JPH01309689A

JPH01309689A - 微生物菌体を用いる油脂のエステル交換方法

Info

Publication number: JPH01309689A
Application number: JP63139798A
Authority: JP
Inventors: Toshimitsu Nakajima; 敏光中嶋; Susumu Kyotani; 晋京谷; Hideki Fukuda; 秀樹福田
Original assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Kanegafuchi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-06-07
Filing date: 1988-06-07
Publication date: 1989-12-14
Anticipated expiration: 2009-04-27
Also published as: JPH0630595B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は微生物菌体を用いる酵素反応方法に関し、更に
詳しくは、リパーゼ酵素を触媒として用いて行われる油
脂類の構成成分であるトリグリセライド間でのエステル
交換反応に関する。

〔従来の技術〕

従来、油脂のエステル交換反応はアルカリ金属、アルカ
リ金属アルコキシラード、アルカリ金属水酸化物などを
触媒として行われてきたが、この方法では交換位置に特
異性がないため、最近リパーゼ酵素を用いる方法が数多
く報告されている。し７かし乍ら、トリグリセライドの
ごとき水と混じりあわない基質（反応物質）に、水に溶
解して或いは水が存在して初めて活性が発現する１ｌｉ
ｌ素を触媒として作用させる場合には、下記の如き幾つ
かの問題が存在する。

（１）基質と酵素との接触機会を増やすには、基質中に
直接酵素を添加することが望ましいが、油脂や有機溶媒
中では酵素を何等かの形で保護してやらない限り酵素は
急激に失活する。従来、多く報告されているリパーゼ酵
素を利用する方法では吸着剤の様な担体に酵素を吸着さ
せることにより失活を防止しているが、脱着すると失活
する。

（２）酵素近傍の水分量が多すぎると、反応は加水分解
が支配的となりエステル化が進まない。

逆に水分量を減らしすぎると、エステル交換反応速度は
小さくなる。従来の方法では、反応初期における反応系
の水分濃度がｏ、　ｏ　ｏ　ｓ〜１．０重量％の範囲が
エステル交換反応に適した水分量であるとされているが
、反応中の水分量の調整は行われていない。また水のか
わりに２〜３価の低級アルコールを用いる方法が提案さ
れているが、本発明者らの経験によると、反応速度が小
さく実用性に乏しい。

（３）吸着担体に酵素を吸着させると、反応物質が担体
上の酵素にまで拡散しに＜＜、特に担体の細孔内に吸着
された酵素は実質的に反応に関与し得す、特にこの傾向
は親水性の担体を用いる場合に強くなる。

この様に油相系の反応物質に対し、水相系で活性を発現
するリパーゼ酵素を触媒とするエステル交換反応を行う
に際しては、酵素を失活させず、また反応系の水分量は
適当な微水環境に維持されなければならず、しかも酵素
と反応物質に充分な接触機会が提供されなければならな
い。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来の方法は上述の（２）のみに留意し、しかも反応初
期の水分濃度のみに着目しているに過ぎない、従って、
本発明者らの検討結果によれば、反応速度が遅く実用性
に乏しい。更に従来の方法は精製酵素を利用するため、
煩雑な酵素の分離、精製工程および固定化酵素製造工程
を必要とし、これらは反応触媒の製造コストを上昇させ
、工業的、経済的観点からは不都合であると言わざるを
得ない。

また、上述のごとくリパーゼによるエステル交換反応は
、トリグリセライド（ＴＧ）をジグリセライド（ＤＧ）
　、モノグリセライド（ＭＧ）　、或いはグリセリンと
脂肪酸（Ｆ　Ａ）とに加水分解する反応と、該加水分解
物を再びトリグリセライド等に合成する反応とに可逆反
応の結果化じるものと考えられる。従って、エステル交
換反応では水の存在が必須であるが、水分の添加量が多
くなると、遊離の脂肪酸、モノグリセライド、ジグリセ
ライド等の副生成分を多量に生成してトリグリセライド
の収率を低下せしめ、或いは製品トリグリセライドの品
質を低下させる。また反応系の水分量が少なすぎると、
酵素の触媒活性を充分に発現させることが出来ず、反応
速度が小さくなる。従って、エステル交換反応を効果的
に行うためには、反応系を常に適切な微水濃度に維持し
なければならない。

そこで、工業的にエステル交換反応を実施可能とするに
は、安価なリパーゼの製造方法、及び酵素近傍の水分濃
度を常に最適な微水濃度に調整する方法の開発が高い反
応速度を得、また副反応生成物を抑制し、更に高価なリ
パーゼ酵素を無駄なく有効利用する上で必要とされてい
た。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは上述の如き課題を解決し、長期間酵素を失
活させず、しかも充分な反応速度を持ち、工業的に安価
な製造コストで利用できるリパーゼの利用形態について
鋭意検討の結果、リパーゼ生成能を有する微生物を培養
し、そのリパーゼを菌体内に包蔵した状態で乾燥あるい
は極性溶媒、非極性溶媒で処理した後、トリグリセライ
ドの混合物にリパーゼ触媒として供することによって、
そのエステル交換反応を効率良〈実施せしめ得ることを
見出した。更に、この様な菌体を利用するエステル交換
反応では反応液と菌体との間に水分の吸着平衡関係が成
立することを見出し、反応液中の水分濃度を検出すれば
、この平衡関係を用いて間接的に菌体の水分濃度を求め
得ることを知見した。従って、同様の平衡関係によって
、所望の菌体内水分濃度に対応するように反応液中の水
分濃度を調整することによって、その結果として菌体内
水分濃度を所望の値に調整できることを見出し、本発明
を完成するに至った。

