JP6438119B2 - ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 - Google Patents
ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6438119B2 JP6438119B2 JP2017511219A JP2017511219A JP6438119B2 JP 6438119 B2 JP6438119 B2 JP 6438119B2 JP 2017511219 A JP2017511219 A JP 2017511219A JP 2017511219 A JP2017511219 A JP 2017511219A JP 6438119 B2 JP6438119 B2 JP 6438119B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- seq
- nos
- sequence
- amplification
- optionally
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 57
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title description 77
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 title description 2
- 102100039905 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Human genes 0.000 claims description 62
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 57
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 56
- 101001042041 Bos taurus Isocitrate dehydrogenase [NAD] subunit beta, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 47
- 101000960234 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 claims description 47
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 47
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 30
- 101000599886 Homo sapiens Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 claims description 16
- 102100037845 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Human genes 0.000 claims description 16
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 12
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 11
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 claims description 7
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 7
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001138 tear Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 claims description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 70
- 102100032938 Telomerase reverse transcriptase Human genes 0.000 description 70
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 27
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 25
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 101710177984 Isocitrate dehydrogenase [NADP] Proteins 0.000 description 15
- 101710102690 Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic Proteins 0.000 description 15
- 101710175291 Isocitrate dehydrogenase [NADP], mitochondrial Proteins 0.000 description 15
- 101710157228 Isoepoxydon dehydrogenase patN Proteins 0.000 description 15
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 14
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 13
- 102200069690 rs121913500 Human genes 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 238000007480 sanger sequencing Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102100030979 Methylmalonyl-CoA mutase, mitochondrial Human genes 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 4
- 238000007857 nested PCR Methods 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 206010003571 Astrocytoma Diseases 0.000 description 3
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 3
