JP6160814B2 - Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same - Google Patents
Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same Download PDFInfo
- Publication number
- JP6160814B2 JP6160814B2 JP2013093388A JP2013093388A JP6160814B2 JP 6160814 B2 JP6160814 B2 JP 6160814B2 JP 2013093388 A JP2013093388 A JP 2013093388A JP 2013093388 A JP2013093388 A JP 2013093388A JP 6160814 B2 JP6160814 B2 JP 6160814B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gene
- rhodococcus
- seq
- genome
- dna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
本発明は、ロドコッカス属に属する細菌のゲノムの標的配列を改変する方法に関する。具体的には、前記細菌の有する非相同的な外来DNA挿入能力を喪失させ、標的遺伝子改変が容易になった前記細菌とその製造方法に関する。 The present invention relates to a method for modifying the target sequence of the genome of a bacterium belonging to the genus Rhodococcus. Specifically, the present invention relates to the bacterium in which non-homologous foreign DNA insertion ability of the bacterium is lost and the target gene modification is facilitated, and a method for producing the bacterium.
ロドコッカス属に属する細菌(以下「ロドコッカス属細菌」という)は、その物理的強度、有機溶媒耐性、酸化還元能、酵素などを細胞内に多量に蓄積する能力などを有することから、産業的に有用な微生物触媒として知られている。例えば、ロドコッカス属細菌は、ニトリル類の酵素的水和や加水分解によるアミド若しくは酸の生産などに利用されている(特許文献1、特許文献2)。また、難分解性化合物に対する分解能の高い微生物種としても知られており(特許文献3〜6)、その能力を活用することで、種々の有用物質の生産や環境浄化へ応用することへの検討が進められている。そのような応用の例としては、脱硫による石油からの有用物質の生産、あるいは環境への石油流出時におけるバイオレメディエーションなどが挙げられる。
加えて、ロドコッカス属細菌を遺伝子組換えの方法により、さらに有用なものに改変する試みがなされている(特許文献7〜9)。例えば、ロドコッカス属細菌の遺伝子操作を効率的に推し進めるために、宿主−ベクター系の開発が進められており、新規なプラスミドの探索(特許文献10〜12)、ベクターの開発(特許文献13〜20、非特許文献1)などが行われている。このようにロドコッカス属細菌の有用性が明らかになるに従って、従来の遺伝子組換え手法の開発に加えて、宿主としてのロドコッカス属細菌自体を使用目的に応じて望む特性を有するように改変する手法の開発が期待されてきた。
ところで、細胞におけるDNAの組換えは、様々な状況で生じる現象であり、例えば、ゲノムDNAに切断等の損傷が発生した際や、外来DNAが何らかの原因により細胞内に侵入してゲノムDNAに組み込まれる際に生じることが分かっている。DNAの組換えのメカニズムについては、DNA修復に関する精力的な研究により多くの知見が得られてきている。重篤なDNA損傷であるDNA二本鎖切断(DSB: double strand break)の修復においては、哺乳動物や酵母など真核生物では2つの主要な修復経路が機能していることが明らかになっている。その1つはDNA配列間の相同配列間の組換え(相同組換え、HR: homologous recombination)であり、もう1つはDNAの相同性を利用することなくDNA末端の直接的なライゲーションによりDBSを修復する非相同的な組換え(非相同末端結合、NHEJ: non-homologous end joining)である。HR及びNHEJのうち、どちらの経路が優先的に機能するかは生物種により異なる。これに関連して、糸状菌においては、NHEJの鍵酵素であるATP依存性DNAリガーゼIV、又はDNA末端結合タンパク質Kuの機能を低下又は喪失させることにより、相同組換えの効率が向上した例が報告されている(特許文献21、特許文献22)。
原核生物における相同組換えによるDSB修復については、大腸菌をモデル生物とした研究がなされており、RecAと呼ばれるリコンビナーゼとRecBCD複合体(へリカーゼとヌクレアーゼからなる複合体)が関与していることが知られている。非相同末端結合によるDSB修復については、マイコバクテリア属細菌をモデル生物にした研究がなされており、DNA末端結合タンパク質(Ku)及びATP依存性DNAリガーゼの2つのタンパク質が、DSB修復に関与していることが知られている(非特許文献2)。しかしながら、マイコバクテリア属細菌では、ロドコッカス属細菌で見られるような外来DNAのゲノムへの非相同的な組換えに関する研究例は無く、マイコバクテリア属細菌がロドコッカス属細菌で見られる上記特徴を有しているかは不明である。
Bacteria belonging to the genus Rhodococcus (hereinafter referred to as "Rhodococcus bacteria") are industrially useful because of their physical strength, organic solvent resistance, redox ability, ability to accumulate large amounts of enzymes, etc. in cells. Known as a novel microbial catalyst. For example, Rhodococcus bacteria are used for the production of amides or acids by enzymatic hydration or hydrolysis of nitriles (Patent Documents 1 and 2). It is also known as a high-resolution microbial species for persistent compounds (Patent Documents 3 to 6), and by utilizing its capabilities, it is considered to be applied to the production of various useful substances and environmental purification. Is underway. Examples of such applications include the production of useful substances from petroleum by desulfurization, or bioremediation when oil spills into the environment.
In addition, attempts have been made to modify Rhodococcus bacteria to more useful ones by genetic recombination methods (Patent Documents 7 to 9). For example, in order to efficiently promote genetic manipulation of Rhodococcus bacteria, development of host-vector systems has been promoted. Searching for new plasmids (Patent Documents 10 to 12), development of vectors (Patent Documents 13 to 20) Non-Patent Document 1) and the like have been performed. As the usefulness of Rhodococcus bacteria becomes clear in this way, in addition to the development of conventional genetic recombination techniques, the method of modifying Rhodococcus bacteria itself as a host to have desired characteristics according to the purpose of use. Development has been expected.
By the way, recombination of DNA in cells is a phenomenon that occurs in various situations. For example, when damage such as cleavage occurs in genomic DNA, or when foreign DNA enters the cell for some reason and is incorporated into genomic DNA. Is known to occur when Much knowledge has been obtained about the mechanism of DNA recombination by vigorous research on DNA repair. In repairing DNA double-strand breaks (DSB), which are serious DNA damages, it has become clear that two major repair pathways are functioning in eukaryotes such as mammals and yeast. Yes. One is recombination between homologous sequences between DNA sequences (homologous recombination, HR), and the other is DBS by direct ligation of DNA ends without using DNA homology. Non-homologous recombination (NHEJ: non-homologous end joining). Which of HR and NHEJ functions preferentially depends on the species. In this regard, in filamentous fungi, there are examples in which the efficiency of homologous recombination has been improved by reducing or losing the function of ATP-dependent DNA ligase IV, which is the key enzyme of NHEJ, or the DNA end-binding protein Ku. It has been reported (Patent Document 21, Patent Document 22).
DSB repair by homologous recombination in prokaryotes has been studied using E. coli as a model organism, and it is known that a recombinase called RecA and a RecBCD complex (a complex consisting of a helicase and a nuclease) are involved. It has been. DSB repair by non-homologous end joining has been studied using mycobacteria as model organisms, and two proteins, DNA end-binding protein (Ku) and ATP-dependent DNA ligase, are involved in DSB repair. (Non-Patent Document 2). However, there are no studies on non-homologous recombination of foreign DNA into the genome as seen in Rhodococcus bacteria, and the Mycobacterium bacteria have the above-mentioned characteristics found in Rhodococcus bacteria. It is unknown whether it is.
上記の通り、産業分野への応用がなされているロドコッカス属細菌をより有効に活用するためには、従来の遺伝子組換えによる有用タンパク質の発現に加え、ロドコッカス属細菌のゲノム上の遺伝子を特異的に欠失あるいは不活性化することにより、代謝経路を改変若しくは再設計することが効果的である。
ゲノム上に存在する遺伝子を欠失あるいは不活性化する手法としては、相同組換えを利用する方法が挙げられる。ロドコッカス属細菌において相同組換えにより遺伝子を欠失又は不活性化させる場合、通常の形質転換法であるエレクトロポレーション法を用いても、目的の遺伝子の欠失株や不活性化株を得ることは非常に困難である。これは、ゲノム上の標的遺伝子への「相同的な」組換えではなく、「非相同的な」組換えが優先的に起こってしまうためであると考えられる。
そして、ロドコッカス属細菌に関しては、上記のようなDNA修復等のメカニズムに関する研究例はなく、また、外来DNAのゲノムへの非相同的な組換えに関しても、どのようなメカニズムで起こっているのか明らかになっていなかった。
本発明は、非相同的な外来DNA挿入能力を喪失し、標的遺伝子の改変が容易なロドコッカス属細菌を提供することを目的とする。
As mentioned above, in order to more effectively utilize Rhodococcus bacteria that have been applied to the industrial field, in addition to the expression of useful proteins by conventional genetic recombination, specific genes on the genome of Rhodococcus bacteria are specifically selected. It is effective to modify or redesign metabolic pathways by deleting or inactivating them.
As a technique for deleting or inactivating a gene present on the genome, a method utilizing homologous recombination can be mentioned. When a gene is deleted or inactivated by homologous recombination in a Rhodococcus bacterium, the target gene deletion strain or inactivated strain can be obtained even using the electroporation method, which is a normal transformation method. Is very difficult. This is thought to be because “non-homologous” recombination preferentially occurs, rather than “homologous” recombination to the target gene on the genome.
Regarding Rhodococcus bacteria, there are no examples of the above-mentioned mechanisms for DNA repair, etc., and it is clear what mechanism is involved in heterologous recombination of foreign DNA into the genome. It was not.
An object of the present invention is to provide a Rhodococcus bacterium that loses the ability to insert non-homologous foreign DNA and can easily modify a target gene.
本発明者らは、ロドコッカス属細菌の非相同組換えに関与するタンパク質を明らかにし、その機能を抑制することにより、前記細菌の有する非相同的な外来DNA挿入能力を喪失させ、標的遺伝子改変が容易なロドコッカス属細菌を作製できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下の通りである。
本発明は、ゲノムへの非相同的な外来DNA断片挿入に関与するタンパク質をコードする遺伝子を欠失又は不活性化させたロドコッカス属細菌変異株に関するものである。
本発明は、本発明のロドコッカス属細菌変異株に、前記変異株のゲノムの少なくとも一部と相同な配列を含む遺伝子構築物を導入することを含む、遺伝的に改変されたロドコッカス属細菌を製造する方法でもある。
なお、本発明において、「外来DNA断片」とは、宿主であるロドコッカス属細菌とは異なる生物種に由来するDNA断片、宿主であるロドコッカス属細菌と同種の生物種に由来するDNA断片、及び複数の生物種由来のDNA断片により構成されるキメラDNA断片を指す。キメラDNA断片には、宿主であるロドコッカス属細菌由来の配列が含まれていてもよいものとする。
The present inventors have clarified a protein involved in non-homologous recombination of Rhodococcus bacteria and suppressed its function, thereby losing the non-homologous foreign DNA insertion ability of the bacteria, and target gene modification The present inventors have found that it is possible to easily produce Rhodococcus bacteria and have completed the present invention.
Specifically, the present invention is as follows.
The present invention relates to a Rhodococcus bacterium mutant in which a gene encoding a protein involved in heterologous foreign DNA fragment insertion into a genome is deleted or inactivated.
The present invention produces a genetically modified Rhodococcus bacterium comprising introducing a gene construct comprising a sequence homologous to at least a part of the genome of the mutant strain into the Rhodococcus bacterium mutant of the present invention. It is also a method.
In the present invention, the term “foreign DNA fragment” refers to a DNA fragment derived from a species different from the host Rhodococcus bacterium, a DNA fragment derived from the same species as the host Rhodococcus bacterium, and a plurality of It refers to a chimeric DNA fragment composed of DNA fragments derived from these species. The chimeric DNA fragment may contain a sequence derived from a host Rhodococcus bacterium.
本発明のロドコッカス属細菌変異株によれば、ロドコッカス属細菌のゲノム改変が容易になるので、ロドコッカス属細菌に対して、より効率的に代謝経路の改変若しくは再設計を実施できる。これにより、当該細菌を宿主等に用いた効率的な物質生産をより容易に実施することが可能になる。 According to the Rhodococcus bacterium mutant of the present invention, the genome modification of the Rhodococcus bacterium is facilitated. Therefore, the metabolic pathway can be modified or redesigned more efficiently for the Rhodococcus bacterium. This makes it possible to more easily carry out efficient substance production using the bacterium as a host or the like.
以下、本発明を詳細に説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
なお、本明細書において引用された全ての刊行物、例えば先行技術文献、及び公開公報、特許公報その他の特許文献は、参照として本明細書に組み込まれる。
Hereinafter, the present invention will be described in detail. The scope of the present invention is not limited to these descriptions, and other than the following examples, the scope of the present invention can be appropriately changed and implemented without departing from the spirit of the present invention.
It should be noted that all publications cited in the present specification, for example, prior art documents, publications, patent publications and other patent documents are incorporated herein by reference.
1.標的とする非相同組換え遺伝子を有する微生物
本発明に係るゲノムへの非相同的な外来DNA挿入能力を喪失させたロドコッカス属細菌(以下、「本発明の微生物」ということがある)は、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する遺伝子(以下、「非相同組換え遺伝子」)が欠失又は不活性化された変異株である。
ロドコッカス属細菌としては、ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J1、M8(SU1731814)、M33(VKM Ac-1515D)、ATCC 184、ATCC 999、ATCC 4001、ATCC 4273、ATCC 4276、ATCC 9356、ATCC 12483、ATCC 12674、ATCC 13808、ATCC 14341、ATCC 14347、ATCC 14350、ATCC 15905、ATCC 15998、ATCC 17041、ATCC 17043、ATCC 17895、ATCC 19067、ATCC 19149、ATCC 19150、ATCC 21243、ATCC 21291、ATCC 21785、ATCC 21924、ATCC 21999、ATCC 29670、ATCC 29672、ATCC 29675、ATCC 33258、ATCC 33275、ATCC 39484、IFO 3338、IFO 14894、JCM 3202、NCIMB 11215、NCIMB 11216、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)PR4(NBRC 100887)、NBRC 12320、NBRC 15567、NBRC 16296、IFM 155、DSM 743、DSM 9675、DSM 43200、JCM 6821、JCM 6822、JCM 6823、JCM 6824、JCM 6827、DSM 11397、DSM 44522、JCM 2895、JCM 2893、JCM 2894、IAM 1400、IAM 1503、SK121、ロドコッカス・ピリジノボランス(Rhodococcus pyridinovorans)MW3、S85-2、PA、AK37、PYJ-1、ロドコッカス・オパカス(Rhodococcus opacus)B4、PD630、ロドコッカス・ジョスティ(Rhodococcus jostii)RHA1等、ロドコッカス・イムテケンシス(Rhodococcus imtechensis)、ロドコッカス・エクイ(Rhodococcus equi)103S、ATCC 33707が挙げられる。
本発明における非相同組換え遺伝子とは、ロドコッカス属細菌において、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与するタンパク質(非相同組換えタンパク質)をコードする遺伝子、すなわち非相同組換え遺伝子のことを指す。非相同組換え遺伝子としては、配列番号1または配列番号21で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質が挙げられる。配列番号1で示されるタンパク質は、全ゲノム情報が公開されているロドコッカス・エリスロポリスPR4の有するタンパク質で、LigD(ATP-dependent DNA ligase、accession no: YP_002767969)とアノテーション(注釈)されている。本発明においては、前記LigDとアノテーションされた遺伝子(LigDホモログ遺伝子)の機能を喪失させることにより、PR4株が非相同的な外来DNA挿入が抑制されることが明らかとなった。LigDは上述のように、マイコバクテリア属細菌においてNHEJ の鍵酵素として機能することが知られているため、ロドコッカス属に見られる非相同的な外来DNA挿入には、NHEJ 経路が関与していると推測される。また、配列番号21で示されるタンパク質は、ロドコッカス・ロドクロウスJ1の有するタンパク質で、ATP-dependent DNA ligaseと相同性を有するタンパク質である。本発明においては、前記ATP-dependent DNA ligaseと相同性を有する遺伝子を欠失させることにより、J1株の相同組換能が向上することが明らかとなった。
また、本発明における非相同組換え遺伝子には、配列番号1または配列番号21で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含み、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質;及び配列番号1または配列番号21で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と60%以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質であり、且つ、ゲノムへの外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質を含む。
これらのタンパク質は、PR4株、J1株以外のロドコッカス属細菌の複数の株においても、LigDとアノテーションされており、且つ、前記PR4株、J1株の「非相同組換えタンパク質」と高いホモロジーを有するタンパク質をコードしている。これらも各株における非相同的な外来DNA挿入に関与していると推測される。PR4株、J1株の「非相同組換えタンパク質」と高いホモロジー(相同性)を有するタンパク質としては、ロドコッカス・エリスロポリスSK121のLigC(ATP-dependent DNA ligase、accession no: ZP_04383046;配列番号13;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は98%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は63%)、ロドコッカス・オパカスB4のLigD(ATP-dependent DNA ligase、accession no: YP_002782304;配列番号14;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は73%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は66%)、ロドコッカス・ジョスティRHA1のDNA ligase(ATP-dependent、accession no: YP_704987;配列番号15;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は73%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は65%)、ロドコッカス・イムテケンシスRKJ300のATP-dependent DNA ligase(accession no: EID78745;配列番号16;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は73%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は66%)、ロドコッカス・オパカスPD630のDNA ligase(accession no: EHI44149;配列番号17;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は73%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は65%)、ロドコッカス・エクイ103SのATP-dependent DNA ligase(accession no: YP_004005863;配列番号18;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は68%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は62%)、ロドコッカス・エクイATCC 33707のDNA ligase(accession no: ZP_08155867;配列番号19;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は68%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は62%)、ロドコッカス・ピリジノボランスAK37のATP-dependent DNA ligase(accession no: ZP_09308731;配列番号20;配列番号1のアミノ酸配列との相同性は61%、配列番号21のアミノ酸配列との相同性は95%)等が挙げられる。以上の生物種で見出されている各LigDホモログのアラインメントを図4に示す。
また、本発明の非相同組換え遺伝子には、配列番号2で示される前記PR4株LigD遺伝子及び前記PR4株LigDホモログ遺伝子と相補的な配列を含むDNA、または配列番号22で示される前記J1株LigD遺伝子及び前記J1株LigDホモログ遺伝子と相補的な配列を含むDNAの各々とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与するタンパク質をコードする遺伝子も含まれる。
ここで、ストリンジェントな条件とは、特異的なハイブリダイゼーションのみが起き、非特異的なハイブリダイゼーションが起きないような条件をさす。ストリンジェントな条件は配列に依存的であるが、通常、一般的なハイブリダイゼーション条件よりも塩濃度を低く設定したり、ホルムアミドを加えたりすることにより最適化できる。
1. Microorganisms having target heterologous recombination genes Rhodococcus bacteria (hereinafter sometimes referred to as “microorganisms of the present invention”) that have lost the ability to insert non-homologous foreign DNA into the genome according to the present invention are genomes. This is a mutant strain in which a gene involved in heterologous foreign DNA insertion (hereinafter, “non-homologous recombination gene”) has been deleted or inactivated.