即ち、本発明はリパーゼを含有する菌体の水分含量を０
．１〜２０重量％にコントロールしながらグリセライド
と反応させることを特徴とする、微生物菌体を用いる油
脂のエステル交換方法を内容とするものである。

本発明に用いられる微生物としては、リパーゼ生産能を
有する微生物であればすべて用いることが出来るが、リ
ゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属としては、例えばリゾプ
ス・キネンシス（Ｒｈ、　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、リゾ
プス・デレマー（Ｒｈ、　ｄｅｌ’ｅｍａｒ）、リゾプ
ス・ジャボニカス（Ｒｈ、　ｊａｐａｎｉｃｕｓ）、リ
ゾプス・オリゴスポラス（Ｒｈ、　ｏｌｉｇｏｓｐｏｒ
ｕｓ）、リゾプス・ニベウス（Ｒｈ、　ｎ１ｖｅｕｓ）
　、リゾプス・ジャヴプニカス（Ｒｈ、　ｊａｖａｎｉ
ｃｕｓ）など；ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属としては、例
えばムコール・ジャヴアニカス（Ｍｕｅｏｒｊａｖａｎ
ｉｃｕｓ）など；アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌ　
Ｉｕｓ）属としては、例えばアスペルギルス・ニガー（
Ａｓ−ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）など；ジョー
トリクム（Ｇｅｏｔｒｔ−ｃｈｕｍ）属としては、ジョ
ートリクム・カンディグム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕ＋ａ　
ｃａｎｄｉｄｕｍ）など；キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄ
ａ）属としては、キャンディダ・シリンドラソセ（Ｃａ
ｎｄｉｄａ　ｃｙｌｉｎｄｏｒａｃｅａ）など；コリネ
バクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋）属
としては、コリネバクテリウム・イクイ　（Ｃｏｒｙｎ
ｅｂａｃｔｅｒｉｕ＋ｓ　ｅｑｕ−１）など；スタフィ
ロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｃｕ−３）属とし
てはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）等がその代表的なもの
として挙げられ、いずれも容易に入手することが出来る
。

これらの微生物は通常公知の回分、半回分、連続培養法
等を用いて＋ｔ＋ａされるが、本発明者らの検討結果に
よれば、その培地成分に関してリパーゼ生成に対して阻
害作用を有するアミノ酸群が存在し、これら阻害作用の
大きいアミノ酸群の含有率の低い有機窒素源を主成分と
して用いることによりこれら微生物のリパーゼ生成能を
高め得ること、またアミノ酸またはアミノ酸およびペプ
チドを主成分とする基質を流加して培養液中のアミノ酸
濃度を低濃度に保ちながら培養することによりこれら微
生物のリパーゼ生成能を高め得ることを見出した。これ
らの有機窒素源としては、ポリペプトン、イーストエキ
ス、マルトエキス、イーストペプトン、プロエキス、肉
エキス、コーンステイープリカー等をその代表的なもの
として挙げることが出来る。

またその培地中にグリセライドまたは脂肪酸などの脂質
関連物質を誘導物質として０．２〜８０重量％培養初期
あるいは培養中に添加すると、菌体内のリパーゼ活性は
一層高められる。このような脂質関連物質としては、オ
リーブオイル、茶油、魚油などのトリグリセライド類、
オレイン酸、リノール酸、リルン酸などの脂肪酸類、オ
レイルアルコール、リノールアルコール等の高級アルコ
ール類、オレイン酸メチル、カプリン酸エチル等のエス
テル類をその代表的なものとして挙げることが出来る。

更に培地中に予め微生物保持材、例えば１〜２０００μ
ｍの多孔質粒子を仕込み、微生物を該粒子内あるいは粒
子表層近くで増殖させることにより、菌体内のリパーゼ
活性を飛躍的に上昇させることができる。

このような微生物保持材としては、微生物の持つ粘着力
、吸着力により微生物の吸着増殖を可能ならしめる任意
の材料が使用できる。例えば高分子多孔質材料としては
、ポリエチレンまたはポリプロピレンなどのポリオレフ
ィン系；ブタジェンまたはイソプレンなどのジエン系；
ポリ塩化ビニル、アクリルアミドまたはボリスナレンな
どのビニル重合体；ポリエーテル、ポリエステル、ポリ
カーボネートまたはポリアミドなどの縮合系；ポリウレ
タン、シリコン及びフッ素系樹脂などの材料；また無機
材料としてはセラミックス、ガラス、活性炭、及び多孔
質金属や金属繊維加工材料などが使用できる。いずれの
材料においても微生物を良好に該保持材に固定化させる
ためには、空隙率が１０〜９９％、孔径が１〜２０００
μｍの範囲にある多孔質材料か、空隙率が１０〜９９％
である金属加工材料等を使用するのが好ましい。