- 201000010133 Oligodendroglioma Diseases 0.000 description 3
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 206010024627 liposarcoma Diseases 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 3
- GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N (8S)-8-amino-7-oxononanoic acid zwitterion Chemical compound C[C@H](N)C(=O)CCCCCC(O)=O GUAHPAJOXVYFON-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000005243 Chondrosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 102100036118 Far upstream element-binding protein 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710133945 Far upstream element-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 208000006990 cholangiocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 201000009483 spindle cell hemangioma Diseases 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010004146 Basal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000005262 Chondroma Diseases 0.000 description 1
- 102100021906 Cyclin-O Human genes 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 108700003861 Dominant Genes Proteins 0.000 description 1
- 108700000275 Drosophila cic Proteins 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101000897441 Homo sapiens Cyclin-O Proteins 0.000 description 1
- 101000984753 Homo sapiens Serine/threonine-protein kinase B-raf Proteins 0.000 description 1
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N Lomustine Chemical compound ClCCN(N=O)C(=O)NC1CCCCC1 GQYIWUVLTXOXAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035177 MELAS Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000000172 Medulloblastoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 101100240886 Rattus norvegicus Nptx2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 102100027103 Serine/threonine-protein kinase B-raf Human genes 0.000 description 1
- 208000000453 Skin Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010068771 Soft tissue neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000002439 alpha thalassemia-intellectual disability syndrome type 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010256 biochemical assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000004547 gene signature Effects 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 231100000118 genetic alteration Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 206010073131 oligoastrocytoma Diseases 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N procarbazine Chemical compound CNNCC1=CC=C(C(=O)NC(C)C)C=C1 CPTBDICYNRMXFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000624 procarbazine Drugs 0.000 description 1
- 230000002250 progressing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N pyrogallol Chemical group OC1=CC=CC(O)=C1O WQGWDDDVZFFDIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 125000000548 ribosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 102200055464 rs113488022 Human genes 0.000 description 1
