention will be specifically explained below with reference to Examples, but the present invention should not be limited thereto.
(実施例1)invEの一部分を含むDNA断片のPC
R法による増幅
(1−A) invEを含む大腸菌DNAの調製最初に
赤痢菌由来のinvE遺伝子を含むDNAを調製するた
めに、赤痢菌由来のinvE遺伝子及びアンピシリン耐
性遺伝子を含む組換え体プラスミドpHW1273(p
ss120 : :Tnl )(Watanabe、
H,、Nakamura、 A、 。(Example 1) PC of DNA fragment containing part of invE
Amplification by R method (1-A) Preparation of E. coli DNA containing invE First, in order to prepare DNA containing the invE gene derived from Shigella, recombinant plasmid pHW1273 containing the invE gene derived from Shigella and the ampicillin resistance gene was used. (p
ss120: :Tnl) (Watanabe,
H., Nakamura, A.
Infection and Immunity 48
巻 260〜262頁1985年)を(1コピー/細胞
)有するに−12D旧株大腸菌)IW1273 (国立
予防衛生研究所細菌部(東京)より入手)を使用した。Infection and Immunity 48
Vol. 260-262, 1985) (1 copy/cell) of Ni-12D old strain of E. coli) IW1273 (obtained from the Department of Bacteria, National Institute of Preventive Health, Tokyo) was used.
上記大腸菌をアンピシリン(50μg /d)入りのY
T培地(蒸留水1リットル当り、NaCl5g、バクト
ドリプトン8g、酵母抽出物5gを含む)200−に−
白金耳植菌し、37℃で一夜振とう培養した。培養液を
30分間、3000rprnで遠心分離することにより
集菌し、そこに生理食塩水5−を加えて洗菌した後、再
び15分間、3000rpmで遠心分離して培地成分を
除去し、菌体を得た。これに、0.1 M NaC1,
10mM EDTAを含む0.1M トリス−HCI(
pH8,0)の溶液3.6−を加えて菌体を懸濁後、リ
ゾチーム(40■/−)を400μl加えて攪拌し、3
7℃で10分間加温した。この溶液に5%SDS、 0
.1 M NaC1,l OmM EDTAを含む0.
1Mトリス−HCI(pH8゜0)の溶液を1−加えて
転倒混和後、60℃で20分間加温し細胞膜を破壊した
。これに50mMトリス−HCI(pH7,5)で飽和
しナーフェノール及びクロロホルムの等量混合物を1時
間静置後、上層を除去した下層部分であるフェノール/
クロロホルムを5−加えて混和後、30分間、3000
rpmで遠心分離し、その上層にDNA溶液を得た。こ
のフェノール/クロロホルム抽出をさらにもう2回繰り
返し蛋白を除去した。そこからこの上層にエーテルを加
え混和した後に10分間、3000rpmで遠心分離し
、上層を除去して下層を得た。このエーテル抽出をさら
に2回繰り返しフェノール/クロロホルムを除いた後、
エタノールを71Ll加えて一70℃に15分間静置し
た。その後、20分間、3000rpmで遠心分離する
ことにより得られたDNAの沈澱を70%冷エタノール
で洗浄し、減圧下に乾燥した。これにリボヌクレアーゼ
緩衝液(1mM EDTA、 0.15 M NaCl
を含む20mM)リス−HCI(pH7,4) ) 2
vtlを加え溶解後、熱処理済みのりボヌクレアーゼ(
10mg/ i)を80μで加えて37℃で2時間反応
させRNAを除いた。この溶液をフェノールで2回、エ
ーテルで2回抽出した後、冷エタノールを41nl加え
一20℃で一夜静置した。The above E. coli was treated with Y containing ampicillin (50 μg/d).
T medium (contains 5 g of NaCl, 8 g of bactodoryptone, and 5 g of yeast extract per liter of distilled water) 200 to
A platinum loop was inoculated and cultured with shaking at 37°C overnight. The culture solution was centrifuged at 3,000 rpm for 30 minutes to collect the bacteria, washed with physiological saline, and then centrifuged again at 3,000 rpm for 15 minutes to remove medium components. I got it. To this was added 0.1 M NaCl,
0.1M Tris-HCI containing 10mM EDTA (
After suspending the bacterial cells by adding 3.6- solution (pH 8.0), 400 μl of lysozyme (40 μ/-) was added and stirred.
It was heated at 7°C for 10 minutes. Add 5% SDS to this solution, 0
.. 1 M NaCl, l OmM EDTA.
A solution of 1 M Tris-HCI (pH 8.0) was added and mixed by inversion, followed by heating at 60° C. for 20 minutes to disrupt cell membranes. A mixture of equal amounts of nerphenol and chloroform saturated with 50mM Tris-HCI (pH 7,5) was added to this and left to stand for 1 hour, and the upper layer was removed.
After adding chloroform and mixing, add 3000 ml of chloroform for 30 minutes.
