JPH03164195A - 液体試料の分析方法及び分析装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、表面プラズモン現象を利用する、液体試料の
分析方法及び分析装置に関する．［従来の技術］ 血清などの液体試料を検査して、各種の物質、例えばホ
ルモン、ビタミン、脂質、酵素、含窒素物質、糖類、抗
原性物質などの存在及び／又は濃度を測定することは各
種の疾病の早期発見の観点からますます重要になってき
ている．このうち、酵素反応によって生成又は消費され
るガスを利用する方法としては、ガス変化を酸素電極な
どで電気化学的に測定する方法、ガスと発色性物質とが
ら生成される色素を比色分析する方法などが一般に使用
されている．更に、免疫反応の特異性を基本的に利用し
た上で酵素反応を検出手段として用いる、いわゆる酵素
免疫方法もある．しかし、従来の酵素反応法は工程が複
雑で、検出精度も低い．また、検出精度の高い酵素免疫
法には、時間がかかり過ぎるという問題がある． 一方、表面プラズモン共鳴を利用する分析方法も知られ
ている．例えば、Ｗ○（ＰＣＴ国際公開）８　８／０　
６　７　２　５号及び８　８／０　６　７　２　６号各
明細書には、表面プラズモン共鳴を利用して、液体試料
（例えば血液）中に含まれるガスを定量することが記載
されている．ただし、これらの明細書に記載の技術で測
定対象となっているガスは、血液試料中に本来的に含ま
れていた酸素ガス、二酸化炭素ガス、あるいは麻酔ガス
などである．即ち、検査を目的として、血液中の糖類な
どから酵素反応によって変化させたガスを測定すること
は記載されていない． 更に、血液中に含まれている微量成分の抗原抗体反応の
発生を表面プラズモン共鳴の形で捕捉して分析する技術
が特開昭６１−２９０４５号及び特開昭６３−２７１６
２号公報に記載されている．ただし、この技術は工程が
複雑で、しかも長い時間を必要とする．また、これらの
特許公報には、ガス変化を捕捉することは記載されてい
ない．［発明が解決しようとする課題コ 本発明者らは、例えば酵素反応によるガス変化を、表面
プラズモン現象の利用によって測定すると、液体試料中
の成分を迅速に、正確に、高精度に、しかも簡便な工程
で分析することができることを見い出した．更に、本発
明者らは、回転可能なディスク上で前記の分析を実施す
ると、より効率的な分析が可能になるだけでなく、多或
分を同時に分析することができるなどの優れた効果が得
られることも見い出した．本発明は、これらの知見に基
ずくものである． ［課題を解決するための手段コ 前記の目的は、本発明により、 試薬と液体試料とを接触させることにより生ずるガス量
の変化を、ガス透過性層を介して、表面プラズモン現象
を利用して光学的に測定することを特徴とすることによ
って達成することができる．即ち、本発明の具体的な態
様によれば、本発明は、 酵素又は基質含有層に液体試料を接触させ、酵素反応に
よるガス量の変化を、前記酵素又は基質含有層に隣接す
るガス透過性層を介して、表面プラズモン現象を利用し
た光学的検出手段によって測定することを特徴とする、
液体試料の分析方法［以下、酵素法と称することがある
コに関する．本発明は、また、 酵素で標識された第１免疫反応性物質と液体試料との混
合物を、第２免疫反応性物質を含有する層に接触させ、
第２免疫反応性物質と結合しなかった第１免疫反応性物
質と液体試料とを除去し、標識酵素の基質を加え、酵素
反応の影響によるガス量の変化を、前記の第２免疫反応
性物質含有層に隣接するガス透過性層を介して、表面プ
ラズモン現象を利用した光学的検出手段によって測定す
ることを特徴とする、液体試料の分析方法［以下、酵素
免疫法と称することがある］にも関する．また、本発明
は、 液体試薬注入手段； 前記注入手段によって注入された液体試料と接触するよ
うに配置した試薬含有層； ガス透過性層； 被表面プラズモン活性部； 被表面プラズモン活性部に光を照射する手段；及び 前記活性表面における表面プラズモン現象を利用した光
学的検出手段 を含むことを特徴とする、液体試料分析装置にも関する
． 更に、本発明の好ましい態様によれば、前記の酵素法及
び酵素免疫法などを回転可能なディスク上で実施する方
法、あるいは回転可能なディスク上で試薬と液体試料と
の接触を行う分析装置が提供される． なお、本発明において用いる「表面プラズモン現象を利
用した光学的検出手段」としては、例えば、ｒ　Ｓｕｒ
ｆａｃｅ　ｐｌａｓｍｏｎ　ｒｅｓｏｎａｎｃｅ　ｆｏ
ｒ　ｇａｓ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄ　ｂｉｏｓｅｎ
ｓｉｎｇ　Ｊ　　（　Ｎｙｌａｎｄｅｒら、Ｓａｎｓｏ
ｒｓ　ａｎｄＡｃｔｕａｔｏｒｓ，４、２２９−３０４
、１９８３）に記載されているように、ガスの組戒変化
により生じる誘電率の変化をプラズモン共鳴角度の変化
として測定する方法や、ｒ　Ｓｕｒｆａｃｅ　Ｅｎｈａ
ｎｃｅｄ　ＲａｍａｎＶｉｂｒａｔｉｏｎａｌ　Ｓｔｕ
ｄｉｅｓ　ａｔ　ＳｏｌｉａＧａｓ　Ｉｎｔｅｒｆａｃ
ｅｓ　」（Ｐｏｃｋｒａｎｄ著、Ｓｐｒｕｎｇｅｒ　Ｖ
ｅｒｌａｇ刊）に記載されているラマン吸収によりガス
量の変化を知る方法などがある． また、表面プラズモン現象を利用したラマン吸収とは（
これについては必ずしも一致した解釈がされているわけ
ではないが）、具体的には、銀、金又は銅などで被覆さ
れた基板表面に光を照射し、その表面近傍に存在する物
質のラマン吸収を測定する方法あるいはこれに類似する
方法を意味する．以下、本発明を順に詳細に説明する． 本発明の分析方法は、液体試料と接触することによって
ガスを発生又は消費する試薬を用い、この際のガス量を
、ガス透過性層を介した位置において、表面プラズモン
現象を利用する光学的検出手段によって測定するもので
ある。

具体的に述べれば、後記する酵素法又は酵素免疫法など
であるが、これらに限定されるものではなく、血液など
の液体試料中の特定成分との接触による反応等によって
ガスの変化を生ずる試薬の場合を含むものである．例え
ば、血液中のヘモグロビンは、酸素試薬と反応すること
により、オキシヘモグロビンとなり、この際、酸素を消
費する。

また、水中の過酸化水素は二酸化マンガンと接触するこ
とにより酸素を発生するので、本発明によって測定する
ことができる． 以下に、本発明の代表的な態様について詳述する． 杢且■Ｄ匪果失 本発明の酵素法では、酵素又は基質含有層に含まれてい
る酵素又は基質の特異性を利用して、液体試料中に含ま
れている或る特定の検査対象成分の存在及び／又は濃度
（含有量又は活性ｉ）を測定する． 酵素又は基質含有層は、多孔質材料に酵素又は基質を担
持（捕捉、又は特に固定）させることによって調製する
ことができる．多孔質材料は、繊維材料例えば合成繊維
（例えば、ボリアミド）、天然繊維（例えば、綿又は羊
毛）、無機繊維（例えば、ガラス繊維）からなる織物、
編物もしくは特に不織布、又は多孔性の無機もしくは有
機材料からなるフィルタの形であることができる．この
多孔質材料に、公知の方法、例えば酵素又は基質懸濁液
を含浸又は塗布させる方法などによって酵素を担持（固
定又は捕捉）させることができる．本発明で用いること
のできる酵素は、酵素反応によってガス（例えば、過酸
化水素、酸素、二酸化炭素、又はアンモニア）を生成す
るが、又は消費する酵素である．これらの酵素の具体例
としては、各種のオキシダーゼ、例えば、グルコースオ
キシダーゼ（ＣＯＤ）、ガラクトースオキシダーゼ、コ
レステロールオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、ウリ
カーゼ（尿酸オキシダーゼ）、乳酸オキシダーゼ、シュ
ウ酸オキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、アスコル
ビン酸オキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、アルコー
ルオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼ；デカルボキ
シラーゼ、例えば、シュウ酸デカルボキシラーゼ、アミ
ノ酸デカルボキシラーゼ；デアミナーゼ、例えば、アデ
ノシンデアミナーゼ、ＡＭＰデアミナーゼ；あるいは、
クレアチナーゼ、アンモニアリアーゼ、ウレアーゼなど
を挙げることができる．前記の酵素を用いると、液体試
料中のグルコース、スクロース、マルトース、ガラクト
ース、コレステロールもしくはコレステロールエステル
、ホスファチジルコリン、中性脂肪（トリグリセリド〉
、尿素、尿酸、乳酸、シュウ酸、ピルビン酸、アスコル
ビン酸、アミノ酸、アルコール、クレアチニン、アデノ
シン、アデノシンモノリン酸、アデノシントリリン酸、
モノアミンなどの存在及び／又は濃度を分析することが
できる．ここで、被検物質が例えばスクロースである場
合には、スクロースをインベルターゼでα一Ｄ−グルコ
ースに変え、これを更にムタロターゼでβ一Ｄ−グルコ
一スに変えてから、グルコースオキシダーゼを作用させ
ると酸素を消費し、同時に過酸化水素を生成するので、
これらのガスの変化を測定すればよい．このように、ガ
ス変化を伴う酵素反応に用いることができる形に予め変
化させることが好ましい被検物質としては、マルトース
、ガラクトース、コレステロールもしくはコレステロー
ルエステル、ホスファチジルコリンスは中性脂肪（トリ
グリセリド）などがある．これらの被検物質は、適当な
酵素を用いて、ガス変化を伴う酵素反応に用いることが
できる形に予め変化させてから、本発明方法の試料とし
てもよいが、ガス変化を伴う酵素反応に用いることがで
きる形に予め変化させるための酵素又は酵素群を、前記
の酵素含有層に一緒に担持させておき、酵素含有層で変
化させることもできる． 本発明方法の液体試料は、検査対象となる特定物質を含
有するおそれのある液体であればよく、特には生物学的
液体試料、例えば体液、例えば血液（全血液、血清）又
は尿である．また、検査対象となる物質は、酵素の基質
となる物質である．例えば、糖類（例えばグルコース）
、有機酸、脂質、アミノ酸、タンパク質又はベブチド、
さらには酵素例えばグルタミン酸一オキサロ酢酸トラン
スアミナーゼ（ＧＯＴ）もしくはグルタミン酸一ビルビ
ン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ）である。

本発明方法では、ガス透過性層を介してガス量の変化を
測定する．ガス透過性層は、ガス状物質以外の物質に対
しては、それらを透過させずにバリャーとなり、ガス状
物質だけを透過させることのできる材料から調製する．
このような材料としては、例えば、酢酸酪酸セルロース
（ブチリル基１０〜６０重量％及びアセチル基５〜３０
重量％含有）、プロビオン酸吉草酸セルロース（バレリ
ル基２０〜５０重量％含有）、アセチル化酢酸セルロー
ス（アセチル基含有量１９％以上）、ポリテトラフルオ
ロエチレン又はシリコンラバー等の材料を挙げることが
できる． 本発明方法では、表面プラズモン現象を利用してガス量
の変化を測定するが、この場合に、光の照射によって発
生する表面プラズモン現象を保持することのできる活性
表面を用いることができる．このような活性表面を有す
る光学構造体は、少なくともその一部分が銀、金又は銅
などの金属からなり、入射光の波長又は角度などにより
最適な凹凸形状（ピッチ、深さ、断面形状など）を有す
る．例えば、凹凸のみを有する表面、特には適当なピッ
チの回折格子面、好ましくは、金属被覆されたそれらの
表面を有する光学構造体である．更に、金属被膜面を有
するプリズム、金属微粒子（特には約０．０１〜１０μ
ｍの微粒子）分散体も活性表面担持光学構造体として用
いることができる．この金属被膜面は、通常、光を透過
する．光学構造体上に担持されている活性表面は、通常
、外気密封手段により外気と遮断されている．外気密封
手段は、例えば、外壁で囲まれた空間からなるガス検出
室、光学構造体に隣接して設けた支持体層（例えば、合
或樹脂又はガラスからなる）である．あるいは、例えば
、金属被膜を担持した面を有するプリズムのように、光
学構造体が活性表面部分（金属被膜）とその支持体部分
（プリズム）とからなる場合には、支持体部分くプリズ
ム）を外気密封手段としてもよい．光学構造体をガス検
出室内に設置する場合には、光学構造体それ自体は、前
記のガス透過性層と接触していても又は離れていてもよ
い．前記の支持体層は光透過性層であって、非プラズモ
ン活性表面におけるガス状態を安定に保持する．したが
って、ガス透過性層からの透過ガスが表面において、或
る一定状態を保持することができる場合には、必ずしも
必要としない． 本発明方法においては、まず、液体試料を酵素含有層に
接触させる．その酵素によってガスを生成又は消費する
物質がその液体試料中に含まれていると、酵素反応が起
こり、ガス量が変化する．例えば、酵素含有層にグルコ
ースオキシダーゼを固定させ、液体試料として血清を用
いると、血清中にグルコースが存在する場合には、酵素
反応［以下余白］ グルコース グルコン酸＋２８２０２ が起こり、酸素が消費され、そして過酸化水素が生成さ
れる．″Ｉ．た、尿素とウレアーゼとの組み合わせでは
、 ８２ＣＯ３　（Ｈ２０＋ＣＯ２）＋２ＮＨ３アンモニア
及び二酸化炭素ガスが発生する．このようなガス量の変
化は、ガス透過性層を経て、定量的に（即ち、液体試料
中の特定物質の量に対応して）、光学構造体活性表面の
被表面プラズモン活性部に保持される． 光学構造体でガス量を測定するには、例えば、光学楕遣
体に単色光を照射して表面プラズモン現象を発生させ、
その反射光又は透過光（変調された光を含む．）を観測
すればよい． 生見朋二並呈免皮抜 本発明の酵素免疫法では、抗原抗体反応の特異性を利用
して、液体試料中に含まれている或る特定成分を捕捉し
、続いて標識としての酵素を用いてその特定或分の存在
及び／又は濃度を測定する．本発明の酵素免疫法は、競
合的検査法又はサンドイッチ検査法で実施することがで
きる．競合的検査法では、測定対象となる抗原と同じ抗
原を適当な酵素で標識して、第１免疫反応性物質として
用いる．一方、この抗原に特異的な抗体を第２免疫反応
性物質として用い、多孔性材料に担持させる． また、サンドイッチ検査法では測定対象となる抗原に対
する抗体を適当な酵素で標識して、第１免疫反応性物質
として用いる．一方、この抗原の別の部位に結合する抗
体を第２免疫反応性物質として用い、多孔性材料に担持
させる． 競合的検査法又はサンドイッチ検査法で用いる抗体は、
細胞融合技術によって調製されるモノクローナル抗体が
好ましいが、抗血清から調製されるポリクローナル抗体
であってもよい．多孔質材料としては、前記の酵素法で
述べた材料を用いることができ、その多孔質材料に、公
知の方法、例えば抗体懸濁液を含浸、塗布などさせるこ
とによって第２抗体を担持させることができる． 本発明で用いることのできる酵素は、酵素反応によって
ガス（例えば、過酸化水素、酸素、二酸化炭素、又はア
ンモニア）を生成するか、又は消費する酵素であり、具
体的には前記の酵素法に関連して述べたとおりである．
これらの酵素を第１免疫反応性物質（抗原又は抗体〉の
標識として用いる． 本発明の酵素免疫法では、前記の酵素法で用いるのと同
じガス透過性層及び光学構造体を用いることができる． 本発明の酵素免疫法では、検査対象となる抗原を含むお
それのある液体試料と、酵素で標識された第１免疫反応
性物質との混合物を、第２免疫反応性物質含有層に接触
させる．抗原抗体反応を終了させるのに充分な時間が経
過した後、第２免疫反応性物質に結合していない液体試
料と酵素標識第１免疫反応性物質とを適当な洗浄剤で除
去する．続いて、標識酵素の基質含有液を加えると、液
体試料中に検査対象となる抗原が含まれている場合には
酵素反応が起こり、ガス量が変化する（例えば、酸素の
消費及び過酸化水素の生成が起きる）．このガス量の変
化は、ガス透過性層を経て、定量的に（即ち、液体試料
中の特定物質の量に対応して）、光学楕遣体の活性表面
に保持される．次いで、光を照射し、表面プラズモン現
象を利用し、前記の酵素法と同様に測定することができ
る．杢充■担公近笠里 本発明の分析装置を用いて、例えば、前記の酵素法及び
酵素免疫法を実施することができる．本発明の分析装置
を用いて前記の酵素法を実施する場合には、液体試料注
入手段から液体試料を導入する．また、或る液体試料に
関する分析が終了した後で、適当な洗浄液を導入するこ
とができる． 前記の酵素免疫法を実施する場合には、液体試料注入手
段から液体試料を導入するほか、酵素で標識された第１
免疫反応性物質、非結合物質や過剰液体試料を除去する
ための洗浄液、更には基質含有液を導入する．また、或
る液体試料に関する分析が終了した後で、適当な洗浄液
を導入することができる． 従って、本明細書で「液体試料」とは、分析対象となる
液体試料のほか、酵素標識第１免疫反応性物質含有液、
基質含有液などを含むものである．本発明の分析装置は
、前記注入手段によって注入された液体試料と接触する
ように配置した生物学的反応性物質含有層を有する．こ
こで「生物学的反応性物質」とは、酵素又は基質（前記
の酵素法を実施する場合〉及び第２免疫反応性物質、即
ち抗体又は抗原（前記の酵素免疫法を実施する場合）を
意味する． 従って、生物学的反応性物質含有層は、前記の多孔性材
料に、前記の酵素／基質又は抗体／抗原を含有させるこ
とによって調製する． 本発明の分析装置は、前記のガス透過性層、光学構造体
及び外気密封手段を備えており、更に、適当な光源と検
出器とからなる表面プラズモン現象測定手段を備えてい
る． 次に、第■図及び第２図に沿って、本発明の分析装置を
用いて本発明の分析方法を実施する場合の分析原理を説
明する． 本発明の酵素法を実施するには、最初に、分析装置１の
試料注入口（図示してない）から液体試料２を導入して
酵素担持層３と接触させる．酵素担持層３の酵素と反応
する被検物質が液体試料２中に存在すると酵素反応が進
行してガスの生成及び／又は消費が起きる．このガス量
の変化はガス透過性層４を経て光学構造体く図示してな
い〉上の活性表面５に保持される．活性表面５は支持体
層６（第１図）又はガス検出室７（第２図）により外気
の影響から保護されている．光源８から光ビーム９を活
性表面５に照射し、反射光ビーム１０の吸収変化又は偏
光変化を検出器１１で測定する．第２図に示すように、
ガス検出室７の外側に支持体層１２を設けると、支持体
層を任意の形状又は大きさに設定することができるので
、例えばディスク状とすることができる。

次に、本発明の酵素免疫法を実施するには、最初に、分
析装置１の試料注入口（図示してない）から液体試料と
酵素標識抗原（競合法の場合）又は抗体（サンドイッチ
法の場合〉との混合物２を導入して抗体担持層３と接触
させる．抗原抗体反応に必要な時間が経過したら、前記
の試料注入口から洗浄液を入れて、抗体担持層３の抗体
と結合していない液体試料及び酵素標識抗原又は抗体を
除去する．続いて、前記の試料注入口から標識酵素の基
質含有液を入れると、酵素標識抗原又は抗体が抗体担持
層３の抗体と結合している場合には酵素反応が進行して
ガスの生成及び／又は消費が起きる．このガス量の変化
を前記と同様にして測定する． 韮裏藍■凰扱 本発明の好ましい態様によれば、前記の酵素法及び酵素
免疫法を回転可能なディスク上で実施し、あるいは回転
可能なディスク上に前記分析装置の一部分を構戊する． 即ち、本発明の好ましい態様によれば、回転可能なディ
スク上の少なくとも１部分を中心部から円周部に向かっ
て延びる分析検査区画において、ディスク中心部から液
体試料を導入し、前記ディスクの回転によって発生する
遠心力によって前記液体試料を円周部方向へ流動させる
ことにより酵素又は基質含有層と接触させ、酵素反応に
よるガス量の変化を、ガス透過性層（好ましくは、前記
酵素／基質含有層に隣接している）を介して、表面プラ
ズモン現象を利用した光学的検出手段によって測定する
ことを特徴とする、液体試料の分析方法が提供される． 更に、本発明の好ましい態様によれば、回転可能なディ
スク上の少なくとも１部分を中心部から円周部に向かっ
て延びる分析検査区画において、酵素で標識された第１
免疫反応性物質と液体試料との混合物をディスク中心部
から導入し、前記ディスクの回転によって発生する遠心
力によって前記混合物を円周部方向へ流動させることに
より、第２免疫反応性物質を含有する層に接触させ、続
いて、第２免疫反応性物質と結合しなかった第１免疫反
応性物質と液体試料とを除去し、更に、ディスク中心部
から標識酵素の基質を加えて前記ディスク回転の遠心力
によって前記基質を第２免疫反応性物質含有層と接触さ
せ、酵素反応の影響によるガス量の変化を、ガス透過性
層（好ましくは、前記第２免疫反応性物質含有層に隣接
している）を介して、表面プラズモン現象を利用した光
学的検出手段によって測定することを特徴とする、液体
試料の分析方法が提供される．なお、前記の好ましい態
様において、生物学的反応性物質含有層とガス透過性層
とは、通常、隣接して設けられているが、ｐＨ調整等の
ために中間層を両者の間に設けてもよい． 更に、本発明の好ましい態様によれば、回転可能な分析
用ディスクであって、 ディスク上の少なくとも１部分を中心部から円周部に向
かって延びる分析検査区画； ディスク中心部に設けた液体試料注入手段：前記注入手
段によって注入された液体試料が、ディスクの回転によ
って発生する遠心力によって円周部方向へ流動されるこ
とにより接触するように配置した試薬（生物学的反応性
物質）含有層；ガス透過性層； ガス透過性層を外気から保護する外気密封手段；及び 外気密封手段内でガスを保持することのできる活性表面
を有する光学楕遺体 を含む回転可能な分析用ディスクが提供される．更に、
本発明の好ましい態様によれば、前記の回転可能な分析
用ディスク； 前記ディスクの回転手段； 前記ディスク中心部の液体試料注入手段に液体試料を供
給する手段； 表面プラズモン現象の測定手段；及び 前記各手段の制御手段 を含む液体試料の分析装置が提供される．次に、これら
の好ましい態様を添付図面に沿って説明する． 第３図及び第４図に示すように、ディスク２１は、その
中心部２２から円周部に向かって放射状に複数の検査区
画２３に分割されている．各検査区画２３はそれぞれ分
離壁２４によって相互に隔離され、各々が独立して同種
及び／又は異種の特定物質を分析することができる．各
検査区画２３は中心部に液体試料を系内に導入するため
の試料注入口２５を備え、円周部に反応終了後の廃液を
除去するための排出口２６を備えている．中心部２２に
は、後記する分析装置の回転手段（第■０図参照）に取
付けるための取付手段（図示してない）を設ける．各区
画２３は、上壁２７、底壁（ディスク本体）２８、側壁
２９で囲まれており、ディスク中心部に試料受入室３０
を備えている．第４図及び第５図に示すように、ディス
クの中心部から円周部に及ぶ広い領域において、上壁２
７の下に通路３１が試料受入室３０から排出口２６まで
延びている．通路３１は、酵素膜３２及びガス透過膜３
３を介してガス検査室３４と接している．酵素膜３２を
、第６図に示すように、通路３１内に充填することもで
きる．ガス検査室３４の上部に、ガス透過膜３３と接す
る光学活性体３５（図示の例ではサンドベーバで荒らし
た樹脂の表面に金属例えば銀をコートした活性表面）を
設ける．光学活性体３５は、ガス透過膜３３の全面に設
けてもよいが、その一部分だけに設けてもよい．光学活
性体３５の活性表面のガス量の変化は、適当な光源（図
示していない：例えばレーザダイオード）からの入射ビ
ーム（例えばレーザ光３６を活性表面に照射し、表面プ
ラズモン現象を発生させ、その反射ビーム３７から適当
な測定手段（図示していない）で測定することができる
．検査区画２３の底壁２８は、少なくとも入射ビーム３
６及び反射ビーム３７の通路において、それらのビーム
を透過させることができるものでなければならない． 第７図及び第８図に示すように、試料の通路３１をディ
スク上の下部に設け、ガス検査室３４をディスク上の上
部に、そして、酵素膜３２及びガス透過膜３３をガス検
査室３４の底部及び／又は側部に設け、表面プラズモン
現象の測定をディスクの上方から実施するようにするこ
ともできる。

試料受入室３０と通路３１との間にフィルター層３８を
設けて液体試料中の不純物を除去することもできる． ディスク上に設ける検査区画２３は、第３図に示すもの
のほか、例えば、第９図に示すように、比較的広い隔離
領域４１で分離してもよく、あるいは中心部から円周部
に向かって連続的に曲げたり、又は断続的に折り曲げて
もよい。なお、検査区分（検査部）はディスク上に直接
一体的に設けてもよく、接着して設けてもよい。

ディスクの材質は特に制限されないが、プラスチック例
えばポリカーボネート、ボリスチレン、ポリアクリレー
ト又はポリメタクリレートあるいはガラスなどである． 本発明の好ましい分析装置の１態様を第１０図に示す．
ディスク２１はその中心部で回転手段５１に脱着自在に
取付けられる．回転手段５１は公知のものでよく、３０
００ｒｐｍ程度まで安定して回転することのできるもの
が好ましい．供給手段５２は、供給口５３を介して、デ
ィスク２１の中心部に設けられている試料注入口２５に
液体試料の必要量を供給する．供給千段５２としては、
通常、位置制御機構付きのマイクロプローブなどが用い
られる． ディスク２１の円周部の外側に、廃液収容部５４と廃液
管５５とからなる廃液処理手段５６を設ける． 更に、ディスク２１の円周部の外側に、適当な光源と検
出器とからなる測定手段５７を設ける．この測定手段５
７は、ディスク内の活性表面の位置により、ディスクの
上部又は下部に設ける．前記の回転手段５ｌ、供給手段
５２及び測定手段５７は制御手段５８により有機的に連
絡、制御され、試料の供給から測定までを自動化して迅
速にしかも高精度で行うことができる． 次に、前記の分析装置を用いて本発明の酵素法を実施す
るには、最初に、供給手段５２から液体試料をディスク
の試料注入口２５に導入する．続いて、回転手段５１に
よってディスクを回転させ、遠心力によって液体試料を
流して酵素膜と接触させる．酵素膜中の酵素と反応する
被検物質が液体試料中に存在すると酵素反応が進行して
ガスの生戒及び／又は消費が起きる．このガス量の変化
はガス透過膜を経て光学構造体上の活性表面に保持され
る．この活性表面のガス量を表面プラズモン現象を利用
して測定手段５７で測定する。測定終了後、供給手段５
２から洗浄液を試料注入口２５に導入し、ディスクを再
び回転させ、遠心力で洗浄液を流して酵素膜を洗浄する
．洗浄液は遠心力で廃液収容部５４に流し出され、廃液
管５５から除去される． 次に、酵素免疫法を実施するには、最初に、供給手段５
２から液体試料と酵素標識抗原（競合法の場合）又は抗
体（サンドイッチ法の場合）との混合物をディスクの試
料注入口２５に導入する．続いて、回転手段５１によっ
てディスクを回転させ、遠心力によって前記混合物を流
して抗体担持膜と接触させる．抗原抗体反応に必要な時
間が経過したら、前記の試料注入口から洗浄液を入れ、
ディスクを再び回転させ、遠心力で洗浄液を流して抗体
担持膜を洗浄し、抗体担持膜上の抗体と結合していない
液体試料及び酵素標識抗原又は抗体を除去する．続いて
、前記の試料注入口から標識酵素の基質含有液を入れ、
ディスクを再び回転させ、遠心力で基質含有液を流して
抗体担持膜と接触させる．酵素標識抗原又は抗体が抗体
担持膜の抗体と結合している場合には酵素反応が進行し
てガスの生成及び／又は消費が起きる．このガス量の変
化を前記と同様にして測定する．測定終了後、供給手段
５２から洗浄液を試料注入口２５に導入し、ディスクを
再び回転させ、遠心力で洗浄液を流して抗体担持膜を洗
浄する．洗浄液は遠心力で廃液収容部５４に流し出され
、廃液管５５から除去される． ［実施例］ 以下、実施例によって本発明を更に具体的に説明するが
、これらは本発明の範囲を限定するものではない． 犬旌思上 第７図及び第８図に示す装置を有するディスクを用い、
第１０図に示す装置を用いて、本発明の酵素法を実施し
た。

即ち、ポリカーボネートからなるディスク板の表面に適
当な表面処理を施し、生物学的反応性物質含有層３２と
して、グルコースオキシダーゼを固定したナイロン製不
織布を配置した．装置全体を３７℃に保持した． 既知濃度（１０、５０、１００、２００、５００及び１
　０　０　０ｍｇ／ｍ　１　）のグルコース標準液を１
０倍に希釈し、希釈液２００Ｊｉｌを試料注入口２５か
ら投入し、ディスクを回転してグルコースオキシダーゼ
固定層に接触させた．酵素反応によって消費された酸素
の変化を光学構造体３５にレーザ光を照射し、１　５６
　１　ｃｍ”’の０２によるラマン吸収変化を測定する
ことによって求め、検量線を作戒した． 次に、未知濃度のグルコースを含有する血清試料２００
μｌを用いて同様の測定を行なったところ、前記の血清
試料がグルコース１　０　５ｍｇ／ｍｌを含有している
ことがわかった。

［発明の効果コ 本発明によれば、酵素法又は酵素免疫法などと表面プラ
ズモン現象の測定法とを組み合わせることにより、液体
試料中の被検成分を迅速に、正確に、高精度に、しかも
簡便な工程で分析することができる。更に、回転可能な
ディスク上で前記の分析を実施すると、より効率的な分
析が可能になるだけでなく、多成分を同時に分析するこ
とができ、少量の試料で自動化及び連続化が可能になる
などの優れた効果が得られる．

【図面の簡単な説明】

第ｌ図及び第２図は、本発明の原理を模式的に示す説明
図である． 第３図は、本発明で利用するディスクの一態様の平面図
であり、第４図は第３図のＩＶ−ＩＶ線断面図であり、
第５図は第４図のＶ−Ｖ線断面図であり、第６図は本発
明で利用するディスクの検査区分の別態様の、第５図と
同様の断面図である．第７図は、本発明で利用するディ
スクの検査区分の更に別の態様の断面図であり、第８図
は第７図のＶＴＩＩ−ＶＩＩＩ線断面図である．第９図
は、本発明で利用するディスクの別の態様の平面図であ
る． 第１０図は、本発明の分析装置を模式的に示す説明図で
ある． 生物学的反応性物質含有層・・・３、３２；ガス透過性
層・・・４、３３；

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）試薬含有層に液体試料を接触させることにより生
   ずるガス量の変化を、前記試薬含有層に隣接するガス透
   過性層を介して、表面プラズモン現象を利用した光学的
   検出手段によって測定することを特徴とする、液体試料
   の分析方法。 （２）酵素又は基質含有層に液体試料を接触させ、酵素
   反応によるガス量の変化を、前記酵素又は基質含有層に
   隣接するガス透過性層を介して、表面プラズモン現象を
   利用した光学的検出手段によって測定することを特徴と
   する、液体試料の分析方法。 （３）酵素で標識された第１免疫反応性物質と液体試料
   との混合物を、第２免疫反応性物質を含有する層に接触
   させ、第２免疫反応性物質と結合しなかった第１免疫反
   応性物質と液体試料とを除去し、標識酵素の基質を加え
   、酵素反応よるガス量の変化を、前記の第２免疫反応性
   物質含有層に隣接するガス透過性層を介して、表面プラ
   ズモン現象を利用した光学的検出手段によって免疫反応
   性物質を定量測定することを特徴とする、液体試料の分
   析方法。 （４）回転可能なディスク上で液体試料と試薬との反応
   を実施し、そのディスク上に担持された被表面プラズモ
   ン活性部に光を照射し、表面プラズモン現象を利用した
   光学的検出手段によって液体試料中の特定成分の含有量
   又は活性量を定量する、請求項１〜３のいずれか１項に
   記載の方法。 （５）光学的検出手段がラマン吸収である、請求項１〜
   ４のいずれか１項に記載の方法。（６）液体試料注入手
   段； 前記注入手段によつて注入された液体試料と接触するよ
   うに配置した試薬含有層； ガス透過性層； 被表面プラズモン活性部； 被表面プラズモン活性部に光を照射する手段；及び 前記活性表面における表面プラズモン現象を利用した光
   学的検出手段 を含むことを特徴とする、液体試料分析装置。 （７）試薬含有層、ガス透過性層及び被表面プラズモン
   活性部を回転可能なディスク上に配置した請求項６記載
   の装置。