- 201000000849 skin cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N vincristine Chemical compound C([N@]1C[C@@H](C[C@]2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C([C@]56[C@H]([C@@]([C@H](OC(C)=O)[C@]7(CC)C=CCN([C@H]67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)C[C@@](C1)(O)CC)CC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-XQKSVPLYSA-N 0.000 description 1
- 229960004528 vincristine Drugs 0.000 description 1
- OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N vincristine Natural products C1C(CC)(O)CC(CC2(C(=O)OC)C=3C(=CC4=C(C56C(C(C(OC(C)=O)C7(CC)C=CCN(C67)CC5)(O)C(=O)OC)N4C=O)C=3)OC)CN1CCC1=C2NC2=CC=CC=C12 OGWKCGZFUXNPDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
- C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
- C12Q2521/101—DNA polymerase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
- C12Q2525/10—Modifications characterised by
- C12Q2525/117—Modifications characterised by incorporating modified base
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2527/00—Reactions demanding special reaction conditions
- C12Q2527/101—Temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2531/00—Reactions of nucleic acids characterised by
- C12Q2531/10—Reactions of nucleic acids characterised by the purpose being amplify/increase the copy number of target nucleic acid
- C12Q2531/113—PCR
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、遺伝子アッセイ及び生化学アッセイの分野に関する。具体的には、それは、腫瘍性試料及びそれらの成分のアッセイに関する。
悪性神経膠腫は、成人における最も一般的な中枢神経系(CNS)原発悪性腫瘍であり、2012年の米国において14,000件を超える死亡の原因となっている2。世界保健機関(WHO)は、神経膠腫を種々の亜型に分類し、それらの悪性度を示すI〜IVの等級をそれらに付けるために使用されるいくつかの組織学的及び臨床的基準を定めた。星状細胞腫、乏突起神経膠腫、乏突起星状細胞腫、及び神経膠芽腫(GBM)3を含むびまん性神経膠腫(WHOグレードII〜IV)は、それらが全ての原発性悪性脳腫瘍の80%を占めるため、臨床的に特に重要である。これらの腫瘍は、びまん性で浸潤性であり、これは治療的な外科的切除を不可能にする。加えて、グレードII〜IIIのびまん性神経膠腫は、より高いWHOグレードIVのGBMに進行する能力も有する。GBMは、成人における最も一般的な悪性脳腫瘍であり、生存期間が最も短い(全生存期間の中央値は12〜15カ月である)4。加えて、同一の組織像を有する実体間であっても、患者の転帰は実質的に異なり得る。これは、より低いグレードから進行する二次性GBMと比較して、新たに発症する原発性GBMによって最もよく示される。両方の腫瘍は組織学的に区別できないが、二次性GBMを有する患者の生存率が原発性GBMのほぼ2倍であることから5、これらの疾患は遺伝子的及び臨床的にはっきりと異なる。
[本発明1001]
以下の段階を含む、腫瘍を有するヒトの身体試料を試験する方法:
増幅プライマーのセットを用いて前記ヒトの身体試料の腫瘍DNAを増幅する段階であって、各プライマーが、TERTプロモーターならびにIDH1及びIDH2配列を含む増幅産物を生成するための配列番号1〜14から選択される配列を含む、増幅する段階と、
前記増幅産物を検出する段階。
[本発明1002]
配列番号15〜21を含む増幅プライマーのセットを用いて前記身体試料中の腫瘍DNAを増幅する段階をさらに含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記腫瘍DNAがゲノムDNAである、本発明1001の方法。
[本発明1004]
前記腫瘍DNAが、事前増幅に供されたゲノムDNAである、本発明1001の方法。
[本発明1005]
前記増幅のサイクルの少なくとも一部が、66℃以上で行われる、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記増幅の前記サイクルの一部が、60℃以下で行われる、本発明1005の方法。
[本発明1007]
前記身体試料の前記腫瘍DNAの別個のアリコートが、(a)配列番号1〜3、(b)配列番号4〜6、(c)配列番号3及び6、(d)配列番号7〜9、(e)配列番号9及び10、(f)配列番号11〜13、(g)配列番号13〜14を含む、プライマーの複数のセットを用いて増幅される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
前記増幅が定量的PCRとして実施される、本発明1001の方法。
[本発明1009]
前記事前増幅が、高忠実度のDNAポリメラーゼを用いる、本発明1004の方法。
[本発明1010]
前記事前増幅が、66℃以上のアニーリング温度を用いる、本発明1004の方法。
[本発明1011]
前記事前増幅が、68℃以上のアニーリング温度を用いる、本発明1004の方法。
[本発明1012]
前記事前増幅が、多重反応として行われる、本発明1004の方法。
[本発明1013]
前記身体試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、及び涙からなる群から選択される、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記身体試料が生検試料である、本発明1001の方法。
[本発明1015]
前記身体試料が針吸引物である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
配列番号1、2、4、5、7、8、11、及び12の前記プライマーのうちの少なくとも1つが、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1017]
配列番号1、2、4、5、7、8、11、及び12の前記プライマーの各々が、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、本発明1001の方法。
[本発明1018]
配列番号15〜21の前記プライマーのうちの少なくとも1つが、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1019]
配列番号15〜21の前記プライマーの各々が、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、本発明1002の方法。
[本発明1020]
タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に結合している、本発明1001の方法。
[本発明1021]
タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に結合している、本発明1002の方法。
[本発明1022]
(a)TERT C228Tセグメント及びTERT C250Tセグメント、ならびに(b)IDH1 R132Hセグメント及びIDH1野生型セグメントを含む、TERT/IDH1用ヘテロ接合型キャリブレータプラスミドであって、前記TERTセグメントの各々が等しい量及びサイズで存在し、前記IDH1セグメントの各々が等しい量及びサイズで存在する、ヘテロ接合型キャリブレータプラスミド。
本発明者らは、TERTプロモーター、IDH1/2のホットスポット変異を、迅速に、特異的に、かつ高感度に検出することができる高感度な定量的PCR(qPCR)基づくアッセイを開発した。このqPCRに基づく診断アッセイは、変異体DNAが0.1%の突然変異遺伝子まで低い場合等、正常DNAのバックグラウンドが高い場合も変異体DNAを検出することができる。これは、サンガー配列決定法に基づく従来の方法よりも200倍高感度である。検出限界は、放射(BEAMing)等の他の高価な時間のかかる複雑な技法と同様であるが、qPCRアッセイは、ほんの数時間で終えることができ、単一のPCRステップを必要とする。このアッセイの高感度のため、それは循環腫瘍DNA(ctDNA)における変異の検出を可能にする。ctDNAは、癌患者の血液、尿、及びCSF中でごく限られた量で発見されることが多いが、外科的介入を伴わずに患者を診断することができる「液体生検材料」として使用されることが期待されている。腫瘍再発または薬物耐性発現は、これらの体液を検査することによって監視され得る。しかしながら、本アッセイは体液の使用に限定されず、より伝統的な組織及び生検試料上でも同様に使用することができる。
A.バックグラウンド:
対立遺伝子特異的PCRは、目的とするバリエーションを含有する鋳型の選択的増幅のために使用されるDNA鋳型増幅の一形態であり、このため、SNP遺伝子型決定のための方法である18。ほとんどの方法は、目的とする遺伝子型を有する標的配列により高い相補性を有する判別用プライマーに依存している。これはほとんどの場合、プライマーの3’を変異の位置に配置させて、標的バリアントまたは野生型ヌクレオチドのみに相補的であるようにさせることによって行われる。この方法では、プライマーが非標的対立遺伝子に結合し、選択的増幅をもたらす場合、PCR効率が低減する(図6)。
プライマー設計
本発明者らは、TERTプロモーター及びIDH1/2の両方において最も頻発する変異の検出のための診断法として使用するためのいくつかの対立遺伝子特異的プライマー、ならびに増幅に必要とされるそれらの対立遺伝子非特異的対立プライマーを設計及び試験した(表1A)。注目すべきは、これらの高性能対立遺伝子特異的(AS)プライマーを確立するために、本発明者らは、これらのプライマーの判別を改善するための種々の長さ、導入された強制ミスマッチ(3’−1及び−2位)、ならびに様々なLNAの位置を有する10を超える異なる候補となるASプライマーを設計した。この判別能力を試験するために、本発明者らは、正常DNAのバックグラウンド下で15コピーつまり0.1%までの腫瘍DNAの標準希釈法を使用し、依然として特定の産物を生成しながらqPCR上で最も大きいΔCtを有するプライマーを評価した。加えて、本発明者らは、TERTプロモーターのこの領域を特異的に増幅し、断片化したDNAソース(すなわち、ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋(FFPE)、ctDNA)を増幅することができる十分に小さい増幅産物(160bp未満)を生成するPCR産物をもたらすために、再び20を超える異なる候補となる対立プライマーをバックグラウンドなしで試験した。他の対立プライマーも候補となるASプライマーと連携したが、本発明者らは、qPCRを容易にするために最も小さい増幅産物を選択した(表1、2)。最後に、本発明者らは、極めて稀なIDH1 R132変異(R132C,G,S,L)及びIDH2 R172変異(R172M,W,G)用の同様の対立遺伝子特異的プライマーも開発したが、これらは神経膠腫での用途で使用し得るものの、IDH1 R132Hプライマーセットが最も有用である。
*増幅される標的領域は、M13配列タグが追加されるため、AS増幅産物に関して18bp短く、非AS増幅産物に関して36bp短いことに注意されたい
PCRプログラム及び試薬は、対立遺伝子特異的及び非AS様式で、ならびに2つの異なる状況((1)ゲノムDNAのPCR及び(2)事前増幅されたゲノムDNAのネステッドPCR)において、TERTプロモーター及びIDH1/2エクソン4の両方を効率的に増幅する。変異状態が迅速に必要とされ、複製物でのPCRを実施するために十分な試料が存在する用途に対しては、第1のプログラムが推奨される。限られたDNAが存在する、またはDNAの品質が不十分である用途に対しては、第2のプログラムが推奨される。
効率的な対立遺伝子特異的PCRを可能にするPCRプログラムを創出することは、特にプライマーの位置の制限のため困難である。TERTプロモーターは、その高いGC含量(目的とする領域を通して80%超、及びC228からC250の区間において88%)及び反復配列(目的とする領域における4つのGの10回反復)のため、増幅が困難であることで有名である。野生型と突然変異遺伝子とを最大限判別するために、本発明者らが用いる増幅プログラムは、高アニーリング温度(66℃以上)での初期段階の増幅、続いてより低いアニーリング温度(60℃以下)での第2段階の増幅を使用する。5℃/秒の傾斜率を有する本発明者らのサーモサイクラーでは、このプログラムは、融解曲線を除いて1時間未満である(表3)。これは、さらにより迅速な検出を容易にするために、より高温(例えば、98℃で1分間)でのより短い変性及びより短いアニーリング時間を用いて調整することができ、それは術中診断のシナリオに適用可能であり得る。本発明者らは、より高いアニーリング温度(66℃以上)で最も有効である従来の単一アニーリング温度プログラムも使用したが、これらは感度が低い。本発明者らは、全てのプライマーセットに対して最も有効である最大限の判別のためのプログラムを以下に列記した。対立遺伝子特異的(AS)プライマーは、二重HPLC精製に供された特別注文のオリゴヌクレオチドとしてExiqon(Woburn,MA,USA)から購入された。非ASプライマーは、標準精製された特別注文のオリゴヌクレオチドとしてIDT(Coralville,Iowa,USA)から購入された。
変異検出のための第2の手法は、ネステッドqPCR手法であり、これは低品質試料(すなわち、ctDNA、FFPE gDNA)、及び必要な複製物に不十分である分析物含量の少ない試料(すなわち、細針生検材料)に非常に有効である。このネステッドqPCRアッセイも、PCR阻害として信頼性の高い定量性を有し、プライマー効率の差は、ネステッドPCR環境においてはるかに重要ではない。この手法を使用するために、目的とする遺伝子座は、高アニーリング温度(66℃以上)で、限定されたサイクル数(20サイクル未満)に対する高忠実度の酵素を使用して、TERTプロモーター、IDH1、もしくはIDH2において、または多重様式で3つ全てにおいて、非バイアス(NB)プライマーセットを用いて増幅される(表5、6)。次いで、結果として得られるPCR産物は、精製され(カラムベースまたはビーズベースの手法のいずれかを使用する)、希釈され(通常は1:1000)、上述の対立遺伝子特異的LNA修飾プライマーを使用する次のラウンドの増幅のための鋳型として機能する。ネステッドPCRは、それが最も高い判別を提供するため、66℃以上のアニーリング温度で実施される(表7、8)。このネステッド手法の利益は、全てが1〜50ngのgDNAから生成される、はるかに多くの鋳型の供給があることであり、これらは、さもなければ生じ得るより多くの変異に対してスクリーニングされ得る。本発明者らは、ネステッドqPCRのための高性能PCRプログラムを以下に記載する。事前増幅反応を複数の反応に分けることは有益であり(例えば、50μlを5×10μlに分割する)、これは次いでプールされてもよい。このステップに続いて、カラムまたはビーズベースの手法を使用してPCR産物を精製することができる。
プレートの読み取りは、ステップ3で、及びSYBR及び融解曲線を使用する場合は、FAM/SYBRに対してステップ5で生じる
TERTプローブ:
IDH1プローブ:
。TERTプローブは、C228TとC250Tとの間の共通領域内に設計される一方、IDH1プローブは、対立遺伝子特異的プライマーと共通プライマーとの間の領域に設計され、したがって全ての対立遺伝子特異的IDH反応(R132S、C、L、G、及びH)に対して使用することができる。
AS TERT及びIDH1/2プライマーセットと同時に、本発明者らは、対立遺伝子非特異的様式で、2つの変異(C228T及びC250T)を有するTERTプロモーター領域、R132H変異を有するIDH1エクソン4を増幅するプライマー、及び高反復性ヒトline−1要素を増幅するように設計されるプライマー:
も使用する。この情報を使用して、WTまたはMUT対立遺伝子を増幅する対立遺伝子特異的PCRからのCt値を正規化し、突然変異遺伝子画分の定量的読取値を提供することができ、試料の相互比較が可能となる。E章で言及されるように、試料が全て同一濃度である場合は、これは必要ではない。これに加えて、検証のため、50%変異体試料(陽性対照)、1%変異体試料(低変異陽性対照)、0%野生型試料(陰性対照)、及び鋳型を含まない対照等の試料を含む、いくつかの標準化された試料が、試験される試料とともに実行される。これらの標準物質は、既知のTERT/IDH状態を有する細胞株からゲノムDNA(gDNA)を単離することによって生成された。一例として、本発明者らは、以下の細胞株:DAOY(C228T)、A375(C250T)、HCT116(野生型)、及びHCT116 IDH1 R132Hノックイン#2(IDH1 R132H)からのgDNAを使用する。標的となる遺伝子座におけるgDNA野生型でのこれらの試料の希釈は、1%以下の必要とされる標準物質をもたらす。標準物質の別のソースは、標的変異を有するプラスミドDNAであり、本発明者らは、TOPOクローニング(K4810−01、Life technologies)を使用して「100%標準物質」として生成した。本発明者らは、目的とする変異を有する腫瘍試料からのTERTプロモーター/IDH1/2の一部分のPCR増幅によって生成された挿入断片を使用した。加えて、現実的な定量対照として機能させるために、本発明者らは、これらの遺伝子座を同じプラスミドに、または同様の様式で別個のプラスミドにクローニングすることによって他の標的変異に拡張され得る、TERT及びIDH1の目的とする変異の両方を有する完全なヘテロ接合体プラスミドを生成した(詳細は以下を参照されたい、図7)。
データ分析にはいくつかのオプションが存在する。最も簡単な一つの手法は、全試料を確実に同じ濃度にして、種々の変異割合に応じた標準細胞株DNAの希釈から生成される傾向線を使用し、突然変異遺伝子画分を逆算することである(図9)。以下に示されるように、傾向線は、優れた直線性を有する(R2>0.994)。
上記プライマーセット及び条件を使用して、本発明者らは、高レベルのバックグラウンド下でのこれらのプライマーの検出の限界を試験し、15,000の野生型コピーのバックグラウンド下で15の変異体ゲノムDNAコピー(0.1%)まで確実に検出し、これを0%(野生型)試料と区別することができることを発見した(図10)。ネステッドqPCRを使用して、対立遺伝子特異的PCRで高い判別性も達成することができる(図11)。
臨床に関連する状況下で本発明者らのアッセイを試験するために、本発明者らは、サンガー配列決定法を使用して以前に遺伝子型決定された43の神経膠腫試料からDNAを採取し、この方法を使用してTERTプロモーターWT及びIDH1 R132 WTを識別した。本発明者らは、本発明者らのqPCRアッセイを使用し、TERTプロモーターC228T変異を有する9個の試料及びIDH1 R132H変異を有する3個の試料、合計12個の試料つまり全体の28%を識別した。いずれも10%未満の割合を有し、これらは以前、従来の方法では検出不可能であった(表11)。加えて、このアッセイは、定量的結果を伴って約1時間以内に完了した一方で、サンガー配列決定法では、PCRの後にさらなる配列決定ステップを伴う。
Claims (19)
- 以下の段階を含む、腫瘍を有するヒトの身体試料を試験する方法:
増幅プライマーのセットを用いて前記ヒトの身体試料の腫瘍DNAを増幅する段階であって、各プライマーが、少なくとも1つのTERTプロモーター配列を含む増幅産物ならびに少なくとも1つのIDH1配列を含む増幅産物及び少なくとも1つのIDH2配列を含む増幅産物を生成するための:
任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号3、6、9、10、13、および14の配列;ならびに
配列番号1、2、4、5、7、8、11、および12の配列;
から選択される配列からなり、該プライマーが増幅反応で使用される際に、以下からなる対で使用され:
配列番号1の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号3の配列;
配列番号2の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号3の配列;
配列番号4の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号6の配列;
配列番号5の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号6の配列;
配列番号7の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号9の配列;
配列番号8の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号9の配列;
配列番号11の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号13の配列;
配列番号12の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号13の配列;
任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号3の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号6の配列;
任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号9の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号10の配列;ならびに
任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号13の配列および任意で配列番号28および29から選択されるタグ配列をさらに含む配列番号14の配列であり、
配列番号1、2、4、5、7、8、11、および12からなるプライマーが、その3’末端に修飾LNAヌクレオチドを含む、増幅する段階と、
前記増幅産物を検出する段階。 - 配列番号15〜21の配列を含む増幅プライマーのセットを用いて前記身体試料中の腫瘍DNAを増幅する段階をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍DNAがゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記腫瘍DNAが、事前増幅に供されたゲノムDNAである、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅のサイクルの少なくとも一部が、66℃以上で行われる、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅の前記サイクルの一部が、60℃以下で行われる、請求項5に記載の方法。
- 前記身体試料の前記腫瘍DNAの別個のアリコートが、(a)配列番号1〜3、(b)配列番号4〜6、(c)配列番号3及び6、(d)配列番号7〜9、(e)配列番号9及び10、(f)配列番号11〜13、および(g)配列番号13〜14の配列を含む、プライマーの複数のセットを用いて増幅される、請求項1に記載の方法。
- 前記増幅が定量的PCRとして実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記事前増幅が、高忠実度のDNAポリメラーゼを用いる、請求項4に記載の方法。
- 前記事前増幅が、66℃以上のアニーリング温度を用いる、請求項4に記載の方法。
- 前記事前増幅が、68℃以上のアニーリング温度を用いる、請求項4に記載の方法。
- 前記事前増幅が、多重反応として行われる、請求項4に記載の方法。
- 前記身体試料が、脳脊髄液(CSF)、血液、リンパ液、血清、血漿、尿、唾液、粘液、及び涙からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記身体試料が生検試料である、請求項1に記載の方法。
- 前記身体試料が針吸引物である、請求項1に記載の方法。
- 配列番号15〜21の配列を含む前記プライマーのうちの少なくとも1つが、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、請求項2に記載の方法。
- 配列番号15〜21の配列を含む前記プライマーの各々が、その3’末端にLNA修飾ヌクレオチドを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に位置している、請求項1に記載の方法。
- 前記タグ配列が、前記プライマーのうちの少なくとも1つの5’末端に位置している、請求項2に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462041197P | 2014-08-25 | 2014-08-25 | |
US62/041,197 | 2014-08-25 | ||
PCT/US2015/046519 WO2016032947A1 (en) | 2014-08-25 | 2015-08-24 | Methods for rapid and sensitive detection of hotspot mutations |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017525375A JP2017525375A (ja) | 2017-09-07 |
JP6438119B2 true JP6438119B2 (ja) | 2018-12-12 |
Family
ID=55400402
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017511219A Active JP6438119B2 (ja) | 2014-08-25 | 2015-08-24 | ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10633711B2 (ja) |
EP (1) | EP3186399B1 (ja) |
JP (1) | JP6438119B2 (ja) |
KR (2) | KR20170042725A (ja) |
CN (1) | CN106795563B (ja) |
AU (1) | AU2015306907C9 (ja) |
BR (1) | BR112017003559A2 (ja) |
SG (2) | SG10201805800XA (ja) |
WO (1) | WO2016032947A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107541557A (zh) * | 2017-09-27 | 2018-01-05 | 迈基诺(重庆)基因科技有限责任公司 | 一种检测人类tert基因启动子热点突变的荧光定量pcr方法及其用途 |
WO2019173712A1 (en) * | 2018-03-09 | 2019-09-12 | Duke University | Addressing treatments for glioblastoma |
CN111424094A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-07-17 | 航天中心医院 | 一种检测人tert基因启动子热点突变的方法 |
CN110724742A (zh) * | 2019-10-18 | 2020-01-24 | 航天中心医院 | 一种检测人tert基因启动子热点突变的试剂盒 |
CN114381518A (zh) * | 2020-10-05 | 2022-04-22 | 复旦大学附属华山医院 | 一种用于快速检测胶质瘤突变位点及分型的引物和试剂盒 |
CN115261463B (zh) * | 2021-04-30 | 2024-06-07 | 北京泛生子基因科技有限公司 | 检测人idh基因和tert基因启动子突变的试剂盒、引物探针组合物、引物组合物 |
CN114182003B (zh) * | 2022-01-11 | 2024-06-25 | 杭州百迈生物股份有限公司 | 用于cyp3a5多态性位点基因分型检测的试剂盒及其检测方法 |
Family Cites Families (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1751309B1 (en) * | 2004-05-27 | 2015-07-22 | The Regents of The University of Colorado | Methods for prediction of clinical outcome to epidermal growth factor receptor inhibitors by cancer patients |
CA2684570A1 (en) * | 2007-04-19 | 2008-10-30 | Molecular Detection Inc. | Methods, compositions and kits for detection and analysis of antibiotic-resistant bacteria |
WO2010028099A1 (en) | 2008-09-03 | 2010-03-11 | The Johns Hopkins University | Genetic alterations in isocitrate dehydrogenase and other genes in malignant glioma |
SG183029A1 (en) * | 2009-01-13 | 2012-08-30 | Fluidigm Corp | Single-cell nucleic acid analysis |
AU2010256347A1 (en) * | 2009-06-02 | 2011-12-08 | Flinders University | A method of nucleic acid amplification |
US20130143747A1 (en) * | 2011-12-05 | 2013-06-06 | Myriad Genetics, Incorporated | Methods of detecting cancer |
GB201004339D0 (en) * | 2010-03-16 | 2010-04-28 | Enigma Diagnostics Ltd | Sequence detection assay |
EP2569637B1 (en) * | 2010-05-14 | 2015-04-08 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Methods for the diagnosis and prognosis of a tumor using bcat1 protein |
CN103571953A (zh) * | 2013-10-28 | 2014-02-12 | 深圳市第二人民医院 | Tert启动子的单核苷酸多态性序列的检测方法 |
CN103923976A (zh) * | 2014-01-28 | 2014-07-16 | 吴松 | 一种检测tert单核苷酸多态性的方法 |
-
2015
- 2015-08-24 KR KR1020177007188A patent/KR20170042725A/ko active Application Filing
- 2015-08-24 AU AU2015306907A patent/AU2015306907C9/en active Active
- 2015-08-24 EP EP15837033.8A patent/EP3186399B1/en active Active
- 2015-08-24 US US15/505,777 patent/US10633711B2/en active Active
- 2015-08-24 CN CN201580045332.4A patent/CN106795563B/zh active Active
- 2015-08-24 JP JP2017511219A patent/JP6438119B2/ja active Active
- 2015-08-24 SG SG10201805800XA patent/SG10201805800XA/en unknown
- 2015-08-24 BR BR112017003559A patent/BR112017003559A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-08-24 WO PCT/US2015/046519 patent/WO2016032947A1/en active Application Filing
- 2015-08-24 SG SG11201701220PA patent/SG11201701220PA/en unknown
- 2015-08-24 KR KR1020197015966A patent/KR102278401B1/ko active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP3186399A4 (en) | 2018-07-18 |
SG10201805800XA (en) | 2018-08-30 |
EP3186399A1 (en) | 2017-07-05 |
AU2015306907C1 (en) | 2019-11-07 |
US20170247765A1 (en) | 2017-08-31 |
KR20170042725A (ko) | 2017-04-19 |
KR102278401B1 (ko) | 2021-07-19 |
WO2016032947A1 (en) | 2016-03-03 |
AU2015306907C9 (en) | 2019-11-21 |
JP2017525375A (ja) | 2017-09-07 |
KR20190065479A (ko) | 2019-06-11 |
EP3186399B1 (en) | 2022-06-22 |
SG11201701220PA (en) | 2017-03-30 |
CN106795563A (zh) | 2017-05-31 |
CN106795563B (zh) | 2021-08-06 |
BR112017003559A2 (pt) | 2017-12-19 |
AU2015306907B2 (en) | 2018-07-19 |
US10633711B2 (en) | 2020-04-28 |
AU2015306907A1 (en) | 2017-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6438119B2 (ja) | ホットスポット変異の迅速かつ高感度の検出のための方法 | |
US11674183B2 (en) | Analytical methods for cell free nucleic acids and applications | |
JP2008545418A (ja) | 癌の診断、予後診断、および治療のための遊離循環dnaの使用 | |
JP2015517321A (ja) | 定量的多重メチル化特異的PCR法−cMethDNA、試薬、及びその使用 | |
Miyamae et al. | Mutation detection of epidermal growth factor receptor and KRAS genes using the smart amplification process version 2 from formalin-fixed, paraffin-embedded lung cancer tissue | |
JP2024020392A (ja) | 特定の遺伝子のcpgメチル化変化を利用した肝癌診断用組成物およびその使用 | |
CN105745335A (zh) | 用于对cMET核酸进行多模态分析的组合物及方法 | |
JP6453781B2 (ja) | ヒトpi3kca(pik3ca)遺伝子変異検出のための方法及び組成物 | |
JP2016538872A (ja) | ゲノムの完全性及び/又は確定的制限酵素部位全ゲノム増幅によって得られたdna配列のライブラリの質を判定する方法及びキット | |
Chen et al. | Establishment of multiplex allele-specific blocker PCR for enrichment and detection of 4 common EGFR mutations in non-small cell lung cancer | |
CN110964833A (zh) | 一种一管检测血浆游离dna中kras和braf基因突变的试剂盒 | |
JP2016189746A (ja) | プライマー対、プローブ、薬剤耐性c型肝炎ウイルスの検出キット、薬剤耐性c型肝炎ウイルスの検出方法およびc型肝炎の予後予測方法 | |
KR20070116567A (ko) | 위 암종으로부터의 림프절 전이의 검출법 | |
WO2023145754A1 (ja) | 膀胱癌の存在を検出するためのプライマー及びプローブ | |
EP2496710B1 (en) | Determination of 17q gain in neuroblastoma patients by analysis of circulating dna | |
WO2024048753A1 (ja) | ヘリコバクター・ピロリ除菌後の患者が胃癌を発症するリスクを評価する方法、ポリヌクレオチド及びキット | |
WO2023282179A1 (ja) | マイクロアレイキット、マイクロアレイを用いたターゲット検出方法 | |
RU2688189C1 (ru) | Панель последовательностей олигонуклеотидов для определения мутации Q61R гена NRAS в опухолевых образованиях щитовидной железы | |
KR101930818B1 (ko) | 방광암의 비침습적 진단 방법 | |
KR101977351B1 (ko) | 항암제 저항성 또는 민감성 예측용 조성물 | |
RU2631824C1 (ru) | Способ выявления генных мутаций BRAF в опухолях человека | |
TW202328459A (zh) | 一種腫瘤檢測方法及應用 | |
JP2011015679A (ja) | 黒色腫の早期検出のための方法及び試薬 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170407 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170407 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180516 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180704 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20181022 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20181115 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6438119 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R157 | Certificate of patent or utility model (correction) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R157 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |