JP6989585B2 - 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 - Google Patents
蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6989585B2 JP6989585B2 JP2019231099A JP2019231099A JP6989585B2 JP 6989585 B2 JP6989585 B2 JP 6989585B2 JP 2019231099 A JP2019231099 A JP 2019231099A JP 2019231099 A JP2019231099 A JP 2019231099A JP 6989585 B2 JP6989585 B2 JP 6989585B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sample
- somamer
- seq
- fluorescence
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 37
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 18
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 26
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 22
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 18
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 12
- -1 C-5 modified pyrimidine Chemical class 0.000 claims description 10
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 8
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 6
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 claims description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N [(1s,3r)-3-hydroxy-4-[(3e,5e,7e,9e,11z)-11-[4-[(e)-2-[(1r,3s,6s)-3-hydroxy-1,5,5-trimethyl-7-oxabicyclo[4.1.0]heptan-6-yl]ethenyl]-5-oxofuran-2-ylidene]-3,10-dimethylundeca-1,3,5,7,9-pentaenylidene]-3,5,5-trimethylcyclohexyl] acetate Chemical compound C[C@@]1(O)C[C@@H](OC(=O)C)CC(C)(C)C1=C=C\C(C)=C\C=C\C=C\C=C(/C)\C=C/1C=C(\C=C\[C@]23[C@@](O2)(C)C[C@@H](O)CC3(C)C)C(=O)O\1 UYRDHEJRPVSJFM-VSWVFQEASA-N 0.000 claims description 3
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 claims description 3
- UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N peridinin Natural products CC(=O)OC1CC(C)(C)C(=C=CC(=CC=CC=CC=C2/OC(=O)C(=C2)C=CC34OC3(C)CC(O)CC4(C)C)C)C(C)(O)C1 UTIQDNPUHSAVDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 claims description 2
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 claims description 2
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 claims description 2
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 claims description 2
- ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N coumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C=CC2=C1 ZYGHJZDHTFUPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 229960000956 coumarin Drugs 0.000 claims 1
- 235000001671 coumarin Nutrition 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 41
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 23
- 239000012099 Alexa Fluor family Substances 0.000 description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 17
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 7
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 6
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 6
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 6
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 3
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-1-benzopyran-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(O)=CC2=C1 MJKVTPMWOKAVMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N Digoxigenin Natural products C1CC(C2C(C3(C)CCC(O)CC3CC2)CC2O)(O)C2(C)C1C1=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 2
- 241000495778 Escherichia faecalis Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 2
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 244000062793 Sorghum vulgare Species 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 235000013405 beer Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N digitoxigenin Natural products CC12CCC(C3(CCC(O)CC3CC3)C)C3C11OC1CC2C1=CC(=O)OC1 QONQRTHLHBTMGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N digoxigenin Chemical compound C1([C@@H]2[C@@]3([C@@](CC2)(O)[C@H]2[C@@H]([C@@]4(C)CC[C@H](O)C[C@H]4CC2)C[C@H]3O)C)=CC(=O)OC1 SHIBSTMRCDJXLN-KCZCNTNESA-N 0.000 description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- HQCYVSPJIOJEGA-UHFFFAOYSA-N methoxycoumarin Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(OC)=CC2=C1 HQCYVSPJIOJEGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-[2-[2-[2-[2-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethoxy]propanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCOCCOCCOCCOCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O DTLVBHCSSNJCMJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 2-(4,4-difluoropiperidin-1-yl)-6-methoxy-n-(1-propan-2-ylpiperidin-4-yl)-7-(3-pyrrolidin-1-ylpropoxy)quinazolin-4-amine Chemical compound N1=C(N2CCC(F)(F)CC2)N=C2C=C(OCCCN3CCCC3)C(OC)=CC2=C1NC1CCN(C(C)C)CC1 RNAMYOYQYRYFQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 3-aminochromen-2-one Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(N)=CC2=C1 QWZHDKGQKYEBKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004507 Abelmoschus esculentus Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 241000219318 Amaranthus Species 0.000 description 1
- 240000001592 Amaranthus caudatus Species 0.000 description 1
- 235000009328 Amaranthus caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 244000144725 Amygdalus communis Species 0.000 description 1
- 241000269350 Anura Species 0.000 description 1
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 1
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 description 1
- 244000003416 Asparagus officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005340 Asparagus officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 235000000832 Ayote Nutrition 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 240000007124 Brassica oleracea Species 0.000 description 1
- 235000003899 Brassica oleracea var acephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000011299 Brassica oleracea var botrytis Nutrition 0.000 description 1
- 235000017647 Brassica oleracea var italica Nutrition 0.000 description 1
- 235000012905 Brassica oleracea var viridis Nutrition 0.000 description 1
- 240000003259 Brassica oleracea var. botrytis Species 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 241000282832 Camelidae Species 0.000 description 1
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 1
- 240000006162 Chenopodium quinoa Species 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000555825 Clupeidae Species 0.000 description 1
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 description 1
- 240000004244 Cucurbita moschata Species 0.000 description 1
- 235000009854 Cucurbita moschata Nutrition 0.000 description 1
- 235000009804 Cucurbita pepo subsp pepo Nutrition 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000008620 Fagopyrum esculentum Species 0.000 description 1
- 235000009419 Fagopyrum esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 101710108819 Heme oxygenase (staphylobilin-producing) Proteins 0.000 description 1
- 101710189804 Heme-degrading monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 241000758791 Juglandaceae Species 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 240000008415 Lactuca sativa Species 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241000289619 Macropodidae Species 0.000 description 1
- 240000003183 Manihot esculenta Species 0.000 description 1
- 235000016735 Manihot esculenta subsp esculenta Nutrition 0.000 description 1
- MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N Muraminsaeure Natural products OC(=O)C(C)OC1C(N)C(O)OC(CO)C1O MSFSPUZXLOGKHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010013639 Peptidoglycan Proteins 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 108010010677 Phosphodiesterase I Proteins 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 108010034546 Serratia marcescens nuclease Proteins 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000040738 Sesamum orientale Species 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 108091006014 Strep-tagged proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 244000090207 Vigna sesquipedalis Species 0.000 description 1
- 235000005072 Vigna sesquipedalis Nutrition 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000020224 almond Nutrition 0.000 description 1
- 235000012735 amaranth Nutrition 0.000 description 1
- 239000004178 amaranth Substances 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 235000020246 buffalo milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 101150085107 clfA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000000882 contact lens solution Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960002086 dextran Drugs 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 102000025748 fibrinogen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009104 fibrinogen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 235000012041 food component Nutrition 0.000 description 1
- 239000005417 food ingredient Substances 0.000 description 1
- 244000078673 foodborn pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000012055 fruits and vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 235000015143 herbs and spices Nutrition 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L lucifer yellow dye Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]S(=O)(=O)C1=CC(C(N(C(=O)NN)C2=O)=O)=C3C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC3=C1N DLBFLQKQABVKGT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013048 microbiological method Methods 0.000 description 1
- 235000019713 millet Nutrition 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000021278 navy bean Nutrition 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108091008104 nucleic acid aptamers Proteins 0.000 description 1
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 1
- VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N pacific blue Chemical compound FC1=C(O)C(F)=C2OC(=O)C(C(=O)O)=CC2=C1 VYNDHICBIRRPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 1
- MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N pentaglycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O MXHCPCSDRGLRER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 235000012015 potatoes Nutrition 0.000 description 1
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000015136 pumpkin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 235000020253 reindeer milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 235000012045 salad Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 235000019512 sardine Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 235000020234 walnut Nutrition 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 244000000028 waterborne pathogen Species 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1434—Optical arrangements
- G01N15/1436—Optical arrangements the optical arrangement forming an integrated apparatus with the sample container, e.g. a flow cell
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
- G01N2021/6439—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes" with indicators, stains, dyes, tags, labels, marks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2201/00—Features of devices classified in G01N21/00
- G01N2201/06—Illumination; Optics
- G01N2201/061—Sources
- G01N2201/06113—Coherent sources; lasers
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Description
NAATは、数時間で汚染結果を与えることが知られている。しかしながら、この技術は、高い技術力を必要とするプロトコールの複雑性または偽陽性の問題などのいくつかの欠点を有し、未だサンプル調製方法によって制限されている。
イムノアッセイは、標的微生物を捕捉および/または検出するために、特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用に依存する。イムノアッセイの効率および成功は、試験で使用される抗体の品質に依存する。抗体を使用することの1つの欠点は、それらが生産される方法(動物内、または細胞培養による)に起因するバッチ間の再現性の問題である。
DNAアプタマーは、既に微生物(S.aureusを含む)の検出のために使用されてきた。さらに、蛍光標識DNAアプタマーはまた、蛍光ベースの方法を使用した全細菌細胞(whole bacterial cell)の検出について報告されている:
WO 2013/064818 A1は、サンプル中の病原性細菌の検出のための蛍光標識アプタマーを開示している。
Ochsner at al.(2013, Diagn Microbiol Infect Dis. 76, 278-285)は、Clostridium difficile毒素、すなわち微生物タンパク質に特異的なSOMAmerの特性評価を記載している。
全細菌細胞を検出するためのSOMAmerの使用は、従来技術において記載されていない。
驚くべきことに、特異性の高い蛍光標識SOMAmerが、蛍光ベースの方法を介して複雑なサンプル中の微生物を検出するための極めて有効なツールであることが見出された。
a)蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)と共にサンプルをインキュベートするステップ、
b)任意にサンプルを洗浄するステップ、
c)蛍光ベースの検出方法により、サンプルを分析するステップ
を含む、サンプル中の微生物を検出する方法に関する。
本発明を実施するために必要な慣用の化学的、微生物学的および分子生物学的方法は、当業者に知られており、また、標準的な文献中にも見出し得る。
それは、例えば、Salmonella spp.(Salmonella typhimurium、Salmonella enteritidisなど)、Escherichia coli、Listeria spp、Listeria monocytogenes、Staphylococcus aureus、Pseudomonas、Campylobacter、Shigella、Streptococcus、 Mycobacterium、Burkholderia、Legionella、Yersinia、Clostridium、CorynebacteriumおよびVibrioからなる群から選択され得る。
本発明の好ましい態様において、微生物は、Staphylococcus aureusである。
本発明に係るSOMAmerは、抗体と類似の様式で使用し得る。抗体と同様に、SOMAmerは標的結合特異性を提供する。
配列同一性の比較は、目視によって、またはより一般的には、容易に入手可能な配列比較プログラムの助けを借りて実施し得る。これら商業的に入手可能なコンピュータープログラムは、2以上の配列間の同一性の%を計算し得る。
標識は、SOMAmerの5’または3’末端のいずれかに取り付けることができる。好ましい態様において、標識は、SOMAmerの5’末端に取り付けられる。当業者は、核酸鎖に蛍光標識を取り付けるための技術をよく知っている。これらの方法のいずれか、例えば、Schubert et al, 1990, Nucleic Acids Research 18,3427に記載されているものを、SOMAmerへ蛍光標識を取り付けるために本発明において利用し得る。原理的には、蛍光標識は、オリゴヌクレオチドの合成中または合成後に取り付けることができる。
典型的には、インキュベーションのための期間は、1分から60分の間、好ましくは5分から30分の間である。
本発明に従って使用されるSOMAmerの濃度は、当業者によって決定され得る。
典型的に、洗浄は、サンプルを遠心分離し、ペレットをバッファー中に再懸濁することを意味する。洗浄ステップは、1回行うか、または複数回、例えば、2回、3回または4回反復することができる。
蛍光顕微鏡法は、画像化された特徴が小さく、光学的拡大を介して得られる蛍光イメージングシステムの一例である。
標的分析物を含有し得る試料は、適切な孔サイズ(すなわち、細菌については0.4μm)を有するブラックメンブランフィルター(例えばポリエステルまたはポリカーボネート)上で濾過される。次いで、保持された細胞は、適切な蛍光分子で標識された、標的分析物に特異的な試薬(例えばSOMAmer)で標識される。フィルターは、その後、一連の検出ユニットにより膜上の蛍光イベント(例えば標識された微生物)を検出することを可能にするレーザーによりスキャンされる。これは膜上の標的分析物の検出および計数を可能にする(Reynolds and Fricker 1999, J Appl Microbiol 86, 785−795、Vanhee et al. 2009, Nat Protoc 4, 224-231)。
−励起:488nm(青色レーザー)+発光:530nm(フルオロセイン、Alexa Fluor(登録商標)488)、585nm(R−フィコエリトリン−R−PE)および>670nm(ペリジニン クロロフィル−PerCP)
−励起:532〜561nm(緑色および黄色/緑色レーザー)+発光:560(Alexa Fluor(登録商標)532)、585(R−PE−R−フィコエリトリン)
−励起:635nm(赤色レーザー)+発光:660nm(アロフィコシアニン−APC/シアニン5−Cy5/eFluor(登録商標)660/Alexa Fluor(登録商標)647)
−溶液中での並外れた熱安定性
−より低い分子量
−より高い多重化能
−熱、乾燥および溶媒に対する化学的安定性
−可逆的な再生
−試薬製造の容易性
−一貫したロット間の性能
−より低いコスト
SOMAmer、蛍光標識およびそれらの好ましい態様は上記のとおり定義されている。
さらなる態様において、本発明は、上で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの、サンプル中のStaphylococcus aureus細胞を検出するための使用に関する。
本発明はまた、上記で定義された蛍光標識を含むSOMAmerの少なくとも1つを含むマイクロアレイまたはバイオセンサーに関する。
所望の標的または標的ドメインをコードする遺伝子の関連部分を、S.aureus NRS384(USA300)のゲノムDNAから、表1に示されるプライマーによりPCR増幅し、pCR-Script SK+(Stratagene)中にクローニングした。clfA遺伝子は、アミノ末端にStrep−タグおよびカルボキシ末端にHis10−タグを保有する発現ベクターpET-51b(EMD-Novagen)にBamHI-SacIカセットとして移される。プラスミドを、遺伝子同一性、および、HisタグおよびStrepタグに関するベクターがコードする配列とのクローン化DNA断片の適切な遺伝子融合を確認するために配列決定する。
5−ベンジルアミノカルボニル−dU(BndU)、5−ナフチルメチルアミノカルボニル−dU(NapdU)、および5−トリプタミノカルボニル−dU(TrpdU)による別々のライブラリーを、S.aureusタンパク質とのSELEXのために使用する。各選択は、PCR増幅のために必要な固定配列に挟まれた40個の連続するランダムに選択した位置を含む1nmol(1014〜1015)の配列から開始する。SELEXは、基本的に記載されたとおりに行う(Gold et al. 2010, PLoS One 5: e15004、Ochsner et al. 2013, Diagn Microbiol Infect Dis.、Vaught et al. 2010, J Am Chem Soc 132: 4141-4151)。pH7.5の40mMのHEPES、0.1MのNaCl、5mMのKCl、5mMのMgCl2および0.05%のTween−20からなるバッファーSB18TをSELEXおよびその後の結合アッセイにわたって使用する。
合成SOMAmerは、標準的なホスホラミダイト化学を介して、1μmolスケールで48〜50マーとして調製し、HPLCで精製する。それらは、5’ビオチン−dAまたは5’フルオロセイン−ビオチン−dA、および、3’→5’エキソヌクレアーゼに対する追加の安定性ための3’末端の反転dTヌクレオチド(3’idT)を含む。
SOMAmerは、結合アッセイの前に、95℃で5分間の加熱を介して正しく折り畳まれ、その後、10〜15分間かけて室温まで冷却される。
親和性(Kd’s)は、段階希釈したタンパク質(0.001〜100nM)およびフィルタープレート上に分離するためのZorbax PSM-300A(Agilent Technologies)樹脂による、放射性標識SOMAmer(10〜20pM)の平衡溶液結合アッセイにより、記載されたとおりに決定する(Gold et al. 2010)。
クローニングの前に、SOMAmerのプールはまた、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliおよびP.aeruginosaをコントロールとして使用し、2時間の平衡結合アッセイにおいてS.aureusへの特異的結合について試験する。
プールの親和性アッセイにより、BndU、NapdUまたはTrpU修飾ssDNAにより得られた合計22プールのSOMAmerの成功した選択を確認し、プールの親和性は0.13〜8.90nMの範囲である。S.aureus細胞への特異的結合が観察されるが、S.epidermidis、S.hemolyticus、S.pyogenes、E.faecalis、E.coliまたはP.aeruginosaへの結合は観察されない。
各プールからの48個のクローンについて決定された配列のアラインメントは、共通の配列パターンを共有するマルチコピークローンおよびファミリーを示す。代表的なクローンを親和性アッセイにおいてスクリーニングし、最良のSOMAmerのKd’sは、0.03〜2.17nMの範囲である(表2)。
SOMAmerの配列は表3にリストされている。
フローサイトメトリー実験における使用のために、5’ABflT(ビオチンおよびフルオレセイン)を含む48マーとして上記のようにプロテインA(SpA)に対するSOMAmerを合成する。活性は、4520−8(配列番号3)(Kd=0.17nM)および4531−56(配列番号1)(Kd=0.09nM)について確認される。
トリプケースソイブロス(TSB;bioMerieux, Craponne, France)にStaphylococcus aureus DSM 1104(またはATCC25923)の凍結保存培養物を接種し、振盪しながら32.5℃で一晩インキュベートする。次いで、一晩培養物を、ワーキング培養物がOD600にて0.8(約108細菌ml−1)に達するまで、新鮮なTSB中32.5℃にて振盪しながら継代培養し、チューブあたり約107細胞のアリコートに分割する。細菌を、2分間、10000gの遠心分離によって回収する。
蛍光標識されたSpA SOMAmer 4520−8(配列番号3)および4531−56(配列番号1)を、フローサイトメトリーによるS.aureusの検出についてそれらの効率を評価するために使用する。どちらのSOMAmerもS.aureus全細胞を染色することに良好に機能する。
細胞の100%は、0.07μmoll−1の低いSpA SOMAmer濃度で早くも染色されるが、平均蛍光強度は、0.7μmoll−1および7μmoll−1の高い試薬濃度において大幅に増加する(図1a)。データは、蛍光標識SOMAmerによる、極めて豊富な細胞表面成分の飽和度の予期された増加と一致する。陰性集団(未染色細胞)と陽性集団(染色細胞)との間のフローサイトメトリーによる正確な区別を確保するSpA SOMAmerの最小濃度は0.07μmoll−1に設定することができる(図1b)。
本発明に係るSOMAmerの、特有の遅いオフレート特性により、これらの試薬は、標準的なRNAまたはDNAアプタマーと比較して、より優れた親和性およびより良好な力学的特性を有するはずである。この見解を証明するために、本発明に係るSpA SOMAmerを、S.aureusに特異的なDNAアプタマー(未知標的抗原)と比較する。
本発明のアプタマーおよび標準アプタマーの両方についてのプロトコールは、例4に記載したものと同様である(標準アプタマーの例外:アッセイの前にアプタマーの加熱なし;結合バッファーとしてPBSを使用)。
S.aureus DSM 1104を用いて得られたフローサイトメトリーの結果:
Claims (6)
- サンプル中の微生物を検出する方法であって
a)蛍光標識を含むオフレートの遅い修飾アプタマー(SOMAmer)と共にサンプルをインキュベートするステップ、
b)任意にサンプルを洗浄するステップ、
c)蛍光ベースの検出方法によってサンプルを分析するステップ
を含み、
SOMAmerが、配列番号1のヌクレオチド配列を含み、
配列番号1における「T」ヌクレオチドは、C−5修飾ピリミジンであり、
微生物が、Staphylococcus aureusである、前記方法。 - 蛍光ベースの検出方法が、フローサイトメトリー、固相サイトメトリー、蛍光ベースの分析方法および蛍光イメージングシステムからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- サンプルが、臨床サンプル、食品または飼料サンプル、飲料サンプル、医薬品サンプル、パーソナルケアまたは化粧品サンプルおよび/または水サンプルであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- SOMAmerが、Staphylococcus aureusに特異的なヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 蛍光標識が、フルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、ペリジニンクロロフィル(PerCP)、R−フィコエリトリン、クマリン色素および量子ドットからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- SOMAmerが、配列番号1のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14290046 | 2014-02-21 | ||
EP14290046.3 | 2014-02-21 | ||
EP14290047 | 2014-02-21 | ||
EP14290047.1 | 2014-02-21 | ||
JP2016570171A JP2017506912A (ja) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016570171A Division JP2017506912A (ja) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2020072679A JP2020072679A (ja) | 2020-05-14 |
JP2020072679A5 JP2020072679A5 (ja) | 2021-03-04 |
JP6989585B2 true JP6989585B2 (ja) | 2022-01-05 |
Family
ID=52577818
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016570171A Pending JP2017506912A (ja) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 |
JP2019231099A Active JP6989585B2 (ja) | 2014-02-21 | 2019-12-23 | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016570171A Pending JP2017506912A (ja) | 2014-02-21 | 2015-02-20 | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10526663B2 (ja) |
EP (1) | EP3108007B1 (ja) |
JP (2) | JP2017506912A (ja) |
CN (1) | CN106164292A (ja) |
ES (1) | ES2736474T3 (ja) |
WO (1) | WO2015124315A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2015126769A1 (en) * | 2014-02-18 | 2015-08-27 | Somalogic, Inc. | Compositions and methods for detecting microorganisms |
JP7314456B2 (ja) * | 2018-12-06 | 2023-07-26 | 株式会社マツモト精密工業 | 牛乳の検査装置 |
JP7286070B2 (ja) * | 2021-01-31 | 2023-06-05 | 株式会社バランス・イースト | 検査システム、検査方法、プログラム、およびコンピュータが読み取り可能な記憶媒体 |
WO2023287511A2 (en) * | 2021-06-02 | 2023-01-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions related to engineered biosensors |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7947447B2 (en) * | 2007-01-16 | 2011-05-24 | Somalogic, Inc. | Method for generating aptamers with improved off-rates |
US9562900B2 (en) | 2008-02-21 | 2017-02-07 | Otc Biotechnologies, Llc | Methods and compositions of nucleic acid ligands for detection of foodborne and waterborne pathogens |
WO2013064818A1 (en) | 2011-10-31 | 2013-05-10 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Aptamers |
WO2015126769A1 (en) * | 2014-02-18 | 2015-08-27 | Somalogic, Inc. | Compositions and methods for detecting microorganisms |
-
2015
- 2015-02-20 ES ES15706159T patent/ES2736474T3/es active Active
- 2015-02-20 US US15/119,987 patent/US10526663B2/en active Active
- 2015-02-20 WO PCT/EP2015/000393 patent/WO2015124315A1/en active Application Filing
- 2015-02-20 CN CN201580009181.7A patent/CN106164292A/zh active Pending
- 2015-02-20 EP EP15706159.9A patent/EP3108007B1/en active Active
- 2015-02-20 JP JP2016570171A patent/JP2017506912A/ja active Pending
-
2019
- 2019-12-23 JP JP2019231099A patent/JP6989585B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2736474T3 (es) | 2020-01-02 |
WO2015124315A1 (en) | 2015-08-27 |
US20170051337A1 (en) | 2017-02-23 |
JP2017506912A (ja) | 2017-03-16 |
CN106164292A (zh) | 2016-11-23 |
JP2020072679A (ja) | 2020-05-14 |
EP3108007B1 (en) | 2019-04-17 |
EP3108007A1 (en) | 2016-12-28 |
US10526663B2 (en) | 2020-01-07 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6989585B2 (ja) | 蛍光ベースの検出方法によるサンプル中の微生物を検出する方法 | |
Rajapaksha et al. | A review of methods for the detection of pathogenic microorganisms | |
Moon et al. | Identification of Salmonella Typhimurium-specific DNA aptamers developed using whole-cell SELEX and FACS analysis | |
Wu et al. | A sensitive aptasensor for the detection of Vibrio parahaemolyticus | |
López-Campos et al. | Detection, identification, and analysis of foodborne pathogens | |
Shoaib et al. | A comprehensive review on the prevalence, pathogenesis and detection of Yersinia enterocolitica | |
JP2010537650A (ja) | 細菌及び真菌の検出方法 | |
CN109055381B (zh) | 用于鳗弧菌特异性识别的ssDNA核酸适配体及筛选与应用 | |
CN110093350B (zh) | 一种特异性识别副溶血性弧菌的优化适配体序列及其应用 | |
CN113249499B (zh) | 一种伤寒沙门氏菌的检测试剂盒、其制备方法及其应用 | |
EP3902929A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
CN114891902A (zh) | 一种基于液滴数字pcr快速检测五种烈性病原菌的引物探针组合及其应用方法 | |
Hogmander et al. | Luminometric label array for counting and differentiation of bacteria | |
CN109097365B (zh) | 用于创伤弧菌识别的核酸适配体及筛选方法与应用 | |
JP2003164282A (ja) | 微生物の検出方法、及び微生物の検出用プライマーセット | |
Zhuang et al. | Progress in methods for the detection of viable Escherichia coli | |
Li et al. | PMAxx combined with recombinase aided amplification technique for specific and rapid detection of Salmonella in milk | |
KR20180052991A (ko) | 살모넬라 타이피뮤리움 생균의 표면에 특이적으로 결합하는 dna 앱타머 및 이의 용도 | |
Brehm-Stecher et al. | Rapid methods for detection of Listeria | |
JP4982849B2 (ja) | 細菌検出およびグラム陽性/陰性識別方法 | |
Thongphueak et al. | Development of the rapid test kit for the identification of Campylobacter spp. Based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in combination with a lateral flow dipstick (LFD) and gold nano-DNA probe (AuNPs) | |
JP5006607B2 (ja) | 核酸増幅反応における阻害を回避する方法 | |
JP2010022336A (ja) | 培養併用insituハイブリダイゼーション法により生きているカンピロバクター菌を迅速かつ特異的に計数するための遺伝子プローブ及びその方法 | |
Vidic et al. | Role of real-time DNA analyses, biomarkers, resistance measurement, and ecosystem management in Campylobacter risk analysis | |
JP2006081506A (ja) | 微生物の高感度迅速検出方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200122 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200122 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20200213 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20200528 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20201224 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210216 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210512 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210811 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20211102 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20211202 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6989585 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |