JP6603149B2 - 心血管疾患を処置するためのニューレギュリン法および組成物 - Google Patents
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Description
02/00664(2002年9月18日出願)、中国特許出願第02145145.1
号(2002年11月8日出願)、および中国特許出願第03109976.9号(20
03年4月9日出願)に関連する。上記出願の開示は、その全体が本明細書中に参考とし
て援用されている。
本発明は、哺乳動物(特に、ヒト)における種々の心血管疾患または障害を予防、処置
、または遅延するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、とりわけ
、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュ
リンの産生および/もしくは機能を増強する薬剤を用いて、種々の心血管疾患または障害
を予防、処置、または遅延するための組成物および方法を提供する。
ウイルス性心筋炎は、間質性心筋層における局所性または散在性の炎症の滲出および心
筋線維の分解、壊死、または溶解を誘導する種々のウイルスにより引き起こされるかまた
はそれらに関連する心筋の炎症である。ウイルス性心筋炎は、心外膜炎または心内膜炎に
より併発され得る。ウイルス性心筋炎の結果は、心筋の損傷、心臓の機能不全、不整脈、
および全身性症候群を誘導する。ウイルス性心筋炎は、全ての年齢で起こる。近年、ウイ
ルス性心筋炎の発生率が増加している。急性ウイルス性心筋炎の後遺症としては、不整脈
、心不全、心臓ショックが、および突然死さえも挙げられる。この疾患は、心臓肥大およ
び永久心筋損傷により長期化され得る。心筋症は、最終的には、免疫反応から生じる。ウ
イルス性心筋炎の処置としては、抗生物質、心臓保護剤、抗酸化剤(例えば、高用量のビ
タミンC、ビタミンE、コエンザイムQ10)、心筋用栄養剤(例えば、心筋に十分な栄
養を提供するエネルギーの組み合わせ)が挙げられる。これらの測定は、心臓の機能を改
善するため、心臓の損傷を修復するため、および心不全を予防するために適用されるが、
その効果は理想的ではない(特に、心筋炎における構造的および機能的変化について)。
これらの病的変化に対して信頼できる治療法は存在しない。
終的な結果である。その病理的変化は、非リウマチ性、非高血圧性であり、冠動脈心臓疾
患に起因しない。拡張型心筋症の主要な臨床的特徴は、心室肥大、心筋ポンプ機能不全、
またはうっ血性心不全である。核およびオルガネラの肥大は、一般的に、拡張型心筋症の
穏やかな心筋の損傷において見られる。構造的変化、細胞死、および結果として起こる線
維症は、通常、重篤な損傷において見られる。DCMの病因論および病原論は、はっきり
している。DCMの予後は、効果的な治療法がないため、非常に乏しい。このような患者
のほとんどは、徐々に悪化する心不全により死亡する。突然死が、不整脈から起こり得る
。現在、DCMに対して特に効果的な治療法は存在しない。DCMの慣用的な処置として
は、心臓強壮剤、利尿剤、ACEI、および他の薬物の投与が挙げられる。さらに、第三
世代のカルシウムアンタゴニストであるアムロジピンおよび第三世代のβ−レセプターア
ンタゴニスト(例えば、カルベジルオール)はまた、DCMを処置するために使用される
。甲状腺ホルモンおよび成長ホルモンの効果については議論の余地がある。なぜならば、
無作為化された二重盲目臨床試験の証拠が利用可能でないからである。左心室の容積減少
手術は、左心室の内部直径を減少させ、心臓機能を一時的に改善し得る。しかし、手術後
の心不全および不整脈に関連する死亡率がより高くなることが、この方法の適用を妨げて
いる。動的骨格筋ポンプ(dynamic cardiomyolasty)は、心臓機
能を改善するのに有用であるが、患者は、比較的広い外傷に耐え得ることができない。従
って、この手術は、心臓移植の代替としてのみ使用される。手術の中で、心臓移植は急進
的なDCM処置である。しかし、ドナーの心臓がないこと、費用が高いこと、術後感染、
および移植片拒絶が、主な障害である。従って、臨床実務において、新規のDCM治療が
緊急に必要とされている。
腫瘍活性を有するアントラサイクリン抗癌剤に属する。臨床実務においては、種々の悪性
腫瘍(例えば、肺癌、乳癌、膀胱癌、精巣癌、甲状腺癌、柔組織癌、骨肉腫、神経芽腫、
急性白血病、悪性リンパ腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、および頚部癌)を処置するために広
く使用されている。ADMは、DNAとの結合を通じて、DNA合成を阻害するよう作用
する。その阻害効果は、S期、M期、G1期、およびG2期に観察されるが、その活性は
、S期で最も活性である。乳癌患者に対する単独時間(unit time)において、
転移性化学療法であろうと術後化学療法であろうと、化学療法剤が高用量であるほど、よ
り良好な臨床的効果およびより長期の生存性をもたらすことが発見された。他の研究は、
より高い用量および用量能の重要性、ならびに用量、用量能、および効果の間の関連性を
確認した。
ては、骨髄の沈下が挙げられる。約60〜80%の患者において、白血球数および血小板
数は、投与10〜15日後に最低レベルに低下し、そして21日後に正常レベルに回復す
る。主要な消化管反応は、吐き気、嘔吐、食欲不振、胃炎、および潰瘍および口内炎でさ
えある。脱毛もまた、その効果は退薬後に反転し得るが、ADM処置したほぼ全ての患者
で起こる。
妨げる主要要因が、心臓毒性であることである。ADMの心臓毒性は、酸素由来のフリー
ラジカルの産生から生じ得る。ADM中のセミキノン基は、酸化還元反応を誘導し得、こ
れは、増強された脂質過酸化を誘導し、細胞損傷に寄与する。フリーラジカルは、細胞膜
およびオルガネラ膜を損傷し、そして膜タンパク質の機能および酵素活性を改変する。こ
れらの変化は、細胞内カルシウムの過剰蓄積(overload)、DNAおよびタンパ
ク質合成の阻害、ならびにエネルギー代謝障害を誘導し得、必然的に、心臓の収縮弛緩プ
ロセスを妨げる。
組織よりも心臓組織により高い親和性を有するからである。従って、心臓は、ADMの毒
性効果に対してより脆弱である。心臓毒性は、急性または慢性であり得る。急性心臓毒性
の臨床的特長としては、心臓機能の変化(例えば、洞頻拍、不整脈、伝導ブロック、およ
びST−Tセグメントの変質など)が挙げられる。種々の不整脈は、ADM治療の早期段
階に存在し得る。急性心臓毒性としてはまた、左心室駆出フラクション(LVEF)の減
少、ならびに一回拍出量(SV)の減少、心拍出量(CO)の減少、および心係数(CI
)の減少が挙げられ得る。ADMはまた、左心室の収縮およびポンプ能力を阻害すること
が示唆されている。慢性心臓毒性としては、不可逆的なうっ血性心不全が挙げられる。一
旦、患者がうっ血性心不全に罹患すると、その死亡率は、約30%〜50%に減少する。
心臓毒性はADMに関連するので、患者によっては、ADM治療を終了しなければならな
いか、またはADM使用の用量および期間を減らさなければならず、これは、ADM治療
の効果に影響を及ぼす。
されている。特性の基準(例えば、ADMの総用量を減少させること、または心筋栄養剤
(例えば、高用量のビタミンC)を投与すること)は、心筋炎を保護するのに有用であり
得る。定期的な輸血および鉄キレート剤ICRF−187の投与もまた、心筋炎を保護す
るのにある程度効果を有する。しかし、これらの補助剤は心筋に対して有用であるが、そ
れらは、ADMにより誘導される心臓毒性に対してほとんど効果を有さない。従って、当
該分野において、その効果に影響を与えることなく、ADMの心臓毒性を予防、処置、ま
たは遅延する必要性が存在する。
より引き起こされ、最終的に、難治性の心臓疾患を引き起こす。これらの要因は、心筋細
胞構造および機能の変化を引き起こし、最終的には、心室ポンプ機能の低下および心不全
を引き起こす。心不全の発生率および死亡率は、世界中で非常に高く、最も重篤な致死性
疾患のひとつである。米国において、うっ血性心不全(CHF)の30%〜40%が年単
位の入院を必要とする。CHFの診断の確立の5年後の死亡率は、60%(男性)および
40%(女性)である。平均生存期間は、3.2年(男性)および5.4年(女性)であ
るが、最終段階のCHFを有する患者の生存率はわずかに約20%である。
子(GGF)とも呼ばれる)は、ErbB3およびBrbB4のリガンドである。ニュー
レギュリン遺伝子欠損胎児マウスにおける研究は、ニューレギュリンが心臓および神経系
の発達に必須であることを実証している。しかし、このデータは、ニューレギュリンが細
胞分化および下流へのシグナル伝達を制御する方法についてに制限される。心臓発達の早
期段階において、ニューレギュリンおよびErbBレセプターは、それぞれ、心内膜およ
び心筋細胞の内層で発現される。これらの二層は広範に隔てられているので、ニューレギ
ュリンは、ErbBレセプターを活性化し得る前にこれらの二層の間の空間を通過する必
要がある。心臓細胞にけるErbBレセプターの活性化は、心臓細胞および心内膜へのそ
の移動の補助となる。WO00/37095は、ニューレギュリンが、心筋細胞の分化を
増強し得、筋節および細胞骨格の組み合わせおよび細胞内接着を強化し得ることを示す。
WO00/37095はまた、ニューレギュリンが心臓疾患を検出、診断、および処置す
るのに使用され得ることを示している。WO00/37095はさらに、ニューレギュリ
ンおよびそのアナログが、心臓細胞の分化をインビボで促進し、心臓細胞における筋節お
よび細胞骨格の再構成ならびに細胞内接着を誘導し、ニューレギュリンを阻害し得るポリ
ペプチドまたは化合物を同定し得ることを示している。同定されたポリペプチドまたは化
合物は、心臓疾患および心不全を処置するのに使用され得る。
型心筋症、予防剤または治療剤(例えば、ADM)の心臓毒性(その効果に影響を及ぼす
ことなく)、および心筋収縮に対するニューレギュリン関連処置の必要性が存在する。本
発明は、これらおよび当該分野における他の関連する必要性に取り組んでいる。
(ウイルス性心筋炎または拡張型(うっ血性)心筋症(DCM)の処置)
1つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎または拡張型(う
っ血性)心筋症(DCM)を予防、処置、または遅延するための方法に関する。この方法
は、このような予防、処置、または遅延が必要とされるかまたは望ましい哺乳動物に、有
効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギ
ュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレ
ギュリンの産生および/もしくは機能を増強する薬剤を投与する工程を包含し、それによ
って、ウイルス性心筋炎またはDCMが予防、処置、または遅延される。好ましくは、ニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタ
ンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリン
の産生および/もしくは機能を増強する薬剤は、インビボで投与される。
ク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその
機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産生および/もしく
は機能を増強する薬剤、ならびにウイルス性心筋炎もしくは拡張型(うっ血性)心筋症(
DCM)のための有効量の予防剤もしくは治療剤を含む、組み合わせ、に関する。
(うっ血性)心筋症(DCM)を予防、処置、または遅延するための薬学的組成物に関す
る。この組成物は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
ト、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核
酸、または該ニューレギュリンの産生および/もしくは機能を増強する薬剤を含む。
本発明の目的は、予防剤または治療剤に付随する心臓毒性を予防、処置、または遅延さ
せるための方法を提供することである。特に、本発明の目的は、薬物誘導性の心筋症の心
臓毒性を予防、処置、または減少させる方法を提供することである。
ける心臓毒性を予防、処置、または遅延するための方法を提供する。この方法は、インビ
ボで哺乳動物に、有効量の予防剤または治療剤、および有効量の(i)ニューレギュリン
タンパク質もしくはその機能的フラグメント;(ii)ニューレギュリンタンパク質もし
くはその機能的フラグメントをコードする核酸;または(iii)該ニューレギュリンの
産生もしくは機能を増強する薬剤を投与する工程を包含し、それによって、該予防剤また
は治療剤の投与に付随する心臓毒性が予防、処置、または遅延される。
れるがこれらに限定されない)の任意の臨床的症状を予防、処置、または遅延させるため
に使用され得る。例えば、本発明は、頻拍、不整脈、およびうっ血性心不全を予防、処置
、または遅延させるために使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、急性心臓
毒性の臨床的特長(例えば、洞頻拍、不整脈、伝導ブロック、およびST−Tセグメント
の変質、ならびに左心室駆出フラクション(LVEF)の減少、一回拍出量(SV)の減
少、心拍出量(CO)の減少、または心係数(CI)の減少)を予防、処置、または遅延
させるために使用され得る。本発明はまた、左心室の収縮およびポンプ能力の阻害を含む
細胞毒性を予防、処置、または遅延するために使用され得る。
遅延するために使用され得る。1つの実施形態において、予防剤または治療剤は、心臓毒
性を引き起こす酸素由来のフリーラジカルを産生する。別の実施形態において、予防剤ま
たは治療剤は、心臓毒性を引き起こす脂質の過酸化を増強する。
に使用され得る。抗新生物剤は、好ましくは、アントラサイクリンである。特定の実施形
態において、抗新生物剤は、以下の式I:
、ヒドロキシまたは水素である。本発明の方法において使用するためのアントラサイクリ
ンの非限定的な例としては、アドリアマイシン(またはドキソルビシン)、ダウノルビシ
ン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマシイン
、シクロホフファミド、フルオロウラシル、アクチノマイシンD、およびビンクリスチン
が挙げられる。1つの局面において、本発明は、化学療法剤(例えば、アドリアマイシン
(ADM))により誘導される心臓毒性を予防、処置、または遅延させるための抗心臓毒
性薬剤としてのニューレギュリンの、単独または別の薬剤と組み合わせての使用に関する
。
使用され得る。抗精神病剤は、クロルプロマジン、パーフェナジン、またはトリフルペラ
ジンであり得る。
めに使用され得る。三環系抗うつ剤は、クロリミプラミン、アミトリプチリン、またはド
キセピンであり得る。
ロイキン(例えば、インターロイキン−2)に付随する心臓毒性を予防、減少、または遅
延するために使用され得る。
たは遅延するために使用され得る。
ューレギュリン2、ニューレギュリン3、またはニューレギュリン4であり得る。特定の
実施形態において、本発明の方法において使用するためのニューレギュリンは、ニューレ
ギュリンα2またはニューレギュリンβ2である。別の実施形態において、ニューレギュ
リンフラグメントは、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ2で
ある。
。ニューレギュリン剤はまた、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメン
トをコードする核酸として投与され得る。ニューレギュリンの産生または機能を増強する
薬剤もまた投与され得る。ニューレギュリン剤は、単独でまたは薬学的に受容可能なキャ
リアもしくは賦形剤と組み合わせて投与され得る。ニューレギュリンタンパク質もしくは
その機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグ
メントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産生または機能を増強する薬剤は
、予防剤または治療剤の投与の前、同時、または後に投与され得る。
レギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産
生もしくは機能を増強する薬剤の非存在下で投与される場合に最大限許容される量よりも
高い量で投与される。
たは望ましいヒトにおいて、心臓毒性を予防、処置、または遅延させる方法を提供する。
好ましくは、ヒトは、肺癌、乳癌、膀胱癌、精巣癌、甲状腺癌、柔組織癌、骨肉腫、神経
芽腫、急性白血病、悪性リンパ腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、および頚部癌のような悪性腫
瘍を有する。
1つの局面において、本発明は、組み合わせに関し、この組み合わせは、有効量のニュ
ーレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタ
ンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメント、あるいはこのニューレギ
ュリンの産生および/もしくは機能を増強する薬剤、ならびに心筋梗塞のための有効量の
予防剤または治療剤を含有する。
、および心筋梗塞を予防するか、処置するか、または遅延させる際にこの組み合わせを使
用するための指示書を備える。
か、または遅延させるための方法に関し、この方法は、このような予防、処置または遅延
が必要とされるかまたは望ましい哺乳動物に、有効量のニューレギュリンタンパク質、も
しくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、
もしくはその機能的フラグメント、あるいはこのニューレギュリンの産生および/もしく
は機能を増強する薬剤を投与し、これによって、この心筋梗塞が予防されるか、処置され
るか、または遅延される工程を包含する。
1つの局面において、本発明は、哺乳動物において疾患を予防するか、処置するか、ま
たは遅延させるための薬学的組成物に関し、この組成物は、ニューレギュリンタンパク質
、またはその機能的フラグメントを、a)約170U/kg以下の安全用量で;またはb
)約3,600U/kg以下の全レジメンで、含有する。
開示の明瞭さのために、そして限定によってではなく、本発明の詳細な説明が、以下の
小節に分割される。
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中
に記載される全ての特許、出願、出願公開、および他の刊行物は、その全体が、参考とし
て援用される。この節に記載される定義が、本明細書中に参考として援用される特許、出
願、出願公開、および他の刊行物に記載される定義と矛盾するかまたは他に一致しない場
合は、この節に記載される定義が、本明細書中に参考として援用される定義より優勢であ
る。
たは「1以上」を意味する。
B4ヘテロダイマープロテインキナーゼまたはErbB2/ErbB3ヘテロダイマープ
ロテインキナーゼを活性化し得る、タンパク質またはペプチド(例えば、全てのニューレ
ギュリンアイソフォーム、ニューレギュリンEGFドメイン単独、ニューレギュリン変異
体、および上記レセプターを同様に活性化する任意の種類のニューレギュリン様遺伝子産
物)をいう。例示的なニューレギュリンフラグメントは、ヒトニューレギュリンβ2異性
体のポリペプチドフラグメントであり、これは、レセプター結合ドメイン(すなわち、E
GF様ドメイン)を含む。このポリペプチドは、EGFレセプターファミリーのErbB
レセプターを活性化し得、そしてその生物学的反応を調節し得る(例えば、乳癌細胞分化
およびミルクプロテイン分泌を刺激し得;神経堤細胞のシュワン細胞への分化を誘導し得
;骨格筋細胞におけるアセチルコリン合成を刺激し得;そして心臓細胞の生存およびDN
A合成を改善し得る)。ニューレギュリンはまた、抗ウイルス心筋炎活性、抗DCM活性
、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性を実質的に変化させない、保存的アミノ酸置換
を有する改変体を含む。アミノ酸の適切な保存的置換は、当該分野の当業者に公知であり
、そして一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させずになされ得る。当該分野の当
業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活
性を実質的に変化させないことを認識する(例えば、Watsonら、Molecula
r Biology of the Gene,第4版、1987、The Bejac
min/Cummings Pub.Co.,p224を参照のこと)。ニューレギュリ
ンタンパク質は、ニューレギュリンタンパク質およびニューレギュリンペプチドを包含す
る。ニューレギュリン核酸は、ニューレギュリン核酸およびニューレギュリンオリゴヌク
レオチドを包含する。
メイン」とは、ErbB2、ErbB3、ErbB4、またはこれらの組み合わせに結合
し、そしてこれらを活性化させ、そしてEGFレセプター結合ドメインと類似の構造を保
有する、ニューレギュリン遺伝子によってコードされるポリペプチドモチーフをいう。こ
れらは、WO 00/64400、Holmesら、Science,256:1205
−1210(1992);米国特許第5,530,109号および同第5,716,93
0号;Hijaziら、Int.J.Oncol.13:1061−1067(1998
);Changら、Nature,387:509−512(1997);Carraw
ayら、Nature,387:512−516(1997);Higashiyama
ら、J.Biochem.,122:675−680(1997);ならびにWO97/
09425に開示されている。
メント」とは、その抗ウイルス心筋炎活性、抗DCM活性、抗心臓毒性活性、または抗心
筋梗塞活性をなお実質的に保持する、ニューレギュリンタンパク質またはそのコード核酸
の誘導体またはフラグメントをいう。通常、誘導体またはフラグメントは、その抗ウイル
ス心筋炎活性、抗DCM活性、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性の少なくとも50
%を保持する。好ましくは、誘導体またはフラグメントは、その抗ウイルス心筋炎活性、
抗DCM活性、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性の少なくとも60%、70%、8
0%、90%、95%、99%および100%を保持する。
、ニューレギュリン遺伝子の転写および/または翻訳を増加させる物質、あるいはニュー
レギュリン前駆体の翻訳後修飾および/または細胞輸送を増加させる物質、あるいはニュ
ーレギュリンタンパク質の半減期を延長させる物質をいう。
、ニューレギュリンの抗ウイルス心筋炎活性、抗DCM活性、抗心臓毒性活性、または抗
心筋梗塞活性の強さを増加させる物質、あるいは抗ウイルス心筋炎シグナル伝達経路、抗
DCMシグナル伝達経路、抗心臓毒性活性シグナル伝達経路、または抗心筋梗塞シグナル
伝達経路におけるニューレギュリンの天然リガンドの感受性を増加させる物質、あるいは
ニューレギュリンのアンタゴニストの強さを低下させる物質をいう。このような薬剤は、
ニューレギュリンタンパク質でもそのコード核酸でもない。
り多くの物品の間の任意の連合をいう。
の任意の混合物をいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、
またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
スホーミングレトロウイルス)と会合した2つの癌遺伝子(erb Aおよびerb B
)をいう。
」とは、疾患に関連する症状を軽減するか、または何らかの様式で減少させるために十分
な量である。このような量は、単一の用量として投与され得るか、または効果的であるレ
ジメンに従って投与され得る。この量は、疾患を治癒し得るが、代表的に、疾患の症状を
軽減するために投与される。症状の所望の軽減を達成するために、繰り返しの投与が必要
とされ得る。
めに必要とされる割合で血液をポンピングしない、心臓機能の異常性を意味する。心不全
としては、広範な疾患状態(例えば、うっ血性心不全、心筋梗塞、頻脈性不整脈、家族性
肥大型心筋症、虚血性心臓病、特発性拡張型心筋症、および心筋炎)が挙げられる。心不
全は、多数の要因(虚血性形態、先天性形態、リウマチ性形態、または特発性形態が挙げ
られる)によって引き起こされ得る。慢性心臓肥大は、うっ血性心不全および心停止に対
する前駆体である、非常に疾患した状態である。
れた核酸によってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法
に依存する組換え核酸方法を使用する、産生方法をいう。
クレオチドの2つの配列が、対向するヌクレオチドの間で、好ましくは25%未満のミス
マッチで、より好ましくは15%未満のミスマッチで、なおより好ましくは5%未満のミ
スマッチで、最も好ましくはミスマッチなしでハイブリダイゼーションし得ることを意味
する。好ましくは、これらの2つの分子は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダ
イズする。
イゼーションのストリンジェンシー」とは、以下の通りである:
1)高ストリンジェンシー:0.1×SSPE、0.1%SDS、65℃;
2)中ストリンジェンシー:0.2×SSPE、0.1%SDS、50℃(中程度のスト
リンジェンシーともまた称される);および
3)低ストリンジェンシー:1.0×SSPE、0.1%SDS、50℃。
等価なストリンジェンシーが、代替の緩衝液、塩および温度を使用して達成され得ること
が、理解される。
NAを、その発現または複製のために細胞に導入するために使用される、不連続なエレメ
ントをいう。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者に周知である。発現ベクタ
ーとしては、調節配列(例えば、プロモーター領域であり、これは、このようなDNAフ
ラグメントの発現を引き起こし得る)と作動可能に結合したDNAを発現し得るベクター
が挙げられる。従って、発現ベクターとは、組換えDNA構築物または組換えRNA構築
物(例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞への導入の際
にクローニングされたDNAの発現を生じる他のベクター)をいう。適切な発現ベクター
は、当業者に周知であり、そして真核生物細胞および/または原核生物細胞において複製
可能なもの、ならびにエピソームを保持するもの、あるいは宿主細胞ゲノムに統合される
ものが挙げられる。
ト」とは、DNAまたはRNAの、これらが作動可能に結合されるDNAもしくはRNA
の転写を制御するセグメントをいう。プロモーター領域は、RNAポリメラーゼの認識、
結合および翻訳開始のために十分な特定の配列を含む。プロモーター領域のこの部分は、
プロモーターと称される。さらに、プロモーター領域は、RNAポリメラーゼのこの認識
活性、結合活性、および転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作用
性であり得るか、またはトランス作用性因子に応答性であり得る。プロモーターは、調節
の性質に依存して、構成的であっても調節的であってもよい。原核生物においての使用が
意図される例示的なプロモーターとしては、バクテリオファージT7プロモーターおよび
T3プロモーターなどが挙げられる。
する」とは、DNAの、ヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列(例えば、プロ
モーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列
)との機能的関係をいう。例えば、DNAのプロモーターに対する作動可能な結合とは、
DNAとプロモーターとの間の、このようなDNAの転写がこのDNAを特異的に認識し
、結合し、そして転写するRNAポリメラーゼによってプロモーターから開始されるよう
な、物理的関係および機能的関係をいう。発現および/またはインビトロ転写を最適化す
るために、クローンの5’非翻訳部分を除去するか、付加するか、または変化させて、転
写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで発現を妨害し得るかまたは減少させ得る、余分の
、潜在的に不適切な代替の翻訳開始(initiation)(すなわち、開始(sta
rt))コドンまたは他の配列を排除することが、必要であり得る。あるいは、コンセン
サスリボソーム結合部位(例えば、Kozak,J.Biol.Chem.,266:1
9867−19870(1991)を参照のこと)が、開始コドンのすぐ5’側に挿入さ
れ得、そして発現を増強し得る。このような修飾の所望性(または必要性)は、実験的に
決定され得る。
は疾患の症状が、回復されるかそうでなければ有益に改変される任意の様式をいう。処置
はまた、本明細書中の組成物の任意の薬学的使用を包含する。特定の障害の症状の回復と
は、永久であろうと一時的であろうと、組成物の投与に起因し得るかまたは組成物の投与
に関連し得る、症状の任意の減少をいう。
は腫瘍増殖をいい、これは、良性または悪性であり得る。過形成と異なって、新生物増殖
は、元の刺激が非存在であっても持続する。
防するかまたはそれらの重篤度を減少させるために使用される任意の薬剤をいう。これら
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:抗脈管形成剤、アルキル化剤、
代謝拮抗物質、天然産物、白金コーディネート複合体、アントラセニジオン(anthr
acenedione)、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモ
ン、アンタゴニスト、オンコジーンインヒビター、腫瘍抑制遺伝子もしくは腫瘍抑制タン
パク質抗オンコジーン抗体または抗オンコジーンアンチセンスオリゴヌクレオチド。
ent)」とは、精神障害の処置に使用される任意の薬剤をいう。これらとしては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない:三環系フェノチアジン、チオキサンテンおよび
ジベンゼピン(dibenzepine)、ならびにブチロフェノンならびに同種属、他
の複素環および実験的ベンズアミド。
意の薬剤をいう。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:神経終
末へと取り込まれるノルエピネフリンおよびセロトニンを阻害し、従って、脳におけるノ
ルアドレナリン持続性亢進を導く薬剤をいう。
任意の薬剤をいう。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない:寄生
虫感染、細菌感染または微生物感染に対して使用するための薬剤。
副作用を含まずに哺乳動物における疾患を予防するか、処置するかまたは遅延するのに十
分な用量をいう。
、これは、重篤な虚血または持続性虚血によって引き起こされる心筋部分の限局性壊死(
focal necrosis)を導く。
1つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎もしくは拡張型(
うっ血性の)心筋症(DCM)を予防するか、処置するかもしくは遅延するための方法に
関し、この方法は、このような予防、処置または遅延が必要とされるかまたは所望である
哺乳動物に、有効量のニューレギュリン(neuregulin)タンパク質もしくはそ
の機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
トをコードする核酸、またはニューレギュリンの生産および/または機能を増大する因子
を投与し、それによってウイルス性心筋炎またはDCMを予防、処置または遅延する工程
を包含する。
ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類)におけるウイルス性
心筋炎またはDCMを予防、処置または遅延するために使用され得る。好ましくは、本方
法は、ヒトにおけるウイルス性心筋炎またはDCMを予防、処置または遅延するために使
用され得る。
ーレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、本方法に
使用され得る。1つの特定の実施形態において、本方法に使用されるニューレギュリンは
、ErbB2−ErbB4レセプターを用いる結合を介して抗ウイルス性心筋炎または抗
DCM活性を行う。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン1、ニューレギュリ
ン2、ニューレギュリン3またはニューレギュリン4が、本方法に使用される。ニューレ
ギュリン1の同義語としては、ヘレグリン、GGF2およびp185erbB2リガンド
を含む。例えば、WO00/64400ならびに米国特許第5,530,109号および
同第5,716,930号を参照のこと。ニューレギュリンα2およびニューレギュリン
β2の両方が、本方法に使用される。好ましくは、配列番号4に示されるアミノ酸配列を
含むニューレギュリンβ2フラグメントが、本方法に使用される。
ベースに開示されるニューレギュリンまたはその機能的フラグメントが、本方法に使用さ
れる:米国特許第6,252,051号および同第6,121,415(NRG3)号;
同第6,087,323号(p185erbB2結合活性、p185erbB3結合活性
またはp185erbB4結合活性を有するニューレギュリン);同第6,033,90
6(p185erbB2およびp180erbB4からなる群から選択されるレセプター
のリガンドとしてのニューレギュリン);US2002002276(ニューレギュリン
の競合的アンタゴニストまたはアゴニストとしてのキメラErbBヘテロマルチマー付着
因子);WO01/81540(NRG−4);WO01/64877(NRG1);W
O01/64876(NRG1AG1);WO01/58948(ニューレギュリン−β
);WO01/26607(SMDFおよびGGFのニューレギュリンスプライス改変体
アイソフォーム);WO00/70322(CRDニューレギュリン);WO00/64
400;WO99/18976;WO98/02540(ニューレギュリンの競合的アン
タゴニストまたはアゴニストとしてのキメラErbBヘテロマルチマー付着因子);WO
96/30403;WO96/15812;BC017568(Homo sapien
s、ニューレギュリン4に類似する);BC007675(Homo sapiens、
ニューレギュリン1);AF142632(Xenopus laevisシステインリ
ッチドメインニューレギュリン−1);AF194439(Rattus norveg
icus SMDFニューレギュリンα2a(Nrg1));AF194438(Rat
tus norvegicus SMDFニューレギュリンβ1a(Nrg1));HS
2NRG12(Homo sapiens選択的スプライシングニューレギュリン2(N
RG2));HS2NRG08(Homo sapiens選択的スプライシングニュー
レギュリン2(NRG2));HS2NRG07(Homo sapiens選択的スプ
ライシングニューレギュリン2(NRG2));AF083067(Mus muscu
lusニューレギュリン−4短型アイソフォーム(Nrg4));AF076618(X
enopus laevisニューレギュリンα−1);AF045656(Gallu
s gallusニューレギュリンβ−2b);AF045655(Gallus ga
llusニューレギュリンβ−2a);AF045654(Gallus gallus
ニューレギュリンβ−1a);MAU96612(Mesocricetus aura
tusニューレギュリン);AF010130(Mus musculusニューレギュ
リン−3(NRG3))。好ましくは、GenBank受託番号NT_007995(g
i:18570363)に開示されるニューレギュリンは、本方法において使用される。
ば、Coxsackie Group Aウイルス、Coxsackie Group
Bウイルス、ECHOウイルスまたはポリオウイルスの感染によって引き起こされるかま
たはこれらに関連するウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置または遅延さ
れ得る。好ましくは、Coxsackie Group Bウイルスの感染によって引き
起こされるかまたはこれに関連するウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置
または遅延される。
支援され得る。例えば、心外膜炎または心内膜炎による合併症を伴うウイルス性心筋炎は
が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。別の実施形態において、心筋損
傷、心機能不全、不整脈、全身性症状または心筋症の臨床的特徴を有するウイルス性心筋
炎が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。急性または慢性のウイルス性
心筋炎の両方が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。好ましくは、不整
脈、心不全または心臓性ショックを伴う急性ウイルス性心筋炎が、本方法を使用して、予
防、処置または遅延され得る。心臓の肥大および/または永久性の心筋損傷で延長される
ウイルス性心筋炎がまた、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。
る。例えば、心室肥大、心筋ポンプ機能不全またはうっ血性心不全を伴うDCMが、本方
法を使用して、予防、処置または遅延され得る。
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、単独で投与され得る。
あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレ
ギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、薬学的に受容
可能なキャリアまたは賦形剤と共に投与され得る。
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、インビボで投与され得
る(すなわち、哺乳動物に直接的に投与され得る)。あるいは、ニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメントをコードする核酸は、エキソビボで投与され得(すなわち、細胞、組織
また器官に投与され)、そしてニューレギュリンタンパク質を保有するこのような細胞、
組織または生物体もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質
もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、哺乳動物へと移され得る)。
ントが投与される。別の特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質またはそ
の機能的フラグメントをコードする核酸が投与される。
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、単独で使用され得る。
あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレ
ギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルス性心
筋炎またはDCMのための予防薬または治療剤と組み合せて使用され得る。ニューレギュ
リンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もし
くはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルス性心筋炎またはDCMのため
の予防薬または治療剤の投与の前、同時または引き続いて、使用され得る。
。例えば、ウイルス性心筋炎のための予防薬または治療剤は、抗生物質(例えば、ペニシ
リン)、心臓保護剤(例えば、タウリン)、抗酸化剤(例えば、ビタミンC、ビタミンE
およびコエンザイムQ10)ならびに心筋のための栄養物(例えば、エネルギーの組み合
せ)であり得る。
DCMのための予防薬または治療剤は、以下であり得る:心臓強壮薬(例えば、ジゴキシ
ンおよびセジラニド(cedilanid))、利尿薬(GoodmanおよびGilm
an’s The Pharmacological Basis of Therap
eutics(9th Ed.),McGraw−Hill(1996)pp683−7
13)(例えば、炭酸アンヒドラーゼのインヒビター、浸透圧利尿薬、Na+−K+−2
Cl−共輸送のインヒビター、Na+−Cl−共輸送のインヒビター、腎臓上皮Na+チ
ャネルのインヒビターおよび鉱質コルチコイドレセプターのアンタゴニスト)、アンギオ
テンシンI−変換酵素インヒビター(ACEI)、カルシウムアンタゴニスト(例えば、
アムロジピン)ならびにβレセプターアンタゴニスト(例えば、カルベディロール)。
、キットおよび組み合せ)
別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎または拡張型(うっ
血性の)心筋症(DCM)を予防、処置または遅延するための薬学的組成物に関し、この
薬学的組成物は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、
またはニューレギュリンの生産および/または機能を増大する因子を含む。
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸(上記のセ
クションBに記載されるものを含む)は、本発明の薬学的組成物に使用され得る。1つの
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物に使用されるニューレギュリンは、Er
bB2−ErbB4レセプターを用いる結合によって、その抗ウイルス性心筋炎活性また
は抗DCM活性を実施する。別の実施形態において、ニューレギュリン1、ニューレギュ
リン2、ニューレギュリン3またはニューレギュリン4は、本発明の薬学的組成物に使用
される。ニューレギュリン1の同義語としては、ヘレグリン、GGF2およびp185e
rbB2リガンドが挙げられる。例えば、WO00/64400ならびに米国特許第5,
530,109号および同第5,716,930を参照のこと。ニューレギュリンα2お
よびニューレギュリンβ2の両方は、本発明の薬学的組成物に使用され得る。好ましくは
、配列番号4に示されるアミノ酸配列セットを含むニューレギュリンβ2フラグメントは
、本発明の薬学的組成物に使用される。
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、任意の適切な用量範
囲で使用され得る。例えば、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
ト、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核
酸は、約25μg〜約2,500μgの範囲の用量を有し得る。
はDCMを予防、処置または遅延する際に、容器に入った上記の薬学的組成物および前記
薬学的組成物を使用するための指示書を備える。
ギュリンタンパク質もしくはその機能性フラグメント、またはニューレギュリンタンパク
質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または前記ニューレギュリンの生
産および/または機能を増大する因子、および有効量のウイルス性心筋炎または拡張型(
うっ血性)心筋症(DCM)のための予防薬または治療剤を含む。
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸(上記のセ
クションBに記載されるものを含む)は、本発明の組み合せに使用され得る。1つの特定
の実施形態において、本発明の組み合せに使用されるニューレギュリンは、ErbB2−
ErbB4レセプターを用いる結合によってその抗ウイルス性心筋炎活性または抗DCM
活性を実施する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン1、ニューレギュリン
2、ニューレギュリン3またはニューレギュリン4は、本発明の組み合せに使用される。
ニューレギュリン1の同義語としては、ヘレグリン、GGF2およびp185erbB2
リガンドが挙げられる。例えば、WO00/64400ならびに米国特許第5,530,
109号および同第5,716,930を参照のこと。ニューレギュリンα2およびニュ
ーレギュリンβ2の両方は、本発明の組み合せに使用され得る。好ましくは、配列番号1
に示されるアミノ酸配列セットを含むニューレギュリンβ2フラグメントは、本発明の組
み合せに使用される。
載されるものを含む)が、本発明の組み合せに使用され得る。例えば、ウイルス性心筋炎
のための予防薬または治療剤は、抗生物質(例えば、ペニシリン)、心臓保護剤(例えば
、タウリン)、抗酸化剤(例えば、ビタミンC、ビタミンEおよびコエンザイムQ10)
ならびに心筋のための栄養物(例えば、エネルギーの組み合せ)であり得る。
のを含む)が、本発明の組み合せに使用され得る。例えば、DCMのための予防薬または
治療剤は、以下であり得る:心臓強壮薬(例えば、ジゴキシンおよびセジラニド)、利尿
薬(例えば、炭酸アンヒドラーゼのインヒビター、浸透圧利尿薬、Na+−K+−2Cl
−共輸送のインヒビター、Na+−Cl−共輸送のインヒビター、腎臓上皮Na+チャネ
ルのインヒビターおよび鉱質コルチコイドレセプターのアンタゴニスト)、アンギオテン
シンI−変換酵素インヒビター(ACEI)、カルシウムアンタゴニスト(例えば、アム
ロジピン)ならびにβレセプターアンタゴニスト(例えば、カルベディロール)。
はDCMを予防、処置または遅延する際の、容器に入った上記の組み合せおよび前記組み
合せを使用するための指示書を備える。
ニューレギュリンは、心臓の筋細胞の分化を促進し、そして筋節と細胞骨格との組み合
せならびに細胞間接着力を強化することが見出されている(WO00/37095)。ニ
ューレギュリンはまた、心臓疾患を検出し、診断し、そして処置するために使用され得る
。本発明の方法において、ニューレギュリンは、他の予防剤または治療剤に起因して、心
臓毒性を予防、処置または遅延するための心臓保護剤として使用される。
されるかまたはこれらを所望する哺乳動物)においてに心臓毒性を予防、処置または遅延
するための方法に関し、この方法は、インビボで、哺乳動物に、有効量の予防薬または治
療剤および有効量の(i)ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
;(ii)またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコード
する核酸;または(iii)ニューレギュリンの生産または機能を増大する因子を投与す
る工程を包含し、それによって前記予防薬または治療剤の投与に関連する心臓毒性が、予
防、処置または遅延される。本方法は、任意の哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊
長類)における心臓毒性を予防、処置または遅延するために使用され得る。好ましくは、
本方法は、ヒトにおける心臓毒性を予防、処置または遅延するために使用される。
任意の適切なニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸が、本発明
の方法で使用され得る。一実施形態において、本発明の方法は、ヒトニューレギュリンβ
2異性体のポリペプチドフラグメントを使用し、このヒトニューレギュリンβ2異性体は
、レセプター結合ドメイン(すなわち、EGFクラス領域)を含む。このポリペプチドは
、EGFレセプターファミリーのerbBレセプターを活性化し得、かつその生物学的反
応を調節し得る(例えば、乳癌細胞の分化および乳汁タンパク質分泌を刺激し;Schw
ann細胞への神経冠細胞の分化を誘導し;骨格筋細胞におけるアセチルコリン合成を刺
激し;そして/または心筋細胞生存およびDNA合成を改善する)。ニューレギュリンの
核酸およびタンパク質は、当該分野で公知の任意の適切な方法(組換え生成、キメラ合成
またはこの両者の組合せを含むが、これらに限定されない)によって生成され得る。好ま
しくは、ニューレギュリンの核酸およびタンパク質は、組換え生成によって生成される(
Ausubelら、Current Protocols in Molecular
Biology,John Wiley & Sons,Inc.2002を参照のこと
)。
ン改変体はまた、本発明の方法において使用され得る。アミノ酸の適切な保存的置換は、
当業者に公知であり、そして一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作
製され得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換
が、生物学的活性を実質的に変更しないということを認識する(例えば、Watsonら
、Molecular Biology of the Gene,第4版、224頁、
The Benjamin/Cummings Pub.Co.,1987を参照のこと
)。
DNA、複合体化DNA、cDNA、プラスミドDNA、RNA、またはそれらの他の混
合物の形態で、遺伝子送達系の成分として使用され得る。別の実施形態において、ニュー
レギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルスベク
ターに含まれる。遺伝子治療に適切な任意のウイルスベクターが使用され得る。非限定的
な例としては、アデノウイルスベクター(米国特許第5,869,305号)、シミアン
ウイルスベクター(米国特許第5,962,274号)、条件付きで複製するヒト免疫不
全ウイルスベクター(米国特許第5,888,767号)、レトロウイルス、SV40、
単純ヘルペスウイルスアンプリコンベクター、およびワクシニアウイルスベクターが挙げ
られる。さらに、これらの遺伝子は、脂質が、凝固の間に酸化からDNAまたは他の生体
物質を保護する非ウイルスベクター系(例えば、リポソーム)の形態で送達され得る。
毒性活性を、任意のerbB2レセプター〜erbB4レセプターとの結合によって実施
する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン1、ニューレギュリン2、ニュー
レギュリン3またはニューレギュリン4が、本発明の方法で使用される。ニューレギュリ
ン1の同意語としては、ヘレグリン(heregulin)、GGF2およびp185e
rbB2リガンドが挙げられる(例えば、WO00/64400、ならびに米国特許第5
,530,109号および同第5,716,930号を参照のこと)。ニューレギュリン
α2およびニューレギュリンβ2の両方は、本発明の方法で使用され得る。好ましくは、
配列番号4で記載されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ2フラグメントが本発明
の方法で使用される。
タベースで開示されるニューレギュリンまたはその機能的フラグメントが、本発明の方法
で使用され得る:米国特許第6,252,051号および同第6,121,415号(N
RG3);同第6,087,323号(p185erbB2、p185erbB3または
p185erbB4結合活性を有するニューレギュリン);同第6,033,906号(
p185erbB2およびp185erbB4からなる群から選択されるレセプターに対
するリガンドとしてのニューレギュリン);US2002002276(ニューレギュリ
ンの競合的アンタゴニストまたはアゴニストとしてのキメラErbBヘテロマルチマー付
着因子);WO01/81540(NRG−4);WO01/64877(NRG1);
WO01/64876(NRG1AG1);WO01/58948(ニューレギュリンβ
);WO01/26607(SMDFおよびGGFニューレギュリンスプライス改変アイ
ソフォーム);WO00/70322(CRD−ニューレギュリン);WO00/644
00;WO99/18976;WO98/02540(ニューレギュリンの競合的アンタ
ゴニストまたはアゴニストとしてのキメラErbBヘテロマルチマー付着因子);WO9
6/30403;WO96/15812;BC017568(Homo Sapiens
,ニューレギュリン4と類似);BC007675(Homo Sapiens、ニュー
レギュリン1);AF142632(Xenopus laevisシステインリッチド
メインニューレギュリン1);AF194439(Rattus norvegicus
SMDFニューレギュリンα2a(Nrg1));AF194438(Rattus
norvegicus SMDFニューレギュリンβ1a(Nrg1));HS2NRG
12(Homo sapiensの選択的スプライシングニューレギュリン2(NRG2
));HS2NRG08(Homo sapiensの選択的スプライシングニューレギ
ュリン2(NRG2));HS2NRG07(Homo sapiensの選択的スプラ
イシングニューレギュリン2(NRG2));AF083067(Mus muscul
usニューレギュリン4ショートアイソフォーム(Nrg4));AF076618(X
enopus laevisニューレギュリンα−1);AF045656(Gallu
s gallusニューレギュリンβ−2b);AF045655(Gallus ga
llusニューレギュリンβ−2a);AF045654(Gallus gallus
ニューレギュリンβ−1a);MAU96612(Mesocricetus aura
tusニューレギュリン);AF010130(Mus musculusニューレギュ
リン3(NRG3))。好ましくは、GenBank登録番号NT 007995(gi
:18570363)に開示されるニューレギュリンが、本発明の方法で使用される。
本発明は、予防剤または治療剤の投与に関連する心臓毒性を予防、処置または遅延する
ための方法を提供する。ニューレギュリン剤は、この予防剤または治療剤の投与の前、こ
れと同時、またはこれの後に投与され得る。本発明の方法は、特定の予防剤または治療剤
に関連する心臓毒性の予防、処置または遅延に限定されない。本発明の方法で使用するた
めの予防剤または治療剤の非限定的な例としては、抗腫瘍剤、抗精神病剤、三環系抗欝剤
、インターフェロン、インターロイキンおよび抗感染剤が挙げられる。任意の抗腫瘍剤が
本発明の方法で使用され得る。好ましくは、抗腫瘍剤は、以下の式を有するアントラサイ
クリン抗腫瘍剤である:
ソルビシン)、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイ
トマイシン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、アクチノマイシ
ンD、ビンクリスチン、およびこれらの誘導体が挙げられる(Goodman & Gi
lman’s,The Pharmacological Basis of Ther
apeutics,第9版、pp.1264−1269,McGraw−Hill 19
96を参照のこと)。本発明の方法で使用され得る抗腫瘍剤の他の例は、米国特許出願番
号2002/044919に記載される。他の抗腫瘍剤としては、シチジン、アラビノシ
ルアデニン(araC)、ダウノマイシン、メトトレキサート(MTX)、フッ化ピリミ
ジン(例えば、5−フルオロウラシル(5−FU))、ヒドロキシウレア、6−メルカプ
トプリン、植物アルカロイド(例えば、ビンクリスチン(VCR)、VP−16およびビ
ンブラスチン(VLB))、アルキル化剤、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、
トリサミン(trisamine)、プロカルバジン、ブレオマイシン、マイトマイシン
C、アクチノマイシンD、または酵素(例えば、L−アスパラギナーゼ)が挙げられるが
、これらに限定されない(Goodman & Gilman’s,The Pharm
acological Basis of Therapeutics,第9版、pp.
1227−1229を参照のこと)。
は、クロルプロマジン、ペルフェナジン、およびトリフルペラジン(trifluper
azine)が挙げられる。抗精神病剤の他の例は、Goodman & Gilman
’s,The Pharmacological Basis of Therapeu
tics,第9版、pp.440−420に見出され得る。
しては、クロリミプラミン(chlorimipramine)、アミトリプチリンおよ
びドキセピンが挙げられる。抗精神病剤の他の例は、Goodman & Gilman
’s,The Pharmacological Basis of Therapeu
tics,第9版、pp.431−434に見出され得る。
ロンは、インターフェロン−αである。一実施形態において、インターフェロンは、ヒト
インターフェロン−αである。インターフェロン−αを製造する方法は、米国特許第6,
005,075号;同第5,834,235号;同第5,503,828号;および同第
4,820,638号に見出され得る。
キンは、インターロイキン−2である。一実施形態において、インターロイキンは、ヒト
インターロイキン−2である。インターロイキン−2を製造する方法は、米国特許第5,
834,441号;同第5,795,777号;同第5,419,899号;および同第
5,399,699号に見出され得る。
である。抗感染剤の他の例は、Goodman & Gilman’s,The Pha
rmacological Basis of Therapeutics,第9版、p
p.965−1008に見出される。
る)。あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、または
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸が、エキ
ソビボで投与され得る(すなわち、細胞、組織または器官に投与される。ここで、ニュー
レギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸を有するこのような細胞、組織ま
たは器官が、哺乳動物に移入され得る)。
1つの局面において、本発明は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
をコードする核酸、あるいはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する
薬剤、ならびに心筋梗塞のための有効量の予防剤または治療剤を含む組合わせに関する。
好ましくは、本発明の組合わせは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含
む。
明の組み合わせで使用されるニューレギュリンは、ErbB2レセプター〜ErbB4レ
セプターとの結合によってその抗心筋梗塞活性を実行し得る。別の例において、本発明の
組合せで使用されるニューレギュリンは、ニューレギュリン1、ニューレギュリン2、ニ
ューレギュリン3またはニューレギュリン4である。好ましくは、ニューレギュリン2は
、ニューレギュリンα2またはニューレギュリンβ2である。さらに別の例において、本
発明の組合せで使用されるニューレギュリンは、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含
むニューレギュリンβ2フラグメントである。上記の章で記載される任意の特定のニュー
レギュリンもまた使用され得る。
発明の組み合わせで使用される予防剤または治療剤は、アンギオテンシンI−変換酵素イ
ンヒビター(ACEI)、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、
アスピリン、アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミンまたは血栓溶解剤であり得る
。
ムプリル(rampril)、リシノプリル、ゾフェノプリル(zofenopril)
およびトランドラプリル(trandolapril)が挙げられる。任意の適切なカル
シウムアンタゴニストが使用され得る。例示的なカルシウムアンタゴニストとしては、ジ
ルチアゼムが挙げられる。任意の適切なβ−レセプターアンタゴニストが使用され得る。
例示的なβ−レセプターアンタゴニストとしては、プロプラノロール、メトプロロール、
アテノロールおよびチモロールが挙げられる。任意の適切な血栓溶解剤が使用され得る。
代表的な血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、t−PAおよびアニストレプラーゼ
(anistreplase)が挙げられる。
せ、および心筋梗塞を予防、処置または遅延する際にこの組合せを使用するための指示書
を備える。
延するための方法に関し、この方法は、このような予防、処置または遅延が必要であるか
または所望される哺乳動物に、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的
フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコ
ードする核酸、あるいはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤
を投与し、それによりこの心筋梗塞を予防、処置または遅延する工程を包含する。
法で使用されるニューレギュリンは、ErbB2レセプター〜ErbB4レセプターとの
結合によってその抗心筋梗塞活性を実行し得る。別の例において、本発明の方法で使用さ
れるニューレギュリンは、ニューレギュリン1、ニューレギュリン2、ニューレギュリン
3またはニューレギュリン4である。好ましくは、ニューレギュリン1は、ニューレギュ
リンα2またはニューレギュリンβ2である。さらに別の例において、本発明の方法で使
用されるニューレギュリンは、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリ
ンβ2フラグメントである。上記の章で記載される任意の特定のニューレギュリンもまた
使用され得る。
ト、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、ま
たはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤が、心筋梗塞に関連
する左心室拡張終末期径(LVEDD)および左心室収縮終末期径(LVESD)の増加
に拮抗する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメント、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコー
ドする核酸、またはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤は、
心筋梗塞に関連する左心室EFの減少に拮抗する。
ために使用され得る。代表的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ
、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類が挙げられ
る。好ましくは、本発明の方法は、ヒトにおける心筋梗塞を予防、処置または遅延するた
めに使用される。
る。例えば、本発明の方法は、左心室拡大、減少した収縮機能および増加した充填圧から
なる群から選択される臨床的特徴を有する心筋梗塞を予防、処置または遅延するために使
用され得る。
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、あるいはこのニューレ
ギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤が、単独で投与され得る。好ましくは
、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、あるいはこのニューレ
ギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤が、薬学的に受容可能なキャリアまた
は賦形剤と共に投与される。特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質また
はその機能的フラグメントが投与される。別の実施形態において、ニューレギュリンタン
パク質またはその機能的フラグメントをコードする核酸が、投与される。任意の適切な投
与経路が使用され得る。好ましくは、静脈内投与が使用される。
る。任意の適切な予防剤または治療剤が、本発明の方法で使用され得る。例えば、本発明
の方法で使用される予防剤または治療剤は、アンギオテンシンI変換酵素インヒビター(
ACEI)、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、アスピリン、
アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミンまたは血栓溶解剤であり得る。
ムプリル、リシノプリル、ゾフェノプリルおよびトランドラプリルが挙げられる。任意の
適切なカルシウムアンタゴニストが使用され得る。例示的なカルシウムアンタゴニストと
しては、ジルチアゼムが挙げられる。任意の適切なβ−レセプターアンタゴニストが使用
され得る。例示的なβ−レセプターアンタゴニストとしては、プロパラノロール、メトプ
ロロール、アテノロールおよびチモロールが挙げられる。任意の適切な血栓溶解剤が使用
され得る。例示的な血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、t−PAおよびアニスト
レプラーゼが挙げられる。
ント、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、
またはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤が、インビボで投
与される。
1つの局面において、本発明は、哺乳動物における疾患を予防、処置または遅延するた
めの薬学的組成物に関し、この組成物は、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的
フラグメントを、a)約170U/kg以下の安全用量;またはb)約3,600U/k
g以下の全レジメン中に含む。
され得る。一例において、本発明の薬学的組成物は、約21日以下の間投与される。別の
例において、本発明の薬学的組成物は、連続的または断続的に投与される。
、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。
発明の薬学的組成物に使用されるニューレギュリンは、ErbB2レセプター〜ErbB
4レセプターとの結合によって、その抗疾患活性を実行し得る。別の例において、本発明
の薬学的組成物で使用されるニューレギュリンは、ニューレギュリン1、ニューレギュリ
ン2、ニューレギュリン3またはニューレギュリン4である。好ましくは、ニューレギュ
リン1は、ニューレギュリンα2またはニューレギュリンβ2である。さらに別の例にお
いて、本発明の薬学的組成物で使用されるニューレギュリンは、配列番号4で示されるア
ミノ酸配列を含むニューレギュリンβ2フラグメントである。上記の章で記載される任意
の特定のニューレギュリンもまた使用され得る。
させるために使用され得る。例示的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ
、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類動物
が挙げられる。好ましくは、本発明の方法は、ヒトにおける疾患を予防、処置または遅延
させるために使用される。
され得る。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、心臓血管疾患(例えば、ウイルス性心
筋炎、DCM、心臓毒性活性、心筋梗塞活性など)を予防、処置または遅延させるために
使用される。
。
ンパク質リン酸化の間接的媒介とを組み合わせることによって、NRG−1の生物学的活
性の決定のための例示的な迅速、感受性、高流量かつ定量的方法である(例えば、Mic
hael D.Sadickら Analytical Biochemistry,1
996,235,207−214を参照のこと)。Michael D.Sadickら
に記載されるインビトロNRG−1活性決定の実施例3に従って、種々の起源のNGR−
1生物学的活性が決定され得る。
KIRA−ELISA)と呼ばれる)は、2つの別々のマイクロタイタープレートからな
り、一方は、細胞培養、リガンド刺激、および細胞溶解/レセプター可溶化のためであり
、そして他方のプレートは、レセプター捕捉およびホスホチロシンELISAのためであ
る。このアッセイは、ヘレグリン(heregulin)誘導ErbB2活性の分析のた
めに開発され、接着乳癌細胞株(MCF−7)に対するインタクトなレセプターの刺激を
利用する。膜タンパク質は、Triton X−100溶解を介して可溶化され、そして
このレセプターは、ErbB3またはErbB4への交差反応無しで、ErbB2特異的
抗体でコーティングされたELISAで捕捉される。次いで、レセプターリン酸化の程度
は、抗ホスホチロシンELISAによって定量化される。再生可能な標準曲線は、ヘレグ
リンβ1(177−244)(HRGβ1(177−244)について約360pMのE
C(50)で生成される。HRGβ1(177−244)の同一のサンプルがKIRA−
ELISAと定量的抗ホスホチロシンウェスタンブロット分析の両方によって分析される
場合、この結果は、互いに非常に密接した関係にある。この報告に記載されるアッセイは
、HRGとErbB3および/またはErbB4との相互作用から生じるErbB2のチ
ロシンリン酸化を特異的に定量化することが可能である。
の活性は、それらのアミノ酸配列またはそれらの空間的構造によって形成される活性中心
によって決定され得る。タンパク質およびポリペプチドの活性力価は、それらの絶対的な
品質と一致せず、従って、化学薬物の活性力価のように重量単位を用いて決定できない。
しかし、遺伝的に操作された医薬の生物学的活性は、一般的にそれらの薬力学と一致し、
そして所定の生物学的活性を介して確立された力価決定系は、その力価単位を決定し得る
。従って、生物学的活性決定は、生物学的活性を有する物質を力価決定するプロセスの一
部であり得、そして遺伝的に操作された産物の品質制御の重要な成分である。遺伝的に操
作された産物および臨床的に使用された薬物の品質制御の生物学的活性の基準を決定する
ことは、重要である。
従って、異なる薬物および異なるバッチ数からの産物は、均一な基準で定量化され得る。
ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュ
リンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの処方、用量および
投与の経路(好ましくは、薬学的組成物の形態)は、当該分野で公知の方法に従って決定
され得る(例えば、Remington:The Scienee and Pract
ice of Pharmacy,Alfonso R.Gennaro(Editor
)Mack Publishing Company,April 1997;Ther
apeutic Peptides and Proteins:Formulatio
n,Processing,and Delivery Systems,Banga,
1999;およびPharmaceutical Formulation Devel
opment of Peptides and Proteins,Hovgaard
and Frkjr(Ed.),Taylor & Francis,Inc.,20
00;Medical Applications of Liposomes,Las
ic and Papahadjopoulos(Ed.),Elsevier Sci
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uses:Basic Biology to Gene Therapy,Vol.1
5,Seth,Landes Bioscience,1999;Biopharmac
eutical Drug Design and Development,Wu−P
ong and Rojanasakul(Ed.),Humana Press,19
99;Therapeutic Angiogenesis:From Basic S
cience to the Clinic,Vol.28,Doleら(Ed.),S
pringer−Verlag New York,1999を参照のこと)。ニューレ
ギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは、経口、直腸、局所、吸入、
頬(例えば、舌下)、非経口(例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内)、経皮の投
与または任意の他の適切な投与経路のために処方され得る。任意の所定の場合において、
大部分の適切な経路は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに使用されている、
特定のニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレ
ギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの性質に依存す
る。
リンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは、単独で投与され
得る。代替的に、好ましくは、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグ
メント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラ
グメントは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と同時に投与される。任意の適切
な薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、本発明の方法において使用され得る(例
えば、Remington:The Science and Practice of
Pharmacy.Alfonso R.Gennaro(Editor)Mack
Publishing Company,April 1997を参照のこと)。
子送達システムの成分として、裸のDNA、複合体化DNA、cDNA、プラスミドDN
A、RNAまたは他のそれらの混合物の形態で使用され得る。別の実施形態において、ニ
ューレギュリンタンパク質をコードする核酸またはその機能的フラグメントは、ウイルス
ベクター内に含まれる。遺伝子治療に適切な任意のウイルスベクターが使用され得る。例
えば、アデノウイルスベクター(米国特許第5,869,305号)、シミアンウイルス
ベクター(米国特許第5,962,274号)、条件付き複製ヒト免疫欠損ウイルスベク
ター(米国特許第5,888,767号)、レトロウイルス、SV40、単純ヘルペスウ
イルスアンプリコンベクターおよびワクシニアウイルスベクターが使用され得る。さらに
、遺伝子は、非ウイルスベクター系(例えば、リポソーム)内に送達され得、ここで、こ
の脂質は、凝固の間、酸化からDNAまたは他の生体材料を保護する。
たはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは
、単独でまたは他の薬剤、キャリアまたは賦形剤とともに、任意の適切な投与経路(例え
ば、海綿質内(intracavernous)注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注
射、皮内注射、経口投与または局所投与)のために処方され得る。この方法は、添加され
た保存剤とともに、単位投薬形態で、アンプルで、または多用量容器で、注射可能投与の
ための処方物を使用し得る。処方物は、オイルまたは水性のビヒクル中の懸濁液、溶液ま
たはエマルジョンのような形態を取り得、そして懸濁剤、安定化剤および/または分散剤
のような処方剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、滅菌性の
発熱物質を含まない水または他の溶媒で、構成するための粉末形態であり得る。本発明の
局所投与は、泡状物、ゲル、クリーム、軟膏、経皮パッチ、またはペーストの使用を利用
し得る。
与のための方法としては、米国特許第5,736,154号;同第6,197,801B
1号;同第5,741,511号;同第5,886,039号;同第5,941,868
号;同第6,258,374B1号;および同第5,686,102号に記載されるもの
が挙げられるが、これらに限定されない。
路とともに変化する。用量、およびおそらく用量頻度はまた、個々の患者の年齢、体重、
状態および応答に従って変化する。
用量に調節するための方法および時期を知ることが注意されるべきである。逆に、医師は
また、臨床的応答が、適切でない場合、処置をより高いレベルに調節する方法および時期
を知る(毒性の副作用を排除する)。
剤、分散物、懸濁液、溶液、カプセル剤、パッチなどが挙げられる。Remington
’s Pharmaceutical Sciencesを参照のこと。
、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメン
トは、単独でまたは他の薬剤とともに、従来の薬学的調合技術に従って、薬学的キャリア
または賦形剤(例えば、β−シクロデキストリンおよび2−ヒドロキシ−プロピル−β−
シクロデキストリン)との完全な混合物中の活性物として組み合わされ得る。キャリアは
、局所的または非経口的な投与のために所望される幅広い形態の調製物をとり得る。非経
口投薬形態(例えば、静脈内注射または注入)のための組成物を調製する際に、類似の薬
学的媒体(水、グリコール、オイル、緩衝液、糖、保存剤、リポソームおよび当業者に公
知なもの)が使用され得る。このような非経口組成物の例としては、デキストロース5%
w/v、生理食塩水または他の液体が挙げられるが、これらに限定されない。ニューレギ
ュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク
質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの合計用量は、単独でまたは投与
される他の薬剤とともに、約1ml〜2000mlの範囲の静脈内流体のバイアルで投与
され得る。希釈流体の容量は、投与される合計用量に従って変化する。
キットは、薬学的に受容可能な形態で、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能
的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機
能的フラグメントを、単独でまたは他の薬剤との組合せの治療有効量を1つ以上の容器に
、含む。好ましい薬学的形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液
、あるいは他の薬学的に受容可能な滅菌流体との組合せである。あるいは、この組成物は
、凍結乾燥され得るかまたは乾燥(dessicated)され得;この場合、キットは
、必要に応じて、容器中に、複合体を再構成して、注射目的のために溶液を形成するため
に、薬学的に受容可能な溶液(好ましくは、滅菌)をさらに含む。例示的な薬学的に受容
可能な溶液は、生理食塩水およびデキストロース溶液である。
くは、滅菌形態で包装された針またはシリンジ、および/または包装されたアルコールパ
ッドを備える。説明書は、必要に応じて、医師または患者による組成物の投与のために含
まれる。
本発明者らによって開発された組換えヒトニューレギュリン−1βS177−Q237
(ニューレギュリン−1のrhNRG−1β177−Q237)は、損傷した心筋細胞構
造を修復し得、これらの細胞間の接続を強化し得、心筋機能を改善し得、そして心筋の生
物学的効果を強化し得る。本明細書中に記載される実験は、特定のニューレギュリンフラ
グメント(例えば、rhNRG−1β177−Q237)が、心臓血管疾患(例えば、ウ
イルス性心筋炎または拡張型(または鬱血型)心筋症(DCM))、特定の治療剤によっ
て引き起こされる心臓毒性、またはインビボでの心筋梗塞の種々の形態を有効に処置し得
、そして正常な動物の血行力学に影響しない。
図1。操作された株の構築物の技術的概要
ヒトニューレギュリン遺伝子は、約13エキソンとともに染色体8P12内に位置する
。組換えニューレギュリンフラグメントは、61アミノ酸から構成される。理論分子量は
、7,055Dである。SDS−PAGE電気泳動における見かけの分子量は、6,50
0〜7,000Dである。その等電点は、約6.5である。グリコシル化された遺伝子座
は存在しない。ペプチド構造は、3つのジスルフィド結合を含む。この遺伝子は、E.c
oliにおける発現に適切である。
プラスミド内に導入され、次いで、E.coli BL21は、このプラスミドによって
形質転換された。高レベルの発現組換え体は、組換えヒトニューレギュリンフラグメント
を産生するために操作された株としてスクリーニングされた。
全RNAおよびmRNAは、5ヶ月のヒト胎児の脳組織から抽出され、そしてcDNA
に逆転写される。RT−PCRは、標的遺伝子を増幅するために、テンプレートとして転
写されたcDNAおよび一対のプライマー
図4。エンドヌクレアーゼ消化による組換えプラスミドの同定
塩化カルシウム沈降法を、発現プラスミドPET22b内へヒトニューレギュリン遺伝
子をクローニングするために適用して、組換えヒトニューレギュリン発現プラスミド(P
ET22b−ヒトニューレギュリン)を構築した。この遺伝子は、T7プロモーターの駆
動下で有効に発現された。発現遺伝子のN末端は、NdeI遺伝子座に挿入された。C末
端ターミネーターは、最後のアミノ酸の隣である。発現されたタンパク質は、任意のアミ
ノ酸との融合タンパク質を形成しなかった。正確な183bpのフラグメントは、エンド
ヌクレアーゼ消化分析後に得られた。形質転換体は、エンドヌクレアーゼ消化によって特
徴付けられた。二本鎖DNAを、配列分析のために抽出された。配列決定の結果は、発現
ベクター内に含まれるヒトニューレギュリンの配列が、完全に正確であったことを確認し
た。決定されたcDNA配列を、ここに列挙する:
PCR増幅およびエンドヌクレアーゼ消化分析の後に、操作されたクローン(BL21
−PET22b−ヒト−ニューレギュリン)の単一コロニーを、無作為に取り出し、2m
lのLB−Amp液体培地中に播種した。培養物を37℃で一晩インキュベートし、そし
て250rpmで振盪した。次いで、純粋な培養物の割合は、20mlのLB−Amp培
地中に播種された。培養物は、37℃でインキュベーション後、混濁がOD600で1.
0に増加するまで、IPTGを4時間加えて、発現を誘導した後に、収集された。封入体
は、細胞を破壊した後に、収集された。15%SDS−PAGEにおける電気泳動、薄層
走査分析、ウェスタンブロッティング、および反復されたスクリーニングの後に、操作さ
れた株(BL21−PET22b−ヒト−ニューレギュリン)を特徴付け、標的タンパク
質ニューレギュリンの安定高レベル発現を確立した。発現された標的タンパク質は、この
株における全タンパク質の約10%を占めた。高圧力ホモジネートプロセスの後に、標的
タンパク質は、封入体の形態で存在した。
分析した。封入体は、全タンパク質の約20%を占めた。精製された組換えニューレギュ
リン特異的活性は、5×103EU/mgを超え、ニューレギュリン産生株の構築が成功
したことを示した。SDS−PAGE、ウェスタンブロット、株スクリーニングの段階に
おける生物学的活性分析に加えて、さらなる分析(例えば、ニューレギュリンアミノ酸組
成物分析およびN末端配列分析)が実施された。これらの結果は、発現された組換えヒト
ニューレギュリンのアミノ酸配列が、設計されたものと同じであることを示す。
(実施例2.冠状動脈の結紮によって引き起こされるラットにおける心不全に対する組換
えヒトニューレギュリン(Neuregulin)の治療効果)
(1.要約)
(目的)冠状動脈の結紮によって引き起こされるラットにおける心不全に対する組換えヒ
トニューレギュリン−1β(rhNRG−1β)の治療効果を研究すること。(方法)ラ
ットを開胸し、環状脈の下行枝を左心耳と肺動脈円錐との間の部位で非侵襲性縫合糸で結
紮し、亜急性心不全ラットモデルを準備した。一般的に、結紮の約6日後、左心室の駆出
率は約50%まで低下した。これらの群を無作為(すなわち、モデル群、試験薬物群(t
esting drug group)、および偽手術(偽操作)群(開胸のみで冠状動
脈を結紮しなかった)に分けた。各群には10〜13の動物が存在し、3つの投薬レベル
の群を試験薬物群について設定した(投薬レベルは、それぞれ、5、10および20μg
/kgであった)。薬物を、1日1回、連続10日間、尾部の静脈に注射した。心機能の
決定(心エコー検査)を、薬物の投与の6日前および薬物の投与中止の後に実施し、試験
マウスを、剖検し、心臓の重量を量り、心室壁の厚みを決定し、病理学的検査および血漿
中のレニン−アンジオテンシン−アルドステロンレベルを決定した。(結果)3つの投薬
レベルのrhNRG−1の連続5日の薬物投与後、動物モデルの駆出率(71.1±12
.0%、64.4±12.9%、62.9±8.4%)および動物モデルの短縮率(36
.9±9.7%、32.0±9.5%、30.3±6.1%)は、全て増加し、動物モデ
ル群と比較して、20μg/kg群と、10μg/kg群との間に有意差があった(P<
0.01);さらに、20μg/kgモデル群の駆出率の変化は、薬物投与の約35日後
まで維持され(P<0.05);rhNRG−Iβの20μg/kgは、心筋の虚血領域
を有意に減少させ、繊維性病変の毛細血管数を増加させ(P<0.05);rhNRG−
1βの20μg/kgおよび10μg/kgは、末梢のアンジオテンシンI(AI)、ア
ンジオテンシンII(AII)、レニン(PRA)およびアルドステロン(ALD)のレ
ベルを低下させ、これはモデル群と比べた場合に有意差があった(P<0.01、P<0
.05)。連続10日の注入と連続5日の注入との間には有意差はなかった(P<0.0
5)。(結論)特定の用量のrhNRG−1βを連続5日の静脈注入すると、冠状動脈の
結紮によって生じたラットにおける心不全を効果的に処理し得る。
(2.実験の目的)
冠状動脈の結紮によって生じたラットにおける心不全について、rhNRG−1βの治
療効果を研究すること。
(3.試験薬物)
rhNRG−Iβを、Zensun(Shanghai)Science & Tec
hnology Co Ltd、ロット番号:200110006−2;濃度:500μ
g/アンプル;力価決定:5000u/アンプル;純度:>95%(HPLC−C8)を
調査し、産生した。
(4.実験動物)
4.1 種、供給源および適応性証明数(number of certificat
e of competency):SDラット(Experimental Anim
al Center of Chinese Academy of Scienceに
より提供)、適応性証明数:Zhong Ke Yuan Dong Guan Hui
003;
4.2 体重、性別:200〜220g、雄性
(5.試薬および設備)
5.1 心エコーデバイス、Hewlett Packard Sonos 5500
、プローブ型:S12;
5.2 6 誘導電子生理レコーダーを指導する(Six leads electr
o−physiology recorder)、SMUP−C−6、Shanghai
医科大学の生理学部によって製造された;
5.3 電子バランス、Mateler−Tolido設備(Shanghai)Co
Ltd;
5.4 冠状静脈留置ニードル、20G、Sino−America Weng Zh
ou Hua Li Medical Equipment Companyによって製
造された;
5.5 微小副尺付きカリパス(Micro−vernier calipers)、
Harbin Measure & Knife Factory;
5.6 放射性−免疫γ係数器(Radio−immuneγ counter)、G
C−1200、Zhong Jia Photoelectric Equipment
Branch of General Science & Technology
Industry Company of China Science & Tech
nology University;
5.7 レニン、アンジオテンシンキット、AI:Beijing North Bi
o−Tech Institute、ロット番号:0210;
全て:Beijing North Bio−Tech Institute、ロット番
号:2028;
5.8 脱毛剤、8%硫酸ナトリウム、Xi Long Chemical Plan
t of GuangDong Province、ロット番号:010622;
5.9 塩酸ケタミン、Shanghai Zhong Xi Pharmaceut
icals Co Ltdによって製造された、ロット番号:20020401。
(6.実験方法)
6.1 実験群
偽手術(偽操作)群、モデル群および試験薬物群を準備した。
群(ネガティブコントロール群)(n=12):調製物のビヒクルを注入した(10mM
PB, 0.2% ヒト血清アルブミン,5% マンニトール);試験薬物群(n=1
3):rhNRG−1β(3つの投薬レベル)、2亜群を各投薬レベル群について設定し
た;1つの群を、薬物投与後の長期間のモニタリングに使用した。
6.2 試験薬物および薬物調製物の投薬準備、投薬経路、注入時間、投薬される濃度お
よび容積。投薬レベル群(高(20μg/kg)、中(10μg/kg)、低(5μg/
kg))を、予備実験の結果によって設定した。薬物を、調製緩衝溶液(10mM PB
、0.2%ヒト血清アルブミン、5%マンニトール)で必要な濃度に希釈した
薬物投与経路:試験薬物群とモデル群の両方において、薬物を、尾部静脈に連続5日の
間、1日1回注入した。心エコー検査を薬物投与の6日前に実施し、次いで、5日間にわ
たって連続的に注入した。各薬物注入の容積は、0.4ml/l00g体重であった。
6.3.1 冠状動脈の前下行枝の結紮によって心不全ラットモデルを準備する
100mg/kgケタミンの腹腔内投与での麻酔後、ラットを仰臥位に固定し、除毛後
、ブロモ−ゲラミン(bromo−geramine)で頸部領域を消毒した。正中切開
し、前頚部筋肉組織を分離した後に気管を見出し、18Gの動脈留置套管針(troch
ar)を、3〜5気管軟骨のレベルで気管に注入し、スタイレットを取り出し、プラスチ
ックカニューレを1〜2cm気管にさらに挿入し、小さな動物については、後でベンチレ
ータと接続するために固定した(換気堆積は約20 ml、頻度は80/minである)
。左前胸壁皮膚を開いた後、筋肉を分離し、4番目および5番目の肋骨を露出させ、カー
ブ鉗子で胸壁を貫通し、肋骨下の組織を分離し、ベンチレータと接続し、心臓を露出させ
、肺の拡張および心拍をモニタリングし、心膜を裂き、上方の脂肪パッド(fat pa
d)を上向きにし、左耳介および肺円錐体を完全に露出し、医学的使用の間、2つの部分
の間で左冠状動脈を6/0非侵襲性縫合糸で結紮した。梗塞を起こした心筋領域(約8m
m×8mm)は、紫色になり、結紮後、著しく有意に減少した活性を示した。次いで、胸
壁を閉じ、肺を膨張させるためにベンチレータの開口を遮断し、空気を追い出すように胸
部を強く押し、次いで、胸筋および皮膚を縫合した。呼吸をモニタリングし、自発的な呼
吸が回復した後、ベンチレータを取り外し、飼育のために動物をケージに戻した。偽手術
(偽操作)群では、冠状動脈の結紮はせず、心膜を裂いて開いただけである。手術したラ
ットに、手術の約6日後に心エコー検査を実施した。EF値が約50%低下した動物を、
無作為に群分けし、各々の群のEF値を全て約50%にし、次いで薬物投与を始めた。
約50%のEF値を有する動物を、無作為にモデル群(ネガティブ群)および3つの投
薬レベルの試験薬物群(各群12〜13匹の動物)に、分けた。試験薬物群およびモデル
群の薬物投薬経路は、尾部静脈への注入であり、連続5日間、1日1回であった。6日目
の心エコー検査後、もう5日の薬物連続投与を実施した。各注入用量は、0.4ml/1
00g体重であった。
量り、心室壁の厚みを決定し、心臓の病理検査を実施し、末梢血を採取し、血漿を分離し
、そしてレニン−アンジオテンシンアルドステロンを測定した。
6.3.3.1 心機能の測定
心エコー検査を、結紮後であり、かつ薬物投与の前、薬物投与の6日後、薬物投与の1
1日後に、ケタミンを用いた麻酔下に実施した。主要な指標は、以下が挙げられる:
EF:心駆出率、心室の駆出機能を反映する;
FS:心室短軸短縮率、心室の収縮機能を反映する;
LVDd:左心室の拡張期最大内径(cm);
LVDs:左心室の収縮期最小内径(cm)
6.3.3.2 血漿中のレニン−アンジオテンシン−アルドステロンの含有量の決定
これは、Fudan大学と提携したRadio−isotope Departmen
t of Zhong Shan Hospitalによって実施されたことを提示した
。
−20℃で保存した。レニン活性(PRA)、アンジオテンシンI(AI)、アンジオテ
ンシンII(AII)およびアルドステロン(ALD)の含有量を、免疫アッセイで決定
した。
Shanghai Difficult Pathologic Consultin
g CenterのWand Bing Seng教授が実施した。
スライスに切断し、パラフィンに包埋して切片を作製し、HE染色し、心臓の線維性領域
について画像分析し、線維性病巣における毛細血管数を数え(計数単位:標本/mm2)
;Nagar−Oslen染色し、心筋における虚血性低酸素領域の大きさを研究した。
t検定を、収集された実験データについて実施した。
(8.実験結果)
8.1 ラットの虚血性心臓の機能に対するrhNRG−1βの効果
薬物投与の5日後に実施した心エコーの結果は、モデル群のEF値(50.2±8.4
%)およびFS値(22.4±4.6%)は、偽手術(偽操作)群のEF(91.1±2
.4%)およびFS(57.3±3.9%)よりも有意に低く、有意差がある(P<0.
01)ことを示した。試験薬物群(20、10および5μg/kg)のEF値(71.1
±12.0%、64.3±12.8%、62.9±8.4%)とFS値(36.9±9.
7%、32.0±9.5%、30.3±6.1%)の両方は、一旦有意に増加し、モデル
群と比較した場合に有意差があった(P<0.01)。
びFS値(18.3±3.2%)が、偽手術(偽操作)群のEF(95.0±2.8%)
およびFS(65.3±6.8%)よりも依然として有意に低く、有意差(P<0.01
)があることを示した。試験薬物群(20、10および5μg/kg)のEF値(75.
7±10. 8%、61.4±15.0%、59.2±12.4%)およびFS値(41
.3±11. 0%、30.3±10.4%、28.4±8.6%)は、依然として相対
的に高レベルで維持され、モデル群と比較した場合、有意差があった(P<0.01)。
しかし、薬物投与の5日目の結果と比べた場合、有意差はなかった。表1〜6は、2つの
実験の結果を示した。
おける、ラット心臓のEF値についての観察を実施し、その結果は、20μg/kg r
hNRG−1β群のラット心臓EF値が、相対的に高レベルで安定に維持され、モデル動
物群と比べた場合に、有意差(P<0.05)を有することを示した(表7)。
(表1.心不全モデル動物(1)を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投与
前の心機能の測定パラメータ)
8.2 モデルラット心筋の病理組織学に対するrhNRG−1βの効果
8.2.1 モデル動物における心筋虚血および低酸素症の重傷度に対するrhNRG
−1βの効果
Nagar−Oslenで染色した切片において、正常な心筋は淡黄色に染まるが、虚
血性領域は、赤茶色に深く染まった。虚血性低酸素症は、この方法で分析および定量的試
験および半定量的試験の比較がなされ得る。
染まり、心筋の大きなパッチは赤色に染まるが、偽手術(偽操作)群の心筋は、赤色に染
まった領域はなく、黄色に染まり;20μg/kg rhNRG−1βの赤色に染まった
心筋細胞は、途切れた分布(punctuate distribution)を示し;
10μg/kgおよび5μg/kg群の赤色に染まった組織は、一様でない分布を示した
。このことは、rhNRG−1βが、虚血性低酸素症損傷の重傷度を軽減し得ることを実
証した。
NRG−1βの効果)
種々の試験群の心筋組織における毛細管数の変化を、Leica画像分析システムを用
いて研究した。rhNRG−1βを用いた試験薬物群のモデル動物の心筋の線維性病変に
おける毛細管数の増加が存在することが結果から明らかとなり、20μg/kgの用量レ
ベルと、モデル群との間に有意差が存在し(P<0.01)、10μg/kgおよび5μ
g/kgの用量レベルの群と、モデル群との間には、統計的に差が見られず、このことは
、高用量のrhNRG−1β(20μg/kg)が、ラットにおける冠動脈の結紮後に、
心筋の線維性病変における毛細管の増殖を促進し得ることを示す(表8、図16および1
7)。
効果)
(8.3 モデル動物における血漿中レニン−アンギオテンシン−アルドステロンレベ
ルに対するrhNRG−1βの効果)
血漿中のレニン(PRA)、アンギオテンシンI(AI)、アンギオテンシンII(A
II)、およびアルドステロン(ALD)のレベルを、ラジオイムノアッセイを用いて、
種々の試験薬物群において決定した。モデル動物群において、結果は、PRA、AI、A
IIおよびALDがそれぞれ、3.506±1.78ng/ml.h、10.655±1
.18ng/ml、1366.38±577.33pg/mlおよび1.738±0.3
4ng/mlであったことを示した。擬操作群の結果(1.315±0.96ng/ml
、8.125±1.57ng/ml、564.37±273.56pg/mlおよび1.
113±0.45ng/ml)と比較すると、含量は有意に増加し、その差は統計的に有
意であった(P<0.05)。
よびAII(641.47±283.86pg/ml、468.58±165.10pg
/ml)のレベルは、有意差(P<0.01)を伴って、20μg/kgおよび10μg
/kgのrhNRG−1β群において有意に減少した。PRA(1.337±1.09n
g/ml.h、1.075±1.50ng/ml.h)およびALD(1.02±0.2
7ng/ml、1.26±0.38ng/ml)もまた有意に減少し、モデル群のものと
比較すると、有意差(P<0.05)が存在した。しかし、擬操作群のものと比較すると
、この差は統計的に意味を有さず(P>0.05)、このことは、特定の用量レベルのr
hNRG−1βが、その冠動脈を結紮した後に、ラットにおける血漿中のPRA、AI、
AIIおよびALDの含量を減少し得ることを示す(表9)。
シンI(AI)、アンギオテンシンII(AII)およびアルドステロン(ALD))
(9.結論)
モデルコントロール群の拍出画分(50.2±8.4%)と短縮画分(22.4±4.
6%)を比較すると、連続した5日間注射された、3つの用量レベルのrhNRG−1β
は、拍出画分(71.1±12.0%、64.4±12.9%、62.9±8.4%)お
よび短縮画分(36.9±9.7%、32.0±9.5%、30.3±6.1%)を上昇
し得、20μg/kgと10μg/kgとモデル動物群との間に有意差が存在し(P<0
.01)、さらに、試験薬物群のモデル動物における拍出画分の変化は、薬物投与後約3
5日間、維持され得る(P<0.05);20μg/kgのrhRNG−1βは、心筋の
虚血性低酸素領域を有意に減少し得、線維性病変における毛細管数を増加し得る(P<0
.05);20μg/kgおよび10μg/kgのrhNRG−1βは、モデル動物の末
梢血液におけるアンギオテンシンI(AI)、アンギオテンシンII(AII)、レニン
(PRA)およびアルドステロン(ALD)のレベルを減少し得、モデル動物群のものと
比較した場合、有意差を有する(P<0.01、P<0.05)。連続した10日の薬物
投与と、連続した5日の薬物投与との間には有意差は存在しなかった(P<0.05)。
hNRG−1βは、冠動脈の結紮によって生じたラットの心不全を効果的に処置し得るこ
とを示した。
る、20μg/kgのrhNRG−1βの治療効果)
(1.要約)
(目的) ラットにおいてアドリアマイシンに予引き起こされた毒性心筋炎に対する、
20μg/kgのrhNRG−1βの治療効果を研究すること。(方法) 3.3mg/
kgのアドリアマイシンを、1週間毎の連続4回の注射で、SDラットの尾静脈に注射し
、アドリアマイシンが引き起こすSDラットの毒性心筋炎モデルを準備した。3つの用量
レベルのrhNRG−1β群を準備し、これらに、10μg/kg、20μg/kgおよ
び40μg/kgを、連続した10日間、1日あたり1回(qd)、静脈内に注射した。
動物の生存をモニタリングした:血流動的指数、心臓重量/体重の比、心筋の病理学的検
査を実験の終わりにモニタリングし、血清中のトロポニンT(cTnT)レベルもまた決
定した。(結果) 40μg/kg、20μg/kgおよび10μg/kgの用量レベル
のrhNRG−1β群の生存率は、モデル動物の15%の生存率と比較して、有意に上昇
し、それぞれ、85%、90%および60%に達した。試験薬物の高用量レベル、中用量
レベルおよび低用量レベルの群のdp/dt、−dp/dtおよびLVPmaxは、有意
に上昇し、dp/dtはそれぞれ、5954±689、6107±418および4875
±636に達し、−dp/dtはそれぞれ、−4794±954、−4323±457お
よび−3672±884であり、LVPmaxはそれぞれ、165.72±22.7、1
56.1±17.7および145±15.2であり、モデル動物群と比較した場合、有意
差(P<0.001)が存在し、さらに、40μg/kgおよび20μg/kgの用量群
と、10μg/kgの用量群との間のdp/dt、−dp/dt、LVPmaxには有意
差が存在し(P<0.05)、いくらか用量依存性であった;40μg/kg、20μg
/kgおよび10μg/kgのrhNRG−1βは、モデル動物における心筋損傷の重篤
度を効率的に改善し得、かつ、血漿中のトロポニンT(cTnT)レベルを減少し得、こ
れらは、それぞれ、0.025±0.011、0.031±0.006および0.074
±0.024であり、モデル群の0.205±0.072と比較した場合、有意差があっ
た(P<0.01)。(結論) 20μg/kgのrhNG−1βは、ラットにおいてア
ドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋損傷を効率的に処置し得る。
ラットにおいてアドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋炎に対するrhNRG
−1βの治療効果を研究するため。
rhRNG−1β、Zensun(Shanghai)Science&Techno
logy Development Co.Ltd製。バッチ番号:200110006
−2 規格:500μg/アンプル。力価測定:5000u/アンプル;純度:>95%
(HPLC−C8)。
SDラット:Experimental Animal Center of Fud
an University Medical Collegeより提供された、動物適
格性の証明書番号:Yi Dong Zi 02−22−11。体重250±30g、雄
性。動物を、ランダムに群(各群20匹の動物)に分け、別々のケージで飼育した。動物
室の温度は18〜22℃であり、相対湿度は50%〜70%であった。
6リード電気−生理学的レコーダー(Six leads electro−phys
iology recorder)、SMUP−C−6(Physiology Dep
artment of Shanghai Medical University製)
;
エネルギー交換器(Japan Photoelectricity Industr
y Company、NIHON KOHDEN、モデル:TP−400T);
電気化学発光自動免疫分析装置(モデル2010):Roche Diagnosti
cs Co Ltd、バッチ番号158468;
精密電気天秤(Precisive electro−balance)、(Mate
ler−Tolido Equipment Co Ltd;Max:610g d=0
.01g);
マイクロスケールノギス(Harbin Measure&Knife Factory
、0.05mm);
動静脈留置針、20Gm(Sino−America Weng Zhou Hua
Li Medical Equipment Company製);
血清トロポニン測定のための試薬キット(Behring Dignostic In
c.)。
(6.1 実験のグループ分け)
正常なコントロール群、モデル動物群および試験薬物群を準備した;モデル群(ネガテ
ィブコントロール群):アドリアマイシン(MingZhi Pharmaceutic
als製;ShanTou Special Economy Prefecture(
バッチ番号:000201、有効期限:2003年2月);試験薬物群:rhNRG−1
β群。
の濃度および容量)
試験薬物群の10μg/kg、20μg/kgおよび40μg/kgの3つの用量レベ
ルを設定した。1mlの注射用水で溶解し、賦形剤で必要な濃度に調節した。賦形剤の主
要な成分は、5%マンニトール(注射用)、0.2%ヒト血清アルブミン(注射用)、1
0mM リン酸緩衝溶液(Zensun(Shanghai)Science&Tech
nology Development Co Ltd.製)であった。試験薬物を注射
前に調製した。
、rhNRG−1βの注射を、10日間にわたって、1日1回実施した。用量は、体重に
よって調節し、投与される薬物の容量は、0.2ml/100gであった。
(6.3.1 動物心不全モデルの構築方法)
<<Guidance Principle of New Drug Precli
nical Experiment>>に基づいて、3.3mg/kgのアドリアマイシ
ンを、連続4回にわたって、1週間に1回の注射で、尾静脈に注射し、アドリアマイシン
が引き起こした毒性心筋炎ラットモデルを確立した。
アドリアマイシンの初回注射の後、24時間以内に、rhNRG−1βを尾静脈に注射
した。実験の間、動物の生存を、動力学的にモニタリングし、心臓機能指数(左心室内の
圧増加の最大速度であるdt/dpmax、左心室内の圧減少の最大速度である−dp/
dt、左心室の収縮期圧であるLVPmax、左心室の拡張期圧であるLVPmin)を
、5週目にモニタリングした。心臓組織から切片を作製し、病理学的変化を試験した。
(6.3.3.1 生存率)
生存の状況を毎週記録し、種々の実験群の生存率を算出した。生存率(%)=生存動物
数/実験動物数 ×100
(6.3.3.2 心臓の重さ/体重の比、心臓組織の病理学的切片)
開胸術(心耳は取っておかれる)の後、心臓を摘出し、吸収紙で乾燥させた後、心臓の
重さを測定し、心臓の重さ/体重の比を算出した;心臓の外径を、垂直に立っている心臓
の1/2の部位で測定した;左心室の中間部分を横方向に切開し、左心室の遊離壁(fr
ee wall)の最大厚を測定した;心臓を10%ホルムアルデヒドで固定し、パラフ
ィン包埋し、HE染色し、光学顕微鏡下で心筋構造の観察を行って、病理学的スコアを割
り当てた。
グレード0:正常な心筋構造、心筋細胞の萎縮または肥大を伴わず、液胞および横紋は
はっきりとしている;心筋の規則正しい配列;異常のない心内膜および心膜;血管および
間質組織に変化はない。
て見られ、一方で、隣接する心筋細胞は依然として正常に見えた。
成した心筋細胞において見られ、心筋細胞の小さな病巣壊死がまた見られた。
著な壊死を伴う液胞の形成。スコア付けは、グレード1とグレード2の間、またはグレー
ド2とグレード3の間(例えば、グレード1.5、グレード2.5など)で行われ得る。
血行動態指数(例えば、頚動脈圧、心室内圧、dp/dt)を、6リード電気−生理学
的レコーダーで測定した。主な手順:右頚動脈を分離し、その遠位端で結紮し、動脈クラ
ンプでその近位端をブロックし、20G動静脈留置針を頚動脈に挿入して、メダル探針を
摘出し、動脈クランプを緩めてプラスチック套管針をさらに適切な深さまで押し込み、1
0分間留置して、生理学的レコーダーにより記録された波形を観察し、波形が安定した後
に、頚動脈圧を記録し、そして、左心室へとさらに套管針を押し込み、適所に15分間維
持して、波形が安定した後に、dp/dt、−dp/dt、LVPmaxおよびLVPm
inを記録した。
2mlの動脈血を回収し、血清を抽出して、凍結し、−20℃にて保存し、Clini
cal Laboratory of Zhong Shan Hospitalによっ
て実施されているように提示された、電気化学照射法を用いて、血清cTnT含量の決定
を行った。
データをX±SDとして表した。群間の差を、一階乗分散分析(monofactor
ial variance analysis)を用いて分析した。
(8.1 アドリアマイシンは、ラットにおいて心不全を合併した毒性心筋炎を誘導し
得る)
表10および図18を参照のこと。3.3mg/kgのアドリアマイシンを、4連続の
毎週一回の注射で、静脈内注射した。5週後、動物の生存率は15%であり、生存してい
るラットにおいて有意な心臓機能の障害が見られた。これらのdp/dt、−dp/dt
、LVPmax、LVPminは、それぞれ、正常値の43%、47%、58%および3
7%であった。心筋組織の病理学的スコア付けは、2.33±0.26であり、相対罹患
率は100%であった。血清cTnTは、有意に増加して0.2ng/mlに達し、この
ことは、アドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋炎と結果として生じる心不全の
動物モデルが、首尾よく確立されたことを示す。
数(determination index))
的切片を示す;a:正常なコントロール群:心筋の病理学的スコアは0であり、心筋細胞
の萎縮および肥大は伴わず、液胞の形成が見られ、横紋がはっきりと見られ得る;心筋は
規則正しく整列していた;心内膜および心膜の異常なし;脈管および間質組織の変化なし
;b:モデル動物群:心筋の病理学的スコアは3であった、広い領域の心筋細胞の壊死お
よび溶解。
この結果は、延長された実験時間でrhNGR−1βの3つ全ての投薬レベルが、モデ
ル動物の死亡率を有意に減少させ、20μg/kgの投薬群のモデル動物の生存率が90
%に達したことを示した(P<0.01)(図19)。
薬物投与の後、全ての試験薬物群動物のdp/dtおよびLVPmaxは、いくらか上
昇した。SPSSソフトウェアでの一因数変数分析(monofactorial va
riance analysis)を通して、内部群比較が、試験薬物群動物のdp/d
tおよび−dp/dtがモデル動物群のdp/dtおよび−dp/dtと比べて有意に高
く(P<0.001)、コントロール群のdp/dtおよび−dp/dtと比較した場合
、その差は有意ではない(P>0.05)ことを示した。40μg/kgおよび20μg
/kgの投薬群のdp/dtおよび−dp/dtは、10μg/kgの投薬群のdp/d
tおよび−dp/dtより有意に高く(P<0.01);試験薬物群のLVPmax(4
0μg/kg、20μg/kgおよび10μg/kg)は、同様にモデル動物群のdp/
dtおよび−dp/dtより有意に高く(P<0.001)、さらに、種々の試験薬物群
の間の差は、統計的に有意であり(P<0.05)、rhNRG−1βは、モデル動物の
心臓機能を改善するのに効果的であり得、用量依存性であることを示した。2つの実験の
結果は、一致した(表11および表12)。
(8.4モデル動物の心筋構造におけるrhNRG−1βの効果)
rhNRG−1βは、モデル動物の心筋細胞損傷の重篤度を有意に減少し、病理学上の
スコアを有意に減少し、その差は、モデル群のものと比較した場合に統計的に有意であっ
た(p<0.01、P<0.05)。表13および表14ならびに図20は、2つの実験
の結果を示した。
a:モデル動物心筋病理学的スコアは3であった、心筋細胞壊死および崩壊の大きな領
域;b:40μg/kg試験薬物群、心筋病理学的スコアは1であり、心筋細胞のほとん
どは正常であり、散在性心筋細胞中の局所的心筋細胞質崩壊が存在した;c:20μg/
kg試験薬物群、心筋病理学的スコアは1であり、心筋細胞のほとんどは正常であり、散
在性心筋細胞中の局所的心筋細胞質崩壊が存在した;d:130μg/kgの試験薬物群
、心筋病理学的スコアは1.5であり、小胞変性が、心筋細胞の小さなクラスター中で見
られた。
(8.5モデル動物の血清cTnTにおけるrhNRG−1βの効果)
薬物投与の後、血清cTnT含有量は、各々の動物群において有意に減少し、血清cT
nTの高い、中間の、および低い投薬レベル群は、モデル群より有意に低かった(P<0
.001)。これら2つの実験の結果は、一致した(表15および表16)。
(8.6モデル動物の心臓サイズにおけるrhNRG−1βの効果)
表18は2つの実験の結果を示した。試験薬物群の心臓身体的パラメーターにおける有
意な変化はなく、群の間の差は、統計的に有意でなかった(P>0.05)。
(9.結論)
40μg/kg、20μg/kgおよび10μg/kgのrhNRG−1は、生存率を
有意に改善し、モデル群の15%の生存率と比較して各々85%、90%および60%に
達した;dp/dt、−dp/dtおよびLVPmaxの高い、中間の、および低い投薬
レベル群は、有意に増加し、dp/dtは、各々5954±689、6107±418、
4875±636であった。−dp/dtは、各々−4794±954、−4323±4
57、−3672±884であった。そしてLVPmaxは、それぞれ165.7±22
.7、156.1±17.7、145±15.2であった。コントロール群と比較する際
に有意な差が存在した(P<0.001)。さらに、40μg/kgおよび20μg/k
gの投薬群のdp/dt、−dp/dtおよびLVPmaxは、10μg/kg群のdp
/dt、−dp/dtおよびLVPmaxと有意に異なり(<0.05)、そしてある程
度用量依存性であり;40μg/kg、20μg/kgおよび10μg/kgのrhNR
G−1βの3つ全ての用量レベルは、モデル動物における心筋損傷の重篤度を効果的に軽
減し、血清トロポニンT(cTnT)含有量を減少し、各々0.025±0.011、0
.031±0.006および0.074±0.024であり、モデル動物群の0.205
±0.072と比較した場合、有意な差が存在した(P<0.01)。
を介してラットにおけるAdriamycinによる毒性心筋障害を効果的に処置し得、
心臓の収縮機能を改善し、動物の死亡率を減少させたことを示した。
るrhNRG−1βの治療効果)
(1.要旨)
目的:ウイルス(Coxsackie B3)感染により引き起こされる急性心筋損傷
におけるrhNRG−1βの治療効果を研究すること。方法:Mマウス(Mmouse)
急性ウイルス心筋モデルが、Coxsackie B3ウイルス(CVB3)の腹内感染
を介して確立した。モデル動物を、以下の群に無作為に分割した:すなわち、正常なコン
トロール群、モデル群、試験薬物群(各々の群は20匹の動物を有する)。rhNRG−
1βの30μg/kg、15μg/kg、および7.5μg/kgの3つの投薬レベルが
確立され、尾静脈中に注入され、これは、連続した5日間の間の同じ日に実行された。実
験の間、動物生存率をモニタリングした。心臓機能試験(心エコー検査)を7日目に実施
し、8日目にその動物を殺し、血清をトロポニンI(cTnI)レベル決定のために抽出
し、そして心臓病理学的試験を実施した。結果:30μg/kgおよび15μg/kgの
両方の群のEF値(90.2±2.5%、86.0±2.9%)およびFS値(55.7
±2.1%、50.7±4.3%)は、有意に増大した;モデル群の値と比較して有意な
差が存在し(P<0.01)、LVDd値(0.187±0.006、0.189±0.
008)およびLVDs値(0.085±0.009、0.099±0.027)は、モ
デル群の値(0.208±0.015、0.142±0.020)より有意に低かった(
P<0.05);rhNRG−1βは、心筋病理学的損傷の重篤度を軽減し、血清トロポ
ニン(cTnI)レベルを効果的に減少し、cTnIの30μg/kgの用量群(7.9
8±6.07ng/ml)および15μg/kgの用量群(19.43±10.76ng
/ml)は、モデル群(44.44±12.39ng/ml)のcTnIより有意に低く
、これらの間の差は、統計的に有意であった(P<0.001、P<0.005);30
μg/kgのrhNRG−1βは、モデル動物の生存比を有意に改善し、この比は80%
に達した(P<0.05)。結論:rhNRG−1βの特定の用量が、ウイルス感染によ
って生じる急性心筋障害を効果的に処置し得た。
マウス中のウイルス感染により生じる急性心筋損傷におけるrhNRG−1βの治療効
果を研究することおよび任意の有効な用量を見い出すこと。
rhNRG−1β(Zensun(Shanghai)Science & Tech
nology Developmentによって提供される)。ロット番号:20011
0006−2。滴定:5000u;純度:>95%(HPLC−C8)。
4.1種、供給源、能力の証明:4週齢の純粋繁殖されたBALB/Cマウス(Fud
an Universityの実験動物部門により提供された)動物能力の証明書番号:
Yi Dong Zi 22−9。
4.3各々の群の動物数:各々の実験群における20匹の動物、正常なコントロール群
の10匹の動物
(5.ウイルス)
Coxsackie Virus B3、CVB3、Nancy株(Minister
ial Viral Heart Disease Laboratory(Shang
hai Municipal Cardiovascular Diseases In
stitute)により提供された)。
6.1心エコー検査装置、Hewlett Packard sonos 5500;
プローブの型:S12’;
6.2Immuno−Assay System Opus(登録商標)Plus(血
清トロポニンI(cTnI)を決定するためのBehring Diagnostic
Inc.により生成された)、ロット番号:CTE8;
6.3正確な電子天秤、KERN822;
6.4注入のための水、Zang Jiang Andus Bioproduct
Co Ltd,10×5ml、ロット番号:0112180;
6.5脱毛剤、8%硫化ナトリウム、GuangDong XiLong Chemi
cal Plant、ロット番号:010622。
7.1実験群
正常なコントロール群、モデル群、試験薬物群および偽薬コントロール群を、準備した
;モデル群は、ネガティブコントロール群である(n=20)。調製された緩衝液が、投
与された(10mN PB,0.2%ヒト血清アルブミン、5%マンニトール);
試験薬物群(n=20):高い、中間の、低い投薬レベルのrhNRG−1β群が分割
された;偽薬コントロール群(n=20):非CVB3凍結解凍細胞上清の腹内注射、0
.2ml/動物。
度および容積)
3つの投薬レベル、30μg/kg、15μg/kgおよび7.5μg/kgの試験薬
物群が、予備実験の結果に基づいて確立された。調製緩衝溶液(10mM PB、0.2
%ヒト血清アルブミン、5%マンニトール)で必要とされる濃度に希釈した。
。毎日1回(qd)、連続する5日間について、投与される各々の薬物の容積は、0.2
ml/動物であった。
7.3.1マウス中の急性ウイルス心筋炎動物モデルの準備
Fudan Universityに付属するZhong Shan Hospita
lにより提供される0.2mlの100×TCID50CVB3を、腹内に注入し、心筋
モデルを確立した。続く一週間以内に、マウスは、起毛、脱毛、衰弱、不活発化および死
を示し、試験動物の約半数が、8日目に死んだ。
試験薬物の尾静脈への静脈内注入が、マウスにおける腹内ウイルス感染と同じ日に実施
された。この注入は、連続する5日間の間実施され、動物生存率がモニタリングされ、実
験の完了の後、心エコー検査、心筋病理学的試験、血清トロポニン測定が、実施された。
7.3.3.1マウスにおける心臓機能測定
胸部脱毛を、ウイルス感染の7日目に実施し、次いでマウスを、特別に作製された固定
化マウント上に固定し、心エコー検査を、S12高振動数プローブを用いて実施した。主
な指標は、以下を含んだ:
EF:左心室の駆出画分であって、左心室の駆出機能を反映する主な指標;
FS:左心室の短縮画分であって、左心室の収縮機能を反映する指標;
LVDd:心臓拡張最大内部直径(cm);
LVDs:心収縮最小内部直径(cm)。
心筋損傷の重篤度は、他の慣習的な指標(例えば、CK、LDH、およびAST)と比
較する場合、高い特異性および高い感度の利点を有する、血清cTnIの量の測定を介し
て評価された。従って、血清cTnI含有量測定を、心筋損傷の重篤度を反映する客観的
な指標として使用した。ウイルス感染の8日目にて、マウスの体重が測定され、血液が眼
窩から引き出され、血清が分離され、−20℃の冷凍庫で保存され、発光反応を有する血
清cTnI測定が、実行された。
試験は、Fudan Universityに付属するShanghai Medic
al Collegeの病理学部により実行されるように付託された。
を摘出し、心臓重量を測定し、固定のためにホルムアルデヒド中に心筋層を入れ、パラフ
ィン中で包埋し、連続した切片を作製し、病理学的試験を実施し、心筋の炎症細胞浸潤、
変性および壊死を観察した。新薬評価ガイドラインの原理に基づいて、病理学的スコア基
準を、以下のように規定した:
スコア0:0%を占める病変領域;
スコア1:25%を占める病変領域;
スコア2:50%を占める病変領域;
スコア3:75%を占める病変領域;
スコア4:100%を占める病変領域;
スコアリングを、スコア1とスコア2との間で、またはスコア2とスコア3との間で実
施し得た(例えば、病変領域が80%である場合は、スコア3.2としてスコアされた)
。
種々の試験薬物群におけるモデル動物の死の状態が、モニタリングされた。
関連するデータの1対のt検定(pairing t test)が、データ処理につ
いて使用された。
9.1ウイルスで感染されたマウスの心臓機能におけるrhNRG−1βの効果
結果は、EF値(67.1±9.9%)およびFs値(32.0±7.2%)の両方が
、正常な値(EF,92.5±2.3%/Fs59.2±3.1%)より有意に低かった
、p<0.05;rhNRG−1β群の30μg/kgおよび15μg/kgのEF値(
90.2±2.5%,86.0±2.9%)およびFS値(55.7±2.1%,50.
7±4.3%)は有意に増加し、モデル群の値と比較する場合、有意な差が存在した(P
<0.01)。7.5μg/kg群のEF/FSは、モデル群のEF/FSと有意な差を
有さなかった(P>0.05)。
±0.020cm)は、正常なコントロール群の値よりも有意に高く(LVDs,0.1
79±0.007cm/LVDs,0.073±0.006cm)、これらの間に有意な
差が存在した(P<0.01)。rhNRG−1β群の30μg/kgおよび15μg/
kgのLVDdおよびLVDsは、モデル群のLVDdおよびLVDsより有意に低い(
P<0.05)一方、7.5μg/kgのLVDdおよびLVDsは、モデル群のLVD
dおよびLVDsと有意に異らなかった(P>0.05)。表19および表20は、2度
繰り返された実験の結果を示した。
定パラメーター)
定パラメーター)
)
結果により、モデル群のcTnI(44.44±12.39ng/ml)がrhNRG
−1β 30μg/kgのコントロール群(3.28±4.55ng/ml)より有意に
高いことが示された。群(7.98±6.07ng/ml)は、モデル群より有意に低か
った(P<0.01);rhNRG−1β 15μg/kg群のcTnI(19.43±
10.76ng/ml)は、モデル群とは有意に異なった(P<0.05)のに対して、
rhNRG−1β 7.5μg/kg群(29.05±17.06ng/ml)のcTn
Iとモデル群のcTnIとの間では、統計的有意差は何らなかった。表21および22は
、2つの実験の結果を示した。
量に対するrhNRG−1βの効果)
有量に対するrhNRG−1βの効果)
分析によって、モデル群と比較(*P<0.05、**P<0.01)
(9.3.ウイルスに感染したマウスの心筋傷害に対するrhNRG−1βの効果)
実験の結果により、通常群の心筋病理的スコアは、0.0±0.00であり、モデル群
の心筋病理的スコアは、2.22±0.97であり、これらの間には有意差があることが
示された(P<0.01)。rhNRG−1βの高用量および中間用量レベルの両方の病
理的スコアは、有意に減少し(それぞれ、0.56±0.47および0.73±0.58
)、モデル群とは有意差があり(P<0.001)、低用量レベル群の病理的スコアとモ
デル群の病理的スコアとの間には有意差がなかった(P>0.05)。表23および24
ならびに図21および22は、2つの実験の結果を示す。
RG−1βの効果)
NRG−1βの効果)
表25および26は、2つの実験の結果を示した。ウイルスを注射して1週間後、モデ
ル群のマウスの生存率は、それぞれ、50%および55%であった一方で、rhNRG−
1βを注射した後、マウスは、85%および80%(30μg/kg)ならびに70%お
よび65%(15μg/kg)まで上昇した。
)
果)
30μg/kgおよび15μg/kgのrhNRG−1β群のEF値(90.2±2.
5%、86.0±2.9%)およびFS値(55.7±2.1%、50.7±4.3%)
は、有意に上昇し、モデル群と比較した場合、有意差があり(P<0.02)、LVDd
値(0.187±0.006、0.189±0.008)およびLVDs値(0.085
±0.009、0.099±0.027)の両方は、モデル群(0.208±0.015
、0.142±0.020)より低かった(P<0.05);rhNRG−1βは、モデ
ル群動物の心筋の病理的損傷の重篤度を緩和することができ、血清トロポニンI(cTn
I)レベルを有効に減少させ、30μg/kg用量レベル群(7.98±6.07ng/
ml)および15μg/kg用量レベル群(19.43±10.76ng/ml)のcT
nI含有量は、モデル群(44.44±12.39ng/ml)より有意に低く、それら
の間に有意差があった(P<0.001、P<0.005);30μg/kgのrhNR
G−1βは、モデル群動物の生存率を有意に改善でき、モデル群動物の生存率50%と比
較した場合、80%に達した(P<0.05)。
イルス感染により引き起こされた急性心筋傷害を有効に処置し得ることが示された。
るrhNRG−1βの治療的効果に対する観察)
(1.緒言)
(目的) ウイルス感染により引き起こされたマウスの急性心筋傷害の処置におけるr
hNRG−1βの薬物投与の効率的時間を研究すること。(方法) 急性心筋傷害動物モ
デルを、コクサッキーB3ウイルス(CVB3)のマウスにおける腹腔内感染を介して樹
立した。このモデル動物を、無作為に群分けし(すなわち、通常コントロール群、モデル
群、試験薬物群)、20匹の動物を、各群に割り当てた。30μg/kgのrhNRG−
1βを、それぞれ連続して3日間、5日間および7日間尾静脈に注射した。実験の間、動
物の生存率をモニターし、心エコー検査を7日目に行って、動物を8日目に屠殺した。血
清をcTnIレベル決定のために分離し、心臓病理組織学的検査を行った。(結果) 3
0μg/kgのrhNRG−1βの3日間、5日間および7日間の連続注射により、EF
/FS値を上昇させることができ、5日間および7日間試験薬物群のEF/FS値(86
.8±4.4%/51.9±5.8%、87.0±3.3%/51.8±5.1%)と、
モデル群のEF/FS値(66.5±5.6/31.8±3.7)とを比較すると、有意
差が存在し(P<0.001)、5日間および7日間試験薬物群のLVD値は、有意に減
少し(それぞれ、0.090±0.011、0.092±0.012cmである)、モデ
ル群(0.133±0.012)と比較した場合、有意差があった(P<0.01);r
hNRG−1βは、心筋の病理学的損傷の重篤度を緩和することができ、モデル動物の血
清トロポニンI(cTnI)レベルを有効に減少させ、5日間試験薬物群のcTnI(1
.06±1.32ng/ml)および7日間試験薬物群のcTnI(1.05±1.2n
g/ml)は、モデル群より有意に低かった(23.54±16.96ng/ml)P<
0.01;rhNRG−1βの連続5日間および7日間の注射は、動物の生存率を有意に
改善することができ、モデル動物の生存率50%と比較した場合、85%に達した(P<
0.05)。(結論) 連続5日間注射した30μg/kgのrhNRG−1βは、ウイ
ルス感染によって引き起こされたマウスにおける急性心筋傷害を有効に処置することがで
きた。
ウイルス感染によって引き起こされたマウスの急性心筋傷害の処置におけるrhNRG
−1βの薬物投与の有効時間を明らかにすること。
rhNRG−1β(Zensun(Shanghai)Science&Techno
logy Development.バッチ番号:200110006−2、力価:50
0u;純度:>95%(HPLC−C8)によって提供)
(5.実験動物)
5.1 種、供給源および能力の確認:4週齡の純系BALB/Cマウス(Exper
iment Animal Department of Fudan Univers
ityにより提供、動物能力の確認数:Yi Dong Zi 22−9)
5.2 体重および性別:13〜15g、雄性。
10匹。
前節において記載されたものと同じ。
前節において記載されたものと同じ。
10.1 実験群分け
通常マウスコントロール群、モデル群および試験薬物群を設定した;
通常マウスコントロール群(n=10);
モデル群(n=20):調製済み緩衝溶液を注射した;
試験薬物群(n=20):30μg/kgのrhNRG−1βを、3つの異なる治療過
程として、連続して3日間、5日間および7日間投与し、各群につき20匹の動物を割り
当てた;
プラシーボコントロール群(n=20):非CVB3凍結融解細胞上清(0.2ml/
動物)の腹腔内注射。
および容量
rhNRG−1βを、調製緩衝溶液(10mM PB、0.2% ヒト血清アルブミン
、必要な濃度まで5% マンニトール)で希釈した;3つの薬物投与群を設定し、連続3
日間、5日間および7日間の、各用量の薬物容積0.2ml/動物の静脈内注射を行った
。
連続7日間、各用量に対する薬物容量は、0.2ml/動物であった)。
7.3.1 マウスにおける急性ウイルス心筋炎動物モデルの設定
100×TCID50 CVB3(Fudan Universityの付属機関であ
るZhong Shan Hospitalによって提供された)を0.2ml、腹腔内
に注射し、心筋炎モデルを樹立した。翌週内に、そのマウスは、立毛、脱毛、やせ、無気
力および死亡を発現し、試験動物の約半数は、8日目に死亡した。
前節において記載されたものと同じ。
前節において記載されたものと同じ。
データ処理のために、関連データの両側t検定を使用した。
9.1 3日間、5日間および7日間投与されたrhNRG−1βの、ウイルスに感染
したマウスの心機能に対する効果)
結果により、EF/Fs値(66.5±5.6%/31.8±3.7%)が、通常群(
93.5±0.9%/68.1±1.3%)より有意に低く、その差は、統計学的に有意
であった(P<0.01)。連続5日間および7日間のrhNRG−1β注射のEF/F
S値(86.8±4.4%/51.9±5.8%、87.0±3.3%/51.8±5.
1%)は、モデル群とは有意に異なった(P<0.001)。連続3日間のrhNRG−
1β注射のEF値は、再び上昇した(73.1±6.6%)が、モデル群と比較した場合
、有意差はなかった(P<0.05)。
より高く、それらの間には有意差があった(P<0.01)。rhNRG−1βの5日間
投与群および7日間投与群のLVD値は、有意に減少し(それぞれ、0.090±0.0
11、0.092±0.012cm)、モデル群とは有意に異なった(P<0.001)
。rhNRG−1βの3日間投与群のLVD値(0.123±0.012cm)は、モデ
ル群とは有意に異なった(P<0.05)。表27および17〜28は、2つの実験の結
果を示す。
NRG−1βの効果)
hNRG−1βの効果)
)
結果により、通常群のcTnIの平均(0.12±0.03ng/ml)およびモデル
群のcTnIの平均は、有意に上昇し(23.54±16.96ng/ml)、それらの
間には有意差がある(P<0.001)ことが示された。cTnI値は、rhNRG−1
βの5日間投与群および7日間投与群の両方とも、有意に減少し(それぞれ、1.06±
1.32ng/ml、1.05±1.20ng/mlである)、モデル群とは有意に異な
った(P<0.001)。その差は、3日間薬物投与群とモデル群との間は有意でなかっ
た(P>0.05)。表29および30は、2つの実験の結果を示した。
するrhNRG−1βの効果)
対するrhNRG−1βの効果)
rhNRG−1βの効果)
実験結果により、通常群の病理的スコアが0.0±0.00であり、モデル群の病理的
スコアが増大し(1.44±1.19)、これらの間には有意差があり(P<0.01)
、rhNRG−1βの5日間投与群および7日間投与群の病理的スコアは有意に減少し(
それぞれ、0.11±0.14および0.13±0.13である)、モデル群とは有意に
異なる(P<0.01)ことが示された。3日間薬物投与群の心筋傷害もまた改善され(
0.33±0.155)、モデル群と比較した場合、有意差があったが、5日薬物投与群
の心筋細胞の改善は、3日間薬物投与群より顕著に良好であり、それらの間には有意差が
あった(P<0.01)が、その一方で、5日間薬物投与群と7日間薬物投与群との間に
は病理的スコアに有意差はなかった。
る日数投与されたrhNRG−1βの効果)
なる日数投与されたrhNRG−1βの効果)
表33および34は、2つの実験の結果を示し、モデル群のマウスの生存率は、それぞ
れ、50%および55%であったが、その一方で、rhNRG−1βの5日間投与群およ
び7日間投与群両方の生存率は、85%および80%まで上昇し、モデル群と比較した場
合、有意差があった(P<0.05)。3日間群の生存率は、65%および75%まで上
昇したが、モデル群と比較した場合に、有意差はなかった(P<0.05)。
れたrhNRG−1βの効果)
されたrhNRG−1βの効果)
連続して3日間、5日間、および7日間の間静脈内注射した30μg/kgのrhNR
G−1βは、すべて、EF/FS値を上昇させ得、5日間および7日間の群についての薬
物投与のEF/FS値(86.8±4.4%/51.9±5.8%/87.0±3.3%
/51.8%±5.1%)は、モデル群のEF/FS値(66.5±5.6/31.8±
3.7)とは有意に異なり(P<0.01)、5日間群および7日間群の両方のLVDは
、有意に減少し(それぞれ、0.090±0.011および0.092±0.012cm
である)、モデル群のLVD(0.133±0.012)とは有意に異なった(P<0.
01);rhNRG−1βは、モデル動物において心筋の病理学的損傷の重篤度を改善し
得、血清トロポニンI(cTnI)レベルを有効に減少させ、5日間群についての薬物投
与のcTnI(1.06±1.32ng/ml)および7日間群についての薬物投与のc
TnI(1.05±1.2ng/ml)は、モデル群のcTnI(23.54±16.9
6ng/ml)よりも有意に低かった(P<0.01);連続して5日間および7日間の
間静脈内注射したrhNRG−1βは、モデル動物の生存率を有意に上昇させ得、これは
、85%に達した。P<0.05。
ルスにより感染したマウスにおいて急性心筋損傷を有効に処置し得ることを実証した。
βの治療効果)
(1.要旨)
(目的) イヌにおいて下大静脈狭窄により引き起こされる鬱血性心不全に対するrh
NRG−1βの治療効果を研究すること。(方法) 約1週間にわたる50%の下大静脈
狭窄の後、EF値が約20%減少したか、または心エコー検査により心拍出量が20%減
少した。このことは、安定な低拍出量の鬱血性心不全動物モデルが確立されたことを示し
た。その後、これらの動物を、各群について6匹のイヌを含む群へとランダムに分割し、
3つの投与量レベルのrhNRG−1β(すなわち、1μg/kg、3μg/kgおよび
10μg/kg)を、連続5日間にわたり毎日静脈内注射した。心機能(心エコー検査)
決定を、この薬物投与後に実施した。モデル動物における種々の血流力学的パラメーター
を、頸静脈カテーテル法および頸動脈カテーテル法をそれぞれ介して分析した。(結果)
連続5日間にわたり投与したこれら3つの投与量レベルのrhNRG−1β(1μg/
kg、3μg/kgおよび10μg/kg)はすべて、モデル動物のEF/FS値および
心拍出量(CO)を上昇させ得た。薬物投与前の値と薬物投与後の値との間およびモデル
群の値の間で、有意な差異が存在した(P<0.05、P<0.01)。1μg/kg、
3μg/kgおよび10μg/kgのrhNRG−1βは、モデル動物における左心室の
dp/dtを有効に上昇させ得た。モデル群の左心室のdp/dtと比較した場合に、有
意な差異(P<0.01)が存在した。上記rhNRG−1βは、モデル動物のLVPm
axを有効に上昇させ得、LVPmin値を減少させ得、このモデル群と比較した場合に
P<0.04であったが、右心室に対する影響は、明らかではなかった。(結論) rh
NRG−1βは、イヌにおいて下大静脈の狭窄により引き起こされる鬱血性心不全を有効
に処置し得た。
イヌにおいて下大静脈の狭窄により引き起こされる鬱血性心不全に対するrhNRG−
1βの治療効果を示すこと。
Zensun(Shanghai)Science & Technology De
velopmentにより提供されるrhNRG−1β。バッチ番号:20011000
6−2;濃度:500μg/アンプル;力価:5000u/アンプル;純度:>95%(
HPLC−C8)。
6.1 (種、供給源および適任証明書):Zhong Shan Hospital
of Fudan Universityにより提供される交配種のイヌ。Exper
iment Department of Fudan Universityにより保
証された適格さである。
6.3 (各群における動物数):各実験群において6匹の動物。
5.1 心エコー検査装置、Hewlett Packard sonos 5500
;プローブの型:S4
5.2 注射用水、Zang Jiang Antus Bioproduct Co
Ltd,10×5ml、バッチ番号:0112180;
5.3 高振動数電気ナイフ、Shanghai Hu Tong electron
ic equipment factory,GD350−D;
5.4 心電図レコーダー、Nihon Kohden ECG−6511;
5.5 モニタリング電極、Ludlow Company of Canada、モ
デル:MT−200;
5.6 生理学レコーダー、Equipment Research Center
of Shanghai Medical University、SMUP−B;
5.7 電気ベンチレーター、Shanghai No.4 Medical Equ
ipment Factory;
5.8 三叉バルーンフローティングカテーテル、Edwards 114F7.
(6.実験方法)
(6.1 実験グループ分け)
偽手術群、モデル群、および試験薬物験群を、設定した。
それぞれ、1μg/kg、3μg/kgおよび10μg/kgの高投与レベル、中投与
レベルおよび低投与レベルのrhNRG−1βを、調製緩衝溶液(ビヒクル)を用いて必
要な濃度まで希釈し、連続5日間にわたり毎日1回静脈内注射した。
(6.3.1 イヌにおける下大静脈動物モデルの狭窄により引き起こされる心不全の
設定)
3%のペントバルビタールナトリウム(30mg/kg)を、イヌを麻酔するために末
梢静脈中に注射し、その後、気管に挿管した。第4肋骨と第5肋骨との間で右胸を経由し
て無菌開胸し、右心耳から3cmにて下大静脈の周囲を測定した。下大静脈の円周の1/
3〜1/2の円周を有する硬いスプール(spool)を選択し、そのスプールと下大静
脈とを#7絹糸で一緒に締め、そのスプールを伸ばし、出血をすべて停止させ、胸を閉じ
た。1週間育てた後、心エコー検査を、腹水の量に従って実施した。EFが約20%減少
した時、または左心の拡張が約20%減少した時、安定な低拍出量のうっ血性心不全動物
モデルが、確立された。その後、上記薬物の静脈内注射を、連続5日間実行した。下大静
脈を狭窄することのない開胸術を、偽手術群について実行した。
動物モデルの確立を同定した後に、動物グループ分けおよび薬物投与レジメンに従って
、実験を実行した。
心機能指標の決定を、手術前、薬物投与の前および薬物投与の5日間後に、そのイヌを
麻酔して実行した。主要な指標としては、以下が挙げられた:
EF(駆出率):心臓の駆出率(すなわち、左室拡張末期容積(EDV)と左室収縮末
期容積(ESV)との間の差異と、左室拡張末期容積との比)であり、これは、心室のポ
ンプ機能を反映する(特に、収縮機能を反映する)ために使用される一般的指標である;
FS:心室内径短縮率(これは、心室の収縮機能を反映する指標である)
CO:心拍出量(すなわち、1分間につき心臓により駆出される血液容積)。
7F三叉バルーンフローティングカテーテルを、右頸静脈中に挿入し、右心耳圧、右心
室圧、肺圧および肺動脈楔入圧を、記録した。6F三叉バルーンフローティングカテーテ
ルをまた、左頸動脈中に挿入し、大動脈圧および左心室圧を、以下の主要指標とともに生
理機能レコーダーを用いて記録した:LVPmax、LVPmin、+dp/dt、およ
び−dp/dt。
SPSSソフトウェアを用いて、収集したデータの両側t検定またはノンパラメトリッ
ク検定を、実行した。
(8.1 TIVCCイヌの心機能に対するrhNRG−1βの効果)
(8.1.1 TIVCCイヌの左室EF/FS値に対するrhNRG−1βの効果)
モデル動物における狭窄の前のEFおよびFSの値は、心エコー検査を介して、それぞ
れ、82.3±1.6%および49.2±2.6%であり、手術後に、それぞれ、59.
1±7.3%および29.3±3.9%にまで減少した。狭窄前と狭窄後との間には、有
意な差(P<0.01、P<0.05)が存在した。EFおよびFSの値は、5日間後に
55.5±10.9%および28.5±6.6%のレベルで継続して維持された。このこ
とは、下大静脈の狭窄を介して、鬱血性心不全イヌモデルが確立され、そしてそれが比較
的安定であったことを示した。
上昇した。低投与量レベル群(1μg/kg)のEFおよびFSは、57.7±10.9
および30.6±8.0から、70.4±8.4および39.7±5.7へと増加した。
薬物投与前と薬物投与後との間には有意な差(P<0.05)が存在した。一方、モデル
群と比較した場合には、有意な差(P<0.05)が存在した。さらに、中間投与レベル
群のモデル動物のEF/FS値および高投与レベル群のモデル動物のEF/FS値は、有
意に増加した。そして、薬物投与前および薬物投与後のEF/FS値を、モデル群のEF
/FS値と比較した場合に、有意な差(P<0.01)が存在した。表35は、これらの
結果を示した。
)
*モデル群と比較した場合に、P<0.05;**モデル群と比較した場合に、P<0.
01;(黒三角)薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、P<0.05
(黒三角2つ)薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、P<0.01。
表36は、rhNRG−1βは、モデル動物の心拍出量を有意に増加し得ることを示し
た。1μg/kgのrhNRG−1β群の心拍出量は、2.4±0.5から3.7±0.
8へと増加した。薬物投与前および薬物投与後を比較した場合に、有意な差(P<0.0
5)が存在した。一方、モデル動物と比較した場合にもまた、有意な差(P<0.05)
が存在した。3μg/kg投与量レベル群および10μg/kg投与量レベル群のCO変
化は、なお有意であった(P<0.01)。心拍数変化決定の結果は、rhNRG−1β
が、心拍数に対してそれほど影響を有さないことを示した(詳細は明らかにならなかった
)。
*モデル群と比較した場合に、P<0.05;**モデル群と比較した場合に、P<0.
01;(黒三角)薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、P<0.05
(黒三角2つ)薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、P<0.01。
左室および右室のdp/dtの変化および収縮期末期圧/拡張末期圧の変化を、フロー
ティングカテーテル法技術を用いて決定した。その結果は、1μg/kg、3μg/kg
および10μg/kgのrhNRG−1βが、動物の左室dp/dtを有効に増加し得た
ことを示した。モデル群と比較した場合に、有意な差(P<0.05)が存在した。これ
らの1μg/kg、3μg/kgおよび10μg/kgのrhNRG−1βは、モデル群
と比較した場合(P<0.05)に、LVPmax値を有効に上昇させ、LVPmin値
を減少させた。rhNRG−1βは、左心dp/dt、左室+dp/dtおよび左室末期
圧に対して、それほど効果を有さない。表37および表38は、結果を詳細に示す。
βの効果)
連続5日間にわたって投与した3つの投与量レベル(1μg/kg、3μg/kgおよ
び10μg/kg)すべてのrhNRG−1βは、モデル動物のEF/FS値および心拍
出量(CO)を上昇させ得た。薬物投与前を薬物投与後と比較した場合に、有意な差が存
在した(P<0.005、P<0.01);1μg/kg、3μg/kg、および10μ
g/kgのrhNRG−1βは、左室dp/dtを有効に増加させ得た。モデル群と比較
した場合に、有意な差(P<0.05)が存在した。これらの1μg/kg、3μg/k
g、および10μg/kgのrhNRG−1βは、モデル動物のLVPmaxを有効に上
昇させ得、LVPminを減少させ得る。モデル群と比較した場合に、有意な差異が存在
した(P<0.05)。一方、右室に対しては、それほど影響は存在しなかった。
血性心不全を有効に処置し得ることを示した。
のアカゲザル長期毒性研究)
(要旨)
アカゲザルに対する注射について、7.5g/日、15g/日、75g/日の組換えヒ
トニューレギュリン−1βS177〜Q237の静脈内注射に関する長期毒性実験(使用
した投与量は、マウス薬力学モデルにおける有効投与量に基づき、サルの投与量の2倍、
4倍、20倍に等しい投与量に変換され、イヌの薬力学モデルに基づいて、サルについて
の投与量の4倍、5倍、9倍および45倍と等しい投与量に変換された)。賦形剤をコン
トロールとして使用した。モニタリングを、退薬3週間後に連続して実行した。注射につ
いての組換えヒトニューグレリン−1β S177〜Q237の毒性反応および生物に対
するその重症性を研究して、毒性反応の標的器官および損傷の可逆性を探索し、そして毒
性反応を引き起こさない投与量を決定し、そしてヒトにおいて使用されるべき安全な投与
量についての基準としての投与量を提供した。
の雄および3匹の雌)であった。投与した薬物の体積は、1ml/kg体重であった。体
重を毎週測定し、投与量を、測定した体重に従って調節した。その薬物を、連続3週間の
間、毎日朝に投与した。心電図、血液学的試験、生化学的試験、尿および糞便の試験、な
らびに抗体の決定を、薬物投与前、ならびに薬物投与開始の10日間後および21日間後
に、それぞれ実行した。底(fundus)実験を、22日目および42日目(薬物投与
の第1日目から数えた)にそれぞれ麻酔下で実施し、その後、2/3および1/3の動物
を屠殺し、剖検し、そして病理組織学的に研究した。骨髄スミアを同時に調製した。心エ
コー検査を、剖検の1日前に麻酔下で実施した。
び唾液過多が、薬物投与開始の1週間後に、各薬物摂取群において動物の一部で生じた:
立毛、艶のない柔皮、活性の減少、食欲不振が、薬物投与の2週間後に観察された。軽度
の蒼白、局所的皮膚および脈管の硬化が、薬物注射部位にて発生した。上記の症状および
徴候は、退薬の3週間後に消失したかまたは減少した。異常な発現は、薬物投与期間の間
および退薬後の回復期間の間には、コントロール群の動物において観察されなかった。
前および薬物投与後の自己比較は、この差が有意であったことを示した;しかし、コント
ロールの群の体重と比較した場合、有意な差はなかった)。すべての動物において、薬物
投与前および薬物投与後で体温の有意な変化はなかった。
れなかったが、すべての薬物を摂取した群の理性のある動物において、3週間の薬物投与
で心拍数の有意な減少が起こった。これはおそらく、試験薬物の薬理効果に起因する;さ
らに、心電図のV1リードにおけるR波およびV3リードにおけるS波の相対的に高い電
圧は、おそらく、動物の胸部リードの変動と関連する;病理学的には、心電図、心拍数お
よび他の指標における有意な異常性、ならびに心筋の肥大性の変化は見られなかった。
れ3頭の動物における心内膜液浸出を示し、これらの各々で2〜3mlの漏出液を取り出
すことができた;クモ膜下腔における水頭症を、高用量群の2頭の動物において発見し、
それらの各々から、それぞれ0.5mlおよび3mlの漏出液を取り出した。
が、水頭症を有する場合に見られた。これらのすべては、試験薬物による何らかの影響を
有していた。。
おいて生じる体重の減少は、おそらく、胃腸管における試験薬物の分布および***に起因
する。症状(例えば、蒼白、注射部位での皮膚の硬化、心内膜液浸出および水頭症)、お
よび退薬の3週間後に高用量群の動物の水頭症の完全な回復なしの症状は、アカゲザルに
おける毛細血管の滲出症候群および漏出症候群が、注射用組換えヒトニューレギュリン−
1 βS177−Q237の中用量および高用量によって引き起こされ得ることを実証し
た。さらに、理性のある動物における心拍の減速および高用量群に関する心筋の細胞質に
おける空腔は、すべて試験薬物と関連付けられた。
37の7.5g/日、15g/日、75g/日の毎日の静脈内注射を合計3週間、および
連続的なモニタリングを3週間行った。この結果は、10日間を超える注射用組換えヒト
ニューレギュリン−1 βS177−Q237の連続注射が、理性のある動物における心
拍の減速を引き起こし得たこと;これは、胃腸反応をもたらし得ること;注射用組換えヒ
トニューレギュリン−1 βS177−Q237の連続注射が、中用量群および高用量群
のアカゲザルにおいて軟膜下の心内膜液浸出、水頭症および軽度の鬱血ならびに水腫を引
き起こし、水頭症は、高用量群の動物において退薬の3週間後に完全には回復しなかった
こと;注射部位における肌および脈管の蒼白および硬化が、退薬後に徐々に回復したこと
、を示した。これらの徴候は、考えられる原因が、毛細管の漏出−滲出症候群であること
を実証した。注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237の高用量は
、心筋の細胞質における空腔を引き起こし得た;抗体試験はネガティブな結果を示した。
3週間の薬物投与および3週間の回復期間中に、心内膜液浸出および水頭症を引き起こさ
なかった投薬レベルは、7.5g/kg/日であった。
注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237の毒性反応およびそれ
らの生物体に対する重篤度を研究すること、毒性反応の標的器官および損傷の可逆性を調
査すること、毒性反応を引き起こさない用量を決定すること、ヒトにおいて使用されるべ
き安全な用量のための参考としての用量を供給すること。
2.1 薬物の名称:注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237
。
Technology Development Company Ltd,住所:C
棟2階、328 Bi Bo Road、Zhang Jiang High Tech
Zoon。
。
3.1 動物種:アカゲザル。
ty、Anhui Province、適格性の認可:Wan Fa Xun Fan
第2002−6号。
Shi Ling Science & Technology Company L
tdによって提供された)を与えた。動物に、約100gの果物に加えて、100gの飼
料を1日2回与えた。室温を20℃〜25℃に保ち、相対湿度を50%〜70%、毎日1
2時間の照明を保った。
4.1 投薬準備:
コントロール群:0μg/kg/日(賦形剤と同じ容積を注射した);
低用量群:7.5μg/kg/日(サルの等価用量の2倍に相当する);
中用量群:15μg/kg/日(サルの等価用量の4倍に相当する);
高用量群:75μg/kg/日(サルの等価用量の20倍に相当する)。
注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237のための表示されてい
た効能は、心不全の治療についてであった。マウスの薬力学的モデルは、前心臓性コクサ
ッキーB3ウイルスにより誘導した心筋炎モデルであり、使用された用量は、7.5μg
/kg/日、15μg/kg/日、および30μg/kg/日(サルについて使用される
1.875μg/kg/日、3.75μg/kg/日、および7.5μg/kg/日に相
当する)であり、連続5日間静脈内に注射し、病理学的スコアは、それぞれ、1.5、0
.7、0.56であった(病理学的採点法についての基準は:スコア0:病変の領域=0
%、スコア1:病変の領域=25%、スコア2:病変の領域=50%、スコア3:病変の
領域=100%)。従って、15μg/kg/日および30μg/kg/日の用量は、心
臓に対する損傷を有意に減少し得た。薬物投与の指定経路は、1日1回で連続3〜5日間
の静脈内注射であった。注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237
の静脈内注射における急性毒性実験のMTDは、35mg/kgであった。有意に有効な
用量としてサルについての等価用量の3.75μg/kg/日を取ると、動物についての
長期毒性用量は、暫定的には、動物の有効用量の2倍、4倍、および20倍に定められる
。
1日1回を連続3週間。
3週間。
1.0ml/kg体重。
臨床的に使用される静脈内注射と同様の、ゆっくりした静脈内注射。
アルベンダゾールを使用して、腸の寄生虫を殺し、そして実験動物を購入する前にツベ
ルクリン試験を実施し、次いで、環境適応試験;血液試験、生化学試験、尿試験および心
電図検査を2回実施して、実験動物が健康な状態であることを保証した。動物の体重およ
び性別に基づいて、各々の群に6頭の動物、オス半数およびメス半数を含む、4つの群に
分類した。投与した薬物の容積は、1.0ml/kg体重であり、体重は、各々の薬物投
与の前に毎週測定し、そして投与すべき薬物の容積は、測定した体重に従って調整し、各
々の群における2/3および1/3の動物(それぞれ2頭のメスザルおよび1頭のオスザ
ル)を、3週間の薬物投与の24時間後に殺し、そして回復期間の3週間後の終わりに、
検死を実施し、器官を秤量し、器官係数を計算し、そして病理組織検査を行った。血液を
血液検査および生化学検査のために抜き取り、そして骨髄塗抹標本を薬物投与の10日目
および検死の前に実施した。
9.1.1 血液試験のための試薬。
Na2CO3 0.159g。
HPO4・12H2O 3.68g。
M PBS。
の製品。
Science & Technology Company Ltdによって提供され
た。
装の輸入原材料、Shanghai Huamei Bioengineering C
ompanyによって提供された。
al Reagent Co Ltd。
Roche 血液検査血球計数器。
を使用)。
血液試験の方法
コーティング抗原:注射用組換えヒトニューレギュリン−1 βS177−Q237を
、コーティング緩衝溶液で6μg/mlに希釈し、96穴の酵素標識プレート中に100
μl/穴で添加した、37℃1時間。
:100。
100μl/穴、37℃1時間。
抗サル免疫グロブリンを添加する、100μl/穴、37℃1時間。
、37℃10分間。
ブコントロールのOD値よりも2.1倍大きかった(血清は、1:100希釈した)。
10.1 死亡状態:
モニタリングを、1日1回または2回行い、そして任意の動物の死亡があった場合に、
動物の死亡時間を記録する。
全体的な外観、兆候、行動活動、ケージ表面に付着した血液または滲出液、毛皮の艶が
挙げられる。観察は、1日1回または2回行った。
体重を、1日1回薬物投与の前に測定した。
体温を、薬物投与の1日目、3日目および5日目に、薬物投与の前および薬物投与の1
時間後に計った。
100gの果物と共に、顆粒飼料200gを毎日各々のサルに与え、1日当たりの動物
1頭当たりの食物の消費を算出する。
薬物投与の前、および、また薬物投与開始10日後、薬物投与終了時ならびに回復期間
の間に、2回の心電計検査を行い、それぞれP−R値、QRS値、QT値およびST値を
、計算した。
薬物投与の終了後および回復期間の最後かつ死体解剖の1日前に、死体解剖する計画の
動物を3%ペントバルビタール(30mg/kg)の静脈注射で麻酔し、次いで、エコー
心臓検査を行って、心室内厚(IVS)、左心室後壁(PW)、左心室拡張終期容量(L
VDd)、左心室収縮末期容量(LVDs)、駆出画分(EF)、短縮画分(short
ening fraction)(Fs)、僧帽弁血流ピーク値(MV)、大動脈弁血流
ピーク値(AV)および心拍(HR)を決定する。
薬物投与前、薬物投与開始10日後、薬物投与終了時、および3週間の回復期間の最後
(死体解剖前)、0.5mlの血液を、伏在静脈から2回採血し、これを、抗凝血のため
に3.8% EDTAで処理し、以下の指数について検査した:赤血球数(RBC)、網
赤血球数(Ret)、ヘモグロビン(Hb)、白血球数(WBC)、ならびに以下:好中
球(N)、好酸球(E)、リンパ球(L)および単球(M)、を含む分化項目、血小板数
(PLT)、凝固時間(CT),ヘマトクリット(Ht)、平均血球容積(MCV)、平
均ヘモグロビン濃度(MCH)、および平均赤血球ヘモグロビン濃度(MCHC)。
薬物投与前、薬物投与開始10日後、薬物投与終了時、および3週間の回復期間の最後
(死体解剖前)、5mlの血液を、伏在静脈から2回採血し、遠心分離後血清を分離し、
そして以下の項目を試験した:アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アルカリホスファターゼ(ALP)、乳酸
デヒドロゲナーゼ(LDH)、クレアチンホスホキナーゼ(CPK)、血中尿素窒素(B
UN)、総タンパク質(TP)、アルブミン(ALB)、グルコース(GLU)、血清総
ビリルビン(T−Bil)、クレアチニン(CRE)、総コレステロール(T−CHO)
、ナトリウム(Na+)、カリウム(K+)、塩素(Cl−)、カルシウム(Ca++)
、マグネシウム(Mg++)、およびリン(P+++)。
薬物投与前、薬物投与開始10日後、薬物投与終了時、および3週間の回復期間の最後
(死体解剖前)、尿サンプルを収集し、白血球数、亜硝酸塩、pH値、尿タンパク、グル
コース、ケトン体、ウロビリノゲン、尿ビリルビンおよびヘモグロビンについて試験した
。
糞便寄生虫卵および潜血を、薬物投与前に試験した。また、糞便潜血試験を、薬物投与
開始10日後、薬物投与終了時、および3週間の回復期間の最後にも行った。
眼底検査を、死体解剖前に、麻酔下で行った。
各群における2/3および1/3の動物(各2匹の雌および1匹の雄)を、薬物投与3
週間後の24時間および薬物投与終了後の回復期間の最後に屠殺し、死体解剖を行った。
心臓、脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、副腎、胸腺、リンパ節、甲状腺、精巣もしくは子宮
、卵巣または前立腺を採取し、その重量を測定し、そして係数を計算した。
以下の器官の病理組織学試験を行った:心臓(左心室の前壁、右心室、横隔膜、左心房
、右心房)、肝臓、脾臓、肺、脳、胃、十二指腸、回腸、結腸、腎臓、膀胱、副腎、下垂
体、甲状腺、胸腺、膵臓、精巣、前立腺、卵巣、子宮、リンパ節(頚部、腸間膜)、血管
および注射した部位の皮下組織。
大腿骨からの骨髄サンプルを、死体解剖前に麻酔下で採取し、塗抹標本を作製し、染色
し、光学顕微鏡検査を行って、巨核球(magakaryocyte)系、顆粒球および
赤血球系、リンパ球、形質細胞、および他の型の細胞を調べた。4つの四分区間および中
央部において5×100個の有核細胞を計数し、GE比を計算し、写真撮影した。
Q237:
薬物投与開始1週間後、2週間後および3週間後、ならびに回復期間の最後に、注射抗
体のための血清組換えヒトニューレギュリン−1βS177−Q237を検出し、そして
抗体を検出し、検出した抗体が中和抗体であった場合にいつでも薬物投与を停止した。
種々の用量群およびコントロール群から収集したデータについての統計学的検定として
、分散分析を行った。
11.1 死亡状態:
実験期間中、試験薬物に関連する動物死は起こらなかった。3週間の薬物投与の最後に
、コントロール群および低用量群(5番および6番)の各1匹の動物の心拍の有意な減速
(20〜30拍/分)が、3週間の回復期間の最後に麻酔下のエコー心臓検査を通して見
られた;これは、過剰麻酔の徴候であり、従って、死体解剖を計画したより1日早く行っ
た。
薬物投与の2日目に、静脈注射の30分後、高用量群の1匹の雄サルにおいて嘔吐が起
こった。薬物投与の2日目〜7日目の間、中用量群および高用量群における各1匹の動物
が、静脈注射の20〜30分後に嘔吐した。投与一週間後に全ての群の一部の動物に流涎
が起こり、その出現頻度は、高用量群において、他の薬物摂取群よりも有意に高かった;
低用量群中1匹の動物だけが、薬物投与の9日目に流涎を示した。薬物投与の2週間後、
高用量群において、起毛、毛皮のつやの消失、活動性の低下、食欲不振が現れた。軽度の
蒼白、注射部位の局所的皮膚および血管の硬化が、薬物投与の3日目から始まり、これは
進行的に亢進し、そして用量依存的であった。上述の症状および徴候は、薬物中止後の3
週間の回復期間に消失するかまたは改善された。不規則な淡黄色の下痢便が、高用量群の
21番の動物において起こった。コントロール群の動物において、薬物投与の間および薬
物中止後の回復期間の間、異常な徴候は現れなかった。
コントロール群の動物と種々の薬物摂取群の動物との間で、有意の体重の相違は見られ
なかった(P>0.05);動物における薬物投与前および後の自己比較は、高用量群の
動物において、有意な体重減少を示した(P<0.01)。
薬物投与の1日目、3日目、および5日目において、薬物投与前および薬物投与1時間
後に測定した体温に、有意な相違は見られなかった。
中用量群および高用量群の動物において、薬物投与1週間後、飼料の有意な残留、およ
び飼料の50g〜150gの種々の摂取量が見られた。コントロール群および低用量群の
動物において、飼料の残留は見られず、そして回復期間の全ての動物において飼料の残留
は起こらなかった。
薬物投与の10日目に、全ての薬物摂取群の意識のある全ての動物において、有意の心
拍の減速は見られず(コントロール群の心拍と比較したときP>0.05)、そして全て
の薬物摂取群の意識のある動物において、有意の心拍の減速が起こった(コントロール群
の心拍と比較したときP<0.05、P<0.01);同時に、P−R、QRSおよびQ
Tの間隔を、低用量群および中用量群においてより顕著にするために延長したところ、薬
物中止3週間後、正常に戻った。中用量群および高用量群の動物におけるRv1の電圧は
より高く、一方、高用量群、低用量群および中用量群におけるSv1はより深く、各薬物
摂取群におけるRv3の電圧は、より高かった(P<0.05;P<0.01およびP<
0.001)。異なった時間に収集した他の独立したパラメータにおいて軽度のゆらぎが
あったが、全て正常範囲内であった。
薬物投与3週間目および3週間の回復期間の最後に、コントロール群および種々の薬物
摂取群において、エコー心臓検査のパラメータにおいて、有意の相違は見られなかった(
P<0.05)。
全実験期間の間、独立したパラメータの正常範囲内のゆらぎに加えて、有意な異常変化
は見られなかった。
全実験期間の間、独立したパラメータの正常範囲内のゆらぎに加えて、有意な異常変化
は見られなかった。
全ての薬物摂取群およびコントロール群における動物個体の尿検査において、尿タンパ
クの増加、陽性ケトン体(しかし、不規則である)が、薬物投与前、薬物投与開始10日
後および薬物投与開始3週間後、3週間の回復期間(死体解剖前)に見られた。コントロ
ール群および全ての薬物摂取群の動物個体において、尿中の赤血球の過渡的な増加が見ら
れた。他の有意な異常は見られなかった。
薬物投与前、薬物投与開始10日後、薬物投与開始3週間後、および3週間の回復期間
(死体解剖前)に、全ての動物において、糞便潜血検査陰性が見られ、糞便寄生虫卵は見
られなかった。
薬物投与3週間目および3週間の回復期間(死体解剖前)に行った眼底検査において、
異常は見られなかった。
中用量群中の2番雄サルならびに23番および24番の雌サルにおいて、心嚢における
少量の浸出を発見し、薬物投与3週間目に、各動物から明淡黄色の液体を2〜3ml採取
した;くも膜下領域における水頭(hydrorcephalus)が、高用量群の1番
および21番の動物において見られ、各動物から明淡黄色の液体を1〜2ml採取した;
21番動物において、心嚢における少量の浸出、結腸粘膜の表面上に出血箇所があり、こ
れは、潰瘍の病巣を有する21番動物と一緒であった。高用量群の22番雄サルにおいて
、肺葉における鬱血および出血性病変が見られた。コントロール群の8番サルは、過剰麻
酔のために死体解剖前に死亡し、死体解剖の間、肺に有意な鬱血およびまだら状の出血が
見られたが、他の有意な異常は見られなかった。
および1匹の雌の動物(10番;14番)において見られ、これらからそれぞれ液体を0
.5mlおよび3ml採取した;過剰麻酔し早めに死体解剖した動物において、有意の異
常は見られなかった。
主要器官の重さを測定し、そして死体解剖の間、全ての動物の器官係数を計算した。試
験薬物と何かするような器官重量に異常な変化は、見られなかった。
淡く染まった液胞が、「+」または「+〜++」の重篤度を有する高用量群の1番、1
1番の雄サルおよび21番雌サルにおいて、心房および心室の心筋の細胞質中に現れ、筋
状構造は維持された;心内膜および心膜の有意の異常のない、拡散小胞様変性があった。
他方、血管鬱血および中程度の水腫が、11番および21番のサルにおいて、くも膜下(
subarchnoid)領域において見られた;死体解剖前に死んだ8番動物の死体解
剖の間、21番動物の結腸粘膜の一部に、炎症細胞浸潤があった;肺胞(avleola
)中隔、鬱血、肺のまだら状出血、肺胞(avleola)の一部における浮腫液の充満
、腎臓、胃、結腸、腸および膵臓における部分的組織自己細胞溶解が見られた。他の異常
は見られなかった。
管収縮が見られた。過剰麻酔によって早めに死体解剖した動物において、有意な異常は、
発見されなかった。全ての薬物投与群において、注射部位内の血管における出血性変化に
加えて、刺激に対する有意な応答は見られなかった。散発性の偶然の病変(例えば、肺お
よび胃腸管における炎症反応)は、残りの動物において見られたが、それらのほとんどは
自然発生の病変であった。
3週間の薬物投与および回復期の第3週目における麻酔下での剖検の前に、骨髄を右寛
骨から吸引し、塗抹作製、染色し、巨核球系、顆粒球系、赤血球系、リンパ球およびプラ
ズマ細胞ならびに他の型の細胞を、光学顕微鏡下で試験した。四分円および中央部分の5
×100の有核細胞を計数し、分化の計数を行い、GE比を計算し、顕微鏡写真術を実施
した。
常な比で、正常な増殖が観察された。異常な病的な細胞および骨髄毒性による病的な障害
は起こらなかった。
7−Q237の結果)
全ての薬物摂取群における注射抗体検出についての全ての血清組換えヒトニューレギュ
リン−1βS177−Q237は、薬物投与の開始の1、2、3週間後および回復期の3
週目の終わりでは、ネガティブな結果を示した。
アカゲザルへの注射のための7.5、15、75g/dの組換えヒトニューレギュリン
−1βS177−Q237の静脈内注射(使用した用量は、サルに対する用量の2、4、
20倍と等量であった);賦形剤をコントロールとして使用した;薬物中止の後3週間、
モニタリングを実施した。
薬物試験群の動物の一部で、嘔吐、吐き気および唾液分泌が生じた;薬物投与の2週間後
、高用量群の動物で、毛髪の直立、つやのない毛皮、活性の低下、摂食障害が観察された
;軽い蒼白、薬物注射の部位の局所的な皮膚および血管の硬化;前に述べた症状および徴
候は、薬物中止の3週間後で消えたかまたは低減した。薬物投与の期間および薬物中止後
の回復期の間、コントロール群の動物では、異常な徴候は、観察されなかった。
著に低くなった。薬物投与の前後で、全ての動物の体温の顕著な変化はなかった。
かった。
は観察されなかったのに対して、毎日の薬物摂取群の意識のある動物での3週の薬物投与
で、心拍数の有意な減少が生じたが、これはおそらく試験薬物の薬理学的な効果のためで
あり;さらに、心エコー図のV1およびV3誘導における比較的高い電圧のR波およびS
波は、おそらく動物の胸部誘導の変化と関連する。心エコー図、心拍数および他の指標に
おいて有意な異常は検出されず;心筋の肥大性変化は、病理学的には観察されなかった。
量群で)心外膜液を示し、2〜3mlの濾出液を取り除き得;高投薬群の2匹の動物で、
クモ膜下腔において水頭を発見し、1〜3mlの濾出液を取り除いた。
頭で観察された。これら全ては、試験薬物となんらかの関係を有した。
く、胃腸管での試験薬物の分布および排出のために、高用量群での体重の減少につながり
得た。症状(例えば、蒼白、注射部位での皮膚の硬化、心外膜液および水頭症が観察され
、薬物中止3週間後の高投薬群動物では、水頭症の完全な回復はなく、中用量および高用
量の組換えヒトニューレギュリン−1βS177−Q237の注射群で、アカゲザルにお
いて毛細血管浸出物および漏出液症候群が起こり得ることを示した。さらに、意識のある
動物における心拍数の減速および高用量群動物の心筋の細胞質中の小胞は、全て試験薬物
と関連していた。
トニューレギュリン−1βS177−Q237の毎日の静脈内注射および3週間の継続的
なモニタリングを実施した。結果は、注射のための組換えヒトニューレギュリン−1βS
177−Q237の10日間より長い継続的な注射が、意識のある動物において心拍数の
減速を引き起こし得ることを示した;それは、中用量群および高用量群のアカゲザルで、
胃腸の反応につながり得、心外膜液を引き起こし、水頭症および軽いうっ血および軟膜下
での水腫を引き起こし、水頭症は、高用量群の動物では、薬物中止の3週間後では完全に
は回復せず;注射した部位の皮膚および血管の蒼白および硬化は、薬物の中止後、次第に
回復した。これらの徴候は、毛細血管濾出液浸出症候群が潜在的な原因であることを示し
た。高用量の組換えヒトニューレギュリン−1βS177−Q237の注射は、心筋の細
胞質に小胞を生じ得;全ての抗体試験がネガティブな結果を示した。3週間の薬物投与お
よび3週間の回復期の間に、心外膜液および水頭症を引き起こさなかった用量レベルは、
7.5g/kg/dであった。
のELISA試験)
(1.実験の原理)
HER2/neu遺伝子は、膜貫通タンパク質p185をコードし、これはチロシンプ
ロテインキナーゼである。ニューレギュリン−1のErbB3またはErbB4との結合
は、ヘテロ二量体ErbB3−ErbB2およびErbB4−ErbB2形成を誘導し、
HER2によりコードされるチロシンプロテインキナーゼ(ニューレギュリン−1の機能
性シグナルの伝達を仲介する)を活性化する。ニューレギュリン−1のそのレセプターと
の結合がErbB2タンパク質のリン酸化を引き起こすという事実に基いて、本発明者ら
は、組換えニューレギュリン−1の生物学的活性をインビトロで定量的に決定するための
、迅速で、感度が良く、高流量の方法を確立する。
2.1 96穴細胞培養プレート(Corning社);Costar 96穴ELI
SA検出プレート
2.2 U.S.ATCCから導入したヒト乳癌細胞株を、37℃で、50% CO2
下で、基本培養培地で培養した。
O2、0.1g/L グルタミンおよび5.5g/LのHEPESを添加した。
10% ウシ胎仔血清およびインスリン9mg/Lを含むDMEM培地を4℃で保存し
た。
Ca2+およびMg2+を含まないPBSで調製した。
メインH4モノクローナル抗体を選択する。
アーゼモノクローナル抗体(抗P−tyr−HRP)
2.9 基質、基質緩衝溶液
基質(TMB):2mg/ml TMB(無水アルコールで調製)
基質緩衝液:0.2M クエン酸+0.1M Na2HPO4(pH5.0)。
合調製)。
150mM NaCl+50mM Hepes+1% Triton−X 100+2
mM(オルトバナジン酸ナトリウム)+0.01%(チメロサール(thimeroso
l))。一錠の混合プロテアーゼインヒビター(錠剤、プロテアーゼインヒビターの反応
混液(Tabletten、Proteasen−Inhibitoren−Cockt
ail))を、作業の前に各25mlに添加する。
プロセス3.1を、第1日目に実施し、第2日目にプロセス3.2〜3.3を実施し、
第3日目にプロセス3.4〜3.12を実施した;ここで、3.1および3.2のプロセ
スは、滅菌条件下で実施すべきである。
MCF−7細胞を所定量まで増殖させ、滅菌PBS溶液で洗浄し、次いで0.25%ト
リプシナーゼで消化した。計数後、細胞の濃度を基本培養培地で調節した。細胞を96穴
細胞培養プレート(5×104/穴、100μl/穴)に添加し、37℃で5%CO2下
で培養箱中で一晩培養した。
96穴プレート中の全ての培養培地を吸引し、各穴を37℃に加温したPBSで洗浄し
、次いで100μlのDMEM培養培地(ウシ血清を含まず、インシュリンを含まない)
を添加した。細胞を、37℃で5%CO2下で培養箱中で24時間培養した。
抗ErbB2細胞外機能性ドメインH4抗体を、コーティング緩衝溶液で6μg/ml
になるまで希釈し、次いで、穴あたり50μlを96穴ELISAプレートに添加し、4
℃下で一晩(16〜18時間)置く。
コントロール溶液および試験を求められるサンプルを、DMEM培養培地(ウシ血清を
含まず、インシュリンを含まない)でそれぞれ2μg/mlまで希釈し、次いで3倍の勾
配希釈を再度行い、全部で9希釈を有する。
飢餓後96穴細胞培養培地を吸引し、標準物質および試験を求められるサンプルを、穴
あたり100μl添加し、各濃度2連の穴を準備する。同時にネガティブコントロール(
すなわち、DMEM培養培地プラセボコントロール)を準備する。37℃下で20分間反
応させた。
サンプルを迅速に吸引し、PBSで一回洗浄し、100μlの断片化溶液を各穴に添加
し、4℃の冷蔵庫で30分間断片化した。足場性依存性細胞が全て落ちるまで、氷浴条件
下で水平に攪拌し、4℃で15,000rpmで15分間遠心する。
プレートを5分間洗浄する。5%脱脂粉乳を洗浄溶液で調製し、プレートの各穴に20
0μl添加し、37℃下に2時間置く。
密閉ELISAプレートを3回洗浄した後、標準細胞断片化溶液および試験サンプル断
片化溶液を穴あたり90μl添加し、同時にネガティブコントロールを準備し、37℃下
に1時間置く。
プレートを5回洗浄し、HRP酵素結合マウス抗リン酸化チロシンタンパク質抗体を1
:500ローション(手引書を使用して産物および使用する時間によって決定した)で希
釈し、プレートの各穴に100μl添加する。37℃下に1時間置く。
プレートを5回洗浄し、調製した基質作業溶液を穴あたり100μlで添加し、37℃
下に10分間置いた。
反応を停止するために、2N H2SO4を穴あたり50μlで添加した。
ELISA読み取り装置による比色分析は、450nmの波長、655の参照波長で決
定する。結果を記録する。
組換えヒトニューレギュリン−1の濃度対OD値を用いた作図および分析を、線形回帰
方法を使用して行い、試験を求められる各サンプルの半有効量を計算した。
1.DMEM基本培養培地
ウシ胎仔血清 100ml
インシュリン 9.2mg
を1LのDMEM培養培地に添加し、よく混合する。
NaCl 4.38g
HEPES 5.96g
オルトバナジン酸ナトリウム 0.368g
チメロサール(thimerosol) 0.05g
Triton−X 100 5mL
500mLのH2Oに溶解する。
NaHCO3 0.293g
Na2CO3 0.159g
100mLのH2Oに溶解する。
クエン酸 1.02g
Na2HPO4・12H2O 3.68g
H2Oに溶解する。
脱脂粉乳粉末 5g
100mLの0.01MPBS(pH7.4)に溶解する。
Na2HPO4・12H2O 2.9014g
NaH2PO4・4H2O 0.2964g
NaCl 8.5g
1000mLのH2Oに溶解する。
1mlのTween20を、2000MLの0.01M PBS中に添加し、よく混合
する。
TMB 20mg
10mLの無水アルコールに溶解する。
9.20×PBS(1000ML)
Na2HPO4・12H2O 58g
NaH2PO4・4H2O 5.9g
NaCl 170g
1000mLのH2Oに溶解する。
い。上記の実施例に対して多くの変化が可能である。上記の実施例に対する改変および変
化は、当業者には明らかであるので、本発明は、添付した特許請求の範囲の範囲によって
のみ制限されることが意図される。
Claims (26)
- 哺乳動物における心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための薬学的組成物であって、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを含み、前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを3,600U/kg以下の総レジメンで、21日以下の間投与され、前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを(a)前記哺乳動物の体重に対して1μg/kgから40μg/kg、
(b)前記哺乳動物の体重に対して10U/kgから400U/kg、または(c)前記哺乳動物の体重に対して0.14nmol/kgから5.6nmol/kgの投与量で、1日1回、21日以下の間投与されるように調製される、薬学的組成物。 - 前記心筋梗塞による心不全がヒトにおけるものである、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを1日当たり170U/kg以下の安全用量で投与される、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、ErbB2−ErbB4レセプターとの結合を通じて、その抗心筋梗塞活性を発揮する、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質が、ニューレギュリン1、ニューレギュリン2、ニューレギュリン3、およびニューレギュリン4からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、ヒトニューレギュリンβ2異性体のEGF様ドメインを含む、請求項1〜4のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質がニューレギュリンα2またはニューレギュリンβ2である、請求項1〜4のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質の機能的フラグメントが、配列番号4に示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ2フラグメントである、請求項1〜4のいずれかに記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、心筋梗塞に関連する左心室拡張終末期径(LVEDD)および左心室収縮終末期径(LVESD)の増加に拮抗する、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、心筋梗塞に関連する左心室EFの減少に拮抗する、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記心筋梗塞が、左心室拡大、減少した収縮機能および増加した充填圧からなる群から選択される臨床的特徴を有する、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に投与される、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための有効量の予防剤もしくは治療剤を含む、請求項1に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントが、前記予防剤または治療剤の投与の前、同時、またはその後に投与される、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、アンギオテンシンI−変換酵素インヒビター(ACEI)、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、アスピリン、アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミン、および血栓溶解剤からなる群より選択される、請求項13に記載の薬学的組成物。
- 前記ACEIが、カプトプリル、ラムプリル、リシノプリル、ゾフェノプリル、およびトランドラプリルからなる群より選択される、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記カルシウムアンタゴニストがジルチアゼムまたはアムロジピンである、請求項15に記載の薬学的組成物。
- β−レセプターアンタゴニストがカルベジロール、プロパノールオール、メトプロロール、アテノールオール、およびチモールオールからなる群より選択される、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記血栓溶解剤が、ストレプトキナーゼ、t−PA、およびアニストレプラーゼからなる群より選択される、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、アスピリンである、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、アトロピンである、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、ニトログリセリンである、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、スコポラミンである、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記予防剤または治療剤が、血栓溶解剤である、請求項15に記載の薬学的組成物。
- 前記ニューレギュリンタンパク質が、静脈内投与される、請求項1に記載の薬学的組成物。
- キットであって、容器中の請求項1〜25のいずれかに記載の薬学的組成物、および薬学的組成物を用いて心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための指示書を備える、キット。
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