このような微生物保持材は微生物の種ｚｉ及び培養条件
等によって適宜選択でき、形状については例えば球状、
ブロック状あいはシート状等に加工して使用することが
できる。寸法については、微生物の種類、培養条件、反
応器の種ｔｆｆ等によって異なるが、球状であれば概ね
直径１〜１００ｍｍ、ブロック状のものであれば一辺が
概ね１〜１００■ｌのものが使用される。また、微生物
を上記保持材に固定化させるには、通常公知の回分、半
回分、連続培養法等を用いて容易に達成される。

微生物保持材の添加量としては、５〜４０容量％が微生
物の増殖及び固定化の条件として好ましい。

本発明において、培養槽への通気は空気、酸素あるいは
両者の混合ガスが用いられ、培養槽としては、撹拌機型
または無攪拌機型、気泡塔型のあらゆる形式のものが適
用できるが、通常、微生物保持材に固定化増殖させるに
は、無攪拌機型の培養槽が操作面及びコスト面から一層
好ましい。

更に、本発明においては微生物保持材とともに培養する
場合は、前述の様に菌体内のリパーゼの誘導物質として
加えられるグリセライド類や脂肪酸類は、例えば微生物
保持材として親油性の高分子材料、例えばポリウレタン
等を用いる場合、これらの脂質関連物質は微生物保持材
内に吸収される。従って、脂質関連物質が多量に微生物
保持材内に吸収されると、微生物保持材内への酸素、基
質の移動抵抗が大きくなり、微生物保持材内での増殖に
対してマイナス要因となるばかりでなく、ひいては微生
物保持材内での増殖が不可能となるためリパーゼ生成は
促進されなくなる。従って、微生物保持材を用いる場合
に加えられる脂質関連物質の景は好ましくは０．２〜８
％、より好ましくは０．２〜２％である。

更に微生物保持材内での安定した増殖を保ち、微生物の
微生物保持材からの剥離を抑制するためには、培養液中
の乱流強度及び培養液中の微生物保持材の濃度が重要な
因子となる。従って、微生物保持材内でのリパーゼを生
成する微生物の安定した増殖を維持するための乱流強度
としては、撹拌機型の培養槽では攪拌レイノルズ数で好
ましくは１０２〜１０７、より好ましくは１０３〜１０
５となる攪拌条件で操作される。

無攪Ｐ！機型の気泡塔では、特に微生物保持材からの微
生物の剥離の問題は、通気ガスの吹き抜けが発生する通
気線速度までの範囲においては認められない。従って、
通常１　ｃｒｎ／ｓｅｃ　、、好ましくは１．５ｃｍ／
ｓｅｃ以上の通気線速度で１桑作される。菌体内のリパ
ーゼの漏洩を防ぐという観点からは１゜２〜２．８　ｃ
ｍ　／　ｓｅｃの範囲が好ましい。

上述の様に培養して得られた微生物、即ち固定化微生物
は生菌体のまま反応に使用することもできるが、前述の
如く水分含量が大きすぎるとエステル交換収率が小さく
なるため、予め菌体がら水分を除去しておくのが望まし
い。また水分を除去した状態では乾燥菌体内のリパーゼ
は非常に安定であり、長期間保存することができる。

微生物から水分を除去する方法としては、原則的には酵
素が失活しない温度（８０℃以下）で乾燥すればよいが
、単に水分を１発させると細胞組織の収縮が起こり非常
に堅くなり、組織内のリパーゼと外界との接触が断たれ
て活性を発揮することが困難となる。従って、菌体を乾
燥させるには細胞組織の収縮を伴わない方法を採用する
のが好ましい。このため、極性溶媒に菌体を浸して＆［
Ｉ織内の水分を極性溶媒に置換した後、極性溶媒を蒸発
させる方法により、細胞ｍ織の収縮を抑えて乾燥菌体を
得ることができる。この場合、乾燥方法としては真空あ
るいは凍結乾燥、低温乾燥、温風乾燥等の公知の乾燥法
が使用できる。本発明に用いられる極性溶媒としては、
水と混合した場合に水と均一相となるものならいかなる
ものも利用できるが、その代表的なものとしてアセトン
、メチルエチルケトン、ジエチルケトン等のケトン類；
メタノール、エタノール、イソプロパツール、ｎ−ブタ
ノール等の低級アルコール類；エチレングリコール、プ
ロピレングリコール等のジオール類：グリセロール等の
トリオール類などが挙げられる。就中、アセトンやグリ
セロールが酵素活性をほとんど低下させないので好まし
い。

更に乾燥せずともこのような極性溶媒を非極性溶媒で置
換することによっても、菌体内の水分４度を所望のオー
ダーまで低下させることができる。

本発明で用いられる非極性溶媒としては、反応基質であ
る油脂類を溶解し得る物であればいかなる物も用い得る
。その代表的なものとして、ヘキサン、ヘプタン、オク
タン、イソオクタン、ノナン、デカン等のアルキル炭化
水素類；ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化
水素類が例示される。

このようにして培養された菌体は菌体内の水分ン；度を
０．１〜２０重量％に調整され（以後、リパーゼ含有菌
体と記す）、エステル交換反応に供される。

次に、リパーゼ含有菌体、或いは微生物保持材に固定化
されたリパーゼ含有菌体はいずれも反応液中に懸濁させ
るが、取扱の容易さおよびリパーゼ活性が飛躍的に上界
している点から、工業的には微生物保持材に固定化され
たものを用いる方が好都合である。

前述のごとく酵素近傍の水分量が多すぎると、反応は加
水分解が支配的となりエステル化が進まないので、効率
良くエステル交換反応を実施するためには酵素近傍の水
分量は適当な値に制御されなければならない。本発明者
らはこの点に関して鋭意検討の結果、反応液中の水分濃
度をコントロールすることにより、それに対する吸着平
衡関係に基づいて菌体内の水分濃度を制御できることを
見出した。

以下、具体的な水分量のコントロール方法について記述
する。

本反応系のごとき固液（菌体−反応液）の混在する系で
は、菌体（酵素触媒）内の水分を直接求めることも困難
であるとされているが、本発明者らは菌体（酵素触媒）
に保持された水分を間接的に求める方法を見出した。即
ち、微水系での菌体く酵素触媒）と反応液（油相）との
間に、水分の吸着平衡という関係が存在することに着目
し、予め求めておいたこの平衡関係を用いて反応液中の
極＜微量の水分濃度を検出することによって菌体内の水
分量を求める方法である。このような吸着平衡関係は反
応液の種類、組成、菌体或いは菌体が固定化されている
微生物保持材の種類によって異なり、また、それぞれの
組合わせについて各々固有の平衡関係が存在する。この
ような平衡関係は通常の液相吸着の吸着等温線の求め方
に従って容易に得ることができる。例えば、第１図のよ
うな反応液−菌体（酵素触媒）間の水分吸着平衡関係が
得られ、反応時における反応液中の水分濃度をコントロ
ールすることにより、菌体内の水分濃度の制御が可能と
なる。

反応速度に及ぼす水分濃度の影口は、固定化に使用され
る微生物保持材の種類・菌体の種類・菌体のリパーゼ活
性等により様々な様相を呈する。

このような系での最適水分濃度は別途公知の方法により
容易に決定することができ、種々の微生物について検討
した結果、菌体内の最適水分濃度は概ね０．１〜２０重
■％が好ましい。この様な菌体内水分濃度に調整するに
は反応液中の水分４度を５〜１１０００ｐｐ程度の微水
レベルに調整する必要があり、好ましくは１０〜５００
ｐｐｍに調整するのがよい。更に好ましくは１０〜２０
０ｐｐｍであり、この範囲内では副反応の加水分解が抑
制され、製品の品質が向上する。

水分を分析する手法としては、−Ｃ的には試料の水分だ
けを蒸発させその重量変化から試料の水分を求める重量
法や、あるいは脱水反応を利用したカールフィッシャー
の方法が良く知られている。

カールフィッシャー法では、反応器から液体試料を採取
する時に適切なフィルター（例えば焼結金属や樹脂製の
多孔性フィルター）によって固相を分離して液相中の水
分濃度を測定すればよい。その他の手段として、種々の
公知の原理に基づいたオンライン水分濃度計、例えば試
料に赤外線を投光し、吸収された光量を測定する方法や
、センサ一部の電気的な抵抗の変化から測定する方法、
あるいは液の静電容量を測定する方法等による水分セン
サーが使用できる。これらのセンサーを用いて反応器内
の反応液中のｉｌｔ水分？Ｗ度あるいは反応系（固液）
の平均水分濃度を測定すれば、固液間の水分の吸着平衡
関係を用いて、同相である菌体（酵素触媒）に保持され
た水分の珊を知ることが出来る。得られた水分濃度が設
定したい値よりも小であれば反応液中の水分濃度を増加
し、逆に大であれば減少させることにより、触媒内の水
分、濃度を常に適量に保つことが出来る。

反応器内の水分を増加する方法としては、水分を直接反
応器中に注入したり、反応液に水分を溶解させた後反応
器に注入する方法が適用できる。

注入する反応液は新規な反応液であってもよく・あるい
は反応器から抜き出した反応液に水分を溶解したもので
あってもよい。また反応液は水分を飽和溶解したもので
あってもよく、あるいは飽和に達せずにある程度まで水
分を溶解したものであってもよい。

反応液に水分を飽和溶解させる方法としては、反応液と
水とを長時間接触させることによって達成できる。また
水分をある程度溶解するためには、水と反応液との接触
時間を調整することによって可能であるが、また反応液
と相互に溶解しない水溶性物質、例えばグリセリン、エ
チレングリコール、ジエチレングリコール、トリエチレ
ングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコ
ール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール
等の水溶液を反応液と接触させ、反応液−水溶性物質水
溶液間の水分分配平衡を利用することによっても反応液
中の水分濃度の調整が可能である。

反応液中の水分濃度を減少させる方法としては、水分を
除去した新規な反応液を直接反応器中に注入したり、あ
るいは反応器から抜出した反応液から水分を除去し反応
器に戻す方法などが適用できる。