Centrifugation was performed at rpm to obtain a DNA solution in the upper layer. This phenol/chloroform extraction was repeated two more times to remove proteins. Ether was then added to this upper layer and mixed, followed by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes, and the upper layer was removed to obtain a lower layer. After repeating this ether extraction two more times to remove phenol/chloroform,
71 Ll of ethanol was added and the mixture was allowed to stand at -70°C for 15 minutes. Thereafter, the DNA precipitate obtained by centrifugation at 3000 rpm for 20 minutes was washed with 70% cold ethanol and dried under reduced pressure. Add ribonuclease buffer (1mM EDTA, 0.15M NaCl) to this.
20mM) Lis-HCI (pH 7,4) containing 2
After adding and dissolving vtl, add heat-treated glue bonuclease (
10 mg/i) was added at 80μ and reacted at 37°C for 2 hours to remove RNA. After extracting this solution twice with phenol and twice with ether, 41 nl of cold ethanol was added and allowed to stand overnight at -20°C.
それを20分間、3000rpmで遠心分離して得られ
たDNAの沈澱を70%冷エタノールで洗浄し、減圧下
で乾燥した後、0.1 mM EDTAを含む1 mM
トリス−HCI(PH7,4)の溶液2−に溶解した。It was centrifuged at 3000 rpm for 20 min, and the resulting DNA precipitate was washed with 70% cold ethanol, dried under reduced pressure, and then diluted with 1 mM containing 0.1 mM EDTA.
Dissolved in solution 2- of Tris-HCI (PH 7,4).
それをDNA試料溶液として凍結保存した。It was stored frozen as a DNA sample solution.
(1−B)オリゴヌクレオチドプライマーの選定と合成
invE遺伝子の塩基配列(Watanabe、 H,
、Arakawa。(1-B) Selection and synthesis of oligonucleotide primers Base sequence of invE gene (Watanabe, H.
, Arakawa.
E、 、 Ito、 K、 、 Kato、 J、 、
Nakamura、 A、 、 Journal o
f Bacteriology 172巻619−62
9頁1990年)より特異的オリゴヌクレオチドプライ
マーを以下の方法で選定した。E., Ito, K., Kato, J.
Nakamura, A., Journal o
f Bacteriology Volume 172 619-62
9, 1990), specific oligonucleotide primers were selected using the following method.
InvE蛋白質のN末端よりは、ParB(Abele
s、 A、 L、 。From the N-terminus of InvE protein, ParB (Abele
s, A, L, .
Friedman、 S、 A、 、 Au5t in
、 S、 J、 、 J、 Mo1. Biol、 1
85巻261−272頁 1985年)およびSopB
(Mori、 H,、Kondo。Friedman, S. A., Au5tin.
, S, J, , J, Mo1. Biol, 1
85, pp. 261-272, 1985) and SopB
(Mori, H., Kondo.
A、 、 Oshima、 A、 、 Ogura、
T、 、 Hiraga、 S、 、 J、 Mo1.
Bio1192巻1−15頁 1986年)と類似し
ていたがC末端よりの部分は既知蛋白との類似性はなか
った(前記文献、Journal of Bacter
iology 172巻619−629頁1990年)
。従ってInvE蛋白のC末端より部分をコードしてい
るinvE遺伝子の3°より部分から特異的増幅を阻害
する虞れのある繰り返し配列、類似配列、GC含量の多
い領域、パリンドローム構造、ループ構造をコンピュー
ターで検索して除き、以下の5種類のオリゴヌクレオチ
ドをプライマーとして選定した。A, , Oshima, A, , Ogura,
T, , Hiraga, S, , J, Mo1.
Bio1192, pp. 1-15, 1986), but the portion from the C-terminus had no similarity to known proteins (see the above document, Journal of Bacter
iology, Vol. 172, pp. 619-629, 1990)
. Therefore, repeat sequences, similar sequences, regions with high GC content, palindromic structures, and loop structures that may inhibit specific amplification are removed from the 3° portion of the invE gene that encodes the C-terminal portion of the InvE protein. After searching with a computer, the following five types of oligonucleotides were selected as primers.
すなわちセンスストランド用プライマーとしては以下の
3種を選定し、
5’ −ATATCTCTATTTCCAATCGCG
T−3795816
5’ −AAAAGGCTAATGAATCTCTTA
G−3゜871 892
5’ −CCTTGATACAAATTTGCCCCC
G−3゜929 950
アンチセンスストランド用プライマーとしては以下の2
種のプライマーを選定した。That is, the following three types of primers were selected as sense strand primers, and 5'-ATATCTCTATTTCCAATCGCG
T-3795816 5'-AAAAGGCTAATGAATCTCTTA
G-3゜871 892 5' -CCTTGATACAAAATTTGCCCCCC
G-3゜929 950 The following two primers are used for antisense strands.
Species primers were selected.
