JPH02501746A - 種々の病理的状態に於いてｐｓ２遺伝子から特異的に発現される蛋白質及びその断片、該蛋白質及び／又はその断片から得られる抗体、並びに病理的状態に対する検出、診断及び治療への該蛋白質、その断片及び抗体の適用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 種々の病理的状態に於いてＰＳ２遺伝子から特異的に発現される蛋白質及びその 断片、該蛋白質及び／又はその断片から得られる抗体、並びに病理的状態に対す る検出、診断及び治療への該蛋白質、その断片及び抗体の適用 本発明は異なるヒト組織及び体液で分泌されるｐＳ２蛋白質の配列の同定、及び この蛋白質のペプチド断片に関する；本発明はさらにｐＳ２及びｐＳ２蛋白質の ペプチド断片に対するポリクローナル及びモノクローナル抗体、及び種々の病理 学的状態と特にホルモン依存性乳癌及び胃癌又は胃潰瘍の診断及び検出にこの蛋 白質及びこれらのペプチド並びに抗体を適用することに関する。

乳癌がホルモン依存性であるという事実は、ビートラン（Ｂ　ｅａｔｓｏｎ）　 ［ランセット（Ｌ　ａｎｅｅｔ）　（１９８６）　、　２．１０４−１０７１が 卵巣摘出後まだ月経周期を有する婦人の手術不可能な癌の後退を２例観察と報告 した１８９６年から知られていた。

今日では約１７３の乳癌がホルモンに反応し種々のホルモンの操作の後後退する ことがよく確立されている。

近年になるまで、ホルモン依存性癌を患い、従って内分泌療法の利益を得ること のできる婦人を確認するための、生物学的試験法は無かった。　１９７１年にジ エンセン（Ｊ　ｅｎｓｅｎ）ら［ＮＡＴＬ、ＣＡＮＣＥＲｌＮ５ＴＩ、ＭＯＮ　 ＯＧ　Ｒ，（１９７１）３４．５５−７０３が、癌標本中のエストロゲン　レセ プターの測定が副腎摘出に対する反応を予想するために有用でありうることを最 初に示した。その後この観察は、癌がエストロゲン　レセプター（ＥＲ″Ｓ）を 含む婦人の５０から６５％が内分泌療法に反応し、一方癌がエストロゲン　レセ プターを含まない婦人はホルモン治療で助かる機会が良くて１０％しかないと、 広く確認された。

実際、もしも癌性細胞が、あるホルモンに対し強い親和性を持つ、乳腺に正常存 在するような部位（即ちレセプター）を有するならば、それらの増殖は正常細胞 のようにホルモン環境によって調節できる。逆に、癌性細胞が、その悪性転移の 間に、そのレセプターを失うならば、これらレセプターは、標的細胞としては認 識されなくなる。しかし、癌がレセプターを有する婦人の５５％から６５％しか ホルモン治療に好ましく反応しないので、エストロゲン　レセプター（ＥＲ−ｓ ）の測定結果は完全にはホルモン療法に対する反応性を予測しない。その一つの 説明は、脱分化の過程でいくつかの癌はそのエストロゲン　レセプターを失うか もしれないという事実に存する。もしもこれらのレセプターが存続するならば、 癌はエストラジオールに結合する能力を保持するが、エストロゲンの反応の続く ステップを行いとおすことが出来ないのであろう。両方の場合共、ホルモンに自 立的又はホルモンに抵抗性の癌が関連する。

この後者の仮説は初期ステップ、即ちサイドシル　レセプターへの結合の後を調 べ、エストロゲンの細胞反応の最終産物を調べることにより証明された。例えば 、ＭＣＦ−７細胞（ヒト乳癌から派生した細胞ライン）そして多分インビボでの ヒト乳癌細胞において、その合成がエストロゲンに依存するプロゲステロン　レ セプター（Ｐ　Ｒ）が、これにあたる。実際、もしもプロゲステロンレセプター の割合が考慮されるならば、ホルモン治療下の癌の軽減レベルは６５％のオーダ ーである。多数の臨床試験から、癌が両者のレセプターを有する婦人の８０％が ホルモン療法に反応することが確立された。対照的に、もしも癌がエストロゲン 　レセプターを含むがプロゲステロン　レセプターを含まないならば、反応の可 能性は症例の１／３以下である。

従ってプロゲステロン　レセプター（ＰＲ″Ｓ）は治療反応性の予測のための情 報を付加する。

エストロゲンは、ＮＣＦ−７のよ、うな細胞ラインのインキュベーション　メデ ィウム中に放出される多数の蛋白質の合成を刺激する。分泌される蛋白質の大部 分がインキュベーション　メディウム中にエストラジオールの存在又は非存在下 で検出されるが、ホルモンが存在するならばそれらの活性は非常に増大する。こ れらは分子ｊ１３７，０００．４６．０００．５４，０００及び６０，０００Ｍ に相当する［マイレッセ（ＭＡＩＲＥＳＳＥ）ら、リーセント　リザルツ　イン 　キャンサー　リサーチ（ＲＥＣＥＮＴＲＥＳＵＬＴＳ　ＩＮ　ＣＡＮＣＥＲＲ ＥＳＥＡＲＣＨ）、ジー、ルクレルク（Ｇ、ＬＥＣＬＥＲＣＱ）　、ニス、トマ （Ｓ、ＴＯＭＡ）　、アール、バリディーンズ（Ｒ，ＰＡＲＩＤＥＡＮＳ）　、 ジエイ、シ、ヒューゼ：／（Ｊ、Ｃ。

ＨＥ　Ｕ　Ｓ　Ｅ　Ｎ）　９１．（１９８４）３０１−３０６１゜　これらの幾 つか（４６，０００，５４，０００及び６０．ＯＯＯＭ）　は、サイドシルの蛋 白質と同一である。５０，０００Ｍの蛋白質はエストラジオールで処理したイン キュベーション　メディウムにより豊富であるが、マイレッセの研究から、これ には誘導よりはむしろホルモンの作用下でのこの蛋白質の分泌の刺激が含まれる ことが示された。さらに、これらの刺激された蛋白質はＭＣＦ−７細胞のインキ ュベーション　メディウムに存在すると共に、エストロゲン非依存性のＥｖｓａ −Ｔ細胞のインキュベーション　メディウムにも存在するが、後者のメディウム 中のエストラジオールはこれらの合成及び／又は分泌に影響しない。従ってこの 場合はホルモン影響下の新しい生成物の誘導ではなくて、ただ存在している生成 物の濃度の増加のみである。

ロッシュフォール（ＲＯＣＨＥＦＯＲＴ）（上記と同じ刊行物ｐ　、２８９−２ ９４）はインキュベーション　メディウム中に高レベルの５２に蛋白質を見つけ 、この蛋白質の誘導は生理的濃度のエストラジオールの作用に特異的であり、一 方プロゲステロンとデキサメサゾンは活性がないことを示した。細胞増殖を阻害 するタモキシフェンは５２に蛋白質の分泌を誘導せず、モル比１０でエストラジ オールの作用を防止する。代謝物の一つであるモノヒドロキシタモキシフェンは 、　細胞増殖のブロックとＭＣＦ−７細胞での５２にの分泌に、タモキシフェン の２００倍の活性がある。

より最近同じチームが、ＥＲ＝ｓとＰＲ″Ｓは持つがその増殖はエストロゲン阻 害剤の作用を受けないＭＣＦ−７細胞の変異体、即ちＲ−２７細胞で、タモキシ フェン又はモノヒドロキシタモキシフェンの存在下で５２に蛋白質が分泌され続 けることを発見した。

本特許出願の発見者の幾人かを含む研究チームが、特異的な遺伝子の発現を行う ことになった。エストラジオールに誘導されたＭＣＦ−７細胞から確立したｃＤ ＮＡライブラリーから始めて、　このホルモン存在下で合成されたｍＲＮＡに対 応するｃＤＮＡ−ｓの分別クローニングを行うことができた。ホルモンの存在下 又は非存在下で増殖している細胞から作成したｃＤＮＡプローブを用いて、エス トラジオール存在下で培養したＭＣＦ−７細胞のみに存在するｍＲＮＡに対応す るｃＤＮＡクローンが単離され得た。

これをｐＳ２と呼んだ。著者は、クローンしたｃＤＮＡの核酸配列の決定から、 これが、８４個のアミノ酸から成り９１４０ダルトンの低分子量を有する蛋白質 であることを推論した［ジャカラリュー（ＪＡＫＯＷＬＥＷ）ら、ニュークレイ ツク　アシッド　リサーチ（ＮＵＣＬＥＩＣＡＣＩＤＳ　ＲＥＳ、）　、（１９ ８４）１２．２８８１−２８７８コ。　ｐＳ２遺伝子に作用するホルモン制御は 転写レベルに位置する。

遺伝子はエストラジオール非存在下では転写されず、一方ホルモンが培養メディ ウムに添加されてから８時間後にはｍ　ＲＮ　Ａの明確な蓄積がある。　しかし 、著者らはまだｐＳ２蛋白質を単離していなかった。ＭＣＦ−７細胞から確立し たｃＤＮＡライブラリーのエストラジオール誘導のスクリーニングは他の二つの クローン、　３６Ｂ４及び３Ａ５の単離も可能にした。これらの対応する遺伝子 は転写レベルでホルモンの制御を受けない。これらの二つのクローンは“定常° クローンと呼ばれた。従って３６８４及び３Ａ５プローブは、存在する全ｍＲＮ Ａ−５の量を調べるために使用でき、一方ｐＳ２プローブはＭＣＦ−７細胞の特 異的エストロゲン誘導ＲＮＡに対応する。　ｐＳ２ＲＮＡは、エストロゲン及び プロゲステロン　レセプターを有するが後者のレセプターの存在はコンスティテ ユーティブ（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）である、Ｔ４７Ｄヒト乳癌細胞から抽 出したＲＮＡには存在しない。　対照的に、３６Ｂ４ＲＮＡはＴ４７Ｄ細胞に存 在する。

ジエルチ（ＦＥＬＴＳＣＨ）らは［二ニークレイツクアシッド　リサーチ（ＮＵ ＣＬＥＩＣＡＣＩＤＲＥＳ、　’）　（１９８７）、旦、１４０１−１４１４］ 　続いて胎盤細胞及びＭＣＦ−７ラインの細胞のＤＮＡからヒトｐＳ２遺伝子を クローンし、その構造を研究し確立し、その結果上記細胞ラインから得られたｐ ８２Ｍクローン及び胎盤細胞から得られたｐＳ２ＰクローンをもとにｐＳ２遺伝 子の核酸配列を確認した。

ｐＳ２　ＲＮＡがヒト乳癌から派生したＭＣＦ−７細胞ラインで発現するが、Ｔ ４７Ｄ細胞ラインでは発現しないという観察から、ホルモン依存性乳癌を同定す る方法が示される。これが、ｐＳ２遺伝子の発現がホルモン依存性乳癌の検出の ための新たなマーカーとなり得るか否かを発明者がチェックしようと試みた理由 である。

より最近になって［リオ（ＲＩ　Ｏ）ら、　サイエンス（ＳＣＩ　ＥＮＣＥ）　 、（１９８８）旦１．ｐ、７０５−７０７１、ｐＳ２蛋白質が胃上皮の粘膜細胞 で検出された。胃液に分泌される蛋るものと同一の電気泳動の移動を示し、この 論文で報告された研究は、上記は二つの組織から単離されたｍＲＮＡ−５のサイ ズと配列が厳密に同一であることを示すと述べている。

ｍＲＮＡからｐＳ２蛋白質として決定された配列（Ｉ）は８４個のアミノ酸から 成り、分子量が９１４０ダルトンのオーダーであり、以下であることを思い出そ う：ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＴＨＲＭＥＴ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ 　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＶＡＬＬＥＵ　ＭＡＬ　ＳＥＲＭＥＴ　ＬＥＵ　Ａ ＬＡ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＴＨＲＬＥＵ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＬＡＧＬＮ　ＴＨＲ ＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＬＡ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＵ　ＡＲＧ 　ＧＬＮＡＳＮ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＲ ＯＳＥＲＧＬＮ　ＣＹＳ　ＡＬＡＡＳＮ　ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　Ｐ ＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＭＡＬ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＶＡＬＰＲＯＴＲＰ　 ＣＹＳ　Ｐ）ＩＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＰＲ ＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＰＨＥ（Ｉ） 今、これがｐＳ２ペプチドの分泌型ではないことが本発明者によって確立され得 た。

従って、本発明の目的は、　異なる組織で分泌されるｐＳ２ペプチドの実際上の 完全な一次配列を同定し、それにより遺伝子工学、特に適当なベクターと適当な 宿主内で合成して生産し、及び、とりわけ病理学的検出及び診断に使用できる抗 体を作成することを可能にすることにある。

本発明は上記で確認した配列（Ｉ）の蛋白質の６０個のアミノ酸に相当する断片 から成り、　分泌型に相当し、ＧＬＵが最初に確認された配列（Ｉ）の蛋白質の Ｎ−末端ＭＥＴから２５位下流に位置する配列ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＮに始まり 、分子量が約６６００ダルトンである、ペプチドに関する。

本発明によれば、６０個のアミノ酸を持つｐＳ２ペプチドは以下のアミノ酸配列 （Ｄ）を有する：ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨ ＲＶＡＬ　ＡＬＡ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＵＡＲＧ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　Ｇ ＬＹ　Ｐ）ＩＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＲＯＳＥＲＧＬＮＣＹＳ　Ａ ＬＡ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　、ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　 ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲ ＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　Ｇ ＬＵ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＰＨＥ（Ｄ） さらに本発明においては、配列（Ｄ）のペプチドは塩基性アミノ酸Ａｒｇ３６ｓ 　ＡｒｇＨｌ、Ｌ）’Ｓｓ４及びＡｒｇ６３の下流に位置する４個のトリプシン 分解部位を含有する。

本発明はさらに、配列（Ｄ）のペプチドをトリプシン分解部位で分解して得られ る、いわゆる“トリプシン　ペプチド類°に関する。

これらのトリプシン　ペプチド類のうち、本発明は特に以下を包含するニ ー配列ＣＤ）のペプチドの１２個のＮ−末端アミノ酸に相当するトリプシン　ペ プチド。

−ＧＬＮ、、からＬＹＳ５４にわたるアミノ酸配列に相当するトリプシン　ペプ チド。

るトリプシン　ペプチド。

一該ペプチドの２１個のＣ−末端アミノ酸に相当するトリプシン　ペプチド。

本発明は、さらにｐＳ２蛋白質が分泌された場合に、特に乳癌、及び胃の病理学 的状態の場合に、シグナル　ペプチドを構成する、ｐＳ２蛋白質の２４個のＮ− 末端アミノ酸に相当するペプチドに関する 本発明は、さらに配列（Ｄ）のペプチドの３１個のＣ−末端アミノ酸に相当する 断片から成り、　分子量が約３４５０ダルトンであるペプチドに関する。

本発明は、さらに配列（Ｄ）のペプチドの３０個のＮ−末端アミノ酸に相当する 断片から成り、　分子量が約３３００ダルトンであるペプチドに関する。

本発明は、さらに配列（Ｄ）のペプチドのＣ−末端の２８個のアミノ酸に相当す る断片から成り、分子量が約３１００ダルトンであるペプチドに関する。

本発明においては、シグナル　ペプチドは以下のアミノ酸配列（Ｇ）を有する： ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＴＨＲＭＥＴ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　Ｃ ＹＳ　ＡＬＡ　ＬＥＬＩ　ＶＡＬＬＥＵ　ＶＡＬ　ＳＥＲＭＥＴ　ＬＥＤ　ＡＬ Ａ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＴＨＲＬＥＵ　ＡＬＡ（Ｇ） 本発明においては、“トリプシン　ペプチド類′と呼ばれるペプチド断片は以下 のアミノ酸配列（Ｈ）、（Ｊ）。

（Ｋ）及び（Ｌ）に相当する： ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＬＡ 　ＰＲＯＡＲＧ（Ｈ） ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＬＹＳ （Ｊ） ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ（Ｋ ） ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲ ＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳ　ＧＬＵ ＰＩＥ（Ｌ） 本発明においては、３１個のアミノ酸から成る配列（Ｃ）のペプチドは以下のと おりである： ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　Ａ ＲＧ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　 ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＬＩＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳ 　ＧＬＵ　ＰＨＥ（Ｃ） さらに本発明においては、３０個のアミノ酸から成る配列（Ｅ）のペプチドは以 下のとおりである：ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　Ｔ ＨＲＶＡＬ　ＡＬＡ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＬＩＡＲＧ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ 　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＲＯＳＥＲＧＬＮＣＹＳ　 ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＬＹＳ （Ｅ） さらに本発明においては、２８個のアミノ酸から成る配列（Ｆ）のペプチドは以 下のとおりである。

ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　Ｐ ＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡ Ｌ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳＧＬＵＰＨＥ　（Ｆ） 本発明は、さらにウサギ又は他の適当な動物をｐＳ２蛋白質又はその断片に対し て免疫して得られる、抗ｐＳ２ポリクローナル抗体に関する。

本発明はさらに、適当な哺乳動物にｐＳ２蛋白質又はその断片を適切に注射して 免疫し、その動物の牌細胞を適当なミエローマの細胞と融合した結果得られるハ イブリドーマをクローニングして得られる抗ｐＳ２モノクローナル抗体に関する 。

もちろん、本発明の範囲内で保護される抗ｐＳ２モノクローナル抗体を得ること が可能である限り、モノクローナル抗体を得る他の方法が、本発明の構成に包含 される。

本発明は、さらにその液体に含まれる蛋白質を低温下、特に約−２０℃でアセト ンで沈殿させ、ペプチドを含む分画を回収するためにペプチドを含む装置をクロ マトグラフィで精製し、これを必要ならば凍結及び／又は濃縮する、生物起源の 液体から式（Ｄ）のペプチドを得る方法に関する。

本発明に従って式（Ｄ）のペプチドを得る方法を行う一つの態様では、生物起源 の液体を精製する前に、Ｍ　ＣＦ　−７細胞を取得し、エストラジオールの存在 下で培養し、培養上清を集め、含まれる本質的な残屑を除いた後、上記精製過程 に供する。

本発明に従って式（Ｄ）のペプチドを得る方法を行う他の態様では、使用する生 物起源の液体が胃組織から分泌された上記ペプチドを含む胃液であり、上記精製 過程に供する前にこれを約ｐＨ９，６の適当な緩衝液で中和する。

本発明に従って式（Ｄ）のペプチドを得る方法を行う有利な態様では、該ペプチ ドはｐＳ２蛋白質又はその断片に対する抗体を用いて、生物起源の液体又は上記 ペプチドを含む細胞の抽出物から免疫学的精製により単離する。

本発明は、さらにｐＳ２蛋白質及びその断片を合成、特に化学合成又は生合成に よって製造する方法に関する。

特に、メリフィールドによって開発された固相法［メリフィールドの方法は“ザ 　ペプチド：アナリシス、シンセシス、バイオロジー（ＴＨＥ　ＰＥＰＴＩＤＥ Ｓ　：Ａｎａｌｙｓｉｓ、５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　”第２巻 、パートＡｌ１−２５４頁、アカデミツク　プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ）、二ニーヨーク、中のイー、グロス（Ｅ、ＧＲＯ８Ｓ）及びジェイ、マイ エンホーバー（ＪｏＭＥ　Ｉ　ＥＮＨＯＰＥＲ）著、１９８０年刊“スペシャル 　メソッド　イン　ベブチドシンセシス　（Ｓｐｅｃｉａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　 ｉｎ、ＰｅｐｔｉｄｅＳ　ｙｎｔｈｅｓｉｓ）”に記載されている］又は他の合 成法（生合成、特に遺伝子工学）を用いることができる。

本発明は、さらにその組織で発現され得る式（Ｄ）のペプチド、その前駆体又は その断片を生じるある組織の病理学的状態を検出及び診断する、これらのペプチ ドの１つの存在がそのペプチドに対する抗体を用いた生物標本での免疫学的方法 によって検出される方法に関する。

本発明を効果的にする他の態様では、検出及び診断は体液を使用して行われる。

本発明による検出と診断の方法の一つの有利な実施態様では、ｐＳ２遺伝子の発 現が免疫細胞化学により検出される。

上記検出方法の他の有利な実施態様では、ｐＳ２遺伝子の発現が癌標本で検出さ れる。

さらに本発明による検出と診断の方法の他の有利な実施態様では、使用する癌標 本がとりわけ組織切片又はサイドシルでもよい。

この実施態様の有利な手法に従えば、使用する癌標本はパラフィンに包埋するこ とにより保存及び安定化されホルマリンで固定された組織切片であり、これは非 常に高度の感受性と低いバックグラウンドを診断法に与え、組織病理学的構造を 保存する。

本発明による検出と診断の方法の一つの有利な実施態様は、例で示せば、免疫細 胞化学的方法が以下の様にして行われる。即ち、非特異的染色を減らすためヒツ ジ（又は他の適当な動物）の血清とインキュベートした後、上記標本をｐＳ２又 はｐＳ２断片に対するウサギ（又は他の適当な動物）のポリクローナル又はモノ クローナル抗体と共にインキュベートし、その後続いて数回、　抗ウサギ　ヒツ ジＩｇＧの後ラベル化のための適当な系とインキュベートし、抗体を現出させる 。

本発明の有利な手法においては、ラベル化と抗体現出のための上記系はウサギＰ ＡＰ　（ベロキシダーゼ−抗ペロキシダーゼ）系を含むことができ、これと共に 上記標本をインキュベートした後、ＤＡＢ　（３，３−−ジアミノベンジジン塩 酸塩）とインキュベートシ、°これらの操作の後、必要ならば、切片をヘマトキ シリン又は類似物で染色し、得られた染色を染色強度スケール及び全癌細胞に対 するパーセントとして出した染色癌細胞の割合（１−１００％）で評価する。− 万乗色指数は染色された細胞のパーセントに染色スコアをかけて得られる（１− ３００）。

本発明はさらに、 −ｐＳ２蛋白質及び／又はその断片に対する適当な用量のポリクローナル又はモ ノクローナル抗体；−使用する抗体がそれに対するものである適当な用量のｐＳ ２蛋白質及び／又はその断片； −適当な用量のウサギ（又は他の適当な哺乳動物）の免疫クロプリンに対する抗 体； 一抗原抗体反応を進展させるための（特にＰＡＰ　（ペロキシダーゼ−抗ベロキ シダーゼ系）のような）酵素系；−酵素反応を進展させるための、特にＤＡＢの ような基質； −もしも生物標本が組織切片であり、それを染色する必要があれば、必要ならば 癌細胞を染色するための物質：及び 一検出及び診断試験を行うための有用な量の適当な緩衝液 から成る、免疫細胞化学によって病理学的状態を検出及び診断するための、レデ ィー−トウーユース　（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ　）キットにも関する。

もちろん、抗体を直接的又は間接的な方法でラベル化し現出させるための他の適 当な系（特に、サンドイツチ法、アビジンとビオチンのラベル化系の方法、蛍光 、燐光、プロテイネー）　（Ｐ　ｒｏｔｅｉｎａｔｅ）、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ、 その他）を用いることができる。

ある種の乳癌がホルモン依存性であることはよく知られているが、ＥＲ″Ｓ（エ ストロゲン　レセプター）を含む癌を有する患者のすべてでは無いが大多数がホ ルモン治療の利益を受けることができる。　一方、富ＥＲ（ＥＲ−ｒｉｃｈ）の 癌を有する患者の３０〜４０％がホルモン治療に負の反応を示すという事実は、 癌の非同−性又はＥＲ′Ｓが機能的でないという事実に帰された。さらに、正常 な生殖組織及び乳癌から派生したＭＣＦ−７細胞ラインにおけるその発現がエス トロゲン依存性であることが知られているＰＲ−ｓ（プロゲステロン　レセプタ ー）の割合の測定が、機能的レセプターを持つ癌を同定することを可能にし得る ことが示唆されている。実際、ＥＲ（＋）かつＰＲ（＋）の乳癌がすべてホルモ ン療法に反応するわけではない（８０％のみが反応する）。これは、ホルモン療 法の利益を受けられる乳癌をより容易に同定するために、ホルモン療法への反応 性に対する新たなマーカーが必要であることを示す。

本発明による検出及び診断法の有利な一実施憇様では、乳癌の検出に使用される 生物標本には同時にＥＲ−ｓ。

ＰＲ−ｓ、及びｐＳ２蛋白質又はその断片の一つの免疫細胞化学的検出を行い、 一方でＥＲ（＋）乳癌の新たな機能的不均一性（ＥＲ（＋）癌の約６０％だけが ＰＲ−ｓ及びｐＳ２遺伝子の発現にもまた陽性であること）を明らかにし、他方 でＰＲ＝ｓ及びｐＳ２の発現に関するＥＲ（−）癌の大きな同一性（約９６％に エストロゲン誘導性のこれら２つの遺伝子が発現しないこと）を明らかにする。

この実施態様の有利な手法に従って、ＥＲ及びＰＲの免疫細胞化学的検出試験は 一１８０℃で好ましくはイソペンタン中で凍結した組織切片を使用して行われる 。

ＥＲ′ｓ及びＰＲ−ｓの免疫細胞化学的検出のための実際の技術は既知であり、 文献に記載されている。

本発明を実施する他の手段では、胃の病理学的状態、特に癌と潰瘍が検出及び診 断される。

実際、本発明者は胃癌中に配列（Ｄ）のペプチドの存在を検出した。

この観察から、特に胃癌を検出し診断し、転移の起源を決めることが可能になる 。

本発明によれば、検出及び診断の方法は、本発明による抗体を用いた免疫シンチ グラフィによるある器官の病理学的状態のインビボでの測定に適用される。

本発明はさらに、本発明による−又は二以上の抗体を含む治療剤に関する。

本発明に於いては、上記抗体は他の治療剤と組み合わせても良い。

上記の手法に加えて、本発明は以下の記載から明らかになる他の手法も含有する 。

本発明は本発明の主題の実際の実施例に関連した以下の記載に基いて、より明確 に理解されるであろうが、いかなる場合もこれに限定されない。

しかし、これらの実際の実施例は本発明の詳細な説明するためにのみ示されてい るものであり、いかなる場合にも限定を意味するものではないことは言うまでも ない。

実施例１−ＭＣＦ−７細胞の産生ずるペプチド（Ｄ）の精製 ＭＣＦ−７細胞を１０−’Ｍのエストラジオール存在下で４日間培養する。

上記細胞により培養メディウム中に分泌されたペプチド（Ｄ）の豊富な培養上清 を集め、 一高分子量の蛋白質を沈殿させるための一２０℃のアセトン（ＩＶ）及び −このｐＨで溶解しない蛋白質を沈殿させるための（約ｐＨ１の）１２ＮＨＣ／ を引き続き作用させる。

装置を除去するために二つの沈殿を続いて遠心し、ペプチド（Ｄ）を含む上滑の みを得る。ペプチド（Ｄ）を含む、存在する他の蛋白質を沈殿させるため、この 上清を一２０℃の４倍量アセトンで処理する。遠心後上清を除去しペプチド（Ｄ ）を含む装置を集する。

装置を凍結乾燥し；凍結乾燥物に３ｍ／のＫＣ／緩衝液、５０ｍＭ　ＥＤＴＡを 加え、；続いて混合物をＧ３０００のＨＰＬＣと逆層ＨＰＬＣにかける。

各々１．５ｍ／の１２０個の分画を回収しウェスタンブロッティング（イミュノ フィンガープリント）にかける。

ペプチド（Ｄ）のＣ−末端アミノ酸３１個に相当する合成ペプチドに対するウサ ギ　ポリクローナル抗体を用いてペプチド（Ｄ）を含む分画を同定する。

陽性の分画をプールし、ブラウンリーーアクアポアー（ＢＲＯＷＮＬＥＥ−ＡＱ ＵＡＰＯＲＥ）　ＲＰ　３００型の逆層ＨＰＬＣに再びかけ、−２０℃で凍結す るか又は減圧下で遠心して濃縮する。試料を５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル でチェックし、硝酸銀で蛋白質を染色し現出させる。

純度８０％のペプチド（Ｄ）が単離される。

実施例２−胃粘膜細胞から分泌されるペプチド（Ｄ）の胃液からの精製 絶食中の個体から胃液を集め（ｐＨ１）、炭酸／重炭酸緩衝液でｐＨ９，６に中 和し、遠心して残屑を除く。上清）に 一上清の４倍量の割合の一２０℃のアセトンを作用させる。

遠心後上清を除去し、ペプチド（Ｄ）を含む装置を集め凍結乾燥する。

この装置をＧ３０００のＨＰＬＣにかける。回収した分画をウェスタン　ブロッ ティングで同定し、陽性の分画をプールし、減圧下で遠心し濃縮する。これらを 再びブラウンリーーアクアボアー　ＲＰ　３００型の逆層ＨＰＬＣにかけ、ドツ ト−プロットにより陽性の分画を同定し、減圧下で遠心し再濃縮する。

実施例３一式■の蛋白質及びその断片、とくに式（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（ Ｆ）のペプチドの合成これらの物質のそれぞれをメリフィールド（ＭＥＲＲＩＦ ＩＥＬＤ）の固層法を用いて合成する。凍結乾燥後、合成した蛋白質またはペプ チドを各々尿素／β−メルカプトエタノール混合物の存在下で還元し、脱塩して 塩を除去し、再び凍結乾燥し、これらのアミノ酸配列を確認した。

実施例４一式（Ｃ）のペプチドを用いたポリクローナル抗体の調製 蛋白質（Ｉ）のカルボキシ−末端の３１個のアミノ酸から成り、実施例３に従っ て合成されたペプチド（Ｃ）を、２週間間隔で３回、２００μｇの量で、ウサギ に腹腔内投与する。初めの２回は上記ペプチドをフロイント完全アジニバントに 混合して投与する。最後の投与の２週間後に血清を集め、適当に希釈して使用す る。

同じ方法を用いて、蛋白質（１）の全ての断片、特に式（Ｄ）、（Ｅ）及び（１ ’）のペプチドからポリクローナル抗体を調製する。

ビオッジ（Ｂ　１ｏｚｚｉ）マウスをｐＳ２蛋白質のＣ末端の２８個のアミノ酸 に相当する配列（Ｆ）の合成ペプチドで免疫した。

初めの２回の投与はグルタルアルデヒドによって（Ｆ−ＯＶＡ、　Ｎｅｏｓｙｓ ｔｅｍ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）卵アルブミンにカップルさせたペプチド（Ｆ ）（１００μｇ）を用いて行った。

得られたカップリング比は卵アルブミン１ｍｏ／に対しペプチド（Ｆ）２５ｍｏ ／である。その後、投与をペプチド（Ｆ）（１００μｇ）単独で続けた。この投 与は１５日ごとに全て腹腔内に、初めの投与にはフロイントの完全アジュバント を添加し、２回目と３回目の投与にはフロイントの不完全アジュバントを添加゛ して行った。３回目の投与の１０日後に動物の目から１滴の血液を採り、凝固後 に得られた血清を、精製しヨード化したペプチド（Ｄ）に対するＲＩＡで試験す る。もしも血清の力価が適当ならば、マウスに２回、融合の２日及び４日前に再 投与する。

もしも血清の力価が適当でなければ、試験が陽性になるまで３週間ごとにマウス に再投与する。

Ｂ）ハイブリドーマの調製 ２個の牌細胞に対し１個のミエローマ細胞の割合テ、Ｘ６３ミエローマ細胞を用 いてＰＥＧ存在下で融合を行った。得られたハイブリドーマを２４ウエルのプレ ート３個に分配した。融合の４時間後にＨＡＴを培養メディウムに添加すること により、ハイブリドーマを選別することができる。培養をマクロファージの存在 下で続けた。融合の８日後に、培養上清に最初の試験を行った。上記試験は血清 に行ったものと同一であり、　即ち天然の蛋白質に対するＲＩＡ技術を用いる。

さらに産生じた抗体のクラスを厳密なサブクラスに対する第二抗体を用いるＥＬ 　Ｉ　ＳＡ技術によって決定した。

−又は二個以上のハイブリドーマを含む１３ウエルを以下の方法で選別した：　 そのうち４個、即ちＣｌＢ５、ＣｌＢ６、ＣｌＣ４及びＣｌｌＩＤ５をクローン した。初めのクローニングの後、　両方ともＲＩＡ−陽性であるＣｌＣ４１２及 びＣｌＩＤ５−２ＣＩ）りｏ−＞を再びクローンした。この２回目のクローニン グの後、ペプチド（Ｆ）に対する抗体を含むＣｌｌＩＤ５−２０から１２個のク ローンのうち１０個を再培養した。　これらのうちＣＩ　Ｉ　Ｄ５−２０　９　 （ｐ２８＋　０２　）　ヲ培養基準（：従ッて選択した。他方のクローニングが １２個のうち３個しが陽性クローンを検出できなかったので、３回目のクローニ ングを行い、１２個のクローンのうち１１個が陽性であった。上記のように、こ れらのうちから１個を選択した二〇　Ｉ　Ｃ４−１２−４−７（１）２８２０３ 　）。

得られたクローンの幾つかは、乳癌生検切片上の配列（Ｄ）のペプチドの免疫組 織化学の検出に優れた結果を示し、この検出は合成ペプチド、特にペプチドＣＣ ）に対するポリクローナル抗体で既に得られていたものに、全ての点で同一であ る。

Ｃ）ペプチド（Ｄ）に対する抗体を検出するためのＲＩ　Ａ　（ｒａｄｉｏｉｍ ｍｕｎｏａｓｓａｙ）ペプチド（Ｄ）の存在の確認及びハイブリドーマの選択に 使用したＲＩＡは以下のように行った：ＭＣＦ−７培養メディウムからペプチド （Ｄ）を抽出した後、ＨＰＬＣを繰り返して部分的に精製した。こうして８０％ のペプチド（Ｄ）を含む分画が得られる。その後、この濃縮された分画をクロラ ミンＴ法によりヨード１２５（ＯＲＩ　Ｓ　Ｌａｐａｍ）でラベルする。　ラベ ル化の収率は２０００Ｃｉ／ｍｍｏ／のオーダーである。

ヨード化したペプチド（Ｄ）を、セファロースＣＮ４Ｂにウサギ　ポリクローナ ル抗体をカップリングして調製したアライニティ　カラムに通し、遊離ヨードか ら分離する。

ペプチドはｐＨ２，８のＩＣ／−グリシン　メディウムに溶離させて回収する。

その後これを部分に別けて、使用に備える。

試験では以下を加える： ２００μｔのＰＢＳ　ＢＳＡ　０．３％、１００μ／の１２５　Ｉ　（Ｆ）　） レーサー（約３０．０００ｃｐｍ）及び供試抗体を含む１００μｌのメディウム 。

混合液を振盪し室温で一昼夜放置する。

次の日に以下を加える： ５０μンのＮＨ８（正常ヒト血清）及び５０μ２のＡＭＳＳ（抗マウス　ヒツジ 血清）。

混合液を振盪し室温で１５分間放置する。

これを１５分間３０００ｒｐｍで遠心しく　Ｊ　ｏｕａｎ）　、装置をガンマ　 カウンターでカウントする。

各回の試験について以下を調製した。

−使用する最大のｃｐｍ（約３０，０００ｃｐｍ）を与える、ヨード化ペプチド のみを含む試験管（Ｔ）；及び−操作のバックグラウンド（約６００ｃｐｍ）を 与える、抗り抗体を加えない試験管（ＮＢＳ）。供試血清は１／１００及び１／ １０００に希釈する。

実施例６−配列（Ｄ）のペプチドの特徴付はエストラジオール存在下で培養した ＭＣＦ−７細胞の７０から９０％融合した単一層を３５８−システィン（添付し た第１図を参照）又は３５Ｓ−メチオニン（添付した第２図を参照）でラベルし 、メディウムを細胞抽出物と共に一定の時間間隔で集めた。部分をｐＳ２抗血清 で免疫沈殿させ、１５から２５％の５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲルで分析し た。３５Ｓ−システィンに関する時間経過は（第１図、Ａ及びＢ）、約７ＫＤに 位置する単一バンドの存在を示す。

細胞抽出物中には（第１図のパートＢ）、１５分のラベル化でシグナルを既に見 ることができる。全培養メディウムの同一部分に相当するメディウムの試料を分 析すると（第１図のパートＡ）、シグナルはラベル化の１時間後に見られるよう になった。このことは、分泌過程にいくらかの遅れのあることを示唆する。第１ 図Ｃでメディウム中のペプチド（Ｄ）の免疫沈殿は（レーン２）、ペプチド（Ｄ ）のバンドが合成ペプチド（Ｃ）（レーン１）に競合することを示し、特に注意 を要する。

対照的に、３５Ｓ−メチオニンによるラベル化及び抗血清での免疫沈殿の後には 、ペプチド（Ｄ）に期待される大きさのバンドが、メディウム中にも或いは細胞 抽出物中にも、どの経過時間にも検出できなかった（第２図、パー）Ａ）。

ゲル上部に存在するバンド　パターンは非免疫的対照血清を使用した後も残り（ レーン７及び１５）、合成ペプチド（Ｃ）を添加して免疫沈殿反応を行っても競 合しなかった。

このことは、それが非特異的吸収に相当することを示唆する。　さらに培養メゾ 、イウムと細胞抽出物とを免疫沈殿なしに３５８−システィン（第２Ｂ図、レー ン１及び４参照）又は３５Ｓ−メチオニン（レーン５）でラベル化した後分析し た。培養メディウム中に、メチオニンによってラベル化されず（レーン２）、シ スティンによってラベル化される（レーン１）１つのバンド（矢印で示す）が明 確に見え、それは免疫沈殿したペプチド（Ｄ）（レーン３）と同じ位置に移動し た。対照的に、全細胞抽出物の中には他と区別されるラベルは無かった。このこ とは、この位置に移動する分子量の蛋白質がペプチド（Ｄ）に相当しないことを 示唆する。

上記の結果から、ｃＤＮＡから推測されたｐＳ２蛋白質の配列のアミノ末端に位 置する３個のメチオニン残基はシグナル　ペプチドに属し、これは迅速に分離す る、という　。

仮説の基礎が形成される。

第１図は３５Ｓ−システィンによるペプチド（Ｄ）のラベル化の時間経過を示す 。　パー）ＡとパートＢは共に、ＭＣＦ−７細胞をエストラジオール及びフェノ ール　レッドの存在下で培養し、異なる時間：レーン１〜６でそれぞれ１５分、 ３０分、１時間、２時間、４時間及び６時間３５Ｓ−システィンでラベル化した ものを示す。全培養物と同一の画分に相当する、一部のメディウム（２００μ２ ）（パートＡ）及び細胞抽出物（２５μ／）　（パートＢ）を免疫沈殿した後、 １５〜２５％の勾配の５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル及びフルオログラフィ で分析した。Ｍは分子量マーカーを示す。パートＣは１６時間の３５Ｓ−システ ィンによるラベル化を示し：レーン２はメディウムの一部の免疫沈殿；レーン１ は競合する合成ペプチド（Ｃ）が存在する以外はレーン２と同様である。

第２図のパートＡは３５Ｓ−メチオニンによって、メディウム中（レーン１〜８ ）及び細胞抽出物中の（レーン９〜１６）ペプチド（Ｄ）をラベルする試みを示 す。実験は第レーン０は第１図Ａのレーン５と同一であり、ラベルする時間は示 した通り、１５分、３０分、１時間、２時間、３時間、４時間及び６時間であっ た。免疫沈殿は非免疫血清（メディウムはレーン７、細胞抽出物はレーン１５） 又は免疫血清を用い、競合する合成ペプチド（Ｃ）の存在下で（メディウムはレ ーン８、細胞抽出物はレーン１６）行った。Ｍは分子量マーカーを示す。

パートＢ：ペプチド（Ｄ）はメディウム中に直接検出できる。ＭＣＦ−７細胞に よる蛋白質の合成は３５Ｓ−システィン（レーン１及びレーン４）または３５Ｓ −メチオニン（レヘン２及び５）の存在下で行った。細胞はフェノールレッド及 びエストラジオールの存在下で培養し、６時間ラベルした。同じ数量の沈殿カウ ントのＴＣＡを含むメディウム及び細胞抽出物の部分を直接１５〜２５％の勾配 の５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲルで分析した。レーン１及び２：培養メディ ウム；レーン４及び５：細胞抽出物。

レーン３及び矢印：インビボで３５８−システィンでラベルした免疫沈殿ｐＳ２ 蛋白質。

パートＣ：ペプチド（Ｄ）を１４Ｃ−ロイシンでラベルする試み。エストラジオ ール及びフェノール　レッドの存在下で培養したＭＣＦ−７細胞を１４Ｃ−ロイ シンで６時間ラベルした。培養メディウム（レーン２）または細胞抽出物（レー ン３）の２００μ２を第１図及び第２図Ａと同様に免疫沈殿した。レーン１及び 矢印はインビボで３５８−システィンでラベルした免疫沈殿ペプチド（Ｄ）の位 置を示す。

フィルム暴露：２ケ月。

実施例７−ＭＣＦ−７細胞から単離したペプチド（Ｄ）フリートマン法によって システィンを還元及びアルキル化してＳ−（β−ピリド−４−イレチル）システ ィンを形成した後、トリプシンで分解し、６個の主なペプチドを得、これを０８ 逆層クロマトグラフィで分離する。

システィンは、“トリプシン分解で得たそれぞれのペプチドが少くとも一つのＳ −（β−ピリド−４−イレチル）システィンを含むように蛋白質中に分布し、　 これは２５４ｎｍの波長で測定される。

この方法からＴ１〜Ｔ６と呼ばれる６つのトリプシン断片を得られる。（第５図 、上方の曲線）第５図は、Ｓ−（β−ピリド−４−イレチル）システィン残基を 持つ胃液（ｐ８２Ｇ）　及びＭＣＦ−７細胞（ｐ　８２Ｍ）から単離したペプチ ド（Ｄ）のトリプシンペプチドを、０．１％のＴＦＡ溶液（トリフルオロ酢酸、 ｐＨ２）を含む緩衝液で平衡化したアクアポア　ブラウンリー　ＲＰ３００　マ イクロポア　カラム　（７μＣ８／２、ＩＸ３０ｍｍ）のクロマトグラフにかけ て分別したものを示す。カラムは０．　１％のＴＦＡを含むアセトニトリ、　ル からなる緩衝液Ｂの０〜８０％の勾配で６０分間溶出した。カラムへの添加量は Ｏ，１ｍ／　／ｍｉ　ｎであり、異なるペプチドを２５４ｎｍの吸光度で、出現 する時間の関数として検出した。

これらのトリプシン　ペプチドを配列決定し、ＭＣＦ−７細胞から単離したペプ チド（Ｄ）のマツプを得た（第６図）。　第６図はｐＳ２蛋白質の配列であり、 ペプチド（Ｄ）を生じるシグナル　ペプチダーゼによる分解部位（↑）、トリプ シンによる分解部位（ム）、これら２つの酵素に帰されない分解部位（△）を示 す。

このペプチドの配列から、塩基性アミノ酸Ａｒｇ、６、Ａ　ｒ　ｇ　３ｇ、Ｌ　 Ｙ　Ｓ　５４及びＡ　ｒ　ｇ　６３の下流に位置する４個のトリプシン分解部位 を決定できる。

従ってトリプシンの作用は以下の５ペプチド：ＧＬＵ２５Ａ　ＲＧ　ｓ　ｂ、Ｇ ＬＵ３７　ＡＲＧ３８、ＧＬＮ３．−ＬＹＳ、４、ＧＬＹ５５　ＡＲＧ６３及び ＧＬＹ６４　ＰＨＥ８４を生じる筈である。実際、観察された６ピー、りのうち 、Ｔ１、Ｔ３及びＴ４のみは予期されるトリプシン　ペプチド：それぞれＧＬ　 Ｕ　２．−　Ａ　ＲＧ　３６、ＧＬＹｓｓ　ＡＲＧｂ３及びＧＬＮ、、−ＬＹ　 Ｓ　、４に相当する。

他のピーク（Ｔ２、Ｔ５及びＴ６）は予期されない分解から生じるニ ーＴＲＰ６．と０７８６８間の分解はｐ５２Ｍ分子のただ３０％のみに生じ、ト リプシン標品へのキモトリプシンの混入から発生する； −Ａ　Ｓ　Ｎ７□とＴＨＲ，、間の分解はトリプシンからもキモトリプシンから はも生じず、トリプシンと共に分泌され、又は混入するペプチダーゼの作用であ る。

さらに、ジペプチドＧ　Ｌ　Ｕ　３７Ａ　ＲＧ　３ｓはカラムに保持されるには 小さすぎ、そのため検出されず、その存在は修飾しない蛋白質の配列から推定さ れた。

これらのトリプシン　ペプチドの末端と末端を繋いで得られた配列と８４個のア ミノ酸の修飾しない蛋白質の配列との比較から、シグナル　ペプチダーゼは初期 蛋白質を、Ｎ−末端メチオニンの２４位下流に位置するＡＬＡ残基の後ろで切断 することが示された。従って分泌型はＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＮの配列から始まる 。

実施例８−胃液から単離したペプチド（Ｄ）（ｐＳ２Ｇ）の配列決定 胃液から単離したペプチド（Ｄ）（ｐ８２Ｇ）の配列決定における、システィン の還元とアルキル化及びその後のトリプシン溶解のプロトコールは、ｐ８２Ｍの 配列決定に用いたものと同一である。

得られた溶解物のクロマトグラフィは、ｐＳ２Ｍの場合に得られたものと比較し て、二三の相違点のあるトレースを示した。

一断片Ｔ１、Ｔ３、Ｔ４及びＴ６を配列決定し、これらは両者で同一であった。

−７２及びＴ５に相当する配列はこの場合発見されなかった。

御所たなビークＴ７から配列は得られなかった。

ｐＳ２Ｍ標品と比較してＴ２ペプチドの不存在は、このペプチドが混入の結果で あることから、驚くべきことではない。

従って、シグナル　ペプチダーゼによる分解部位は、２つの異なる型の細胞から 単離したペプチドで同一である。

蛋白質のＮ−末端に位置するＧＬＵ残基に関して、ｐ８２Ｍとｐ８２Ｇの相違が 見られた。実際、ｐ８２Ｇの場合、このアミノ酸は環化してビロー７ＧＬＵを形 成し、修飾しない型で配列決定することを妨げている。しかし、トリプシン　ペ プチドのＮ−末端は配列決定でき、このことは、このＮ−末端がブロックされて ないことを示唆している。

実施例９−ペプチド（Ｄ）の免疫細胞化学的検出１）組織切片の調製 手術標本を薄片に切り、これをＥＲ−ｓ、ＰＲ−ｓ及びペプチド（Ｄ）の免疫細 胞化学的検出に使用した。ＥＲ−５及びＰＲ−ｓの免疫細胞化学的検出のための 標本はイソペンタン中で一１８０℃で凍結し、一方ペプチドＣＤ）の免疫細胞化 学的検出のための標本はパラフィンに包埋し、１０％ホルマリンで２４時間固定 した。

２）ペプチド（Ｄ）の免疫細胞化学的染色パラフィンに包埋し、ホルマリンで固 定し標本を切片に切り、パラフィンをトルエンで除去し、標本を無水エタノール で完全にすすいだ。水とＰＢＳで洗浄後、切片をヒラ中に２．５％溶解）と共に インキュベートして非特異的染色を減じた。抗ペプチド　ウサギ　ポリクローナ ル抗体（１：６４０の濃度）と共にインキュベートした後、切片を抗ウサギ　ヒ ツジＩｇＧ″Ｓ及びウサギベロキシダーゼ−抗ペロキシダーゼ系と共に、ＩｇＧ ＝ｓは１：１０の濃度で、ベロキシダーゼ−抗ベロキシダーゼ系は１：５０の濃 度で順次インキュベートした。各々のインキュベートの後にはＰＢＳで洗浄した 。最後のＰＢＳ洗浄後、　切片をＤＡＢでインキュベートし、１：１０の濃度の ヘマトキシリンで染色した。ＥＲ−ｓ及びＰＲ−ｓの免疫細胞化学的測定は凍結 切片で、各々アボット（Ａ　ｂｂｏｔ）及びトランスビオ（Ｔ　ｔａｎｓｂｉｏ ）から供給されたモノクローナル抗体キットを用いて、これらの供給者の推薦す る方法に従って行った。染色強度は４−ポイント　スケール（０〜３＋）で評価 し、染色陽性の癌細胞の割合を全癌細胞に対するパーセント（１〜１００％）で 表した；染色指数は染色された細胞のパーセントに染色スコアに掛けて算出した （１〜３００）。

３）ペプチド（Ｄ）染色試験は乳癌細胞切片及び転移結節切片で細胞質的である ことが分った（第３図、バートＡ、Ｅ及びＦ）。しかし、染色の細胞質的分布は 一様でなく、しばしば核付近に濃縮が見られ（第３図バートＦの矢印参照）、こ れはペプチド（Ｄ）が分泌するとして知られているゴルジ装置に相当するもので あろう。さらに、染色強度は与えられた切片の区域の中でも細胞ごとに異なって いた（第３図Ａ及びＦ）。同様のことがＥＲ−ｓの特異的核染色でもいえた（第 ３図Ｂ）。しかし、全ての乳癌がペプチド（Ｄ）の特異的な染色に対して陽性で あるわけではない。

抗原を生じる時に使用した合成ペプチドの一つ（この場合このペプチドは、３１ 個のアミノ酸からなるペプチド（Ｃ））と競合させると抑制されることから、こ の染色はペプチド（Ｄ）に特異的であることが分った（第３図パートＣ）。

さらに、正常の小管上皮（ｄｕｃｔｕｌａｒ　ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ＞細胞（第 ３図の“Ｎ”）及び良性の乳腫癌細胞は染色されなかった。

ペプチド（Ｄ）の染色指数と、文献記載のＲＮＡのノーザン　プロット　分析か ら決めたｐＳ２　ｍＲＮＡの強度得点との間に、良い相関が見られた。このこと はペプチド（Ｄ）の存在が、文献中でＭＣＦ−７乳癌細胞ラインを用いて既に示 されている転写の増加を、非常に良く反映することを示唆する。この誘導がＥＲ 依存性であることが、ペプチド（Ｄ）の染色指数とＥＲ−ｓの染色指数との間の 良い相関から、強く支持される（第４図及び第１表参照）。

このことから、乳癌でのｐＳ２遺伝子の発現が、ＭＣＦ−７細胞ラインの場合の ように、エストロゲンに依存する可能性が極めて高いことが結論できる。

実施例１０−エストロゲン及びプロゲステロン　レセプター、及びｅｒｂＢ−２ 腫瘍遺伝子の発現に対するｐＳ２遺伝子の相対的発現 添付した第１表は、１８０の乳癌標本について得られた結果の要約を示す。これ らについては、ＥＲ″Ｓ（エストロゲン　レセプター）、ＰＲ−ｓ（プロゲステ ロン　レセプター）、ｐＳ２遺伝子（ｐ　Ｓ　２）及びｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子 の発現に関して、少数の例外を除いて全てのパラメーターを明確に決定した。Ｅ Ｒ″ＳとＰＲ″Ｓの割合は以下の全アッセイを使用して決定し：　ＥＲ−ＤＣＣ ，ＰＲ−ＤＣＣＳＥＲ−ＩＣＡ及びＰＲ−ＩＣＡ、例外として７例、即ちＥＲ（ ＋）　、ＰＲ（−）かつｐＳ２（＋）、のうち２例はＰＲ−ｓをＰＲ−ＤＣＣの みで試験した［Ｄ　ＣＣ＝デキストランーコーテッド　チャーコール　ステロイ ド　パインディング　アッセイ：　ＩＣＡ−免疫細胞化学アッセイコ。ｐＳ２遺 伝子の発現はｐＳ２　ｍＲＮＡ及びｐＳ２−ＩＣＡを用いた分析を使用して決定 した。ｅｒｂＢ−２遺伝子の過剰発現（陽性）と非検出又は非常に少ない程度の 発現（陰性）はｍ　ＲＮ　Ａを用いた分析によって決定した。

腋下リンパ節（Ａ　Ｌ　Ｎ）の転移の分布は第１表最右欄に示す。ＥＲ（＋）及 びＰＲ（＋）はＥＲ及びＰＲ試験の少なくとも一つを使用して陽性であった標本 に相当する；ｐＳ２（＋）はｐＳ２　ｍＲＮＡ及び／又はｐＳ２の免疫細胞化学 アッセイ（通常両者）で陽性の標本に相当し、ｅｒｂＢ−２−（＋）の過剰発現 はｍ　ＲＮ　Ａを用いた分析から決定した。

蒐−よ−宍 ＡＬＮ　（＋）は一つ以上の転移リンパ節の存在を示す。

０中に示したパーセントは全腫瘍数（１００症例）に対するものであり、一方［ ］中に示したパーセントはＥＲ（＋）腫瘍（１２９症例、第１表上部）又はＥＲ （−）腫瘍（５１症例、第１表下部）に対するものである。

全ての乳癌は、第１表に示すように、重要性の異なる６つのサブクラスに分類で きる。７２％の腫瘍はＥＲ（＋）であり、その内８８％はＰＲ（＋）で１２％は ＰＲ（−）である。しかし、ＰＲ（＋）癌の全てがｐｓ２（＋）である訳ではな く、またＰＲ（−）癌の全てがｐＳ２（−）である訳ではない。実際、ＥＲ（十 ）腫瘍のただ６２％のみがＰＲ及びｐＳ２の発現が共に陽性であり、２６％のＥ Ｒ（＋）腫瘍がＰＲ（＋）でｐＳ２（−）であった。さらに、幾つかのＥＲ（＋ ）　、ＰＲ（−）腫瘍はｐＳ２（＋）或いばｐＳ２（−）であった。これらの観 察は、ＭＣＦ−７細胞においてＰＲ遺伝子とｐＳ２遺伝子の両方の転写がエスト ロゲンによって誘導されることを考えると、非常に興味深い。このように、ＥＲ ，ＰＲ及びｐＳ２遺伝子の発現の同時決定はＥＲ（＋）乳癌の新たな機能的非同 −性を明らかにする。このことは、ＰＲ遺伝子とｐＳ２遺伝子の両方を誘導でき るものと、そのどちらも誘導できないものの、ＥＲ″Ｓ自身の不均一性、又はエ ストロゲンに対するＰＲ及びｐＳ２遺伝子の反応能力の不均一性を反映するので あろう。一方ＥＲ（−）癌は、９６％のそれがエストロゲンに誘導され得るこれ ら２つの遺伝子をどちらも発現しないことから、ＰＲ及びｐＳ２の発現に関して 非常に均一であるように見える。過剰のｅｒｂＢ−２発現もまた種々のサブクラ スに分布した。ＥＲ″５ＳＰＲ’ｓ及びペプチド（Ｄ）の免疫細胞科学的測定は 、そのエストロゲンに対する反応性と、結果として、乳癌のホルモン療法に対す る適応性に関して、腫瘍の不均一性を評価するために非常に有用であることを強 調すべきである。

実施例１１−細胞質中のペプチド（Ｄ）の測定乳癌から生体穿刺又は組織粉砕で 得、ホルモン　レセプターの測定で記載したように１．５ｍＭのＥＤＴＡ、１０ ｍＭのモノチオグリセロール及び１０ｍＭのモリブデン酸ナトリウムｐＨ７，４ を含む１０ｍＭのトリス緩衝液中に凍結した標本から、細胞質を調製する。これ は細胞質の特定のプレバレージョン無しで、既に常法により測定したレセプター に加えてペプチド（Ｄ）の測定を可能にする。

上記記載から、本発明は決してこれらの具体的方法、実施態様及び、上記適用方 法に限定されないことは明らかである；反対に、本発明の精神及び範囲から外れ ることなく当業者がなす全ての変更を包含する。

ｉｌｌ　−４３ｋＤ　−４３ｋＯ ＠＠　−２５，７−２５，７ ４−１８４−１８，４ 吸光度 全ｘケール　：　１５０ｍＡＵ 手続補正書印制 平成２年３月２３日圀 特許庁長官　吉　１）文　毅　殿 １　事件の表示 ＰＣＴ／ＦＲ８８１００５３１ 、発明の名称 種々の病理的状態に於いてＰＳ２遺伝子から特異的に発現される蛋白質及びその 断片、該蛋白質及び／又はその断片から得られる抗体、並びに病理的状態に対す る検出、診断及び治療への該蛋白質、その断片及び抗体の適用 ３　補正をする者 事件との関係　特許出願人 アゾレジエム ４代理人 大阪市中央区平野町２−１−２沢の鶴ビルｆｆ１０８（２０３）０９４１ 補正の内容 １　請求の範囲の記載を別紙の通りに訂正する。

２　明細書第１頁下から第１６〜１７行に「及び胃癌又は胃潰瘍」とあるを「及 び消化管の癌又は急性炎症状態」に訂正する。

３　明細書第１８頁第１３行に「免疫細胞化学」とあるを「免疫測定」に訂正す る。

４　明細書第１８頁第１８〜１９行に［プロテイネー）　（Ｐｒｏｔｅｉｎａｔ ｅ）　Ｊとあるを「プロティンＡ」に訂正する。

５　明細書第１９頁第１８〜１９行に「免疫細胞化学的検出」とあるを「免疫学 的検出」に訂正する。

６　明細書第２０頁第３〜５行に「従って、・・・・・・・・・使用して行われ る。」とあるを［従えば、ＥＲ及びＰＲの免疫学的検出試験は、−１８０℃で好 ましくはイソペンタン中で凍結した組織切片を使用して行われる免疫細胞化学的 検出試験である。」に訂正する。

７　明細書第２０頁第６行に「免疫細胞化学的検出」とあるを「免疫学的検出」 に訂正する。

８　明細書第２０頁第８行に「胃の病理学的状態」とあるを「消化管の病理学的 状態」に訂正する。

９　明細書第２０頁第１０行及び第１２行に「胃癌」とあるを「消化管症」に訂 正する。

１０　明細書第２０頁第１９〜２０行に「組み合わせても良い。」とあるを以下 の通りに訂正する。

「組み合わせても良い。

種々の媒体から抽出した天然蛋白質に対するのみでなく、合成ペプチドＤに対す るモノクローナル抗体も本発明に従い獲得し、それにより本発明はｐＳ２蛋白質 の定金的測定を可能にした。

上記モノクローナル抗体はＲＩＡでの使用、特に −測定したい試料中に含まれる抗原と放射標識した天然蛋白質との間に競合反応 をつくることを含むＲＩＡ −ｐ５２分子の異なる２つのエピトープに対する２種のモノクローナル抗体を使 用するＲＩＡ、このような“サンドイッチ”法においては、使用する抗体の一方 を放射標識し、精製したｐＳ２は必要でない のＲＩＡでの使用に優れている。　」 １１　明細書第４２頁第１９行に「上記記載から」とあるを以下の通りに訂正す る。

「実施例１２−ペプチド（Ｄ）の放射免疫アッセイ ペプチド（Ｄ）のアッセイは固相での“サンドイッチ”法の原理に基いて行う。

ＭＣＦ−７培養上清から精製したペプチド（Ｄ）に対し、２種のモノクローナル 抗体を調製した。これら２種のモノクローナル抗体（ＢＣ６及びＢＣ４）はペプ チド（Ｄ）の異なる２つの部位を認識する。

一次抗体ＢＣ６はＥＬＩ　ＳＡの固相に吸着させ、二次抗体ＢＣ４はヨード１２ ５でラベルしトレーサーとして使用する。スタンダードまたは試験試料中に含ま れるペプチド（Ｄ）は、２種のモノクローナル抗体に“サンドイッチ”される。

エストロゲン及びプロゲステロン　レセプター測定時の調製と同じ方法で、腫瘍 標本から調製したサイドシルを測定試料とする。

試験は一次モツクローナル抗体を吸着させたＥＬＳＡチューブに、モノクローナ ル抗体トレーサー３００μｍ及びスタンダード又は試料２０μｍを加えて行う。

チューブを攪拌し、１８〜２５℃で１時間、攪拌しながらインキュベートする。

３回の洗浄を含むステップで過剰のトレーサーを除去する。

このようにして、吸着抗体／抗原／ラベル抗体の複合体のみがＥＬＳＡ上に残る 。チューブをガンマ　カウンターでカウントする。各測定でｉ）チューブに入れ られた全ｃｐｍを与える、ヨード化トレーサーのみを含む（Ｔ）チューブシリー ズ及びｉｉ）操作のバックグラウンドを与える、ペプチド（Ｄ）を含まない試料 をアッセイする（ＮＳＢ）チューブシリーズを用意する。

ＥＬＳＡに結合した放射活性は初めにチューブに存在していたペプチド（Ｄ）の 量に比例する。

サイドシルｐＳ２蛋白質に関する予備試験本実施例に記載した“サンドイッチ” 法によるｐＳ２蛋白質の測定を約１００個のサイドシルについて行い、同じサイ ドシル抽出物についてＥＲ及びＰＲ値も得ることができた。これはＥＲ，ＰＲと ９８２間の良好な相関及びサブポピユレーションＥＲ（＋）ＰＲ（＋）　ｐＳ２ （−）の存在を示し、免疫細胞化学により既に得られていたデータを確かなもの にした。

ＲＩＡ法は定量的であるため、免疫細胞化学よりも有利である。

実施例１３−尿中ｐＳ２の測定 血中マーカーの測定は、第一に危険な患者達を診断又はスクリーニングするため に、第二には疾患を追跡し再発及び転移を早期に発見するために非常に興味深い ことである。乳癌に関しては現在、患者のスクリーニングに使用できるマーカー は記載がない。一方、血中マーカーの殆どは、それらを関連させることにより、 予後の異なるサブグループを明らかにし、幾つかの場合には最初の臨床徴候が現 れる前に再発を明らかにすることを可能にする。

予備試験として、何人かの乳癌患者の尿中に分泌されたｐＳ２蛋白質を、試料の 濃縮を含む操作の後“ウェスタン　ブロッティング法により検出した。この予備 試験の後、上記ＲＩＡの方法により、乳癌を有する婦人患者及び見掛上の健常人 の尿について本蛋白質を夫々測定した。

１）正常人 正常と見られる婦人の尿中に観察されたｐＳ２量は経時的に安定であり、月経周 期のホルモン変化に非感受性であり、各個人に特有の値に対応する。一方、その 値は各婦人の間では、ある決められた限度内で変化する。妊娠期間中、尿中ｐＳ ２量は増加し、出産の数週間後には正常値に戻る。

正常人では尿中ｐＳ２は、ｐＳ２遺伝子が発現する胃組織からのエストロゲン非 依存性の分泌によルノテあろう［Ｍ、Ｃ，ＲＩＯｅｔ　ａｌ、、５ｃｌＥＮｃＥ 。

匪７０５（１９８８）参照コ。

２）乳癌患者 正常人から採取した尿の分析により、陽性の域値を確立することができた。正常 人群の９９％がこの域値以下であった。

これに対して、免疫細胞化学でｐＳ２陽性の腫瘍を有する患者の幾人かに於いて 、異常に高レベルの尿が観察された。

手術後のアジュバントの選択は、異なる分析結果が知られた後は統計的基準に基 くため、常に困難である。例えば、この様にしてステロイドホルモン　レセプタ ーを有する婦人の８０％がホルモン療法に反応するが、反応しない２０％に入る 婦人を知ることはできない。

これまでの研究で、ＭＣＦ−７ホルモン依存性乳癌細胞の培地にタモキシフェン を添加するとｐＳ２蛋白質の発現が抑制可能であることが示されている。このこ とから本発明者らは、診断時に高い尿中ｐ８２レベルを示す患者の場合、手術前 処置としてタモキシフェンを２〜４週間投与し、尿中ｐＳ２レベルの変化を追跡 してその効果を調べることは興味深いことであると考えた。処置前に高い尿中ｐ Ｓ２レベルを示した患者の数人に、ｐＳ２Ｓ２Ｏ低下が見られた。

４）再発または転移の検出 さらに本発明者らは、手術の後比較的長期間（３か月〜４年）タモキシフェンを 投与された２２人の患者について尿中ｐＳ２レベルを調べた。２年以上投与され た患者からの標本のうち３個が高濃度のｐＳ２を含んでいた。臨床検査の結果、 １人の患者に局部的再発の証拠が、もう１人の患者に転移の存在が検出された。

さらに両症例共、ＣＡ１５−３及びカルジノエンブリオニック抗原（ＣＥＡ）は 増加していなかった。第三の症例は投与中に二次的影響が現れた（卵巣嚢胞）患 者であった。

同じＲＩＡを用いて消化器疾患、特に潰瘍性疾患：クローン病、十二指腸・胆嚢 ・巾乗潰瘍及び出血性直腸結腸炎を示す集団の尿を調べた。

尿は高いレベルのｐＳ２を示した。潰瘍領域の各サイドに位置する領域は、免疫 細胞化学的分析によりｐＳ２陽性であったが、正常組織は陰性であった。さらに 、ＲＮＡプローブを用いたインシラ　ハイブリダイゼーション法によりｐＳ２の ｍＲＮＡが検出された。ｐＳ２蛋白質の発現はこれらの組織の再生に関連してい る。

上記記載から」 （以上） 請求の範囲 １８４個のアミノ酸から成り、分子量が９１４０ダルトンのオーダーで、以下の アミノ酸配列（Ｉ）を有し、ｍＲＮＡから同定され、ｐＳ２と呼ばれる蛋白質の 断片から成るペプチド ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＴＨＲＭＥＴ　ＧＬＵ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　Ｃ ＹＳ　ＡＬＡＬＥＵ　ＶＡＬ　ＬＥＵ　ＶＡＬ　ＳＥＲＭＥＴ　ＬＥＵ　ＡＬＡ 　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＴＨＲＬＥＬＩ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲ ＧＬＬＩ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬＡＬＡ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＵ　ＡＲＧ 　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰ ＲＯＳＥＲＧＬＮ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＧＬＹＣＹＳ　ＣＹＳ　 ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲ Ｐ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　Ｐ ＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳ　ＧＬＵ　ＰＨＥ（Ｉ） ２　配列（Ｉ）の蛋白質の６０個のアミノ酸に相当する断片から成り、配列（Ｉ ）の蛋白質の分泌型として同定され、ＧＬＵが配列（Ｉ）の蛋白質のＮ−末端Ｍ ＥＴから２５位下流に位置する配列ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＮから始まり、分子量 が約６６００ダルトンである、請求項１に従うペプチド。

３　以下のアミノ酸配列（Ｄ）を有する、請求項１に従うペプチド。

ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＵ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＬＡ 　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＵ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　 ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬＴＨＲＰＲＯＳＥＲＧＬＮ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　Ｌ ＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ 　ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳＰＩ（Ｅ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨ ＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＵＧＬＵ　ＧＬＬＩ　ＣＹＳ　Ｇ ＬＵ　ＰＨＥ（Ｄ） ４　塩基性アミノ酸Ａ　ｒ　ｇ　３６、Ａ　ｒ　ｇ　３Ｂ、Ｌ　Ｖ　Ｓ　、ａ及 びＡｒｇ６３の下流に位置する４個のトリプシン分解部位を有する、請求項２又 は請求項３に従うペプチド。

５　請求項２又は請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドを、トリプシン分解部位 で分解して得られるペプチド。

６　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、該ペプチドの１２ 個のＮ−末端アミノ酸に相当する、請求項５に従うペプチド。

７　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、ＧＬＮ、、からＬ 　Ｙ　Ｓ　、４にわたるアミノ酸配列に相当する、請求項５に従うペプチド。

８　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、ＧＬＹ、、からＡ ＲＧ６３にわたるアミノ酸配列に相当する請求項５に従うペプチド。

９　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、該ペプチドの２１ 個のＣ−末端アミノ酸に相当する、請求項５に従うペプチド。

１０　請求項１に従う配列（Ｉ）のｐＳ２蛋白質の２４個のＮ−末端アミノ酸に 相当する断片から成る、請求項１に従うペプチド。

１１　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの３１個のＣ−末端アミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３４５０ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。

１２　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの３０個のＮ−末端アミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３３００ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。

１３　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドのＣ−末端２８個のアミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３１００ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。

１４　以下のアミノ酸配列（Ｇ）を有する、請求項６に従うペプチド。

ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＴＨＲＭＥＴ　ＧＬＬＩ　ＡＳＮ　ＬＹＳ　ＶＡＬ　ＩＬＥ　 ＣＹＳ　ＡＬＡＬＥＤ　ＶＡＬ　ＬＥＬＩ　ＶＡＬ　ＳＥＲＭＥＴ　ＬＥＵ　Ａ ＬＡ　ＬＥＵ　ＧＬＹ　ＴＨＲＬＥＵ　ＡＬＡ （Ｇ） １５　以下のアミノ酸配列（Ｈ）を有する、請求項７に従うペプチド。

ＧＬＬＩ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＬＩ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　Ａ ＬＡ　ＰＲＯＲＧ （Ｈ） １６　以下のアミノ酸配列（Ｊ）を有する、請求項８に従うペプチド。

ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬ　ＴＨＲＰＲ ＯＳＥＲＧＬＮ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　ＬＹＳＯ） １７　以下のアミノ酸配列（Ｋ）を有する、請求項９に従うペプチド。

ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ（Ｋ ） １８　以下のアミノ酸配列（Ｌ）を有する、請求項１０に従うペプチド。

ＧＬＹ　ＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲ ＩＬＥＡＳＰ　ＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＬＩ　ＣＹＳ　ＧＬ ＬＩ　ＰＩＥ（Ｌ） １９　以下のアミノ酸配列（Ｃ）を有する、請求項１１に従うペプチド。

ＬＹＳ　ＧＬＹ　ＣＹＳ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　Ａ ＲＧ　ＧＬＹＶＡＬ　ＰＲＯＴＲＰ　ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　Ｔ ＨＲＩＬＥ　ＡＳＰＶＡＬ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬＵ　ＧＬＵ　ＣＹＳ　Ｇ ＬＵ　円］Ｅ（Ｃ） ２０　以下のアミノ酸配列（Ｅ）を有する、請求項１２に従うペプチド。

ＧＬＬＩ　ＡＬＡ　ＧＬＮ　ＴＨＲＧＬＬＩ　ＴＨＲＣＹＳ　ＴＨＲＶＡＬ　Ａ ＬＡ　ＰＲＯＡＲＧ　ＧＬＬＩ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＡＳＮ　ＣＹＳ　ＧＬＹ　Ｐ ＨＥ　ＰＲＯＧＬＹ　ＶＡＬＴＨＲＰＲＯＳＥＲＧＬＮ　ＣＹＳ　ＡＬＡ　ＡＳ Ｎ　ＬＹＳ（Ｅ） ２１　以下のアミノ酸配列（Ｆ）を有する、請求項１３に従うペプチド。

ＣＹＳ　ＰＨＥ　ＡＳＰ　ＡＳＰ　ＴＨＲＶＡＬ　ＡＲＧ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　Ｐ ＲＯＴＲＰＣＹＳ　ＰＨＥ　ＴＹＲＰＲＯＡＳＮ　ＴＨＲＩＬＥ　ＡＳＰ　ＶＡ Ｌ　ＰＲＯＰＲＯＧＬＵ　ＧＬｔｌ　ＧＬＬＩ　ＣＹＳ　ＧＬＬＩ　ＰＨＥ（Ｆ ） ２２　ウサギ又は他の適当な動物を、請求項１から請求項２１のいずれかに従う ｐＳ２蛋白質又はその断片に対して免疫して得られる、抗ｐＳ２ポリクローナル 抗体。

２３　適当な哺乳動物を請求項１から請求項２１のいずれかに従うｐＳ２蛋白質 又はその断片で適切に注射して免疫し、その動物の牌細胞を適当なミエローマの 細胞と融合した結果得られるハイブリドーマをクローニングして得られる抗ｐＳ ２モノクローナル抗体。

２４　生物学的液体に含まれる蛋白質を低温下でアセトンで沈殿させ、ペプチド を含む分画を回収するためにペプチドを含む装置をクロマトグラフィで精製し、 これを必要ならば凍結及び／又は濃縮する、式（Ｄ）のペプチドを得る方法。

２５　生物起源の液体を精製する前に、ＭＣＦ−７細胞を取得し、エストラジオ ールの存在下で培養し、培養上清を集めた後、請求項２４に従う精製過程に供す る、請求項２４に従う式（Ｄ）のペプチドを得る方法。

２６　使用する生物学的液体が胃組織から分泌され上記ペプチドを含む胃液で、 請求項２４に従う精製過程に供する前にこれを約ｐＨ９，６の適当な精製用緩衝 液で中和する、請求項２４に従う式（Ｄ）のペプチドを得る方法。

て、式（Ｄ）のペプチドを生物学的液体又は細胞の抽出物から免疫学的精製によ り単離する、請求項２４から請求項２７のいずれかに従う方法。

２９　請求項１から請求項２１のいずれかに従うｐＳ２蛋白質を、合成、特に化 学合成又は生合成によって製造する方法。

３０　その組織で発現され得る式（Ｄ）のペプチド、その前駆体又はその断片を 生じる組織の病理学的状態を検出及び診断する、これらのペプチドの１つの存在 が請求項２２又は請求項２３に従う抗体を用いた生物学的標本の免疫学的方法に よって検出される方法。

とにより保存及び安定化されホルマリンで固定断片に対するウサギ（又は他の適 当な動物）のポリクローナル又はモノクローナル抗体と共に上記標本をインキュ ベートした後、該抗体をラベルし明確にするための適当なシステムと共にＥＲ＝ 　５ＳＰＲ′ｓ、及びｐＳ２蛋白質又はその断片の１つの免疫学的検出に供され 、一方でＥＲ（＋）乳癌の（ＥＲ（＋）癌の約６０％だけがＰＲ′ｓ及びｐＳ２ 遺伝子の発現が共に陽性であるという）機能的不均一性の付加を、他方でＥＲ（ −）癌のＰＲ−ｓ、及びｐＳ２遺伝子の発現に関する（約９６％はエストロゲン に誘導され得るこれら２つの遺伝子が発現しないという）大きい均一性を特徴と する請求項は診断の方法。

４０　ｐＳ２遺伝子の発現が請求項２２又は請求項２３に従う抗体の少なくとも １うを用いたシンチグラフィにより検出される、請求項３０から請求項３９の一 つに従う方法。

４１　−ｐｓ２蛋白質及び／又はその断片に対する適当な用量のポリクローナル 又はモノクローナル抗体； 一使用する抗体がそれに対するものである適当な用量のｐＳ２蛋白質及び／又は その断片；−酵素又は蛍光マーカー並びに放射標識に結合させた、適当な用量の ウサギ（又は他の適当な哺乳動物）の免疫クロプリンに対する抗体；−ｐＳ２蛋 白質のエピトープに対する適当に標識された二次抗体を含む、抗原抗体反応を行 うための系； −もしも生物標本が組織切片であり、もしもそれを染色する必要があれば、必要 ならば癌細胞を染色するための物質；及び 一検出及び診断試験を行うための有用な量の適当な緩衝液 態を検出及び診断するだめの、レディー−トウーユース（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕ ｓｅ）キット。

４２　請求項２２又は請求項２３に従う１つ以上の抗体を含む治療剤。

４３　他の治療剤を伴う請求項４２に従う治療剤。

国際調査報告 国際調査報告 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　８４個のアミノ酸から成り、分子量が９１４０ダルトンのオーダーで、以下 のアミノ酸配列（Ｉ）を有し、ｍＲＮＡから同定され、ｐＳ２と呼ばれる蛋白質 の断片から成るペプチド 【配列があります】（Ｉ） ２　配列（Ｉ）の蛋白質の６０個のアミノ酸に相当する断片から成り、配列（Ｉ ）の蛋白質の分泌型として同定され、ＧＬＵが配列（Ｉ）の蛋白質のＮ−末端Ｍ ＥＴから２５位下流に位置する配列ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＧＬＮから始まり、分子量 が約６６００ダルトンである、請求項１に従うペプチド。 ３　以下のアミノ酸配列（Ｄ）を有する、請求項１に従うペプチド。 【配列があります】（Ｄ） ４　塩基性アミノ酸Ａｒｇ３６、Ａｒｇ３８、Ｌｙｓ５４及び．Ａｒｇ６３の下 流に位置する４個のトリプシン分解部位を有する、請求項２又は請求項３に従う ペプチド。 ５　請求項２又は請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドを、トリプシン分解部位 で分解して得られるペプチド。 ６　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、該ペプチドの１２ 個のＮ−末端アミノ酸に相当する、請求項５に従うペプチド。 ７　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、ＧＬＮ３９からＬ ＹＳ５４にわたるアミノ酸配列に相当する、請求項５に従うペプチド。 ８　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、ＧＬＹ５５からＡ ＲＧ６３にわたるアミノ酸配列に相当する請求項５に従うペプチド。 ９　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの消化断片であり、該ペプチドの２１ 個のＣ−末端アミノ酸に相当する、請求項５に従うペプチド。 １０　請求項１に従う配列（Ｉ）のｐＳ２蛋白質の２４個のＮ−末端アミノ酸に 相当する断片から成る、請求項１に従うペプチド。 １１　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの３１個のＣ−末端アミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３４５０ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。 １２　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドの３０個のＮ−末端アミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３３００ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。 １３　請求項３に従う配列（Ｄ）のペプチドのＣ−末端２８個のアミノ酸に相当 する断片から成り、分子量が約３１００ダルトンである、請求項１に従うペプチ ド。 １４　以下のアミノ酸配列（Ｇ）を有する、請求項６に従うペプチド。 【配列があります】（Ｇ） １５　以下のアミノ酸配列（Ｈ）を有する、請求項７に従うペプチド。 【配列があります】（Ｈ） １６　以下のアミノ酸配列（Ｊ）を有する、請求項８に従うペプチド。 【配列があります】（Ｊ） １７　以下のアミノ酸配列（Ｋ）を有する、請求項９に従うペプチド。 【配列があります】（Ｋ） １８　以下のアミノ酸配列（Ｌ）を有する、請求項１０に従うペプチド。 【配列があります】（Ｌ） １９　以下のアミノ酸配列（Ｃ）を有する、請求項１１に従うペプチド。 【配列があります】（Ｃ） ２０　以下のアミノ酸配列（Ｅ）を有する、請求項１２に従うペプチド。 【配列があります】（Ｅ） ２１　以下のアミノ酸配列（Ｆ）を有する、請求項１３に従うペプチド。 【配列があります】 （Ｆ） ２２　ウサギ又は他の適当な動物を、請求項１から請求項２１のいずれかに従う ｐＳ２蛋白質又はその断片に対して免疫して得られる、抗ｐＳ２ポリクローナル 抗体。 ２３　適当な哺乳動物を請求項１から請求項２１のいずれかに従うｐＳ２蛋白質 又はその断片で適切に注射して免疫し、その動物の脾細胞を適当なミエローマの 細胞と融合した結果得られるハイブリドーマをクローニングして得られる抗ｐＳ ２モノクローナル抗体。 ２４　生物学的液体に含まれる蛋白質を低温下でアセトンで沈殿させ、ペプチド を含む分画を回収するためにペプチドを含む残査をクロマトグラフィで精製し、 これを必要ならば凍結及び／又は濃縮する、式（Ｄ）のペプチドを得る方法。 ２５　生物起源の液体を精製する前に、ＭＣＦ−７細胞を取得し、エストラジオ ールの存在下で培養し、培養上清を集めた後、請求項２４に従う精製過程に供す る、請求項２４に従う式（Ｄ）のペプチドを得る方法。 ２６　使用する生物学的液体が胃組織から分泌され上記ペプチドを含む胃液で、 請求項２４に従う精製過程に供する前にこれを約ｐＨ９．６の適当な精製用緩衝 液で中和する、請求項２４に従う式（Ｄ）のペプチドを得る方法。 ２７　請求項１から請求項２１のいずれかに従うｐＳ２蛋白質又はその断片に対 する抗体を用いて、式（Ｄ）のペプチドを生物学的液体又は細胞の抽出物から免 疫学的精製により単離する、請求項２４から請求項２６のいずれかに　従う方法 。 ２８請求項１から請求項２１のいずれかに従うｐＳ２蛋白質を、合成、特に化学 合成又は生合成によって製造する方法。 ２９　その組織で発現され得る式（Ｄ）のペプチド、その前駆体又はその断片を 生じる組織の病理学的状態を検出及び診断する、これらのペプチドの１つの存在 が請求項２２又は請求項２３に従う抗体を用いた生物学的標本の免疫学的方法に よって検出される方法。 ３０　検出及び診断が体液を使用して行われる、請求項２９に従う方法。 ３１　ｐＳ２遺伝子の発現が免疫細胞化学により検出される、請求項２９に従う 方法。 ３２　ｐＳ２遺伝子の発現が癌標本で検出される、請求項２９に従う方法。 ３３　使用する癌標本が組織切片である、請求項３２に従う検出及び診断の方法 。 ３４　使用する癌標本がパラフィンに包埋することにより保存及び安定化されホ ルマリンで固定された組織切片である、請求項３３に従う方法。 ３５　使用する癌標本がサイトゾルである、請求項３３に従う方法。 ３６　免疫細胞化学的方法が、ｐＳ２又はｐＳ２断片に対するウサギ（又は他の 適当な動物）のポリクローナル又はモノクローナル抗体と共に上記標本をインキ ュベートした後、該抗体をラベルし明確にするための適当なシステムと共に行わ れる、請求項３１に従う方法。 ３７　乳癌検出に使用される生物標本が、同時にＥＲ′ｓ、ＰＲ′ｓ、及びｐＳ ２蛋白質又はその断片の１つの免疫学的検出に供され、一方でＥＲ（＋）乳癌の （ＥＲ（＋）癌の約６０％だけがＰＲ′ｓ及びｐＳ２遺伝子の発現が共に陽性で あるという）機能的不均一性の付加を、他方でＥＲ（一）癌のＰＲ′ｓ、及びｐ Ｓ２遺伝子の発現に関する（約９６％はエストロゲンに誘導され得るこれら２つ の遺伝子が発現しないという）大きい均一性を明らかにする、請求項２９から請 求項３６の１つに従う方法。 ３８　胃の病理学的状態の検出に適用される、請求項２９から請求項３７の１つ に従う検出又は診断の方法。 ３９　ｐＳ２遺伝子の発現が請求項２２又は請求項２３に従う抗体の少なくとも １つを用いたシンチグラフィにより検出される、請求項２９から請求項３８の一 つに従う方法。 ４０　−ｐＳ２蛋白質及び／又はその断片に対する適当な用量のポリクローナル 又はモノクローナル抗体；−使用する抗体がそれに対するものである適当な用量 のｐＳ２蛋白質及び／又はその断片；−適当な用量のウサギ（又は他の適当な哺 乳動物）の免疫クロブリンに対する抗体； −抗原抗体反応を進展させるための（特にＰＡＰ（ペロキシダーゼ−抗ペロキシ ダーゼ系）のような）酵素系； −酵素反応を進展させるための、特にＤＡＢのような基質； −もしも生物標本が組織切片であり、もしもそれを染色する必要があれば、必要 ならば癌細胞を染色するための物質；及び −検出及び診断試験を行うための有用な量の適当な緩衝液 から成る、免疫細胞化学によって病理学的状態を、請求項２９から３１及び請求 項３３から３９の一つに従い検出及び診断するための、レディー−トゥーユース （ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）キット。 ４１　請求項２２又は請求項２３に従う１つ以上の抗体を含む治療剤。 ４２　他の治療剤を伴う請求項４１に従う治療剤。