反応液のような有機溶媒系から水分を除去する方法とし
ては、吸水性材料と反応液を接触させることによって達
成できる。吸水性材料としては反応液に溶解せず、また
反応基質と反応しないものであればどんなものでも使用
することができるが、例えばグリセリンやエチレングリ
コール、ジエチレングリコール、トリエチレングリコー
ル、ブチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキ
シレングリコール、ポリエチレングリコール等の水溶性
物質；モレキュラーシーブ、ゼオライト、シリカゲル、
アルミナ、珪藻土、活性炭、カオリナイト、パーライト
、セルロースパウダー、ヒドロキシルアパタイト、キト
サン等の吸水性物質；グルコース、ガラクトース、リボ
ース、フラクトース等の単糖類；シュクロース、トレハ
ロース、デキストリン、グリコーゲン、デンプン等の多
糖類；焼石膏、炭酸カルシウム、塩化カルシウム等の吸
水性を存する塩類；水酸化ナトリウム、水酸化カルシウ
ム等の潮解性を有する塩類；または無水硫酸ナトリウム
のような結晶水を失った金属塩類等を使用することがで
きる。

このように水分を増減するための水分調整装置の型式と
しては攪拌槽式、充填層式等どのような形式であっても
よく、更にＩ８水性または親水性の多孔性樹脂からなる
薄膜の両面あるいはチューブの内外にそれぞれ反応液と
水または上記水溶性物質の水溶液を流す隔膜式であって
もよい。

本発明の反応方式は回分式でも連続式であってもよいが
、本発明においては酵素活性の劣化度が低減されるため
、特に長期間にわたる連続式に適している。また反応器
の段数は１段であってもよいが、反応収率を上げるため
には多段方式を用いてもよい。更に反応装置の形式は攪
拌槽式、充填層式、流動層式、あるいはこれらの組合わ
せ等のいずれの形式であってもよい。このうち充填層式
の場合には、供給した水分が反応器入口付近の菌体に選
択的に吸収されてしまうため、効率良く反応させるには
充填層を小さく分割して段数を大きくしなければならな
い。

以下に、第２図乃至第５図を用いて、本発明に適用され
る反応装置の例を具体的に説明するが、もとより本発明
はそれらに限定されるものではない。

第２図は、１段の攪拌槽からなる反応器（１）と攪拌槽
式の水分溶解装置（２）を組合わせた装置の例である。

第２図において、水添加口（１１）は水添加ポンプ（７
）を介して、水分熔解装置（２）と接続されている０反
応液中の水分濃度は水分濃度センサー（４）で常時測定
され、プロセッサー（５）内部で測定値と設定値を比較
して、循環ポンプ（３）、（１３）または水添加ポンプ
（７）をＯＮ、０ＦＦＬ、て注入された水を溶解した反
応液の反応器（１）への流量が調整され設定値に保たれ
る。

第３図は反応器（１）として多段の流動層を有するもの
を用い、各段にそれぞれ攪拌槽式の水分調整装置（８）
を組合わせた装置の例である。第３図において、反応液
と相互に溶解しない水溶性物質の水溶液を反応液と接触
させる水分調整装置（８）が反応器（１）の各段に各々
循環ポンプ（３）、　　（１３）を介して接続されてい
る。第３図では、循環ポンプ（１２）を常時稼働させ菌
体自体、あるいは微生物保持材に固定化された菌体を反
応器（１）内で流動させているや反応２Ｗ　（１）内の
最下段である１段目の水分は、水分溶解装置（２）に水
添加口（１１）より水添加ポンプ（７）を介して水を提
供することによって補われ、さらに２．３段目には各々
循環ポンプ（３）を介して水分調整装置（８）が設けら
れ、該装置（８）内でグリセリン水溶液と反応液が液滴
を形成しない程度に穏やかに攪拌して接触せしめ、反応
液−グリセリン水溶液間の水分分配平衡関係を利用して
反応液中の水分濃度を微小に調整する。

第４図は第２図に示した１段の攪拌槽からなる反応器（
１）と攪拌槽式の水分溶解装置（２）に、更にシリカゲ
ルの充填塔からなる水分除去装置（１４）を組合わせた
例である。第４図に示される装置において、反応器（１
）はフィルター（６）と循環ポンプ（３）、、　　（１
３）を介して水分溶解装置（２）と接続され、また循環
ポンプ（１５）を介して水分除去装置　（１４）と接続
されている。

第２図の場合と同様に、反応液中の水分濃度は水分濃度
センサー（４）で常時測定され、プロセンサー（５）内
部である程度の幅をもつ設定値と測定値を比較して水分
濃度が設定値の下限を下回ると、水添加ポンプ（７）、
循環ポンプ（３）。

（１３）をＯＮにして反応液中の水分？農度を増加させ
、逆に設定値上限を上回ると循環ポンプ（１５）をＯＮ
にして水分を除去して反応液中の水分濃度を減少させる
ことにより、水分濃度が精度良く所望の範囲内に保たれ
る。

第５図は第３図の多段式流動層を単段としだもので、第
４図と同様にシリカゲルの充填塔を水分除去装置（１４
）として組み込んだ例である。第３図と同様に、循環ポ
ンプ（１２）を常時稼働させ菌体そのもの、あるいは微
生物保持材料に固定化された菌体を反応器（１）内で流
動させ、第４図と同様の水分調整方式で反応液の水分濃
度、すなわち菌体内の水分濃度は所望の値にコントロー
ルされる。

第４図、第５図に示した水分調整方式を用いれば、第２
図、第３図に示した方式に比べより微小の水分濃度を調
整することが出来るため、副反応である加水分解の進行
をより効果的に抑制でき、エステル交換反応による製品
の収率や品質を一層向上させることが出来る。

上述のように、エステル交換反応に用いられる反応器と
しては、攪拌撥型または無攪拌機型、気泡塔型のあらゆ
る形式のものが適用できるが、微生物保持材に固定化さ
れた菌体を用いる場合は菌体の剥離を抑制するという観
点から、反応液の流動が穏やかで剪断力の小さい無攪拌
機型の気泡塔型のものが好ましい。

特に微生物保持材を用いる場合は、その分離、洗浄等が
容易となるので、前述の培養槽として用いた装置を培養
の後そのままエステル交換の反応器として利用すること
も可能である。

本発明に用いるグリセライドとしては通常の動植物性油
脂あるいは合成油脂であり、具体的にはオリーブ油、パ
ーム油、シア脂、大豆油、綿実油、サフラワー油、牛脂
、ラード、魚油、サル脂、マンゴ脂、コーカム脂、トリ
オレイン、トリパルミチン、トリステアリン、ジオレイ
ン、シバルミチン、ジステアリン、モノオレイン、モノ
バルミチン、モノステアリン等である。またこれらの油
脂類が通常の分別晶析工程を経て得られるこれら油脂の
高融点部、中融点部、低融点部もまたそれぞれ反応基質
として用いることが出来る。

また本発明において、上記反応７５質は直接用いること
ができるが、必要に応じて基質をｎ−へキサン、イソオ
クタン、アセトン、エタノール、メタノール、石油エー
テル、酢酸エチルのような有機溶媒に希釈して用いる。

二ともできる。

〔実施例〕

次に、本発明を実施例を用いて説明するが、もとより本
発明はかかる実施例のみに限定されるものではない。尚
、％及び部は特に断らない限り、それぞれ重量％及び重
量部を意味する。

実施例１微生物としてリゾプス・デレマー（Ｒｈ、　ｄｅｌｅｍ
ａｒ［Ｆｏ　４６９７　）を用い、グルコース１％、ポ
リペプトン７％、ＮａＮＯｓ　０．１％、ＫＩＩｚＰＯ
４０，１％、Ｍｇ５Ｏａ・７１１□００．０５％からな
る培地で３０℃で２４時間前培養を行い種母を調製した
。

５ｊ！攪拌槽ジャーファーメンタ−（いわしや生物化学
■製、ＭＢＣ−５、攪拌翼径８ｃｍ）を用いて、次の条
件で回分培養を行った。

使用培地組成：酵母エキス７％、ＮａＮ０＋　Ｏ，１％
、Ｋ１１２ＰＯ４０，１％、Ｍｇ５Ｏａ・７ＨｚＯｏ、
　０５％、オリーブオイル６．５％ｐＨ：５．６、攪拌数：４０Ｑｒｐｍ通気ｌ：Ｑ、５ｖｖｍ、温度：３０℃ ４０時間培養した後、菌体を濾別後、水で２回洗浄、更
にアセトンで２回洗浄した後、真空乾燥機で４８時間乾
燥して乾燥菌体を調製した。乾燥菌体内の水分濃度は４
〜６％であった。

この乾燥菌体５部をパーム油中融点画分（ｌＶ：３５、
トリグリセリド中ｐｏｐ含量：６２％）６０部と大豆油
４０部をヘキサン４５０部に溶解したものに加え、第２
図に示した反応装置を用いて反応液中の水分濃度を５Ｑ
ｐｐｍにコントロールして、４０℃で１５時間攪拌して
エステル交換反応を実施した。

反応後ヘキサンは分離せず、常法による溶剤分別に供し
た。すなわち１０℃において高融点画分をカットし、−
１５℃において低融点画分をカントした。得られた中融
点画分の収量はヘキサン除去後の４５部であった。

この油脂は軟化点３２．８℃、油脂中の１不飽和２飽和
型グリセリドの含量は９０．２％であった。

更に、この油脂を用いてチョコレートを製造したが、テ
ンパリング性、耐熱性は非常に良好で、原料油は明らか
に改質されていた。

また同様の反応を反応液の水分濃度を８００ｐｐｍにコ
ントロールして実施し、同様に溶剤分別に供した結果、
得られた中融点画分の収量はヘキサン除去後の３０部で
あった。

また液体クロマトグラフィーにおいて島津製作所（製）
（商品名ＨＧＳ−１５および２０）の２木のカラムを用
い、交換後の全油脂中のジグリセライド（以下、ＤＧと
略す）の量を測定したところ、水分濃度ｓｏｐｐｍの場
合は４．３％、８００ｐｐｍの場合は３０．２％であり
、ｓｏｏｐｐｍでは明らかに反応収率が悪くなり加水分
解が進んでいた。