3°−GGGAAGCGATTTTCAACTG−5’
1010 1028
3°−GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
−5’1155 1176
なおヌクレオチド配列に下記した番号は塩基配列番号で
あり、前記と同様である。これらのオリゴヌクレオチド
をDNA合威台底スウェーデン国、Pharmacia
LKB社製Gene Assembler Plus
)で合成し、陰イオン交換体(スウェーデン国、Pha
rmac ia社製MonoQ)を用いて液体クロマト
グラフ(スウェーデン国、Pharmacia社製FP
LC)で精製した。3°-GGGAAGCGATTTTCAACTG-5'
1010 1028 3°-GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
-5'1155 1176 The numbers shown below in the nucleotide sequence are base sequence numbers, and are the same as above. These oligonucleotides were synthesized by DNA synthesis from Pharmacia, Sweden.
LKB Gene Assembler Plus
) and an anion exchanger (Sweden, Pha
A liquid chromatograph (FP manufactured by Pharmacia, Sweden) was used.
Purified by LC).
上記合成は自動的に行われ約3時間で合成しつる。The above synthesis is performed automatically and takes approximately 3 hours.
それに続く精製も約3時間ですみ、かつ容易である。The subsequent purification takes about 3 hours and is easy.
大腸菌には約4.2 X 10 @塩基対のDNAが存
在しているが塩基配列が解明されているのは一部だけで
ある。従って上記方法によって理論的に選定されたプラ
イマーが、いまだ解明されていない大腸菌の塩基配列と
もアニーリングするものであれば、invE遺伝子を含
むDNA断片以外の部分も増幅してしまうことになり、
このようなプライマーは特異的とは言えない。Escherichia coli has approximately 4.2 x 10 base pairs of DNA, but only a portion of it has been sequenced. Therefore, if the primers theoretically selected by the above method also anneal to the as-yet unknown nucleotide sequence of E. coli, parts other than the DNA fragment containing the invE gene will also be amplified.
Such primers cannot be said to be specific.
そこで選定した5種のオリゴヌクレオチドプライマーに
よってinvE遺伝子の特異的部分のみが増幅されるこ
とを確認するために以下の(1−C)及び(1−D)の
実験を行った。In order to confirm that only the specific portion of the invE gene was amplified by the five selected oligonucleotide primers, the following experiments (1-C) and (1-D) were conducted.
(1−C) invEを含む大腸菌DNA断片の増幅(
1−A)で調製したDNAを前記PCR法を用いて増幅
した。PCR法において必要とされる特異的プライマー
としては(1−B)にて合成したプライマーを用いた。(1-C) Amplification of E. coli DNA fragment containing invE (
The DNA prepared in 1-A) was amplified using the PCR method described above. The primers synthesized in (1-B) were used as specific primers required in the PCR method.
プライマーの組合せ、すなわちセンスストランド用プラ
イマー及びアンチセンスストランド用プライマーの組合
せとしては、前記5種類のプライマーから可能とされる
組合せである(1)〜(Vl)の6組をすべて用い、そ
れぞれの組についてPCR法を行った。第1表にその組
成を示した反応液をミネラルオイルで覆いDNAサーマ
ル・サイクラ−(Thermal Cycler) (
米国、PERKIN ELMERCETUS社製)にセ
ットした。熱変性92°C1分間、アニーリング61°
C1分間、伸張反応を70°C2分間行った後、熱変性
92℃ 10秒間、アニーリング61°01分間、伸張
反応70°C2分間を39サイクル行った。その後70
℃で7分間保温した。As for the combinations of primers, that is, the combinations of the sense strand primer and the antisense strand primer, all six possible combinations (1) to (Vl) of the five types of primers were used, and each set was PCR method was performed on the following. The reaction solution whose composition is shown in Table 1 was covered with mineral oil using a DNA Thermal Cycler (
(manufactured by PERKIN ELMERCETUUS, USA). Heat denaturation at 92°C for 1 minute, annealing at 61°
After performing an extension reaction at 70°C for 2 minutes, heat denaturation at 92°C for 10 seconds, annealing at 61°C for 1 minute, and extension reaction at 70°C for 2 minutes were performed for 39 cycles. then 70
The mixture was kept warm at ℃ for 7 minutes.
第
1
表
第1表中、10倍濃度の反応用緩衝液は500dKCI
、 15mM MgCl2.0.19Aセラチンを含
む100mMトリス−HCI(p)18.3)から成る
ものてあり、dNTPsは4種のデオキシリボヌクレオ
シド三リン酸(dATP、dGTP、dCTP、及びT
TP)を各1.25 mMずつ含むものであり、DNA
溶液は(1−A)において調製したDNA保存試料溶液
を100倍希釈した溶液であり、プライマーはセンスス
トランド用プライマー及びアンチセンスストランド用プ
ライマーを各々1,25μM含むものである。Table 1 In Table 1, the 10x concentration reaction buffer is 500 dKCI.
, 100mM Tris-HCI (p)18.3) containing 15mM MgCl2.
TP) at 1.25 mM each, and DNA
The solution was a 100-fold dilution of the DNA storage sample solution prepared in (1-A), and the primers contained 1.25 μM each of the sense strand primer and the antisense strand primer.
(1−D)増幅DNA断片の検出
増幅反応後、反応溶液の一部をサイズマーカーと共に5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い臭化エチジウ
ムで染色した。その結果、第1図に示される様にいずれ
のプライマーの組合せでも予想された大きさのDNA断
片を確認した。すなわち第1図において、レーンlは対
照のために市販のプラスミドpBR322を旧nflで
消化した断片を電気泳動した結果であり、レーン2〜7
は各々、プライマーの組合せとして前記(1)〜(Vl
)を各々PCR法に用いた場合の電気泳動の結果である
。(1-D) Detection of amplified DNA fragments After the amplification reaction, a portion of the reaction solution was mixed with a size marker for 5 minutes.
% polyacrylamide gel electrophoresis and staining with ethidium bromide. As a result, as shown in FIG. 1, DNA fragments of the expected size were confirmed with each primer combination. That is, in FIG. 1, lane 1 is the result of electrophoresis of a fragment obtained by digesting commercially available plasmid pBR322 with old nfl for control, and lanes 2 to 7
are the above-mentioned (1) to (Vl) as primer combinations, respectively.
) are the results of electrophoresis when each was used in the PCR method.
PCR法で増幅されるDNA断片は2つのプライマーに
はさまれた部分である。たとえばレーン2の場合にはセ
ンスストランド用として5°−795〜816−3’、
アンチセンスストランド用として3゛1010〜102
8−5’の塩基配列番号を有するプライマーを用いてい
るので、増幅されるDNA部分は塩基配列番号の795
から1028であり、従って増幅されるDNA断片の大
きさは1028−795 +1・234bpである。他
のレーン3〜レーン7の場合も同様にアンチセンススト
ランド用プライマーの5′塩塩基列番号からセンススト
ランド用プライマーの5゛塩塩基列番号をひきそれに1
を加えた数が予想されるDNA断片の大きさである。The DNA fragment amplified by PCR is the portion sandwiched between two primers. For example, in the case of lane 2, 5°-795 to 816-3' for the sense strand,
3゛1010-102 for antisense strand
Since a primer with a base sequence number of 8-5' is used, the DNA portion to be amplified is at base sequence number 795.
Therefore, the size of the DNA fragment to be amplified is 1028-795+1·234 bp. Similarly for other lanes 3 to 7, subtract the 5' salt base sequence number of the sense strand primer from the 5' salt base sequence number of the antisense strand primer and add 1 to that number.
The sum of the numbers is the expected size of the DNA fragment.
実際に第1図に示されるようにレーン2〜7において各
々234 bp、 382 bp、 158 bp
、 306bp、 10 obpおよび248bp
の断片が予想どおり増幅され検出された。Actually, as shown in FIG. 1, lanes 2 to 7 are 234 bp, 382 bp, and 158 bp, respectively.
, 306bp, 10obp and 248bp
fragment was amplified and detected as expected.
また、各増幅DNA断片を制限酵素旧nfJで消化し5
%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、確認したと
ころ、すべて予想された大きさのDNA断片に切断され
ていた。In addition, each amplified DNA fragment was digested with the restriction enzyme old nfJ.
% polyacrylamide gel electrophoresis to confirm that all DNA fragments had been cleaved to the expected size.
以上の実験結果より前記プライマー5種からの組合せ(
I)〜(VI)のいずれを用いてもinvE遺伝子の一
部分を特異的に増幅できることか確認できた。Based on the above experimental results, combinations of the five primers (
It was confirmed that a portion of the invE gene could be specifically amplified using any of methods I) to (VI).
(実施例2)検出感度の検定
本発明に係る検査方法により目的とされる細菌の検出を
行った場合における検出感度を以下の如くに検定した。(Example 2) Testing of Detection Sensitivity The detection sensitivity when target bacteria were detected by the test method according to the present invention was tested as follows.
(2−A)invEを含む大腸菌DNAの調製最初に検
査対象となるDNA試料溶液を調製するため、第1実施
例と同じに−12DHI株大腸菌HW1273を使用し
た。上記大腸菌をアンピシリン(50μg /d)入り
のYT培地IO−に−白金耳植菌し37℃で一夜振とう
培養した。この培養液の一部を希釈し、500nmの吸
光度を測定し、ODi。(2-A) Preparation of E. coli DNA containing invE To first prepare a DNA sample solution to be tested, -12DHI strain E. coli HW1273 was used in the same manner as in the first example. The above Escherichia coli was inoculated into YT medium IO- containing ampicillin (50 μg/d) by a platinum loop, and cultured with shaking at 37° C. overnight. A portion of this culture solution was diluted, the absorbance at 500 nm was measured, and ODi was determined.
ol、0=4X10’細胞/mA’として培養液の菌体
濃度を計算すると5.4X10’細胞/mjであった。The bacterial cell concentration of the culture solution was calculated as 0=4×10′ cells/mA′ and was 5.4×10′ cells/mj.
この培養液を以下の如くに(i)熱処理のみ、または(
ij)プロテイナーゼに処理後、熱処理して、DNA試
料溶液を調製した。This culture solution is subjected to (i) heat treatment only, or (
ij) After treatment with proteinase, heat treatment was performed to prepare a DNA sample solution.
(i)熱処理法
培養液1−を97℃で工0分間処理し、DNA試料溶液
とした。(i) Heat treatment method Culture solution 1- was treated at 97°C for 0 minutes to prepare a DNA sample solution.
(ii)プロテイナーゼK及び熱処理法培養液0.1−
を遠心分離し、上清を除去したのちペレットを非イオン
界面活性剤の入った緩衝液(50mM KCI、 2
.5 mM MgC1z、 O,Img/−ゼラチン
、0.45%ノニデットP40,0.45%ツイーン2
0を含むIOmM)リス−〇CI([)88.3 )
)8.9−で懸濁した。この懸濁液1−に3μlのブロ
テイナーゼK(20■/−)を加えて、50〜60℃で
1時間加温後、95℃で10分間熱処理し、DNA試料
溶液とした。(ii) Proteinase K and heat treatment culture solution 0.1-
After centrifuging and removing the supernatant, the pellet was mixed with a buffer containing a nonionic surfactant (50mM KCI, 2
.. 5mM MgC1z, O, Img/-gelatin, 0.45% Nonidet P40, 0.45% Tween 2
IOmM containing 0)ris-〇CI([)88.3)
) 8.9-. 3 μl of Broteinase K (20 μl/−) was added to this suspension 1-, heated at 50 to 60° C. for 1 hour, and then heat-treated at 95° C. for 10 minutes to prepare a DNA sample solution.
(2−B)検出感度
上記(i)および(ii)で得たDNA試料溶液の希釈
液を用いてPCR法により増幅反応を行い、検出感度を
求めた。プライマーの組合せとしては5’−CCTTG
ATACA、AATTTGCCCCCG−3’と3’
−GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG−5
’からなる組合せ(VI)を使用した。(2-B) Detection sensitivity Using the diluted DNA sample solutions obtained in (i) and (ii) above, an amplification reaction was performed by PCR method, and the detection sensitivity was determined. The primer combination is 5'-CCTTG
ATACA, AATTTGCCCCCG-3' and 3'
-GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG-5
A combination (VI) consisting of ' was used.
DNA試料溶液の希釈液としては、反応液50μl中に
(i)の方法で得たDNAについては1500゜150
00又は150000細胞由来の量を、(ii)の方法
で得たDNAについては15.1.50.1500又は
15000細胞由来の量を含む希釈液(以下DNA希釈
液という)を作製して、それぞれ以下の如< PCR法
によりDNAを増幅した。As a diluent for the DNA sample solution, for the DNA obtained by method (i) in 50 μl of the reaction solution, dilute the solution at 1500° and 150°.
For the DNA obtained by method (ii), prepare a diluted solution (hereinafter referred to as DNA dilution solution) containing the amount derived from 00 or 150000 cells, and the amount derived from 15000 or 15000 cells, respectively. DNA was amplified by the PCR method as follows.
PCR法に用いる反応液の組成は第1表においてDNA
溶液としては前記DNA希釈液を適量用い、Taq
DNAポリメラーゼとしては2.5U/−のものを用い
、蒸留水は反応液か全体として50μlとなるまで加え
る以外は第1表に示す反応液組成と同じである。The composition of the reaction solution used in the PCR method is shown in Table 1.
Use an appropriate amount of the DNA dilution solution as a solution, and add Taq
The composition of the reaction solution was the same as shown in Table 1, except that 2.5 U/- of DNA polymerase was used and distilled water was added until the total volume of the reaction solution reached 50 μl.
この反応液をミネラルオイルで覆いDNAサーマル・サ
イクラ−にセットした。熱変性92°C1分間、アニー
リング61’CI分間、伸長反応を70’C2分間行っ
た後、熱変性 92°C10秒間、アニーリング61°
C1分間、伸長反応700C2分間を39サイクル行っ
た。その後70℃で7分間保温した。この簡便かつ迅速
なPCR法によって理論上、試料溶液中のDNA量は約
240倍に増幅されたことになる。This reaction solution was covered with mineral oil and set in a DNA thermal cycler. Heat denaturation at 92°C for 1 minute, annealing for 61'CI minutes, extension reaction at 70'C for 2 minutes, heat denaturation at 92°C for 10 seconds, annealing at 61°C.
39 cycles of C1 minute and extension reaction 700C2 minutes were performed. Thereafter, it was kept warm at 70°C for 7 minutes. This simple and rapid PCR method theoretically amplifies the amount of DNA in the sample solution by about 240 times.
この様にPCR法によって増幅されたDNAを含む溶液
20μlをサイズマーカーと共に5%ポリアクリルアミ
ド電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色して、inv
E遺伝子の一部を含むDNA断片を検出した。その結果
を第2図に示した。20 μl of a solution containing DNA amplified by the PCR method in this way was subjected to 5% polyacrylamide electrophoresis with a size marker, stained with ethidium bromide, and injected into
A DNA fragment containing part of the E gene was detected. The results are shown in Figure 2.
すなわち第2図において、レーン1はDNAを含まない
反応液についての結果であり、ブランクに相当する。レ
ーン2〜4は(i)熱処理法によりDNA試料溶液を調
製した場合において、各々150000、15000.
および1500細胞由来DNAが反応溶液50μl中に
含まれる場合についての結果である。レーン2及び3に
おいては248bpの断片が検出され、すなわち、大腸
菌が検出された。しかしレーン4すなわち1500細胞
由来DNAについては検出不可能であった。That is, in FIG. 2, lane 1 shows the results for a reaction solution containing no DNA and corresponds to a blank. Lanes 2 to 4 are (i) 150,000 and 15,000, respectively, when the DNA sample solution was prepared by the heat treatment method.
and 1500 cell-derived DNA is contained in 50 μl of the reaction solution. A 248 bp fragment was detected in lanes 2 and 3, that is, E. coli was detected. However, lane 4, ie, DNA derived from 1500 cells, was undetectable.
レーン5は断片の大きさの対照として前記pBR322
を旧nflで消化した断片を電気泳動した結果である。Lane 5 shows the pBR322 fragment as a control for fragment size.
This is the result of electrophoresis of fragments digested with old nfl.
レーン6〜9は(ii)プロテイナーゼK及び熱処理法
によってDNA試料溶液を調製した場合の結果であり、
レーン6〜9は各々15000、1500.150およ
び15細胞由来DNAか反応溶液50μl中に含まれる
場合についての結果を示す。Lanes 6 to 9 are the results when the DNA sample solution was prepared by (ii) proteinase K and heat treatment method,
Lanes 6 to 9 show the results when DNA from 15,000, 1,500.150, and 15 cells was contained in 50 μl of the reaction solution, respectively.
レーン6〜8においては248bpの断片か検出され、
すなわち大腸菌か検出された。しかしレーン9すなわち
15細胞由来DNAについては検出不可能であった。A 248 bp fragment was detected in lanes 6 to 8,
In other words, E. coli was detected. However, DNA derived from lane 9, ie, 15 cells, was undetectable.
以上の結果より、50μlの増幅反応系に(i)の熱処
理のみの方法では少なくとも15000以上の、(h)
のプロテイナーセに及び熱処理の方法では少なくとも1
50以上の細胞に由来するDNAが存在すればinvE
遺伝子を含む大腸菌か検出可能であった。これは従来の
RIを使用したプローブ法に比べ約7〜100倍感度か
高い。すなわち本発明に係る検査方法は従来法と比較し
て、検出感度が良好であることが確認された。From the above results, it can be seen that the method (i) using only heat treatment in a 50 μl amplification reaction system results in at least 15,000 or more (h)
in the proteinase and in the heat treatment method, at least 1
If there is DNA derived from 50 or more cells, it is invE.
It was possible to detect E. coli containing the gene. This is about 7 to 100 times more sensitive than the conventional probe method using RI. That is, it was confirmed that the testing method according to the present invention has better detection sensitivity than the conventional method.
(実施例3)侵入性大腸菌(EIEC)の検出臨床分離
菌(EIEC27株およびその他の病原大腸菌8株)を
試料とし、本発明の方法と従来法であるセレニーテスト
、細胞侵入性テスト、菌体表面抗原に対する抗血清を用
いたEIA法(伊藤健一部、中村防子、渡辺治雄他、日
本細菌学雑誌41巻414頁1986年)との検査結果
を比較し、その特異性を確認した。(Example 3) Detection of invasive Escherichia coli (EIEC) Clinically isolated bacteria (27 strains of EIEC and 8 other pathogenic Escherichia coli strains) were used as samples, and the method of the present invention and conventional methods such as the Sereny test, the cell invasion test, and the cell surface The test results were compared with the EIA method using antiserum against the antigen (Kenichi Ito, Moriko Nakamura, Haruo Watanabe et al., Japanese Journal of Bacteriology, Vol. 41, p. 414, 1986), and its specificity was confirmed.
(3−A)試料からのDNAの調製
前記臨床分離菌株35株を普通寒天培地にツスイ)上で
30℃にて一夜培養した。各−白金耳を1 mM ED
TAを含む10+nMトリスーHCI(pH8,0)の
溶液l−に懸濁し、97℃で10分間熱処理したものを
DNA試料溶液とした。(3-A) Preparation of DNA from Samples The 35 clinically isolated strains described above were cultured overnight at 30°C on an ordinary agar medium. Each platinum loop at 1 mM ED
A DNA sample solution was prepared by suspending the DNA in a solution of 10+nM Tris-HCI (pH 8,0) containing TA and heat-treating it at 97°C for 10 minutes.
(3−B)PCR法によるDNAの増幅PCR法に必要
とされる特異的なプライマーの組合せとしては5’−C
CTTGATACAAATTTGCCCCCG−3°と
3゛〜GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
−5°とから成る組合せ(VI)を使用した。(3-B) Amplification of DNA by PCR method The specific primer combination required for PCR method is 5'-C
CTTGATACAAAATTTGCCCCCG-3° and 3゛~GCCCTATATTAAAGAGCGGTAG
-5° was used.
PCR法に用いる反応液の組成は第1表において、DN
A溶液としては上記(3−A)で調製したDNA試料溶
液を用い、Taq DNAポリメラーゼは5μl、蒸
留水は22μl用いた以外は第1表に示す反応液組成と
同じである。The composition of the reaction solution used in the PCR method is shown in Table 1.
The reaction solution composition was the same as that shown in Table 1, except that the DNA sample solution prepared in (3-A) above was used as solution A, 5 μl of Taq DNA polymerase, and 22 μl of distilled water were used.
この反応液をミネラルオイルで覆いDNAサーマル・サ
イクラ−にセットした。熱変性 92°C1分間、アニ
ーリング61’CI分間、伸張反応を70°C2分間を
行った後、熱変性 92℃10秒間、アニーリング61
℃ 1分間、伸長反応70°C2分間を39サイクル行
った。その後70℃で7分間保温した。This reaction solution was covered with mineral oil and set in a DNA thermal cycler. Heat denaturation at 92°C for 1 minute, annealing at 61'CI, extension reaction at 70°C for 2 minutes, heat denaturation at 92°C for 10 seconds, annealing at 61' CI.
C. for 1 minute and extension reaction at 70.degree. C. for 2 minutes for 39 cycles. Thereafter, it was kept warm at 70°C for 7 minutes.
(3−C)電気泳動による検出
PCR法を行って得られた反応溶液の20μlをサイズ
マーカーと共に5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
行い、臭化エチジウムで染色し検出した。その結果、従
来法で陽性であった27菌株を試料とした場合のみin
vE遺伝子を含む特異的DNA断片が検出され、従来法
で陰性であった8菌株の場合には検出されなかった。す
なわち従来法との結果が完全に一致した。従って本発明
に係る検査方法が特異性を有することが確認された。(3-C) Detection by electrophoresis 20 μl of the reaction solution obtained by PCR was subjected to 5% polyacrylamide gel electrophoresis with a size marker, and detected by staining with ethidium bromide. As a result, only when the 27 bacterial strains that were positive using the conventional method were used as samples.
A specific DNA fragment containing the vE gene was detected, but was not detected in the eight strains that were negative using the conventional method. In other words, the results were completely consistent with the conventional method. Therefore, it was confirmed that the testing method according to the present invention has specificity.
(3−D)プローブによる検出
上記(3−C)において5%ポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行い、臭化エチジウムで染色したゲルをサザン
トランスファーし、本発明中のオリゴヌクレオチド3′
−GGGAAGCGATTTTCAACTG−5°をジ
ゴキシゲニン−11−dUTPでラベルしたものをプロ
ーブとし、西ドイツ国、ベーリンガーーマンハイム社製
検出用キット(DNAラベリング&デイテクションキッ
ト 製品番号1093657)を用いて非R1的に検出
したところ、陽性菌のみにおいて特異的DNA断片の位
置が検出された。(3-D) Detection using a probe 5% polyacrylamide gel electrophoresis was performed in (3-C) above, and the gel stained with ethidium bromide was Southern transferred and the oligonucleotide 3′ of the present invention
-GGGAAGCGATTTTCAACTG-5° labeled with digoxigenin-11-dUTP was used as a probe and detected in a non-R1 manner using a detection kit (DNA labeling & detection kit product number 1093657) manufactured by Boehringer Mannheim, West Germany. As a result, the position of a specific DNA fragment was detected only in positive bacteria.
従って従来のプローブ法の如<RIでプローブをラベル
する必要はなく、目的とする菌を検出しうる。また容易
に調製可能である本発明に係るプライマーをプローブと
して用いることができる。Therefore, it is not necessary to label the probe with RI as in the conventional probe method, and the target bacteria can be detected. Furthermore, the easily prepared primer according to the present invention can be used as a probe.
[発明の効果]
請求項1ないし9の発明に係る検査方法によると従来法
よりも感度良く赤痢菌及び/又は腸内侵入性大腸菌を検
出し得る。従って少ない試料でも検査可能である。また
放射能汚染などの危険のない非RI法でも検査可能であ
る。[Effects of the Invention] According to the testing method according to the invention of claims 1 to 9, Shigella and/or enteroinvasive Escherichia coli can be detected with higher sensitivity than conventional methods. Therefore, it is possible to test even a small number of samples. It is also possible to test using a non-RI method that does not pose risks such as radioactive contamination.
請求項2の発明に係る検査方法によると増幅されるべき
DNA断片が効率よく増幅されるのでより迅速に検査し
つる。According to the test method according to the second aspect of the invention, the DNA fragment to be amplified is efficiently amplified, so that the test can be performed more quickly.
請求項4の発明に係る検査方法によるとPCR法が自動
化できるので、より迅速かつ簡便に検査しうる。According to the testing method according to the invention of claim 4, since the PCR method can be automated, testing can be performed more quickly and easily.
請求項8又は9の発明に係る検査方法によると特異的プ
ローブか入手容易である。According to the testing method according to the invention of claim 8 or 9, specific probes are easily available.
請求項10の発明に係るプライマーは入手容易であり、
本発明に係る検査にて好適に用いることができ、かつ、
プローブとして用いることもできる。また、そのような
検査以外の目的で、特定のDNA断片を増幅するために
も用いることかできる。The primer according to the invention of claim 10 is easily available,
Can be suitably used in the inspection according to the present invention, and
It can also be used as a probe. It can also be used to amplify specific DNA fragments for purposes other than such testing.
第1図は第1実施例中の(1−D)において各プライマ
ーの組合せ(I)〜(VI)を用いて増幅反応を行った
場合の臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のゲルを示す。
第2図は第2実施例中の(2−B)において15〜1.
50000細胞由来のDNA量を用いて増幅反応を行っ
た場合の臭化エチジウムで染色されたポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動のゲルを示す。Figure 1 shows the results of polyacrylamide gel electrophoresis stained with ethidium bromide when the amplification reaction was performed using each primer combination (I) to (VI) in (1-D) in the first example. Showing gel. FIG. 2 shows 15 to 1 in (2-B) in the second embodiment.
This figure shows a polyacrylamide gel electrophoresis gel stained with ethidium bromide when an amplification reaction was performed using an amount of DNA derived from 50,000 cells.
Claims (10)
いる遺伝子に対して相補的なプライマーであって、セン
スストランド用プライマー及びアンチセンスストランド
用プライマーから成る組合せを、検査すべき細胞のDN
A系に用いて、該遺伝子の一部分を含むDNA断片を酵
素的方法により増幅させ、該増幅されたDNA断片を検
出することを特徴とする赤痢菌及び/又は腸内侵入性大
腸菌の検査方法。(1) A combination of a sense strand primer and an antisense strand primer, which is complementary to a gene specifically present in Shigella and enteroinvasive E. coli, is applied to the cells to be tested. DN of
A method for testing Shigella and/or enteroinvasive Escherichia coli, which is used in the A system and comprises amplifying a DNA fragment containing a part of the gene by an enzymatic method and detecting the amplified DNA fragment.
である特許請求の範囲第1項に記載の方法。(2) The method according to claim 1, wherein the DNA fragment has a size of 50 to 1000 base pairs.
特許請求の範囲第1項又は第2項に記載の方法。(3) The method according to claim 1 or 2, wherein the enzymatic method is a polymerase chain reaction method.
DNAポリメラーゼが、DNA鎖の解裂温度において耐
熱性である特許請求の範囲第3項に記載の方法。(4) The method according to claim 3, wherein the DNA polymerase used in the polymerase chain reaction method is thermostable at the DNA strand cleavage temperature.
子である特許請求の範囲第1項〜4項のいずれか1項に
記載の方法。(5) The method according to any one of claims 1 to 4, wherein the specifically existing gene is the invE gene.
種の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 又はこれらと同等の相補性を有するプライマーの内から
少なくとも1つを選び、前記アンチセンスストランド用
プライマーとして次の2種の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 又はこれらと同等の相補性を有するプライマーから少な
くとも1つを選んだ特許請求の範囲第5項に記載の方法
。(6) The following three primers are used as the sense strand primers.
Select at least one of the primers that are the nucleotide sequence of the species [there is a gene sequence] or the primers that have the same complementarity as these, and use the primers that are the following two nucleotide sequences as the primers for the antisense strand [ 5. The method according to claim 5, wherein at least one primer is selected from primers having the same complementarity as the gene sequence] or these primers.
法及び特異的プローブを用いる方法のいずれかである特
許請求の範囲第1〜6項のいずれか1項に記載の方法。(7) The method according to any one of claims 1 to 6, wherein the method for detecting the amplified DNA fragment is either electrophoresis or a method using a specific probe.
であって前記増幅されるDNA断片に含まれるプライマ
ーの少なくとも1つを用いる特許請求の範囲第7項に記
載の方法。(8) The method according to claim 7, wherein at least one of the complementary primers contained in the DNA fragment to be amplified is used as the specific probe.
特異的プローブとして、次の塩基配列であるプライマー 【遺伝子配列があります】 であって該増幅されるDNA断片に含まれるプライマー
又はこれらと同等の相補性を有するプライマーの内から
少なくとも1つを任意に選んで用いる特許請求の範囲第
8項に記載の方法。(9) The specific gene is the invE gene, and the specific probe is a primer with the following base sequence [there is a gene sequence] and is included in the DNA fragment to be amplified, or a primer equivalent to these. 9. The method according to claim 8, wherein at least one primer having complementarity is arbitrarily selected and used.
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP2063079A JPH03262500A (en) | 1990-03-14 | 1990-03-14 | Inspection of dysentery bacillus and/or intestinally intruding colibacillus and primer suitable for same inspection |
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EP0669399A2 (en) * | 1994-02-28 | 1995-08-30 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides and method for detecting bacteria |
-
1990
- 1990-03-14 JP JP2063079A patent/JPH03262500A/en active Pending
Cited By (5)
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EP0669399A3 (en) * | 1994-02-28 | 1996-05-22 | Shimadzu Corp | Oligonucleotides and method for detecting bacteria. |
US5795717A (en) * | 1994-02-28 | 1998-08-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
EP1036846A3 (en) * | 1994-02-28 | 2000-10-18 | Shimadzu Corporation | Oligonucleotides for detecting bacteria and detection process |
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