JP7499267B2 - Atxn2発現を調節するためのオリゴヌクレオチド - Google Patents
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Description
ATXN2を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、米国特許第2017/175113号、国際公開第2015/143246号、および同第2017/117496号でも記載されており、特に国際公開第2017/117496号は、ALSの処置に関する。Scolesら 2017 Nature 544:362は、小脳にてATXN2を低下させるアンチセンスオリゴヌクレオチドの能力について評価しており、SCA2に対する潜在的な治療法を示す、プルキンエ細胞への局在化を示した。
本発明は、インビボおよびインビトロの両方にてATXN2を調節するアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドにより標的にされ、効果的なATXN2阻害をもたらし得る、ヒトATXN2 プレmRNAのイントロン9に存在する、特異的な標的配列を識別した。特に、配列番号1の位置83118~83146を標的にするのが、ATXN2の低下という観点から有利である。
TCAcAttttactttaacCTC(配列番号15_4)
(式中、大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、全てのLNA Cが5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)
で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
のオリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容され得る塩を提供する。
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に一般的に理解されているように、共有結合した2つ以上のヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合したヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製および単離によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾に対して言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、通常は精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば2’糖修飾ヌクレオシド等の1種以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続する配列にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってsiRNAまたはshRNAではない。
用語「連続するヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書中で用語「連続する核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全てのヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続するヌクレオチド配列、例えばF-G-F’ギャップマー領域を含み、任意に、さらなるヌクレオチド(複数可)、例えば、官能基を連続するヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても、相補的でなくてもよい。
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のためには、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つまたは複数のリン酸基(ヌクレオシドには存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称され得る。
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと比較して、糖部分または(核酸)塩基部分の1つまたは複数の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。修飾ヌクレオシドという用語はまた、本明細書で用語「ヌクレオシドアナログ」または修飾された「単位」または修飾された「モノマー」と互換的に使用され得る。非修飾DNAまたはRNA糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと称される。DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、Watson Crick塩基対形成が可能であれば、依然として一般にDNAまたはRNAと称される。
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン(例えばアデニンおよびグアニン)およびピリミジン(例えばウラシル、チミンおよびシトシン)部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの際に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然のバリアントとの両方を指す。このようなバリアントは、例えばHiraoら(2012)Accounts of Chemical Research、第45巻、第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 付録37 1.4.1に記載されている。
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、1つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを表す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを表すために文献で使用されている用語である。
用語「相補性」は、ヌクレオシド/ヌクレオチドのWatson-Crick塩基対形成の能力を表す。Watson-Crick塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば、5-メチルシトシンは多くの場合シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のWatson Crick塩基対形成を包含することが理解されよう(例えば、Hiraoら(2012)Accounts of Chemical Research、第45巻、第2055頁およびBergstrom(2009)Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry 付録37 1.4.1を参照されたい)。