本実施例を含む全ての実施例において、水分センサーは
パナメトリノクス社製の水分センサー（商品名ニジステ
ムＩ）を用いた。

実施例２微生物としてムコール・ジャヴアニカス（Ｍｕｃｏｒｊ
ａｖａｎｉｃｕｓ　ＩＦＯ４５６９）を用いて、実施例
１と同様にして種母を調製した。

第６図は実施例２で培養槽として用いた気泡塔（Ｃ４ｒ
ｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｂｅｄ　Ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ）　（
１６）の概略断面図である。第６図に示したごとく、こ
の気泡塔（１６）は高さ（Ｈ）が４００龍、内径（Ｄ、
）が１５０龍である。また第７図は第６図に示されてい
る気泡塔（１６）内に設けられている気泡分散板（１７
）の平面図である。気泡分散板（１７）は直径（Ｄｔ）
が１５０＋ｕであり、第７図に示されているように直径
３鶴の孔（１８）が設けられ、空気は第６図に矢印で示
す方向に通気される。

第６図の気泡塔（１６）を用いて、通気量２４１７ｗ１
ｎ、温度３０℃、ｐＨ５，０の条件で回分培養した。な
お用いた培地は実施例１の酵母エキスを肉エキスにかえ
たものを用いた。

微生物保持材として１辺６龍のブロック状のポリウレタ
ンフォーム（プリジストン０１製、商品名ＨＲ−４０）
を使用培地中に１５００個／ｌとなるように加えた。

８０時間培養した後、微生物保持材に固定化された菌体
を濾別後、実施例１と同様に水洗、アセトン洗浄した後
へキチンでさらに３回；洗浄してリパーゼ含有固定化菌
体を調製した。

この固定化菌体を用いて、実施例１と同様に反応液中の
水分濃度を５０ｐｐｍと８００ｐｐｍにコントロールし
てエステル交換反応を実施したところ、加えた菌体量を
同−星とし７た場合、５時間でほぼ実施例１と同様の改
質反応結果が得られた。

実施例３パーム油中融点部（ＡＶ　：　０．１．　　ｌ　Ｖ　：
　３５゜５）５０部と、シア脂中融点部（ＡＶ：０．０
８゜ＴＶ：５０．２）５０部をヘキサン３００部に溶解
し実施例１と同様の方法で調製したアスペルギルス・ニ
ガー（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎ！ｇｓｒ　ＩＦＯ４
３４３）のリパーゼ含有菌体を１０部加え、第４図に示
した反応装置内で反応液中の水分濃度を２０〜３０ｐｐ
ｍの範囲にコントロールして攪拌し１２時間反応させた
。実施例１と同様に溶剤分別を行った後、ヘキサン除去
後の８５部の中融点画分を得た。

この油脂は軟化点３３．５℃、油脂中の１不飽和２飽和
型グリセリドの含量は９２．２％であり、テンバリング
性も良く、チョコレートを試作して官能テストを供した
ところ、口どけ性と耐熱性に（ｆｉれていた。

実施例４実施例３のシア脂中融点部の代わりにサル脂（ＡＶ　：
　０．０６５．　　Ｉ　Ｖ　：　３７．６）　’ｃ用イ
、実１１例２と同様の方法で調製した微生物保持材に固
定化されたリゾプス・ニベウス（Ｒｈ、　ｎ１ｖｅｕｓ
　ＩＦＯ４７５９）のリパーゼ含有菌体を添加される菌
体量とｊ７て実施例３と同様になるように加え、第５図
に示した反応装置内で反応液中の水分ン農度を４０〜５
ｏ　ｐｐｍの範囲にコントロールして３時間反応させ、
実施例３と同様にハードバターを得た。得られた油脂の
収量はヘキサン除去後の４７部であった。

この油脂は軟化点３１．９℃、油脂中の１不飽和２飽和
型グリセリドの含量は８９．３％であり、テンパリング
性も良く、チョコレートを試作して官能テストに供した
ところ、実施例３と同様に口どけ性と耐熱性に優れてい
た。

実施例５トリオレイン５０部、トリステアリン５０部をヘキサン
１０００部に溶解し実施例１と同様の方法で調製したコ
リネバクテリウム・イクイ　（Ｃｏｒｙ−ｎｃｂａｃｔ
ｅｒｉｕｍ　ｅｑｕｉ　ＩＦＯ３７３０）、スタフィロ
コッカス中アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｒｏｃｏｃｕｓｓ
　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ３０６０）、キャンディダ・シ
リンドラッセ（Ｃａｎｄｉｄａｃｙｌｉｎｄｏｒａｃｅ
ａ　ＡＴＣＣ１０５７１）、ジョートリクム・カンデイ
ダム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃａｎｄｉｄｕｍ　ＩＦ
Ｏ４５９７）のリパーゼ含有菌体をそれぞれ菌体量とし
て１０部加え、４０℃で攪拌しながら第２図に示す反応
装置の水分調整装置を第３図に示すグリセリンとの水分
分配平瑛ｉ関係を利用するものに換えて水分濃度を５０
ｐｐｍにコントロールし、５時間エステル交換反応を実
施した。

反応前後の反応液を液体クロマトグラフィーで分析し、
油脂中のグリセライドの組成ならびに生成したＤＣの星
を第１表に示した。

第　　１　　表Ｓニステアリン酸、０ニオレイン酸を示す。

表中の数値は全トリグリセライド中に占める各グリセラ
イドの量及び全２１訛中のＤＣの生成量を示す（％）。

第１表より、各菌体によってトリグリセライド組成が変
化し、これらの菌体がエステル交換反応を実施する上で
高機能な触媒となっていることが分かる。また反応液中
の水分濃度をコントロールすることによって、副反応で
ある加水分解が抑制されていることも分かる。

実施例６トリオレイン５０部、トリステアリン５０部をヘキサン
１０００部に溶解し、酵母エキスを肉エキスに変えた実
施例１および実施例２と同様の方法で調製したリゾプス
・オリゴスポラス（Ｒｈ、　ｏｌ−ｉｇｏｓｐｏｒｕｓ
　ＩＰＯ８６３１）のリパーゼ含有菌体を菌体量として
１０部加え、４０℃で攪拌しながら実施例３と同様の反
応装置内で反応液中の水分濃度を２０〜３ｏｐｐｓ＋の
範囲にコントロールしてエステル交換反応を実施した。

反応中適宜反応液を抜出し液体クロマトグラフィーで油
脂中のグリセライドの組成を分析した。

第２表に各菌体におけるトリグリセライド組成の変化を
示した。

第２表より、これらの菌体がエステル交換反応の触媒と
なっていることが分かり、微生物保持材に固定化するこ
とによって、菌体内の活性が飛躍的に上昇していること
も分かる。２０時間目でのＤＣの生成量はそれぞれ３．
２％、４．０％であり、副反応は著しく抑制されていた
。

実施例７実施例２と同様にリゾプス・キネンシス（Ｒｈ。

ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ　ＩＦＯ４７６８）を培養後、その
培養槽内で水洗、アセトン洗浄した後、常温で通気して
微生物保持材に固定化された菌体をその水分量が２〜３
％なるまで乾燥した。その後実施例５と同様の反応基質
を仕込み、第５図に示す培養槽をそのまま反応器として
用い、水分濃度を１５〜２０ｐｐｍの範囲にコントロー
ルして連続エステル交換反応を行った。反応基質は供給
ポンプを用いて反応器（培養槽）内に供給され、排出ポ
ンプを用いて反応器（培養槽）から排出された。槽内で
の反応液の平均滞留時間は１０時間とした。

第３表に排出液のトリグリセライド組成及びＤＧの生成
量の経時変化を示す。

第３表より菌体内の水分をコントロールすることによっ
て、菌体内のリパーゼの安定性は一層高められ、５００
時間の連続反応の後も約９０％の活性が残存していた。

また副反応は長時間にわたり抑制されていた。

〔作用・効果〕

畝上の通り、菌体内の水分計を適切な範囲にコントロー
ルして反応させる本発明の酵素反応方法は、リパーゼ酵
素の安定化を図り、失活を防ぐと共に、充分な酵素と基
質の接触機会を提供するばかりでなく、副反応である加
水分解反応を著しく抑制し、反応速度及び収率を高め、
反応を長期間安定的に持続させることができる。

また市販リパーゼ酵素を用いる場合に比べて、低コスト
でのリパーゼ触媒の生産を可能ならしめる。

更に微生物保持材に固定化された菌体を利用する場合は
、菌体内のリパーゼ活性が飛躍的に向上するのに加えて
、エステル交換反応の各工程での菌体の取り扱い等の操
作性が向上するので、工業的にエステル交換反応を実施
する場合に精製酵素を利用する従来のプロセスに比べて
極めて有利である。

４、図面のｉｉｉ　ＩｉＬな説明第１図は菌体と反応液の間に成立する水分吸着平衝関係
の１例を示すグラフであり、第２図乃至第５図はそれぞ
れ本発明に用いられる２Ｈの一例を示す概要図、第６図
は実施例２．　４．　６．　１で用いた気泡塔の概略断
面図、第７図は第６図に示した気泡塔中に設けられた気
泡分散板の平面図である。

１・・・反応器、　　　　　　２・・・水分溶解装置３
・・・循環ポンプ、　　　　４・・・水分濃度センサー
５・・・プロセッサー、　　　６・・・フィルター７・
・・水添加ポンプ、　　８・・・水分調整装置９・・・
反応液入口、　　　ｌＯ・・・反応液抜出口１１・・・
水添加口、　　　　１２・・・循環ポンプ１３・・・循
環ポンプ、　　　１４・・・水分除去装置１５・・・循
環ポンプ、　　　１６・・・気泡塔１７・・・気泡分１
ｉｊｌ板、　　　１８・・・孔第　１図＋ｏｏｏｆ− 反あオ　　− 戟株函イ奎内本分濃度（２−木／ｙ−ｈ体）第２図５ノ第　３図第４図第５図

Claims

【特許請求の範囲】１、リパーゼを含有する菌体の水分含量を０．１〜２０
重量％にコントロールしながらグリセライドと反応させ
ることを特徴とする、微生物菌体を用いる油脂のエステ
ル交換方法。２、菌体の水分含量のコントロールを反応液中の水分濃
度をコントロールすることにより行う請求項１記載のエ
ステル交換方法。３、反応液中の水分濃度を５〜１０００ｐｐｍに調整す
る請求項１又は２記載のエステル交換方法。