JP6853514B2 - 炎症性サイトカインの産生が抑制されるキメラ抗原受容体遺伝子改変リンパ球 - Google Patents
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Description
以下の発明は、以上の成果及び考察に基づく。
[1]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子とともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクト及び/又は腫瘍壊死因子α遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第2核酸コンストラクトを標的細胞に導入するステップ、を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法。
[2]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子、第1核酸コンストラクト、及び第2核酸コンストラクトの導入が、トランスポゾン法によって行われる、[1]に記載の調製方法。
[3]トランスポゾン法がpiggyBacトランスポゾン法である、[2]に記載の調製方法。
[4]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子と、第1核酸コンストラクト及び/又は第2発現コンストラクトが同一のベクターに搭載され、該ベクターが標的細胞に導入される、[1]〜[3]のいずれか一項に記載の調製方法。
[5]標的細胞がT細胞である、[1]〜[4]のいずれか一項に記載の調製方法。
[6][1]〜[5]のいずれか一項に記載の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現するとともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNA及び/又は腫瘍壊死因子α遺伝子を標的とするsiRNAが細胞内で生成される、遺伝子改変リンパ球。
[7][6]に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
[8][6]に記載の遺伝子改変リンパ球を、治療上有効量、がん患者に投与するステップを含む、がんの治療法。
[9]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体発現カセットとともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクト及び/又は腫瘍壊死因子α遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第2核酸コンストラクトを含むsiRNA発現カセットを搭載したベクター。
[10]キメラ抗原受容体発現カセットとsiRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備える、[9]に記載のベクター。
[11][10]に記載のベクターと、トランスポザーゼ発現ベクターを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
[12]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体発現カセットを搭載したベクターと、
インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクト及び/又は腫瘍壊死因子α遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第2核酸コンストラクトを含むsiRNA発現カセットを搭載したベクターと、
を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
[13]キメラ抗原受容体発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
siRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
トランスポザーゼ発現ベクターを更に含む、[12]に記載の調製キット。
[14]標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体第1発現カセットを搭載したベクターと、
インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクトを含む第1siRNA発現カセットを搭載したベクターと、
腫瘍壊死因子α遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第2核酸コンストラクトを含む第2siRNA発現カセットを搭載したベクターと、
を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
[15]キメラ抗原受容体発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
第1siRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
第2siRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
トランスポザーゼ発現ベクターを更に含む、[14]に記載の調製キット。
[16]トランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼである、[11]、[13]、[15]のいずれか一項に記載の調製キット。
本発明はキメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球(CAR遺伝子導入リンパ球)の調製方法に関する。本発明の調製方法で得られるCAR遺伝子導入リンパ球はCAR療法に利用することができる。本発明の調製方法では、以下のステップ、即ち、標的抗原特異的キメラ抗原受容体(CAR)遺伝子とともに、インターロイキン6(以下、「IL-6」と呼ぶ)遺伝子を標的とするsiRNA(以下、「IL-6 siRNA」と呼ぶ)を細胞内で生成する第1核酸コンストラクト及び/又は腫瘍壊死因子α(以下、「TNF-α」と呼ぶ)遺伝子を標的とするsiRNA(以下、「TNF-α siRNA」と呼ぶ)を細胞内で生成する第2核酸コンストラクトを標的細胞に導入するステップ、を行う。このステップによって、標的抗原特異的CAR遺伝子に加え、IL-6 siRNAを発現する細胞(第1核酸コンストラクトを導入した場合)、標的抗原特異的CAR遺伝子に加え、TNF-α siRNAを発現する細胞(第2核酸コンストラクトを導入した場合)、又は標的抗原特異的CAR遺伝子に加え、IL-6 siRNAとTNF-α siRNAを発現する細胞(第1核酸コンストラクトと第2核酸コンストラクトの両者を導入した場合)が得られる。尚、特に言及しない限り、本明細書における各種細胞(例えばT細胞)はヒト細胞である。
細胞外ドメインは標的に特異的な結合性を示す。例えば、細胞外ドメインは、抗標的モノクローナル抗体のscFv断片を含む。ここでのモノクローナル抗体として、例えば、齧歯類(マウス、ラット、ウサギなど)の抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体等が用いられる。ヒト化モノクローナル抗体は、他の動物種(例えばマウスやラット)のモノクローナル抗体の構造をヒトの抗体の構造に類似させた抗体であり、抗体の定常領域のみをヒト抗体のものに置換したヒト型キメラ抗体、及び定常領域及び可変領域に存在するCDR(相補性決定領域)以外の部分をヒト抗体のものに置換したヒト型CDR移植(CDR-grafted)抗体(P.T.Johons et al., Nature 321,522(1986))を含む。ヒト型CDR移植抗体の抗原結合活性を高めるため、マウス抗体と相同性の高いヒト抗体フレームワーク(FR)を選択する方法、相同性の高いヒト型化抗体を作製する方法、ヒト抗体にマウスCDRを移植した後さらにFR領域のアミノ酸を置換する方法の改良技術もすでに開発され(米国特許第5585089号、米国特許第5693761号、米国特許第5693762号、米国特許第6180370号、欧州特許第451216号、欧州特許第682040号、特許第2828340号などを参照)、ヒト化抗体の作製に利用することもできる。
膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと細胞内シグナルドメインの間に介在する。膜貫通ドメインとしては、CD28、CD3ε、CD8α、CD3、CD4又は4-1BBなどの膜貫通ドメインを用いることができる。人工的に構築したポリペプチドからなる膜貫通ドメインを用いることにしてもよい。
細胞内シグナルドメインは、免疫細胞のエフェクター機能の発揮に必要なシグナルを伝達する。即ち、細胞外ドメインが標的の抗原と結合した際、免疫細胞の活性化に必要なシグナルを伝達することが可能な細胞内シグナルドメインが用いられる。細胞内シグナルドメインには、TCR複合体を介したシグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第1ドメイン」と呼ぶ)と、共刺激シグナルを伝達するためのドメイン(便宜上、「第2ドメイン」と呼ぶ)が含まれる。第1ドメインとして、CD3ζの他、FcεRIγ等の細胞内ドメインを用いることができる。好ましくは、CD3ζが用いられる。また、第2ドメインとしては共刺激分子の細胞内ドメインが用いられる。共刺激分子としてCD28、4-1BB(CD137)、CD2、CD4、CD5、CD134、OX-40又はICOSを例示することができる。好ましくは、CD28又は4-1BBの細胞内ドメインを採用する。
CARの分泌を促すために、リーダー配列(シグナルペプチド)が用いられる。例えば、GM-CSFレセプターのリーダー配列を用いることができる。また、細胞外ドメインと膜貫通ドメインがスペーサードメインを介して連結した構造にするとよい。即ち、好ましい態様のCARは、細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間にスペーサードメインを含む。スペーサードメインは、CARと標的抗原との結合を促進させるために用いられる。例えば、ヒトIgG(例えばヒトIgG1、ヒトIgG4)のFc断片をスペーサードメインとして用いることがきる。その他、CD28の細胞外ドメインの一部やCD8αの細胞外ドメインの一部等をスペーサードメインとして用いることもできる。尚、膜貫通ドメインと細胞内シグナルドメインの間にもスペーサードメインを設けることもできる。
本発明の第2の局面は、本発明の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球(以下、「本発明のCAR遺伝子導入リンパ球」と呼ぶ)及びその用途に関する。本発明のCAR遺伝子導入リンパ球はCAR療法が有効と考えられる各種疾患(以下、「標的疾患」と呼ぶ)の治療、予防又は改善に利用され得る。標的疾患の代表はがんであるが、これに限定されるものではない。標的疾患の例を挙げると、各種B細胞リンパ腫(濾胞性悪性リンパ腫、びまん性悪性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、MALTリンパ腫、血管内B細胞性リンパ腫、CD20陽性ホジキンリンパ腫など)、骨髄増殖性腫瘍、骨髄異形成/骨髄増殖性腫瘍(CMML,JMML,CML,MDS/MPN-UC)、骨髄異形成症候群、急性骨髄生白血病、神経芽腫、脳腫瘍、ユーイング肉腫、骨肉腫、網膜芽細胞腫、肺小細胞腫、メラノーマ、卵巣がん、横紋筋肉腫、腎臓がん、膵臓がん、悪性中皮腫、前立腺がん等である。「治療」とは、標的疾患に特徴的な症状又は随伴症状を緩和すること(軽症化)、症状の悪化を阻止ないし遅延すること等が含まれる。「予防」とは、疾病(障害)又はその症状の発症/発現を防止又は遅延すること、或いは発症/発現の危険性を低下させることをいう。一方、「改善」とは、疾病(障害)又はその症状が緩和(軽症化)、好転、寛解、又は治癒(部分的な治癒を含む)することをいう。
本発明の更なる局面は本発明の調製方法に利用可能なベクター(CAR遺伝子導入リンパ球調製ベクター)及びキット(CAR遺伝子導入リンパ球調製キット)に関する。本発明のCAR遺伝子導入リンパ球調製ベクターは、CAR発現カセットとsiRNA発現カセットを搭載したもの(即ち、CAR-siRNAベクター)であり、一つのベクターで当該二つの発現カセットの標的細胞への導入を可能にする。CAR発現カセットにはCAR遺伝子の他、CAR遺伝子の発現に必要なプロモーター(CMV-IE、SV40ori、レトロウイルスLTP、SRα、EF1α、βアクチンプロモーター等)が含まれる。siRNA発現カセットには、siRNA用コンストラクト、即ち、IL-6 siRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト(第1核酸コンストラクト)又はTNF-α siRNAを細胞内で生成する核酸コンストラクト(第2核酸コンストラクト)、或いはこれらの両者と、siRNA用コンストラクトの発現に必要なプロモーター(U6プロモーター、H1プロモーター、tRNAプロモーター等)が含まれる。本発明のベクターに、検出用遺伝子(レポーター遺伝子、細胞又は組織特異的な遺伝子、選択マーカー遺伝子など)、エンハンサー配列、WRPE配列等を含めることができる。
<pIRII-CAR.CD19-IL6KDベクター(図1)の作製>
(1)既報のCD19 CAR発現piggyBacトランスポゾンベクター(pIRII-CAR.CD19、Huye LE, Nakazawa Y, Patel MP, et al. Combining mTor inhibitors with rapamycin-resistant T cells: a two-pronged approach to tumor elimination. Mol Ther. 2011;19: 2239-48.;Saito S, Nakazawa Y, Sueki A, et al. Anti-leukemic potency of piggyBac-mediated CD19-specific T cells against refractory Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia. Cytotherapy. 2014;16:1257-69.)を制限酵素MunIとClaIの両者で切断した。
(2)U6プロモーター下でIL-6遺伝子の発現を抑制するshRNA(IL6KD)配列及びその両側に制限酵素認識配列(5’側にMunI認識配列、3’側にClaI認識配列)を有するDNA断片(図2、配列番号15。U6プロモーター(配列番号16)、shRNAをコードする配列(配列番号17)を含む)をMunIとClaIの両者で切断した。
(3)(1)で得られた6341bpのDNA断片と、(2)で得られた339bpのDNA断片をT4 DNA ligaseを用いてライゲーションした。
(4)コンピテントセルを用いて、(3)で得られた6680bpの環状DNAプラスミドを大量増幅した。
(5)シーケンサーを用いて全塩基配列(配列番号11)を確認した。
(1)既報のCD19 CAR発現piggyBacトランスポゾンベクターを制限酵素MunIとClaIの両者で切断した。
(2)U6プロモーター下でTNF-α遺伝子の発現を抑制するshRNA(TNFaKD)配列及びその両側に制限酵素認識配列(5’側にMunI認識配列、3’側にClaI認識配列)を有する3種類のDNA断片(図4、配列番号18、配列番号19、配列番号20。各々、U6プロモーター(配列番号16)、shRNAをコードする配列(配列番号21、配列番号22、配列番号23)を含む)をMunIとClaIの両者で切断した。
(3)(1)で得られた6341bpのDNA断片と、(2)で得られた3種類の342bpのDNA断片を各々T4 DNA ligaseを用いてライゲーションした。
(4)コンピテントセルを用いて、(3)で得られた6683bpの環状DNAプラスミドを大量増幅した。
(5)シーケンサーを用いて全塩基配列(配列番号12〜14)を確認した。
(1)末梢血約10 mlより比重遠心分離法を用いて単核球(PBMC)を分離した。
(2)4D-NucleofectorTM装置とP3 Primary Cell 4D-NucleofectorTM Xキット(ロンザ社)の組み合わせによるエレクトロポレーション法(Program EO-115)を用いて、pIRII-CAR.CD19-IL6KDベクター(5μg)とpCMV-piggyBacベクター(5μg)を1×107個のPBMCに遺伝子導入した。
(3)(2)で得られた遺伝子導入細胞を、インターロイキン(IL)-15 (5 ng/ml、ミルテニーバイオテク社)添加TexMACSTM培地(ミルテニーバイオテク社)2 mlで満たされた24ウェル培養プレートの1ウェルに静置した。16〜24時間後、抗CD3抗体(ミルテニーバイオテク社)と抗CD28抗体(ミルテニーバイオテク社)で固相化した24ウェル培養プレートの1ウェルに、2 mlの培地と共に遺伝子導入細胞を移入した。遺伝子導入4日後、非固相化24ウェル培養プレートの1ウェルに遺伝子導入細胞を移入した。その際、IL-15添加TexMACSTM培地を1 ml交換した。遺伝子導入7日後、遺伝子導入細胞をIL-15 (5 ng/ml)添加TexMACSTM培地30 mlで満たされたG-Rex10培養器(Wilson Wolf Manufacturing Inc, New Brighton, MN)に移入した。遺伝子導入14日目に細胞を回収した(CD19 CAR/IL6KD-T細胞)。一部の細胞を用いてCD19 CAR蛋白の発現をフローサイトメトリー法で確認した。尚、対照群として、既報のpIRII-CAR.CD19ベクターを遺伝子導入した従来のCD19 CAR-T細胞及び遺伝子未導入T細胞(mock T細胞)も同様の方法で増幅培養した。
48ウェル培養プレートの1ウェルにmock T細胞、CD19 CAR-T細胞、CD19 CAR/IL6KD-T細胞の各々1×105個を、5×105個の急性リンパ性白血病(ALL)細胞株SU/SRと、T細胞:白血病細胞比1:5で、1 mlの10%ウシ胎仔血清含RPMI1640培地下で5日間共培養した。共培養3日目の培養上清0.5 mlを回収し、新たに0.5 mlの10%ウシ胎仔血清含RPMI培地を加えた。共培養開始5日目、ウェル毎に細胞を回収し、トリパンブルー染色で生細胞数をカウントし、抗CD3-APC抗体と抗CD19-PE抗体で染色した後フローサイトメトリー法でCD3陽性細胞(T細胞)とCD19陽性細胞(ALL細胞)の比率を測定した。また、共培養開始3日目に回収した培養上清のIL-6濃度をELISA法で測定した。
IL-6遺伝子又はTNF-α遺伝子の発現を抑制できるCD19 CAR発現ベクター(pIRII-CAR.CD19-IL6KD及びpIRII-CAR.CD19-TNFaKD)を構築した(図1、図3)。pIRII-CAR.CD19-IL6KDを発現させたT細胞(CD19 CAR/IL6KD-T細胞)を用いて、CAR-T細胞の炎症性サイトカイン産生抑制及び殺細胞効果を検討した。結果を図5に示す。CD19 CAR-T細胞はCD19陽性ALL細胞との共培養によってIL-6を産生する。しかし、CD19 CARベクターにIL-6遺伝子の発現を抑制するshRNA配列を組み込むことにより、CD19 CAR-T細胞からのIL-6産生はほぼ完全に抑制された。尚、IL-6 shRNA配列の組み込みによって、CD19 CAR-T細胞の殺細胞効果は減弱しなかった。
炎症性サイトカインの遺伝子発現をノックダウンされたCAR-T細胞は、従来のCAR-T細胞と同等の抗白血病効果を発揮しながらも、対応する炎症性サイトカインを放出しない。2つ以上の遺伝子を同時にノックダウンする、あるいは炎症性サイトカインの放出を促進する上流遺伝子をノックダウンすることによって、効果の増強も期待できる。
Claims (15)
- 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子とともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクトを標的細胞に導入するステップ、を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製方法。
- 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子、及び第1核酸コンストラクトの導入が、トランスポゾン法によって行われる、請求項1に記載の調製方法。
- トランスポゾン法がpiggyBacトランスポゾン法である、請求項2に記載の調製方法。
- 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子と、第1核酸コンストラクトが同一のベクターに搭載され、該ベクターが標的細胞に導入される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の調製方法。
- 標的細胞がT細胞である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の調製方法。
- 請求項1〜5のいずれか一項に記載の調製方法で得られた、キメラ抗原受容体を発現するとともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAが細胞内で生成される、遺伝子改変リンパ球。
- 請求項6に記載の遺伝子改変リンパ球を治療上有効量含む、細胞製剤。
- 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体発現カセットとともに、インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクトを含むsiRNA発現カセットを搭載したベクター。
- キメラ抗原受容体発現カセットとsiRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備える、請求項8に記載のベクター。
- 請求項9に記載のベクターと、トランスポザーゼ発現ベクターを含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。
- 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体発現カセットを搭載したベクターと、
インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクトを含むsiRNA発現カセットを搭載したベクターと、
を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。 - キメラ抗原受容体発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
siRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
トランスポザーゼ発現ベクターを更に含む、請求項11に記載の調製キット。 - 標的抗原特異的キメラ抗原受容体遺伝子を含むキメラ抗原受容体第1発現カセットを搭載したベクターと、
インターロイキン6遺伝子を標的とするsiRNAを細胞内で生成する第1核酸コンストラクトを含む第1siRNA発現カセットを搭載したベクターと、
を含む、キメラ抗原受容体を発現する遺伝子改変リンパ球の調製キット。 - キメラ抗原受容体第1発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
第1siRNA発現カセットが一対のトランスポゾン逆向き反復配列に挟まれた構造を備え、
トランスポザーゼ発現ベクターを更に含む、請求項13に記載の調製キット。 - トランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼである、請求項10、12、14のいずれか一項に記載の調製キット。
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