JP6651066B1 - ヘモグロビン類測定用試薬及びヘモグロビン類の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、非イオン性界面活性剤を含むことが好ましい。上記非イオン性界面活性剤は、成分A1〜A9のいずれかの成分である。上記非イオン性界面活性剤は、成分A1〜A9のうちの1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A1は、オキシエチレン基の平均付加モル数が8以上20以下であり、かつアルキル基の炭素数が12以上17以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルである。成分A1は、下記式(1)で表される成分である。成分A1は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A2は、オキシエチレン基の平均付加モル数が40以上60以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテルである。成分A2は、下記式(2)で表される成分である。成分A2は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A3は、オキシエチレン基の平均付加モル数が9以上15以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである。成分A3は、下記式(3)で表される成分である。成分A3は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A4は、オキシエチレン基の平均付加モル数が6以上10以下であり、かつアルキル基の炭素数が11以上15以下であるポリオキシエチレン−sec−アルキルエーテルである。成分A4は、下記式(4)で表される成分である。成分A4は、炭素数が11以上15以下である第2級アルコールのエチレンオキシドの付加物である。成分A4は、成分A1とは異なる。成分A4は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A5は、オキシエチレン基の平均付加モル数が15であるポリオキシエチレントリデシルエーテルである。成分A5は、下記式(5)で表される成分である。成分A5は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A6は、HLB値が11以上15以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである。ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルは、オキシプロピレン基とオキシエチレン基とを有する。成分A6は、下記式(6)で表される成分である。成分A6は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分A7は、n−ノナノイル−N−メチル−D−グルカミンである。
成分A8は、n−オクチル−β−D−グルコピラノシドである。
成分A9は、サポニンである。成分A9は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、両性界面活性剤を含むことが好ましい。上記界面活性剤は、成分B1〜B3のいずれかの成分である。上記両性界面活性剤は、成分B1〜B3のうちの1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
成分B1は、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]プロパンスルホネート(CHAPS)である。
成分B2は、3−[(3−コールアミドプロピル)ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシプロパンスルホネート(CHAPSO)である。
成分B3は、ラウリルジメチルアミンオキサイドである。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、緩衝剤を含むことが好ましい。上記緩衝剤を含むことにより、pHの変動を抑えることができる。上記緩衝剤は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、無機塩類を含むことが好ましい。上記無機塩類を含むことにより、浸透圧を良好に調整することができる。上記無機塩類は、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、水を含むことが好ましい。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上述した成分以外の他の成分を含んでいてもよい。上記他の成分としては、防腐剤、ヘモグロビン安定剤、及びpH調整剤等が挙げられる。上記他の成分はそれぞれ、1種のみが用いられてもよく、2種以上が併用されてもよい。
上記ヘモグロビン類測定用試薬は、上記非イオン性界面活性剤を含むことが好ましく、上記非イオン性界面活性剤として成分A1、成分A2、成分A3、成分A4、成分A5又は成分A6を含むことがより好ましく、成分A1、又は成分A3を含むことが更に好ましく、成分A1’、又は成分A3’を含むことが特に好ましい。この場合には、本発明の効果をより一層効果的に発揮することができる。また、ヘモグロビン類測定用試薬と被検査物質とが混合された混合液の保存安定性をより一層高めることができる。
本発明に係るヘモグロビン類の測定方法は、赤血球含有検体と、上述したヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、上記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える。
ヘモグロビン類測定用試薬の調製:
リン酸二水素カリウムと、リン酸水素二カリウムと、塩化ナトリウムと、アジ化ナトリウムと、水とを混合し第1の組成物を得た。得られた第1の組成物に、表2〜6に示す界面活性剤を添加して混合し、ヘモグロビン類測定用試薬を調製した。得られたヘモグロビン類測定用試薬の組成を以下の表1に示す。表1中の界面活性剤の種類、含有量、HLB値及び曇点は、表2〜6に示した。なお、界面活性剤のHLB値は、上述した方法で測定された値である。
(1)界面活性剤の溶解性
上記第1の組成物に界面活性剤を添加して混合した際の界面活性剤の溶解性を目視にて確認した。界面活性剤の溶解性を以下の基準で判定した。
○○:界面活性剤が15分未満で完全に溶解する
○:界面活性剤が15分以上30分未満で完全に溶解する
△:界面活性剤が30分以上1時間未満で完全に溶解する
×:界面活性剤が1時間以上で完全に溶解する、又は溶解しない
採血管(積水メディカル社製)に収容された全血(赤血球含有検体)を用意した。全血1mLに対して、得られたヘモグロビン類測定用試薬100mLを混合し、混合液を得た。得られた混合液を以下の条件で測定した。なお、「(1)界面活性剤の溶解性」の判定結果が×であるヘモグロビン類測定用試薬では、陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定を行わなかった。
HPLC装置:グリコヘモグロビン分析装置(アークレイ社製「HA−8180」)
陽イオン交換カラム:カラムユニット80(アークレイ社製)
溶離液A:溶離液80A(アークレイ社製)
溶離液B:溶離液80B(アークレイ社製)
混合液を測定して得られたクロマトグラムについて、以下のi)〜iii)を確認した。なお、参考例Aでは、図2に示すクロマトグラムのピークパターンが得られた。得られるクロマトグラムにおいて、約19秒に検出されたピークがヘモグロビンA1cのピークであり、約40秒に検出されたピークがヘモグロビンA0のピークである。
参考例Aで得られたヘモグロビンA1cのピーク高さと、実施例2〜23、参考例1,24〜30及び比較例で得られたヘモグロビンA1cのピーク高さとを比較した。参考例Aで得られたヘモグロビンA1cのピーク高さに対して、得られたヘモグロビンA1cのピーク高さが吸光度基準で50以上低下していない場合に、ヘモグロビンA1cピークの分離が良好と判定し、50を超えて低下している場合に不良と判定した。
参考例Aでは、ヘモグロビンA0ピークのピークテール部分において、ピークは検出されない。実施例2〜23、参考例1,24〜30及び比較例で得られたヘモグロビンA0ピークのピークテールの形状を確認した。このピークテール部分において、ピークが検出されてない場合に、ヘモグロビンA0ピークの形状が良好と判定し、ピークが検出された場合に不良と判定した。
参考例Aでは、ファーストフラクションのピークにおいて、ショルダーピークは検出されない。実施例2〜23、参考例1,24〜30及び比較例で得られたファーストフラクションのピーク形状を確認した。このファーストフラクションのピークにおいて、ショルダーピークが検出されてない場合に、ファーストフラクションのピーク形状が良好と判定し、ショルダーピークが検出された場合に不良と判定した。
○:i)〜iii)の判定が全て良好
×:i)〜iii)の判定のいずれかが不良
全血とヘモグロビン類測定用試薬とを混合した混合液を測定した後に続けて、ヘモグロビン類測定用試薬のみを5回連続して測定した。得られたクロマトグラムについて、以下のi)〜iii)を確認した。
1回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、参考例Aで得られたヘモグロビンA0のピーク高さと、実施例2〜23、参考例1,24〜30及び比較例で得られたヘモグロビンA0のピーク高さとを比較した。参考例Aで得られたヘモグロビンA0のピーク高さに対して、得られたヘモグロビンA0のピーク高さが吸光度基準で100以上増加していない場合に良好と判定し、100を超えて増加している場合に不良と判定した。
1回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンA1cピークの有無を確認した。ヘモグロビンA1cピークが観察されない場合に良好と判定し、ヘモグロビンA1cピークが観察される場合に不良と判定した。
1回目のヘモグロビン類測定用試薬の測定において、ヘモグロビンA0ピークのドリフトの有無を確認した。ドリフトが観察されない場合に良好と判定し、ドリフトが観察される場合に不良と判定した。
○:i)〜iii)の判定が全て良好
×:i)〜iii)の判定のいずれかが不良
参考例A、実施例2〜23及び参考例1,24〜30で得られたヘモグロビン類測定用試薬のpHを、pH計(堀場製作所社製「F−52」)を用いて測定した。
参考例A、実施例2〜23及び参考例1,24〜30で得られたヘモグロビン類測定用試薬の浸透圧を、浸透圧計(Advanced Instruments社製「オズモメーター3250」)を用いて測定した。
表7に示す組成に変更したこと以外は、実施例1と同様にしてヘモグロビン類測定用試薬を調製した。
参考例A及び界面活性剤の濃度が0.5重量%である実施例32,34,36〜38で得られたヘモグロビン類測定用試薬をそれぞれ、ガラス製バイアル瓶に密封し、60℃で7日間保存した。保存後、目視にて、ヘモグロビン類測定用試薬の性状を確認した。
A:相分離が生じない
B:相分離が生じる
(6−1)全血との混合液の保存安定性
全血(赤血球含有検体)を用意した。また、参考例A及び実施例31〜36で得られたヘモグロビン類測定用試薬を用意した。全血を、ヘモグロビン類測定用試薬で101倍希釈し、混合液を得た。得られた混合液を、ガラス製バイアル瓶に収容し、4℃で保存した。保存前、保存後1日目,2日目,5日目,7日目,9日目に、「(2)陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定」に記載の測定条件で混合液を繰り返し3回測定し、その平均値からヘモグロビンA1c値及びヘモグロビンA1c値の変化量を求めた。
○:5日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.2%以下である
△:5日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.2%を超え0.4%以下である
△△:5日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.4%を超え0.7%以下である
×:5日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.7%を超える
ヘモグロビンA1c値が5.8%である測定管理用ヘモグロビンA1c物質(低濃度)(IRC−L)を用意した。また、参考例A及び実施例31〜36で得られたヘモグロビン類測定用試薬を用意した。測定管理用ヘモグロビンA1c物質(低濃度)(IRC−L)を、ヘモグロビン類測定用試薬で101倍希釈し、混合液を得た。得られた混合液を、ガラス製バイアル瓶に収容し、4℃で保存した。保存前、保存後1日目,2日目,3日目,9日目,14日目に、「(2)陽イオン交換液体クロマトグラフィーによる測定」での測定条件で混合液を繰り返し3回測定し、その平均値から上記と同様にしてヘモグロビンA1c値及びヘモグロビンA1c値の変化量を求めた。
○:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.2%以下である
△:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.2%を超え0.4%以下である
△△:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.4%を超え0.7%以下である
×:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.7%を超える
測定管理用ヘモグロビンA1c物質(低濃度)(IRC−L)を、ヘモグロビンA1c値が10.4%である測定管理用ヘモグロビンA1c物質(高濃度)(IRC−H)に変更したこと以外は、「(6−2)測定管理用ヘモグロビンA1c物質(低濃度)(IRC−L)との混合液の保存安定性」と同様にして、ヘモグロビンA1c値及びヘモグロビンA1c値の変化量を求めた。
○:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.25%以下である
△:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.25%を超え0.45%以下である
△△:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.45%を超え0.75%以下である
×:14日目のヘモグロビンA1c値の変化量において、参考例Aとの差の絶対値が0.75%を超える
全血(赤血球含有検体)と、ヘモグロビンA1c値が10.4%である測定管理用ヘモグロビンA1c物質(高濃度)(IRC−H)と、参考例A及び実施例32で得られたヘモグロビン類測定用試薬とを用意した。全血を、ヘモグロビン類測定用試薬で101倍希釈し、液(1)を得た。また、測定管理用ヘモグロビンA1c物質を、ヘモグロビン類測定用試薬で101倍希釈し、液(2)を得た。液(1)は、カラムに負荷を与えるための測定試料であり、液(2)は、ヘモグロビンA1c値の変化量及び理論段数の変化量を確認するための測定試料である。得られた液(1)及び液(2)を以下の手順及び条件で測定した。
HPLC装置:グリコヘモグロビン分析装置(アークレイ社製「HA−8160VP」)
陽イオン交換カラム:カラムユニットHSVI−VP(アークレイ社製)
溶離液A:溶離液60A−VP/TP(アークレイ社製)
溶離液B:溶離液60B−VP/TP(アークレイ社製)
溶離液C:溶離液60C−VP(アークレイ社製)
Claims (6)
- 陽イオン交換液体クロマトグラフィーによりヘモグロビン類を測定するために用いられるヘモグロビン類測定用試薬であって、
非イオン性界面活性剤を含み、
前記非イオン性界面活性剤が、下記成分A1、下記成分A2、下記成分A3、下記成分A4、下記成分A5又は下記成分A6である、ヘモグロビン類測定用試薬。
成分A1:オキシエチレン基の平均付加モル数が10以上20以下であり、かつアルキル基の炭素数が12以上17以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテル
成分A2:オキシエチレン基の平均付加モル数が40以上60以下であるポリオキシエチレンステアリルエーテル
成分A3:オキシエチレン基の平均付加モル数が9以上15以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテル
成分A4:オキシエチレン基の平均付加モル数が6以上10以下であり、かつアルキル基の炭素数が11以上15以下であるポリオキシエチレン−sec−アルキルエーテル
成分A5:オキシエチレン基の平均付加モル数が15であるポリオキシエチレントリデシルエーテル
成分A6:HLB値が11以上15以下であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテル - 前記成分A1が、オキシエチレン基の平均付加モル数が12若しくは19であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が13若しくは20であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、
前記成分A2が、オキシエチレン基の平均付加モル数が50であるポリオキシエチレンステアリルエーテルであり、
前記成分A3が、オキシエチレン基の平均付加モル数が9又は13であるポリオキシエチレンオレイルエーテルであり、
前記成分A4が、オキシエチレン基の平均付加モル数が7又は9であり、かつアルキル基の炭素数が11以上15以下のポリオキシエチレン−sec−アルキルエーテルであり、
前記成分A6が、HLB値が12.5、12.7又は14.0であるポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルである、請求項1に記載のヘモグロビン類測定用試薬。 - 前記非イオン性界面活性剤が、前記成分A1又は前記成分A3を含み、
前記成分A1が、オキシエチレン基の平均付加モル数が10以上15以下であり、かつアルキル基の炭素数が12以上17以下であるポリオキシエチレンアルキルエーテルであり、
前記成分A3が、オキシエチレン基の平均付加モル数が10以上15以下であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである、請求項1に記載のヘモグロビン類測定用試薬。 - 前記成分A1が、オキシエチレン基の平均付加モル数が12であるポリオキシエチレンラウリルエーテル、又はオキシエチレン基の平均付加モル数が13であるポリオキシエチレンセチルエーテルであり、
前記成分A3が、オキシエチレン基の平均付加モル数が13であるポリオキシエチレンオレイルエーテルである、請求項1〜3のいずれか1項に記載のヘモグロビン類測定用試薬。 - 前記非イオン性界面活性剤の含有量が、0.01重量%以上1.0重量%以下である、請求項1〜4のいずれか1項に記載のヘモグロビン類測定用試薬。
- 赤血球含有検体と、請求項1〜5のいずれか1項に記載のヘモグロビン類測定用試薬とを混合して混合液を得る工程と、
前記混合液を陽イオン交換液体クロマトグラフィーにより測定する工程とを備える、ヘモグロビン類の測定方法。
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