5’ ttaaggaggttaaagtaaaatgtgaattt 3’(配列番号:6)
3’ ctccaatttcattttacact 5’(配列番号15)
本明細書で使用される用語「同一性」は、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列(例えば、配列モチーフ)と同一である、核酸分子(例えば、オリゴヌクレオチド)内の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合(パーセントで表される)を指す。したがって、同一性のパーセンテージは、2つの配列(本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における)の間で同一の(一致する)整列された核酸塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率=(一致数×100)/整列領域(例えば、連続ヌクレオチド配列)の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がWatson Crick塩基対を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されよう(例えば、5-メチルシトシンは、同一性%の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる)。
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、2つの核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が対向する鎖上の塩基対との間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成することとして理解されるべきである。2つの核酸鎖間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、多くの場合、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される融解温度(Tm)によって表される。生理学的条件では、Tmは親和性に厳密に比例しない(Mergny and Lacroix,2003,Oligonucleotides 13:515-537)。標準状態ギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、ΔG°=-RTln(Kd)によって反応の解離定数(Kd)に関連付けられる(式中、Rは気体定数であり、Tは絶対温度である)。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との反応のΔG°が非常に低ければ、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが強いことを示している。ΔG°は、水中濃度が1M、pHが7、および温度が37℃の反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔG°はゼロ未満である。ΔG°は、Hansenら,1965,Chem.Comm.36-38、およびHoldgateら,2005,Drug Discov Todayに記載されているように、例えば等温滴定熱量測定(ITC)により、実験的に測定し得る。ΔG°測定のために、市販の装置が入手可能であることは当業者には公知であると思われる。ΔG°は、SantaLucia,1998,Proc Natl Acad Sci USA.95:1460-1465に記載の最近接モデル(nearest neighbor model)を用いて(Sugimotoら,1995,Biochemistry34:11211-11216、およびMcTigueら,2004,Biochemistry43:5388-5405に記載された適切に誘導された熱力学的パラメータを使用し)、数値的に推定し得る。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を確保するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、10~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcal未満の概算ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態ギブス自由エネルギーΔG°により測定される。オリゴヌクレオチドは、8~30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して-10kcalの範囲未満、例えば-15kcal未満、例えば-20kcal未満、および例えば-25kcal未満の概算ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、-10~-60kcal、例えば-12~-40、例えば-15~-30kcalまたは-16~-27kcal、例えば-18~-25kcalの推定ΔG゜値で標的核酸にハイブリダイズする。
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ATXN2をコードする核酸であり、例えば遺伝子、RNA、mRNA、およびプレmRNA、成熟mRNAまたはcDNA配列であり得る。したがって、標的は、ATXN2標的核酸と称され得る。
Fwd=フォワード鎖 ゲノム座標は、プレmRNA配列(ゲノム配列)を提供する。NCBI参照は、mRNA配列(cDNA配列)を提供する。
*アメリカ国立生物工学情報センター参照配列データベースは、ゲノム、転写物およびタンパク質を含む、包括的で統合された、冗長性のない、十分に注釈が付けられた参照配列のセットである。これはwww.ncbi.nlm.nih.gov/refseq.で主催されている。
本明細書で使用される用語「標的配列」は、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む、標的核酸中に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な核酸塩基配列を有する標的核酸上の領域からなる。標的核酸のこの領域は、互換的に標的ヌクレオチド配列、標的配列または標的領域と称され得る。いくつかの実施形態では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば、本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドにより標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
本明細書で使用される用語「標的細胞」は、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施形態では、標的細胞は、インビボまたはインビトロであり得る。いくつかの実施形態では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類細胞、例えば、マウス細胞もしくはラット細胞、または霊長類細胞、例えば、サル細胞もしくはヒト細胞である。
いくつかの実施形態では、標的細胞は、プルキンエ細胞などのプルキンエニューロンであり得る。他の関係する標的細胞は、上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンなどの、運動ニューロンである。
天然に存在するバリアント
本明細書で使用される用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のATXN2の量と比較したときに、ATXN2の量を変更するオリゴヌクレオチドの能力の総称として理解されるべきである。あるいは、発現の調節は、対照実験を参照することによって決定され得る。対照は、生理食塩水組成物で処置された個体もしくは標的細胞、または非標的化オリゴヌクレオチド(モック)で処置された個体もしくは標的細胞であると一般的に理解されている。
高親和性修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば融解温度(Tm)によって測定して、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり+0.5~+12℃、より好ましくは+1.5~+10℃、最も好ましくは+3~+8℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野において公知であり、例えば、多くの2’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸(LNA)が含まれる(例えば、Freier&Altmann;Nucl.Acid Res.,1997,25,4429-4443およびUhlmann;Curr.Opinion in Drug Development,2000,3(2),293-213を参照されたい)。
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、DNAおよびRNAに見られるリボース糖部分と比較した場合に糖部分の修飾を有する、1つまたは複数のヌクレオシドを含み得る。
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’位にHもしくは-OH以外の置換基を有するヌクレオシド(2’置換ヌクレオシド)、またはリボース環の2’炭素と第2の炭素との間に架橋を形成できる2’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばLNA(2’-4’バイラジカル架橋)ヌクレオシドである。
ロックド核酸ヌクレオシド(LNAヌクレオシド)
用語「薬学的に許容され得る塩」は、生物学的にも別様にも望ましくないものではない、遊離塩基または遊離酸の生物学的有効性および特性を保持している塩を指す。
用語「保護基」は、単独または組合せで、化学反応が他の非保護の反応性部位で選択的に行われることができるように、多官能化合物の反応性部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基を、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基またはヒドロキシ保護基である。
ヌクレアーゼ媒介分解は、相補的なヌクレオチド配列と二重鎖を形成するときに、そのような配列の分解を媒介することができるオリゴヌクレオチドを指す。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNase H活性は、相補的RNA分子と二重鎖を形成する場合にRNase Hを動員する、その能力を指す。国際公開第01/23613号は、RNase H活性を決定するためのインビトロ方法を提供し、RNase Hを動員する能力の決定に使用することができる。典型的には、オリゴヌクレオチドが、相補的標的核酸配列が提供された場合に、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中の全てのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するDNAモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第01/23613号(参照により本明細書に組み込まれる)の実施例91~95により提供される方法論を使用したときに決定された初期速度の少なくとも5%、例えば、少なくとも10%または20%超のpmol/l/分で測定された初期速度を有する場合に、このオリゴヌクレオチドはRNase Hを動員し得ると見なされる。RNase H活性の決定に使用するために、組換えヒトRNase H1が、Lubio Science GmbH、Lucerne、Switzerlandから入手可能である。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列はギャップマーであってもよく、また、ギャップマーオリゴヌクレオチドまたはギャップマー設計とも称され得る。アンチセンスギャップマーは、通常、RNase H媒介分解を介して標的核酸を阻害するために使用される。ギャップマー型オリゴヌクレオチドは、少なくとも3つの別個の構造領域、5’-フランク、ギャップおよび3’-フランク、F-G-F’を5’→3’方向で含む。「ギャップ」領域(G)は、オリゴヌクレオチドがRNase Hを動員することを可能にする連続DNAヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、1つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む5’隣接領域(F)、および1つ以上の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む3’隣接領域(F’)と隣接する。領域FおよびF’の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる(すなわち、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである)。いくつかの実施形態では、領域FおよびF’の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、例えばLNAおよび2’-MOEから独立して選択される、高親和性2’糖修飾などの2’糖修飾ヌクレオシドである。
F1-8-G6-16-F’1-8、例えば
F1-8-G8-16-F’2-8
但し、ギャップマー領域F-G-F’の全長は、少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
LNAギャップマーは、領域FおよびF’のいずれか一方または両方が、LNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。ベータ-D-オキシギャップマーは、領域FおよびF’のいずれか一方または両方が、ベータ-D-オキシLNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなるギャップマーである。
いくつかの実施形態では、LNAギャップマーは、式:[LNA]1-5-[領域G]-[LNA]1-5のものであり、領域Gはギャップマー領域Gの定義に規定したとおりである。
フランキング領域は、LNAおよびDNAヌクレオシドの両方を含み得、それらがLNA-DNA-LNAヌクレオシドの交互モチーフを含むので、「交互フランク」と称される。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と称される。「交互フランクギャップマー」はそれ故、LNAギャップマーオリゴヌクレオチドであり、フランクの少なくとも一方(FまたはF’)が、LNAヌクレオシドに加えてDNAを含む。いくつかの実施形態では、領域FもしくはF’の少なくとも一方、または領域FおよびF’の両方は、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む。このような実施形態では、フランキング領域FもしくはF’、またはFおよびF’の両方は、少なくとも3つのヌクレオシドを含み、Fおよび/またはF’領域の最も5’および3’のヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである。
本明細書に開示のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの連続するヌクレオチド配列、例えばギャップマーF-G-F’、ならびにさらに5’および/または3’ヌクレオシドを含むか、またはそれからなり得る。さらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であっても、完全に相補的でなくてもよい。このようなさらなる5’および/または3’ヌクレオシドは、本明細書では領域D’およびD”と称され得る。
F-G-F’;特にF1-8-G6-16-F’2-8
D’-F-G-F’、特にD’1-3-F1-8-G6-16-F’2-8
F-G-F’-D”、特にF1-8-G6-16-F’2-8-D”1-3
D’-F-G-F’-D”、特にD’1-3-F1-8-G6-16-F’2-8-D”1-3。
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cまたは第3の領域)に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す。
結合またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して、ある目的の化学基またはセグメントを別の目的の化学基またはセグメントに結合する、2個の原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接、または結合部分(例えば、リンカーまたはテザー)を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、例えばコンジュゲート部分などの第3の領域(領域C)を、例えば標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続するヌクレオチド配列などの第1の領域(領域A)に共有結合させるよう機能する。
本明細書で使用される用語「処置」は、既存の疾患(例えば、本明細書で言及される疾患または障害)の処置、または疾患の予防(prevention)、すなわち予防(prophylaxis)の両方を指す。したがって、本明細書で言及される処置は、いくつかの実施形態において、予防的であり得ることが認識されよう。
いくつかの実施形態では、本発明の化合物は、脊髄小脳失調症2型(SCA2)または筋萎縮性側索硬化症(ALS)の処置で使用するためのものである。
本発明は、式
TCAcAttttactttaacCTC(配列番号15_4)
(式中、大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、全てのLNA Cが5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)
で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
さらなる態様において、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドを製造する方法であって、ヌクレオチド単位を反応させ、それによってオリゴヌクレオチド内に含まれる共有結合された連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、方法を提供する。好ましくは、この方法は、ホスホロアミダイト化学を使用する(例えば、Caruthersら,1987,Methods in Enzymology、第154巻、第287~313頁を参照されたい)。さらなる実施形態において、この方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲーティング部分(リガンド)と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様において、本発明の組成物を製造する方法であって、本発明のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲートされたオリゴヌクレオチドを、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントと混合することを含む、方法が提供される。
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容され得る塩を提供する。好ましい実施形態では、薬学的に許容され得る塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。
さらなる態様において、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび/またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、塩および/またはアジュバントとを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容され得る希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)が含まれ、薬学的に許容され得る塩には、限定するものではないが、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれる。いくつかの実施形態において、薬学的に許容され得る希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、薬学的に許容され得る希釈剤中50~300μM溶液の濃度で使用される。
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療および予防のための研究試薬として利用し得る。
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、非経口(静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、眼内、または髄腔内投与など)を介して投与することができる。
併用療法
オリゴヌクレオチド合成は、当技術分野で一般に知られている。以下は、適用できるプロトコルである。本発明のオリゴヌクレオチドは、使用する装置、支持体および濃度に関してわずかに異なる方法によって生成されている場合がある。
β-シアノエチル-ホスホロアミダイトのカップリング(DNA-A(Bz)、DNA-G(ibu)、DNA-C(Bz)、DNA-T、LNA-5-メチル-C(Bz)、LNA-A(Bz)、LNA-G(dmf)、またはLNA-T)は、アセトニトリル中の0.1Mの5’-O-DMT保護アミダイトおよびアセトニトリル(0.25M)中のDCI(4,5-ジシアノイミダゾール)の溶液を活性剤として用いて行われる。最終サイクルでは、所望の修飾を有するホスホラミダイト、例えばコンジュゲート基を結合するためのC6リンカー、またはそのようなコンジュゲート基を使用できる。ホスホルチオエート結合を導入するためのチオール化は、水素化キサンタン(アセトニトリル/ピリジン9:1中0.01M)を使用することにより行われる。ホスホジエステル結合は、THF/ピリジン/水7:2:1中の0.02Mヨウ素を使用して導入できる。残りの試薬は、オリゴヌクレオチド合成に通常使用される試薬である。
粗化合物は、Phenomenex Jupiter C18 10μ 150x10mmカラムでの取RP-HPLCにより精製される。0.1M酢酸アンモニウムpH8およびアセトニトリルを5mL/分の流速でバッファーとして使用する。収集された画分は凍結乾燥されて、精製された化合物が典型的には白色固体として得られる。
DCI 4,5-ジシアノイミダゾール
DCM:ジクロロメタン
DMF:ジメチルホルムアミド
DMT:4,4’-ジメトキシトリチル
THF:テトラヒドロフラン
Bz:ベンゾイル
Ibu:イソブチリル
RP-HPLC:逆相高速液体クロマトグラフィー
Tmアッセイ
配列番号1の位置83121~83144の領域を標的にする、表4のLNAオリゴヌクレオチドを使用して、3つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。ヒト細胞株のA341、NCI-H23、およびARPE19を、表5に列挙する販売者から購入し、5%CO2で37℃にて、加湿したインキュベーター内で、供給元により推奨される方法で維持した。スクリーニングアッセイのために、細胞を、供給元により推奨される培地内で96マルチウェルプレートに播種した(材料および方法セクションの、表5を参照のこと)。1ウェル当たりの細胞数は、各細胞株に対して最適化されている(材料および方法セクションの、表5を参照のこと)。
以下のオリゴヌクレオチド濃度:50、15.81、5.00、1.58、0.50、0.16、0.05、および0.016μM(半対数希釈、50μMから8箇所)、およびn=1~2の生物学的複製にて、実施例1に記載するアッセイを使用して、5μMにおいて、NCI-H23細胞で20%未満の残留ATXN2 mRNAを示す実施例1のオリゴヌクレオチドの、EC50および有効性(KD)を測定した。
ATXN2 プレmRNA配列(配列番号1)にまたがり、1500個を超えるLNAギャップマーオリゴヌクレオチドを設計し、0.5μMの低用量におけるそれらのインビトロ潜在性を、A431およびU2OS細胞で評価した。結果を図2にまとめている。実線円として表されるホットスポット領域(配列番号6)が、潜在性の高い化合物を提供することが、データから確認される。図3は、選択したホットスポット領域化合物のみを示す。
配列番号1の位置83121~83144の領域もまた標的にする、表11のLNAオリゴヌクレオチドを使用して、3つのヒト細胞株にてオリゴヌクレオチドスクリーンを行った。上記実施例に記載のとおりである。相対的なATXN2 mRNA発現レベルを表11に、対照(PBS処理細胞)の割合として示す。すなわち、値が小さいほど、阻害は大きい。
実施例2に記載の方法論を使用し、開始濃度として10mMを使用して、実施例3で試験した化合物のEC50を測定した。EC50値を以下のとおりに計算した:
化合物37_1=gtgggatacaaattctaggc(式中、下線付き太文字は2’-O-MOEヌクレオシドを表し、太字でない文字はDNAヌクレオシドであり、ヌクレオシド間結合は全てホスホロチオエートである(Scholesら,Nature、第544巻、第362~366頁(2017年4月20日)に開示しているとおり)。
標準的な手順に従い、15日齢のマウスの胚脳から、一次皮質ニューロン培養物を調製した。手短に言うと、37℃、5%CO2の加湿インキュベーター内で2~3時間、培養皿をポリ-L-リジン(50μg/mlポリ-L-リジン、10mM Naテトラボレート、pH8の緩衝液)でコーティングした。皿を、使用前に1×PBSで洗浄した。回収したマウス胚脳をかみそりの刃で切開して均質化し、38mlの切開培地(HBSS、0.01M Hepes、ペニシリン/ストレプトマイシン)に浸した。トリプシン2mlを添加し、細胞を37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、4mlのトリプシンストッパーを添加し、細胞を遠心分離した。
翌日、培地を、96ウェルプレート中の増殖培地(Gibco Neurobasal培地、B27上清、Glutamax、ペニシリン-ストレプトマイシン)および5μM FdUに変更し、所望濃度にて6日間、オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。RNAを全て細胞から分離し、ノックダウン有効性をqPCR分析により測定した。ワンステップqPCR(cDNA合成およびqPCR)のために、RPL4、Mm.PT.58.17609218、またはRPS29、Mm.PT.58.21577577のいずれかのデュプレックスで実施する、1つのATXN2プローブセット(IDT,Leuven,Belgium)(ATXN2_assay1、Mm.PT.58.7178341)と共に、各サンプルを二連で実行した。各反応物に、以前に希釈した4μLのRNA、0.5μLの水、および5.5μLのTaqMan MasterMixを添加した。プレートを遠心分離し、90℃にて40秒間熱閉鎖させた後、氷上で短いインキュベーションを行い、その後、qPCRを使用してサンプルを分析した(50℃にて15分間、および90℃にて3分間、続いて40サイクル、95℃にて5秒間、および60℃にて45秒間の、インキュベーション)。
使用した化合物:7_1、15_4、および37_1(ASO7)
結果を図4に示す。
動物の管理
カゴ1つ当たり5~6匹を収容したC57BL/6JBomTacメスマウス(16-23g、Taconic Biosciences、Ejby、Denmark)にて、化合物のインビボ活性および忍容性を試験した。動物を一定の温度(22±2℃)および湿度(55±10%)に維持したコロニー室で保持し、12時間/日照射した(0600時間点灯)。全ての動物は試験期間中、自由に食物および水を摂取し得た。全てのマウスプロトコルは、デンマーク動物実験国内倫理委員会(Danish National Committee for Ethics in Animal Experiments)によって承認された。
化合物を脳室内(ICV)注射によりマウスに投与した。ICV投与前にマウスの体重を測定し、イソフルランまたはプロポフォールで麻酔した(30mg/kg)。脳室内注射は、皮膚および頭蓋骨を通り右側脳室中へ正確な距離(3.9mm)を貫通するように調節されたスタンドに固定された23ゲージ針を装着したFEPカテーテルを有する、ハミルトン・マイクロ・シリンジを用いて行った。注射されるマウスは、片手の親指と人差し指とで首のひだを保持した。優しくではあるがしっかりとした圧力をかけ、針が頭蓋骨の正中線の右1~2mm(内側外側)と目の後ろ1~2mmとを貫通するように頭を上に押した。試験化合物またはビヒクルのボーラスを、以前に測定した注入速度にて、30秒間注射した。還流を避けるために、マウスをさらに5秒間この位置で保持した後、針から離れるように注意深く下方に引き抜いた。この手順は手術または切開を必要としない。この手順から回復するまで動物を加熱ランプ下に置いた。脳組織(皮質および小脳)、ならびに肝臓および腎臓皮質を、投与の2または4週間後に、薬剤濃度分析、ならびにATXN2 mRNAおよびタンパク質分析のために、ドライアイス上で収集した。
国際公開第2016/126995号に記載されているとおりに動物の挙動を監視することで、急性の毒性を測定した(実施例9を参照のこと)。慢性毒性を、実験の時間経過中の、各動物の体重を監視することで測定し、5%を超える体重減少は、慢性毒性を示す。毒性の兆候を示した顕著な動物を安楽死させ、場合によっては実験を早く終えた(高い割合で動物が毒性の兆候を示す場合、全ての動物を安楽死させた)。
化合物7_1:いずれの動物も、急性の毒性の兆候は示さなかった。1匹のマウスが、実験中(27日間)に体重減少を示した。
化合物37_1(ASO7)は10匹の動物全てにおいて急性の毒性を示し、投与後30分以内に深刻な痙攣を伴い、投与の1時間後に安楽死させる必要があった。
化合物15_3:6匹の動物のうち2匹が急性の毒性を示し、投与の1日後に安楽死させる必要があった。残りの4匹のうち、2匹が、実験中(15日目に終了)に体重減少した。
Qiagen TissueLyzer IIを使用して、MagNA Pure LC RNA Isolation Tissue Lysis Buffer(Roche,Indianapolis,IN)にて、マウスの脳、肝臓、および腎臓サンプルを均質化した。ホモジネートを完全に溶解させるため室温で30分間インキュベートした。溶解後、ホモジネートを3分間13000rpmで遠心分離し、上清を分析に使用した。半分を生物学的分析のために取っておき、もう半分に関して、RNA抽出を直接継続した。
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションELISA法を用いて、10~50倍に希釈した。ビオチン化LNA捕捉プローブ、およびジゴキシゲニン抱合体化LNA検出プローブ(5xSSCTにて両方35nM、それぞれ、検出されるLNAオリゴヌクレオチドの一端に相補性である)を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、30分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたELISAプレートに加えた(Nuncカタログ番号436014)。
RNAを、キットCellular RNA Large Volume Kitを用いるMagNA Pure 96 instrument(Roche、インディアナ州インディアナポリス)を用いて、350μLの上清から精製した。RNAサンプルを、RNaseフリー水中で2ng/μLに標準化し、およびさらなる使用まで-20℃で保存した。
ATXN2タンパク質分析のための、組織の均質化
BCA Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用して測定した全てのタンパク質に基づき、サンプルを0.05mg/mlに正規化した。ATXN2タンパク質の減少をデュプレックス(一次抗体:Mouse Anti-Ataxin-2、1:50、#611378、BD BioscienceおよびAnti-HPRT、1:100、#ab109021、Abcam:二次抗体:抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Protein Simple,San Jose,CA)で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイWES機器(Protein Simple)で分析した。
化合物7_1の作用期間を調査するために、新しい研究を立ち上げた。15_4を、1箇所の時点のみ(7日間)に含めた。手順は、以下のプロトコルを使用する、実施例7に記載されているとおりである。
対象
対象は、投与開始時に体重が2~4kgの、オスおよびメスカニクイザルであった。それぞれの、腰の髄腔内空間に、ポリウレタンカテーテルを埋め込んだ。カテーテルの近位端を、皮下アクセスポートに接続して、髄腔内空間への注射、およびCSFサンプルの引き出しを可能にした。
生活相の間に、臨床的副作用は報告されなかった。組織病理学的には、試験量において、いずれの化合物に対しても懸念は示されなかった。
オリゴ含有量およびATXN2 mRNA分析のための、組織の均質化
生物学的分析に関して、サンプルを、オリゴ含有量測定のために、ハイブリダイゼーションELISA法を用いて、50~100倍に希釈した。ビオチン化LNA捕捉プローブ、およびジゴキシゲニン抱合体化LNA検出プローブ(5xSSCTにて両方35nM、それぞれ、検出されるLNAオリゴヌクレオチドの一端に相補性である)を、希釈したホモジェネート、または関係する規格で希釈し、30分間室温にてインキュベートし、ストレプトアビジンでコーティングしたELISAプレートに加えた(Nuncカタログ番号436014)。
ATXN2 mRNAの減少
RNAを、キットCellular RNA Large Volume Kitを用いるMagNA Pure 96 instrument(Roche、インディアナ州インディアナポリス)を用いて、350μLの上清から精製した。RNAサンプルを、RNaseフリー水中で2ng/μLに標準化し、およびさらなる使用まで-20℃で保存した。
マウス研究と同じ
ATXN2タンパク質の減少
BCA Kit(Thermo Fisher Scientific)を使用して測定した全タンパク質に基づき、小脳および皮質サンプルを0.2mg/mlに正規化した。ATXN2タンパク質の減少をデュプレックス(一次抗体:Mouse Anti-Ataxin-2、1:50、#611378、BD BioscienceおよびAnti-HPRT、1:50、#ab109021、Abcam:二次抗体:抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体、Protein Simple,San Jose,CA)で測定し、メーカーの標準的な手順に従い、キャピラリーウェスタン免疫アッセイWES機器(Protein Simple)で分析した。
Claims (23)
- 式
TCAcAttttactttaacCTC(CMP番号15_4)
(式中、大文字はベータ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドであり、全てのLNA Cが5-メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエートヌクレオシド間結合である)
で表されるアンチセンスオリゴヌクレオチド。 - 薬学的に許容され得る塩の形態である、請求項1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 薬学的に許容され得るナトリウム塩の形態である、請求項1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 薬学的に許容され得るカリウム塩の形態である、請求項1または2に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る希釈剤、溶媒、担体、塩および/またはアジュバントとを含む、医薬組成物。
- 薬学的に許容され得る希釈剤が、滅菌リン酸緩衝生理食塩水である、請求項7に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、1~100mg/mLの濃度の溶液で、前記薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される、請求項7または8に記載の医薬組成物。
- 前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、2~30mg/mLの濃度の溶液で、前記薬学的に許容され得る希釈剤中で使用される、請求項7または8に記載の医薬組成物。
- ATXN2を発現する標的細胞におけるATXN2発現を調節するためのインビトロ法であって、請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲート、または請求項7~10のいずれか一項に記載の医薬組成物を、有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
- ATXN2を発現する標的細胞におけるATXN2発現を調節するための医薬組成物であって、有効量の、請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項6に記載のコンジュゲート、を含む、医薬組成物。
- ATXN2を発現する標的細胞におけるATXN2発現を調節するための医薬の調製のための、請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは請求項6に記載のコンジュゲートの使用。
- 医薬品に使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲート、または請求項7~10のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 脊髄小脳失調症2型(SCA2)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、パーキンソン症候群、およびTDP-43タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患の処置に使用するための、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲート。
- 脊髄小脳失調症2型(SCA2)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、パーキンソン症候群、およびTDP-43タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される神経変性疾患の処置または予防のための医薬の調製のための、請求項1~5のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲート、または請求項7に記載の医薬組成物の使用。
- 治療的、または予防的有効量の、請求項1~5のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または請求項6に記載のコンジュゲートを含む、神経変性疾患を処置または予防するための医薬組成物であって、前記神経変性疾患が、脊髄小脳失調症2型(SCA2)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症(FTD)、パーキンソン症候群、およびTDP-43タンパク質症を伴う状態からなる群から選択される、医薬組成物。
- 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症2型(SCA2)である、請求項15記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート。
- 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)である、請求項15記載のオリゴヌクレオチドまたはコンジュゲート。
- 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症2型(SCA2)である、請求項16記載の使用。
- 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)である、請求項16記載の使用。
- 前記神経変性疾患が脊髄小脳失調症2型(SCA2)である、請求項17記載の医薬組成物。
- 前記神経変性疾患が筋萎縮性側索硬化症(ALS)である、請求項17記載の医薬組成物。
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