As Rhodococcus bacteria, Rhodococcus rhodochrous J1, M8 (SU1731814), M33 (VKM Ac-1515D), ATCC 184, ATCC 999, ATCC 4001, ATCC 4273, ATCC 4276, ATCC 9356, ATCC 12483, ATCC 12674, ATCC 13808, ATCC 14341, ATCC 14347, ATCC 14350, ATCC 15905, ATCC 15998, ATCC 17041, ATCC 17043, ATCC 17895, ATCC 19067, ATCC 19149, ATCC 19150, ATCC 21243, ATCC 21291, ATCC 21785, ATCC 21924, ATCC 21999, ATCC 29670, ATCC 29672, ATCC 29675, ATCC 33258, ATCC 33275, ATCC 39484, IFO 3338, IFO 14894, JCM 3202, NCIMB 11215, NCIMB 11216, Rhodococcus erythropolis PR4 (NBRC 100887), NBRC 12320, NBRC 15567, NBRC 16296, IFM 155, DSM 743, DSM 9675, DSM 43200, JCM 6821, JCM 6822, JCM 6823, JCM 6824, JCM 6827, DSM 11397, DSM 44522, JCM 2895, JCM 2893, JCM 2894 , IAM 1400, IAM 1503, SK121, Rhodococcus pyrid inovorans) MW3, S85-2, PA, AK37, PYJ-1, Rhodococcus opacus B4, PD630, Rhodococcus jostii RHA1, etc., Rhodococcus imtechensis, Rhodococcus imtechensis equi) 103S, ATCC 33707.
The non-homologous recombination gene in the present invention refers to a gene encoding a protein (non-homologous recombination protein) involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome in Rhodococcus bacteria, that is, a non-homologous recombination gene. Point to. Examples of the heterologous recombination gene include a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 21. The protein represented by SEQ ID NO: 1 is a protein possessed by Rhodococcus erythropolis PR4 whose whole genome information is disclosed, and is annotated with LigD (ATP-dependent DNA ligase, accession no: YP_002767969). In the present invention, it has been clarified that non-homologous foreign DNA insertion in the PR4 strain is suppressed by losing the function of the gene annotated as LigD (LigD homolog gene). As described above, LigD is known to function as a key enzyme for NHEJ in mycobacterial bacteria, so that the NHEJ pathway is involved in heterologous foreign DNA insertion found in Rhodococcus. Guessed. The protein represented by SEQ ID NO: 21 is a protein possessed by Rhodococcus rhodochrous J1 and is a protein having homology with ATP-dependent DNA ligase. In the present invention, it has been clarified that the homologous recombination ability of the J1 strain is improved by deleting a gene having homology with the ATP-dependent DNA ligase.
The heterologous recombinant gene of the present invention includes an amino acid sequence obtained by deleting, substituting, or adding one or several amino acids in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 21, and A protein having a function involved in heterologous insertion of foreign DNA into the genome; and a protein comprising an amino acid sequence having 60% or more homology with a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 21 And a protein having a function involved in the insertion of foreign DNA into the genome.
These proteins are also annotated as LigD in multiple strains of Rhodococcus bacteria other than PR4 and J1 strains, and have high homology with the “non-homologous recombination proteins” of the PR4 and J1 strains. It encodes a protein. These are also presumed to be involved in heterologous foreign DNA insertion in each strain. As a protein having high homology (homology) with PR4 strain and J1 strain “non-homologous recombination protein”, Rhodococcus erythropolis SK121 LigC (ATP-dependent DNA ligase, accession no: ZP_04383046; SEQ ID NO: 13; sequence) The homology with the amino acid sequence of No. 1 is 98%, the homology with the amino acid sequence of SEQ ID No. 21 is 63%), and LigD of Rhodococcus opacus B4 (ATP-dependent DNA ligase, accession no: YP_002782304; SEQ ID NO: 14; The homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 73%, the homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is 66%), the DNA ligase of Rhodococcus josti RHA1 (ATP-dependent, accession no: YP_704987; SEQ ID NO: 15; 73% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, 65% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21), ATP-dependent DNA ligase (accession no: EID78745; SEQ ID NO: 16; sequence of Rhodococcus imtekensis RKJ300) Number 1 73% homology with the non-acid sequence, 66% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21), DNA ligase (accession no: EHI44149; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 1) of Rhodococcus opacus PD630 Is 73%, homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 is 65%), Rhodococcus equii 103S ATP-dependent DNA ligase (accession no: YP_004005863; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) Homology 68%, 62% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21), Rhodococcus equi Ecc ATCC 33707 DNA ligase (accession no: ZP_08155867; SEQ ID NO: 19; homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 68%, 62% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21), ATP-dependent DNA ligase (accession no: ZP_09308731) of Rhodococcus pyridinovorans AK37; SEQ ID NO: 20; homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is 61 %, Homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 It includes 95%), and the like. The alignment of each LigD homolog found in the above species is shown in FIG.
The heterologous recombination gene of the present invention includes DNA comprising a sequence complementary to the PR4 strain LigD gene represented by SEQ ID NO: 2 and the PR4 strain LigD homolog gene, or the J1 strain represented by SEQ ID NO: 22. A gene that hybridizes under stringent conditions with each of the LigD gene and DNA containing a sequence complementary to the J1 strain LigD homolog gene and encodes a protein involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome Is also included.
Here, stringent conditions refer to conditions in which only specific hybridization occurs and non-specific hybridization does not occur. Stringent conditions are sequence-dependent, but can usually be optimized by setting the salt concentration lower than general hybridization conditions or by adding formamide .
2.標的とする非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化された微生物の製造方法
標的とする非相同組換え遺伝子を欠失又は不活性化する方法は限定されず、如何なる方法を適用してもよい。例えば、当該遺伝子又はその周辺配列と相同な配列を有するプラスミドでロドコッカス属細菌を形質転換する方法を用いることができる。形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や接合伝達法等が使用できる。
エレクトロポレーション法によるロドコッカス属細菌の形質転換の手法は本発明の技術の属する分野において周知である。また、形質転換法の詳細については、Journal of General Microbiology 138: 1003-1010等を参照することができる。
ここで、上記欠失又は不活性化する方法として、エレクトロポレーション法を使用した場合、非相同組換え株が圧倒的に多く出現し、所望の相同組換え微生物を探し当てることが困難であるため、本発明では接合伝達法が特に好ましい。接合伝達法による形質転換方法の詳細については、特開2011-200133号公報を参照することができる。
具体的には、例えば、ドナー微生物からレシピエント微生物への接合伝達を利用した形質転換方法を用いることにより、本発明の、標的とする非相同組換え遺伝子の欠失又は不活性化する方法であって、以下の工程(a)〜(d)を含むことを特徴とする方法により、本発明の微生物を得ることができる。本発明における接合伝達法による形質転換は、以下の工程(a)〜(d)を含む方法により行われることが好ましい。
(a)レシピエント微生物として、ドナー微生物の生育を阻害する生育条件への耐性を示す選択マーカー(以下、「ドナー微生物生育阻害マーカー」という)が導入され、或いは強化されたロドコッカス属細菌を作製する工程;
(b)ドナー微生物として、下記(i)〜(v) を含む、非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する工程;
(i)レシピエント微生物中の標的とする非相同組換え遺伝子とその周辺の塩基配列とを含む塩基配列において当該遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域、
(ii)当該ドナー微生物において機能する接合伝達開始領域、
(iii)当該ドナー微生物において機能する複製開始領域、
(iv)レシピエント微生物の生育を阻害する生育条件への耐性を示す選択マーカー(以下、「レシピエント微生物生育阻害マーカー」という)、及び
(v)レシピエント微生物に対する条件致死遺伝子
(c)工程(b)で作製されたドナー微生物から工程(a)で作製されたレシピエント微生物への接合伝達を行うことにより、当該レシピエント微生物の形質転換体を作製する工程;並びに
(d)工程(c)で作製された形質転換体を、前記条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する工程。
上記欠失又は不活性化方法においてレシピエントとして使用するロドコッカス属細菌は、特に限定されない。
接合伝達を用いた遺伝子欠失又は不活性化を行う場合、ドナーとなる微生物の組換え株(ドナー微生物)とレシピエントとなる微生物(レシピエント微生物)の非組換え株の双方の生育を阻害しなければならないため、2種類の選択マーカー(ドナー微生物生育阻害マーカー及びレシピエント微生物生育阻害マーカー)が必要である。ドナー微生物生育阻害マーカーはレシピエント微生物自体が有している必要がある。レシピエント微生物生育阻害マーカーは、非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド中に含まれている必要がある。両マーカーの詳細については、下記の各工程において説明する。
2. Method for producing microorganism in which target heterologous recombination gene is deleted or inactivated The method for deleting or inactivating target nonhomologous recombination gene is not limited, and any method can be applied. Good. For example, a method of transforming Rhodococcus bacteria with a plasmid having a sequence homologous to the gene or its peripheral sequence can be used. As a transformation method, an electroporation method, a junction transfer method, or the like can be used.
The technique of transformation of Rhodococcus bacteria by electroporation is well known in the field to which the technology of the present invention belongs. For details of the transformation method, Journal of General Microbiology 138: 1003-1010 can be referred to.
Here, when the electroporation method is used as the method for deletion or inactivation, it is difficult to find a desired homologous recombination microorganism because an overwhelmingly large number of non-homologous recombination strains appear. In the present invention, the joint transmission method is particularly preferable. JP, 2011-200133, A can be referred to for details of the transformation method by the junction transfer method.
Specifically, for example, by using a transformation method using conjugative transfer from a donor microorganism to a recipient microorganism, the method for deleting or inactivating a target heterologous recombinant gene of the present invention is used. And the microorganisms of this invention can be obtained by the method characterized by including the following process (a)-(d). The transformation by the junction transfer method in the present invention is preferably performed by a method including the following steps (a) to (d).
(a) As a recipient microorganism, a Rhodococcus bacterium having a selective marker (hereinafter referred to as “donor microorganism growth inhibition marker”) showing resistance to growth conditions that inhibits the growth of a donor microorganism is introduced or enhanced. Process;
(b) a step of producing a microorganism transformed with a non-homologous recombinant gene loss-of-function plasmid comprising the following (i) to (v) as a donor microorganism;
(i) a base sequence region in which the gene is deleted or inactivated in the base sequence including the target heterologous recombinant gene in the recipient microorganism and the surrounding base sequence,
(ii) a junction transmission initiation region that functions in the donor microorganism;
(iii) a replication initiation region that functions in the donor microorganism,
(iv) a selection marker (hereinafter referred to as a “recipient microorganism growth inhibition marker”) that exhibits resistance to growth conditions that inhibit the growth of the recipient microorganism, and
(v) Conditionally lethal genes for recipient microorganisms
(c) producing a transformant of the recipient microorganism by performing conjugation transfer from the donor microorganism produced in step (b) to the recipient microorganism produced in step (a); and
(d) A step of culturing the transformant prepared in the step (c) under a culture condition in which the conditionally lethal gene can function.
The Rhodococcus bacterium used as a recipient in the deletion or inactivation method is not particularly limited.
In the case of gene deletion or inactivation using conjugative transfer, the growth of both the recombinant strain of the donor microorganism (donor microorganism) and the non-recombinant strain of the recipient microorganism (recipient microorganism) is inhibited. Therefore, two kinds of selection markers (donor microbial growth inhibition marker and recipient microbial growth inhibition marker) are necessary. The donor microorganism growth inhibition marker must be possessed by the recipient microorganism itself. The recipient microorganism growth inhibition marker must be contained in a plasmid for loss of function of the heterologous recombination gene. Details of both markers will be described in the following steps.
2-1. 工程(a)
工程(a)では、ドナー微生物生育阻害マーカーが導入され、或いは強化されたロドコッカス属細菌を作製する。上述の理由から、レシピエントとなるロドコッカス属細菌にはドナー微生物の生育を阻害するための薬剤耐性マーカー(ドナー微生物生育阻害マーカー)が必要である。よって、薬剤耐性を有していない、又は薬剤耐性の乏しいロドコッカス属細菌を使用する場合、ドナー微生物生育阻害マーカーとして機能しうる薬剤選択可能な程度の薬剤耐性を有する変異株の作製が必要となる。
ロドコッカス属細菌はいくつかの薬剤に対し耐性を示すことは知られているが、その耐性は弱い場合もあり、その特性は、接合伝達用のマーカーとしてそのまま利用するには十分ではない。
そこで、ロドコッカス属細菌が本来有している薬剤耐性を利用する場合、高濃度の薬剤に対しても十分な耐性を示すよう耐性が強化されたロドコッカス属細菌の変異株を製造し、当該変異株をレシピエントとすることにより、汎用性に優れ且つ高効率な相同組換えが可能となる。
ここで、ドナー微生物生育阻害用の薬剤としては、接合伝達時にドナーとして用いる微生物(ドナー微生物)の有する薬剤耐性を考慮し、ドナー微生物が感受性を示す薬剤を選択することが好ましい。当該薬剤としては、クロラムフェニコール、アンピシリン、カナマイシン、トリメトプリム、ゲンタマイシン、ナルジクス酸、カルベニシン、チオストレプトン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が好ましく、クロラムフェニコール、アンピシリンがより好ましい。
ドナー微生物生育阻害マーカーが強化されたレシピエント微生物を作製する方法としては、特に限定はされないが、例えば、(イ)自然変異誘発法、(ロ)紫外線照射や変異誘発剤を用いる突然変異誘発法、(ハ)あらかじめ非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドとは別の、抗生物質耐性獲得用のプラスミドを導入する方法等が好ましく挙げられ、中でも自然変異誘発法がより好ましい。
自然変異誘発法は、所望の薬剤を一定濃度で含有する培地中で対象とする微生物を継代培養等することにより、もともとは当該培地中で生育不可又は困難な微生物に自然変異を誘発させて、より高濃度の薬剤を含有する当該培地中でも生育し得る株を取得する方法である。
レシピエント微生物となるロドコッカス属細菌の薬剤耐性をどの程度まで強化するかは、使用するロドコッカス属細菌の種類、ドナー微生物及び選択する薬剤により異なるため必要に応じて適宜調整すればよいが、レシピエント微生物の生育が抑制されず、且つ、ドナー微生物の生育が十分阻害される薬剤濃度を基準に薬剤耐性を強化することが好ましい。例えば、レシピエント微生物としてのロドコッカス属細菌を用い、ドナー微生物として大腸菌を、選択用薬剤としてクロラムフェニコールを用いる場合、自然突然変異により、クロラムフェニコール10〜200 mg/L、好ましくは20〜200 mg/L、より好ましくは50〜200 mg/Lを含有する培地において生育可能なロドコッカス属細菌(クロラムフェニコール耐性強化株)を得ることが望ましい。
2-1. Process (a)
In the step (a), a Rhodococcus bacterium having a donor microorganism growth inhibition marker introduced or enhanced is produced. For the reasons described above, a Rhodococcus bacterium as a recipient needs a drug resistance marker (donor microorganism growth inhibition marker) for inhibiting the growth of a donor microorganism. Therefore, when using Rhodococcus bacteria that do not have drug resistance or poor drug resistance, it is necessary to produce mutants having drug resistance to the extent that a drug can be selected that can function as a donor microbial growth inhibition marker. .
Rhodococcus bacteria are known to be resistant to several drugs, but their resistance may be weak, and their properties are not sufficient for use as markers for conjugation transmission.
Therefore, when utilizing the drug resistance inherent in Rhodococcus bacteria, a mutant strain of Rhodococcus bacteria with enhanced resistance so as to exhibit sufficient resistance against a high concentration of the drug is produced, and the mutant strain By using as a recipient, homogenous recombination with excellent versatility and high efficiency becomes possible.
Here, as a drug for inhibiting the growth of donor microorganisms, it is preferable to select a drug that is sensitive to the donor microorganism in consideration of the drug resistance of the microorganism (donor microorganism) used as the donor during conjugation transmission. As the drug, chloramphenicol, ampicillin, kanamycin, trimethoprim, gentamicin, naldicric acid, carbenicine, thiostrepton, tetracycline, streptomycin, etc. are preferable, and chloramphenicol and ampicillin are more preferable.
There are no particular limitations on the method for producing a recipient microorganism with enhanced donor microorganism growth inhibition markers. For example, (i) natural mutagenesis, (b) mutagenesis using ultraviolet irradiation or a mutagen. (C) A method of introducing a plasmid for acquiring antibiotic resistance separately from a plasmid for loss of function of a non-homologous recombination gene is preferable, and a natural mutagenesis method is more preferable.
The natural mutagenesis method involves subculturing a target microorganism in a medium containing a desired drug at a constant concentration, thereby inducing spontaneous mutation in a microorganism that originally cannot or cannot grow in the medium. This is a method for obtaining a strain that can grow even in the medium containing a higher concentration of the drug.
The degree to which the drug resistance of Rhodococcus bacteria that are recipient microorganisms is enhanced depends on the type of Rhodococcus bacteria used, the donor microorganism, and the drug to be selected, and may be adjusted as necessary. It is preferable to enhance drug resistance based on a drug concentration at which the growth of microorganisms is not suppressed and the growth of donor microorganisms is sufficiently inhibited. For example, when Rhodococcus bacterium is used as the recipient microorganism, Escherichia coli is used as the donor microorganism, and chloramphenicol is used as the selective agent, chloramphenicol is 10 to 200 mg / L, preferably 20 by spontaneous mutation. It is desirable to obtain a Rhodococcus bacterium (chloramphenicol resistance-enhanced strain) that can grow in a medium containing ˜200 mg / L, more preferably 50 to 200 mg / L.
2-2. 工程(b)
工程(b)では、接合伝達に供するドナー微生物として、所定の非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドを用いて形質転換された微生物を作製する。非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド、すなわちレシピエント微生物中の標的とする薬剤耐性遺伝子を欠失又は不活性化するためのプラスミドとしては、前述の(i)〜(v)の構成(遺伝子・塩基配列等)を含むものを用いる。
接合伝達に用いる非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドは、如何なるベクターをベースとして構築されたものであってもよく、その種類は特に限定はされない。使用するベクターとしては、例えば、pBR322、pSC101、pACYC184、pACYC177、pTrc99A、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pHSG298、pHSG299、pSP64、pSP65、pGEM-3、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4p、pGEM-4Z、pBluescript M13+、pBluescript M13-、pK19mob、pK18mob、pK18mobsacB等が挙げられる。中でも、プラスミド内部に既にプラスミドRP4由来のoriT及びmobを有しているpK19mob、pK18mob、pK18mobsacB(Schaefer等, Gene, vol. 45, p. 69-73(1994))を用いることがより好ましい。
ドナー微生物からレシピエント微生物にプラスミドを伝達するためには、oriTに加え、mob遺伝子及びtra遺伝子(群)が最小限必要である。mobはoriT特異的ニック酵素をコードする遺伝子で、この酵素がoriTに働くことによりドナー微生物からレシピエント微生物への(非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドの)移行が開始される。traは多数の遺伝子群の総称で、性繊毛形成、接合管形成、接合制御に関与する遺伝子群で構成されている。mob遺伝子及びtra遺伝子(群)は必ずしも非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド上になくてもよく、別のプラスミド(ヘルパープラスミド)、若しくはドナーとなる微生物ゲノム上に組み込まれていてもよい(蛋白質 核酸 酵素, vol. 38, p. 60-68 (1993))。
本発明の製造方法において、ドナー微生物としては、上記レシピエント微生物と接合伝達可能な微生物であればよく、限定されないが、上記の接合伝達に最低限必要な構成要件を満たしている必要がある。例えば、使用する非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド上にoriT 、mob遺伝子及びtra遺伝子(群)が一通り備わっている場合は、それぞれが機能しうる微生物であれば特に限定されないが、使用する非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド上にoriTのみが備わっている場合は、oriTに対応するmob遺伝子及びtra遺伝子(群)を保有する微生物を用いる必要がある。ドナーとなる微生物と非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドの組み合わせとしては、例えば、大腸菌S17-1と、pK19mob、pK18mob、pK18mobsacBのいずれかとの組み合わせが好ましい。大腸菌S17-1のゲノム上には、プラスミドRP4由来のtra遺伝子(群)が、pK19mob、pK18mob、pK18mobsacBには(前記のとおり)プラスミドRP4由来のoriT及びmob遺伝子がそれぞれ備わっているため、上記3種のプラスミドいずれかで形質転換された大腸菌S17-1はドナー微生物として使用可能である。
ここで、前記(i)の配列は、(改変の対象とする)ロドコッカス属細菌中の標的とする非相同組換え遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列とを含む塩基配列において、当該遺伝子を欠失又は不活性化させた塩基配列領域である。当該遺伝子の欠失は、(1)レシピエント微生物のゲノムにコードされる非相同組換え遺伝子の一部又は全部が欠失等されたもの、(2)プロモーター配列の一部又は全部が欠失等されたもの、(3)非相同組換え遺伝子の発現調節に関連する遺伝子の一部又は全部が欠失等されたものなどが挙げられ、これらの欠失等された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。不活性化させた遺伝子としては、(1)レシピエント微生物のゲノムにコードされる非相同組換え遺伝子又は当該遺伝子の発現調節に関連する遺伝子に変異を導入する、(2)非相同組換え遺伝子又は当該遺伝子の発現調節に関連する遺伝子の内部に、例えば薬剤耐性遺伝子等の外来塩基配列等を導入する等の方法により、本来の機能(非相同的な外来DNA導入能力)を発現しない遺伝子に改変されたものなどが挙げられる。この際の外来塩基配列挿入による不活性化を行う場合、使用する外来配列は当該遺伝子が正常に発現しない状態にできるものであれば限定されない。従って、必ずしも何らかの遺伝子をコードしている必要はないが、レシピエント微生物中で当該微生物の生育を著しく阻害しないものが好ましい。
レシピエント微生物のゲノムから、標的とする非相同組換え遺伝子と当該遺伝子の周辺の塩基配列の単離(クローニング)は、遺伝子ライブラリー作製やPCR等の公知技術を用いて行うことができる。
なお、標的とする非相同組換え遺伝子の周辺の塩基配列としては限定されないが、当該ロドコッカス属細菌ゲノムとの相同領域(標的遺伝子周辺の塩基配列)が長いほどより効率よく相同組換えを起こすことが出来るため、クローニングに支障が出ない範囲でより長い配列を用いることが好ましい。
例えば、当該遺伝子の上流及び下流の相同領域がそれぞれ100〜3000 bpの塩基配列を含む配列であることが好ましく、より好ましくは500〜2000 bpの塩基配列を含む配列である。単離した塩基配列を用いて、前述(i)を作製する方法は特に限定されず、PCR法や制限酵素を用いた標的遺伝子部分の切除又は置換等の公知技術を用いて行うことができる。
欠失された遺伝子としては、ロドコッカス属細菌のゲノムにコードされる標的とする非相同組換え遺伝子の一部又は全部が欠失されたもの、プロモーター配列の一部又は全部が欠失されたもの、当該遺伝子の発現調節に関連する遺伝子が存在する場合は、その一部又は全部が欠失されたものなどが挙げられ、これらの欠失された領域は単独でもよいし複数を組み合わせたものでもよい。
不活性化された遺伝子としては、ロドコッカス属細菌のゲノムにコードされる標的とする非相同組換え遺伝子若しくは当該遺伝子の発現調節に関連する遺伝子の内部に、外来DNA、例えは薬剤耐性遺伝子等を導入し、本来の機能を発現しない遺伝子に改変されたものが挙げられる。
前記(ii)の接合伝達開始領域は、使用するドナー微生物中において接合伝達の開始点となる塩基配列を含む領域であればよく、特に限定されない。例えば、Fプラスミド由来の接合伝達開始領域を含む配列、プラスミドR6K由来のoriT、プラスミドRP4由来のoriTが好ましい。
前記(iii)の複製開始領域は、使用するドナー微生物中において前記非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドの自己複製起点として機能し得る塩基配列を含む領域であればよく、特に限定はされない。例えば、プラスミドpMB1及び広宿主域プラスミドRK2由来の複製開始点並びにその派生物等を含む領域の使用が好ましい。
前記(iv)のレシピエント微生物生育阻害マーカーは、形質転換後に非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドが挿入されたロドコッカス属細菌の取得を可能にするものであれば特に限定されない。レシピエント微生物生育阻害マーカーとしては、例えばポジティブセレクションに使用される薬剤耐性遺伝子等が挙げられる。
薬剤耐性遺伝子としては、例えば、アミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子、β-ラクタム系抗生物質耐性遺伝子、クロラムフェニコール系抗生物質耐性遺伝子、テトラサイクリン系抗生物質耐性遺伝子、トリメトプリム耐性ジヒドロキシ葉酸レダクターゼ等が挙げられる。
ここで、アミノグリコシド系抗生物質耐性遺伝子としては、カナマイシン及びネオマイシン耐性遺伝子であるアミノグリコシド3’-ホスホトランスフェラーゼ等のリン酸転移酵素遺伝子群、ストレプトマイシン耐性遺伝子であるアミノグリコシド3’-アデニリルトランスフェラーゼ等のヌクレオチジル転移酵素遺伝子群、アセチル転移酵素遺伝子群が挙げられる。β-ラクタム系抗生物質耐性遺伝子としては、β-ラクタマーゼ遺伝子が挙げられる。クロラムフェニコール系抗生物質耐性遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。テトラサイクリン系抗生物質耐性遺伝子としては、トランスポゾンTn10由来テトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。
当該生育阻害マーカーを元々レシピエント微生物が有している場合は、当該レシピエント微生物が有する薬剤耐性遺伝子のみでは耐性を獲得できない高濃度薬剤を用いることで、目的の組換え株(相同組換え株)を取得することも可能である。
また、非相同組換え遺伝子機能喪失を実施するロドコッカス属細菌が栄養要求性を示す株(例えば、必須代謝経路の欠損変異株や、特定の炭素源及び/又は窒素源を資化する代謝系を持たない株等)である場合、その株の欠損等を相補するような遺伝子(群)を選択マーカーとして用いることもできる。栄養要求性としては、代表的なものに、アミノ酸要求性(アミノ酸生合成経路欠損)、核酸要求性(核酸生合成経路欠損)、ビタミン要求性(ビタミン生合成経路欠損)等がある。
前記(v)の条件致死遺伝子は、ロドコッカス属細菌のゲノム上に導入され、且つある特定条件下にさらされた場合に、当該細菌を死に至らしめる作用を有し得る遺伝子であれば限定されない。例えば、sacB遺伝子が好ましく挙げられる。sacB遺伝子は、当該遺伝子を保有し発現する微生物(例えばロドコッカス属細菌等)をスクロース含有培地で培養した場合に、スクロースを基質とし当該微生物に対して致死作用を有する有害物質を産生する酵素(レバンスクラーゼ)をコードする遺伝子である。グラム陽性菌の一部やグラム陰性菌では、スクロース存在下においてsacB遺伝子が導入された細胞株を排除(ネガティブセレクション)することにより、目的とする遺伝子改変細胞株を効率よく選択することが可能である(Jagar W et al., Journal of bacteriology 1992; 5462-5465、Pelicic V et al., Journal of bacteriology 1996; 1197-1199)。なお、SacB遺伝子の発現が、スクロース存在下において細胞に致死性を付与する理由は明らかになっていない。
上記sacB遺伝子以外のレバンスクラーゼをコードする遺伝子としては、fefA遺伝子(accession number: AJ508391, Lactobacillus sanfranciscensis由来のレバンスクラーゼ)、lev遺伝子(accession number: Q8GGV4, Lactobacillus reuteri由来のレバンスクラーゼ)、mlft遺伝子(accession number: AAT81165, Leuconostoc mesenteroides由来のレバンスクラーゼ)、lsc遺伝子(accession number:O68609, Pseudomonas syringae由来のレバンスクラーゼ)、lsxA遺伝子(accession number:BAA93720, Gluconacetobacter xylinus由来のレバンスクラーゼ)等が挙げられるが、他のレバンスクラーゼをコードする遺伝子であっても、これらに限定されることなく用いることができる。
前記非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドにおける(i)〜(v)の構成は、その配置については特に限定されず、如何なる順番で配置されていてもよい。前記(i)〜(v)の構成を含む非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドの構築は、公知の遺伝子組換え技術を用いて実施することができる。
工程(b)では、上述したような各構成を有する非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドをドナーとして用いる微生物内に導入して形質転換された微生物、すなわち接合伝達に供するドナー微生物を作製する。その際、形質転換の方法としては、エレクトロポレーション法や塩化カルシウム法等の、微生物の形質転換方法として公知の方法を用いることができる。
2-2. Process (b)
In step (b), a microorganism transformed with a predetermined heterologous recombination gene function loss plasmid is prepared as a donor microorganism to be used for conjugation transfer. Non-homologous recombination gene loss-of-function plasmids, that is, plasmids for deleting or inactivating a target drug resistance gene in a recipient microorganism, include the above-described configurations (i) to (v) (gene / Including the base sequence).
The non-homologous recombinant gene loss-of-function plasmid used for conjugation transfer may be constructed based on any vector, and the kind thereof is not particularly limited. Examples of the vector to be used include pBR322, pSC101, pACYC184, pACYC177, pTrc99A, pUC18, pUC19, pUC118, pUC119, pHSG298, pHSG299, pSP64, pSP65, pGEM-3, pGEM-3Z, pGEM-3Zf (-), pGEM -4p, pGEM-4Z, pBluescript M13 +, pBluescript M13-, pK19mob, pK18mob, pK18mobsacB and the like. Among them, it is more preferable to use pK19mob, pK18mob, and pK18mobsacB (Schaefer et al., Gene, vol. 45, p. 69-73 (1994)) that already have oriT and mob derived from plasmid RP4 inside the plasmid.
In order to transfer the plasmid from the donor microorganism to the recipient microorganism, in addition to oriT, the mob gene and tra gene (s) are minimally required. mob is a gene encoding an oriT-specific nick enzyme, and when this enzyme acts on oriT, transfer from a donor microorganism to a recipient microorganism (a plasmid for loss of function of a heterologous recombination gene) is initiated. tra is a general term for a large number of gene groups, and is composed of gene groups involved in sex cilia formation, junction tube formation, and junction control. The mob gene and tra gene (s) are not necessarily on the plasmid for loss of function of the non-homologous recombination gene, but may be integrated in another plasmid (helper plasmid) or in the donor microbial genome (protein Nucleic acid enzyme, vol. 38, p. 60-68 (1993)).
In the production method of the present invention, the donor microorganism may be any microorganism that can be conjugated and transferred to the recipient microorganism, and is not limited. However, the donor microorganism needs to satisfy the minimum requirements for the conjugated transfer. For example, when the oriT, mob gene, and tra gene (s) are provided on the non-homologous recombinant gene loss-of-function plasmid to be used, it is not particularly limited as long as each can function, but it is used. When only the oriT is provided on the plasmid for loss of function of the heterologous recombination gene, it is necessary to use a microorganism having the mob gene and tra gene (s) corresponding to oriT. As a combination of a microorganism serving as a donor and a plasmid for loss of function of a heterologous recombination gene, for example, a combination of E. coli S17-1 and any one of pK19mob, pK18mob, and pK18mobsacB is preferable. The tra gene (group) derived from plasmid RP4 is provided on the genome of E. coli S17-1, and pK19mob, pK18mob, and pK18mobsacB are provided with oriT and mob genes derived from plasmid RP4 (as described above). E. coli S17-1 transformed with any of the species plasmids can be used as a donor microorganism.
Here, the sequence (i) is a base sequence including a heterologous recombination gene targeted in a Rhodococcus bacterium (to be modified) and a base sequence around the gene, and the gene is missing. This is a base sequence region that has been lost or inactivated. Deletion of the gene includes (1) deletion of a part or all of the non-homologous recombination gene encoded in the genome of the recipient microorganism, and (2) deletion of a part or all of the promoter sequence. (3) those in which a part or all of the genes related to the regulation of expression of heterologous recombination genes are deleted, etc., and these deleted regions may be single or A combination of two or more may be used. The inactivated gene includes (1) a heterologous recombination gene encoded in the genome of the recipient microorganism or a gene related to expression regulation of the gene, (2) a non-homologous recombination gene Alternatively, a gene that does not express its original function (heterologous foreign DNA introduction ability), for example, by introducing a foreign base sequence such as a drug resistance gene into a gene related to the regulation of the expression of the gene. Modified ones are listed. When performing inactivation by inserting a foreign base sequence at this time, the foreign sequence to be used is not limited as long as the gene can be brought into a state in which it is not normally expressed. Accordingly, it is not always necessary to encode any gene, but a recipient microorganism that does not significantly inhibit the growth of the microorganism is preferable.
Isolation (cloning) of the target non-homologous recombination gene and the base sequence around the gene from the genome of the recipient microorganism can be performed using known techniques such as gene library preparation and PCR.
Although the base sequence around the target non-homologous recombination gene is not limited, the longer the homologous region (base sequence around the target gene) with the Rhodococcus genome, the more efficiently homologous recombination occurs. Therefore, it is preferable to use a longer sequence as long as it does not interfere with cloning.
For example, the homologous region upstream and downstream of the gene is preferably a sequence containing a base sequence of 100 to 3000 bp, more preferably a sequence containing a base sequence of 500 to 2000 bp. The method for preparing the above (i) using the isolated base sequence is not particularly limited, and can be performed using a known technique such as PCR method or excision or replacement of a target gene portion using a restriction enzyme.
The deleted genes include those in which part or all of the target non-homologous recombination gene encoded in the genome of Rhodococcus bacteria has been deleted, or part or all of the promoter sequence has been deleted. In the case where a gene related to the regulation of the expression of the gene is present, a part or all of the gene may be deleted. These deleted regions may be used alone or in combination. Good.
Examples of inactivated genes include non-homologous recombination genes that are encoded in the genome of Rhodococcus bacteria or genes that are related to the regulation of expression of the gene, such as foreign DNA, such as drug resistance genes. Examples include those that have been introduced and modified into genes that do not express their original functions.
The junction transmission start region of (ii) is not particularly limited as long as it includes a base sequence serving as a junction transmission start point in the donor microorganism to be used. For example, a sequence containing a junction transfer initiation region derived from F plasmid, oriT derived from plasmid R6K, oriT derived from plasmid RP4 is preferable.
The replication initiation region (iii) is not particularly limited as long as it contains a base sequence that can function as a self-replication origin of the plasmid for loss of function of the heterologous recombination gene in the donor microorganism used. For example, it is preferable to use a region containing the replication origin derived from plasmid pMB1 and broad host range plasmid RK2, and derivatives thereof.
The recipient microbial growth inhibition marker (iv) is not particularly limited as long as it enables the acquisition of Rhodococcus bacteria into which a plasmid for loss of function of the heterologous recombination gene has been inserted after transformation. Examples of the recipient microorganism growth inhibition marker include drug resistance genes used for positive selection.
Examples of drug resistance genes include aminoglycoside antibiotic resistance genes, β-lactam antibiotic resistance genes, chloramphenicol antibiotic resistance genes, tetracycline antibiotic resistance genes, and trimethoprim resistant dihydroxyfolate reductase. .
Here, aminoglycoside antibiotic resistance genes include phosphotransferase gene groups such as aminoglycoside 3′-phosphotransferase, which is a kanamycin and neomycin resistance gene, and nucleotides such as aminoglycoside 3′-adenylyltransferase, which is a streptomycin resistance gene. Examples include a gill transferase gene group and an acetyltransferase gene group. Examples of β-lactam antibiotic resistance genes include β-lactamase genes. Examples of chloramphenicol antibiotic resistance genes include chloramphenicol acetyltransferase genes. Examples of tetracycline antibiotic resistance genes include transposon Tn10-derived tetracycline resistance genes.
When the recipient microorganism originally has the growth inhibition marker, the target recombinant strain (homologous recombinant strain) can be obtained by using a high-concentration drug that cannot acquire resistance only by the drug resistance gene of the recipient microorganism. ) Is also possible.
In addition, strains of the genus Rhodococcus that perform loss of function of heterologous recombination genes exhibit auxotrophy (for example, mutant strains that lack essential metabolic pathways, metabolic systems that assimilate specific carbon sources and / or nitrogen sources). In the case of a non-strain etc.), a gene (group) that complements the deletion of the strain can also be used as a selection marker. Typical nutritional requirements include amino acid requirements (amino acid biosynthesis pathway deficiency), nucleic acid requirements (nucleic acid biosynthesis pathway deficiency), vitamin requirements (vitamin biosynthesis pathway deficiency), and the like.
The conditional lethal gene of (v) is not limited as long as it is a gene that can be introduced into the genome of Rhodococcus bacteria and has the effect of causing the bacteria to die when exposed to certain conditions. For example, the sacB gene is preferable. The sacB gene is an enzyme that produces a harmful substance that has a lethal action on a microorganism when sucrose is cultured in a sucrose-containing medium (for example, Rhodococcus bacteria) that possesses and expresses the gene. A gene encoding sucrase. For some Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria, it is possible to efficiently select the target genetically modified cell line by eliminating the cell line introduced with the sacB gene in the presence of sucrose (negative selection). (Jagar W et al., Journal of bacteriology 1992; 5462-5465, Pelicic V et al., Journal of bacteriology 1996; 1197-1199). The reason why SacB gene expression imparts lethality to cells in the presence of sucrose has not been clarified.
Examples of genes encoding levansucrase other than the sacB gene include fefA gene (accession number: AJ508391, levansucrase derived from Lactobacillus sanfranciscensis), lev gene (accession number: Q8GGV4, levansucrase derived from Lactobacillus reuteri), mlft gene (accession number: AAT81165, Leuconostoc mesenteroides-derived levansucrase), lsc gene (accession number: O68609, Pseudomonas syringae-derived levansucrase), lsxA gene (accession number: BAA93720, Gluconacetobacter xylinus-derived levansucrase), etc. Even a gene encoding levansucrase can be used without being limited thereto.
The configurations of (i) to (v) in the heterologous recombination gene loss-of-function plasmid are not particularly limited with respect to the arrangement, and may be arranged in any order. The construction of the plasmid for loss of function of the non-homologous recombination gene including the structures (i) to (v) can be performed using a known gene recombination technique.
In the step (b), a non-homologous recombination gene loss-of-function plasmid having each of the above-described structures is introduced into a microorganism that is used as a donor to produce a transformed microorganism, that is, a donor microorganism that is used for conjugation transmission. At this time, as a transformation method, a method known as a transformation method for microorganisms, such as an electroporation method or a calcium chloride method, can be used.
2-3. 工程(c)
工程(c)では、工程(b)で得られたドナー微生物から工程(a)で得られたレシピエント微生物への接合伝達を行う。通常は、ドナー微生物及びレシピエント微生物のそれぞれの菌体懸濁液を混合し、適当なプレート培地(LB培地等)上に均一に広げて、両微生物の接合を行わせる。当該接合においては、ドナー微生物中の非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドがレシピエント微生物内に移動し、レシピエント微生物のゲノムと上記プラスミドとの相同配列で相同組換えが起こり、非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドの一部又は大部分が当該レシピエント微生物のゲノム上に導入される。この接合により、レシピエント微生物の形質転換体、すなわち相同組換え株が作製される。
本工程(c)における所望の相同組換え株は、1重交差により標的遺伝子の上流又は下流に当該非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミドが導入されたものである。所望の相同組換え株であるかどうかの確認は、レシピエント微生物自体の薬剤耐性、及び前記非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド由来の薬剤耐性を利用して行うことができる。具体的には、両薬剤を含む培地(例えば、カナマイシン及びクロラムフェニコール含有培地)において上記接合後の微生物を培養することにより、所望の相同組換え株を選択することができる。
2-3. Process (c)
In step (c), conjugation transfer from the donor microorganism obtained in step (b) to the recipient microorganism obtained in step (a) is performed. Usually, the cell suspensions of the donor microorganism and the recipient microorganism are mixed and spread uniformly on an appropriate plate medium (LB medium or the like) to allow the two microorganisms to be joined. In this conjugation, the plasmid for loss of function of the non-homologous recombination gene in the donor microorganism moves into the recipient microorganism, and homologous recombination occurs in the homologous sequence between the genome of the recipient microorganism and the above plasmid. Part or most of the plasmid for loss of gene function is introduced onto the genome of the recipient microorganism. By this conjugation, a transformant of the recipient microorganism, that is, a homologous recombinant strain is produced.
The desired homologous recombination strain in this step (c) is one in which the plasmid for loss of function of the non-homologous recombination gene is introduced upstream or downstream of the target gene by single crossover. Whether or not the desired homologous recombination strain is desired can be confirmed using the drug resistance of the recipient microorganism itself and the drug resistance derived from the plasmid for loss of function of the non-homologous recombination gene. Specifically, a desired homologous recombination strain can be selected by culturing the microorganism after conjugation in a medium containing both drugs (for example, a medium containing kanamycin and chloramphenicol).
2-4. 工程(d)
工程(d)では、工程(c)で作製されたレシピエント微生物の相同組換え株(相同組換え微生物)を、前記非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド由来の条件致死遺伝子が機能し得る培養条件で培養する。条件致死遺伝子が機能し得る培養条件としては、条件致死遺伝子が機能する限り、特に限定はされない。例えば、条件致死遺伝子がsacB遺伝子の場合は、スクロース含有培地を用いた培養が用いられる。
当該培養においては、上記条件致死遺伝子を有する相同組換え微生物は生育困難であるため、当該微生物のゲノム上から2度目の相同組換えにより上記条件致死遺伝子、薬剤耐性遺伝子、接合伝達開始領域、複製開始領域を含む非相同組換え遺伝子機能喪失用プラスミド由来の塩基配列領域が除かれた(脱落した)ロドコッカス属細菌を得ることができる。
ただし、当該培養により得られた微生物の中には、レシピエント微生物中の標的の非相同組換え遺伝子が、当初の目的通り欠失又は不活性化しているものと、そうでないもの(上記脱落の際の相同組換えにより元の非相同組換え遺伝子の機能が復活したもの)が含まれている。よって、通常は、得られた微生物からゲノムを抽出し、非相同組換え遺伝子周辺配列を解析することにより、標的の非相同組換え遺伝子欠失又は不活性化を確認する。
2-4. Process (d)
In the step (d), the homologous recombination strain (homologous recombination microorganism) of the recipient microorganism prepared in the step (c) is cultured so that the conditionally lethal gene derived from the non-homologous recombination gene loss-of-function plasmid can function. Incubate under conditions. The culture conditions under which the conditional lethal gene can function are not particularly limited as long as the conditional lethal gene functions. For example, when the conditional lethal gene is the sacB gene, culture using a sucrose-containing medium is used.
In this culture, the homologous recombination microorganism having the conditionally lethal gene is difficult to grow, so the conditionally lethal gene, drug resistance gene, conjugation transfer initiation region, replication by the second homologous recombination from the genome of the microorganism. A Rhodococcus bacterium in which the base sequence region derived from the plasmid for loss of function of the heterologous recombination gene including the initiation region is removed (dropped out) can be obtained.
However, among the microorganisms obtained by the culture, the target non-homologous recombination gene in the recipient microorganism is deleted or inactivated as originally intended, and the target non-homologous recombinant gene is not In which the function of the original non-homologous recombination gene is restored). Therefore, usually, the genome is extracted from the obtained microorganism and the sequence around the heterologous recombination gene is analyzed to confirm the deletion or inactivation of the target heterologous recombination gene.
3.非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌の更なる遺伝子改変
本発明の非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌は、非相同的な外来DNA挿入能力を喪失しているため、前記ロドコッカス属細菌のゲノムの一部と相同な配列を含む遺伝子構築物を導入することにより、高頻度に生じる相同組換えを利用して遺伝的に改変されたロドコッカス属細菌を効率よく作製することができる。この目的に利用できる遺伝子構築物は、ロドコッカス属細菌のゲノムの一部と相同な配列を含み相同組換えに利用できる遺伝子構造物であれば特に限定されず、例えばロドコッカス属細菌で自律複製ができないプラスミドに前記ゲノムの一部と相同な配列を組み込んだもの等が挙げられる。前記遺伝子構造物は、当業者によく知られた方法で作製することができる。特に、非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化されたロドコッカス属細菌に、前記遺伝子構築物をエレクトロポレーション法により導入した場合でも非相同組換えが抑制され、相同組換えが効率的に生じるため、非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化されており、且つ更に遺伝的に改変されたロドコッカス属細菌を容易且つ効率的に作製することが可能である。
本明細書において、「遺伝的に改変されたロドコッカス属細菌」とは、人為的なゲノム改変が施されたロドコッカス属細菌のことを指す。非相同組換え遺伝子の欠失又は不活性化に加えて更に施し得る人為的なゲノム改変には、当該細菌のゲノム上に存在する内在性遺伝子の破壊又は欠失、及び、ゲノム上に存在しない外来DNA断片の挿入又は置換が含まれる。本発明のロドコッカス属細菌変異株を用いれば、非相同組換え遺伝子が欠失又は不活性化されていることにより、更なる人為的なゲノム改変が容易かつ効率的に行えるため、たとえば当該細菌の代謝経路をより望ましい状態に改変することが容易になる。
代謝経路の改変としては、例えば、微生物の生育時又は所望の物質生産時に律速となる代謝経路の改変(反応速度の向上)が挙げられる。この場合、当該律速経路を触媒する酵素をコードする遺伝子をより高活性な酵素遺伝子に置き換えて酵素活性を上げる、当該酵素遺伝子のプロモーターをより強力なものに置き換えて生体内の当該酵素量を上げる、当該律速経路そのものを経由せず、当該律速経路をバイパス可能にする酵素遺伝子を導入し、当該律速経路を経由しない新規代謝経路をデザインするなどの改変を施すことにより、当該経路の律速状態を解除し、生育時又は所望の物質生産を促進することができる。
所望の物質生産時に同時に生成する副産物の生成抑制も代謝改変例として挙げられる。例えば、副産物生成に関与する代謝経路を触媒する酵素をコードする遺伝子を欠失させ、副生物生成を抑制することができる。
本発明の微生物を用いて生産し得る所望の物質は特に限定されないが、本発明の微生物の生育を著しく阻害しないものが好ましい。そのような所望の物質には、例えば、酵素や多糖類のような高分子化合物や、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、ヘキサン、デカン、ドデカン、テトラデカン等の炭化水素類、各種アミノ酸及びその誘導体、ニトリル、アミド、カルボン酸等が含まれる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらに限定されるものではない。本明細書では、「%」は「W/V」を意味する。
3. Further genetic modification of Rhodococcus bacteria in which the heterologous recombination gene has been deleted or inactivated Rhodococcus bacteria in which the heterologous recombination gene of the present invention has been deleted or inactivated are heterologous foreign DNA Rhodococcus genetically modified using homologous recombination that occurs at a high frequency by introducing a gene construct containing a sequence homologous to a part of the genome of the genus Rhodococcus due to loss of insertion ability A genus bacterium can be produced efficiently. The gene construct that can be used for this purpose is not particularly limited as long as it is a gene structure that contains a sequence homologous to a part of the genome of Rhodococcus bacteria and can be used for homologous recombination. For example, a plasmid that cannot autonomously replicate in Rhodococcus bacteria In which a sequence homologous to a part of the genome is incorporated. The gene structure can be prepared by a method well known to those skilled in the art. In particular, even when the gene construct is introduced by electroporation into a Rhodococcus bacterium in which the heterologous recombination gene has been deleted or inactivated, the heterologous recombination is suppressed and the homologous recombination occurs efficiently. Therefore, it is possible to easily and efficiently produce Rhodococcus bacteria in which heterologous recombination genes have been deleted or inactivated and genetically modified.
As used herein, “genetically modified Rhodococcus bacteria” refers to Rhodococcus bacteria that have been subjected to artificial genomic modification. Artificial genomic modifications that can be further performed in addition to deletion or inactivation of non-homologous recombination genes include disruption or deletion of endogenous genes present on the genome of the bacterium, and are not present on the genome Includes insertion or replacement of foreign DNA fragments. When the Rhodococcus bacterium mutant of the present invention is used, since the non-homologous recombination gene is deleted or inactivated, further artificial genome modification can be easily and efficiently performed. It becomes easy to modify the metabolic pathway to a more desirable state.
Examples of the alteration of the metabolic pathway include alteration of the metabolic pathway (improving the reaction rate) which is rate-limiting during the growth of microorganisms or the production of a desired substance. In this case, the enzyme encoding the enzyme that catalyzes the rate-limiting pathway is replaced with a more active enzyme gene to increase the enzyme activity, and the enzyme gene promoter is replaced with a stronger one to increase the amount of the enzyme in the living body. By introducing an enzyme gene that allows bypassing the rate-limiting pathway without passing through the rate-limiting pathway itself, and by designing a new metabolic pathway that does not pass through the rate-limiting pathway, the rate-limiting state of the pathway is changed. It can cancel | release and can accelerate | stimulate production at the time of growth or a desired substance.
Inhibition of the production of by-products generated simultaneously with the production of a desired substance is also an example of metabolic modification. For example, a gene encoding an enzyme that catalyzes a metabolic pathway involved in byproduct production can be deleted to suppress byproduct production.
The desired substance that can be produced using the microorganism of the present invention is not particularly limited, but preferably does not significantly inhibit the growth of the microorganism of the present invention. Examples of such desired substances include polymer compounds such as enzymes and polysaccharides, alcohols such as ethanol, propanol, and butanol, hydrocarbons such as hexane, decane, dodecane, and tetradecane, various amino acids, and their amino acids. Derivatives, nitriles, amides, carboxylic acids and the like are included.
Hereinafter, the present invention will be described more specifically by way of examples. However, the technical scope of the present invention is not limited to these examples. In this specification, “%” means “W / V”.
<実施例1>
接合伝達用レシピエントPR4KSの作製
ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)PR4(製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門;受託番号:NBRC 100887)を特開2011-200133号公報に記載の方法により改変し、120 mg/Lのクロラムフェニコールに耐性を示し、且つカナマイシン耐性遺伝子を欠失した変異株を作製し、PR4KS株と命名した。
具体的には、クロラムフェニコール耐性を強化するために、MYK培地(0.5% polypeptone、0.3% bact yeast extract、0.3% malt extract、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4)中のクロラムフェニコールの濃度を10mg/mLから始めて120mg/mLまで段階的に徐々に高めつつ、PR4株を継体培養することにより自然変異を誘発し、120mg/mLのクロラムフェニコールに耐性を有する変異株RhCmSR-09株を得た。
次いで、上記RhCmSR-09株を、特開2011-200133号公報に記載のカナマイシン耐性遺伝子欠失変異導入用プラスミドpKM043を保有する大腸菌株と1:1の比率で混合して培養し、接合伝達によりRhCmSR-09株内にpKM043を導入後、カナマイシン硫酸塩200 mg/L 及びクロラムフェニコール50 mg/L含有MYKプレート(0.5% polypeptone、0.3% bact yeast extract、0.3% malt extract、0.2% KH2PO4、0.2% K2HPO4、1.5%寒天)にて培養することにより、pKM043がRhCmSR-09株ゲノム内に挿入された相同組換え株を得た。前記相同組換え株を、10%スクロース含有MYKプレートにて培養し、得られたコロニーの中からカナマイシン感受性株となった変異株、すなわちカナマイシン耐性遺伝子欠失変異株PR4KS株を得た。
<Example 1>
Production of recipient PR4KS for junction transfer Rhodococcus erythropolis PR4 (Product Evaluation Technology Organization, Biological Genetic Resources Division; Accession Number: NBRC 100887) was modified by the method described in JP 2011-200133 A, A mutant strain resistant to 120 mg / L chloramphenicol and lacking the kanamycin resistance gene was prepared and named PR4KS strain.
Specifically, in order to strengthen chloramphenicol resistance, in MYK medium (0.5% polypeptone, 0.3% bact yeast extract, 0.3% malt extract, 0.2% KH 2 PO 4 , 0.2% K 2 HPO 4 ) While gradually increasing the concentration of chloramphenicol from 10 mg / mL to 120 mg / mL, it induces spontaneous mutation by subculturing PR4 strain and is resistant to 120 mg / mL chloramphenicol Mutant RhCm SR- 09 was obtained.
Next, the above RhCm SR- 09 strain was mixed and cultured at a ratio of 1: 1 with an Escherichia coli strain harboring the plasmid kKM043 for introducing a kanamycin resistance gene deletion mutation described in JP-A-2011-200133. After introducing pKM043 into the RhCm SR- 09 strain, MYK plates containing kanamycin sulfate 200 mg / L and chloramphenicol 50 mg / L (0.5% polypeptone, 0.3% bact yeast extract, 0.3% malt extract, 0.2% KH 2 PO 4 , 0.2% K 2 HPO 4 , 1.5% agar) was obtained to obtain a homologous recombination strain in which pKM043 was inserted into the RhCm SR- 09 strain genome. The homologous recombination strain was cultured on a MYK plate containing 10% sucrose to obtain a mutant strain that became a kanamycin sensitive strain from the obtained colonies, that is, a kanamycin resistance gene deletion mutant PR4KS strain.
接合伝達用レシピエントJ1-Cmの作製
ロドコッカス・ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous)J1株(受託番号:FERM BP−1478として独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに寄託)を改変し、クロラムフェニコール耐性を有するJ1株の変異株を下記の方法で取得し、J1-Cm株と命名した。
2 mg/lのクロラムフェニコールを含んだMYKプレートにJ1株を接種し、コロニーが生育するまで30℃で保温した。約2週間後、生育してきたクロラムフェニコール耐性株を、再度2 mg/lのクロラムフェニコール入りMYKプレートに接種して、30℃で保温した。
次に、2 mg/lのクロラムフェニコール入りMYKプレートから生育したコロニーを、5 mg/lのクロラムフェニコール入りMYKプレートに接種し、クロラムフェニコール耐性株が出現するまで30℃で保温した。以下、同様の操作をクロラムフェニコール濃度10 mg/lに高めて繰り返し、10 mg/lのクロラムフェニコール濃度で生育するクロラムフェニコール耐性株(J1-Cm株)を得た。
Production of recipient J1-Cm for junction transfer Rhodococcus rhodochrous J1 strain (Accession number: FERM BP-1478, deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary), Chlorampheni A mutant strain of J1 strain having call resistance was obtained by the following method and designated as J1-Cm strain.
The MYK plate containing 2 mg / l chloramphenicol was inoculated with the J1 strain and incubated at 30 ° C. until colonies grew. About 2 weeks later, the chloramphenicol resistant strain that had grown was inoculated again on a MYK plate containing 2 mg / l chloramphenicol and incubated at 30 ° C.
Next, colonies grown from MYK plates containing 2 mg / l chloramphenicol were inoculated into MYK plates containing 5 mg / l chloramphenicol and kept at 30 ° C until chloramphenicol resistant strains appeared. Keep warm. Thereafter, the same operation was repeated with the chloramphenicol concentration increased to 10 mg / l to obtain a chloramphenicol resistant strain (J1-Cm strain) that grew at a chloramphenicol concentration of 10 mg / l.
<実施例2>
LigDホモログ遺伝子のクローニングと遺伝子欠失用プラスミドの作製
PR4KS株のLigDホモログ遺伝子(accession no: YP_002767969)を標的遺伝子とした。LigD遺伝子周辺配列を含む約5.4 kbのDNAをPCRにより増幅後、特開2011-200133に記載された、sacB遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の下流且つ同方向に導入されたプラスミドベクターpK19mobsacB1にクローニングし、プラスミドpTJ001を得た。PCR条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-138: 5'- GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC -3' (配列番号3)
GB-139: 5'- GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG -3'(配列番号4)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-138(配列番号3) 1 μl
GB-139(配列番号4) 1 μl
PR4KSゲノム(50 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を35サイクル
pTJ001内部のLigDホモログ遺伝子全長(約2.3 kb)を欠失させLigDホモログ遺伝子の上流及び下流配列のみを残存させた、LigDホモログ遺伝子欠失用プラスミドpTJ002を作製した(図1参照)。pTJ002は、標的であるLigDホモログ遺伝子の開始コドン付近の配列と終始コドン付近の配列の両方を含み、それぞれ開始コドンから上流方向又は終始コドンから下流方向に伸長するように設計されたプライマーGB-140とGB-141によりpTJ001内部の配列を増幅することにより得られたLigDホモログ遺伝子を含まないPCR産物により大腸菌JM109株を形質転換して、環状DNAとすることにより取得した。
PCRの条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-140: 5'- GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG -3' (配列番号5)
GB-141: 5'- GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG -3'(配列番号6)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-140(配列番号5) 1 μl
GB-141(配列番号6) 1 μl
pTJ001(1 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、50℃ 10秒及び72℃ 180秒の反応を30サイクル
上記プラスミドpTJ002製造手順において、PR4株からのゲノム抽出にはWizard Genomic DNA Purification Kit(Promega社製)を、制限酵素により切断したDNA断片及びPCR産物の精製にはGel/PCR Purification Kit(FAVORGEN社製)を、DNA同士の接続にはDNA Ligation Kit <Mighty Mix>(タカラバイオ社製)を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit(QIAGEN社製)を用いた。
<Example 2>
Cloning of LigD homolog gene and construction of plasmid for gene deletion
The LigD homologue gene (accession no: YP_002767969) of PR4KS strain was used as a target gene. After amplification of about 5.4 kb DNA containing the peripheral sequence of the LigD gene by PCR, the plasmid described in JP2011-200133 was cloned into the plasmid vector pK19mobsacB1 into which the sacB gene was introduced downstream and in the same direction of the kanamycin resistance gene, pTJ001 was obtained. PCR conditions are as follows.
Primer:
GB-138: 5'-GGCCTGCAGGTACCGATCATCACCATCGGTGTC -3 '(SEQ ID NO: 3)
GB-139: 5'-GGTCTAGACTGAGCAGTGTTCCAATGCG-3 '(SEQ ID NO: 4)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-138 (SEQ ID NO: 3) 1 μl
GB-139 (SEQ ID NO: 4) 1 μl
PR4KS genome (50 ng / μl) 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
35 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 120 seconds
A LigD homolog gene deletion plasmid pTJ002 in which the entire length of LigD homolog gene (about 2.3 kb) in pTJ001 was deleted and only the upstream and downstream sequences of the LigD homolog gene remained was prepared (see FIG. 1). pTJ002 contains both the sequence near the start codon and the sequence near the stop codon of the target LigD homolog gene, primer GB-140 designed to extend upstream from the start codon or downstream from the stop codon, respectively. It was obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with a PCR product containing no LigD homolog gene obtained by amplifying the sequence inside pTJ001 with GB-141, and making it circular DNA.
PCR conditions are as follows.
Primer:
GB-140: 5'-GAGGAAATGGTCACAGGGCGAGAATAGGTTG-3 '(SEQ ID NO: 5)
GB-141: 5'-GCCCTGTGACCATTTCCTCATTGTGCTGG-3 '(SEQ ID NO: 6)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-140 (SEQ ID NO: 5) 1 μl
GB-141 (SEQ ID NO: 6) 1 μl
pTJ001 (1 ng / μl) 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 10 seconds, and 72 ° C for 180 seconds In the above procedure for producing plasmid pTJ002, the Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega) was cleaved with restriction enzymes for genome extraction from PR4 strain. Gel / PCR Purification Kit (manufactured by FAVORGEN) is used to purify DNA fragments and PCR products, DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio) is used to connect DNA, and QIAprep miniprep is used to extract plasmids. kit (manufactured by QIAGEN) was used.
<実施例3>
PR4KSのLigDホモログ遺伝子欠失株の作製
大腸菌(Escherichia coli)S17-1λpirをpTJ002により形質転換したものをドナーとし、実施例1の方法により得られたPR4KSをレシピエントとして、特開2011-200133号公報に記載の方法と同様に接合伝達を行い、相同組換えによって生じた13株のligD遺伝子欠失株を得た。前記欠失株から1株を選び、PR4KSΔLigD株と命名した。
<Example 3>
Preparation of PR4KS LigD homolog gene deletion strain Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-200133 using Escherichia coli S17-1λpir transformed with pTJ002 as a donor and PR4KS obtained by the method of Example 1 as a recipient Conjugation transfer was performed in the same manner as described in the publication, and 13 ligD gene-deficient strains produced by homologous recombination were obtained. One strain was selected from the deletion strains and named PR4KSΔLigD strain.
<実施例4>
PR4KSΔLigD株における相同組換え頻度の改善
本発明のロドコッカス属細菌変異株を使用することにより、容易に相同組換えによる遺伝子改変を実施できることを実証するために、以下の実験を行った。
破壊する標的遺伝子にイソクエン酸リアーゼ(ICL)(accession no: YP_002765021)を選んだ。PR4ゲノム配列情報を基に、ICL遺伝子部分配列をPR4KS株から抽出したゲノムを鋳型に使用したPCRにより増幅し、増幅した遺伝子をpK19mobsacB1にクローニングした。
PR4KS株から抽出したゲノムを鋳型に使用し、HindIIIサイトを付加したプライマーGB-208(配列番号7)及びGB-211(配列番号10)、又はGB-209(配列番号8)及びGB-210(配列番号9)を使用したPCRにより、約0.8 kb又は約0.4 kbのICL遺伝子部分配列を増幅した。増幅条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-208: 5'- GGAAGCTTACCGGCAACATGGCTGTG -3' (配列番号7)
GB-209: 5'- GGAAGCTTCGGTGGCGCTCTCAACGC -3'(配列番号8)
GB-210: 5'- GGAAGCTTCTTTGCAACCTCGAGATC -3'(配列番号9)
GB-211: 5'- GGAAGCTTCTGGAACTTCGCGATGGTC -3'(配列番号10)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-208(配列番号7)又はGB-209(配列番号8) 1 μl
GB-210(配列番号9)又はGB-211(配列番号10) 1 μl
PR4KSゲノム(50 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を35サイクル
ICL遺伝子部分配列2種をそれぞれ制限酵素HindIII(タカラバイオ社製)にて消化後、同酵素で消化したpK19mobに接続し、プラスミドpTJ007(ICL遺伝子の470 bpから888 bpを含む)、pTJ008(ICL遺伝子の470 bpから888 bpを含む)、pTJ009(ICL遺伝子の214 bpから1002 bpを含む)を構築した(図2)。pTJ007とpJT008は同じICL遺伝子断片が挿入されているが、挿入方向が異なる。前記プラスミド各製造手順では、実施例2記載のキット類を使用した。
PR4KS株とPR4KSΔligD株対数増殖期の細胞を遠心分離器により集菌し、氷冷した滅菌水で3回洗浄後、滅菌水に懸濁して、コンピテントセルを作製した。両株のコンピテントセル20 μlと、プラスミドpTJ007、pTJ008、pTJ009(全て1 ng/μl)1 μlをそれぞれ混合し、氷冷した。遺伝子導入装置 Gene Pulser(BIO RAD)用のキュベットに各混合液を入れ、Gene Pulserを用いて20 KV/cm、200 OHMSで電気パルス処理を行った。電気パルス処理後、キュベットにLB培地(1% bact tryptone、0.5% bact yeast extract、1% NaCl)500 μlを加え、30 ℃、5時間静置した後、カナマイシン硫酸塩50 mg/L含有LB寒天培地に塗布し、30 ℃、3日間培養した。
得られたコロニーを2個ずつ選び、各形質転換株からゲノムを抽出した。抽出したゲノムを鋳型にしたPCRを行い、標的であるICL遺伝子にpTJ007、pTJ008、pTJ009が挿入されているかを確認した。増幅条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-60: 5'- CGTAGGAATCTTCACAGAC -3' (配列番号11)
GB-216: 5'- GGCCAGCGTGATGAACTGGAACTTG -3'(配列番号12)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-60(配列番号11) 1 μl
GB-216(配列番号12) 1 μl
各形質転換株ゲノム 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、50℃ 10秒及び72℃ 180秒の反応を30サイクル
PCRの結果を図3に示す。ICL遺伝子にpTJ007、pTJ008、pTJ009が挿入されている場合(相同組換えが起こった場合)、約5.4 kb(pTJ007挿入及びpTJ008挿入)又は約5.8 kb(pTJ009挿入)のDNA断片が増幅し、挿入が起こっていない場合は約1.2 kbのDNA断片が増幅する。ACE01、ACE02のゲノムを鋳型に用いた場合、約1.2 kbのDNA断片が増幅し、PR4KS株を用いた場合と同じ結果となった。すなわち、LigDが欠失していない宿主にICL破壊用プラスミドpTJ007を導入した場合、ゲノム上のICL遺伝子へのプラスミド挿入は起こっていなかった。それに対し、ACE03、ACE04、ACE05、ACE06のゲノムを鋳型に用いた場合は約5.4 kbのDNA断片が、ACE07、ACE09のゲノムを用いた場合は約5.8 kbのDNA断片が増幅した。PR4KSΔLigDを鋳型に用いた場合には、PR4株を用いた場合と同じく約1.2 kbのDNA断片が増幅した。すなわち、LigDを欠失させた宿主にICL遺伝子を含む(非複製型)プラスミドを導入した場合、ゲノム上のICL遺伝子へのプラスミド挿入が起こっていた。従って、LigD遺伝子欠失により、標的遺伝子の相同組換えが容易になったと考えられる。
<Example 4>
Improvement of homologous recombination frequency in PR4KSΔLigD strain In order to demonstrate that gene modification by homologous recombination can be easily carried out by using the Rhodococcus bacterium mutant of the present invention, the following experiment was conducted.
Isocitrate lyase (ICL) (accession no: YP_002765021) was selected as the target gene to be destroyed. Based on the PR4 genome sequence information, the ICL gene partial sequence was amplified by PCR using the genome extracted from the PR4KS strain as a template, and the amplified gene was cloned into pK19mobsacB1.
Primers GB-208 (SEQ ID NO: 7) and GB-211 (SEQ ID NO: 10) or GB-209 (SEQ ID NO: 8) and GB-210 (with a HindIII site added, using a genome extracted from the PR4KS strain as a template An ICL gene partial sequence of about 0.8 kb or about 0.4 kb was amplified by PCR using SEQ ID NO: 9). Amplification conditions are as follows.
Primer:
GB-208: 5'-GG AAGCTT ACCGGCAACATGGCTGTG -3 '(SEQ ID NO: 7)
GB-209: 5'-GG AAGCTT CGGTGGCGCTCTCAACGC -3 '(SEQ ID NO: 8)
GB-210: 5'-GG AAGCTT CTTTGCAACCTCGAGATC -3 '(SEQ ID NO: 9)
GB-211: 5'-GG AAGCTT CTGGAACTTCGCGATGGTC-3 '(SEQ ID NO: 10)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-208 (SEQ ID NO: 7) or GB-209 (SEQ ID NO: 8) 1 μl
GB-210 (SEQ ID NO: 9) or GB-211 (SEQ ID NO: 10) 1 μl
PR4KS genome (50 ng / μl) 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
35 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 120 seconds
After digesting two ICL gene partial sequences with restriction enzyme HindIII (manufactured by TAKARA BIO INC.), Connecting to pK19mob digested with the same enzyme, plasmid pTJ007 (from 470 bp to 888 bp of ICL gene), pTJ008 (ICL PTJ009 (including 214 to 1002 bp of ICL gene) was constructed (Fig. 2). pTJ007 and pJT008 have the same ICL gene fragment inserted, but are inserted in different directions. In each plasmid production procedure, the kits described in Example 2 were used.
Cells in the logarithmic growth phase of PR4KS strain and PR4KSΔligD strain were collected by a centrifugal separator, washed three times with ice-cooled sterilized water, and suspended in sterilized water to prepare competent cells. 20 μl of competent cells of both strains and 1 μl of plasmids pTJ007, pTJ008, and pTJ009 (all 1 ng / μl) were mixed and ice-cooled. Each mixed solution was put in a cuvette for a gene introduction device Gene Pulser (BIO RAD), and electric pulse treatment was performed at 20 KV / cm, 200 OHMS using a Gene Pulser. After electric pulse treatment, add 500 μl of LB medium (1% bact tryptone, 0.5% bact yeast extract, 1% NaCl) to the cuvette and let stand at 30 ° C. for 5 hours, then LB agar containing kanamycin sulfate 50 mg / L It was applied to the medium and cultured at 30 ° C. for 3 days.
Two colonies obtained were selected and the genome was extracted from each transformed strain. PCR was performed using the extracted genome as a template, and it was confirmed whether pTJ007, pTJ008, and pTJ009 were inserted into the target ICL gene. Amplification conditions are as follows.
Primer:
GB-60: 5'-CGTAGGAATCTTCACAGAC-3 '(SEQ ID NO: 11)
GB-216: 5'-GGCCAGCGTGATGAACTGGAACTTG-3 '(SEQ ID NO: 12)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-60 (SEQ ID NO: 11) 1 μl
GB-216 (SEQ ID NO: 12) 1 μl
1 μl of each transformant genome
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 180 seconds
The results of PCR are shown in FIG. When pTJ007, pTJ008, and pTJ009 are inserted into the ICL gene (when homologous recombination occurs), a DNA fragment of approximately 5.4 kb (insert pTJ007 and pTJ008) or approximately 5.8 kb (insert pTJ009) is amplified and inserted. When this does not occur, a DNA fragment of about 1.2 kb is amplified. When the ACE01 and ACE02 genomes were used as templates, a DNA fragment of about 1.2 kb was amplified, which was the same result as when the PR4KS strain was used. That is, when the ICL disruption plasmid pTJ007 was introduced into a host in which LigD was not deleted, plasmid insertion into the ICL gene on the genome did not occur. In contrast, when the ACE03, ACE04, ACE05, and ACE06 genomes were used as templates, an approximately 5.4 kb DNA fragment was amplified, and when the ACE07 and ACE09 genomes were used, an approximately 5.8 kb DNA fragment was amplified. When PR4KSΔLigD was used as a template, a DNA fragment of about 1.2 kb was amplified as in the case of using PR4 strain. That is, when a plasmid containing the ICL gene (non-replicating type) was introduced into a host lacking LigD, plasmid insertion into the ICL gene on the genome occurred. Therefore, it is considered that the homologous recombination of the target gene was facilitated by the deletion of the LigD gene.
<実施例5>
LigDホモログ遺伝子欠失による非相同的な外来DNA挿入の抑制効果
PR4KSΔLigD株において、そのゲノムとの相同配列を持たない直鎖状DNA(非複製型DNA)による形質転換、即ち、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入が起こるどうか、確認を実施した。PR4KSΔLigD株ゲノムと相同配列を持たないDNAとしては、特開2011-223925号公報記載のpK19Bを鋳型として作製した、カナマイシン耐性遺伝子とプラスミド複製開始領域(大腸菌内で機能)を含むDNA断片MK09を使用した。対照株としてPR4KS株を、形質転換効率確認用プラスミドにはpK4(特開05-064589号公報、ロドコッカスATCC12674/pK4:旧工業技術研究所・微工研条寄第3731号)を使用した。形質転換は実施例4と同様にエレクトロポレーション法により実施した。
その結果、両株はプラスミドpK4に対しては同程度の形質転換効率であるにもかかわらず、MK09を用いた場合に、PR4KSΔLigD株ではコロニーが出現しなかった。PR4KS株では282個のコロニーが出現したことから、LigDホモログ遺伝子を欠失させることにより、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入率が2桁以上低下することが分かった(表1)。
<Example 5>
Inhibition of heterologous foreign DNA insertion by deletion of LigD homolog gene
In the PR4KSΔLigD strain, it was confirmed whether transformation with linear DNA (non-replicating DNA) having no homologous sequence with the genome, that is, non-homologous foreign DNA insertion into the genome occurred. As DNA that does not have a homologous sequence with the PR4KSΔLigD strain genome, the DNA fragment MK09 containing the kanamycin resistance gene and the plasmid replication initiation region (functional in E. coli) prepared using pK19B described in JP-A-2011-223925 as a template is used. did. The PR4KS strain was used as a control strain, and pK4 (Japanese Patent Laid-Open No. 05-064589, Rhodococcus ATCC12674 / pK4: Former Industrial Technology Research Institute / Kikenkenjo No. 3731) was used as a plasmid for confirming transformation efficiency. Transformation was carried out by electroporation as in Example 4.
As a result, although both strains had transformation efficiency comparable to that of plasmid pK4, no colonies appeared in the PR4KSΔLigD strain when MK09 was used. Since 282 colonies appeared in the PR4KS strain, it was found that deletion of the LigD homolog gene decreased the heterologous foreign DNA insertion rate to the genome by two orders of magnitude (Table 1).
表1:pK4又はMK09によるPR4KS株及びPR4KSΔLigD株の形質転換効率(cfu/μg DNA)
Table 1: Transformation efficiency of PR4KS strain and PR4KSΔLigD strain by pK4 or MK09 (cfu / μg DNA)
<実施例6>
LigDホモログ遺伝子のクローニングと遺伝子欠失用プラスミドの作製
1) J1-Cm株の染色体DNAの調製
ロドコッカス・ロドクロウス (Rhodococcus rhodochrous) J1-Cm株 (J1-Cm株) を100 mlのMYKG培地中、30℃にて72時間振とう培養した。
培養後、集菌し、集菌された菌体をSaline-EDTA溶液 (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH8.0)) 4 mlに懸濁した。懸濁液にリゾチーム40 mgを加えて37℃で1時間〜2時間振とうした後、-20℃で凍結した。
次に、10 mlのTris-SDS液 (1 % SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)) を穏やかに振とうしながら加え、さらにプロテイナーゼK (メルク社) (10 mg/ml) を10 μl加えて37℃で1時間振とうした。
次に、等量のTE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH8.0)) 飽和フェノールを加え、攪拌後、遠心した。上層を採取し、2倍量のエタノールを加えた後、ガラス棒でDNAを巻き取り、90 %, 80 %, 70 %のエタノールで順次フェノールを取り除いた。
次に、DNAを3 mlのTE緩衝液に溶解させ、リボヌクレアーゼA溶液 (100℃, 15分間の加熱処理済) を10 μg/mlになるように加え、37℃で30分間振とうした。さらに、プロテイナーゼKを加え37℃で30分間振とうした後、等量のTE飽和フェノールを加えて遠心し、上層と下層に分離させた。
上層についてこの操作を2回繰り返した後、同量のクロロホルム (4 %イソアミルアルコール含有) を加え、同様の抽出操作を繰り返した。その後、上層に2倍量のエタノールを加え、ガラス棒でDNAを巻き取り回収し、染色体DNA標品を得た。
<Example 6>
Cloning of LigD homolog gene and construction of plasmid for gene deletion
1) Preparation of chromosomal DNA of J1-Cm strain Rhodococcus rhodochrous J1-Cm strain (J1-Cm strain) was cultured in 100 ml of MYKG medium with shaking at 30 ° C for 72 hours.
After culturing, the cells were collected, and the collected cells were suspended in 4 ml of Saline-EDTA solution (0.1 M EDTA, 0.15 M NaCl (pH 8.0)). 40 mg of lysozyme was added to the suspension, shaken at 37 ° C. for 1 to 2 hours, and then frozen at −20 ° C.
Next, 10 ml of Tris-SDS solution (1% SDS, 0.1 M NaCl, 0.1 M Tris-HCl (pH 9.0)) was added while gently shaking, and proteinase K (Merck) (10 mg / ml) was added. 10 μl) was added and shaken at 37 ° C. for 1 hour.
Next, an equal amount of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA (pH 8.0)) saturated phenol was added, stirred and centrifuged. After collecting the upper layer and adding twice the amount of ethanol, the DNA was wound up with a glass rod, and phenol was sequentially removed with 90%, 80%, and 70% ethanol.
Next, DNA was dissolved in 3 ml of TE buffer, ribonuclease A solution (100 ° C., heat-treated for 15 minutes) was added to 10 μg / ml, and shaken at 37 ° C. for 30 minutes. Furthermore, after adding proteinase K and shaking at 37 ° C. for 30 minutes, an equal amount of TE saturated phenol was added and centrifuged to separate the upper layer and the lower layer.
After repeating this operation twice for the upper layer, the same amount of chloroform (containing 4% isoamyl alcohol) was added, and the same extraction operation was repeated. Thereafter, twice the amount of ethanol was added to the upper layer, and the DNA was wound up and collected with a glass rod to obtain a chromosomal DNA preparation.
2) LigDホモログ遺伝子を含む断片のクローニング
J1-Cm株のLigD遺伝子をPCRで増幅するためのプライマーを以下の方法で設計した。
図4はロドコッカス属細菌の産生するATP dependent DNA ligaseのアミノ酸ホモロジー解析結果を示す。図4中、特に保存されている2つの領域を選んで配列番号23および配列番号24のデジェネレイトプライマーを設計し、1)で調製したJ1菌染色体DNAを鋳型としてデジェネレイトPCRを以下の条件で実施した。その結果、約1.4 kbのバンドの増幅が確認された。
反応液組成
鋳型DNA (J1-Cm染色体DNA) 1 μl
10×Ex Buffer (タカラバイオ社) 10 μl
150 μMプライマーDG-01 (配列番号23) 1 μl
150 μMプライマーDG-02 (配列番号24) 1 μl
2.5 mM dNTP 8 μl
DMSO 10 μl
滅菌水 18 μl
ExTaq DNAポリメラーゼ (タカラバイオ社) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル: 94℃ 30秒、65℃ 30秒および72℃ 1分の反応を30サイクル
プライマー:
DG-01: 5'- ggccarcargcngcnctsgar-3’(配列番号23)
DG-02: 5'- ggyttscgsagsaggctsacgcc-3’(配列番号24)
なお、上記プライマー中、rはプリン塩基(puRine)を、sはグアニン又はシトシン(Strong interactions)を、yはピリミジン塩基(pYrimidine)を指す。
次に、増幅された配列のダイレクトシークエンシングをPCRで使用したプライマー(DG-01及びDG-02)を用いて実施した。その結果、配列番号25に示す配列が得られ、ホモロジー検索の結果、前述のATP dependent DNA ligaseとの相同性が認められた。
2) Cloning of a fragment containing the LigD homolog gene
Primers for amplifying LigD gene of J1-Cm strain by PCR were designed by the following method.
FIG. 4 shows the results of amino acid homology analysis of ATP dependent DNA ligase produced by Rhodococcus bacteria. In FIG. 4, two conserved regions were selected and degenerate primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24 were designed. Using the chromosomal DNA prepared in 1) as a template, degenerate PCR was performed under the following conditions. Carried out. As a result, amplification of a band of about 1.4 kb was confirmed.
Reaction solution composition
Template DNA (J1-Cm chromosomal DNA) 1 μl
10 × Ex Buffer (Takara Bio) 10 μl
150 μM primer DG-01 (SEQ ID NO: 23) 1 μl
150 μM primer DG-02 (SEQ ID NO: 24) 1 μl
2.5 mM dNTP 8 μl
DMSO 10 μl
Sterile water 18 μl
ExTaq DNA polymerase (Takara Bio) 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle: 94 ° C for 30 seconds, 65 ° C for 30 seconds and 72 ° C for 1 minute for 30 cycles Primer:
DG-01: 5'-ggccarcargcngcnctsgar-3 '(SEQ ID NO: 23)
DG-02: 5'- ggyttscgsagsaggctsacgcc-3 '(SEQ ID NO: 24)
In the primers, r represents a purine base (puRine), s represents a guanine or cytosine (Strong interactions), and y represents a pyrimidine base (pYrimidine).
Next, direct sequencing of the amplified sequence was performed using primers (DG-01 and DG-02) used in PCR. As a result, the sequence shown in SEQ ID NO: 25 was obtained, and as a result of homology search, homology with the aforementioned ATP dependent DNA ligase was confirmed.
3) ゲノミックサザンハイブリダイゼーション
ApaI, ApaLI, BamHI, ClaI, Eco52I, EcoT14I, KpnI, MluI, NcoI, NotI, PvuI, SacI, XbaIそれぞれで消化したJ1-Cm染色体DNAに対し、後述の方法で調製したプローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行ったところ、ApaIで消化した断片から、約6.4 kbの単一シグナルが得られた。
なお、プローブは以下のようにして調製した。
2)で調製したPCR産物をGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit (GEヘルスケア バイオサイエンス社) を用いて精製した。精製したPCR産物に対してAlkPhos Direct Labeling kit (GEヘルスケア バイオサイエンス社) を用い、添付のマニュアルにしたがってラベリングを行い、プローブとした。
3) Genomic Southern hybridization
Southern hybridization using a probe prepared by the following method to J1-Cm chromosomal DNA digested with ApaI, ApaLI, BamHI, ClaI, Eco52I, EcoT14I, KpnI, MluI, NcoI, NotI, PvuI, SacI, XbaI. As a result, a single signal of about 6.4 kb was obtained from the fragment digested with ApaI.
The probe was prepared as follows.
The PCR product prepared in 2) was purified using the GFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit (GE Healthcare Bioscience). The purified PCR product was labeled using the AlkPhos Direct Labeling kit (GE Healthcare Bioscience) according to the attached manual.
4) コロニーハイブリダイゼーション
J1-Cm染色体DNAを制限酵素ApaIで分解して0.7 %アガロースゲル電気泳動で分離し、ゲルからGFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit (GEヘルスケア バイオサイエンス社) を使用して約6.4 kbの断片を回収した。得られた断片は、pBluescriptII SK (+) ベクター (Stratagene社製) にDNA ligation kit <Mighty mix> (タカラバイオ社製) を用いて連結した。反応条件は以下の通りである。
反応液組成:
ligation mighty mix (タカラバイオ社製) 5 μl
J1-Cm染色体DNA/ApaI切断断片 4 μl
pBluescriptII SK (+)/ApaI切断断片 1 μl
総量 10 μl
反応:
16℃, 1時間
上記ライゲーション産物の全量を大腸菌JM109株コンピテントセル200 μlに加え、0℃で30分放置した。続いて、前述コンピテントセルに42℃で45秒間ヒートショックを与え、0℃で2分間冷却した。その後、SOC培地 (20 mMグルコース、2 %バクトトリプトン、0.5 %バクトイーストエキス、10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgSO4, 1 mM MgCl2) を1 ml添加し、37℃にて1時間振とう培養した。培養後の培養液を200 μlずつ、LB AIXプレート (100 μg/lアンピシリン、100 μM IPTG, 50μg/l X-galを含むLB寒天培地) に塗布し、37℃で一晩放置した。プレート上に生育した白色の組換コロニーを新しいLB AIXプレートに、プレート1枚に付き94個、プレート10枚分単離した。各プレートにはインサートを含まないpBluescriptII SK (+) で形質転換したJM109株を2コロニー/プレート植菌した。コロニー単離したプレートを37℃で一晩放置した後、Hybond-N+ (GEヘルスケア バイオサイエンス社) 膜にコロニーを写し取り、3) で調製したプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行った。
検出されたコロニーを培養して得られた培養液を集菌後、QIAprep miniprep kit (QIAGEN社製) を用いて組換えプラスミドを回収した。キャピラリーDNAシーケンサーCEQ2000 (ベックマン・コールター社製) を用いて、添付のマニュアルに従って、プラスミド中にクローニングされている染色体DNA断片の塩基配列を解析した。その結果、配列番号26に示される塩基配列が得られた。配列番号26に示される塩基配列中に、配列番号22に示す2493 bpのオープンリーディングフレーム (ORF1) を見出した。このORF1のコードするアミノ酸配列は、図4中に示したロドコッカス属細菌由来ATP dependent DNA ligaseに対して62 %〜95 %の相同性を持っていることから、ORF1はATP dependent DNA ligaseをコードしていることが推定されたため、ORF1のコードするATP dependent DNA ligaseをJ1 ATP dependent DNA ligaseと命名した。また、得られたORF1を含むプラスミドをpBJ1LigDと命名した。
4) Colony hybridization
The J1-Cm chromosomal DNA was digested with the restriction enzyme ApaI and separated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and the gel was purified using the GFX PCR DNA band and Gel Band Purification kit (GE Healthcare Bioscience). Fragments were collected. The obtained fragment was ligated to pBluescriptII SK (+) vector (Stratagene) using DNA ligation kit <Mighty mix> (Takara Bio). The reaction conditions are as follows.
Reaction solution composition:
ligation mighty mix (Takara Bio) 5 μl
J1-Cm chromosomal DNA / ApaI fragment 4 μl
pBluescriptII SK (+) / ApaI cleavage fragment 1 μl
Total volume 10 μl
reaction:
16 ° C., 1 hour The total amount of the ligation product was added to 200 μl of E. coli JM109 strain competent cell, and left at 0 ° C. for 30 minutes. Subsequently, the competent cell was subjected to a heat shock at 42 ° C. for 45 seconds and cooled at 0 ° C. for 2 minutes. Then, 1 ml of SOC medium (20 mM glucose, 2% bactotryptone, 0.5% bacto yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 ) was added, and 1 ml at 37 ° C. Cultured with shaking. 200 μl of the culture solution after the culture was applied to an LB AIX plate (LB agar medium containing 100 μg / l ampicillin, 100 μM IPTG, 50 μg / l X-gal) and left at 37 ° C. overnight. White recombinant colonies grown on the plates were isolated on a new LB AIX plate for 94 plates per plate and 10 plates. Each plate was inoculated with 2 colonies / plate of JM109 strain transformed with pBluescriptII SK (+) containing no insert. The colony-isolated plate was allowed to stand at 37 ° C. overnight, and then the colony was copied onto a Hybond-N + (GE Healthcare Bioscience) membrane, and colony hybridization was performed using the probe prepared in 3).
A culture solution obtained by culturing the detected colonies was collected, and then the recombinant plasmid was recovered using QIAprep miniprep kit (manufactured by QIAGEN). Using a capillary DNA sequencer CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), the base sequence of the chromosomal DNA fragment cloned in the plasmid was analyzed according to the attached manual. As a result, the base sequence represented by SEQ ID NO: 26 was obtained. In the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26, the 2493 bp open reading frame (ORF1) shown in SEQ ID NO: 22 was found. Since the amino acid sequence encoded by ORF1 has 62% to 95% homology to the ATP dependent DNA ligase derived from Rhodococcus bacteria shown in FIG. 4, ORF1 encodes ATP dependent DNA ligase. Therefore, the ATP dependent DNA ligase encoded by ORF1 was named J1 ATP dependent DNA ligase. Further, the obtained plasmid containing ORF1 was named pBJ1LigD.
5) J1 ATP dependent DNA ligase (LigD) 遺伝子欠失用プラスミドの作製
J1菌のLigD遺伝子周辺配列を含む約4.2 kbのDNAをPCRにより増幅後、特開2011-200133に記載された、sacB遺伝子がカナマイシン耐性遺伝子の下流且つ同方向に導入されたプラスミドベクターpK19mobsacB1にクローニングし、プラスミドpK19ligDを得た。PCR条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-224: 5'- GGTCCTGCAGGCCGTTGAGATACGCCTCG -3' (配列番号27)
GB-225: 5'- GGTTCTAGAGATATCCGATCGCGACGAATC -3'(配列番号28)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-224(配列番号27) 1 μl
GB-225(配列番号28) 1 μl
J1-Cm染色体DNA 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を35サイクル
pK19ligD内部のLigDホモログ遺伝子全長(約2.5 kb)を欠失させLigDホモログ遺伝子の上流及び下流配列のみを残存させた、LigDホモログ遺伝子欠失用プラスミドpK19ΔligDを作製した。pK19ΔligDは、標的であるLigDホモログ遺伝子の開始コドン付近の配列と終始コドン付近の配列の両方を含み、それぞれ開始コドンから上流方向又は終始コドンから下流方向に伸長するように設計されたプライマーGB-226とGB-227によりpK19ligD内部の配列を増幅することにより得られたLigDホモログ遺伝子を含まないPCR産物により大腸菌JM109株を形質転換して、環状DNAとすることにより取得した。
PCRの条件は以下の通りである。
プライマー:
GB-226: 5'- GTCGGACCCTCTGCTAACGTTCGTCCGAAG -3' (配列番号29)
GB-227: 5'- ACGTTAGCAGAGGGTCCGACTCCCGACGCG -3'(配列番号30)
反応液組成:
滅菌水22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
GB-226(配列番号29) 1 μl
GB-227(配列番号30) 1 μl
pK19ligD(1 ng/μl) 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、50℃ 10秒及び72℃ 180秒の反応を30サイクル
上記プラスミドpK19ΔligD製造手順において、制限酵素により切断したDNA断片及びPCR産物の精製にはGel/PCR Purification Kit(FAVORGEN社製)を、DNA同士の接続にはDNA Ligation Kit <Mighty Mix>(タカラバイオ社製)を、プラスミドの抽出にはQIAprep miniprep kit(QIAGEN社製)を用いた。
5) Preparation of plasmid for deletion of J1 ATP dependent DNA ligase (LigD) gene
About 4.2 kb of DNA containing the sequence around the LigD gene of J1 bacteria was amplified by PCR and then cloned into the plasmid vector pK19mobsacB1 described in JP-A 2011-200133 in which the sacB gene was introduced downstream and in the same direction as the kanamycin resistance gene Plasmid pK19ligD was obtained. PCR conditions are as follows.
Primer:
GB-224: 5'-GGTCCTGCAGGCCGTTGAGATACGCCTCG-3 '(SEQ ID NO: 27)
GB-225: 5'- GGTTCTAGAGATATCCGATCGCGACGAATC -3 '(SEQ ID NO: 28)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-224 (SEQ ID NO: 27) 1 μl
GB-225 (SEQ ID NO: 28) 1 μl
J1-Cm chromosomal DNA 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
35 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 120 seconds
A LigD homolog gene deletion plasmid pK19ΔligD was prepared by deleting the entire length of the LigD homolog gene (about 2.5 kb) inside pK19ligD and leaving only the upstream and downstream sequences of the LigD homolog gene. pK19ΔligD contains both a sequence near the start codon and a sequence near the stop codon of the target LigD homolog gene, and primer GB-226 designed to extend upstream from the start codon or downstream from the stop codon, respectively. It was obtained by transforming Escherichia coli JM109 strain with a PCR product not containing the LigD homolog gene obtained by amplifying the sequence inside pK19ligD with GB-227 and making it circular DNA.
PCR conditions are as follows.
Primer:
GB-226: 5'- GTCGGACCCTCTGCTAACGTTCGTCCGAAG -3 '(SEQ ID NO: 29)
GB-227: 5'-ACGTTAGCAGAGGGTCCGACTCCCGACGCG-3 '(SEQ ID NO: 30)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
GB-226 (SEQ ID NO: 29) 1 μl
GB-227 (SEQ ID NO: 30) 1 μl
pK19ligD (1 ng / μl) 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 50 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 180 seconds Gel / PCR Purification Kit (manufactured by FAVORGEN) for purification of DNA fragments and PCR products cleaved with restriction enzymes in the above plasmid pK19ΔligD production procedure The DNA Ligation Kit <Mighty Mix> (manufactured by Takara Bio Inc.) was used for connecting DNAs, and the QIAprep miniprep kit (manufactured by QIAGEN) was used for plasmid extraction.
<実施例7>
J1-CmのLigDホモログ遺伝子欠失株及びその誘導株の作製
大腸菌(Escherichia coli)S17-1λpirをpK19ΔligDにより形質転換したものをドナーとし、実施例1の方法により得られたJ1-Cmをレシピエントとして、特開2011-200133号公報に記載の方法と同様に接合伝達を行い、相同組換えによって生じた2株のligD遺伝子欠失株を得た。前記欠失株から1株を選び、J1-CmΔLigD株と命名した。
次に、特開2013−5792号公報に記載の方法で調製したJ1菌の制限酵素RrhJ1I遺伝子欠失用プラスミドpK19ΔRを用いて大腸菌S17-1λpirを形質転換し、得られた形質転換体をドナー、J1-CmΔLigD株をレシピエントとして上記と同様に接合伝達を行い、相同組換えによって生じた3株のRrhJ1I遺伝子欠失株を得た。前記欠失株から1株を選び、J1-CmΔLigDΔR株と命名した。
<Example 7>
Preparation of a J1-Cm LigD homolog gene deletion strain and its derivative strain J1-Cm obtained by the method of Example 1 was used as a donor using Escherichia coli S17-1λpir transformed with pK19ΔligD. As a result, conjugation transfer was performed in the same manner as described in JP 2011-200133 A, and two ligD gene deletion strains resulting from homologous recombination were obtained. One strain was selected from the deletion strains and named J1-CmΔLigD strain.
Next, E. coli S17-1λpir was transformed with the plasmid pK19ΔR for deletion of the restriction enzyme RrhJ1I gene of J1 prepared by the method described in JP2013-5792A, and the obtained transformant was used as a donor. J1-CmΔLigD strain was used as a recipient for conjugation transfer in the same manner as described above to obtain three RrhJ1I gene deletion strains generated by homologous recombination. One strain was selected from the deletion strains and designated as J1-CmΔLigDΔR strain.
<実施例8>
J1-CmΔLigDΔR株におけるエレクトロポレーションによる相同組換え、遺伝子欠失
本発明のロドコッカス属細菌変異株を使用することにより、容易に相同組換えによる遺伝子改変を実施できることを実証するために、以下の実験を行った。
欠失する標的遺伝子にニトリルヒドラターゼ(NHase)を選んだ。NHase遺伝子の上流部分と下流部分を含む領域を取得するため、J1-Cm株から抽出した染色体DNAを鋳型に使用したPCRにより増幅し、増幅した遺伝子をpK19mobsacB1にクローニングした。
J1-Cm株から抽出した染色体DNAを鋳型に使用し、プライマーNH-121(配列番号31)及びNH-122(配列番号32)、またはNH-123(配列番号33)及びNH-124(配列番号34)を使用したPCRにより、それぞれ約1.8 kbのNHase遺伝子周辺配列を増幅した。増幅条件は以下の通りである。
プライマー:
NH-121: 5'- GGCCTGCAGGagctgctgacgatgttcatcc -3' (配列番号31)
NH-122: 5'- tcttcgctgattcctcattcctttcatcgg -3'(配列番号32)
NH-123: 5'- gaatgaggaatcagcgaagatgagatccgc -3'(配列番号33)
NH-124: 5'- CCTCTAGAtggcacgactgatcgatgcc -3'(配列番号34)
反応液組成:
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
NH-121(配列番号31) 1 μl
NH-122(配列番号32) 1 μl
J1-Cm染色体DNA 1 μl
総量 50 μl
または、
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR(タカラバイオ社製) 25 μl
NH-123(配列番号33) 1 μl
NH-124(配列番号34) 1 μl
J1-Cm染色体DNA 1 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 10秒及び72℃ 120秒の反応を35サイクル
PCR終了後、反応液2 μlを0.7 %アガロースゲル電気泳動に供し、それぞれ約1.8 kbpのPCR産物の検出を行った。PCR産物を確認した後、反応液をGFX PCR DNA band and GelBand Purification kit(アマシャムバイオサイエンス社製)で精製した。
次に上記の増幅した2つのPCR断片を連結するため、以下の条件でAssembly PCRを行った。
反応液組成:
鋳型DNA1(NH-121とNH-122の増幅産物) 0.5 μl
鋳型DNA2(NH-123とNH-124の増幅産物) 0.5 μl
プライマーNH-121(配列番号31) 1 μl
プライマーNH-124(配列番号34) 1 μl
滅菌水 22 μl
2×PrimeSTAR Max(タカラバイオ社製) 25 μl
総量 50 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 5秒及び72℃ 20秒の反応を30サイクル
PCR終了後、約3.6 kbpの増幅産物を0.7 %アガロース電気泳動で確認し、Mighty Cloning Kit(Blunt End)(タカラバイオ社製)を使用してpUC118に連結した。このようにして得たプラスミドをpUC118/ΔNHと命名した。
続いて、上記プラスミドpUC118/ΔNH及びプラスミドベクターpK19mobsacB1を制限酵素XbaI及びSse8387Iで切断した。
反応液組成1:
プラスミドpUC118/ΔNH 20 μl
XbaI(タカラバイオ社製) 1 μl
Sse8387I(タカラバイオ社製) 1 μl
10×M Buffer(酵素に添付) 5 μl
10×BSA(酵素に添付) 5 μl
滅菌水 18 μl
総量 50 μl
反応液組成2:
プラスミドpK19mobsacB1 5 μl
XbaI(タカラバイオ社製) 0.5 μl
Sse8387I(タカラバイオ社製) 0.5 μl
10×M Buffer(酵素に添付) 2 μl
10×BSA(酵素に添付) 2 μl
滅菌水 10 μl
総量 20 μl
反応:
37℃, 2.5時間
反応終了後、プラスミドpUC118/ΔNHについては反応液の全量を0.7 %アガロースゲル電気泳動に供して約3.6 kbの断片を切り出し、GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit(アマシャムバイオサイエンス社製)で回収してΔNH/XbaI-Sse8387Iとした。
プラスミドベクターpK19mobsacB1については、反応液に2 μlの3 M酢酸ナトリウム、50 μlの99.5 %エタノールを加えてよく混和し、-20℃で1時間冷却した。冷却後の溶液を15,000 rpm, 4℃, 10分遠心して上清を除去し、減圧乾燥にて溶媒を除去した。その後、乾燥させたペレットに50 μlの滅菌水を加えて再度溶解させ、pK19mobsacB1/XbaI-Sse8387Iのベクター溶液を得た。
<Example 8>
Homologous recombination by electroporation and gene deletion in the J1-CmΔLigDΔR strain In order to demonstrate that genetic modification by homologous recombination can be easily performed by using the Rhodococcus bacterium mutant of the present invention, the following experiment was conducted. Went.
Nitrile hydratase (NHase) was selected as the target gene to be deleted. In order to obtain a region including the upstream and downstream portions of the NHase gene, the chromosomal DNA extracted from the J1-Cm strain was amplified by PCR using the template, and the amplified gene was cloned into pK19mobsacB1.
Chromosomal DNA extracted from J1-Cm strain is used as a template, primers NH-121 (SEQ ID NO: 31) and NH-122 (SEQ ID NO: 32), or NH-123 (SEQ ID NO: 33) and NH-124 (SEQ ID NO: Each of the sequences around the NHase gene of about 1.8 kb was amplified by PCR using (34). Amplification conditions are as follows.
Primer:
NH-121: 5'-GGCCTGCAGGagctgctgacgatgttcatcc -3 '(SEQ ID NO: 31)
NH-122: 5'-tcttcgctgattcctcattcctttcatcgg -3 '(SEQ ID NO: 32)
NH-123: 5'-gaatgaggaatcagcgaagatgagatccgc-3 '(SEQ ID NO: 33)
NH-124: 5'- CCTCTAGAtggcacgactgatcgatgcc -3 '(SEQ ID NO: 34)
Reaction solution composition:
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
NH-121 (SEQ ID NO: 31) 1 μl
NH-122 (SEQ ID NO: 32) 1 μl
J1-Cm chromosomal DNA 1 μl
Total volume 50 μl
Or
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR (Takara Bio) 25 μl
NH-123 (SEQ ID NO: 33) 1 μl
NH-124 (SEQ ID NO: 34) 1 μl
J1-Cm chromosomal DNA 1 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
35 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 10 seconds and 72 ° C for 120 seconds
After completion of PCR, 2 μl of the reaction solution was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis, and PCR products of about 1.8 kbp were detected for each. After confirming the PCR product, the reaction solution was purified with GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (Amersham Biosciences).
Next, assembly PCR was performed under the following conditions in order to link the two amplified PCR fragments.
Reaction solution composition:
Template DNA1 (NH-121 and NH-122 amplification product) 0.5 μl
Template DNA2 (NH-123 and NH-124 amplification product) 0.5 μl
Primer NH-121 (SEQ ID NO: 31) 1 μl
Primer NH-124 (SEQ ID NO: 34) 1 μl
Sterile water 22 μl
2 x PrimeSTAR Max (Takara Bio Inc.) 25 μl
Total volume 50 μl
Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds and 72 ° C for 20 seconds
After completion of PCR, an amplification product of about 3.6 kbp was confirmed by 0.7% agarose electrophoresis, and ligated to pUC118 using Mighty Cloning Kit (Blunt End) (manufactured by Takara Bio Inc.). The plasmid thus obtained was named pUC118 / ΔNH.
Subsequently, the plasmid pUC118 / ΔNH and the plasmid vector pK19mobsacB1 were cleaved with restriction enzymes XbaI and Sse8387I.
Reaction solution composition 1:
Plasmid pUC118 / ΔNH 20 μl
XbaI (Takara Bio) 1 μl
Sse8387I (Takara Bio Inc.) 1 μl
10 × M Buffer (attached to the enzyme) 5 μl
10 x BSA (attached to the enzyme) 5 μl
Sterile water 18 μl
Total volume 50 μl
Reaction solution composition 2:
Plasmid pK19mobsacB1 5 μl
XbaI (Takara Bio Inc.) 0.5 μl
Sse8387I (Takara Bio Inc.) 0.5 μl
10 x M Buffer (attached to the enzyme) 2 μl
10 x BSA (attached to the enzyme) 2 μl
Sterile water 10 μl
Total volume 20 μl
reaction:
After completion of the reaction at 37 ° C for 2.5 hours, the plasmid pUC118 / ΔNH was subjected to 0.7% agarose gel electrophoresis to cut out an approximately 3.6 kb fragment. GFX PCR DNA band and GelBand Purification kit (Amersham Biosciences) To obtain ΔNH / XbaI-Sse8387I.
For the plasmid vector pK19mobsacB1, 2 μl of 3 M sodium acetate and 50 μl of 99.5% ethanol were added to the reaction mixture, mixed well, and cooled at −20 ° C. for 1 hour. The cooled solution was centrifuged at 15,000 rpm, 4 ° C. for 10 minutes to remove the supernatant, and the solvent was removed by drying under reduced pressure. Thereafter, 50 μl of sterilized water was added to the dried pellet and dissolved again to obtain a vector solution of pK19mobsacB1 / XbaI-Sse8387I.
次に回収したΔNH断片とベクターpK19mobsacB1/XbaI-Sse8387Iを連結した。
反応液組成:
Ligation mighty mix(タカラバイオ社製) 5 μl
ΔNH/XbaI-Sse8387I 4 μl
pK19mobsacB1/XbaI-Sse8387I 1 μl
総量 10 μl
反応:
16℃, 1時間
反応終了後、反応産物で大腸菌JM109株を形質転換し、NHase遺伝子欠失プラスミドを得た。本プラスミドをpBKNH01と名付けた。次にプラスミドpBKNH01を用いて大腸菌SCS110株(Stratagene社製)を形質転換し、得られたコロニーからプラスミドを調製した。
次に、後述の方法により作製したJ1-CmΔligDΔR株のコンピテントセル20 μlと、大腸菌SCS110株から調製したプラスミドpBKNH01(1 ng/μl)1 μlをそれぞれ混合し、氷冷した。遺伝子導入装置 Gene Pulser(BIO RAD)用のキュベットに混合液を入れ、Gene Pulserを用いて印加条件1.5 kV, 400Ω, 25 μFにてエレクトロポレーションした。その後、氷上で10分間放置し、続いて37℃で10分間放置した。キュベットにMYK液体培地0.5 mlを加えてよく混和し、懸濁液を全量Φ10×105 mmワッセルマン試験管に移して30℃, 180 rpmで一晩振盪し、復帰培養を行った。復帰培養後の培養液全量をMYK寒天培地(10 mg/lカナマイシン含有)に塗布し、30℃で3日間培養した。
得られたコロニーを1個選んで滅菌水に懸濁して、10 %スクロースを含んだMYKプレートに懸濁液を適度に希釈して塗布し、30℃で静置した。生育したコロニー10個についてコロニーPCRを行い、PCR断片のサイズを電気泳動で調べた。
反応液組成:
プライマーNH-121(配列番号31) 0.2 μl
プライマーNH-124(配列番号34) 0.2 μl
滅菌水 4.1 μl
2×PrimeSTAR Max(タカラバイオ社製) 5 μl
総量 10 μl
温度サイクル:
98℃ 10秒、55℃ 5秒および72℃ 35秒の反応を30サイクル
その結果、10個のコロニーはNHase遺伝子が欠失していることが確認された。PCRの結果を図5に示す。図5中、Lane Mは分子量マーカー、Lane P, Lane GはプラスミドpBKNH01,J1-Cm株染色体DNAを鋳型としたときの増幅パターンである(Lane Pは約3.6kb、Lane Gは約5.7kb)。NHase遺伝子が欠失した場合(エレクトロポレーションによるpBKNH01の導入により相同組換えが起こり、続く10 %スクロースによる選抜で、pBKNH01上のNHase周辺配列と、ゲノム上のNHase周辺配列の間での相同組換えが起こり、NHase遺伝子とベクター部分の脱落が起こった場合)、約3.6 kbのDNA断片が増幅し、NHase遺伝子が欠失しなかった場合(エレクトロポレーションによるpBKNH01の導入により相同組換えが起こり、続く10 %ショ糖による選抜で、pBKNH01上のNHase周辺配列と、ゲノム上のNHase周辺配列の間での相同組換えが起こり、NHase周辺配列とベクター部分の脱落が起こった場合)は約5.7 kbのDNA断片が増幅する。コロニーPCRの結果、すべて約3.6 kbのDNA断片が増幅し、NHase遺伝子が欠失していることが分かった(図5、Lane 1から10)。すなわち、LigDが欠失した宿主にNHase欠失用プラスミドpBKNH01をエレクトロポレーションにより導入した場合、ゲノム上のNHase遺伝子周辺配列との相同組換えが起こっていることが示された。従って、LigD遺伝子欠失により、エレクトロポレーションによる標的遺伝子の相同組換えが容易になったと考えられる。
Next, the recovered ΔNH fragment was ligated with the vector pK19mobsacB1 / XbaI-Sse8387I.
Reaction solution composition:
Ligation mighty mix (Takara Bio Inc.) 5 μl
ΔNH / XbaI-Sse8387I 4 μl
pK19mobsacB1 / XbaI-Sse8387I 1 μl
Total volume 10 μl
reaction:
After completion of the reaction at 16 ° C. for 1 hour, E. coli strain JM109 was transformed with the reaction product to obtain an NHase gene-deleted plasmid. This plasmid was named pBKNH01. Next, Escherichia coli SCS110 strain (manufactured by Stratagene) was transformed with the plasmid pBKNH01, and a plasmid was prepared from the obtained colonies.
Next, 20 μl of J1-CmΔligDΔR competent cell prepared by the method described below and 1 μl of plasmid pBKNH01 (1 ng / μl) prepared from E. coli SCS110 were mixed and ice-cooled. The mixed solution was placed in a cuvette for a gene transfer device Gene Pulser (BIO RAD), and electroporated using Gene Pulser under application conditions of 1.5 kV, 400Ω, and 25 μF. Then, it was left on ice for 10 minutes, and then left at 37 ° C. for 10 minutes. 0.5 ml of MYK liquid medium was added to the cuvette and mixed well. The whole suspension was transferred to a Φ10 × 105 mm Wasselman test tube and shaken overnight at 30 ° C. and 180 rpm for reincubation. The whole culture solution after reversion culture was applied to MYK agar medium (containing 10 mg / l kanamycin) and cultured at 30 ° C. for 3 days.
One obtained colony was selected and suspended in sterilized water, and the suspension was appropriately diluted and applied to a MYK plate containing 10% sucrose, and allowed to stand at 30 ° C. Colony PCR was performed on 10 grown colonies, and the size of the PCR fragment was examined by electrophoresis.
Reaction solution composition:
Primer NH-121 (SEQ ID NO: 31) 0.2 μl
Primer NH-124 (SEQ ID NO: 34) 0.2 μl
Sterile water 4.1 μl
2 x PrimeSTAR Max (Takara Bio Inc.) 5 μl
Total volume 10 μl
Temperature cycle:
30 cycles of reaction at 98 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. for 35 seconds. As a result, it was confirmed that the NHase gene was deleted in 10 colonies. The results of PCR are shown in FIG. In FIG. 5, Lane M is a molecular weight marker, and Lane P and Lane G are amplification patterns using plasmid pBKNH01 and J1-Cm chromosomal DNA as templates (Lane P is about 3.6 kb, Lane G is about 5.7 kb). . When the NHase gene is deleted (homologous recombination occurs by introduction of pBKNH01 by electroporation, and subsequent selection with 10% sucrose results in a homologous group between the NHase peripheral sequence on pBKNH01 and the NHase peripheral sequence on the genome. When the NHase gene and the vector part are lost), a DNA fragment of about 3.6 kb is amplified, and when the NHase gene is not deleted (the introduction of pBKNH01 by electroporation causes homologous recombination. In the subsequent selection with 10% sucrose, homologous recombination occurs between the NHase peripheral sequence on pBKNH01 and the NHase peripheral sequence on the genome, and the NHase peripheral sequence and the vector part are lost)). A kb DNA fragment is amplified. As a result of colony PCR, it was found that a DNA fragment of about 3.6 kb was amplified and the NHase gene was deleted (FIG. 5, Lane 1 to 10). That is, when the NHase deletion plasmid pBKNH01 was introduced into a host lacking LigD by electroporation, it was shown that homologous recombination with the NHase gene peripheral sequence on the genome occurred. Therefore, it is considered that the homologous recombination of the target gene by electroporation has been facilitated by deletion of the LigD gene.
なお、J1-CmΔligDΔR株のコンピテントセルは以下の方法で調製した。
MYKG培地(0.5 %ポリペプトン、0.3 %バクトイーストエキス、0.3 %マルツエキス、0.2 %KH2PO4,0.2 %K2HPO4,1 %グルコース)をΦ24 mm×165 mm試験管に10 mlずつ分注し、各試験管にJ1-CmΔligDΔR株のコロニーを植菌した。30 ℃,350 rpmで1日培養した後、得られた培養液各3 mlをMYKG-20 %Sucrose培地(500 ml三角フラスコ中の100 ml)に植菌し、30 ℃、230 rpmで20時間培養した。得られた培養液を全量50 ml容のチューブに移し、遠心分離(5000 rpm,10分間、4℃)により各菌体を回収した。回収した各菌体を10 mlのElectroporation Buffer(2 mM K2HPO4,10 %スクロース、pH8.3;以降EBと略記することがある)で2回洗浄した後、菌濃度が同一となるように、それぞれEBに懸濁し、-80℃で凍結してコンピテントセルとした。
A competent cell of the J1-CmΔligDΔR strain was prepared by the following method.
Dispense 10 ml of MYKG medium (0.5% polypeptone, 0.3% bactoeast extract, 0.3% malt extract, 0.2% KH 2 PO 4 , 0.2% K 2 HPO 4 , 1% glucose) into a Φ24 mm x 165 mm test tube. Each test tube was inoculated with a colony of J1-CmΔligDΔR strain. After culturing at 30 ° C and 350 rpm for 1 day, inoculate 3 ml of each of the obtained cultures into MYKG-20% Sucrose medium (100 ml in a 500 ml Erlenmeyer flask), and 30 hours at 30 ° C and 230 rpm. Cultured. The obtained culture solution was transferred to a tube having a total volume of 50 ml, and each bacterial cell was collected by centrifugation (5000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.). Each collected bacterial cell is washed twice with 10 ml of Electroporation Buffer (2 mM K 2 HPO 4 , 10% sucrose, pH 8.3; hereinafter abbreviated as EB), so that the bacterial concentration becomes the same. Each was suspended in EB and frozen at −80 ° C. to prepare competent cells.
Claims (4)
ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する前記タンパク質が(a)、(b)、(d)又は(e)のいずれかのタンパク質である、前記ロドコッカス属細菌変異株:
(a)配列番号1で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号1で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含み、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質
(d)配列番号21で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(e)配列番号21で示されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加してなるアミノ酸配列を含み、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質。 A Rhodococcus strain mutant in which a gene encoding a protein involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome is deleted or inactivated ,
The Rhodococcus spp. Bacterial strain, wherein the protein involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome is any one of the proteins (a), (b), (d), and (e):
(A) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1
(B) a function involving an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 and involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome Protein with
(D) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21
(E) a function involving an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21, and involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome A protein having
ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する前記タンパク質をコードする遺伝子が(a)から(d)のいずれかのDNAによりコードされる、前記ロドコッカス属細菌変異株:
(a)配列番号2で示される塩基配列を含むDNA
(b)配列番号2で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質をコードするDNA
(c)配列番号22で示される塩基配列を含むDNA
(d)配列番号22で示される塩基配列に相補的な塩基配列を含むDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、且つ、ゲノムへの非相同的な外来DNA挿入に関与する機能を有するタンパク質をコードするDNA。 A Rhodococcus strain mutant in which a gene encoding a protein involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome is deleted or inactivated,
The Rhodococcus bacterium mutant , wherein the gene encoding the protein involved in heterologous foreign DNA insertion into the genome is encoded by any one of DNAs (a) to (d):
(A) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 2
(B) a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 and has a function involved in heterologous insertion of foreign DNA into the genome DNA encoding
(C) DNA containing the base sequence represented by SEQ ID NO: 22
(D) a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising a base sequence complementary to the base sequence represented by SEQ ID NO: 22 and has a function involved in heterologous insertion of foreign DNA into the genome DNA encoding
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2013093388A JP6160814B2 (en) | 2012-05-16 | 2013-04-26 | Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2012112758 | 2012-05-16 | ||
JP2012112758 | 2012-05-16 | ||
JP2013093388A JP6160814B2 (en) | 2012-05-16 | 2013-04-26 | Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013255486A JP2013255486A (en) | 2013-12-26 |
JP6160814B2 true JP6160814B2 (en) | 2017-07-12 |
Family
ID=49952527
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2013093388A Expired - Fee Related JP6160814B2 (en) | 2012-05-16 | 2013-04-26 | Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6160814B2 (en) |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2007300857A (en) * | 2006-05-11 | 2007-11-22 | Saitama Univ | Method for controlling random integration accompanied by gene targeting |
JP2011200133A (en) * | 2010-03-24 | 2011-10-13 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | Method for producing genetically modified microorganism |
JP5712495B2 (en) * | 2010-03-24 | 2015-05-07 | 三菱レイヨン株式会社 | Microorganisms deleted or inactivated drug resistance genes |
JP5754084B2 (en) * | 2010-06-01 | 2015-07-22 | 三菱レイヨン株式会社 | Microorganism in which amidase gene and / or nitrilase gene is deleted or inactivated |
-
2013
- 2013-04-26 JP JP2013093388A patent/JP6160814B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2013255486A (en) | 2013-12-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Liang et al. | A CRISPR/Cas9-based genome editing system for Rhodococcus ruber TH | |
US11041159B2 (en) | Nucleic acids and vectors for regulated target gene expression in methanotrophic bacteria | |
Zhang et al. | I-SceI-mediated scarless gene modification via allelic exchange in Clostridium | |
JP4298165B2 (en) | Microbial strains and processes for the production of biocompatible materials | |
JP3408737B2 (en) | Protein involved in nitrile hydratase activation and gene encoding the same | |
JP2011200133A (en) | Method for producing genetically modified microorganism | |
JP7061018B2 (en) | A novel promoter and a method for producing a protein using the promoter | |
JP5712495B2 (en) | Microorganisms deleted or inactivated drug resistance genes | |
JP5842691B2 (en) | Rhodococcus bacteria with nuclease gene deleted or inactivated | |
JP6160814B2 (en) | Genetically modified Rhodococcus spp. Mutant and method for producing the same | |
JP5754084B2 (en) | Microorganism in which amidase gene and / or nitrilase gene is deleted or inactivated | |
JP5817088B2 (en) | Microorganisms with deletion or inactivation of the nitrile hydratase gene | |
Winteler et al. | Anaerobically controlled expression system derived from the arcDABC operon of Pseudomonas aeruginosa: application to lipase production | |
JP6156442B2 (en) | Microorganisms that have replaced the nitrile hydratase gene | |
JP4903004B2 (en) | Methods for transforming bacteria belonging to the genus Rhodococcus | |
JP4904444B2 (en) | Shuttle vector | |
US20050227356A1 (en) | Novel compositions and methods for genetic manipulation of Rhodococcus bacteria | |
JP4495429B2 (en) | Transformation method of Rhodococcus bacteria | |
JP2003235565A (en) | Shuttle vector for lactobacillus | |
KR100953104B1 (en) | A Novel plasmid from Leuconostoc sp. and Shuttle Vector comprising the plasmid | |
JP2014226090A (en) | Bacterium of genus rhodococcus of which genes encoding proteins participating with cleavage of foreign dna are deleted or inactivated | |
JP6048716B2 (en) | Rhodococcus bacteria with deleted or inactivated urease gene | |
JP5740955B2 (en) | Random gene transfer tool for transformation of Rhodococcus bacteria | |
KR20230133352A (en) | Method for producing target protein | |
JP2005237335A (en) | Recombinant plasmid for streptomyces bacteria |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160122 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20161128 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161221 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170220 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170517 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170530 |
|
R151 | Written notification of patent or utility model registration |
Ref document number: 6160814 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R151 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |