JP6603149B2 - 心血管疾患を処置するためのニューレギュリン法および組成物 - Google Patents

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Description

本願は、ＰＣＴ／ＣＮ０２／００３４９（２００２年５月２４日出願）、ＰＣＴ／ＣＮ
０２／００６６４（２００２年９月１８日出願）、中国特許出願第０２１４５１４５．１
号（２００２年１１月８日出願）、および中国特許出願第０３１０９９７６．９号（２０
０３年４月９日出願）に関連する。上記出願の開示は、その全体が本明細書中に参考とし
て援用されている。
（技術分野）
本発明は、哺乳動物（特に、ヒト）における種々の心血管疾患または障害を予防、処置
、または遅延するための組成物および方法に関する。より詳細には、本発明は、とりわけ
、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュ
リンの産生および／もしくは機能を増強する薬剤を用いて、種々の心血管疾患または障害
を予防、処置、または遅延するための組成物および方法を提供する。
（背景技術）
ウイルス性心筋炎は、間質性心筋層における局所性または散在性の炎症の滲出および心
筋線維の分解、壊死、または溶解を誘導する種々のウイルスにより引き起こされるかまた
はそれらに関連する心筋の炎症である。ウイルス性心筋炎は、心外膜炎または心内膜炎に
より併発され得る。ウイルス性心筋炎の結果は、心筋の損傷、心臓の機能不全、不整脈、
および全身性症候群を誘導する。ウイルス性心筋炎は、全ての年齢で起こる。近年、ウイ
ルス性心筋炎の発生率が増加している。急性ウイルス性心筋炎の後遺症としては、不整脈
、心不全、心臓ショックが、および突然死さえも挙げられる。この疾患は、心臓肥大およ
び永久心筋損傷により長期化され得る。心筋症は、最終的には、免疫反応から生じる。ウ
イルス性心筋炎の処置としては、抗生物質、心臓保護剤、抗酸化剤（例えば、高用量のビ
タミンＣ、ビタミンＥ、コエンザイムＱ１０）、心筋用栄養剤（例えば、心筋に十分な栄
養を提供するエネルギーの組み合わせ）が挙げられる。これらの測定は、心臓の機能を改
善するため、心臓の損傷を修復するため、および心不全を予防するために適用されるが、
その効果は理想的ではない（特に、心筋炎における構造的および機能的変化について）。
これらの病的変化に対して信頼できる治療法は存在しない。
拡張型（うっ血性）心筋症（ＤＣＭ）は、起源の同定されていない種々の心筋疾患の最
終的な結果である。その病理的変化は、非リウマチ性、非高血圧性であり、冠動脈心臓疾
患に起因しない。拡張型心筋症の主要な臨床的特徴は、心室肥大、心筋ポンプ機能不全、
またはうっ血性心不全である。核およびオルガネラの肥大は、一般的に、拡張型心筋症の
穏やかな心筋の損傷において見られる。構造的変化、細胞死、および結果として起こる線
維症は、通常、重篤な損傷において見られる。ＤＣＭの病因論および病原論は、はっきり
している。ＤＣＭの予後は、効果的な治療法がないため、非常に乏しい。このような患者
のほとんどは、徐々に悪化する心不全により死亡する。突然死が、不整脈から起こり得る
。現在、ＤＣＭに対して特に効果的な治療法は存在しない。ＤＣＭの慣用的な処置として
は、心臓強壮剤、利尿剤、ＡＣＥＩ、および他の薬物の投与が挙げられる。さらに、第三
世代のカルシウムアンタゴニストであるアムロジピンおよび第三世代のβ−レセプターア
ンタゴニスト（例えば、カルベジルオール）はまた、ＤＣＭを処置するために使用される
。甲状腺ホルモンおよび成長ホルモンの効果については議論の余地がある。なぜならば、
無作為化された二重盲目臨床試験の証拠が利用可能でないからである。左心室の容積減少
手術は、左心室の内部直径を減少させ、心臓機能を一時的に改善し得る。しかし、手術後
の心不全および不整脈に関連する死亡率がより高くなることが、この方法の適用を妨げて
いる。動的骨格筋ポンプ（ｄｙｎａｍｉｃ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｌａｓｔｙ）は、心臓機
能を改善するのに有用であるが、患者は、比較的広い外傷に耐え得ることができない。従
って、この手術は、心臓移植の代替としてのみ使用される。手術の中で、心臓移植は急進
的なＤＣＭ処置である。しかし、ドナーの心臓がないこと、費用が高いこと、術後感染、
および移植片拒絶が、主な障害である。従って、臨床実務において、新規のＤＣＭ治療が
緊急に必要とされている。
ドキソルビシンまたはアドリアマイシン（ＡＤＭ）は、広範なスペクトルおよび強い抗
腫瘍活性を有するアントラサイクリン抗癌剤に属する。臨床実務においては、種々の悪性
腫瘍（例えば、肺癌、乳癌、膀胱癌、精巣癌、甲状腺癌、柔組織癌、骨肉腫、神経芽腫、
急性白血病、悪性リンパ腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、および頚部癌）を処置するために広
く使用されている。ＡＤＭは、ＤＮＡとの結合を通じて、ＤＮＡ合成を阻害するよう作用
する。その阻害効果は、Ｓ期、Ｍ期、Ｇ１期、およびＧ２期に観察されるが、その活性は
、Ｓ期で最も活性である。乳癌患者に対する単独時間（ｕｎｉｔ ｔｉｍｅ）において、
転移性化学療法であろうと術後化学療法であろうと、化学療法剤が高用量であるほど、よ
り良好な臨床的効果およびより長期の生存性をもたらすことが発見された。他の研究は、
より高い用量および用量能の重要性、ならびに用量、用量能、および効果の間の関連性を
確認した。
しかし、ＡＤＭの適用は、その毒性の副作用により制限されている。ＡＤＭの毒性とし
ては、骨髄の沈下が挙げられる。約６０〜８０％の患者において、白血球数および血小板
数は、投与１０〜１５日後に最低レベルに低下し、そして２１日後に正常レベルに回復す
る。主要な消化管反応は、吐き気、嘔吐、食欲不振、胃炎、および潰瘍および口内炎でさ
えある。脱毛もまた、その効果は退薬後に反転し得るが、ＡＤＭ処置したほぼ全ての患者
で起こる。
より重要なことは、より高用量のＡＤＭおよび他のアントラサイクリン剤の臨床適用を
妨げる主要要因が、心臓毒性であることである。ＡＤＭの心臓毒性は、酸素由来のフリー
ラジカルの産生から生じ得る。ＡＤＭ中のセミキノン基は、酸化還元反応を誘導し得、こ
れは、増強された脂質過酸化を誘導し、細胞損傷に寄与する。フリーラジカルは、細胞膜
およびオルガネラ膜を損傷し、そして膜タンパク質の機能および酵素活性を改変する。こ
れらの変化は、細胞内カルシウムの過剰蓄積（ｏｖｅｒｌｏａｄ）、ＤＮＡおよびタンパ
ク質合成の阻害、ならびにエネルギー代謝障害を誘導し得、必然的に、心臓の収縮弛緩プ
ロセスを妨げる。
心臓毒性は、ＡＤＭが身体内に蓄積された場合に起こる。なぜならば、ＡＤＭは、他の
組織よりも心臓組織により高い親和性を有するからである。従って、心臓は、ＡＤＭの毒
性効果に対してより脆弱である。心臓毒性は、急性または慢性であり得る。急性心臓毒性
の臨床的特長としては、心臓機能の変化（例えば、洞頻拍、不整脈、伝導ブロック、およ
びＳＴ−Ｔセグメントの変質など）が挙げられる。種々の不整脈は、ＡＤＭ治療の早期段
階に存在し得る。急性心臓毒性としてはまた、左心室駆出フラクション（ＬＶＥＦ）の減
少、ならびに一回拍出量（ＳＶ）の減少、心拍出量（ＣＯ）の減少、および心係数（ＣＩ
）の減少が挙げられ得る。ＡＤＭはまた、左心室の収縮およびポンプ能力を阻害すること
が示唆されている。慢性心臓毒性としては、不可逆的なうっ血性心不全が挙げられる。一
旦、患者がうっ血性心不全に罹患すると、その死亡率は、約３０％〜５０％に減少する。
心臓毒性はＡＤＭに関連するので、患者によっては、ＡＤＭ治療を終了しなければならな
いか、またはＡＤＭ使用の用量および期間を減らさなければならず、これは、ＡＤＭ治療
の効果に影響を及ぼす。
その治療効果を維持しつつ、ＡＤＭの毒性を減少させる方法を見出すために、研究がな
されている。特性の基準（例えば、ＡＤＭの総用量を減少させること、または心筋栄養剤
（例えば、高用量のビタミンＣ）を投与すること）は、心筋炎を保護するのに有用であり
得る。定期的な輸血および鉄キレート剤ＩＣＲＦ−１８７の投与もまた、心筋炎を保護す
るのにある程度効果を有する。しかし、これらの補助剤は心筋に対して有用であるが、そ
れらは、ＡＤＭにより誘導される心臓毒性に対してほとんど効果を有さない。従って、当
該分野において、その効果に影響を与えることなく、ＡＤＭの心臓毒性を予防、処置、ま
たは遅延する必要性が存在する。
心不全は、多くの病因（例えば、冠動脈硬化、高血圧、および炎症誘導性心筋損傷）に
より引き起こされ、最終的に、難治性の心臓疾患を引き起こす。これらの要因は、心筋細
胞構造および機能の変化を引き起こし、最終的には、心室ポンプ機能の低下および心不全
を引き起こす。心不全の発生率および死亡率は、世界中で非常に高く、最も重篤な致死性
疾患のひとつである。米国において、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の３０％〜４０％が年単
位の入院を必要とする。ＣＨＦの診断の確立の５年後の死亡率は、６０％（男性）および
４０％（女性）である。平均生存期間は、３．２年（男性）および５．４年（女性）であ
るが、最終段階のＣＨＦを有する患者の生存率はわずかに約２０％である。
ニューレギュリン−１（ＮＲＧ−１）（Ｎｅｕ分化因子（ＮＤＦ）またはグリア成長因
子（ＧＧＦ）とも呼ばれる）は、ＥｒｂＢ３およびＢｒｂＢ４のリガンドである。ニュー
レギュリン遺伝子欠損胎児マウスにおける研究は、ニューレギュリンが心臓および神経系
の発達に必須であることを実証している。しかし、このデータは、ニューレギュリンが細
胞分化および下流へのシグナル伝達を制御する方法についてに制限される。心臓発達の早
期段階において、ニューレギュリンおよびＥｒｂＢレセプターは、それぞれ、心内膜およ
び心筋細胞の内層で発現される。これらの二層は広範に隔てられているので、ニューレギ
ュリンは、ＥｒｂＢレセプターを活性化し得る前にこれらの二層の間の空間を通過する必
要がある。心臓細胞にけるＥｒｂＢレセプターの活性化は、心臓細胞および心内膜へのそ
の移動の補助となる。ＷＯ００／３７０９５は、ニューレギュリンが、心筋細胞の分化を
増強し得、筋節および細胞骨格の組み合わせおよび細胞内接着を強化し得ることを示す。
ＷＯ００／３７０９５はまた、ニューレギュリンが心臓疾患を検出、診断、および処置す
るのに使用され得ることを示している。ＷＯ００／３７０９５はさらに、ニューレギュリ
ンおよびそのアナログが、心臓細胞の分化をインビボで促進し、心臓細胞における筋節お
よび細胞骨格の再構成ならびに細胞内接着を誘導し、ニューレギュリンを阻害し得るポリ
ペプチドまたは化合物を同定し得ることを示している。同定されたポリペプチドまたは化
合物は、心臓疾患および心不全を処置するのに使用され得る。
当該分野において、より効果的かつ／または費用効果の高い、ウイルス性心筋炎、拡張
型心筋症、予防剤または治療剤（例えば、ＡＤＭ）の心臓毒性（その効果に影響を及ぼす
ことなく）、および心筋収縮に対するニューレギュリン関連処置の必要性が存在する。本
発明は、これらおよび当該分野における他の関連する必要性に取り組んでいる。
（発明の開示）
（ウイルス性心筋炎または拡張型（うっ血性）心筋症（ＤＣＭ）の処置）
１つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎または拡張型（う
っ血性）心筋症（ＤＣＭ）を予防、処置、または遅延するための方法に関する。この方法
は、このような予防、処置、または遅延が必要とされるかまたは望ましい哺乳動物に、有
効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギ
ュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレ
ギュリンの産生および／もしくは機能を増強する薬剤を投与する工程を包含し、それによ
って、ウイルス性心筋炎またはＤＣＭが予防、処置、または遅延される。好ましくは、ニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタ
ンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリン
の産生および／もしくは機能を増強する薬剤は、インビボで投与される。
別の局面において、本発明は、組み合わせであって、有効量のニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその
機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産生および／もしく
は機能を増強する薬剤、ならびにウイルス性心筋炎もしくは拡張型（うっ血性）心筋症（
ＤＣＭ）のための有効量の予防剤もしくは治療剤を含む、組み合わせ、に関する。
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎または拡張型
（うっ血性）心筋症（ＤＣＭ）を予防、処置、または遅延するための薬学的組成物に関す
る。この組成物は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
ト、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核
酸、または該ニューレギュリンの産生および／もしくは機能を増強する薬剤を含む。
（予防剤または治療剤に付随する心臓毒性の処置）
本発明の目的は、予防剤または治療剤に付随する心臓毒性を予防、処置、または遅延さ
せるための方法を提供することである。特に、本発明の目的は、薬物誘導性の心筋症の心
臓毒性を予防、処置、または減少させる方法を提供することである。
本発明は、その予防、処置、または遅延が必要とされるかまたは望ましい哺乳動物にお
ける心臓毒性を予防、処置、または遅延するための方法を提供する。この方法は、インビ
ボで哺乳動物に、有効量の予防剤または治療剤、および有効量の（ｉ）ニューレギュリン
タンパク質もしくはその機能的フラグメント；（ｉｉ）ニューレギュリンタンパク質もし
くはその機能的フラグメントをコードする核酸；または（ｉｉｉ）該ニューレギュリンの
産生もしくは機能を増強する薬剤を投与する工程を包含し、それによって、該予防剤また
は治療剤の投与に付随する心臓毒性が予防、処置、または遅延される。
本発明は、当業者に公知の任意の心臓毒性（急性心臓毒性または慢性心臓毒性が挙げら
れるがこれらに限定されない）の任意の臨床的症状を予防、処置、または遅延させるため
に使用され得る。例えば、本発明は、頻拍、不整脈、およびうっ血性心不全を予防、処置
、または遅延させるために使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、急性心臓
毒性の臨床的特長（例えば、洞頻拍、不整脈、伝導ブロック、およびＳＴ−Ｔセグメント
の変質、ならびに左心室駆出フラクション（ＬＶＥＦ）の減少、一回拍出量（ＳＶ）の減
少、心拍出量（ＣＯ）の減少、または心係数（ＣＩ）の減少）を予防、処置、または遅延
させるために使用され得る。本発明はまた、左心室の収縮およびポンプ能力の阻害を含む
細胞毒性を予防、処置、または遅延するために使用され得る。
本発明の方法は、任意の予防剤または治療剤に付随する心臓毒性を予防、処置、または
遅延するために使用され得る。１つの実施形態において、予防剤または治療剤は、心臓毒
性を引き起こす酸素由来のフリーラジカルを産生する。別の実施形態において、予防剤ま
たは治療剤は、心臓毒性を引き起こす脂質の過酸化を増強する。
本発明の方法は、抗新生物剤に付随する心臓毒性を予防、処置、または遅延させるため
に使用され得る。抗新生物剤は、好ましくは、アントラサイクリンである。特定の実施形
態において、抗新生物剤は、以下の式Ｉ：
Figure 0006603149
 を有し、式中、Ｒ１はメトキシまたは水素であり；ならびにＲ２、Ｒ３、およびＲ４は
、ヒドロキシまたは水素である。本発明の方法において使用するためのアントラサイクリ
ンの非限定的な例としては、アドリアマイシン（またはドキソルビシン）、ダウノルビシ
ン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイトマイシン、ブレオマシイン
、シクロホフファミド、フルオロウラシル、アクチノマイシンＤ、およびビンクリスチン
が挙げられる。１つの局面において、本発明は、化学療法剤（例えば、アドリアマイシン
（ＡＤＭ））により誘導される心臓毒性を予防、処置、または遅延させるための抗心臓毒
性薬剤としてのニューレギュリンの、単独または別の薬剤と組み合わせての使用に関する
。
本発明の方法は、抗精神病剤に付随する心臓毒性を予防、減少、または遅延するために
使用され得る。抗精神病剤は、クロルプロマジン、パーフェナジン、またはトリフルペラ
ジンであり得る。
本発明の方法は、三環系抗うつ剤に付随する心臓毒性を予防、減少、または遅延するた
めに使用され得る。三環系抗うつ剤は、クロリミプラミン、アミトリプチリン、またはド
キセピンであり得る。
本発明の方法は、インターフェロン（例えば、インターフェロン−α）またはインター
ロイキン（例えば、インターロイキン−２）に付随する心臓毒性を予防、減少、または遅
延するために使用され得る。
本発明の方法は、抗感染剤（例えば、エメチン）に付随する心臓毒性を予防、減少、ま
たは遅延するために使用され得る。
本発明の方法において使用するためのニューレギュリン剤は、ニューレギュリン１、ニ
ューレギュリン２、ニューレギュリン３、またはニューレギュリン４であり得る。特定の
実施形態において、本発明の方法において使用するためのニューレギュリンは、ニューレ
ギュリンα２またはニューレギュリンβ２である。別の実施形態において、ニューレギュ
リンフラグメントは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ２で
ある。
ニューレギュリン剤は、タンパク質またはその機能的フラグメントとして投与され得る
。ニューレギュリン剤はまた、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメン
トをコードする核酸として投与され得る。ニューレギュリンの産生または機能を増強する
薬剤もまた投与され得る。ニューレギュリン剤は、単独でまたは薬学的に受容可能なキャ
リアもしくは賦形剤と組み合わせて投与され得る。ニューレギュリンタンパク質もしくは
その機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグ
メントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産生または機能を増強する薬剤は
、予防剤または治療剤の投与の前、同時、または後に投与され得る。
１つの実施形態において、予防剤または治療剤は、その予防剤または治療剤が、ニュー
レギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または該ニューレギュリンの産
生もしくは機能を増強する薬剤の非存在下で投与される場合に最大限許容される量よりも
高い量で投与される。
特定の実施形態において、本発明は、その予防、処置、または遅延が必要とされるかま
たは望ましいヒトにおいて、心臓毒性を予防、処置、または遅延させる方法を提供する。
好ましくは、ヒトは、肺癌、乳癌、膀胱癌、精巣癌、甲状腺癌、柔組織癌、骨肉腫、神経
芽腫、急性白血病、悪性リンパ腫、胃癌、肝臓癌、食道癌、および頚部癌のような悪性腫
瘍を有する。
（心筋梗塞の処置）
１つの局面において、本発明は、組み合わせに関し、この組み合わせは、有効量のニュ
ーレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタ
ンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメント、あるいはこのニューレギ
ュリンの産生および／もしくは機能を増強する薬剤、ならびに心筋梗塞のための有効量の
予防剤または治療剤を含有する。
別の局面において、本発明は、キットに関し、このキットは、容器内の上記組み合わせ
、および心筋梗塞を予防するか、処置するか、または遅延させる際にこの組み合わせを使
用するための指示書を備える。
なお別の局面において、本発明は、哺乳動物において心筋梗塞を予防するか、処置する
か、または遅延させるための方法に関し、この方法は、このような予防、処置または遅延
が必要とされるかまたは望ましい哺乳動物に、有効量のニューレギュリンタンパク質、も
しくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、
もしくはその機能的フラグメント、あるいはこのニューレギュリンの産生および／もしく
は機能を増強する薬剤を投与し、これによって、この心筋梗塞が予防されるか、処置され
るか、または遅延される工程を包含する。
（薬学的組成物）
１つの局面において、本発明は、哺乳動物において疾患を予防するか、処置するか、ま
たは遅延させるための薬学的組成物に関し、この組成物は、ニューレギュリンタンパク質
、またはその機能的フラグメントを、ａ）約１７０Ｕ／ｋｇ以下の安全用量で；またはｂ
）約３，６００Ｕ／ｋｇ以下の全レジメンで、含有する。
（発明を実施するための形態）
開示の明瞭さのために、そして限定によってではなく、本発明の詳細な説明が、以下の
小節に分割される。
（Ａ．定義）
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本
発明が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中
に記載される全ての特許、出願、出願公開、および他の刊行物は、その全体が、参考とし
て援用される。この節に記載される定義が、本明細書中に参考として援用される特許、出
願、出願公開、および他の刊行物に記載される定義と矛盾するかまたは他に一致しない場
合は、この節に記載される定義が、本明細書中に参考として援用される定義より優勢であ
る。
本明細書中において使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」ま
たは「１以上」を意味する。
本明細書中において使用される場合、「ニューレギュリン」とは、ＥｒｂＢ２／Ｅｒｂ
Ｂ４ヘテロダイマープロテインキナーゼまたはＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３ヘテロダイマープ
ロテインキナーゼを活性化し得る、タンパク質またはペプチド（例えば、全てのニューレ
ギュリンアイソフォーム、ニューレギュリンＥＧＦドメイン単独、ニューレギュリン変異
体、および上記レセプターを同様に活性化する任意の種類のニューレギュリン様遺伝子産
物）をいう。例示的なニューレギュリンフラグメントは、ヒトニューレギュリンβ２異性
体のポリペプチドフラグメントであり、これは、レセプター結合ドメイン（すなわち、Ｅ
ＧＦ様ドメイン）を含む。このポリペプチドは、ＥＧＦレセプターファミリーのＥｒｂＢ
レセプターを活性化し得、そしてその生物学的反応を調節し得る（例えば、乳癌細胞分化
およびミルクプロテイン分泌を刺激し得；神経堤細胞のシュワン細胞への分化を誘導し得
；骨格筋細胞におけるアセチルコリン合成を刺激し得；そして心臓細胞の生存およびＤＮ
Ａ合成を改善し得る）。ニューレギュリンはまた、抗ウイルス心筋炎活性、抗ＤＣＭ活性
、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性を実質的に変化させない、保存的アミノ酸置換
を有する改変体を含む。アミノ酸の適切な保存的置換は、当該分野の当業者に公知であり
、そして一般に、得られる分子の生物学的活性を変化させずになされ得る。当該分野の当
業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換が、生物学的活
性を実質的に変化させないことを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，第４版、１９８７、Ｔｈｅ Ｂｅｊａｃ
ｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，ｐ２２４を参照のこと）。ニューレギュリ
ンタンパク質は、ニューレギュリンタンパク質およびニューレギュリンペプチドを包含す
る。ニューレギュリン核酸は、ニューレギュリン核酸およびニューレギュリンオリゴヌク
レオチドを包含する。
本明細書中において使用される場合、「上皮増殖因子様ドメイン」または「ＥＧＦ様ド
メイン」とは、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、またはこれらの組み合わせに結合
し、そしてこれらを活性化させ、そしてＥＧＦレセプター結合ドメインと類似の構造を保
有する、ニューレギュリン遺伝子によってコードされるポリペプチドモチーフをいう。こ
れらは、ＷＯ ００／６４４００、Ｈｏｌｍｅｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６：１２０５
−１２１０（１９９２）；米国特許第５，５３０，１０９号および同第５，７１６，９３
０号；Ｈｉｊａｚｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１３：１０６１−１０６７（１９９８
）；Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，３８７：５０９−５１２（１９９７）；Ｃａｒｒａｗ
ａｙら、Ｎａｔｕｒｅ，３８７：５１２−５１６（１９９７）；Ｈｉｇａｓｈｉｙａｍａ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１２２：６７５−６８０（１９９７）；ならびにＷＯ９７／
０９４２５に開示されている。
本明細書中において使用される場合、ニューレギュリンの「機能的誘導体またはフラグ
メント」とは、その抗ウイルス心筋炎活性、抗ＤＣＭ活性、抗心臓毒性活性、または抗心
筋梗塞活性をなお実質的に保持する、ニューレギュリンタンパク質またはそのコード核酸
の誘導体またはフラグメントをいう。通常、誘導体またはフラグメントは、その抗ウイル
ス心筋炎活性、抗ＤＣＭ活性、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性の少なくとも５０
％を保持する。好ましくは、誘導体またはフラグメントは、その抗ウイルス心筋炎活性、
抗ＤＣＭ活性、抗心臓毒性活性、または抗心筋梗塞活性の少なくとも６０％、７０％、８
０％、９０％、９５％、９９％および１００％を保持する。
本明細書中において使用される場合、「ニューレギュリンの産生を増強する薬剤」とは
、ニューレギュリン遺伝子の転写および／または翻訳を増加させる物質、あるいはニュー
レギュリン前駆体の翻訳後修飾および／または細胞輸送を増加させる物質、あるいはニュ
ーレギュリンタンパク質の半減期を延長させる物質をいう。
本明細書中において使用される場合、「ニューレギュリンの機能を増強する薬剤」とは
、ニューレギュリンの抗ウイルス心筋炎活性、抗ＤＣＭ活性、抗心臓毒性活性、または抗
心筋梗塞活性の強さを増加させる物質、あるいは抗ウイルス心筋炎シグナル伝達経路、抗
ＤＣＭシグナル伝達経路、抗心臓毒性活性シグナル伝達経路、または抗心筋梗塞シグナル
伝達経路におけるニューレギュリンの天然リガンドの感受性を増加させる物質、あるいは
ニューレギュリンのアンタゴニストの強さを低下させる物質をいう。このような薬剤は、
ニューレギュリンタンパク質でもそのコード核酸でもない。
本明細書中において使用される場合、「組み合わせ」とは、２つの物品の間、またはよ
り多くの物品の間の任意の連合をいう。
本明細書中において使用される場合、「組成物」とは、２つ以上の生成物または化合物
の任意の混合物をいう。これは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、
またはこれらの任意の組み合わせであり得る。
本明細書中において使用される場合、「ｅｒｂ」とは、赤芽球症ウイルス（急性トラン
スホーミングレトロウイルス）と会合した２つの癌遺伝子（ｅｒｂ Ａおよびｅｒｂ Ｂ
）をいう。
本明細書中において使用される場合、「特定の疾患を処置するために有効な化合物の量
」とは、疾患に関連する症状を軽減するか、または何らかの様式で減少させるために十分
な量である。このような量は、単一の用量として投与され得るか、または効果的であるレ
ジメンに従って投与され得る。この量は、疾患を治癒し得るが、代表的に、疾患の症状を
軽減するために投与される。症状の所望の軽減を達成するために、繰り返しの投与が必要
とされ得る。
本明細書中において使用される場合、「心不全」とは、心臓が組織を代謝する要件のた
めに必要とされる割合で血液をポンピングしない、心臓機能の異常性を意味する。心不全
としては、広範な疾患状態（例えば、うっ血性心不全、心筋梗塞、頻脈性不整脈、家族性
肥大型心筋症、虚血性心臓病、特発性拡張型心筋症、および心筋炎）が挙げられる。心不
全は、多数の要因（虚血性形態、先天性形態、リウマチ性形態、または特発性形態が挙げ
られる）によって引き起こされ得る。慢性心臓肥大は、うっ血性心不全および心停止に対
する前駆体である、非常に疾患した状態である。
本明細書中において使用される場合、「組換え手段による産生」とは、クローニングさ
れた核酸によってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法
に依存する組換え核酸方法を使用する、産生方法をいう。
本明細書中において使用される場合、「相補」とは、２つの核酸分子をいう場合に、ヌ
クレオチドの２つの配列が、対向するヌクレオチドの間で、好ましくは２５％未満のミス
マッチで、より好ましくは１５％未満のミスマッチで、なおより好ましくは５％未満のミ
スマッチで、最も好ましくはミスマッチなしでハイブリダイゼーションし得ることを意味
する。好ましくは、これらの２つの分子は、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダ
イズする。
本明細書中において使用される場合、ミスマッチの百分率を決定する際の「ハイブリダ
イゼーションのストリンジェンシー」とは、以下の通りである：
１）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；
２）中ストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（中程度のスト
リンジェンシーともまた称される）；および
３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。
等価なストリンジェンシーが、代替の緩衝液、塩および温度を使用して達成され得ること
が、理解される。
本明細書中において使用される場合、「ベクター（またはプラスミド）」とは、異種Ｄ
ＮＡを、その発現または複製のために細胞に導入するために使用される、不連続なエレメ
ントをいう。このようなビヒクルの選択および使用は、当業者に周知である。発現ベクタ
ーとしては、調節配列（例えば、プロモーター領域であり、これは、このようなＤＮＡフ
ラグメントの発現を引き起こし得る）と作動可能に結合したＤＮＡを発現し得るベクター
が挙げられる。従って、発現ベクターとは、組換えＤＮＡ構築物または組換えＲＮＡ構築
物（例えば、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは適切な宿主細胞への導入の際
にクローニングされたＤＮＡの発現を生じる他のベクター）をいう。適切な発現ベクター
は、当業者に周知であり、そして真核生物細胞および／または原核生物細胞において複製
可能なもの、ならびにエピソームを保持するもの、あるいは宿主細胞ゲノムに統合される
ものが挙げられる。
本明細書中において使用される場合、「プロモーター領域またはプロモーターエレメン
ト」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡの、これらが作動可能に結合されるＤＮＡもしくはＲＮＡ
の転写を制御するセグメントをいう。プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼの認識、
結合および翻訳開始のために十分な特定の配列を含む。プロモーター領域のこの部分は、
プロモーターと称される。さらに、プロモーター領域は、ＲＮＡポリメラーゼのこの認識
活性、結合活性、および転写開始活性を調節する配列を含む。これらの配列は、シス作用
性であり得るか、またはトランス作用性因子に応答性であり得る。プロモーターは、調節
の性質に依存して、構成的であっても調節的であってもよい。原核生物においての使用が
意図される例示的なプロモーターとしては、バクテリオファージＴ７プロモーターおよび
Ｔ３プロモーターなどが挙げられる。
本明細書中において使用される場合、「作動可能に連結されるかまたは作動可能に会合
する」とは、ＤＮＡの、ヌクレオチドの調節配列およびエフェクター配列（例えば、プロ
モーター、エンハンサー、転写停止部位および翻訳停止部位、ならびに他のシグナル配列
）との機能的関係をいう。例えば、ＤＮＡのプロモーターに対する作動可能な結合とは、
ＤＮＡとプロモーターとの間の、このようなＤＮＡの転写がこのＤＮＡを特異的に認識し
、結合し、そして転写するＲＮＡポリメラーゼによってプロモーターから開始されるよう
な、物理的関係および機能的関係をいう。発現および／またはインビトロ転写を最適化す
るために、クローンの５’非翻訳部分を除去するか、付加するか、または変化させて、転
写レベルまたは翻訳レベルのいずれかで発現を妨害し得るかまたは減少させ得る、余分の
、潜在的に不適切な代替の翻訳開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）（すなわち、開始（ｓｔａ
ｒｔ））コドンまたは他の配列を排除することが、必要であり得る。あるいは、コンセン
サスリボソーム結合部位（例えば、Ｋｏｚａｋ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：１
９８６７−１９８７０（１９９１）を参照のこと）が、開始コドンのすぐ５’側に挿入さ
れ得、そして発現を増強し得る。このような修飾の所望性（または必要性）は、実験的に
決定され得る。
本明細書中で使用される場合、「処置」または「処置すること」とは、状態、障害また
は疾患の症状が、回復されるかそうでなければ有益に改変される任意の様式をいう。処置
はまた、本明細書中の組成物の任意の薬学的使用を包含する。特定の障害の症状の回復と
は、永久であろうと一時的であろうと、組成物の投与に起因し得るかまたは組成物の投与
に関連し得る、症状の任意の減少をいう。
本明細書中で使用される場合、「新生物（新生物形成）」とは、異常な新しい増殖また
は腫瘍増殖をいい、これは、良性または悪性であり得る。過形成と異なって、新生物増殖
は、元の刺激が非存在であっても持続する。
本明細書中で使用される場合、「抗新生物剤」とは、新生物、腫瘍または癌の発生を予
防するかまたはそれらの重篤度を減少させるために使用される任意の薬剤をいう。これら
としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：抗脈管形成剤、アルキル化剤、
代謝拮抗物質、天然産物、白金コーディネート複合体、アントラセニジオン（ａｎｔｈｒ
ａｃｅｎｅｄｉｏｎｅ）、置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、ホルモ
ン、アンタゴニスト、オンコジーンインヒビター、腫瘍抑制遺伝子もしくは腫瘍抑制タン
パク質抗オンコジーン抗体または抗オンコジーンアンチセンスオリゴヌクレオチド。
本明細書中で使用される場合、「抗精神病性剤（ａｎｔｉ−ｐｓｙｃｈｏｔｉｃ ａｇ
ｅｎｔ）」とは、精神障害の処置に使用される任意の薬剤をいう。これらとしては、以下
が挙げられるが、これらに限定されない：三環系フェノチアジン、チオキサンテンおよび
ジベンゼピン（ｄｉｂｅｎｚｅｐｉｎｅ）、ならびにブチロフェノンならびに同種属、他
の複素環および実験的ベンズアミド。
本明細書中で使用される場合、「三環系抗うつ剤」とは、うつ病の処置に使用される任
意の薬剤をいう。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：神経終
末へと取り込まれるノルエピネフリンおよびセロトニンを阻害し、従って、脳におけるノ
ルアドレナリン持続性亢進を導く薬剤をいう。
本明細書中で使用される場合、「抗感染剤」とは、感染疾患を処置するのに使用される
任意の薬剤をいう。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：寄生
虫感染、細菌感染または微生物感染に対して使用するための薬剤。
本明細書中で使用される場合、「安全な用量」とは、哺乳動物に過度の毒性または他の
副作用を含まずに哺乳動物における疾患を予防するか、処置するかまたは遅延するのに十
分な用量をいう。
本明細書中で使用される場合、「心筋梗塞」とは、冠状動脈の遮断（血流妨害）をいい
、これは、重篤な虚血または持続性虚血によって引き起こされる心筋部分の限局性壊死（
ｆｏｃａｌ ｎｅｃｒｏｓｉｓ）を導く。
（Ｂ．ウイルス性心筋炎またはＤＣＭを予防、処置または遅延する方法）
１つの局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎もしくは拡張型（
うっ血性の）心筋症（ＤＣＭ）を予防するか、処置するかもしくは遅延するための方法に
関し、この方法は、このような予防、処置または遅延が必要とされるかまたは所望である
哺乳動物に、有効量のニューレギュリン（ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）タンパク質もしくはそ
の機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
トをコードする核酸、またはニューレギュリンの生産および／または機能を増大する因子
を投与し、それによってウイルス性心筋炎またはＤＣＭを予防、処置または遅延する工程
を包含する。
本方法は、任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌
ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類）におけるウイルス性
心筋炎またはＤＣＭを予防、処置または遅延するために使用され得る。好ましくは、本方
法は、ヒトにおけるウイルス性心筋炎またはＤＣＭを予防、処置または遅延するために使
用され得る。
任意の適切なニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニュ
ーレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、本方法に
使用され得る。１つの特定の実施形態において、本方法に使用されるニューレギュリンは
、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４レセプターを用いる結合を介して抗ウイルス性心筋炎または抗
ＤＣＭ活性を行う。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン１、ニューレギュリ
ン２、ニューレギュリン３またはニューレギュリン４が、本方法に使用される。ニューレ
ギュリン１の同義語としては、ヘレグリン、ＧＧＦ２およびｐ１８５ｅｒｂＢ２リガンド
を含む。例えば、ＷＯ００／６４４００ならびに米国特許第５，５３０，１０９号および
同第５，７１６，９３０号を参照のこと。ニューレギュリンα２およびニューレギュリン
β２の両方が、本方法に使用される。好ましくは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を
含むニューレギュリンβ２フラグメントが、本方法に使用される。
なお別の特定の実施形態において、以下の特許、特許出願およびＧｅｎＢａｎｋデータ
ベースに開示されるニューレギュリンまたはその機能的フラグメントが、本方法に使用さ
れる：米国特許第６，２５２，０５１号および同第６，１２１，４１５（ＮＲＧ３）号；
同第６，０８７，３２３号（ｐ１８５ｅｒｂＢ２結合活性、ｐ１８５ｅｒｂＢ３結合活性
またはｐ１８５ｅｒｂＢ４結合活性を有するニューレギュリン）；同第６，０３３，９０
６（ｐ１８５ｅｒｂＢ２およびｐ１８０ｅｒｂＢ４からなる群から選択されるレセプター
のリガンドとしてのニューレギュリン）；ＵＳ２００２００２２７６（ニューレギュリン
の競合的アンタゴニストまたはアゴニストとしてのキメラＥｒｂＢヘテロマルチマー付着
因子）；ＷＯ０１／８１５４０（ＮＲＧ−４）；ＷＯ０１／６４８７７（ＮＲＧ１）；Ｗ
Ｏ０１／６４８７６（ＮＲＧ１ＡＧ１）；ＷＯ０１／５８９４８（ニューレギュリン−β
）；ＷＯ０１／２６６０７（ＳＭＤＦおよびＧＧＦのニューレギュリンスプライス改変体
アイソフォーム）；ＷＯ００／７０３２２（ＣＲＤニューレギュリン）；ＷＯ００／６４
４００；ＷＯ９９／１８９７６；ＷＯ９８／０２５４０（ニューレギュリンの競合的アン
タゴニストまたはアゴニストとしてのキメラＥｒｂＢヘテロマルチマー付着因子）；ＷＯ
９６／３０４０３；ＷＯ９６／１５８１２；ＢＣ０１７５６８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎ
ｓ、ニューレギュリン４に類似する）；ＢＣ００７６７５（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ、
ニューレギュリン１）；ＡＦ１４２６３２（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓシステインリ
ッチドメインニューレギュリン−１）；ＡＦ１９４４３９（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇ
ｉｃｕｓ ＳＭＤＦニューレギュリンα２ａ（Ｎｒｇ１））；ＡＦ１９４４３８（Ｒａｔ
ｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＳＭＤＦニューレギュリンβ１ａ（Ｎｒｇ１））；ＨＳ
２ＮＲＧ１２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ選択的スプライシングニューレギュリン２（Ｎ
ＲＧ２））；ＨＳ２ＮＲＧ０８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ選択的スプライシングニュー
レギュリン２（ＮＲＧ２））；ＨＳ２ＮＲＧ０７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ選択的スプ
ライシングニューレギュリン２（ＮＲＧ２））；ＡＦ０８３０６７（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕ
ｌｕｓニューレギュリン−４短型アイソフォーム（Ｎｒｇ４））；ＡＦ０７６６１８（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓニューレギュリンα−１）；ＡＦ０４５６５６（Ｇａｌｌｕ
ｓ ｇａｌｌｕｓニューレギュリンβ−２ｂ）；ＡＦ０４５６５５（Ｇａｌｌｕｓ ｇａ
ｌｌｕｓニューレギュリンβ−２ａ）；ＡＦ０４５６５４（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ
ニューレギュリンβ−１ａ）；ＭＡＵ９６６１２（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａ
ｔｕｓニューレギュリン）；ＡＦ０１０１３０（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓニューレギュ
リン−３（ＮＲＧ３））。好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＴ＿００７９９５（ｇ
ｉ：１８５７０３６３）に開示されるニューレギュリンは、本方法において使用される。
任意のウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。例え
ば、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｇｒｏｕｐ Ａウイルス、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｇｒｏｕｐ
Ｂウイルス、ＥＣＨＯウイルスまたはポリオウイルスの感染によって引き起こされるかま
たはこれらに関連するウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置または遅延さ
れ得る。好ましくは、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｇｒｏｕｐ Ｂウイルスの感染によって引き
起こされるかまたはこれに関連するウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置
または遅延される。
種々の臨床的特徴を有するウイルス性心筋炎は、本方法を使用して、予防、処置または
支援され得る。例えば、心外膜炎または心内膜炎による合併症を伴うウイルス性心筋炎は
が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。別の実施形態において、心筋損
傷、心機能不全、不整脈、全身性症状または心筋症の臨床的特徴を有するウイルス性心筋
炎が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。急性または慢性のウイルス性
心筋炎の両方が、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。好ましくは、不整
脈、心不全または心臓性ショックを伴う急性ウイルス性心筋炎が、本方法を使用して、予
防、処置または遅延され得る。心臓の肥大および／または永久性の心筋損傷で延長される
ウイルス性心筋炎がまた、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得る。
種々の臨床的特徴を有するＤＣＭが、本方法を使用して、予防、処置または遅延され得
る。例えば、心室肥大、心筋ポンプ機能不全またはうっ血性心不全を伴うＤＣＭが、本方
法を使用して、予防、処置または遅延され得る。
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリン
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、単独で投与され得る。
あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレ
ギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、薬学的に受容
可能なキャリアまたは賦形剤と共に投与され得る。
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリン
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、インビボで投与され得
る（すなわち、哺乳動物に直接的に投与され得る）。あるいは、ニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメントをコードする核酸は、エキソビボで投与され得（すなわち、細胞、組織
また器官に投与され）、そしてニューレギュリンタンパク質を保有するこのような細胞、
組織または生物体もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質
もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、哺乳動物へと移され得る）。
１つ特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメ
ントが投与される。別の特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質またはそ
の機能的フラグメントをコードする核酸が投与される。
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリン
タンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、単独で使用され得る。
あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレ
ギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルス性心
筋炎またはＤＣＭのための予防薬または治療剤と組み合せて使用され得る。ニューレギュ
リンタンパク質もしくはその機能的フラグメントまたはニューレギュリンタンパク質もし
くはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルス性心筋炎またはＤＣＭのため
の予防薬または治療剤の投与の前、同時または引き続いて、使用され得る。
ウイルス性心筋炎のための任意の適切な予防薬または治療剤が、本方法に使用され得る
。例えば、ウイルス性心筋炎のための予防薬または治療剤は、抗生物質（例えば、ペニシ
リン）、心臓保護剤（例えば、タウリン）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥ
およびコエンザイムＱ１０）ならびに心筋のための栄養物（例えば、エネルギーの組み合
せ）であり得る。
ＤＣＭのための任意の適切な予防薬または治療剤が、本方法に使用され得る。例えば、
ＤＣＭのための予防薬または治療剤は、以下であり得る：心臓強壮薬（例えば、ジゴキシ
ンおよびセジラニド（ｃｅｄｉｌａｎｉｄ））、利尿薬（ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍ
ａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐ
ｅｕｔｉｃｓ（９ｔｈ Ｅｄ．），ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ（１９９６）ｐｐ６８３−７
１３）（例えば、炭酸アンヒドラーゼのインヒビター、浸透圧利尿薬、Ｎａ＋−Ｋ＋−２
Ｃｌ−共輸送のインヒビター、Ｎａ＋−Ｃｌ−共輸送のインヒビター、腎臓上皮Ｎａ＋チ
ャネルのインヒビターおよび鉱質コルチコイドレセプターのアンタゴニスト）、アンギオ
テンシンＩ−変換酵素インヒビター（ＡＣＥＩ）、カルシウムアンタゴニスト（例えば、
アムロジピン）ならびにβレセプターアンタゴニスト（例えば、カルベディロール）。
（Ｃ．ウイルス性心筋炎またはＤＣＭを予防、処置または遅延するための薬学的組成物
、キットおよび組み合せ）
別の局面において、本発明は、哺乳動物におけるウイルス性心筋炎または拡張型（うっ
血性の）心筋症（ＤＣＭ）を予防、処置または遅延するための薬学的組成物に関し、この
薬学的組成物は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、
またはニューレギュリンの生産および／または機能を増大する因子を含む。
任意の適切なニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸（上記のセ
クションＢに記載されるものを含む）は、本発明の薬学的組成物に使用され得る。１つの
特定の実施形態において、本発明の薬学的組成物に使用されるニューレギュリンは、Ｅｒ
ｂＢ２−ＥｒｂＢ４レセプターを用いる結合によって、その抗ウイルス性心筋炎活性また
は抗ＤＣＭ活性を実施する。別の実施形態において、ニューレギュリン１、ニューレギュ
リン２、ニューレギュリン３またはニューレギュリン４は、本発明の薬学的組成物に使用
される。ニューレギュリン１の同義語としては、ヘレグリン、ＧＧＦ２およびｐ１８５ｅ
ｒｂＢ２リガンドが挙げられる。例えば、ＷＯ００／６４４００ならびに米国特許第５，
５３０，１０９号および同第５，７１６，９３０を参照のこと。ニューレギュリンα２お
よびニューレギュリンβ２の両方は、本発明の薬学的組成物に使用され得る。好ましくは
、配列番号４に示されるアミノ酸配列セットを含むニューレギュリンβ２フラグメントは
、本発明の薬学的組成物に使用される。
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸は、任意の適切な用量範
囲で使用され得る。例えば、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
ト、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核
酸は、約２５μｇ〜約２，５００μｇの範囲の用量を有し得る。
なお別の局面において、本発明はキットに関し、このキットは、ウイスル性心筋炎また
はＤＣＭを予防、処置または遅延する際に、容器に入った上記の薬学的組成物および前記
薬学的組成物を使用するための指示書を備える。
なお別の局面において、本発明は組み合せに関し、この組み合せは、有効量のニューレ
ギュリンタンパク質もしくはその機能性フラグメント、またはニューレギュリンタンパク
質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、または前記ニューレギュリンの生
産および／または機能を増大する因子、および有効量のウイルス性心筋炎または拡張型（
うっ血性）心筋症（ＤＣＭ）のための予防薬または治療剤を含む。
任意の適切なニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸（上記のセ
クションＢに記載されるものを含む）は、本発明の組み合せに使用され得る。１つの特定
の実施形態において、本発明の組み合せに使用されるニューレギュリンは、ＥｒｂＢ２−
ＥｒｂＢ４レセプターを用いる結合によってその抗ウイルス性心筋炎活性または抗ＤＣＭ
活性を実施する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン１、ニューレギュリン
２、ニューレギュリン３またはニューレギュリン４は、本発明の組み合せに使用される。
ニューレギュリン１の同義語としては、ヘレグリン、ＧＧＦ２およびｐ１８５ｅｒｂＢ２
リガンドが挙げられる。例えば、ＷＯ００／６４４００ならびに米国特許第５，５３０，
１０９号および同第５，７１６，９３０を参照のこと。ニューレギュリンα２およびニュ
ーレギュリンβ２の両方は、本発明の組み合せに使用され得る。好ましくは、配列番号１
に示されるアミノ酸配列セットを含むニューレギュリンβ２フラグメントは、本発明の組
み合せに使用される。
ウイルス性心筋炎のための任意の適切な予防薬または治療剤（上記のセクションＢに記
載されるものを含む）が、本発明の組み合せに使用され得る。例えば、ウイルス性心筋炎
のための予防薬または治療剤は、抗生物質（例えば、ペニシリン）、心臓保護剤（例えば
、タウリン）、抗酸化剤（例えば、ビタミンＣ、ビタミンＥおよびコエンザイムＱ１０）
ならびに心筋のための栄養物（例えば、エネルギーの組み合せ）であり得る。
ＤＣＭのための任意の適切な予防薬または治療剤（上記のセクションＢに記載されるも
のを含む）が、本発明の組み合せに使用され得る。例えば、ＤＣＭのための予防薬または
治療剤は、以下であり得る：心臓強壮薬（例えば、ジゴキシンおよびセジラニド）、利尿
薬（例えば、炭酸アンヒドラーゼのインヒビター、浸透圧利尿薬、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ
−共輸送のインヒビター、Ｎａ＋−Ｃｌ−共輸送のインヒビター、腎臓上皮Ｎａ＋チャネ
ルのインヒビターおよび鉱質コルチコイドレセプターのアンタゴニスト）、アンギオテン
シンＩ−変換酵素インヒビター（ＡＣＥＩ）、カルシウムアンタゴニスト（例えば、アム
ロジピン）ならびにβレセプターアンタゴニスト（例えば、カルベディロール）。
なお別の局面において、本発明はキットに関し、このキットは、ウイルス性心筋炎また
はＤＣＭを予防、処置または遅延する際の、容器に入った上記の組み合せおよび前記組み
合せを使用するための指示書を備える。
（Ｄ．心臓毒性を予防、処置または遅延するための方法）
ニューレギュリンは、心臓の筋細胞の分化を促進し、そして筋節と細胞骨格との組み合
せならびに細胞間接着力を強化することが見出されている（ＷＯ００／３７０９５）。ニ
ューレギュリンはまた、心臓疾患を検出し、診断し、そして処置するために使用され得る
。本発明の方法において、ニューレギュリンは、他の予防剤または治療剤に起因して、心
臓毒性を予防、処置または遅延するための心臓保護剤として使用される。
１つの局面において、本発明は、哺乳動物（心臓毒性の予防、処置または遅延が必要と
されるかまたはこれらを所望する哺乳動物）においてに心臓毒性を予防、処置または遅延
するための方法に関し、この方法は、インビボで、哺乳動物に、有効量の予防薬または治
療剤および有効量の（ｉ）ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
；（ｉｉ）またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコード
する核酸；または（ｉｉｉ）ニューレギュリンの生産または機能を増大する因子を投与す
る工程を包含し、それによって前記予防薬または治療剤の投与に関連する心臓毒性が、予
防、処置または遅延される。本方法は、任意の哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ウサ
ギ、ネコ、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊
長類）における心臓毒性を予防、処置または遅延するために使用され得る。好ましくは、
本方法は、ヒトにおける心臓毒性を予防、処置または遅延するために使用される。
（１．ニューレギュリン剤）
任意の適切なニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニ
ューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸が、本発明
の方法で使用され得る。一実施形態において、本発明の方法は、ヒトニューレギュリンβ
２異性体のポリペプチドフラグメントを使用し、このヒトニューレギュリンβ２異性体は
、レセプター結合ドメイン（すなわち、ＥＧＦクラス領域）を含む。このポリペプチドは
、ＥＧＦレセプターファミリーのｅｒｂＢレセプターを活性化し得、かつその生物学的反
応を調節し得る（例えば、乳癌細胞の分化および乳汁タンパク質分泌を刺激し；Ｓｃｈｗ
ａｎｎ細胞への神経冠細胞の分化を誘導し；骨格筋細胞におけるアセチルコリン合成を刺
激し；そして／または心筋細胞生存およびＤＮＡ合成を改善する）。ニューレギュリンの
核酸およびタンパク質は、当該分野で公知の任意の適切な方法（組換え生成、キメラ合成
またはこの両者の組合せを含むが、これらに限定されない）によって生成され得る。好ま
しくは、ニューレギュリンの核酸およびタンパク質は、組換え生成によって生成される（
Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．２００２を参照のこと
）。
その抗心臓毒性活性を実質的に変更しない保存的アミノ酸置換を有するニューレギュリ
ン改変体はまた、本発明の方法において使用され得る。アミノ酸の適切な保存的置換は、
当業者に公知であり、そして一般に、得られる分子の生物学的活性を変更することなく作
製され得る。当業者は、一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換
が、生物学的活性を実質的に変更しないということを認識する（例えば、Ｗａｔｓｏｎら
、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅ，第４版、２２４頁、
Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，１９８７を参照のこと
）。
ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、裸の
ＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの他の混
合物の形態で、遺伝子送達系の成分として使用され得る。別の実施形態において、ニュー
レギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントをコードする核酸は、ウイルスベク
ターに含まれる。遺伝子治療に適切な任意のウイルスベクターが使用され得る。非限定的
な例としては、アデノウイルスベクター（米国特許第５，８６９，３０５号）、シミアン
ウイルスベクター（米国特許第５，９６２，２７４号）、条件付きで複製するヒト免疫不
全ウイルスベクター（米国特許第５，８８８，７６７号）、レトロウイルス、ＳＶ４０、
単純ヘルペスウイルスアンプリコンベクター、およびワクシニアウイルスベクターが挙げ
られる。さらに、これらの遺伝子は、脂質が、凝固の間に酸化からＤＮＡまたは他の生体
物質を保護する非ウイルスベクター系（例えば、リポソーム）の形態で送達され得る。
特定の実施形態において、本発明の方法で使用されるニューレギュリンは、その抗心臓
毒性活性を、任意のｅｒｂＢ２レセプター〜ｅｒｂＢ４レセプターとの結合によって実施
する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリン１、ニューレギュリン２、ニュー
レギュリン３またはニューレギュリン４が、本発明の方法で使用される。ニューレギュリ
ン１の同意語としては、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）、ＧＧＦ２およびｐ１８５ｅ
ｒｂＢ２リガンドが挙げられる（例えば、ＷＯ００／６４４００、ならびに米国特許第５
，５３０，１０９号および同第５，７１６，９３０号を参照のこと）。ニューレギュリン
α２およびニューレギュリンβ２の両方は、本発明の方法で使用され得る。好ましくは、
配列番号４で記載されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ２フラグメントが本発明
の方法で使用される。
さらに別の特定の実施形態において、以下の特許、特許出願およびＧｅｎＢａｎｋデー
タベースで開示されるニューレギュリンまたはその機能的フラグメントが、本発明の方法
で使用され得る：米国特許第６，２５２，０５１号および同第６，１２１，４１５号（Ｎ
ＲＧ３）；同第６，０８７，３２３号（ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８５ｅｒｂＢ３または
ｐ１８５ｅｒｂＢ４結合活性を有するニューレギュリン）；同第６，０３３，９０６号（
ｐ１８５ｅｒｂＢ２およびｐ１８５ｅｒｂＢ４からなる群から選択されるレセプターに対
するリガンドとしてのニューレギュリン）；ＵＳ２００２００２２７６（ニューレギュリ
ンの競合的アンタゴニストまたはアゴニストとしてのキメラＥｒｂＢヘテロマルチマー付
着因子）；ＷＯ０１／８１５４０（ＮＲＧ−４）；ＷＯ０１／６４８７７（ＮＲＧ１）；
ＷＯ０１／６４８７６（ＮＲＧ１ＡＧ１）；ＷＯ０１／５８９４８（ニューレギュリンβ
）；ＷＯ０１／２６６０７（ＳＭＤＦおよびＧＧＦニューレギュリンスプライス改変アイ
ソフォーム）；ＷＯ００／７０３２２（ＣＲＤ−ニューレギュリン）；ＷＯ００／６４４
００；ＷＯ９９／１８９７６；ＷＯ９８／０２５４０（ニューレギュリンの競合的アンタ
ゴニストまたはアゴニストとしてのキメラＥｒｂＢヘテロマルチマー付着因子）；ＷＯ９
６／３０４０３；ＷＯ９６／１５８１２；ＢＣ０１７５６８（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ
，ニューレギュリン４と類似）；ＢＣ００７６７５（Ｈｏｍｏ Ｓａｐｉｅｎｓ、ニュー
レギュリン１）；ＡＦ１４２６３２（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓシステインリッチド
メインニューレギュリン１）；ＡＦ１９４４３９（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ
ＳＭＤＦニューレギュリンα２ａ（Ｎｒｇ１））；ＡＦ１９４４３８（Ｒａｔｔｕｓ
ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＳＭＤＦニューレギュリンβ１ａ（Ｎｒｇ１））；ＨＳ２ＮＲＧ
１２（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓの選択的スプライシングニューレギュリン２（ＮＲＧ２
））；ＨＳ２ＮＲＧ０８（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓの選択的スプライシングニューレギ
ュリン２（ＮＲＧ２））；ＨＳ２ＮＲＧ０７（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓの選択的スプラ
イシングニューレギュリン２（ＮＲＧ２））；ＡＦ０８３０６７（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌ
ｕｓニューレギュリン４ショートアイソフォーム（Ｎｒｇ４））；ＡＦ０７６６１８（Ｘ
ｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓニューレギュリンα−１）；ＡＦ０４５６５６（Ｇａｌｌｕ
ｓ ｇａｌｌｕｓニューレギュリンβ−２ｂ）；ＡＦ０４５６５５（Ｇａｌｌｕｓ ｇａ
ｌｌｕｓニューレギュリンβ−２ａ）；ＡＦ０４５６５４（Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ
ニューレギュリンβ−１ａ）；ＭＡＵ９６６１２（Ｍｅｓｏｃｒｉｃｅｔｕｓ ａｕｒａ
ｔｕｓニューレギュリン）；ＡＦ０１０１３０（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓニューレギュ
リン３（ＮＲＧ３））。好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＴ ００７９９５（ｇｉ
：１８５７０３６３）に開示されるニューレギュリンが、本発明の方法で使用される。
（２．予防剤または治療剤）
本発明は、予防剤または治療剤の投与に関連する心臓毒性を予防、処置または遅延する
ための方法を提供する。ニューレギュリン剤は、この予防剤または治療剤の投与の前、こ
れと同時、またはこれの後に投与され得る。本発明の方法は、特定の予防剤または治療剤
に関連する心臓毒性の予防、処置または遅延に限定されない。本発明の方法で使用するた
めの予防剤または治療剤の非限定的な例としては、抗腫瘍剤、抗精神病剤、三環系抗欝剤
、インターフェロン、インターロイキンおよび抗感染剤が挙げられる。任意の抗腫瘍剤が
本発明の方法で使用され得る。好ましくは、抗腫瘍剤は、以下の式を有するアントラサイ
クリン抗腫瘍剤である：
Figure 0006603149
 ここで、Ｒ１は、メトキシまたは水素であり；そしてＲ２、Ｒ３およびＲ４は、ヒドロキ
シまたは水素である。
アントラサイクリン抗腫瘍剤の非限定的な例としては、アドリアマイシン（またはドキ
ソルビシン）、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、マイ
トマイシン、ブレオマイシン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、アクチノマイシ
ンＤ、ビンクリスチン、およびこれらの誘導体が挙げられる（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉ
ｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版、ｐｐ．１２６４−１２６９，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ １９
９６を参照のこと）。本発明の方法で使用され得る抗腫瘍剤の他の例は、米国特許出願番
号２００２／０４４９１９に記載される。他の抗腫瘍剤としては、シチジン、アラビノシ
ルアデニン（ａｒａＣ）、ダウノマイシン、メトトレキサート（ＭＴＸ）、フッ化ピリミ
ジン（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））、ヒドロキシウレア、６−メルカプ
トプリン、植物アルカロイド（例えば、ビンクリスチン（ＶＣＲ）、ＶＰ−１６およびビ
ンブラスチン（ＶＬＢ））、アルキル化剤、シスプラチン、ナイトロジェンマスタード、
トリサミン（ｔｒｉｓａｍｉｎｅ）、プロカルバジン、ブレオマイシン、マイトマイシン
Ｃ、アクチノマイシンＤ、または酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）が挙げられるが
、これらに限定されない（Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍ
ａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版、ｐｐ．
１２２７−１２２９を参照のこと）。
任意の抗精神病剤が、本発明の方法で使用され得る。抗精神病剤の非限定的な例として
は、クロルプロマジン、ペルフェナジン、およびトリフルペラジン（ｔｒｉｆｌｕｐｅｒ
ａｚｉｎｅ）が挙げられる。抗精神病剤の他の例は、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ
’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ，第９版、ｐｐ．４４０−４２０に見出され得る。
任意の三環系抗欝剤が、本発明の方法で使用され得る。三環系抗欝剤の非限定的な例と
しては、クロリミプラミン（ｃｈｌｏｒｉｍｉｐｒａｍｉｎｅ）、アミトリプチリンおよ
びドキセピンが挙げられる。抗精神病剤の他の例は、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ
’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕ
ｔｉｃｓ，第９版、ｐｐ．４３１−４３４に見出され得る。
任意のインターフェロンが、本発明の方法で使用され得る。好ましくは、インターフェ
ロンは、インターフェロン−αである。一実施形態において、インターフェロンは、ヒト
インターフェロン−αである。インターフェロン−αを製造する方法は、米国特許第６，
００５，０７５号；同第５，８３４，２３５号；同第５，５０３，８２８号；および同第
４，８２０，６３８号に見出され得る。
任意のインターロイキンが、本発明の方法で使用され得る。好ましくは、インターロイ
キンは、インターロイキン−２である。一実施形態において、インターロイキンは、ヒト
インターロイキン−２である。インターロイキン−２を製造する方法は、米国特許第５，
８３４，４４１号；同第５，７９５，７７７号；同第５，４１９，８９９号；および同第
５，３９９，６９９号に見出され得る。
任意の抗感染剤が、本発明の方法で使用され得る。好ましくは、抗感染剤は、エメチン
である。抗感染剤の他の例は、Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ，Ｔｈｅ Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版、ｐ
ｐ．９６５−１００８に見出される。
ニューレギュリン剤は、インビボで投与され得る（すなわち、哺乳動物に直接投与され
る）。あるいは、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、または
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸が、エキ
ソビボで投与され得る（すなわち、細胞、組織または器官に投与される。ここで、ニュー
レギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸を有するこのような細胞、組織ま
たは器官が、哺乳動物に移入され得る）。
（Ｅ．心筋梗塞の処置）
１つの局面において、本発明は、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント
をコードする核酸、あるいはこのニューレギュリンの生成および／または機能を増大する
薬剤、ならびに心筋梗塞のための有効量の予防剤または治療剤を含む組合わせに関する。
好ましくは、本発明の組合わせは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含
む。
任意の適切なニューレギュリンが、本発明の組み合わせで使用され得る。例えば、本発
明の組み合わせで使用されるニューレギュリンは、ＥｒｂＢ２レセプター〜ＥｒｂＢ４レ
セプターとの結合によってその抗心筋梗塞活性を実行し得る。別の例において、本発明の
組合せで使用されるニューレギュリンは、ニューレギュリン１、ニューレギュリン２、ニ
ューレギュリン３またはニューレギュリン４である。好ましくは、ニューレギュリン２は
、ニューレギュリンα２またはニューレギュリンβ２である。さらに別の例において、本
発明の組合せで使用されるニューレギュリンは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含
むニューレギュリンβ２フラグメントである。上記の章で記載される任意の特定のニュー
レギュリンもまた使用され得る。
任意の適切な予防剤または治療剤が、本発明の組み合わせで使用され得る。例えば、本
発明の組み合わせで使用される予防剤または治療剤は、アンギオテンシンＩ−変換酵素イ
ンヒビター（ＡＣＥＩ）、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、
アスピリン、アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミンまたは血栓溶解剤であり得る
。
任意の適切なＡＣＥＩが使用され得る。例示的なＡＣＥＩとしては、カプトプリル、ラ
ムプリル（ｒａｍｐｒｉｌ）、リシノプリル、ゾフェノプリル（ｚｏｆｅｎｏｐｒｉｌ）
およびトランドラプリル（ｔｒａｎｄｏｌａｐｒｉｌ）が挙げられる。任意の適切なカル
シウムアンタゴニストが使用され得る。例示的なカルシウムアンタゴニストとしては、ジ
ルチアゼムが挙げられる。任意の適切なβ−レセプターアンタゴニストが使用され得る。
例示的なβ−レセプターアンタゴニストとしては、プロプラノロール、メトプロロール、
アテノロールおよびチモロールが挙げられる。任意の適切な血栓溶解剤が使用され得る。
代表的な血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡおよびアニストレプラーゼ
（ａｎｉｓｔｒｅｐｌａｓｅ）が挙げられる。
別の局面において、本発明は、キットに関し、このキットは、容器中の上記の組み合わ
せ、および心筋梗塞を予防、処置または遅延する際にこの組合せを使用するための指示書
を備える。
さらに別の局面において、本発明は、哺乳動物における心筋梗塞を予防、処置または遅
延するための方法に関し、この方法は、このような予防、処置または遅延が必要であるか
または所望される哺乳動物に、有効量のニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的
フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコ
ードする核酸、あるいはこのニューレギュリンの生成および／または機能を増大する薬剤
を投与し、それによりこの心筋梗塞を予防、処置または遅延する工程を包含する。
任意の適切なニューレギュリンが、本発明の方法で使用され得る。例えば、本発明の方
法で使用されるニューレギュリンは、ＥｒｂＢ２レセプター〜ＥｒｂＢ４レセプターとの
結合によってその抗心筋梗塞活性を実行し得る。別の例において、本発明の方法で使用さ
れるニューレギュリンは、ニューレギュリン１、ニューレギュリン２、ニューレギュリン
３またはニューレギュリン４である。好ましくは、ニューレギュリン１は、ニューレギュ
リンα２またはニューレギュリンβ２である。さらに別の例において、本発明の方法で使
用されるニューレギュリンは、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリ
ンβ２フラグメントである。上記の章で記載される任意の特定のニューレギュリンもまた
使用され得る。
特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメン
ト、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、ま
たはこのニューレギュリンの生成および／または機能を増大する薬剤が、心筋梗塞に関連
する左心室拡張終末期径（ＬＶＥＤＤ）および左心室収縮終末期径（ＬＶＥＳＤ）の増加
に拮抗する。別の特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機
能的フラグメント、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコー
ドする核酸、またはこのニューレギュリンの生成および／または機能を増大する薬剤は、
心筋梗塞に関連する左心室ＥＦの減少に拮抗する。
本発明の方法は、任意の適切な哺乳動物における心筋梗塞を予防、処置または遅延する
ために使用され得る。代表的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ
、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類が挙げられ
る。好ましくは、本発明の方法は、ヒトにおける心筋梗塞を予防、処置または遅延するた
めに使用される。
本発明の方法は、任意の適切な心筋梗塞を予防、処置または遅延するために使用され得
る。例えば、本発明の方法は、左心室拡大、減少した収縮機能および増加した充填圧から
なる群から選択される臨床的特徴を有する心筋梗塞を予防、処置または遅延するために使
用され得る。
ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、あるいはこのニューレ
ギュリンの生成および／または機能を増大する薬剤が、単独で投与され得る。好ましくは
、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリ
ンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、あるいはこのニューレ
ギュリンの生成および／または機能を増大する薬剤が、薬学的に受容可能なキャリアまた
は賦形剤と共に投与される。特定の実施形態において、ニューレギュリンタンパク質また
はその機能的フラグメントが投与される。別の実施形態において、ニューレギュリンタン
パク質またはその機能的フラグメントをコードする核酸が、投与される。任意の適切な投
与経路が使用され得る。好ましくは、静脈内投与が使用される。
本発明の方法は、心筋梗塞のための予防剤または治療剤を投与する工程をさらに包含す
る。任意の適切な予防剤または治療剤が、本発明の方法で使用され得る。例えば、本発明
の方法で使用される予防剤または治療剤は、アンギオテンシンＩ変換酵素インヒビター（
ＡＣＥＩ）、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、アスピリン、
アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミンまたは血栓溶解剤であり得る。
任意の適切なＡＣＥＩが使用され得る。例示的なＡＣＥＩとしては、カプトプリル、ラ
ムプリル、リシノプリル、ゾフェノプリルおよびトランドラプリルが挙げられる。任意の
適切なカルシウムアンタゴニストが使用され得る。例示的なカルシウムアンタゴニストと
しては、ジルチアゼムが挙げられる。任意の適切なβ−レセプターアンタゴニストが使用
され得る。例示的なβ−レセプターアンタゴニストとしては、プロパラノロール、メトプ
ロロール、アテノロールおよびチモロールが挙げられる。任意の適切な血栓溶解剤が使用
され得る。例示的な血栓溶解剤としては、ストレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡおよびアニスト
レプラーゼが挙げられる。
好ましい実施形態において、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメ
ント、ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントをコードする核酸、
またはこのニューレギュリンの生成および/または機能を増大する薬剤が、インビボで投
与される。
（Ｆ．好ましい安全用量および／レジメンを有する薬学的組成物）
１つの局面において、本発明は、哺乳動物における疾患を予防、処置または遅延するた
めの薬学的組成物に関し、この組成物は、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的
フラグメントを、ａ）約１７０Ｕ／ｋｇ以下の安全用量；またはｂ）約３，６００Ｕ／ｋ
ｇ以下の全レジメン中に含む。
本発明の薬学的組成物は、任意の適切なレジメンおよび／または投与計画において使用
され得る。一例において、本発明の薬学的組成物は、約２１日以下の間投与される。別の
例において、本発明の薬学的組成物は、連続的または断続的に投与される。
本発明の薬学的組成物は、単独で投与され得る。好ましくは、本発明の薬学的組成物は
、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤をさらに含み得る。
任意の適切なニューレギュリンが、本発明の薬学的組成物に使用され得る。例えば、本
発明の薬学的組成物に使用されるニューレギュリンは、ＥｒｂＢ２レセプター〜ＥｒｂＢ
４レセプターとの結合によって、その抗疾患活性を実行し得る。別の例において、本発明
の薬学的組成物で使用されるニューレギュリンは、ニューレギュリン１、ニューレギュリ
ン２、ニューレギュリン３またはニューレギュリン４である。好ましくは、ニューレギュ
リン１は、ニューレギュリンα２またはニューレギュリンβ２である。さらに別の例にお
いて、本発明の薬学的組成物で使用されるニューレギュリンは、配列番号４で示されるア
ミノ酸配列を含むニューレギュリンβ２フラグメントである。上記の章で記載される任意
の特定のニューレギュリンもまた使用され得る。
本発明の薬学的組成物は、任意の適切な哺乳動物における疾患を予防、処置または遅延
させるために使用され得る。例示的な哺乳動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ネコ
、イヌ、ブタ、雌ウシ、雄ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、サルおよび他の非ヒト霊長類動物
が挙げられる。好ましくは、本発明の方法は、ヒトにおける疾患を予防、処置または遅延
させるために使用される。
本発明の薬学的組成物は、任意の適切な疾患を予防、処置または遅延させるために使用
され得る。好ましくは、本発明の薬学的組成物は、心臓血管疾患（例えば、ウイルス性心
筋炎、ＤＣＭ、心臓毒性活性、心筋梗塞活性など）を予防、処置または遅延させるために
使用される。
好ましい実施形態において、本発明の薬学的組成物は、静脈内投与のために処方される
。
以下は、ニューレギュリンと細胞表面ＥｒｂＢ３／ＥｒｂＢ４分子およびＥｒｂＢ２タ
ンパク質リン酸化の間接的媒介とを組み合わせることによって、ＮＲＧ−１の生物学的活
性の決定のための例示的な迅速、感受性、高流量かつ定量的方法である（例えば、Ｍｉｃ
ｈａｅｌ Ｄ．Ｓａｄｉｃｋら Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１
９９６，２３５，２０７−２１４を参照のこと）。Ｍｉｃｈａｅｌ Ｄ．Ｓａｄｉｃｋら
に記載されるインビトロＮＲＧ−１活性決定の実施例３に従って、種々の起源のＮＧＲ−
１生物学的活性が決定され得る。
簡単に述べると、このアッセイ（キナーゼレセプター活性酵素結合免疫吸着アッセイ（
ＫＩＲＡ−ＥＬＩＳＡ）と呼ばれる）は、２つの別々のマイクロタイタープレートからな
り、一方は、細胞培養、リガンド刺激、および細胞溶解／レセプター可溶化のためであり
、そして他方のプレートは、レセプター捕捉およびホスホチロシンＥＬＩＳＡのためであ
る。このアッセイは、ヘレグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）誘導ＥｒｂＢ２活性の分析のた
めに開発され、接着乳癌細胞株（ＭＣＦ−７）に対するインタクトなレセプターの刺激を
利用する。膜タンパク質は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００溶解を介して可溶化され、そして
このレセプターは、ＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４への交差反応無しで、ＥｒｂＢ２特異的
抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡで捕捉される。次いで、レセプターリン酸化の程度
は、抗ホスホチロシンＥＬＩＳＡによって定量化される。再生可能な標準曲線は、ヘレグ
リンβ１（１７７−２４４）（ＨＲＧβ１（１７７−２４４）について約３６０ｐＭのＥ
Ｃ（５０）で生成される。ＨＲＧβ１（１７７−２４４）の同一のサンプルがＫＩＲＡ−
ＥＬＩＳＡと定量的抗ホスホチロシンウェスタンブロット分析の両方によって分析される
場合、この結果は、互いに非常に密接した関係にある。この報告に記載されるアッセイは
、ＨＲＧとＥｒｂＢ３および／またはＥｒｂＢ４との相互作用から生じるＥｒｂＢ２のチ
ロシンリン酸化を特異的に定量化することが可能である。
遺伝的に操作された医薬の大部分がタンパク質およびポリペプチドであるので、それら
の活性は、それらのアミノ酸配列またはそれらの空間的構造によって形成される活性中心
によって決定され得る。タンパク質およびポリペプチドの活性力価は、それらの絶対的な
品質と一致せず、従って、化学薬物の活性力価のように重量単位を用いて決定できない。
しかし、遺伝的に操作された医薬の生物学的活性は、一般的にそれらの薬力学と一致し、
そして所定の生物学的活性を介して確立された力価決定系は、その力価単位を決定し得る
。従って、生物学的活性決定は、生物学的活性を有する物質を力価決定するプロセスの一
部であり得、そして遺伝的に操作された産物の品質制御の重要な成分である。遺伝的に操
作された産物および臨床的に使用された薬物の品質制御の生物学的活性の基準を決定する
ことは、重要である。
最大反応の５０％を誘導し得る標準産物の量は、活性単位（１Ｕ）として規定される。
従って、異なる薬物および異なるバッチ数からの産物は、均一な基準で定量化され得る。
（Ｇ．ニューレギュリンの処方、用量および投与の経路）
ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュ
リンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの処方、用量および
投与の経路（好ましくは、薬学的組成物の形態）は、当該分野で公知の方法に従って決定
され得る（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｅｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ
）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ １９９７；Ｔｈｅｒ
ａｐｅｕｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏ
ｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂａｎｇａ，
１９９９；およびＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌ
ｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｖｇａａｒｄ
ａｎｄ Ｆｒｋｊｒ（Ｅｄ．），Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｉｎｃ．，２０
００；Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，Ｌａｓ
ｉｃ ａｎｄ Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（Ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，１９９８；Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊａｉｎ，
Ｈｏｇｒｅｆｅ ＆ Ｈｕｂｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９８；Ａｄｅｎｏｖｉｒ
ｕｓｅｓ：Ｂａｓｉｃ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１
５，Ｓｅｔｈ，Ｌａｎｄｅｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９；Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃ
ｅｕｔｉｃａｌ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｕ−Ｐ
ｏｎｇ ａｎｄ Ｒｏｊａｎａｓａｋｕｌ（Ｅｄ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９
９９；Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：Ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｃ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ ｔｏ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｖｏｌ．２８，Ｄｏｌｅら（Ｅｄ．），Ｓ
ｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９を参照のこと）。ニューレ
ギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパ
ク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは、経口、直腸、局所、吸入、
頬（例えば、舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）、経皮の投
与または任意の他の適切な投与経路のために処方され得る。任意の所定の場合において、
大部分の適切な経路は、処置される状態の性質および重篤度、ならびに使用されている、
特定のニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレ
ギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの性質に依存す
る。
ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュ
リンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは、単独で投与され
得る。代替的に、好ましくは、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグ
メント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラ
グメントは、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と同時に投与される。任意の適切
な薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤は、本発明の方法において使用され得る（例
えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ
Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ｍａｃｋ
Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ａｐｒｉｌ １９９７を参照のこと）。
ニューレギュリンタンパク質をコードする核酸またはその機能的フラグメントは、遺伝
子送達システムの成分として、裸のＤＮＡ、複合体化ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドＤＮ
Ａ、ＲＮＡまたは他のそれらの混合物の形態で使用され得る。別の実施形態において、ニ
ューレギュリンタンパク質をコードする核酸またはその機能的フラグメントは、ウイルス
ベクター内に含まれる。遺伝子治療に適切な任意のウイルスベクターが使用され得る。例
えば、アデノウイルスベクター（米国特許第５，８６９，３０５号）、シミアンウイルス
ベクター（米国特許第５，９６２，２７４号）、条件付き複製ヒト免疫欠損ウイルスベク
ター（米国特許第５，８８８，７６７号）、レトロウイルス、ＳＶ４０、単純ヘルペスウ
イルスアンプリコンベクターおよびワクシニアウイルスベクターが使用され得る。さらに
、遺伝子は、非ウイルスベクター系（例えば、リポソーム）内に送達され得、ここで、こ
の脂質は、凝固の間、酸化からＤＮＡまたは他の生体材料を保護する。
本発明に従って、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、ま
たはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントは
、単独でまたは他の薬剤、キャリアまたは賦形剤とともに、任意の適切な投与経路（例え
ば、海綿質内（ｉｎｔｒａｃａｖｅｒｎｏｕｓ）注射、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注
射、皮内注射、経口投与または局所投与）のために処方され得る。この方法は、添加され
た保存剤とともに、単位投薬形態で、アンプルで、または多用量容器で、注射可能投与の
ための処方物を使用し得る。処方物は、オイルまたは水性のビヒクル中の懸濁液、溶液ま
たはエマルジョンのような形態を取り得、そして懸濁剤、安定化剤および／または分散剤
のような処方剤を含み得る。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、滅菌性の
発熱物質を含まない水または他の溶媒で、構成するための粉末形態であり得る。本発明の
局所投与は、泡状物、ゲル、クリーム、軟膏、経皮パッチ、またはペーストの使用を利用
し得る。
薬学的に受容可能な組成物および本発明における使用のために利用され得るそれらの投
与のための方法としては、米国特許第５，７３６，１５４号；同第６，１９７，８０１Ｂ
１号；同第５，７４１，５１１号；同第５，８８６，０３９号；同第５，９４１，８６８
号；同第６，２５８，３７４Ｂ１号；および同第５，６８６，１０２号に記載されるもの
が挙げられるが、これらに限定されない。
処置または予防における治療的用量の大きさは、処置される状態の重篤度および投与経
路とともに変化する。用量、およびおそらく用量頻度はまた、個々の患者の年齢、体重、
状態および応答に従って変化する。
主治医が、毒性または副作用に起因して、治療を終了するか、中断するか、または低い
用量に調節するための方法および時期を知ることが注意されるべきである。逆に、医師は
また、臨床的応答が、適切でない場合、処置をより高いレベルに調節する方法および時期
を知る（毒性の副作用を排除する）。
任意の適切な投与経路が使用され得る。投薬形態としては、錠剤、トローチ剤、カシェ
剤、分散物、懸濁液、溶液、カプセル剤、パッチなどが挙げられる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ
’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照のこと。
実際の使用において、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント
、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメン
トは、単独でまたは他の薬剤とともに、従来の薬学的調合技術に従って、薬学的キャリア
または賦形剤（例えば、β−シクロデキストリンおよび２−ヒドロキシ−プロピル−β−
シクロデキストリン）との完全な混合物中の活性物として組み合わされ得る。キャリアは
、局所的または非経口的な投与のために所望される幅広い形態の調製物をとり得る。非経
口投薬形態（例えば、静脈内注射または注入）のための組成物を調製する際に、類似の薬
学的媒体（水、グリコール、オイル、緩衝液、糖、保存剤、リポソームおよび当業者に公
知なもの）が使用され得る。このような非経口組成物の例としては、デキストロース５％
ｗ／ｖ、生理食塩水または他の液体が挙げられるが、これらに限定されない。ニューレギ
ュリンタンパク質、もしくはその機能的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク
質をコードする核酸、もしくはその機能的フラグメントの合計用量は、単独でまたは投与
される他の薬剤とともに、約１ｍｌ〜２０００ｍｌの範囲の静脈内流体のバイアルで投与
され得る。希釈流体の容量は、投与される合計用量に従って変化する。
本発明はまた、本発明の治療レジメンを実施するためのキットを提供する。このような
キットは、薬学的に受容可能な形態で、ニューレギュリンタンパク質、もしくはその機能
的フラグメント、またはニューレギュリンタンパク質をコードする核酸、もしくはその機
能的フラグメントを、単独でまたは他の薬剤との組合せの治療有効量を１つ以上の容器に
、含む。好ましい薬学的形態は、滅菌生理食塩水、デキストロース溶液、または緩衝溶液
、あるいは他の薬学的に受容可能な滅菌流体との組合せである。あるいは、この組成物は
、凍結乾燥され得るかまたは乾燥（ｄｅｓｓｉｃａｔｅｄ）され得；この場合、キットは
、必要に応じて、容器中に、複合体を再構成して、注射目的のために溶液を形成するため
に、薬学的に受容可能な溶液（好ましくは、滅菌）をさらに含む。例示的な薬学的に受容
可能な溶液は、生理食塩水およびデキストロース溶液である。
別の実施形態において、本発明のキットは、さらに、組成物を注射するために、好まし
くは、滅菌形態で包装された針またはシリンジ、および／または包装されたアルコールパ
ッドを備える。説明書は、必要に応じて、医師または患者による組成物の投与のために含
まれる。
図１は、ニューレギュリンタンパク質を組換え産生するために操作された細菌株の構築を示す。 図２は、ヒトニューレギュリン遺伝子のＰＣＲ増幅を示す。レーン１：ＲＴ−ＰＣＲによって得られる１８３ｂｐのニューレギュリン遺伝子；ならびにレーン２および３：ＤＮＡマーカー。 図３は、プラスミドＰＥＴ２２ｂの物理的地図を示す。 図４は、エンドヌクレアーゼ消化による組換えプラスミドの同定を示す。レーン１および３：ＤＮＡマーカー；ならびにレーン２：酵素消化後のフラグメント。 図５は、操作された株の発現についてのスクリーニングを示す。レーン１：マーカー；レーン２：誘導なしで操作された株；レーン３：誘導後１時間；レーン４：誘導後２時間；レーン５：誘導後３時間；レーン６：誘導後４時間；およびレーン７〜９：誘導された異なる株。 図６は、擬操作群のラット（１）における心筋組織の病理学的切片を示す（１０×１０）、特定の病理学的変化が存在しなかったことを示す。 図７は、モデル群における、赤色に染色された領域の大きい面積を示す（１０×１０）。 図８は、ｒｈＮＲＧ−１β群（２０μｇ／ｋｇ）（Ｉ）の、赤色に染色された心筋細胞の散在性の分布を示す（１０×１０）。 図９は、中間の用量（１０μｇ／ｋｇ）のｒｈＮＲＧ−１β群（Ｉ）の、赤色に染色された心筋細胞および結合組織の、斑状の分布を示す（１０×１０）。 図１０は、低い用量（５μｇ／ｋｇ）のｒｈＮＲＧ−１β群（Ｉ）の、赤色に染色された心筋細胞および結合組織の、斑状の分布を示す（１０×１０）。 図１１は、擬操作群（ＩＩ）における心筋組織の病理組織学的切片を示す（１０×１０）、心筋組織の特定の病理学的変化が存在しなかったことを示す。 図１２は、モデル群（ＩＩ）において、赤色に染色された領域の大きい面積が見られたことを示す（１０×１０）。 図１３は、高い用量のｒｈＮＲＧ−１β（２０μｇ／ｋｇ）の群（ＩＩ）において見られる、赤色に染色された心筋細胞の散在性の分布を示す（１０×１０）。 図１４は、中間の投薬レベルのｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７（１０μｇ／ｋｇ）の群（ＩＩ）において見られる、赤色に染色された心筋細胞および線維組織の、斑状の分布を示す（１０×１０）。 図１５は、低い投薬レベルのｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７（５μｇ／ｋｇ）の群（ＩＩ）において見られる、赤色に染色された心筋細胞および線維組織の、斑状の分布を示す（１０×１０）。 図１６は、モデル動物（Ｉ）（ＨＥ染色、５０倍）の心筋線維症領域の毛細管再生に対するｒｈＮＲＧ−１βの影響を示す；Ａ：擬操作群：線維症の変化を有する正常な心筋構造；Ｂ：モデル動物群：顕著な心筋線維症および少量の毛細管増殖が見られた；Ｃ：２０μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：心筋における斑状の線維症の変化、有意な毛細管増殖；Ｄ：１０μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：比較的多数の毛細管増殖を伴う顕著な線維症の変化；ならびにＥ：５μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：斑状の線維症の変化および毛細管増殖が見られ得た。 図１７は、モデル動物（ＩＩ）（ＨＥ染色、５０倍）の心筋線維症領域の毛細管増殖に対するｒｈＮＲＧ−１βの影響を示す；Ａ：擬操作群：線維症の変化を有する正常な心筋構造；Ｂ：モデル動物群：顕著な心筋線維症の変化、少数の毛細管増殖が見られ得た；Ｃ：２０μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：心筋における斑状の線維症の変化、有意な毛細管増殖；Ｄ：１０μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：顕著な線維症の変化、比較的多数の毛細管増殖が存在した；ならびにＥ：５μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１β群：斑状の線維症の変化、毛細管増殖が見られ得た。 図１８は、アドリアマイシンによって誘導されるＳＤラット毒性心筋炎の、心筋の病理学的切片を示す；ａ：正常なコントロール群：心筋層の病理スコアは０であった。心筋細胞の萎縮症および肥大が存在せず、小胞の形成を伴い、交差した線状が明らかに見られ得る；心筋層が規則的に配置される；心内膜および心膜の異常性なし；脈管および結合組織の変化なし；ｂ：モデル動物群：心筋層の病理スコアは３であった。大きい面積の心筋細胞の壊死および溶解。 図１９は、モデル動物の生存率に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果を示す。 図２０は、モデル動物の心筋層の構造に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果を示す。 図２１は、ウイルスによって感染されたマウス（Ｉ）における心筋層の病理的損傷に対する、ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の効果を示す；Ａ：正常群；Ｂ：モデル群；Ｃ：プラシーボコントロール群；Ｄ：高投薬レベル群；Ｅ：中程度投薬レベル群；およびＦ：低投薬レベル群。 図２２は、ウイルスによって感染されたマウスにおける心筋層の病理的損傷に対する、ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の効果を示す；Ａ：正常群；Ｂ：モデル群；Ｃ：プラシーボコントロール群；Ｄ：高投薬レベル群；Ｅ：中程度投薬レベル群；およびＦ：低投薬レベル群。 図２３は、ウイルスによって感染されたマウス（Ｉ）における心筋層の病理的変化に対する、異なる日数にわたって投与されたｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の効果を示す（ＨＥ染色、４０倍）；Ａ：正常コントロール群；Ｂ：モデル群；Ｃ：３日間ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の群；Ｄ：５日間ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の群；Ｅ：７日間ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の群。 図２４は、ウイルスによって感染されたマウス（ＩＩ）における心筋層の病理的変化に対する、異なる日数にわたって投与されたｒｈＮＲＧ−１βの効果を示す（ＨＥ染色、４０倍）；Ａ：正常コントロール群；Ｂ：モデル群；Ｃ：３日間ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の群；Ｄ：５日間ｒｈＮＲＧ−１βの群；Ｅ：７日間ｒｈＮＲＧ−１β Ｓ１７７−Ｑ２３７の群。
（Ｈ．実施例）
本発明者らによって開発された組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７７−Ｑ２３７
（ニューレギュリン−１のｒｈＮＲＧ−１β１７７−Ｑ２３７）は、損傷した心筋細胞構
造を修復し得、これらの細胞間の接続を強化し得、心筋機能を改善し得、そして心筋の生
物学的効果を強化し得る。本明細書中に記載される実験は、特定のニューレギュリンフラ
グメント（例えば、ｒｈＮＲＧ−１β１７７−Ｑ２３７）が、心臓血管疾患（例えば、ウ
イルス性心筋炎または拡張型（または鬱血型）心筋症（ＤＣＭ））、特定の治療剤によっ
て引き起こされる心臓毒性、またはインビボでの心筋梗塞の種々の形態を有効に処置し得
、そして正常な動物の血行力学に影響しない。
（実施例１．ｒｈＮＲＧ−１β１７７−Ｑ２３７の組換え産生）
図１。操作された株の構築物の技術的概要
ヒトニューレギュリン遺伝子は、約１３エキソンとともに染色体８Ｐ１２内に位置する
。組換えニューレギュリンフラグメントは、６１アミノ酸から構成される。理論分子量は
、７，０５５Ｄである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動における見かけの分子量は、６，５０
０〜７，０００Ｄである。その等電点は、約６．５である。グリコシル化された遺伝子座
は存在しない。ペプチド構造は、３つのジスルフィド結合を含む。この遺伝子は、Ｅ．ｃ
ｏｌｉにおける発現に適切である。
ＰＥＴ２２ｂは、発現プラスミドとして選択された。ヒトニューレギュリン遺伝子は、
プラスミド内に導入され、次いで、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１は、このプラスミドによって
形質転換された。高レベルの発現組換え体は、組換えヒトニューレギュリンフラグメント
を産生するために操作された株としてスクリーニングされた。
図２。ヒトニューレギュリン遺伝子の増幅
全ＲＮＡおよびｍＲＮＡは、５ヶ月のヒト胎児の脳組織から抽出され、そしてｃＤＮＡ
に逆転写される。ＲＴ−ＰＣＲは、標的遺伝子を増幅するために、テンプレートとして転
写されたｃＤＮＡおよび一対のプライマー
Figure 0006603149
 を用いて実施した。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースにおいて電気泳動で調べた。特定
の１８３ｂｐＤＮＡフラグメントを、アガロースにおいて見出し、その長さは、予期され
た長さと同じであった。
図３。プラスミドＰＥＴ２２ｂの物理的マップ
図４。エンドヌクレアーゼ消化による組換えプラスミドの同定
塩化カルシウム沈降法を、発現プラスミドＰＥＴ２２ｂ内へヒトニューレギュリン遺伝
子をクローニングするために適用して、組換えヒトニューレギュリン発現プラスミド（Ｐ
ＥＴ２２ｂ−ヒトニューレギュリン）を構築した。この遺伝子は、Ｔ７プロモーターの駆
動下で有効に発現された。発現遺伝子のＮ末端は、ＮｄｅＩ遺伝子座に挿入された。Ｃ末
端ターミネーターは、最後のアミノ酸の隣である。発現されたタンパク質は、任意のアミ
ノ酸との融合タンパク質を形成しなかった。正確な１８３ｂｐのフラグメントは、エンド
ヌクレアーゼ消化分析後に得られた。形質転換体は、エンドヌクレアーゼ消化によって特
徴付けられた。二本鎖ＤＮＡを、配列分析のために抽出された。配列決定の結果は、発現
ベクター内に含まれるヒトニューレギュリンの配列が、完全に正確であったことを確認し
た。決定されたｃＤＮＡ配列を、ここに列挙する：
Figure 0006603149
 上記ｃＤＮＡに基づく推定アミノ酸配列は、以下：
Figure 0006603149
 である。
図５。操作された株の発現についてのスクリーニング
ＰＣＲ増幅およびエンドヌクレアーゼ消化分析の後に、操作されたクローン（ＢＬ２１
−ＰＥＴ２２ｂ−ヒト−ニューレギュリン）の単一コロニーを、無作為に取り出し、２ｍ
ｌのＬＢ−Ａｍｐ液体培地中に播種した。培養物を３７℃で一晩インキュベートし、そし
て２５０ｒｐｍで振盪した。次いで、純粋な培養物の割合は、２０ｍｌのＬＢ−Ａｍｐ培
地中に播種された。培養物は、３７℃でインキュベーション後、混濁がＯＤ６００で１．
０に増加するまで、ＩＰＴＧを４時間加えて、発現を誘導した後に、収集された。封入体
は、細胞を破壊した後に、収集された。１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける電気泳動、薄層
走査分析、ウェスタンブロッティング、および反復されたスクリーニングの後に、操作さ
れた株（ＢＬ２１−ＰＥＴ２２ｂ−ヒト−ニューレギュリン）を特徴付け、標的タンパク
質ニューレギュリンの安定高レベル発現を確立した。発現された標的タンパク質は、この
株における全タンパク質の約１０％を占めた。高圧力ホモジネートプロセスの後に、標的
タンパク質は、封入体の形態で存在した。
操作された株を、ＩＰＴＧによる４時間の誘導後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって
分析した。封入体は、全タンパク質の約２０％を占めた。精製された組換えニューレギュ
リン特異的活性は、５×１０３ＥＵ／ｍｇを超え、ニューレギュリン産生株の構築が成功
したことを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、株スクリーニングの段階に
おける生物学的活性分析に加えて、さらなる分析（例えば、ニューレギュリンアミノ酸組
成物分析およびＮ末端配列分析）が実施された。これらの結果は、発現された組換えヒト
ニューレギュリンのアミノ酸配列が、設計されたものと同じであることを示す。
（実施例２．冠状動脈の結紮によって引き起こされるラットにおける心不全に対する組換
えヒトニューレギュリン（Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ）の治療効果）
（１．要約）
（目的）冠状動脈の結紮によって引き起こされるラットにおける心不全に対する組換えヒ
トニューレギュリン−１β（ｒｈＮＲＧ−１β）の治療効果を研究すること。（方法）ラ
ットを開胸し、環状脈の下行枝を左心耳と肺動脈円錐との間の部位で非侵襲性縫合糸で結
紮し、亜急性心不全ラットモデルを準備した。一般的に、結紮の約６日後、左心室の駆出
率は約５０％まで低下した。これらの群を無作為（すなわち、モデル群、試験薬物群（ｔ
ｅｓｔｉｎｇ ｄｒｕｇ ｇｒｏｕｐ）、および偽手術（偽操作）群（開胸のみで冠状動
脈を結紮しなかった）に分けた。各群には１０〜１３の動物が存在し、３つの投薬レベル
の群を試験薬物群について設定した（投薬レベルは、それぞれ、５、１０および２０μｇ
／ｋｇであった）。薬物を、１日１回、連続１０日間、尾部の静脈に注射した。心機能の
決定（心エコー検査）を、薬物の投与の６日前および薬物の投与中止の後に実施し、試験
マウスを、剖検し、心臓の重量を量り、心室壁の厚みを決定し、病理学的検査および血漿
中のレニン−アンジオテンシン−アルドステロンレベルを決定した。（結果）３つの投薬
レベルのｒｈＮＲＧ−１の連続５日の薬物投与後、動物モデルの駆出率（７１．１±１２
．０％、６４．４±１２．９％、６２．９±８．４％）および動物モデルの短縮率（３６
．９±９．７％、３２．０±９．５％、３０．３±６．１％）は、全て増加し、動物モデ
ル群と比較して、２０μｇ／ｋｇ群と、１０μｇ／ｋｇ群との間に有意差があった（Ｐ＜
０．０１）；さらに、２０μｇ／ｋｇモデル群の駆出率の変化は、薬物投与の約３５日後
まで維持され（Ｐ＜０．０５）；ｒｈＮＲＧ−Ｉβの２０μｇ／ｋｇは、心筋の虚血領域
を有意に減少させ、繊維性病変の毛細血管数を増加させ（Ｐ＜０．０５）；ｒｈＮＲＧ−
１βの２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇは、末梢のアンジオテンシンＩ（ＡＩ）、ア
ンジオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、レニン（ＰＲＡ）およびアルドステロン（ＡＬＤ）のレ
ベルを低下させ、これはモデル群と比べた場合に有意差があった（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０
．０５）。連続１０日の注入と連続５日の注入との間には有意差はなかった（Ｐ＜０．０
５）。（結論）特定の用量のｒｈＮＲＧ−１βを連続５日の静脈注入すると、冠状動脈の
結紮によって生じたラットにおける心不全を効果的に処理し得る。
（２．実験の目的）
冠状動脈の結紮によって生じたラットにおける心不全について、ｒｈＮＲＧ−１βの治
療効果を研究すること。
（３．試験薬物）
ｒｈＮＲＧ−Ｉβを、Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ Ｌｔｄ、ロット番号：２００１１０００６−２；濃度：５００μ
ｇ／アンプル；力価決定：５０００ｕ／アンプル；純度：＞９５％（ＨＰＬＣ−Ｃ８）を
調査し、産生した。
（４．実験動物）
４．１ 種、供給源および適応性証明数（ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｅｒｔｉｆｉｃａｔ
ｅ ｏｆ ｃｏｍｐｅｔｅｎｃｙ）：ＳＤラット（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍ
ａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅに
より提供）、適応性証明数：Ｚｈｏｎｇ Ｋｅ Ｙｕａｎ Ｄｏｎｇ Ｇｕａｎ Ｈｕｉ
００３；
４．２ 体重、性別：２００〜２２０ｇ、雄性
（５．試薬および設備）
５．１ 心エコーデバイス、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｏｎｏｓ ５５００
、プローブ型：Ｓ１２；
５．２ ６ 誘導電子生理レコーダーを指導する（Ｓｉｘ ｌｅａｄｓ ｅｌｅｃｔｒ
ｏ−ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ｒｅｃｏｒｄｅｒ）、ＳＭＵＰ−Ｃ−６、Ｓｈａｎｇｈａｉ
医科大学の生理学部によって製造された；
５．３ 電子バランス、Ｍａｔｅｌｅｒ−Ｔｏｌｉｄｏ設備（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｃｏ
Ｌｔｄ；
５．４ 冠状静脈留置ニードル、２０Ｇ、Ｓｉｎｏ−Ａｍｅｒｉｃａ Ｗｅｎｇ Ｚｈ
ｏｕ Ｈｕａ Ｌｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙによって製
造された；
５．５ 微小副尺付きカリパス（Ｍｉｃｒｏ−ｖｅｒｎｉｅｒ ｃａｌｉｐｅｒｓ）、
Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅ ＆ Ｋｎｉｆｅ Ｆａｃｔｏｒｙ；
５．６ 放射性−免疫γ係数器（Ｒａｄｉｏ−ｉｍｍｕｎｅγ ｃｏｕｎｔｅｒ）、Ｇ
Ｃ−１２００、Ｚｈｏｎｇ Ｊｉａ Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ
Ｂｒａｎｃｈ ｏｆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｃｈｉｎａ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；
５．７ レニン、アンジオテンシンキット、ＡＩ：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｔｈ Ｂｉ
ｏ−Ｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ロット番号：０２１０；
全て：Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｎｏｒｔｈ Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、ロット番
号：２０２８；
５．８ 脱毛剤、８％硫酸ナトリウム、Ｘｉ Ｌｏｎｇ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｐｌａｎ
ｔ ｏｆ ＧｕａｎｇＤｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、ロット番号：０１０６２２；
５．９ 塩酸ケタミン、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｚｈｏｎｇ Ｘｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ
ｉｃａｌｓ Ｃｏ Ｌｔｄによって製造された、ロット番号：２００２０４０１。
（６．実験方法）
６．１ 実験群
偽手術（偽操作）群、モデル群および試験薬物群を準備した。
偽手術（偽操作）群（ｎ＝１０）（すなわち、冠状動脈を結紮しない開胸術）；モデル
群（ネガティブコントロール群）（ｎ＝１２）：調製物のビヒクルを注入した（１０ｍＭ
ＰＢ， ０．２％ ヒト血清アルブミン，５％ マンニトール）；試験薬物群（ｎ＝１
３）：ｒｈＮＲＧ−１β（３つの投薬レベル）、２亜群を各投薬レベル群について設定し
た；１つの群を、薬物投与後の長期間のモニタリングに使用した。
６．２ 試験薬物および薬物調製物の投薬準備、投薬経路、注入時間、投薬される濃度お
よび容積。投薬レベル群（高（２０μｇ／ｋｇ）、中（１０μｇ／ｋｇ）、低（５μｇ／
ｋｇ））を、予備実験の結果によって設定した。薬物を、調製緩衝溶液（１０ｍＭ ＰＢ
、０．２％ヒト血清アルブミン、５％マンニトール）で必要な濃度に希釈した
薬物投与経路：試験薬物群とモデル群の両方において、薬物を、尾部静脈に連続５日の
間、１日１回注入した。心エコー検査を薬物投与の６日前に実施し、次いで、５日間にわ
たって連続的に注入した。各薬物注入の容積は、０．４ｍｌ／ｌ００ｇ体重であった。
６．３実験方法
６．３．１ 冠状動脈の前下行枝の結紮によって心不全ラットモデルを準備する
１００ｍｇ／ｋｇケタミンの腹腔内投与での麻酔後、ラットを仰臥位に固定し、除毛後
、ブロモ−ゲラミン（ｂｒｏｍｏ−ｇｅｒａｍｉｎｅ）で頸部領域を消毒した。正中切開
し、前頚部筋肉組織を分離した後に気管を見出し、１８Ｇの動脈留置套管針（ｔｒｏｃｈ
ａｒ）を、３〜５気管軟骨のレベルで気管に注入し、スタイレットを取り出し、プラスチ
ックカニューレを１〜２ｃｍ気管にさらに挿入し、小さな動物については、後でベンチレ
ータと接続するために固定した（換気堆積は約２０ ｍｌ、頻度は８０／ｍｉｎである）
。左前胸壁皮膚を開いた後、筋肉を分離し、４番目および５番目の肋骨を露出させ、カー
ブ鉗子で胸壁を貫通し、肋骨下の組織を分離し、ベンチレータと接続し、心臓を露出させ
、肺の拡張および心拍をモニタリングし、心膜を裂き、上方の脂肪パッド（ｆａｔ ｐａ
ｄ）を上向きにし、左耳介および肺円錐体を完全に露出し、医学的使用の間、２つの部分
の間で左冠状動脈を６／０非侵襲性縫合糸で結紮した。梗塞を起こした心筋領域（約８ｍ
ｍ×８ｍｍ）は、紫色になり、結紮後、著しく有意に減少した活性を示した。次いで、胸
壁を閉じ、肺を膨張させるためにベンチレータの開口を遮断し、空気を追い出すように胸
部を強く押し、次いで、胸筋および皮膚を縫合した。呼吸をモニタリングし、自発的な呼
吸が回復した後、ベンチレータを取り外し、飼育のために動物をケージに戻した。偽手術
（偽操作）群では、冠状動脈の結紮はせず、心膜を裂いて開いただけである。手術したラ
ットに、手術の約６日後に心エコー検査を実施した。ＥＦ値が約５０％低下した動物を、
無作為に群分けし、各々の群のＥＦ値を全て約５０％にし、次いで薬物投与を始めた。
６．３．２ 薬物動態実験
約５０％のＥＦ値を有する動物を、無作為にモデル群（ネガティブ群）および３つの投
薬レベルの試験薬物群（各群１２〜１３匹の動物）に、分けた。試験薬物群およびモデル
群の薬物投薬経路は、尾部静脈への注入であり、連続５日間、１日１回であった。６日目
の心エコー検査後、もう５日の薬物連続投与を実施した。各注入用量は、０．４ｍｌ／１
００ｇ体重であった。
心エコー検査を、薬物投与の終了後に再度実施し、これらの動物を剖検し、心臓重量を
量り、心室壁の厚みを決定し、心臓の病理検査を実施し、末梢血を採取し、血漿を分離し
、そしてレニン−アンジオテンシンアルドステロンを測定した。
種々の群のいくつかの試験動物を、長期モニタリングのために残した。
６．３．３観察指標
６．３．３．１ 心機能の測定
心エコー検査を、結紮後であり、かつ薬物投与の前、薬物投与の６日後、薬物投与の１
１日後に、ケタミンを用いた麻酔下に実施した。主要な指標は、以下が挙げられる：
ＥＦ：心駆出率、心室の駆出機能を反映する；
ＦＳ：心室短軸短縮率、心室の収縮機能を反映する；
ＬＶＤｄ：左心室の拡張期最大内径（ｃｍ）；
ＬＶＤｓ：左心室の収縮期最小内径（ｃｍ）
６．３．３．２ 血漿中のレニン−アンジオテンシン−アルドステロンの含有量の決定
これは、Ｆｕｄａｎ大学と提携したＲａｄｉｏ−ｉｓｏｔｏｐｅ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎ
ｔ ｏｆ Ｚｈｏｎｇ Ｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌによって実施されたことを提示した
。
頸動脈瀉血を、試薬キットの指示に従って、実施して血漿を抽出し、凍結させ、そして
−２０℃で保存した。レニン活性（ＰＲＡ）、アンジオテンシンＩ（ＡＩ）、アンジオテ
ンシンＩＩ（ＡＩＩ）およびアルドステロン（ＡＬＤ）の含有量を、免疫アッセイで決定
した。
６．３．３．３ 心筋の病理組織学切片
Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎ
ｇ ＣｅｎｔｅｒのＷａｎｄ Ｂｉｎｇ Ｓｅｎｇ教授が実施した。
１０％ホルムアルデヒドで固定した後、ラットの心筋を、長軸方向に同じ距離で３つの
スライスに切断し、パラフィンに包埋して切片を作製し、ＨＥ染色し、心臓の線維性領域
について画像分析し、線維性病巣における毛細血管数を数え（計数単位：標本／ｍｍ２）
；Ｎａｇａｒ−Ｏｓｌｅｎ染色し、心筋における虚血性低酸素領域の大きさを研究した。
（７．データ処理）
ｔ検定を、収集された実験データについて実施した。
（８．実験結果）
８．１ ラットの虚血性心臓の機能に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
薬物投与の５日後に実施した心エコーの結果は、モデル群のＥＦ値（５０．２±８．４
％）およびＦＳ値（２２．４±４．６％）は、偽手術（偽操作）群のＥＦ（９１．１±２
．４％）およびＦＳ（５７．３±３．９％）よりも有意に低く、有意差がある（Ｐ＜０．
０１）ことを示した。試験薬物群（２０、１０および５μｇ／ｋｇ）のＥＦ値（７１．１
±１２．０％、６４．３±１２．８％、６２．９±８．４％）とＦＳ値（３６．９±９．
７％、３２．０±９．５％、３０．３±６．１％）の両方は、一旦有意に増加し、モデル
群と比較した場合に有意差があった（Ｐ＜０．０１）。
薬物１０日後に繰り返した心エコー検査の結果は、ＥＦ値（４２．７±６．４％）およ
びＦＳ値（１８．３±３．２％）が、偽手術（偽操作）群のＥＦ（９５．０±２．８％）
およびＦＳ（６５．３±６．８％）よりも依然として有意に低く、有意差（Ｐ＜０．０１
）があることを示した。試験薬物群（２０、１０および５μｇ／ｋｇ）のＥＦ値（７５．
７±１０． ８％、６１．４±１５．０％、５９．２±１２．４％）およびＦＳ値（４１
．３±１１． ０％、３０．３±１０．４％、２８．４±８．６％）は、依然として相対
的に高レベルで維持され、モデル群と比較した場合、有意差があった（Ｐ＜０．０１）。
しかし、薬物投与の５日目の結果と比べた場合、有意差はなかった。表１〜６は、２つの
実験の結果を示した。
モデル動物群、ならびに薬物投与の５日後および薬物投薬中止の３５日後試験薬物群に
おける、ラット心臓のＥＦ値についての観察を実施し、その結果は、２０μｇ／ｋｇ ｒ
ｈＮＲＧ−１β群のラット心臓ＥＦ値が、相対的に高レベルで安定に維持され、モデル動
物群と比べた場合に、有意差（Ｐ＜０．０５）を有することを示した（表７）。
（表１．心不全モデル動物（１）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投与
前の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表２．心不全モデル動物（１）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投与
５日後の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
 ＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表３．心不全モデル動物（１）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投与
１０日後の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表４．心不全モデル動物（ＩＩ）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投
与１０日後の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
 ＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表５．心不全モデル動物（ＩＩ）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投
与５日後の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表６．心不全モデル動物（ＩＩ）を生じる冠状動脈の前下行枝の結紮における、薬物投
与１０日後の心機能の測定パラメータ）
Figure 0006603149
 ＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
（表７．モデル動物における薬物投与の５日目および薬物投与中止の３５日後に測定した
心機能のＥＦ値）
Figure 0006603149
 ＊Ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１、モデル動物群と比較した場合
８．２ モデルラット心筋の病理組織学に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
８．２．１ モデル動物における心筋虚血および低酸素症の重傷度に対するｒｈＮＲＧ
−１βの効果
Ｎａｇａｒ−Ｏｓｌｅｎで染色した切片において、正常な心筋は淡黄色に染まるが、虚
血性領域は、赤茶色に深く染まった。虚血性低酸素症は、この方法で分析および定量的試
験および半定量的試験の比較がなされ得る。
図６〜１５は、種々の試験群の病理組織学的変化を示した。モデル群の心筋は深い色に
染まり、心筋の大きなパッチは赤色に染まるが、偽手術（偽操作）群の心筋は、赤色に染
まった領域はなく、黄色に染まり；２０μｇ／ｋｇ ｒｈＮＲＧ−１βの赤色に染まった
心筋細胞は、途切れた分布（ｐｕｎｃｔｕａｔｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を示し；
１０μｇ／ｋｇおよび５μｇ／ｋｇ群の赤色に染まった組織は、一様でない分布を示した
。このことは、ｒｈＮＲＧ−１βが、虚血性低酸素症損傷の重傷度を軽減し得ることを実
証した。
（８．２．２ モデルラットの虚血心筋の線維芽領域における毛細管再生に対するｒｈ
ＮＲＧ−１βの効果）
種々の試験群の心筋組織における毛細管数の変化を、Ｌｅｉｃａ画像分析システムを用
いて研究した。ｒｈＮＲＧ−１βを用いた試験薬物群のモデル動物の心筋の線維性病変に
おける毛細管数の増加が存在することが結果から明らかとなり、２０μｇ／ｋｇの用量レ
ベルと、モデル群との間に有意差が存在し（Ｐ＜０．０１）、１０μｇ／ｋｇおよび５μ
ｇ／ｋｇの用量レベルの群と、モデル群との間には、統計的に差が見られず、このことは
、高用量のｒｈＮＲＧ−１β（２０μｇ／ｋｇ）が、ラットにおける冠動脈の結紮後に、
心筋の線維性病変における毛細管の増殖を促進し得ることを示す（表８、図１６および１
７）。
（表８ モデル動物の心筋線維性領域における毛細管再生に対するｒｈＮＲＧ−１βの
効果）
Figure 0006603149
 ＊＊Ｐ＜０．０１（モデル群と比較した場合）
（８．３ モデル動物における血漿中レニン−アンギオテンシン−アルドステロンレベ
ルに対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
血漿中のレニン（ＰＲＡ）、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、アンギオテンシンＩＩ（Ａ
ＩＩ）、およびアルドステロン（ＡＬＤ）のレベルを、ラジオイムノアッセイを用いて、
種々の試験薬物群において決定した。モデル動物群において、結果は、ＰＲＡ、ＡＩ、Ａ
ＩＩおよびＡＬＤがそれぞれ、３．５０６±１．７８ｎｇ／ｍｌ．ｈ、１０．６５５±１
．１８ｎｇ／ｍｌ、１３６６．３８±５７７．３３ｐｇ／ｍｌおよび１．７３８±０．３
４ｎｇ／ｍｌであったことを示した。擬操作群の結果（１．３１５±０．９６ｎｇ／ｍｌ
、８．１２５±１．５７ｎｇ／ｍｌ、５６４．３７±２７３．５６ｐｇ／ｍｌおよび１．
１１３±０．４５ｎｇ／ｍｌ）と比較すると、含量は有意に増加し、その差は統計的に有
意であった（Ｐ＜０．０５）。
血漿中のＡＩ（７．４０±１２．１５ｎｇ／ｍｌ、７．６５±１．４０ｎｇ／ｍｌ）お
よびＡＩＩ（６４１．４７±２８３．８６ｐｇ／ｍｌ、４６８．５８±１６５．１０ｐｇ
／ｍｌ）のレベルは、有意差（Ｐ＜０．０１）を伴って、２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ
／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１β群において有意に減少した。ＰＲＡ（１．３３７±１．０９ｎ
ｇ／ｍｌ．ｈ、１．０７５±１．５０ｎｇ／ｍｌ．ｈ）およびＡＬＤ（１．０２±０．２
７ｎｇ／ｍｌ、１．２６±０．３８ｎｇ／ｍｌ）もまた有意に減少し、モデル群のものと
比較すると、有意差（Ｐ＜０．０５）が存在した。しかし、擬操作群のものと比較すると
、この差は統計的に意味を有さず（Ｐ＞０．０５）、このことは、特定の用量レベルのｒ
ｈＮＲＧ−１βが、その冠動脈を結紮した後に、ラットにおける血漿中のＰＲＡ、ＡＩ、
ＡＩＩおよびＡＬＤの含量を減少し得ることを示す（表９）。
（表９ 種々の試験群モデル動物における、血漿中のレニン（ＰＲＡ）、アンギオテン
シンＩ（ＡＩ）、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）およびアルドステロン（ＡＬＤ））
Figure 0006603149
 ＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１（モデル群と比較した場合）
（９．結論）
モデルコントロール群の拍出画分（５０．２±８．４％）と短縮画分（２２．４±４．
６％）を比較すると、連続した５日間注射された、３つの用量レベルのｒｈＮＲＧ−１β
は、拍出画分（７１．１±１２．０％、６４．４±１２．９％、６２．９±８．４％）お
よび短縮画分（３６．９±９．７％、３２．０±９．５％、３０．３±６．１％）を上昇
し得、２０μｇ／ｋｇと１０μｇ／ｋｇとモデル動物群との間に有意差が存在し（Ｐ＜０
．０１）、さらに、試験薬物群のモデル動物における拍出画分の変化は、薬物投与後約３
５日間、維持され得る（Ｐ＜０．０５）；２０μｇ／ｋｇのｒｈＲＮＧ−１βは、心筋の
虚血性低酸素領域を有意に減少し得、線維性病変における毛細管数を増加し得る（Ｐ＜０
．０５）；２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の末
梢血液におけるアンギオテンシンＩ（ＡＩ）、アンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）、レニン
（ＰＲＡ）およびアルドステロン（ＡＬＤ）のレベルを減少し得、モデル動物群のものと
比較した場合、有意差を有する（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。連続した１０日の薬物
投与と、連続した５日の薬物投与との間には有意差は存在しなかった（Ｐ＜０．０５）。
実験の結果は、連続した５日間、静脈内に注射された特定の用量の２０μｇ／ｋｇのｒ
ｈＮＲＧ−１βは、冠動脈の結紮によって生じたラットの心不全を効果的に処置し得るこ
とを示した。
（実施例３ ＳＤラットにおいてアドリアマイシンにより引き起こされた心不全に対す
る、２０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βの治療効果）
（１．要約）
（目的） ラットにおいてアドリアマイシンに予引き起こされた毒性心筋炎に対する、
２０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βの治療効果を研究すること。（方法） ３．３ｍｇ／
ｋｇのアドリアマイシンを、１週間毎の連続４回の注射で、ＳＤラットの尾静脈に注射し
、アドリアマイシンが引き起こすＳＤラットの毒性心筋炎モデルを準備した。３つの用量
レベルのｒｈＮＲＧ−１β群を準備し、これらに、１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよ
び４０μｇ／ｋｇを、連続した１０日間、１日あたり１回（ｑｄ）、静脈内に注射した。
動物の生存をモニタリングした：血流動的指数、心臓重量／体重の比、心筋の病理学的検
査を実験の終わりにモニタリングし、血清中のトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルもまた決
定した。（結果） ４０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇの用量レベル
のｒｈＮＲＧ−１β群の生存率は、モデル動物の１５％の生存率と比較して、有意に上昇
し、それぞれ、８５％、９０％および６０％に達した。試験薬物の高用量レベル、中用量
レベルおよび低用量レベルの群のｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔおよびＬＶＰｍａｘは、有意
に上昇し、ｄｐ／ｄｔはそれぞれ、５９５４±６８９、６１０７±４１８および４８７５
±６３６に達し、−ｄｐ／ｄｔはそれぞれ、−４７９４±９５４、−４３２３±４５７お
よび−３６７２±８８４であり、ＬＶＰｍａｘはそれぞれ、１６５．７２±２２．７、１
５６．１±１７．７および１４５±１５．２であり、モデル動物群と比較した場合、有意
差（Ｐ＜０．００１）が存在し、さらに、４０μｇ／ｋｇおよび２０μｇ／ｋｇの用量群
と、１０μｇ／ｋｇの用量群との間のｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔ、ＬＶＰｍａｘには有意
差が存在し（Ｐ＜０．０５）、いくらか用量依存性であった；４０μｇ／ｋｇ、２０μｇ
／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物における心筋損傷の重篤
度を効率的に改善し得、かつ、血漿中のトロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルを減少し得、こ
れらは、それぞれ、０．０２５±０．０１１、０．０３１±０．００６および０．０７４
±０．０２４であり、モデル群の０．２０５±０．０７２と比較した場合、有意差があっ
た（Ｐ＜０．０１）。（結論） ２０μｇ／ｋｇのｒｈＮＧ−１βは、ラットにおいてア
ドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋損傷を効率的に処置し得る。
（２．実験の目的）
ラットにおいてアドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋炎に対するｒｈＮＲＧ
−１βの治療効果を研究するため。
（３．試験薬物）
ｒｈＲＮＧ−１β、Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ．Ｌｔｄ製。バッチ番号：２００１１０００６
−２ 規格：５００μｇ／アンプル。力価測定：５０００ｕ／アンプル；純度：＞９５％
（ＨＰＬＣ−Ｃ８）。
（４．実験動物）
ＳＤラット：Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ Ｆｕｄ
ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅより提供された、動物適
格性の証明書番号：Ｙｉ Ｄｏｎｇ Ｚｉ ０２−２２−１１。体重２５０±３０ｇ、雄
性。動物を、ランダムに群（各群２０匹の動物）に分け、別々のケージで飼育した。動物
室の温度は１８〜２２℃であり、相対湿度は５０％〜７０％であった。
（５．試薬および設備機器）
６リード電気−生理学的レコーダー（Ｓｉｘ ｌｅａｄｓ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｐｈｙｓ
ｉｏｌｏｇｙ ｒｅｃｏｒｄｅｒ）、ＳＭＵＰ−Ｃ−６（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ製）
；
エネルギー交換器（Ｊａｐａｎ Ｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ Ｉｎｄｕｓｔｒ
ｙ Ｃｏｍｐａｎｙ、ＮＩＨＯＮ ＫＯＨＤＥＮ、モデル：ＴＰ−４００Ｔ）；
電気化学発光自動免疫分析装置（モデル２０１０）：Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ Ｃｏ Ｌｔｄ、バッチ番号１５８４６８；
精密電気天秤（Ｐｒｅｃｉｓｉｖｅ ｅｌｅｃｔｒｏ−ｂａｌａｎｃｅ）、（Ｍａｔｅ
ｌｅｒ−Ｔｏｌｉｄｏ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ Ｌｔｄ；Ｍａｘ：６１０ｇ ｄ＝０
．０１ｇ）；
マイクロスケールノギス（Ｈａｒｂｉｎ Ｍｅａｓｕｒｅ＆Ｋｎｉｆｅ Ｆａｃｔｏｒｙ
、０．０５ｍｍ）；
動静脈留置針、２０Ｇｍ（Ｓｉｎｏ−Ａｍｅｒｉｃａ Ｗｅｎｇ Ｚｈｏｕ Ｈｕａ
Ｌｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ製）；
血清トロポニン測定のための試薬キット（Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｄｉｇｎｏｓｔｉｃ Ｉｎ
ｃ．）。
（６．実験方法）
（６．１ 実験のグループ分け）
正常なコントロール群、モデル動物群および試験薬物群を準備した；モデル群（ネガテ
ィブコントロール群）：アドリアマイシン（ＭｉｎｇＺｈｉ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃ
ａｌｓ製；ＳｈａｎＴｏｕ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｅｃｏｎｏｍｙ Ｐｒｅｆｅｃｔｕｒｅ（
バッチ番号：０００２０１、有効期限：２００３年２月）；試験薬物群：ｒｈＮＲＧ−１
β群。
（６．２ 用量の設定、試験薬物の調製、薬物の投薬経路、薬物の投与回数、試験薬物
の濃度および容量）
試験薬物群の１０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよび４０μｇ／ｋｇの３つの用量レベ
ルを設定した。１ｍｌの注射用水で溶解し、賦形剤で必要な濃度に調節した。賦形剤の主
要な成分は、５％マンニトール（注射用）、０．２％ヒト血清アルブミン（注射用）、１
０ｍＭ リン酸緩衝溶液（Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏ Ｌｔｄ．製）であった。試験薬物を注射
前に調製した。
アドリアマイシンの初回注射後、２４時間以内に、ｒｈＮＲＧ−１βを尾静脈に注射し
、ｒｈＮＲＧ−１βの注射を、１０日間にわたって、１日１回実施した。用量は、体重に
よって調節し、投与される薬物の容量は、０．２ｍｌ／１００ｇであった。
（６．３ 実験方法）
（６．３．１ 動物心不全モデルの構築方法）
＜＜Ｇｕｉｄａｎｃｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ ｏｆ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ｐｒｅｃｌｉ
ｎｉｃａｌ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ＞＞に基づいて、３．３ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシ
ンを、連続４回にわたって、１週間に１回の注射で、尾静脈に注射し、アドリアマイシン
が引き起こした毒性心筋炎ラットモデルを確立した。
（６．３．２ 薬力学的実験）
アドリアマイシンの初回注射の後、２４時間以内に、ｒｈＮＲＧ−１βを尾静脈に注射
した。実験の間、動物の生存を、動力学的にモニタリングし、心臓機能指数（左心室内の
圧増加の最大速度であるｄｔ／ｄｐｍａｘ、左心室内の圧減少の最大速度である−ｄｐ／
ｄｔ、左心室の収縮期圧であるＬＶＰｍａｘ、左心室の拡張期圧であるＬＶＰｍｉｎ）を
、５週目にモニタリングした。心臓組織から切片を作製し、病理学的変化を試験した。
（６．３．３ 観察指数）
（６．３．３．１ 生存率）
生存の状況を毎週記録し、種々の実験群の生存率を算出した。生存率（％）＝生存動物
数／実験動物数 ×１００
（６．３．３．２ 心臓の重さ／体重の比、心臓組織の病理学的切片）
開胸術（心耳は取っておかれる）の後、心臓を摘出し、吸収紙で乾燥させた後、心臓の
重さを測定し、心臓の重さ／体重の比を算出した；心臓の外径を、垂直に立っている心臓
の１／２の部位で測定した；左心室の中間部分を横方向に切開し、左心室の遊離壁（ｆｒ
ｅｅ ｗａｌｌ）の最大厚を測定した；心臓を１０％ホルムアルデヒドで固定し、パラフ
ィン包埋し、ＨＥ染色し、光学顕微鏡下で心筋構造の観察を行って、病理学的スコアを割
り当てた。
（病理学的スコア付けの基準：）
グレード０：正常な心筋構造、心筋細胞の萎縮または肥大を伴わず、液胞および横紋は
はっきりとしている；心筋の規則正しい配列；異常のない心内膜および心膜；血管および
間質組織に変化はない。
グレード１：心筋細胞質の病巣溶解と、液胞の形成が、散在した個々の心筋細胞におい
て見られ、一方で、隣接する心筋細胞は依然として正常に見えた。
グレード２：心筋細胞質の萎縮、溶解および液胞の形成が、小〜中程度のクラスター形
成した心筋細胞において見られ、心筋細胞の小さな病巣壊死がまた見られた。
グレード３：心筋細胞の広い範囲の散在性の萎縮と、細胞質の溶解、または、極めて顕
著な壊死を伴う液胞の形成。スコア付けは、グレード１とグレード２の間、またはグレー
ド２とグレード３の間（例えば、グレード１．５、グレード２．５など）で行われ得る。
（６．３．３．３ 血行動態指数の決定）
血行動態指数（例えば、頚動脈圧、心室内圧、ｄｐ／ｄｔ）を、６リード電気−生理学
的レコーダーで測定した。主な手順：右頚動脈を分離し、その遠位端で結紮し、動脈クラ
ンプでその近位端をブロックし、２０Ｇ動静脈留置針を頚動脈に挿入して、メダル探針を
摘出し、動脈クランプを緩めてプラスチック套管針をさらに適切な深さまで押し込み、１
０分間留置して、生理学的レコーダーにより記録された波形を観察し、波形が安定した後
に、頚動脈圧を記録し、そして、左心室へとさらに套管針を押し込み、適所に１５分間維
持して、波形が安定した後に、ｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔ、ＬＶＰｍａｘおよびＬＶＰｍ
ｉｎを記録した。
（６．３．３．４ 血清トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルの決定）
２ｍｌの動脈血を回収し、血清を抽出して、凍結し、−２０℃にて保存し、Ｃｌｉｎｉ
ｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｚｈｏｎｇ Ｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌによっ
て実施されているように提示された、電気化学照射法を用いて、血清ｃＴｎＴ含量の決定
を行った。
（７．データ処理）
データをＸ±ＳＤとして表した。群間の差を、一階乗分散分析（ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒ
ｉａｌ ｖａｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を用いて分析した。
（８．実験の結果）
（８．１ アドリアマイシンは、ラットにおいて心不全を合併した毒性心筋炎を誘導し
得る）
表１０および図１８を参照のこと。３．３ｍｇ／ｋｇのアドリアマイシンを、４連続の
毎週一回の注射で、静脈内注射した。５週後、動物の生存率は１５％であり、生存してい
るラットにおいて有意な心臓機能の障害が見られた。これらのｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔ
、ＬＶＰｍａｘ、ＬＶＰｍｉｎは、それぞれ、正常値の４３％、４７％、５８％および３
７％であった。心筋組織の病理学的スコア付けは、２．３３±０．２６であり、相対罹患
率は１００％であった。血清ｃＴｎＴは、有意に増加して０．２ｎｇ／ｍｌに達し、この
ことは、アドリアマイシンにより引き起こされた毒性心筋炎と結果として生じる心不全の
動物モデルが、首尾よく確立されたことを示す。
（表１０ アドリアマイシンにより誘導された毒性心筋炎ラットモデルの種々の決定指
数（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ））
Figure 0006603149
Figure 0006603149
ｎ＝２０、Ｘ±ＳＤ、正常群と比較した場合の分散分析、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．
００１。
図１８は、アドリアマイシンにより誘導されたＳＤラットの毒性心筋炎の心筋の病理学
的切片を示す；ａ：正常なコントロール群：心筋の病理学的スコアは０であり、心筋細胞
の萎縮および肥大は伴わず、液胞の形成が見られ、横紋がはっきりと見られ得る；心筋は
規則正しく整列していた；心内膜および心膜の異常なし；脈管および間質組織の変化なし
；ｂ：モデル動物群：心筋の病理学的スコアは３であった、広い領域の心筋細胞の壊死お
よび溶解。
（８．２モデル動物の生存率におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
この結果は、延長された実験時間でｒｈＮＧＲ−１βの３つ全ての投薬レベルが、モデ
ル動物の死亡率を有意に減少させ、２０μｇ／ｋｇの投薬群のモデル動物の生存率が９０
％に達したことを示した（Ｐ＜０．０１）（図１９）。
（８．３モデル動物の心臓機能におけるｒｈＮＲＧ−１の効果）
薬物投与の後、全ての試験薬物群動物のｄｐ／ｄｔおよびＬＶＰｍａｘは、いくらか上
昇した。ＳＰＳＳソフトウェアでの一因数変数分析（ｍｏｎｏｆａｃｔｏｒｉａｌ ｖａ
ｒｉａｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ）を通して、内部群比較が、試験薬物群動物のｄｐ／ｄ
ｔおよび−ｄｐ／ｄｔがモデル動物群のｄｐ／ｄｔおよび−ｄｐ／ｄｔと比べて有意に高
く（Ｐ＜０．００１）、コントロール群のｄｐ／ｄｔおよび−ｄｐ／ｄｔと比較した場合
、その差は有意ではない（Ｐ＞０．０５）ことを示した。４０μｇ／ｋｇおよび２０μｇ
／ｋｇの投薬群のｄｐ／ｄｔおよび−ｄｐ／ｄｔは、１０μｇ／ｋｇの投薬群のｄｐ／ｄ
ｔおよび−ｄｐ／ｄｔより有意に高く（Ｐ＜０．０１）；試験薬物群のＬＶＰｍａｘ（４
０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇ）は、同様にモデル動物群のｄｐ／
ｄｔおよび−ｄｐ／ｄｔより有意に高く（Ｐ＜０．００１）、さらに、種々の試験薬物群
の間の差は、統計的に有意であり（Ｐ＜０．０５）、ｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の
心臓機能を改善するのに効果的であり得、用量依存性であることを示した。２つの実験の
結果は、一致した（表１１および表１２）。
（表１１．モデル動物（Ｉ）の心臓機能におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 ＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１（モデル動物群と比較した場合）
（表１２．モデル動物（ＩＩ）の心臓機能におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１（モデル動物群と比較した場合）
（８．４モデル動物の心筋構造におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
ｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の心筋細胞損傷の重篤度を有意に減少し、病理学上の
スコアを有意に減少し、その差は、モデル群のものと比較した場合に統計的に有意であっ
た（ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）。表１３および表１４ならびに図２０は、２つの実験
の結果を示した。
（図２０．モデル動物の心筋構造のｒｈＮＲＧ−１βの効果）
ａ：モデル動物心筋病理学的スコアは３であった、心筋細胞壊死および崩壊の大きな領
域；ｂ：４０μｇ／ｋｇ試験薬物群、心筋病理学的スコアは１であり、心筋細胞のほとん
どは正常であり、散在性心筋細胞中の局所的心筋細胞質崩壊が存在した；ｃ：２０μｇ／
ｋｇ試験薬物群、心筋病理学的スコアは１であり、心筋細胞のほとんどは正常であり、散
在性心筋細胞中の局所的心筋細胞質崩壊が存在した；ｄ：１３０μｇ／ｋｇの試験薬物群
、心筋病理学的スコアは１．５であり、小胞変性が、心筋細胞の小さなクラスター中で見
られた。
（表１３．モデル動物（Ｉ）の心筋病理学的変化におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（モデル動物群のスコアと比較した場合）
（表１４．モデル動物（ＩＩ）の心筋病理学的変化におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 ＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（モデル動物群のスコアと比較した場合）
（８．５モデル動物の血清ｃＴｎＴにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
薬物投与の後、血清ｃＴｎＴ含有量は、各々の動物群において有意に減少し、血清ｃＴ
ｎＴの高い、中間の、および低い投薬レベル群は、モデル群より有意に低かった（Ｐ＜０
．００１）。これら２つの実験の結果は、一致した（表１５および表１６）。
（表１５．モデル動物（Ｉ）の血清ｃＴｎＴにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 ＊＊ｐ＜０．００１（モデル動物群のｃＴｎＴと比較した場合）
（表１６．モデル動物（ＩＩ）の血清ｃＴｎＴにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 ＊＊ｐ＜０．００１（モデル動物群のものと比較した場合）
（８．６モデル動物の心臓サイズにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
表１８は２つの実験の結果を示した。試験薬物群の心臓身体的パラメーターにおける有
意な変化はなく、群の間の差は、統計的に有意でなかった（Ｐ＞０．０５）。
（表１７．モデル動物（Ｉ）の心臓のサイズにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
＊＊ｐ＜０．０１（モデル動物群と比較した場合）
（表１８．モデル動物（ＩＩ）の心臓のサイズにおけるｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 ＊＊ｐ＜０．０１（モデル動物群と比較した場合）
（９．結論）
４０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１は、生存率を
有意に改善し、モデル群の１５％の生存率と比較して各々８５％、９０％および６０％に
達した；ｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔおよびＬＶＰｍａｘの高い、中間の、および低い投薬
レベル群は、有意に増加し、ｄｐ／ｄｔは、各々５９５４±６８９、６１０７±４１８、
４８７５±６３６であった。−ｄｐ／ｄｔは、各々−４７９４±９５４、−４３２３±４
５７、−３６７２±８８４であった。そしてＬＶＰｍａｘは、それぞれ１６５．７±２２
．７、１５６．１±１７．７、１４５±１５．２であった。コントロール群と比較する際
に有意な差が存在した（Ｐ＜０．００１）。さらに、４０μｇ／ｋｇおよび２０μｇ／ｋ
ｇの投薬群のｄｐ／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔおよびＬＶＰｍａｘは、１０μｇ／ｋｇ群のｄｐ
／ｄｔ、−ｄｐ／ｄｔおよびＬＶＰｍａｘと有意に異なり（＜０．０５）、そしてある程
度用量依存性であり；４０μｇ／ｋｇ、２０μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲ
Ｇ−１βの３つ全ての用量レベルは、モデル動物における心筋損傷の重篤度を効果的に軽
減し、血清トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）含有量を減少し、各々０．０２５±０．０１１、０
．０３１±０．００６および０．０７４±０．０２４であり、モデル動物群の０．２０５
±０．０７２と比較した場合、有意な差が存在した（Ｐ＜０．０１）。
実験の結果は、ｒｈＮＲＧ−１βが、ｃＴｎＴの減少した血清放出および心筋線維壊死
を介してラットにおけるＡｄｒｉａｍｙｃｉｎによる毒性心筋障害を効果的に処置し得、
心臓の収縮機能を改善し、動物の死亡率を減少させたことを示した。
（実施例４ マウスにおけるウイルス感染によって引き起こされる急性心筋損傷におけ
るｒｈＮＲＧ−１βの治療効果）
（１．要旨）
目的：ウイルス（Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ３）感染により引き起こされる急性心筋損傷
におけるｒｈＮＲＧ−１βの治療効果を研究すること。方法：Ｍマウス（Ｍｍｏｕｓｅ）
急性ウイルス心筋モデルが、Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｂ３ウイルス（ＣＶＢ３）の腹内感染
を介して確立した。モデル動物を、以下の群に無作為に分割した：すなわち、正常なコン
トロール群、モデル群、試験薬物群（各々の群は２０匹の動物を有する）。ｒｈＮＲＧ−
１βの３０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇ、および７．５μｇ／ｋｇの３つの投薬レベルが
確立され、尾静脈中に注入され、これは、連続した５日間の間の同じ日に実行された。実
験の間、動物生存率をモニタリングした。心臓機能試験（心エコー検査）を７日目に実施
し、８日目にその動物を殺し、血清をトロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベル決定のために抽出
し、そして心臓病理学的試験を実施した。結果：３０μｇ／ｋｇおよび１５μｇ／ｋｇの
両方の群のＥＦ値（９０．２±２．５％、８６．０±２．９％）およびＦＳ値（５５．７
±２．１％、５０．７±４．３％）は、有意に増大した；モデル群の値と比較して有意な
差が存在し（Ｐ＜０．０１）、ＬＶＤｄ値（０．１８７±０．００６、０．１８９±０．
００８）およびＬＶＤｓ値（０．０８５±０．００９、０．０９９±０．０２７）は、モ
デル群の値（０．２０８±０．０１５、０．１４２±０．０２０）より有意に低かった（
Ｐ＜０．０５）；ｒｈＮＲＧ−１βは、心筋病理学的損傷の重篤度を軽減し、血清トロポ
ニン（ｃＴｎＩ）レベルを効果的に減少し、ｃＴｎＩの３０μｇ／ｋｇの用量群（７．９
８±６．０７ｎｇ／ｍｌ）および１５μｇ／ｋｇの用量群（１９．４３±１０．７６ｎｇ
／ｍｌ）は、モデル群（４４．４４±１２．３９ｎｇ／ｍｌ）のｃＴｎＩより有意に低く
、これらの間の差は、統計的に有意であった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．００５）；３０
μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の生存比を有意に改善し、この比は８０％
に達した（Ｐ＜０．０５）。結論：ｒｈＮＲＧ−１βの特定の用量が、ウイルス感染によ
って生じる急性心筋障害を効果的に処置し得た。
（２．実験の目的）
マウス中のウイルス感染により生じる急性心筋損傷におけるｒｈＮＲＧ−１βの治療効
果を研究することおよび任意の有効な用量を見い出すこと。
（３．試験薬物）
ｒｈＮＲＧ−１β（Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔによって提供される）。ロット番号：２００１１
０００６−２。滴定：５０００ｕ；純度：＞９５％（ＨＰＬＣ−Ｃ８）。
（４．実験動物）
４．１種、供給源、能力の証明：４週齢の純粋繁殖されたＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｆｕｄ
ａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの実験動物部門により提供された）動物能力の証明書番号：
Ｙｉ Ｄｏｎｇ Ｚｉ ２２−９。
４．２体重および性：１０−１２ｇ、雄
４．３各々の群の動物数：各々の実験群における２０匹の動物、正常なコントロール群
の１０匹の動物
（５．ウイルス）
Ｃｏｘｓａｃｋｉｅ Ｖｉｒｕｓ Ｂ３、ＣＶＢ３、Ｎａｎｃｙ株（Ｍｉｎｉｓｔｅｒ
ｉａｌ Ｖｉｒａｌ Ｈｅａｒｔ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓｈａｎｇ
ｈａｉ Ｍｕｎｉｃｉｐａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅｓ Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ）により提供された）。
（６．試薬および装置）
６．１心エコー検査装置、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｏｎｏｓ ５５００；
プローブの型：Ｓ１２’；
６．２Ｉｍｍｕｎｏ−Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ Ｏｐｕｓ（登録商標）Ｐｌｕｓ（血
清トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）を決定するためのＢｅｈｒｉｎｇ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｉｎｃ．により生成された）、ロット番号：ＣＴＥ８；
６．３正確な電子天秤、ＫＥＲＮ８２２；
６．４注入のための水、Ｚａｎｇ Ｊｉａｎｇ Ａｎｄｕｓ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
Ｃｏ Ｌｔｄ，１０×５ｍｌ、ロット番号：０１１２１８０；
６．５脱毛剤、８％硫化ナトリウム、ＧｕａｎｇＤｏｎｇ ＸｉＬｏｎｇ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ Ｐｌａｎｔ、ロット番号：０１０６２２。
（７．実験の方法）
７．１実験群
正常なコントロール群、モデル群、試験薬物群および偽薬コントロール群を、準備した
；モデル群は、ネガティブコントロール群である（ｎ＝２０）。調製された緩衝液が、投
与された（１０ｍＮ ＰＢ，０．２％ヒト血清アルブミン、５％マンニトール）；
試験薬物群（ｎ＝２０）：高い、中間の、低い投薬レベルのｒｈＮＲＧ−１β群が分割
された；偽薬コントロール群（ｎ＝２０）：非ＣＶＢ３凍結解凍細胞上清の腹内注射、０
．２ｍｌ／動物。
（７．２投薬設定、試験薬物の調製、薬物投与の経路、薬物投与の回数、試験薬物の濃
度および容積）
３つの投薬レベル、３０μｇ／ｋｇ、１５μｇ／ｋｇおよび７．５μｇ／ｋｇの試験薬
物群が、予備実験の結果に基づいて確立された。調製緩衝溶液（１０ｍＭ ＰＢ、０．２
％ヒト血清アルブミン、５％マンニトール）で必要とされる濃度に希釈した。
試験薬物群とモデル群との両方の薬物投与は、マウスの尾静脈への静脈内注入であった
。毎日１回（ｑｄ）、連続する５日間について、投与される各々の薬物の容積は、０．２
ｍｌ／動物であった。
（７．３実験の方法）
７．３．１マウス中の急性ウイルス心筋炎動物モデルの準備
Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに付属するＺｈｏｎｇ Ｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａ
ｌにより提供される０．２ｍｌの１００×ＴＣＩＤ５０ＣＶＢ３を、腹内に注入し、心筋
モデルを確立した。続く一週間以内に、マウスは、起毛、脱毛、衰弱、不活発化および死
を示し、試験動物の約半数が、８日目に死んだ。
（７．３．２薬力学的実験）
試験薬物の尾静脈への静脈内注入が、マウスにおける腹内ウイルス感染と同じ日に実施
された。この注入は、連続する５日間の間実施され、動物生存率がモニタリングされ、実
験の完了の後、心エコー検査、心筋病理学的試験、血清トロポニン測定が、実施された。
（７．３．３観察指標）
７．３．３．１マウスにおける心臓機能測定
胸部脱毛を、ウイルス感染の７日目に実施し、次いでマウスを、特別に作製された固定
化マウント上に固定し、心エコー検査を、Ｓ１２高振動数プローブを用いて実施した。主
な指標は、以下を含んだ：
ＥＦ：左心室の駆出画分であって、左心室の駆出機能を反映する主な指標；
ＦＳ：左心室の短縮画分であって、左心室の収縮機能を反映する指標；
ＬＶＤｄ：心臓拡張最大内部直径（ｃｍ）；
ＬＶＤｓ：心収縮最小内部直径（ｃｍ）。
（７．３．３．２マウス中の血清トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）の測定）
心筋損傷の重篤度は、他の慣習的な指標（例えば、ＣＫ、ＬＤＨ、およびＡＳＴ）と比
較する場合、高い特異性および高い感度の利点を有する、血清ｃＴｎＩの量の測定を介し
て評価された。従って、血清ｃＴｎＩ含有量測定を、心筋損傷の重篤度を反映する客観的
な指標として使用した。ウイルス感染の８日目にて、マウスの体重が測定され、血液が眼
窩から引き出され、血清が分離され、−２０℃の冷凍庫で保存され、発光反応を有する血
清ｃＴｎＩ測定が、実行された。
（７．３．３．３マウス中の心筋の病理学的試験）
試験は、Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに付属するＳｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅの病理学部により実行されるように付託された。
生き残ったマウスを、頚部棘を脱臼させることにより殺し、無菌開胸術を実施し、心臓
を摘出し、心臓重量を測定し、固定のためにホルムアルデヒド中に心筋層を入れ、パラフ
ィン中で包埋し、連続した切片を作製し、病理学的試験を実施し、心筋の炎症細胞浸潤、
変性および壊死を観察した。新薬評価ガイドラインの原理に基づいて、病理学的スコア基
準を、以下のように規定した：
スコア０：０％を占める病変領域；
スコア１：２５％を占める病変領域；
スコア２：５０％を占める病変領域；
スコア３：７５％を占める病変領域；
スコア４：１００％を占める病変領域；
スコアリングを、スコア１とスコア２との間で、またはスコア２とスコア３との間で実
施し得た（例えば、病変領域が８０％である場合は、スコア３．２としてスコアされた）
。
（７．３．３．４マウスの生存における観察）
種々の試験薬物群におけるモデル動物の死の状態が、モニタリングされた。
（８．データ処理）
関連するデータの１対のｔ検定（ｐａｉｒｉｎｇ ｔ ｔｅｓｔ）が、データ処理につ
いて使用された。
（９．結果）
９．１ウイルスで感染されたマウスの心臓機能におけるｒｈＮＲＧ−１βの効果
結果は、ＥＦ値（６７．１±９．９％）およびＦｓ値（３２．０±７．２％）の両方が
、正常な値（ＥＦ，９２．５±２．３％／Ｆｓ５９．２±３．１％）より有意に低かった
、ｐ＜０．０５；ｒｈＮＲＧ−１β群の３０μｇ／ｋｇおよび１５μｇ／ｋｇのＥＦ値（
９０．２±２．５％，８６．０±２．９％）およびＦＳ値（５５．７±２．１％，５０．
７±４．３％）は有意に増加し、モデル群の値と比較する場合、有意な差が存在した（Ｐ
＜０．０１）。７．５μｇ／ｋｇ群のＥＦ／ＦＳは、モデル群のＥＦ／ＦＳと有意な差を
有さなかった（Ｐ＞０．０５）。
モデル群のＬＶＤｄ値（０．２０８±０．０１５ｃｍ）およびＬＶＤｓ値（０．１４２
±０．０２０ｃｍ）は、正常なコントロール群の値よりも有意に高く（ＬＶＤｓ，０．１
７９±０．００７ｃｍ／ＬＶＤｓ，０．０７３±０．００６ｃｍ）、これらの間に有意な
差が存在した（Ｐ＜０．０１）。ｒｈＮＲＧ−１β群の３０μｇ／ｋｇおよび１５μｇ／
ｋｇのＬＶＤｄおよびＬＶＤｓは、モデル群のＬＶＤｄおよびＬＶＤｓより有意に低い（
Ｐ＜０．０５）一方、７．５μｇ／ｋｇのＬＶＤｄおよびＬＶＤｓは、モデル群のＬＶＤ
ｄおよびＬＶＤｓと有意に異らなかった（Ｐ＞０．０５）。表１９および表２０は、２度
繰り返された実験の結果を示した。
（表１９．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける５日間の薬物投与後の心機能の決
定パラメーター）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ一元配置分散分析によって、モデ
ル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（表２０．ウイルス（II）に感染したマウスにおける５日間の薬物投与後の心機能の決
定パラメーター）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ一元配置分散分析によって、モデ
ル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（９．２．ウイルスに感染したマウスの血清ｃＴｎＩに対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
）
結果により、モデル群のｃＴｎＩ（４４．４４±１２．３９ｎｇ／ｍｌ）がｒｈＮＲＧ
−１β ３０μｇ／ｋｇのコントロール群（３．２８±４．５５ｎｇ／ｍｌ）より有意に
高いことが示された。群（７．９８±６．０７ｎｇ／ｍｌ）は、モデル群より有意に低か
った（Ｐ＜０．０１）；ｒｈＮＲＧ−１β １５μｇ／ｋｇ群のｃＴｎＩ（１９．４３±
１０．７６ｎｇ／ｍｌ）は、モデル群とは有意に異なった（Ｐ＜０．０５）のに対して、
ｒｈＮＲＧ−１β ７．５μｇ／ｋｇ群（２９．０５±１７．０６ｎｇ／ｍｌ）のｃＴｎ
Ｉとモデル群のｃＴｎＩとの間では、統計的有意差は何らなかった。表２１および２２は
、２つの実験の結果を示した。
（表２１．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける血清ｃＴｎＩ（ｎｇ／ｍｌ）含有
量に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ非母数検定（独立サンプル検定）
分析によって、モデル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（表２２．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスにおける血清ｃＴｎＩ（ｎｇ／ｍｌ）含
有量に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ非母数検定（独立サンプル検定）
分析によって、モデル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）
（９．３．ウイルスに感染したマウスの心筋傷害に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
実験の結果により、通常群の心筋病理的スコアは、０．０±０．００であり、モデル群
の心筋病理的スコアは、２．２２±０．９７であり、これらの間には有意差があることが
示された（Ｐ＜０．０１）。ｒｈＮＲＧ−１βの高用量および中間用量レベルの両方の病
理的スコアは、有意に減少し（それぞれ、０．５６±０．４７および０．７３±０．５８
）、モデル群とは有意差があり（Ｐ＜０．００１）、低用量レベル群の病理的スコアとモ
デル群の病理的スコアとの間には有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）。表２３および２４
ならびに図２１および２２は、２つの実験の結果を示す。
（表２３．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける心筋の病理的変化に対するｒｈＮ
ＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ非母数検定（独立サンプル検定）
分析によって、モデル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（表２４．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスにおける心筋の病理的変化に対するｒｈ
ＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ非母数検定（独立サンプル検定）
分析によって、モデル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（９．４ ウイルスに感染したマウスの生存率に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
表２５および２６は、２つの実験の結果を示した。ウイルスを注射して１週間後、モデ
ル群のマウスの生存率は、それぞれ、５０％および５５％であった一方で、ｒｈＮＲＧ−
１βを注射した後、マウスは、８５％および８０％（３０μｇ／ｋｇ）ならびに７０％お
よび６５％（１５μｇ／ｋｇ）まで上昇した。
（表２５．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスの生存率に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記のデータを、ＳＰＳＳソフトウェア、Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｌｉｆｅ Ｔａｂｌｅｓ
分析により処理した（コントロール群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０
１）。
（表２６．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスの生存率に対するｒｈＮＲＧ−１βの効
果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記のデータを、ＳＰＳＳソフトウェア、Ｓｕｒｖｉｖａｌ Ｌｉｆｅ Ｔａｂｌｅｓ
分析により処理した（コントロール群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０
１）。
（９．結論）
３０μｇ／ｋｇおよび１５μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１β群のＥＦ値（９０．２±２．
５％、８６．０±２．９％）およびＦＳ値（５５．７±２．１％、５０．７±４．３％）
は、有意に上昇し、モデル群と比較した場合、有意差があり（Ｐ＜０．０２）、ＬＶＤｄ
値（０．１８７±０．００６、０．１８９±０．００８）およびＬＶＤｓ値（０．０８５
±０．００９、０．０９９±０．０２７）の両方は、モデル群（０．２０８±０．０１５
、０．１４２±０．０２０）より低かった（Ｐ＜０．０５）；ｒｈＮＲＧ−１βは、モデ
ル群動物の心筋の病理的損傷の重篤度を緩和することができ、血清トロポニンＩ（ｃＴｎ
Ｉ）レベルを有効に減少させ、３０μｇ／ｋｇ用量レベル群（７．９８±６．０７ｎｇ／
ｍｌ）および１５μｇ／ｋｇ用量レベル群（１９．４３±１０．７６ｎｇ／ｍｌ）のｃＴ
ｎＩ含有量は、モデル群（４４．４４±１２．３９ｎｇ／ｍｌ）より有意に低く、それら
の間に有意差があった（Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．００５）；３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲ
Ｇ−１βは、モデル群動物の生存率を有意に改善でき、モデル群動物の生存率５０％と比
較した場合、８０％に達した（Ｐ＜０．０５）。
実験の結果により、ｒｈＮＲＧ−１βの３０μｇ／ｋｇ用量レベルにより、マウスのウ
イルス感染により引き起こされた急性心筋傷害を有効に処置し得ることが示された。
（実施例５．ウイルス感染（ＩＩ）により引き起こされたマウスの急性心筋傷害に対す
るｒｈＮＲＧ−１βの治療的効果に対する観察）
（１．緒言）
（目的） ウイルス感染により引き起こされたマウスの急性心筋傷害の処置におけるｒ
ｈＮＲＧ−１βの薬物投与の効率的時間を研究すること。（方法） 急性心筋傷害動物モ
デルを、コクサッキーＢ３ウイルス（ＣＶＢ３）のマウスにおける腹腔内感染を介して樹
立した。このモデル動物を、無作為に群分けし（すなわち、通常コントロール群、モデル
群、試験薬物群）、２０匹の動物を、各群に割り当てた。３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−
１βを、それぞれ連続して３日間、５日間および７日間尾静脈に注射した。実験の間、動
物の生存率をモニターし、心エコー検査を７日目に行って、動物を８日目に屠殺した。血
清をｃＴｎＩレベル決定のために分離し、心臓病理組織学的検査を行った。（結果） ３
０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βの３日間、５日間および７日間の連続注射により、ＥＦ
／ＦＳ値を上昇させることができ、５日間および７日間試験薬物群のＥＦ／ＦＳ値（８６
．８±４．４％／５１．９±５．８％、８７．０±３．３％／５１．８±５．１％）と、
モデル群のＥＦ／ＦＳ値（６６．５±５．６／３１．８±３．７）とを比較すると、有意
差が存在し（Ｐ＜０．００１）、５日間および７日間試験薬物群のＬＶＤ値は、有意に減
少し（それぞれ、０．０９０±０．０１１、０．０９２±０．０１２ｃｍである）、モデ
ル群（０．１３３±０．０１２）と比較した場合、有意差があった（Ｐ＜０．０１）；ｒ
ｈＮＲＧ−１βは、心筋の病理学的損傷の重篤度を緩和することができ、モデル動物の血
清トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルを有効に減少させ、５日間試験薬物群のｃＴｎＩ（１
．０６±１．３２ｎｇ／ｍｌ）および７日間試験薬物群のｃＴｎＩ（１．０５±１．２ｎ
ｇ／ｍｌ）は、モデル群より有意に低かった（２３．５４±１６．９６ｎｇ／ｍｌ）Ｐ＜
０．０１；ｒｈＮＲＧ−１βの連続５日間および７日間の注射は、動物の生存率を有意に
改善することができ、モデル動物の生存率５０％と比較した場合、８５％に達した（Ｐ＜
０．０５）。（結論） 連続５日間注射した３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、ウイ
ルス感染によって引き起こされたマウスにおける急性心筋傷害を有効に処置することがで
きた。
（２．目的）
ウイルス感染によって引き起こされたマウスの急性心筋傷害の処置におけるｒｈＮＲＧ
−１βの薬物投与の有効時間を明らかにすること。
（３．試験薬物）
ｒｈＮＲＧ−１β（Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ＆Ｔｅｃｈｎｏ
ｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．バッチ番号：２００１１０００６−２、力価：５０
０ｕ；純度：＞９５％（ＨＰＬＣ−Ｃ８）によって提供）
（５．実験動物）
５．１ 種、供給源および能力の確認：４週齡の純系ＢＡＬＢ／Ｃマウス（Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔ Ａｎｉｍａｌ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙにより提供、動物能力の確認数：Ｙｉ Ｄｏｎｇ Ｚｉ ２２−９）
５．２ 体重および性別：１３〜１５ｇ、雄性。
５．３ 各群の動物数：各実験群において２０匹の動物、通常コントロール群において
１０匹。
（５．ウイルス）
前節において記載されたものと同じ。
（６．試薬および装置）
前節において記載されたものと同じ。
（１０．実験方法）
１０．１ 実験群分け
通常マウスコントロール群、モデル群および試験薬物群を設定した；
通常マウスコントロール群（ｎ＝１０）；
モデル群（ｎ＝２０）：調製済み緩衝溶液を注射した；
試験薬物群（ｎ＝２０）：３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βを、３つの異なる治療過
程として、連続して３日間、５日間および７日間投与し、各群につき２０匹の動物を割り
当てた；
プラシーボコントロール群（ｎ＝２０）：非ＣＶＢ３凍結融解細胞上清（０．２ｍｌ／
動物）の腹腔内注射。
１０．２ 用量設定、試験薬物の調製、薬物投与経路、薬物投与時間、試験薬物の濃度
および容量
ｒｈＮＲＧ−１βを、調製緩衝溶液（１０ｍＭ ＰＢ、０．２％ ヒト血清アルブミン
、必要な濃度まで５％ マンニトール）で希釈した；３つの薬物投与群を設定し、連続３
日間、５日間および７日間の、各用量の薬物容積０．２ｍｌ／動物の静脈内注射を行った
。
モデル群の薬物投与は、マウスの尾静脈への静脈内注射であった（毎日１回（ｑｄ）、
連続７日間、各用量に対する薬物容量は、０．２ｍｌ／動物であった）。
７．３ 実験方法
７．３．１ マウスにおける急性ウイルス心筋炎動物モデルの設定
１００×ＴＣＩＤ５０ ＣＶＢ３（Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの付属機関であ
るＺｈｏｎｇ Ｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌによって提供された）を０．２ｍｌ、腹腔内
に注射し、心筋炎モデルを樹立した。翌週内に、そのマウスは、立毛、脱毛、やせ、無気
力および死亡を発現し、試験動物の約半数は、８日目に死亡した。
７．３．２ 薬物動態実験
前節において記載されたものと同じ。
７．３．３ 観察指数
前節において記載されたものと同じ。
（８．データ処理）
データ処理のために、関連データの両側ｔ検定を使用した。
（９．結果）
９．１ ３日間、５日間および７日間投与されたｒｈＮＲＧ−１βの、ウイルスに感染
したマウスの心機能に対する効果）
結果により、ＥＦ／Ｆｓ値（６６．５±５．６％／３１．８±３．７％）が、通常群（
９３．５±０．９％／６８．１±１．３％）より有意に低く、その差は、統計学的に有意
であった（Ｐ＜０．０１）。連続５日間および７日間のｒｈＮＲＧ−１β注射のＥＦ／Ｆ
Ｓ値（８６．８±４．４％／５１．９±５．８％、８７．０±３．３％／５１．８±５．
１％）は、モデル群とは有意に異なった（Ｐ＜０．００１）。連続３日間のｒｈＮＲＧ−
１β注射のＥＦ値は、再び上昇した（７３．１±６．６％）が、モデル群と比較した場合
、有意差はなかった（Ｐ＜０．０５）。
ＬＶＤ値（０．１３３±０．０１２ｃｍ）は、通常群（０．０５９±０．００６ｃｍ）
より高く、それらの間には有意差があった（Ｐ＜０．０１）。ｒｈＮＲＧ−１βの５日間
投与群および７日間投与群のＬＶＤ値は、有意に減少し（それぞれ、０．０９０±０．０
１１、０．０９２±０．０１２ｃｍ）、モデル群とは有意に異なった（Ｐ＜０．００１）
。ｒｈＮＲＧ−１βの３日間投与群のＬＶＤ値（０．１２３±０．０１２ｃｍ）は、モデ
ル群とは有意に異なった（Ｐ＜０．０５）。表２７および１７〜２８は、２つの実験の結
果を示す。
（表２７．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスの心機能に対する異なる日数投与したｒｈ
ＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ一元配置分散分析によって、モデ
ル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（表２８．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスの心機能に対する異なる日数投与したｒ
ｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々において（各群ｎ＝６）、ＳＰＳＳ一元配置分散分析によって、モデ
ル群と比較（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。
（９．２ ウイルスに感染したマウスの血清ｃＴｎＩに対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
）
結果により、通常群のｃＴｎＩの平均（０．１２±０．０３ｎｇ／ｍｌ）およびモデル
群のｃＴｎＩの平均は、有意に上昇し（２３．５４±１６．９６ｎｇ／ｍｌ）、それらの
間には有意差がある（Ｐ＜０．００１）ことが示された。ｃＴｎＩ値は、ｒｈＮＲＧ−１
βの５日間投与群および７日間投与群の両方とも、有意に減少し（それぞれ、１．０６±
１．３２ｎｇ／ｍｌ、１．０５±１．２０ｎｇ／ｍｌである）、モデル群とは有意に異な
った（Ｐ＜０．００１）。その差は、３日間薬物投与群とモデル群との間は有意でなかっ
た（Ｐ＞０．０５）。表２９および３０は、２つの実験の結果を示した。
（表２９．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける血清ｃＴｎＩ（ｎｇ／ｍｌ）に対
するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記データの各々を、モデル群と比較した場合（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）
、ＳＰＳＳソフトウェアの非母数検定（独立サンプル検定）によって分析した。
（表３０．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスにおける血清ｃＴｎＩ（ｎｇ／ｍｌ）に
対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々を、モデル群と比較した場合（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）
、ＳＰＳＳソフトウェアの非母数検定（独立サンプル検定）によって分析した。
（９．３ ウイルスに感染したマウスの心筋の病理的傷害に対する異なる日数投与した
ｒｈＮＲＧ−１βの効果）
実験結果により、通常群の病理的スコアが０．０±０．００であり、モデル群の病理的
スコアが増大し（１．４４±１．１９）、これらの間には有意差があり（Ｐ＜０．０１）
、ｒｈＮＲＧ−１βの５日間投与群および７日間投与群の病理的スコアは有意に減少し（
それぞれ、０．１１±０．１４および０．１３±０．１３である）、モデル群とは有意に
異なる（Ｐ＜０．０１）ことが示された。３日間薬物投与群の心筋傷害もまた改善され（
０．３３±０．１５５）、モデル群と比較した場合、有意差があったが、５日薬物投与群
の心筋細胞の改善は、３日間薬物投与群より顕著に良好であり、それらの間には有意差が
あった（Ｐ＜０．０１）が、その一方で、５日間薬物投与群と７日間薬物投与群との間に
は病理的スコアに有意差はなかった。
表３１、３２および図２１および２４は、２つの実験の結果を示した。
（表３１．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける心筋の病理学的変化に対する異な
る日数投与されたｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々を、モデル群と比較した場合（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）
、ＳＰＳＳソフトウェアの非母数検定（独立サンプル検定）によって分析した。
（表３２．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスにおける心筋の病理学的変化に対する異
なる日数投与されたｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記データの各々を、モデル群と比較した場合（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）
、ＳＰＳＳソフトウェアの非母数検定（独立サンプル検定）によって分析した。
（９．４ ウイルスに感染したマウスの生存率に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
表３３および３４は、２つの実験の結果を示し、モデル群のマウスの生存率は、それぞ
れ、５０％および５５％であったが、その一方で、ｒｈＮＲＧ−１βの５日間投与群およ
び７日間投与群両方の生存率は、８５％および８０％まで上昇し、モデル群と比較した場
合、有意差があった（Ｐ＜０．０５）。３日間群の生存率は、６５％および７５％まで上
昇したが、モデル群と比較した場合に、有意差はなかった（Ｐ＜０．０５）。
（表３３．ウイルス（Ｉ）に感染したマウスにおける生存率に対する異なる日数投与さ
れたｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記群の各々を、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌ Ｌｉｆｅ Ｔａｂｌｅｓ
分析により処理した（コントロール群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０
１）。
（表３４．ウイルス（ＩＩ）に感染したマウスにおける生存率に対する異なる日数投与
されたｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記群の各々を、ＳＰＳＳソフトウェアのＳｕｒｖｉｖａｌ Ｌｉｆｅ Ｔａｂｌｅｓ
分析により処理した（コントロール群と比較した場合、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０
１）。
（１０．結論）
連続して３日間、５日間、および７日間の間静脈内注射した３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲ
Ｇ−１βは、すべて、ＥＦ／ＦＳ値を上昇させ得、５日間および７日間の群についての薬
物投与のＥＦ／ＦＳ値（８６．８±４．４％／５１．９±５．８％／８７．０±３．３％
／５１．８％±５．１％）は、モデル群のＥＦ／ＦＳ値（６６．５±５．６／３１．８±
３．７）とは有意に異なり（Ｐ＜０．０１）、５日間群および７日間群の両方のＬＶＤは
、有意に減少し（それぞれ、０．０９０±０．０１１および０．０９２±０．０１２ｃｍ
である）、モデル群のＬＶＤ（０．１３３±０．０１２）とは有意に異なった（Ｐ＜０．
０１）；ｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物において心筋の病理学的損傷の重篤度を改善し
得、血清トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）レベルを有効に減少させ、５日間群についての薬物投
与のｃＴｎＩ（１．０６±１．３２ｎｇ／ｍｌ）および７日間群についての薬物投与のｃ
ＴｎＩ（１．０５±１．２ｎｇ／ｍｌ）は、モデル群のｃＴｎＩ（２３．５４±１６．９
６ｎｇ／ｍｌ）よりも有意に低かった（Ｐ＜０．０１）；連続して５日間および７日間の
間静脈内注射したｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の生存率を有意に上昇させ得、これは
、８５％に達した。Ｐ＜０．０５。
この実験結果は、連続して５日間投与した３０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、ウイ
ルスにより感染したマウスにおいて急性心筋損傷を有効に処置し得ることを実証した。
（実施例６．下大静脈狭窄により引き起こされる鬱血性心不全に対するｒｈＮＲＧ−１
βの治療効果）
（１．要旨）
（目的） イヌにおいて下大静脈狭窄により引き起こされる鬱血性心不全に対するｒｈ
ＮＲＧ−１βの治療効果を研究すること。（方法） 約１週間にわたる５０％の下大静脈
狭窄の後、ＥＦ値が約２０％減少したか、または心エコー検査により心拍出量が２０％減
少した。このことは、安定な低拍出量の鬱血性心不全動物モデルが確立されたことを示し
た。その後、これらの動物を、各群について６匹のイヌを含む群へとランダムに分割し、
３つの投与量レベルのｒｈＮＲＧ−１β（すなわち、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよび
１０μｇ／ｋｇ）を、連続５日間にわたり毎日静脈内注射した。心機能（心エコー検査）
決定を、この薬物投与後に実施した。モデル動物における種々の血流力学的パラメーター
を、頸静脈カテーテル法および頸動脈カテーテル法をそれぞれ介して分析した。（結果）
連続５日間にわたり投与したこれら３つの投与量レベルのｒｈＮＲＧ−１β（１μｇ／
ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇ）はすべて、モデル動物のＥＦ／ＦＳ値および
心拍出量（ＣＯ）を上昇させ得た。薬物投与前の値と薬物投与後の値との間およびモデル
群の値の間で、有意な差異が存在した（Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）。１μｇ／ｋｇ、
３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物における左心室の
ｄｐ／ｄｔを有効に上昇させ得た。モデル群の左心室のｄｐ／ｄｔと比較した場合に、有
意な差異（Ｐ＜０．０１）が存在した。上記ｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物のＬＶＰｍ
ａｘを有効に上昇させ得、ＬＶＰｍｉｎ値を減少させ得、このモデル群と比較した場合に
Ｐ＜０．０４であったが、右心室に対する影響は、明らかではなかった。（結論） ｒｈ
ＮＲＧ−１βは、イヌにおいて下大静脈の狭窄により引き起こされる鬱血性心不全を有効
に処置し得た。
（２．目的）
イヌにおいて下大静脈の狭窄により引き起こされる鬱血性心不全に対するｒｈＮＲＧ−
１βの治療効果を示すこと。
（３．試験サンプル）
Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅ
ｖｅｌｏｐｍｅｎｔにより提供されるｒｈＮＲＧ−１β。バッチ番号：２００１１０００
６−２；濃度：５００μｇ／アンプル；力価：５０００ｕ／アンプル；純度：＞９５％（
ＨＰＬＣ−Ｃ８）。
（６．実験動物）
６．１ （種、供給源および適任証明書）：Ｚｈｏｎｇ Ｓｈａｎ Ｈｏｓｐｉｔａｌ
ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより提供される交配種のイヌ。Ｅｘｐｅｒ
ｉｍｅｎｔ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｕｄａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより保
証された適格さである。
６．２ （体重および性別）：１３〜１８ｋｇ、雄
６．３ （各群における動物数）：各実験群において６匹の動物。
（５．材料および器具）
５．１ 心エコー検査装置、Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｏｎｏｓ ５５００
；プローブの型：Ｓ４
５．２ 注射用水、Ｚａｎｇ Ｊｉａｎｇ Ａｎｔｕｓ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ Ｃｏ
Ｌｔｄ，１０×５ｍｌ、バッチ番号：０１１２１８０；
５．３ 高振動数電気ナイフ、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｕ Ｔｏｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ
ｉｃ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｙ，ＧＤ３５０−Ｄ；
５．４ 心電図レコーダー、Ｎｉｈｏｎ Ｋｏｈｄｅｎ ＥＣＧ−６５１１；
５．５ モニタリング電極、Ｌｕｄｌｏｗ Ｃｏｍｐａｎｙ ｏｆ Ｃａｎａｄａ、モ
デル：ＭＴ−２００；
５．６ 生理学レコーダー、Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ
ｏｆ Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＳＭＵＰ−Ｂ；
５．７ 電気ベンチレーター、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｎｏ．４ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｑｕ
ｉｐｍｅｎｔ Ｆａｃｔｏｒｙ；
５．８ 三叉バルーンフローティングカテーテル、Ｅｄｗａｒｄｓ １１４Ｆ７．
（６．実験方法）
（６．１ 実験グループ分け）
偽手術群、モデル群、および試験薬物験群を、設定した。
偽手術群（ｎ＝６）：開胸（但し、下大静脈の狭窄を伴わない）を実行した。
モデル群（ｎ＝６）：調製した緩衝溶液を、心不全モデルの確立後に注射した。
試験薬物群：ｒｈＮＲＧ−１βを、心不全モデルの確立後に注射した。
（６．２ 投与量設定、試験薬物の調製、薬物投与レジメン）
それぞれ、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇの高投与レベル、中投与
レベルおよび低投与レベルのｒｈＮＲＧ−１βを、調製緩衝溶液（ビヒクル）を用いて必
要な濃度まで希釈し、連続５日間にわたり毎日１回静脈内注射した。
調製緩衝溶液を、モデル群について連続５日間にわたり１日１回静脈内注射した。
投与した薬物の容積は、０．８ｍｌ／ｋｇ体重であった。
（６．３ 実験方法）
（６．３．１ イヌにおける下大静脈動物モデルの狭窄により引き起こされる心不全の
設定）
３％のペントバルビタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ）を、イヌを麻酔するために末
梢静脈中に注射し、その後、気管に挿管した。第４肋骨と第５肋骨との間で右胸を経由し
て無菌開胸し、右心耳から３ｃｍにて下大静脈の周囲を測定した。下大静脈の円周の１／
３〜１／２の円周を有する硬いスプール（ｓｐｏｏｌ）を選択し、そのスプールと下大静
脈とを＃７絹糸で一緒に締め、そのスプールを伸ばし、出血をすべて停止させ、胸を閉じ
た。１週間育てた後、心エコー検査を、腹水の量に従って実施した。ＥＦが約２０％減少
した時、または左心の拡張が約２０％減少した時、安定な低拍出量のうっ血性心不全動物
モデルが、確立された。その後、上記薬物の静脈内注射を、連続５日間実行した。下大静
脈を狭窄することのない開胸術を、偽手術群について実行した。
（６．３．２ 薬力学的実験）
動物モデルの確立を同定した後に、動物グループ分けおよび薬物投与レジメンに従って
、実験を実行した。
（６．３．３ 観察指標）
心機能指標の決定を、手術前、薬物投与の前および薬物投与の５日間後に、そのイヌを
麻酔して実行した。主要な指標としては、以下が挙げられた：
ＥＦ（駆出率）：心臓の駆出率（すなわち、左室拡張末期容積（ＥＤＶ）と左室収縮末
期容積（ＥＳＶ）との間の差異と、左室拡張末期容積との比）であり、これは、心室のポ
ンプ機能を反映する（特に、収縮機能を反映する）ために使用される一般的指標である；
ＦＳ：心室内径短縮率（これは、心室の収縮機能を反映する指標である）
ＣＯ：心拍出量（すなわち、１分間につき心臓により駆出される血液容積）。
（６．３．３．２ 血行力学的指標の決定）
７Ｆ三叉バルーンフローティングカテーテルを、右頸静脈中に挿入し、右心耳圧、右心
室圧、肺圧および肺動脈楔入圧を、記録した。６Ｆ三叉バルーンフローティングカテーテ
ルをまた、左頸動脈中に挿入し、大動脈圧および左心室圧を、以下の主要指標とともに生
理機能レコーダーを用いて記録した：ＬＶＰｍａｘ、ＬＶＰｍｉｎ、＋ｄｐ／ｄｔ、およ
び−ｄｐ／ｄｔ。
（７．データ処理）
ＳＰＳＳソフトウェアを用いて、収集したデータの両側ｔ検定またはノンパラメトリッ
ク検定を、実行した。
（８．結果）
（８．１ ＴＩＶＣＣイヌの心機能に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
（８．１．１ ＴＩＶＣＣイヌの左室ＥＦ／ＦＳ値に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
モデル動物における狭窄の前のＥＦおよびＦＳの値は、心エコー検査を介して、それぞ
れ、８２．３±１．６％および４９．２±２．６％であり、手術後に、それぞれ、５９．
１±７．３％および２９．３±３．９％にまで減少した。狭窄前と狭窄後との間には、有
意な差（Ｐ＜０．０１、Ｐ＜０．０５）が存在した。ＥＦおよびＦＳの値は、５日間後に
５５．５±１０．９％および２８．５±６．６％のレベルで継続して維持された。このこ
とは、下大静脈の狭窄を介して、鬱血性心不全イヌモデルが確立され、そしてそれが比較
的安定であったことを示した。
ｒｈＮＲＧ−１β注射後の３つすべての投与量レベル群のＥＦおよびＦＳの値は有意に
上昇した。低投与量レベル群（1μｇ／ｋｇ）のＥＦおよびＦＳは、５７．７±１０．９
および３０．６±８．０から、７０．４±８．４および３９．７±５．７へと増加した。
薬物投与前と薬物投与後との間には有意な差（Ｐ＜０．０５）が存在した。一方、モデル
群と比較した場合には、有意な差（Ｐ＜０．０５）が存在した。さらに、中間投与レベル
群のモデル動物のＥＦ／ＦＳ値および高投与レベル群のモデル動物のＥＦ／ＦＳ値は、有
意に増加した。そして、薬物投与前および薬物投与後のＥＦ／ＦＳ値を、モデル群のＥＦ
／ＦＳ値と比較した場合に、有意な差（Ｐ＜０．０１）が存在した。表３５は、これらの
結果を示した。
（表３５．ＴＩＶＣＣイヌにおける左室のＥＦ／ＦＳに対するｒｈＮＲＧ−１βの効果
）
Figure 0006603149
Figure 0006603149
上記の群のすべて、ｎ＝６
＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．０５；＊＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．
０１；（黒三角）薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、Ｐ＜０．０５
（黒三角２つ）薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、Ｐ＜０．０１。
（８．１．２ ＴＩＶＣＣイヌの心拍出量（ＣＯ）に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
表３６は、ｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物の心拍出量を有意に増加し得ることを示し
た。１μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１β群の心拍出量は、２．４±０．５から３．７±０．
８へと増加した。薬物投与前および薬物投与後を比較した場合に、有意な差（Ｐ＜０．０
５）が存在した。一方、モデル動物と比較した場合にもまた、有意な差（Ｐ＜０．０５）
が存在した。３μｇ／ｋｇ投与量レベル群および１０μｇ／ｋｇ投与量レベル群のＣＯ変
化は、なお有意であった（Ｐ＜０．０１）。心拍数変化決定の結果は、ｒｈＮＲＧ−１β
が、心拍数に対してそれほど影響を有さないことを示した（詳細は明らかにならなかった
）。
（表３６．ＴＩＶＣＣイヌの心拍量（Ｌｍｉｎ）に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記の群のすべて、ｎ＝６。
＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．０５；＊＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．
０１；（黒三角）薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、Ｐ＜０．０５
（黒三角２つ）薬物投与前および薬物投与後と比較した場合に、Ｐ＜０．０１。
（８．２ ＴＩＶＣＣイヌの血流動力学に対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
左室および右室のｄｐ／ｄｔの変化および収縮期末期圧／拡張末期圧の変化を、フロー
ティングカテーテル法技術を用いて決定した。その結果は、１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ
および１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βが、動物の左室ｄｐ／ｄｔを有効に増加し得た
ことを示した。モデル群と比較した場合に、有意な差（Ｐ＜０．０５）が存在した。これ
らの１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル群
と比較した場合（Ｐ＜０．０５）に、ＬＶＰｍａｘ値を有効に上昇させ、ＬＶＰｍｉｎ値
を減少させた。ｒｈＮＲＧ−１βは、左心ｄｐ／ｄｔ、左室＋ｄｐ／ｄｔおよび左室末期
圧に対して、それほど効果を有さない。表３７および表３８は、結果を詳細に示す。
（表３７．ＴＩＶＣＣイヌの左室ｄｐ／ｄｔに対するｒｈＮＲＧ−１βの効果）
Figure 0006603149
 上記の群のすべて、ｎ＝６。
＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．０５；＊＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．
０１。
（表３８．ＴＩＶＣＣイヌの左室ＬＶＰｍａｘ／ＬＶＰｍｉｎに対するｒｈＮＲＧ−１
βの効果）
Figure 0006603149
 上記の群のすべて、ｎ＝６。
＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．０５；＊＊モデル群と比較した場合に、Ｐ＜０．
０１。
（１０．結論）
連続５日間にわたって投与した３つの投与量レベル（１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇおよ
び１０μｇ／ｋｇ）すべてのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物のＥＦ／ＦＳ値および心拍
出量（ＣＯ）を上昇させ得た。薬物投与前を薬物投与後と比較した場合に、有意な差が存
在した（Ｐ＜０．００５、Ｐ＜０．０１）；１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋｇ、および１０μ
ｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、左室ｄｐ／ｄｔを有効に増加させ得た。モデル群と比較
した場合に、有意な差（Ｐ＜０．０５）が存在した。これらの１μｇ／ｋｇ、３μｇ／ｋ
ｇ、および１０μｇ／ｋｇのｒｈＮＲＧ−１βは、モデル動物のＬＶＰｍａｘを有効に上
昇させ得、ＬＶＰｍｉｎを減少させ得る。モデル群と比較した場合に、有意な差異が存在
した（Ｐ＜０．０５）。一方、右室に対しては、それほど影響は存在しなかった。
これらの実験の結果は、ｒｈＮＲＧ−１βが、下大静脈の狭窄により引き起こされる鬱
血性心不全を有効に処置し得ることを示した。
（実施例７．組換えヒトニューレギュリン−１β Ｓ１７７〜Ｑ２３７の注射について
のアカゲザル長期毒性研究）
（要旨）
アカゲザルに対する注射について、７．５ｇ／日、１５ｇ／日、７５ｇ／日の組換えヒ
トニューレギュリン−１βＳ１７７〜Ｑ２３７の静脈内注射に関する長期毒性実験（使用
した投与量は、マウス薬力学モデルにおける有効投与量に基づき、サルの投与量の２倍、
４倍、２０倍に等しい投与量に変換され、イヌの薬力学モデルに基づいて、サルについて
の投与量の４倍、５倍、９倍および４５倍と等しい投与量に変換された）。賦形剤をコン
トロールとして使用した。モニタリングを、退薬３週間後に連続して実行した。注射につ
いての組換えヒトニューグレリン−１β Ｓ１７７〜Ｑ２３７の毒性反応および生物に対
するその重症性を研究して、毒性反応の標的器官および損傷の可逆性を探索し、そして毒
性反応を引き起こさない投与量を決定し、そしてヒトにおいて使用されるべき安全な投与
量についての基準としての投与量を提供した。
実験動物を、体重に基づいて４つの群へのランダムに分割した。各群６匹の動物（３匹
の雄および３匹の雌）であった。投与した薬物の体積は、１ｍｌ／ｋｇ体重であった。体
重を毎週測定し、投与量を、測定した体重に従って調節した。その薬物を、連続３週間の
間、毎日朝に投与した。心電図、血液学的試験、生化学的試験、尿および糞便の試験、な
らびに抗体の決定を、薬物投与前、ならびに薬物投与開始の１０日間後および２１日間後
に、それぞれ実行した。底（ｆｕｎｄｕｓ）実験を、２２日目および４２日目（薬物投与
の第１日目から数えた）にそれぞれ麻酔下で実施し、その後、２／３および１／３の動物
を屠殺し、剖検し、そして病理組織学的に研究した。骨髄スミアを同時に調製した。心エ
コー検査を、剖検の１日前に麻酔下で実施した。
この試験薬物に関連する動物死は、この実験の間に全く生じなかった。嘔吐、悪心およ
び唾液過多が、薬物投与開始の１週間後に、各薬物摂取群において動物の一部で生じた：
立毛、艶のない柔皮、活性の減少、食欲不振が、薬物投与の２週間後に観察された。軽度
の蒼白、局所的皮膚および脈管の硬化が、薬物注射部位にて発生した。上記の症状および
徴候は、退薬の３週間後に消失したかまたは減少した。異常な発現は、薬物投与期間の間
および退薬後の回復期間の間には、コントロール群の動物において観察されなかった。
高用量群において、食物摂取は有意に減少し、そして体重は顕著に低下した（薬物投与
前および薬物投与後の自己比較は、この差が有意であったことを示した；しかし、コント
ロールの群の体重と比較した場合、有意な差はなかった）。すべての動物において、薬物
投与前および薬物投与後で体温の有意な変化はなかった。
血液検査、生化学検査、尿素試験および糞便試験は、有意な毒性変化を示さなかった。
心電図検査：理性のある動物において、１０日間の薬物投与で心拍の有意な減速は見ら
れなかったが、すべての薬物を摂取した群の理性のある動物において、３週間の薬物投与
で心拍数の有意な減少が起こった。これはおそらく、試験薬物の薬理効果に起因する；さ
らに、心電図のＶ１リードにおけるＲ波およびＶ３リードにおけるＳ波の相対的に高い電
圧は、おそらく、動物の胸部リードの変動と関連する；病理学的には、心電図、心拍数お
よび他の指標における有意な異常性、ならびに心筋の肥大性の変化は見られなかった。
眼底検査において、異常な変化は見られなかった。
骨髄塗抹標本において、有意な毒性病理変化は見られなかった。
３週間の薬物投与で実施した検死は、中用量群および高用量群の両方において、それぞ
れ３頭の動物における心内膜液浸出を示し、これらの各々で２〜３ｍｌの漏出液を取り出
すことができた；クモ膜下腔における水頭症を、高用量群の２頭の動物において発見し、
それらの各々から、それぞれ０．５ｍｌおよび３ｍｌの漏出液を取り出した。
心筋の細胞質において出現した種々の程度の空腔、軟膜下の血管の鬱血および軽い水腫
が、水頭症を有する場合に見られた。これらのすべては、試験薬物による何らかの影響を
有していた。。
抗体試験は、ネガティブな結果を示した。
これらの動物の胃腸の症状（例えば、嘔吐、吐き気および食欲不振）および高用量群に
おいて生じる体重の減少は、おそらく、胃腸管における試験薬物の分布および***に起因
する。症状（例えば、蒼白、注射部位での皮膚の硬化、心内膜液浸出および水頭症）、お
よび退薬の３週間後に高用量群の動物の水頭症の完全な回復なしの症状は、アカゲザルに
おける毛細血管の滲出症候群および漏出症候群が、注射用組換えヒトニューレギュリン−
１ βＳ１７７−Ｑ２３７の中用量および高用量によって引き起こされ得ることを実証し
た。さらに、理性のある動物における心拍の減速および高用量群に関する心筋の細胞質に
おける空腔は、すべて試験薬物と関連付けられた。
結論：アカゲザルに対する注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２
３７の７．５ｇ／日、１５ｇ／日、７５ｇ／日の毎日の静脈内注射を合計３週間、および
連続的なモニタリングを３週間行った。この結果は、１０日間を超える注射用組換えヒト
ニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７の連続注射が、理性のある動物における心
拍の減速を引き起こし得たこと；これは、胃腸反応をもたらし得ること；注射用組換えヒ
トニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７の連続注射が、中用量群および高用量群
のアカゲザルにおいて軟膜下の心内膜液浸出、水頭症および軽度の鬱血ならびに水腫を引
き起こし、水頭症は、高用量群の動物において退薬の３週間後に完全には回復しなかった
こと；注射部位における肌および脈管の蒼白および硬化が、退薬後に徐々に回復したこと
、を示した。これらの徴候は、考えられる原因が、毛細管の漏出−滲出症候群であること
を実証した。注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７の高用量は
、心筋の細胞質における空腔を引き起こし得た；抗体試験はネガティブな結果を示した。
３週間の薬物投与および３週間の回復期間中に、心内膜液浸出および水頭症を引き起こさ
なかった投薬レベルは、７．５ｇ／ｋｇ／日であった。
（１．実験の目的）
注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７の毒性反応およびそれ
らの生物体に対する重篤度を研究すること、毒性反応の標的器官および損傷の可逆性を調
査すること、毒性反応を引き起こさない用量を決定すること、ヒトにおいて使用されるべ
き安全な用量のための参考としての用量を供給すること。
（２．試験薬物）：
２．１ 薬物の名称：注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７
。
２．２ バッチ番号：２００２１００２４。
２．３ 薬物を提供した機関：Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄ，住所：Ｃ
棟２階、３２８ Ｂｉ Ｂｏ Ｒｏａｄ、Ｚｈａｎｇ Ｊｉａｎｇ Ｈｉｇｈ Ｔｅｃｈ
Ｚｏｏｎ。
２．４ 含有量：３．７５ｍｇ／ｍｌ。
２．５ 比活性：１．１２×１０４Ｕ／ｍｇ。
２．６ 性質：無色透明溶液。
２．７ 保管：４℃で保存。
２．８ 賦形剤：０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ リン酸ナトリウム、ｐＨ ６．０
。
２．９ 調製：標準生理食塩水で必要な濃度まで希釈する。
（３．動物）：
３．１ 動物種：アカゲザル。
３．２ 動物の出所：Ｄａ Ｌｉ Ｊｉアカゲザル飼育場、Ｌｉ Ｘｉｎｇ Ｃｏｕｎ
ｔｙ、Ａｎｈｕｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ、適格性の認可：Ｗａｎ Ｆａ Ｘｕｎ Ｆａｎ
第２００２−６号。
３．３ 動物の受入日：２００２年１０月１３日。
３．４ 体重：薬物投与の開始時に２．６ｋｇ〜５．９ｋｇ。
３．５ 性別：オス半数およびメス半数。
３．６ 動物の数：合計２４頭。
３．７ 動物におけるマーク：胸部カードを使用して、個々の動物を識別した。
３．８ 給餌条件：各々のケージについて１頭の動物に、顆粒飼料（Ｓｈａｎｇｈａｉ
Ｓｈｉ Ｌｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌ
ｔｄによって提供された）を与えた。動物に、約１００ｇの果物に加えて、１００ｇの飼
料を１日２回与えた。室温を２０℃〜２５℃に保ち、相対湿度を５０％〜７０％、毎日１
２時間の照明を保った。
３．９ 環境適応時間：環境適応のために２５日間の給餌。
（４．投薬）：
４．１ 投薬準備：
コントロール群：０μｇ／ｋｇ／日（賦形剤と同じ容積を注射した）；
低用量群：７．５μｇ／ｋｇ／日（サルの等価用量の２倍に相当する）；
中用量群：１５μｇ／ｋｇ／日（サルの等価用量の４倍に相当する）；
高用量群：７５μｇ／ｋｇ／日（サルの等価用量の２０倍に相当する）。
４．２ 投薬準備の理論的根拠：
注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７のための表示されてい
た効能は、心不全の治療についてであった。マウスの薬力学的モデルは、前心臓性コクサ
ッキーＢ３ウイルスにより誘導した心筋炎モデルであり、使用された用量は、７．５μｇ
／ｋｇ／日、１５μｇ／ｋｇ／日、および３０μｇ／ｋｇ／日（サルについて使用される
１．８７５μｇ／ｋｇ／日、３．７５μｇ／ｋｇ／日、および７．５μｇ／ｋｇ／日に相
当する）であり、連続５日間静脈内に注射し、病理学的スコアは、それぞれ、１．５、０
．７、０．５６であった（病理学的採点法についての基準は：スコア０：病変の領域＝０
％、スコア１：病変の領域＝２５％、スコア２：病変の領域＝５０％、スコア３：病変の
領域＝１００％）。従って、１５μｇ／ｋｇ／日および３０μｇ／ｋｇ／日の用量は、心
臓に対する損傷を有意に減少し得た。薬物投与の指定経路は、１日１回で連続３〜５日間
の静脈内注射であった。注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７
の静脈内注射における急性毒性実験のＭＴＤは、３５ｍｇ／ｋｇであった。有意に有効な
用量としてサルについての等価用量の３．７５μｇ／ｋｇ／日を取ると、動物についての
長期毒性用量は、暫定的には、動物の有効用量の２倍、４倍、および２０倍に定められる
。
（５．薬物投与のコース）：
１日１回を連続３週間。
（６．回復期間）：
３週間。
（７．投与した薬物容積）：
１．０ｍｌ／ｋｇ体重。
（８．薬物投与の経路）：
臨床的に使用される静脈内注射と同様の、ゆっくりした静脈内注射。
（９．実験の方法）：
アルベンダゾールを使用して、腸の寄生虫を殺し、そして実験動物を購入する前にツベ
ルクリン試験を実施し、次いで、環境適応試験；血液試験、生化学試験、尿試験および心
電図検査を２回実施して、実験動物が健康な状態であることを保証した。動物の体重およ
び性別に基づいて、各々の群に６頭の動物、オス半数およびメス半数を含む、４つの群に
分類した。投与した薬物の容積は、１．０ｍｌ／ｋｇ体重であり、体重は、各々の薬物投
与の前に毎週測定し、そして投与すべき薬物の容積は、測定した体重に従って調整し、各
々の群における２／３および１／３の動物（それぞれ２頭のメスザルおよび１頭のオスザ
ル）を、３週間の薬物投与の２４時間後に殺し、そして回復期間の３週間後の終わりに、
検死を実施し、器官を秤量し、器官係数を計算し、そして病理組織検査を行った。血液を
血液検査および生化学検査のために抜き取り、そして骨髄塗抹標本を薬物投与の１０日目
および検死の前に実施した。
９．１ 試薬：
９．１．１ 血液試験のための試薬。
９．１．２ 血清生化学試験のための試薬：微量の輸入生化学試薬。
９．１．３ 抗体検出のための主な試薬。
１．コーティング液：１００ｍｌの水中に溶解させたＮａＨＣＯ３ ０．２９３ｇ、
Ｎａ２ＣＯ３ ０．１５９ｇ。
２．基板緩衝溶液：ｐＨ ５．０、水中に溶解させたクエン酸 １．０２ｇ、Ｎａ２
ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ３．６８ｇ。
３．清浄溶液：１：２０００ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加した０．０１Ｍ ＰＢＳ。
４．封着溶液：１００ｍｌ中に溶解させた濃縮脱脂粉乳５ｇ、ｐＨ７．４ ０．０１
Ｍ ＰＢＳ。
５．ＨＲＰ標識ラット抗サル二次抗体：米国バッチ番号Ａ−２０５４のＳｉｇｍａ社
の製品。
６．Ｔｗｅｅｎ−２０：個別包装の輸入原材料、Ｚｅｎｓｕｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）
Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｌｔｄによって提供され
た。
７．テトラメチロ（ｔｅｔａｍｅｔｈｙｌｏ）−アミノベンゼン（ＴＭＢ）：個別包
装の輸入原材料、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｈｕａｍｅｉ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｃ
ｏｍｐａｎｙによって提供された。
８．Ｈ２ＳＯ４：分析試薬、Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇ Ｆｅｎｇ Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ Ｌｔｄ。
９．２ 装置：
Ｒｏｃｈｅ 血液検査血球計数器。
Ｈｉｔａｃｈｉ−７０６０ 生化学自動分析機。
５５０酵素標識機：米国のＢＩＯ−ＲＡＤの製品。
Ｈｅｒａｅｕｓ低温遠心分離機、独国のＨｅｒａｅｕｓ社。
Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ ｓｏｎｏｓ ５５００心電図検査機（Ｓ４プローブ
を使用）。
９．３ 血液試験の方法および血清生化学試験の方法：以下の表を参照のこと
血液試験の方法
Figure 0006603149
 血清生化学試験の方法
Figure 0006603149
 ９．４ 抗体検出の方法
コーティング抗原：注射用組換えヒトニューレギュリン−１ βＳ１７７−Ｑ２３７を
、コーティング緩衝溶液で６μｇ／ｍｌに希釈し、９６穴の酵素標識プレート中に１００
μｌ／穴で添加した、３７℃１時間。
封着：５回プレートを洗浄し、清浄溶液を用いて５％濃縮脱脂粉乳を調製する。
試験用指定血清の希釈；サンプル希釈溶液を用いてサンプルを希釈する、希釈勾配は１
：１００。
添加サンプル：封着した酵素標識プレートを３回洗浄し、試験用指定血清を添加する、
１００μｌ／穴、３７℃１時間。
酵素標識抗体の添加：プレートを５回洗浄し、１：１０００希釈したＨＲＰ標識ラット
抗サル免疫グロブリンを添加する、１００μｌ／穴、３７℃１時間。
基板：プレートを５回洗浄し、新規に調製した基板作動液を添加する、１００μｌ／穴
、３７℃１０分間。
終結：１穴あたり５０μｌの２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を添加して、反応を終了する。
端数検出：ポジティブな結果を、試験サンプルのＯＤ値として規定し、これはネガティ
ブコントロールのＯＤ値よりも２．１倍大きかった（血清は、１：１００希釈した）。
（１０．観察期間および研究期間）
１０．１ 死亡状態：
モニタリングを、１日１回または２回行い、そして任意の動物の死亡があった場合に、
動物の死亡時間を記録する。
１０．２ 全体的な症状：
全体的な外観、兆候、行動活動、ケージ表面に付着した血液または滲出液、毛皮の艶が
挙げられる。観察は、１日１回または２回行った。
１０．３ 体重：
体重を、１日１回薬物投与の前に測定した。
１０．４ 体温：
体温を、薬物投与の１日目、３日目および５日目に、薬物投与の前および薬物投与の１
時間後に計った。
１０．５ 飼料摂取：
１００ｇの果物と共に、顆粒飼料２００ｇを毎日各々のサルに与え、１日当たりの動物
１頭当たりの食物の消費を算出する。
１０．６ 心電計：
薬物投与の前、および、また薬物投与開始１０日後、薬物投与終了時ならびに回復期間
の間に、２回の心電計検査を行い、それぞれＰ−Ｒ値、ＱＲＳ値、ＱＴ値およびＳＴ値を
、計算した。
１０．７ エコー心臓検査器：
薬物投与の終了後および回復期間の最後かつ死体解剖の１日前に、死体解剖する計画の
動物を３％ペントバルビタール（３０ｍｇ／ｋｇ）の静脈注射で麻酔し、次いで、エコー
心臓検査を行って、心室内厚（ＩＶＳ)、左心室後壁（ＰＷ）、左心室拡張終期容量（Ｌ
ＶＤｄ）、左心室収縮末期容量（ＬＶＤｓ）、駆出画分（ＥＦ）、短縮画分（ｓｈｏｒｔ
ｅｎｉｎｇ ｆｒａｃｔｉｏｎ）（Ｆｓ）、僧帽弁血流ピーク値（ＭＶ）、大動脈弁血流
ピーク値（ＡＶ）および心拍（ＨＲ）を決定する。
１０．８ 血液学指数：
薬物投与前、薬物投与開始１０日後、薬物投与終了時、および３週間の回復期間の最後
（死体解剖前）、０．５ｍｌの血液を、伏在静脈から２回採血し、これを、抗凝血のため
に３．８％ ＥＤＴＡで処理し、以下の指数について検査した：赤血球数（ＲＢＣ）、網
赤血球数（Ｒｅｔ）、ヘモグロビン（Ｈｂ）、白血球数（ＷＢＣ）、ならびに以下：好中
球（Ｎ）、好酸球（Ｅ）、リンパ球（Ｌ）および単球（Ｍ）、を含む分化項目、血小板数
（ＰＬＴ）、凝固時間（ＣＴ），ヘマトクリット（Ｈｔ）、平均血球容積（ＭＣＶ）、平
均ヘモグロビン濃度（ＭＣＨ）、および平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）。
１０．９ 血清生化学指数：
薬物投与前、薬物投与開始１０日後、薬物投与終了時、および３週間の回復期間の最後
（死体解剖前）、５ｍｌの血液を、伏在静脈から２回採血し、遠心分離後血清を分離し、
そして以下の項目を試験した：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、ア
ラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、乳酸
デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、血中尿素窒素（Ｂ
ＵＮ）、総タンパク質（ＴＰ）、アルブミン（ＡＬＢ）、グルコース（ＧＬＵ）、血清総
ビリルビン（Ｔ−Ｂｉｌ）、クレアチニン（ＣＲＥ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）
、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、塩素（Ｃｌ−）、カルシウム（Ｃａ＋＋）
、マグネシウム（Ｍｇ＋＋）、およびリン（Ｐ＋＋＋）。
１０．９ 尿検査：
薬物投与前、薬物投与開始１０日後、薬物投与終了時、および３週間の回復期間の最後
（死体解剖前）、尿サンプルを収集し、白血球数、亜硝酸塩、ｐＨ値、尿タンパク、グル
コース、ケトン体、ウロビリノゲン、尿ビリルビンおよびヘモグロビンについて試験した
。
１０．１１ 糞便検査：
糞便寄生虫卵および潜血を、薬物投与前に試験した。また、糞便潜血試験を、薬物投与
開始１０日後、薬物投与終了時、および３週間の回復期間の最後にも行った。
１０．１２ 眼底検査：
眼底検査を、死体解剖前に、麻酔下で行った。
１０．１３ 全身的死体解剖：
各群における２／３および１／３の動物（各２匹の雌および１匹の雄）を、薬物投与３
週間後の２４時間および薬物投与終了後の回復期間の最後に屠殺し、死体解剖を行った。
１０．１４ 器官係数：
心臓、脳、肝臓、脾臓、肺、腎臓、副腎、胸腺、リンパ節、甲状腺、精巣もしくは子宮
、卵巣または前立腺を採取し、その重量を測定し、そして係数を計算した。
１０．１５ 病理組織学検査：
以下の器官の病理組織学試験を行った：心臓（左心室の前壁、右心室、横隔膜、左心房
、右心房）、肝臓、脾臓、肺、脳、胃、十二指腸、回腸、結腸、腎臓、膀胱、副腎、下垂
体、甲状腺、胸腺、膵臓、精巣、前立腺、卵巣、子宮、リンパ節（頚部、腸間膜）、血管
および注射した部位の皮下組織。
１０．１６ 骨髄検査：
大腿骨からの骨髄サンプルを、死体解剖前に麻酔下で採取し、塗抹標本を作製し、染色
し、光学顕微鏡検査を行って、巨核球（ｍａｇａｋａｒｙｏｃｙｔｅ）系、顆粒球および
赤血球系、リンパ球、形質細胞、および他の型の細胞を調べた。４つの四分区間および中
央部において５×１００個の有核細胞を計数し、ＧＥ比を計算し、写真撮影した。
１０．１７ 注射抗体検出のための血清組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７７−
Ｑ２３７：
薬物投与開始１週間後、２週間後および３週間後、ならびに回復期間の最後に、注射抗
体のための血清組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７７−Ｑ２３７を検出し、そして
抗体を検出し、検出した抗体が中和抗体であった場合にいつでも薬物投与を停止した。
１０．１８ データ処理および統計分析：
種々の用量群およびコントロール群から収集したデータについての統計学的検定として
、分散分析を行った。
（１１． 実験の結果：）
１１．１ 死亡状態：
実験期間中、試験薬物に関連する動物死は起こらなかった。３週間の薬物投与の最後に
、コントロール群および低用量群（５番および６番）の各１匹の動物の心拍の有意な減速
（２０〜３０拍／分）が、３週間の回復期間の最後に麻酔下のエコー心臓検査を通して見
られた；これは、過剰麻酔の徴候であり、従って、死体解剖を計画したより１日早く行っ
た。
１１．２ 一般的徴候：
薬物投与の２日目に、静脈注射の３０分後、高用量群の１匹の雄サルにおいて嘔吐が起
こった。薬物投与の２日目〜７日目の間、中用量群および高用量群における各１匹の動物
が、静脈注射の２０〜３０分後に嘔吐した。投与一週間後に全ての群の一部の動物に流涎
が起こり、その出現頻度は、高用量群において、他の薬物摂取群よりも有意に高かった；
低用量群中１匹の動物だけが、薬物投与の９日目に流涎を示した。薬物投与の２週間後、
高用量群において、起毛、毛皮のつやの消失、活動性の低下、食欲不振が現れた。軽度の
蒼白、注射部位の局所的皮膚および血管の硬化が、薬物投与の３日目から始まり、これは
進行的に亢進し、そして用量依存的であった。上述の症状および徴候は、薬物中止後の３
週間の回復期間に消失するかまたは改善された。不規則な淡黄色の下痢便が、高用量群の
２１番の動物において起こった。コントロール群の動物において、薬物投与の間および薬
物中止後の回復期間の間、異常な徴候は現れなかった。
１１．３ 体重変化：
コントロール群の動物と種々の薬物摂取群の動物との間で、有意の体重の相違は見られ
なかった（Ｐ＞０．０５）；動物における薬物投与前および後の自己比較は、高用量群の
動物において、有意な体重減少を示した（Ｐ＜０．０１）。
１１．４ 体温：
薬物投与の１日目、３日目、および５日目において、薬物投与前および薬物投与１時間
後に測定した体温に、有意な相違は見られなかった。
１１．５ 飼料摂取：
中用量群および高用量群の動物において、薬物投与１週間後、飼料の有意な残留、およ
び飼料の５０ｇ〜１５０ｇの種々の摂取量が見られた。コントロール群および低用量群の
動物において、飼料の残留は見られず、そして回復期間の全ての動物において飼料の残留
は起こらなかった。
１１．６ 心電計検査の結果：
薬物投与の１０日目に、全ての薬物摂取群の意識のある全ての動物において、有意の心
拍の減速は見られず（コントロール群の心拍と比較したときＰ＞０．０５）、そして全て
の薬物摂取群の意識のある動物において、有意の心拍の減速が起こった（コントロール群
の心拍と比較したときＰ＜０．０５、Ｐ＜０．０１）；同時に、Ｐ−Ｒ、ＱＲＳおよびＱ
Ｔの間隔を、低用量群および中用量群においてより顕著にするために延長したところ、薬
物中止３週間後、正常に戻った。中用量群および高用量群の動物におけるＲｖ１の電圧は
より高く、一方、高用量群、低用量群および中用量群におけるＳｖ１はより深く、各薬物
摂取群におけるＲｖ３の電圧は、より高かった（Ｐ＜０．０５；Ｐ＜０．０１およびＰ＜
０．００１）。異なった時間に収集した他の独立したパラメータにおいて軽度のゆらぎが
あったが、全て正常範囲内であった。
１１．７ エコー心臓検査の結果：
薬物投与３週間目および３週間の回復期間の最後に、コントロール群および種々の薬物
摂取群において、エコー心臓検査のパラメータにおいて、有意の相違は見られなかった（
Ｐ＜０．０５）。
１１．８ 血液学的検査の結果：
全実験期間の間、独立したパラメータの正常範囲内のゆらぎに加えて、有意な異常変化
は見られなかった。
１１．９ 血清生化学検査の結果：
全実験期間の間、独立したパラメータの正常範囲内のゆらぎに加えて、有意な異常変化
は見られなかった。
１１．１０ 尿検査の結果：
全ての薬物摂取群およびコントロール群における動物個体の尿検査において、尿タンパ
クの増加、陽性ケトン体（しかし、不規則である）が、薬物投与前、薬物投与開始１０日
後および薬物投与開始３週間後、３週間の回復期間（死体解剖前）に見られた。コントロ
ール群および全ての薬物摂取群の動物個体において、尿中の赤血球の過渡的な増加が見ら
れた。他の有意な異常は見られなかった。
１１．１１ 糞便検査の結果：
薬物投与前、薬物投与開始１０日後、薬物投与開始３週間後、および３週間の回復期間
（死体解剖前）に、全ての動物において、糞便潜血検査陰性が見られ、糞便寄生虫卵は見
られなかった。
１１．１２眼底検査の結果：
薬物投与３週間目および３週間の回復期間（死体解剖前）に行った眼底検査において、
異常は見られなかった。
１１．１３ 全身性死体解剖：
中用量群中の２番雄サルならびに２３番および２４番の雌サルにおいて、心嚢における
少量の浸出を発見し、薬物投与３週間目に、各動物から明淡黄色の液体を２〜３ｍｌ採取
した；くも膜下領域における水頭（ｈｙｄｒｏｒｃｅｐｈａｌｕｓ）が、高用量群の１番
および２１番の動物において見られ、各動物から明淡黄色の液体を１〜２ｍｌ採取した；
２１番動物において、心嚢における少量の浸出、結腸粘膜の表面上に出血箇所があり、こ
れは、潰瘍の病巣を有する２１番動物と一緒であった。高用量群の２２番雄サルにおいて
、肺葉における鬱血および出血性病変が見られた。コントロール群の８番サルは、過剰麻
酔のために死体解剖前に死亡し、死体解剖の間、肺に有意な鬱血およびまだら状の出血が
見られたが、他の有意な異常は見られなかった。
３週間の回復期間の最後に、くも膜下領域における水頭が、高用量群の１匹の雄の動物
および１匹の雌の動物（１０番；１４番）において見られ、これらからそれぞれ液体を０
．５ｍｌおよび３ｍｌ採取した；過剰麻酔し早めに死体解剖した動物において、有意の異
常は見られなかった。
他の器官において、異常は見られなかった。
上述の滲出液についての検査の結果は、これらが全て漏出液であることを実証した。
１１．１４ 器官の重さおよびこれらの係数
主要器官の重さを測定し、そして死体解剖の間、全ての動物の器官係数を計算した。試
験薬物と何かするような器官重量に異常な変化は、見られなかった。
１１．１５ 病理組織学検査の結果：
淡く染まった液胞が、「＋」または「＋〜＋＋」の重篤度を有する高用量群の１番、１
１番の雄サルおよび２１番雌サルにおいて、心房および心室の心筋の細胞質中に現れ、筋
状構造は維持された；心内膜および心膜の有意の異常のない、拡散小胞様変性があった。
他方、血管鬱血および中程度の水腫が、１１番および２１番のサルにおいて、くも膜下（
ｓｕｂａｒｃｈｎｏｉｄ）領域において見られた；死体解剖前に死んだ８番動物の死体解
剖の間、２１番動物の結腸粘膜の一部に、炎症細胞浸潤があった；肺胞（ａｖｌｅｏｌａ
）中隔、鬱血、肺のまだら状出血、肺胞（ａｖｌｅｏｌａ）の一部における浮腫液の充満
、腎臓、胃、結腸、腸および膵臓における部分的組織自己細胞溶解が見られた。他の異常
は見られなかった。
高用量群の１４番雌サルにおいて、心筋細胞質内の微小液胞、くも膜下領域における血
管収縮が見られた。過剰麻酔によって早めに死体解剖した動物において、有意な異常は、
発見されなかった。全ての薬物投与群において、注射部位内の血管における出血性変化に
加えて、刺激に対する有意な応答は見られなかった。散発性の偶然の病変（例えば、肺お
よび胃腸管における炎症反応）は、残りの動物において見られたが、それらのほとんどは
自然発生の病変であった。
（１１．１６ 骨髄試験の結果）
３週間の薬物投与および回復期の第３週目における麻酔下での剖検の前に、骨髄を右寛
骨から吸引し、塗抹作製、染色し、巨核球系、顆粒球系、赤血球系、リンパ球およびプラ
ズマ細胞ならびに他の型の細胞を、光学顕微鏡下で試験した。四分円および中央部分の５
×１００の有核細胞を計数し、分化の計数を行い、ＧＥ比を計算し、顕微鏡写真術を実施
した。
結果：顆粒球系、赤血球系および巨核球系全てにおいて、赤血球系に対する顆粒球の正
常な比で、正常な増殖が観察された。異常な病的な細胞および骨髄毒性による病的な障害
は起こらなかった。
（１１．１７ 注入抗体検出についての血清組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７
７−Ｑ２３７の結果）
全ての薬物摂取群における注射抗体検出についての全ての血清組換えヒトニューレギュ
リン−１βＳ１７７−Ｑ２３７は、薬物投与の開始の１、２、３週間後および回復期の３
週目の終わりでは、ネガティブな結果を示した。
（１２．考察）
アカゲザルへの注射のための７．５、１５、７５ｇ／ｄの組換えヒトニューレギュリン
−１βＳ１７７−Ｑ２３７の静脈内注射（使用した用量は、サルに対する用量の２、４、
２０倍と等量であった）；賦形剤をコントロールとして使用した；薬物中止の後３週間、
モニタリングを実施した。
実験の間、試験薬物と関連した動物死は生じなかった。薬物投与の開始の１週間後に各
薬物試験群の動物の一部で、嘔吐、吐き気および唾液分泌が生じた；薬物投与の２週間後
、高用量群の動物で、毛髪の直立、つやのない毛皮、活性の低下、摂食障害が観察された
；軽い蒼白、薬物注射の部位の局所的な皮膚および血管の硬化；前に述べた症状および徴
候は、薬物中止の３週間後で消えたかまたは低減した。薬物投与の期間および薬物中止後
の回復期の間、コントロール群の動物では、異常な徴候は、観察されなかった。
薬物投与の前後で自己と比較して、高用量群では、食物摂取は有意に低減し、体重は顕
著に低くなった。薬物投与の前後で、全ての動物の体温の顕著な変化はなかった。
血液学的な試験、生化学試験ならびに尿および糞便の試験は、顕著な毒性変化を示さな
かった。
心電図検査：１０日間の薬物投与において、意識のある動物では、心拍数の有意な減少
は観察されなかったのに対して、毎日の薬物摂取群の意識のある動物での３週の薬物投与
で、心拍数の有意な減少が生じたが、これはおそらく試験薬物の薬理学的な効果のためで
あり；さらに、心エコー図のＶ１およびＶ３誘導における比較的高い電圧のＲ波およびＳ
波は、おそらく動物の胸部誘導の変化と関連する。心エコー図、心拍数および他の指標に
おいて有意な異常は検出されず；心筋の肥大性変化は、病理学的には観察されなかった。
基底部試験における異常な変化は観察されなかった。
骨髄の塗抹標本では、有意な毒性病理学的な変化は、観察されなかった。
薬物投与の３週間で行なった剖検は、３匹の動物で（両方の培地のそれぞれおよび高用
量群で）心外膜液を示し、２〜３ｍｌの濾出液を取り除き得；高投薬群の２匹の動物で、
クモ膜下腔において水頭を発見し、１〜３ｍｌの濾出液を取り除いた。
心筋の細胞質、血管うっ血および軟膜下の軽い水腫で見られる種々の程度の小胞は、水
頭で観察された。これら全ては、試験薬物となんらかの関係を有した。
抗体試験は、ネガティブな結果を示した。
胃腸の症状（例えば、それらの動物の嘔吐、吐き気および摂食障害）はさらに、おそら
く、胃腸管での試験薬物の分布および排出のために、高用量群での体重の減少につながり
得た。症状（例えば、蒼白、注射部位での皮膚の硬化、心外膜液および水頭症が観察され
、薬物中止３週間後の高投薬群動物では、水頭症の完全な回復はなく、中用量および高用
量の組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７７−Ｑ２３７の注射群で、アカゲザルにお
いて毛細血管浸出物および漏出液症候群が起こり得ることを示した。さらに、意識のある
動物における心拍数の減速および高用量群動物の心筋の細胞質中の小胞は、全て試験薬物
と関連していた。
結論：合計３週間のアカゲザルへの注射のための７．５、１５、７５ｇ／ｄの組換えヒ
トニューレギュリン−１βＳ１７７−Ｑ２３７の毎日の静脈内注射および３週間の継続的
なモニタリングを実施した。結果は、注射のための組換えヒトニューレギュリン−１βＳ
１７７−Ｑ２３７の１０日間より長い継続的な注射が、意識のある動物において心拍数の
減速を引き起こし得ることを示した；それは、中用量群および高用量群のアカゲザルで、
胃腸の反応につながり得、心外膜液を引き起こし、水頭症および軽いうっ血および軟膜下
での水腫を引き起こし、水頭症は、高用量群の動物では、薬物中止の３週間後では完全に
は回復せず；注射した部位の皮膚および血管の蒼白および硬化は、薬物の中止後、次第に
回復した。これらの徴候は、毛細血管濾出液浸出症候群が潜在的な原因であることを示し
た。高用量の組換えヒトニューレギュリン−１βＳ１７７−Ｑ２３７の注射は、心筋の細
胞質に小胞を生じ得；全ての抗体試験がネガティブな結果を示した。３週間の薬物投与お
よび３週間の回復期の間に、心外膜液および水頭症を引き起こさなかった用量レベルは、
７．５ｇ／ｋｇ／ｄであった。
（実施例８．ＮＧＲ−１活性のインビトロでの決定（キナーゼレセプター活性化のため
のＥＬＩＳＡ試験）
（１．実験の原理）
ＨＥＲ２／ｎｅｕ遺伝子は、膜貫通タンパク質ｐ１８５をコードし、これはチロシンプ
ロテインキナーゼである。ニューレギュリン−１のＥｒｂＢ３またはＥｒｂＢ４との結合
は、ヘテロ二量体ＥｒｂＢ３−ＥｒｂＢ２およびＥｒｂＢ４−ＥｒｂＢ２形成を誘導し、
ＨＥＲ２によりコードされるチロシンプロテインキナーゼ（ニューレギュリン−１の機能
性シグナルの伝達を仲介する）を活性化する。ニューレギュリン−１のそのレセプターと
の結合がＥｒｂＢ２タンパク質のリン酸化を引き起こすという事実に基いて、本発明者ら
は、組換えニューレギュリン−１の生物学的活性をインビトロで定量的に決定するための
、迅速で、感度が良く、高流量の方法を確立する。
（２．実験材料）
２．１ ９６穴細胞培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）；Ｃｏｓｔａｒ ９６穴ＥＬＩ
ＳＡ検出プレート
２．２ Ｕ．Ｓ．ＡＴＣＣから導入したヒト乳癌細胞株を、３７℃で、５０％ ＣＯ２
下で、基本培養培地で培養した。
２．３ 所定量のＤＭＥＭを秤量し、対応する体積を定量し、３．７ｇ／ＬのＮａＨＣ
Ｏ２、０．１ｇ／Ｌ グルタミンおよび５．５ｇ／ＬのＨＥＰＥＳを添加した。
２．４ 基本培養培地
１０％ ウシ胎仔血清およびインスリン９ｍｇ／Ｌを含むＤＭＥＭ培地を４℃で保存し
た。
２．５ ＰＢＳ（０．０１Ｍ、ｐＨ７．４）を滅菌した。
２．６ ０．５％ 膵臓酵素
Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで調製した。
２．７ 抗ＥｒｂＢ２モノクローナル抗体コーティング緩衝溶液、ローション。
ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４と交差反応しないマウス抗ヒトＥｒｂＢ２細胞外機能性ド
メインＨ４モノクローナル抗体を選択する。
コーティング緩衝溶液；ｐＨ９．６、０．０５Ｍ 炭酸塩緩衝溶液。
ローション：０．０１Ｍ ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０。
２．８ 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識したマウス抗ヒトリン酸化プロテ
アーゼモノクローナル抗体（抗Ｐ−ｔｙｒ−ＨＲＰ）
２．９ 基質、基質緩衝溶液
基質（ＴＭＢ）：２ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢ（無水アルコールで調製）
基質緩衝液：０．２Ｍ クエン酸＋０．１Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４（ｐＨ５．０）。
作業基質：基質緩衝溶液９ｍｌ＋ＴＭＢ１ｍｌ＋３％ Ｈ２Ｏ２ １０μｌ（必要な場
合調製）。
２．１０ 停止薬剤：２Ｎ Ｈ２ＳＯ４。
２．１１ 細胞脱フラグメント化（ｃｅｌｌ ｄｅｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）溶液
１５０ｍＭ ＮａＣｌ＋５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ＋１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００＋２
ｍＭ（オルトバナジン酸ナトリウム）＋０．０１％（チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏ
ｌ））。一錠の混合プロテアーゼインヒビター（錠剤、プロテアーゼインヒビターの反応
混液（Ｔａｂｌｅｔｔｅｎ、Ｐｒｏｔｅａｓｅｎ−Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｎ−Ｃｏｃｋｔ
ａｉｌ））を、作業の前に各２５ｍｌに添加する。
２．１２ 標準物質および試験を求められる試料。
（３．実験手順）
プロセス３．１を、第１日目に実施し、第２日目にプロセス３．２〜３．３を実施し、
第３日目にプロセス３．４〜３．１２を実施した；ここで、３．１および３．２のプロセ
スは、滅菌条件下で実施すべきである。
３．１ 細胞の接種
ＭＣＦ−７細胞を所定量まで増殖させ、滅菌ＰＢＳ溶液で洗浄し、次いで０．２５％ト
リプシナーゼで消化した。計数後、細胞の濃度を基本培養培地で調節した。細胞を９６穴
細胞培養プレート（５×１０４／穴、１００μｌ／穴）に添加し、３７℃で５％ＣＯ２下
で培養箱中で一晩培養した。
３．２ 細胞飢餓
９６穴プレート中の全ての培養培地を吸引し、各穴を３７℃に加温したＰＢＳで洗浄し
、次いで１００μｌのＤＭＥＭ培養培地（ウシ血清を含まず、インシュリンを含まない）
を添加した。細胞を、３７℃で５％ＣＯ２下で培養箱中で２４時間培養した。
３．３ コーティング
抗ＥｒｂＢ２細胞外機能性ドメインＨ４抗体を、コーティング緩衝溶液で６μｇ／ｍｌ
になるまで希釈し、次いで、穴あたり５０μｌを９６穴ＥＬＩＳＡプレートに添加し、４
℃下で一晩（１６〜１８時間）置く。
３．４ 希釈コントロール溶液および試験を求められるサンプル溶液
コントロール溶液および試験を求められるサンプルを、ＤＭＥＭ培養培地（ウシ血清を
含まず、インシュリンを含まない）でそれぞれ２μｇ／ｍｌまで希釈し、次いで３倍の勾
配希釈を再度行い、全部で９希釈を有する。
３．５ 細胞のリン酸化
飢餓後９６穴細胞培養培地を吸引し、標準物質および試験を求められるサンプルを、穴
あたり１００μｌ添加し、各濃度２連の穴を準備する。同時にネガティブコントロール（
すなわち、ＤＭＥＭ培養培地プラセボコントロール）を準備する。３７℃下で２０分間反
応させた。
３．６ 細胞の分解
サンプルを迅速に吸引し、ＰＢＳで一回洗浄し、１００μｌの断片化溶液を各穴に添加
し、４℃の冷蔵庫で３０分間断片化した。足場性依存性細胞が全て落ちるまで、氷浴条件
下で水平に攪拌し、４℃で１５，０００ｒｐｍで１５分間遠心する。
３．７ ＥＬＩＳＡ検出プレートの密閉
プレートを５分間洗浄する。５％脱脂粉乳を洗浄溶液で調製し、プレートの各穴に２０
０μｌ添加し、３７℃下に２時間置く。
３．８ サンプル添加
密閉ＥＬＩＳＡプレートを３回洗浄した後、標準細胞断片化溶液および試験サンプル断
片化溶液を穴あたり９０μｌ添加し、同時にネガティブコントロールを準備し、３７℃下
に１時間置く。
３．９ 酵素標識抗体の添加
プレートを５回洗浄し、ＨＲＰ酵素結合マウス抗リン酸化チロシンタンパク質抗体を１
：５００ローション（手引書を使用して産物および使用する時間によって決定した）で希
釈し、プレートの各穴に１００μｌ添加する。３７℃下に１時間置く。
３．１０ 基質の発色
プレートを５回洗浄し、調製した基質作業溶液を穴あたり１００μｌで添加し、３７℃
下に１０分間置いた。
３．１１ 停止
反応を停止するために、２Ｎ Ｈ２ＳＯ４を穴あたり５０μｌで添加した。
３．１２ ＯＤ値の読み取り
ＥＬＩＳＡ読み取り装置による比色分析は、４５０ｎｍの波長、６５５の参照波長で決
定する。結果を記録する。
（４．計算）
組換えヒトニューレギュリン−１の濃度対ＯＤ値を用いた作図および分析を、線形回帰
方法を使用して行い、試験を求められる各サンプルの半有効量を計算した。
（５．必要な試薬処方箋）
１．ＤＭＥＭ基本培養培地
ウシ胎仔血清 １００ｍｌ
インシュリン ９．２ｍｇ
を１ＬのＤＭＥＭ培養培地に添加し、よく混合する。
２．細胞断片化溶液
ＮａＣｌ ４．３８ｇ
ＨＥＰＥＳ ５．９６ｇ
オルトバナジン酸ナトリウム ０．３６８ｇ
チメロサール（ｔｈｉｍｅｒｏｓｏｌ） ０．０５ｇ
Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００ ５ｍＬ
５００ｍＬのＨ２Ｏに溶解する。
３．コーティング溶液（ｐＨ９．６）
ＮａＨＣＯ３ ０．２９３ｇ
Ｎａ２ＣＯ３ ０．１５９ｇ
１００ｍＬのＨ２Ｏに溶解する。
４．１００ｍＬ基質緩衝溶液（ｐＨ５．０）
クエン酸 １．０２ｇ
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ３．６８ｇ
Ｈ２Ｏに溶解する。
５．密閉溶液（５％脱脂粉乳）
脱脂粉乳粉末 ５ｇ
１００ｍＬの０．０１ＭＰＢＳ（ｐＨ７．４）に溶解する。
６．０．０１Ｍ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ２．９０１４ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４・４Ｈ２Ｏ ０．２９６４ｇ
ＮａＣｌ ８．５ｇ
１０００ｍＬのＨ２Ｏに溶解する。
７．０．０１Ｍ ＰＢＳ−Ｔ（ｐＨ７．４）
１ｍｌのＴｗｅｅｎ２０を、２０００ＭＬの０．０１Ｍ ＰＢＳ中に添加し、よく混合
する。
８．２ｍｇ／ｍｌ ＴＭＢ
ＴＭＢ ２０ｍｇ
１０ｍＬの無水アルコールに溶解する。
９．２０×ＰＢＳ（１０００ＭＬ）
Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ ５８ｇ
ＮａＨ２ＰＯ４・４Ｈ２Ｏ ５．９ｇ
ＮａＣｌ １７０ｇ
１０００ｍＬのＨ２Ｏに溶解する。
上記実施例は、単に例示目的のために含まれ、本発明の範囲を制限することを意図しな
い。上記の実施例に対して多くの変化が可能である。上記の実施例に対する改変および変
化は、当業者には明らかであるので、本発明は、添付した特許請求の範囲の範囲によって
のみ制限されることが意図される。

Claims (26)

  1. 哺乳動物における心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための薬学的組成物であって、ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを含み、前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを３，６００Ｕ／ｋｇ以下の総レジメンで、２１日以下の間投与され、前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを（ａ）前記哺乳動物の体重に対して１μｇ／ｋｇから４０μｇ／ｋｇ、
    （ｂ）前記哺乳動物の体重に対して１０Ｕ／ｋｇから４００Ｕ／ｋｇ、または（ｃ）前記哺乳動物の体重に対して０．１４ｎｍｏｌ／ｋｇから５．６ｎｍｏｌ／ｋｇの投与量で、１日１回、２１日以下の間投与されるように調製される、薬学的組成物。
  2. 前記心筋梗塞による心不全がヒトにおけるものである、請求項１に記載の薬学的組成物。
  3. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントを１日当たり１７０Ｕ／ｋｇ以下の安全用量で投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
  4. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、ＥｒｂＢ２−ＥｒｂＢ４レセプターとの結合を通じて、その抗心筋梗塞活性を発揮する、請求項１に記載の薬学的組成物。
  5. 前記ニューレギュリンタンパク質が、ニューレギュリン１、ニューレギュリン２、ニューレギュリン３、およびニューレギュリン４からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の薬学的組成物。
  6. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、ヒトニューレギュリンβ２異性体のＥＧＦ様ドメインを含む、請求項１〜４のいずれかに記載の薬学的組成物。
  7. 前記ニューレギュリンタンパク質がニューレギュリンα２またはニューレギュリンβ２である、請求項１〜４のいずれかに記載の薬学的組成物。
  8. 前記ニューレギュリンタンパク質の機能的フラグメントが、配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むニューレギュリンβ２フラグメントである、請求項１〜４のいずれかに記載の薬学的組成物。
  9. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、心筋梗塞に関連する左心室拡張終末期径（ＬＶＥＤＤ）および左心室収縮終末期径（ＬＶＥＳＤ）の増加に拮抗する、請求項１に記載の薬学的組成物。
  10. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、心筋梗塞に関連する左心室ＥＦの減少に拮抗する、請求項１に記載の薬学的組成物。
  11. 前記心筋梗塞が、左心室拡大、減少した収縮機能および増加した充填圧からなる群から選択される臨床的特徴を有する、請求項１に記載の薬学的組成物。
  12. 前記ニューレギュリンタンパク質またはその機能的フラグメントが、薬学的に受容可能なキャリアまたは賦形剤と共に投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
  13. 心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための有効量の予防剤もしくは治療剤を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
  14. 前記ニューレギュリンタンパク質もしくはその機能的フラグメントが、前記予防剤または治療剤の投与の前、同時、またはその後に投与される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
  15. 前記予防剤または治療剤が、アンギオテンシンＩ−変換酵素インヒビター（ＡＣＥＩ）、カルシウムアンタゴニスト、β−レセプターアンタゴニスト、アスピリン、アトロピン、ニトログリセリン、スコポラミン、および血栓溶解剤からなる群より選択される、請求項１３に記載の薬学的組成物。
  16. 前記ＡＣＥＩが、カプトプリル、ラムプリル、リシノプリル、ゾフェノプリル、およびトランドラプリルからなる群より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  17. 前記カルシウムアンタゴニストがジルチアゼムまたはアムロジピンである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  18. β−レセプターアンタゴニストがカルベジロール、プロパノールオール、メトプロロール、アテノールオール、およびチモールオールからなる群より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  19. 前記血栓溶解剤が、ストレプトキナーゼ、ｔ−ＰＡ、およびアニストレプラーゼからなる群より選択される、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  20. 前記予防剤または治療剤が、アスピリンである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  21. 前記予防剤または治療剤が、アトロピンである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  22. 前記予防剤または治療剤が、ニトログリセリンである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  23. 前記予防剤または治療剤が、スコポラミンである、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  24. 前記予防剤または治療剤が、血栓溶解剤である、請求項１５に記載の薬学的組成物。
  25. 前記ニューレギュリンタンパク質が、静脈内投与される、請求項１に記載の薬学的組成物。
  26. キットであって、容器中の請求項１〜２５のいずれかに記載の薬学的組成物、および薬学的組成物を用いて心筋梗塞による心不全を予防、処置または遅延させるための指示書を備える、キット。
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