JP5780506B2 - Photosynthetic suppression gene and its use - Google Patents

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Description

本発明は、光合成を抑制する遺伝子、その遺伝子の発現を低減させた形質転換植物、その遺伝子の発現を増強させた形質転換植物などに関する。   The present invention relates to a gene that suppresses photosynthesis, a transformed plant with reduced expression of the gene, a transformed plant with enhanced expression of the gene, and the like.

近年、世界中で地球温暖化、酸性雨、砂漠化の進行、土壌流出、オゾン層の破壊、熱帯雨林の減少、大気・環境汚染、エネルギー危機、貧困、人口の爆発的な増加などの問題が取り上げられている。その中でも特に、環境問題と食糧が関連する農業生産問題が挙げられる。これらの問題を解決するには、地球生態系の生産者である植物の保全とその生産能力の拡大が重要な位置を占めると考えられている。
なぜならば、植物は光エネルギーを直接利用し、我々の食糧を作り出すと共に、環境を浄化することが可能だからである。言い換えると、植物は光エネルギーにより水を分解し、ATP、NADPHおよび酸素を放出し（光合成明反応）、同時に、空気中の二酸化炭素を固定することによって我々の食糧となるデンプンを主体とする有機物を無機物から作り出す（光合成暗反応）という光合成反応を行うためである。
このような植物の機能を解明し、さまざまな環境に適応できるような植物を作り出すことは、農業生産問題において重要である（シリーズ分子生物学5 、植物分子生物学：5.1. 光合成、第１版、山田康之、朝倉書店、東京、1997, pp.99-113）。 In recent years, global warming, acid rain, progress of desertification, soil runoff, ozone layer destruction, rainforest decline, air / environmental pollution, energy crisis, poverty, explosive population increase, etc. It has been taken up. Among them, environmental problems and agricultural production problems related to food are particularly mentioned. In order to solve these problems, it is considered that the conservation of plants, which are producers of the global ecosystem, and the expansion of their production capacity occupy an important position.
This is because plants can directly use light energy to produce our food and clean the environment. In other words, plants break down water with light energy, release ATP, NADPH and oxygen (photosynthesis light reaction), and at the same time, fix organic carbon dioxide in the air to fix our food as an organic substance. This is because a photosynthetic reaction is performed to create a photosynthesis from an inorganic substance (photosynthetic dark reaction).
It is important in agricultural production problems to elucidate the functions of such plants and create plants that can adapt to various environments (Series Molecular Biology 5, Plant Molecular Biology: 5.1. Photosynthesis, 1st Edition). Yasuyuki Yamada, Asakura Shoten, Tokyo, 1997, pp.99-113).

ところで、遺伝子の発現は正の制御と負の制御の両方で成り立っている。つまり、正の制御では、正の因子によって遺伝子は発現し、負の制御では、負の因子によって遺伝子の発現は抑制されている。それは、光合成の遺伝子においても同様である。光と植物ホルモンの複雑なシグナル伝達によって正の因子と負の因子が働き、光合成遺伝子を発現させていると考えられる。正に制御する因子の研究は、転写因子を介したシグナル伝達経路など比較的進んでいる。しかし、負に制御する因子の報告は光合成遺伝子のプロモーター解析から明らかになったものやdet1変異体の解析によって見いだされたものがわずかに報告されているにすぎない（非特許文献１：Plant Physiol 97, 1260-1264 (1991)； 非特許舟kン２：Plant Cell 5, 109-121 (1993)； 非特許文献３：Curr Biol 12, 1462-1472 (2002)；及び非特許文献４：Plant Cell Physiol. 2009 Feb;50(2):290-303）。また、シグナル伝達系の上位にある因子については報告は無く、この遺伝子群探索に関して全ゲノムスクリーニング（whole-genome screening）は行われていない。   By the way, gene expression consists of both positive control and negative control. That is, in positive control, a gene is expressed by a positive factor, and in negative control, gene expression is suppressed by a negative factor. The same is true for photosynthetic genes. It is thought that positive and negative factors act by complex signal transduction of light and plant hormones to express photosynthetic genes. Research on factors that regulate positively is relatively advanced, including signal transduction pathways via transcription factors. However, there are only a few reports on factors that are negatively regulated, which were clarified from the promoter analysis of the photosynthetic gene and those found by the analysis of the det1 mutant (Non-patent Document 1: Plant Physiol). 97, 1260-1264 (1991); Non-patent boat 2: Plant Cell 5, 109-121 (1993); Non-patent document 3: Curr Biol 12, 1462-1472 (2002); and Non-patent document 4: Plant. Cell Physiol. 2009 Feb; 50 (2): 290-303). In addition, there are no reports on factors at the top of the signal transduction system, and whole-genome screening has not been performed for this gene group search.

Plant Physiol 97, 1260-1264 (1991)Plant Physiol 97, 1260-1264 (1991) Plant Cell 5, 109-121 (1993)Plant Cell 5, 109-121 (1993) Curr Biol 12, 1462-1472 (2002)Curr Biol 12, 1462-1472 (2002) Plant Cell Physiol.;50(2):290-303 (2009 Feb)Plant Cell Physiol.; 50 (2): 290-303 (2009 Feb)

上記のような状況において、植物において、光合成に関与する遺伝子、例えば、光合成を抑制する遺伝子を同定することが望まれていた。   Under the circumstances as described above, it has been desired to identify genes involved in photosynthesis, for example, genes that suppress photosynthesis, in plants.

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討を重ね、アクティベーションタギングを用いて光合成を抑制する遺伝子発現を活性化することにより、光合成抑制遺伝子群の探索を行った結果、次に示す、光合成抑制遺伝子、その遺伝子の発現を低減させた形質転換植物、その遺伝子の発現を増強させた形質転換植物などを提供する。   As a result of searching for a group of genes that suppress photosynthesis by activating gene expression that suppresses photosynthesis by using activation tagging, the present inventors have conducted extensive studies to solve the above-described problems. The present invention provides a photosynthetic suppression gene, a transformed plant with reduced expression of the gene, a transformed plant with enhanced expression of the gene, and the like.

〔１〕以下の(a)〜(d)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(a)配列番号：１、３、５又は７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；
(b)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
(c)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(d) 配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して８０%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
〔１a〕配列番号：１、３、５又は７の塩基配列からなるポリヌクレオチドを除く上記〔1〕のポリヌクレオチド。 [1] A polynucleotide selected from the group consisting of the following (a) to (d):
(a) a polynucleotide comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7;
(b) a polynucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8;
(c) a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 50 amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 and having a photosynthetic inhibitory activity A polynucleotide that;
(d) A polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 80% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and having a photosynthetic inhibitory activity.
[1a] The polynucleotide of [1] above, excluding the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.

〔２〕以下の(g)及び(h)からなる群から選択される上記〔１〕に記載のポリヌクレオチド：
(g)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び
(h) 配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列に対して９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。 [2] The polynucleotide according to [1] above selected from the group consisting of the following (g) and (h):
(g) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, a protein comprising an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added and having a photosynthetic inhibitory activity A polynucleotide which;
(h) a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and having photosynthesis inhibitory activity .

〔３〕配列番号：１、３、５又は７の塩基配列を含有する上記〔１〕に記載のポリヌクレオチド。
〔４〕配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする上記〔1〕に記載のポリヌクレオチド。
〔５〕DNAである、上記〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のポリヌクレオチド。 [3] The polynucleotide according to [1] above, which comprises the base sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7.
[4] The polynucleotide according to [1], which encodes a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8.
[5] The polynucleotide according to any one of [1] to [4] above, which is DNA.

〔６〕以下の(j)〜(m)からなる群から選択されるポリヌクレオチド：
(j) 上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(k)上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド；
(l) 上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び
(m)上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド。 [6] A polynucleotide selected from the group consisting of the following (j) to (m):
(j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to [5] above;
(k) a polynucleotide encoding RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to [5] above by an RNAi effect;
(l) a polynucleotide encoding an RNA having an activity of specifically cleaving the transcript of the polynucleotide (DNA) according to [5] above; and
(m) A polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to [5] above by a co-suppression effect.

〔７〕上記〔1〕〜〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドにコードされるタンパク質。
〔８〕上記〔1〕〜〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔９〕上記〔６に記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔１０〕上記〔８〕又は〔９〕に記載のベクターが導入された形質転換体。
〔１１〕上記〔９〕に記載のベクターを導入することによって、または、上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を破壊することによって、上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現が抑制された形質転換体。
〔１１a〕上記〔５〕に記載のポリヌクレオチド（DNA）に係る遺伝子を欠損させた形質転換植物。
〔１２〕上記〔７〕に記載のタンパク質の発現量を低下させることによって光合成能を向上させた形質転換体。
〔１３〕上記〔７〕に記載のタンパク質の発現量を増加させることによって光合成能を低下させた形質転換体。
〔１４〕形質転換体が植物である上記〔１２〕または〔１３〕の形質転換体。
〔１５〕上記〔1〕〜〔５〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを欠損させる工程を含む、光合成能を増強させた形質転換植物の製造方法。 [7] A protein encoded by the polynucleotide according to any one of [1] to [5] above.
[8] A vector containing the polynucleotide according to any one of [1] to [5].
[9] A vector containing the polynucleotide according to [6] above.
[10] A transformant into which the vector according to [8] or [9] is introduced.
[11] The polynucleotide according to [5] above by introducing the vector according to [9] above or by destroying the gene related to the polynucleotide (DNA) according to [5] above A transformant in which expression of DNA) is suppressed.
[11a] A transformed plant in which the gene according to the polynucleotide (DNA) according to [5] above is deleted.
[12] A transformant having improved photosynthetic ability by reducing the expression level of the protein according to [7].
[13] A transformant having reduced photosynthetic ability by increasing the expression level of the protein according to [7].
[14] The transformant according to [12] or [13] above, wherein the transformant is a plant.
[15] A method for producing a transformed plant with enhanced photosynthetic ability, comprising a step of deleting the polynucleotide according to any one of [1] to [5] above.

本発明によれば、植物の光合成能を調節できるので、環境の浄化に有用な植物や、作物の生産性を向上させた植物などを作出することが可能となる。例えば、光合成能を増強させた植物は、光合成能力が高いため、光エネルギーを効率よく、作物の生産に利用することができる。また、植物が光合成を盛んに行うと、大気中の二酸化炭素を効率よく分解して、より多くの酸素を大気中に放出させることができるので、環境の浄化に有効である。また、光合成能を低減させた植物は、成長が遅くなるので、作物の生産時期を調整することが可能となる。また、光合成能を低減させた植物は、果実などの成長も遅くなるので、ことなった形態あるいは食感の果実などを作出することも可能となる。   According to the present invention, since the photosynthetic ability of a plant can be adjusted, it is possible to produce a plant useful for environmental purification, a plant with improved crop productivity, and the like. For example, a plant with enhanced photosynthetic ability has high photosynthetic ability, so that light energy can be efficiently used for crop production. Moreover, when plants actively perform photosynthesis, carbon dioxide in the atmosphere can be efficiently decomposed and more oxygen can be released into the atmosphere, which is effective for environmental purification. In addition, since plants with reduced photosynthetic ability grow slower, it becomes possible to adjust the production time of crops. In addition, since plants with reduced photosynthetic ability also slow down the growth of fruits and the like, it is possible to produce fruits with different forms or textures.

図１は、４種類のsug(supressed greening of calli, activation-tagged)変異系統および野生株を緑化カルス誘導培地上で生育させたプレートの写真を示す。FIG. 1 shows photographs of plates in which four types of sug (supressed greening of calli, activation-tagged) mutant lines and wild strains were grown on a greening callus induction medium. 図２は、sug 101 変異カルスにおけるT-DNA近傍遺伝子の発現量を示す。(A)： T-DNA近傍遺伝子の挿入部位を示す。挿入部近傍10kbpに含まれる遺伝子を囲み、これに対して発現解析を行った。(B)： T-DNA近傍遺伝子の発現量をCol-0緑化カルスを1として比較した。FIG. 2 shows the expression level of genes near T-DNA in sug 101 mutant callus. (A): Shows the insertion site of a gene near T-DNA. The gene contained in 10kbp near the insertion region was surrounded, and expression analysis was performed on this. (B): The expression level of T-DNA neighboring genes was compared with Col-0 greening callus as 1. 図３は、sug 102 変異カルスにおけるT-DNA近傍遺伝子の発現量を示す。(A)： T-DNA近傍遺伝子の挿入部位を示す。挿入部近傍10kbpに含まれる遺伝子を囲み,これに対して発現解析を行った。(B)： T-DNA近傍遺伝子の発現量をCol-0緑化カルスを1として比較した。FIG. 3 shows the expression level of genes near T-DNA in sug 102 mutant callus. (A): Shows the insertion site of a gene near T-DNA. The gene contained in 10kbp in the vicinity of the insert was surrounded, and expression analysis was performed on this. (B): The expression level of T-DNA neighboring genes was compared with Col-0 greening callus as 1. 図４は、sug 103 変異カルスにおけるT-DNA近傍遺伝子の発現量を示す。 (A)： T-DNA近傍遺伝子の挿入部位を示す。挿入部近傍10kbpに含まれる遺伝子を囲み,これに対して発現解析を行った。(B)： T-DNA近傍遺伝子の発現量をCol-0緑化カルスを1として比較した。FIG. 4 shows the expression level of genes near T-DNA in sug 103 mutant callus. (A): Shows the insertion site of a gene near T-DNA. The gene contained in 10kbp in the vicinity of the insert was surrounded, and expression analysis was performed on this. (B): The expression level of T-DNA neighboring genes was compared with Col-0 greening callus as 1. 図５は、sug 104 変異カルスにおけるT-DNA近傍遺伝子の発現量を示す。 (A)： T-DNA近傍遺伝子の挿入部位を示す。挿入部近傍10kbpに含まれる遺伝子を囲み,これに対して発現解析を行った。 (B)： T-DNA近傍遺伝子の発現量をCol-0緑化カルスを1として比較した。FIG. 5 shows the expression level of genes near T-DNA in sug 104 mutant callus. (A): Shows the insertion site of a gene near T-DNA. The gene contained in 10kbp in the vicinity of the insert was surrounded and expression analysis was performed on this. (B): The expression level of T-DNA neighboring genes was compared with Col-0 greening callus as 1. 図６は、SUG候補遺伝子-pSMAB704形質転換体植物でのSUG候補遺伝子の発現量比較を示す。リアルタイムRT-PCRによってSUG候補遺伝子の発現量を測定し、内部標準ACT2遺伝子によって補正を行い、Col-0との相対値で表した。FIG. 6 shows a comparison of the expression levels of SUG candidate genes in a SUG candidate gene-pSMAB704 transformed plant. The expression level of the SUG candidate gene was measured by real-time RT-PCR, corrected with the internal standard ACT2 gene, and expressed as a relative value to Col-0. 図７は、SUG候補遺伝子-pSMAB704形質転換体でのCABおよびRBCS遺伝子の発現量比較を示す。リアルタイムRT-PCRによってCABおよびRBCS遺伝子の発現量を測定した。内部標準ACT2遺伝子によって補正を行い、Col-0との相対値で表した。FIG. 7 shows a comparison of the expression levels of CAB and RBCS genes in the SUG candidate gene-pSMAB704 transformant. The expression levels of CAB and RBCS genes were measured by real-time RT-PCR. Correction was performed using the internal standard ACT2 gene, and the value was expressed relative to Col-0. 図８は、SUG101候補遺伝子破壊 (KO: knockout) 植物におけるCABおよびRBCS遺伝子の発現量比較を示す。リアルタイムRT-PCRによってCABおよびRBCSの発現量を測定し、内部標準ACT2遺伝子によって補正を行い、Col-0との相対値で表した。FIG. 8 shows a comparison of expression levels of CAB and RBCS genes in SUG101 candidate gene disruption (KO: knockout) plants. The expression levels of CAB and RBCS were measured by real-time RT-PCR, corrected with the internal standard ACT2 gene, and expressed as a relative value to Col-0.

１．本発明のポリヌクレオチド
本発明者らは、アクティベーションタギングを用いて光合成抑制遺伝子の探索を行った結果、4種類の新規な光合成抑制遺伝子（SUG101［配列番号：１］，SUG102［配列番号：３］，SUG103［配列番号：５］，SUG104［配列番号：７］）を同定することに成功した。
まず、本発明は、(a)配列番号：１、３、５又は７の塩基配列を含有するポリヌクレオチド；及び(b)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。 1. Polynucleotides of the Present Invention As a result of searching for photosynthetic suppression genes using activation tagging, the present inventors found that four kinds of novel photosynthesis suppressing genes (SUG101 [SEQ ID NO: 1], SUG102 [SEQ ID NO: 3). ], SUG103 [SEQ ID NO: 5], SUG104 [SEQ ID NO: 7]) was successfully identified.
First, the present invention encodes a protein comprising (a) a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7; and (b) a protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. A polynucleotide is provided. The polynucleotide may be DNA or RNA.

本発明で対象とするポリヌクレオチドは、上記の光合成抑制遺伝子をコードするポリヌクレオチドに限定されるものではなく、このタンパク質と機能的に同等なタンパク質をコードする他のポリヌクレオチドを含む。機能的に同等なタンパク質としては、例えば、(c)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、例えば、１〜50個、１〜40個、１〜39個、１〜38個、１〜37個、１〜36個、１〜35個、１〜34個、１〜33個、１〜32個、１〜31個、１〜30個、１〜29個、１〜28個、１〜27個、１〜26個、１〜25個、１〜24個、１〜23個、１〜22個、１〜21個、１〜20個、１〜19個、１〜18個、１〜17個、１〜16個、１〜15個、１〜14個、１〜13個、１〜12個、１〜11個、１〜10個、１〜9個、１〜8個、１〜7個、１〜6個（1〜数個）、１〜5個、１〜4個、１〜3個、１〜2個、１個のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および／または付加の数は、一般的には小さい程好ましい。また、このようなタンパク質としては、(d)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列と約80%以上、85%以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。上記相同性の数値は一般的に大きい程好ましい。   The polynucleotide targeted by the present invention is not limited to the polynucleotide encoding the above-mentioned photosynthesis suppression gene, but includes other polynucleotides encoding a protein functionally equivalent to this protein. Examples of functionally equivalent proteins include (c) an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. And a protein having a photosynthetic inhibitory activity. As such a protein, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, for example, 1 to 50, 1 to 40, 1 to 39, 1 to 38, 1 to 37, 1 -36, 1-35, 1-34, 1-33, 1-32, 1-31, 1-30, 1-29, 1-28, 1-27, 1 -26, 1-25, 1-24, 1-23, 1-22, 1-21, 1-20, 1-19, 1-18, 1-17, 1 -16, 1-15, 1-14, 1-13, 1-12, 1-11, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1 ~ 6 (1 to several), 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 1 amino acid residues deleted, substituted, inserted and / or added A protein having a sequence and having a photosynthetic inhibitory activity is exemplified. In general, the smaller the number of amino acid residue deletions, substitutions, insertions and / or additions, the better. Further, as such a protein, (d) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 and about 80% or more, 85% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more, 93% or more 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6% or more, 99.7 %, 99.8% or more, 99.9% or more of the amino acid sequence having a photosynthesis inhibitory activity. In general, the larger the homology value, the better.

本発明において、「光合成抑制活性」は、光合成を抑制する能力のことをいい、例えば、本発明に係るDNAを導入した植物において、それを導入しない植物と比較して、5％以上、好ましくは10％以上、好ましくは20％以上、さらに好ましくは30％以上、さらに好ましくは40％以上、さらに好ましくは50％以上光合成能を低減させる活性のことをいう。光合成抑制活性は、例えば、後述の実施例に記載した方法によって測定することができる。   In the present invention, “photosynthesis inhibitory activity” refers to the ability to suppress photosynthesis. For example, in a plant into which the DNA according to the present invention is introduced, 5% or more, preferably 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% or more, more preferably 40% or more, more preferably 50% or more. The photosynthetic inhibitory activity can be measured, for example, by the method described in Examples described later.

また、本発明は、(e)配列番号：１、３、５又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；及び(f)配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも包含する。   The present invention also relates to (e) a protein that hybridizes under stringent conditions with a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7 and has a photosynthetic inhibitory activity. And (f) a polynucleotide consisting of a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 and a stringent condition And a polynucleotide encoding a protein having a photosynthetic inhibitory activity.

ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、配列番号：１、３、５又は７の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチド又は配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。ハイブリダイゼーションの方法としては、例えばMolecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997などに記載されている方法を利用することができる。   Here, the “polynucleotide that hybridizes under stringent conditions” means a polynucleotide comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5 or 7, or SEQ ID NO: 2, 4, A polynucleotide (for example, DNA) obtained by using a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a southern hybridization method, or the like using all or part of a polynucleotide encoding an amino acid sequence of 6 or 8 as a probe. . As a hybridization method, for example, a method described in Molecular Cloning 3rd Ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997 can be used.

本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、50％ホルムアミド、50℃の条件である。これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。   As used herein, the “stringent conditions” may be any of low stringency conditions, moderate stringency conditions, and high stringency conditions. “Low stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 32 ° C. The “medium stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, and 42 ° C. “High stringent conditions” are, for example, conditions of 5 × SSC, 5 × Denhardt's solution, 0.5% SDS, 50% formamide, 50 ° C. Under these conditions, it can be expected that a polynucleotide having high homology (eg, DNA) can be efficiently obtained as the temperature is increased. However, multiple factors such as temperature, probe concentration, probe length, ionic strength, time, and salt concentration can be considered as factors that affect hybridization stringency. Those skilled in the art will select these factors as appropriate. It is possible to achieve similar stringency.

なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコルにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたポリヌクレオチド（例えば、DNA）を検出することができる。   In addition, when using a commercially available kit for hybridization, Alkphos Direct Labeling Reagents (made by Amersham Pharmacia) can be used, for example. In this case, follow the protocol supplied with the kit, incubate with the labeled probe overnight, and then wash the membrane with a primary wash buffer containing 0.1% (w / v) SDS at 55 ° C. , Hybridized polynucleotides (eg, DNA) can be detected.

これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLASTなどの相同性検索ソフトウェアにより、デフォルトのパラメーターを用いて計算したときに、配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、約70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.1％以上、99.2％以上、99.3％以上、99.4％以上、99.5％以上、99.6％以上、99.7％以上99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するポリヌクレオチドをあげることができる。   As other polynucleotides that can be hybridized, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8 is encoded when calculated using homology search software such as FASTA and BLAST using default parameters. About 60% or more, about 70% or more, 71% or more, 72% or more, 73% or more, 74% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80 % Or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or more, 86% or more, 87% or more, 88% or more, 89% or more, 90% or more, 91% or more, 92% or more 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6 % Or more, 99.7% or more, 99.8% or more, and 99.9% or more of the polynucleotide having the identity.

なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、カーリンおよびアルチュールによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873, 1993）を用いて決定できる。ＢＬＡＳＴのアルゴリズムに基づいたＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムが開発されている（Altschul SF, et al： J. Mol. Biol. 215： 403, 1990）。ＢＬＡＳＴＮを用いて塩基配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝１００、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝１２とする。また、ＢＬＡＳＴＸを用いてアミノ酸配列を解析する場合は、パラメーターは、例えばｓｃｏｒｅ＝５０、ｗｏｒｄｌｅｎｇｔｈ＝３とする。ＢＬＡＳＴとＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。   The identity of the amino acid sequence and base sequence is determined by the algorithm BLAST (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2264-2268, 1990; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 90). 5873, 1993). Programs called BLASTN and BLASTX based on the BLAST algorithm have been developed (Altschul SF, et al: J. Mol. Biol. 215: 403, 1990). When analyzing a base sequence using BLASTN, parameters are set to, for example, score = 100 and wordlength = 12. When analyzing an amino acid sequence using BLASTX, parameters are set to score = 50 and wordlength = 3, for example. When using BLAST and Gapped BLAST programs, the default parameters of each program are used.

さらに、本発明のポリヌクレオチドは、(j) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド； (k)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド； (l) 上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド；及び(m)上記（５）に記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチドを含む。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに組込まれ、さらにそのベクターが導入された形質転換細胞において上記(a)〜(i)のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制することができる。したがって、上記ポリヌクレオチド（例えば、DNA）の発現を抑制することが好ましい場合に好適に利用することができる。   Furthermore, the polynucleotide of the present invention is (j) a polynucleotide encoding an RNA having a base sequence complementary to the transcription product of the polynucleotide (DNA) described in (5) above; (k) the above (5) (1) a polynucleotide encoding an RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) according to (1) by an RNAi effect; (l) an activity that specifically cleaves the transcription product of the polynucleotide (DNA) according to (5) above; And (m) a polynucleotide encoding RNA that suppresses the expression of the polynucleotide (DNA) described in (5) above by a co-suppression effect. These polynucleotides are incorporated into a vector, and can further suppress the expression of the polynucleotides (DNA) (a) to (i) above in a transformed cell into which the vector has been introduced. Therefore, it can be suitably used when it is preferable to suppress the expression of the polynucleotide (eg, DNA).

本明細書中、「DNAの転写産物に対して相補的な塩基配列を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、いわゆるアンチセンスDNAのことをいう。アンチセンス技術は、特定の内在性遺伝子の発現を抑制する方法として公知であり、種々の文献に記載されている（例えば、平島および井上: 新生化学実験講座2 核酸IV 遺伝子の複製と発現 （日本生化学会編, 東京化学同人） pp.319-347, 1993などを参照）。アンチセンスDNAの配列は、内在性遺伝子またはその一部と相補的な配列であることが好ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限りにおいて、完全に相補的でなくてもよい。転写されたRNAは、標的遺伝子の転写産物に対して好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上の相補性を有する。アンチセンスDNAの長さは少なくとも15塩基以上であり、好ましくは100塩基以上であり、さらに好ましくは500塩基以上である。   In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having a base sequence complementary to a transcription product of DNA” refers to so-called antisense DNA. Antisense technology is known as a method for suppressing the expression of a specific endogenous gene, and is described in various literatures (for example, Hirashima and Inoue: Shinsei Kagaku Kougaku Kenkyu 2 Nucleic acid IV Gene replication and expression (Japan) Pp.319-347, 1993, etc.). The sequence of the antisense DNA is preferably a sequence complementary to the endogenous gene or a part thereof, but may not be completely complementary as long as the expression of the gene can be effectively suppressed. The transcribed RNA preferably has a complementarity of 90% or more, more preferably 95% or more, with respect to the transcription product of the target gene. The length of the antisense DNA is at least 15 bases or more, preferably 100 bases or more, and more preferably 500 bases or more.

本明細書中、「DNAの発現をRNAi効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、RNA interference（RNAi）によって内在性遺伝子の発現を抑制するためのポリヌクレオチドのことをいう。「RNAi」とは、標的遺伝子配列と同一もしくは類似した配列を有する二重鎖RNAを細胞内に導入すると、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことを指す。ここで用いられるＲＮＡとしては、例えば、21〜25塩基長のRNA干渉を生ずる二重鎖RNA、例えば、dsRNA (double strand RNA)、siRNA(small interfering RNA)又はshRNA(short hairpin RNA)が挙げられる。このようなＲＮＡは、リポソームなどの送達システムにより所望の部位に局所送達させることも可能であり、また上記二重鎖RNAが生成されるようなベクターを用いてこれを局所発現させることができる。このような二重鎖RNA(dsRNA、siRNA又はshRNA)の調製方法、使用方法などは、多くの文献から公知である（特表2002-516062号公報; 米国公開許第2002/086356A号; Nature Genetics, 24(2), 180-183, 2000 Feb.; Genesis, 26(4), 240-244, 2000 April； Nature, 407:6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol.16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99(8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296(5567), 550-553, 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99:9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol.20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20(5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46,2002 May 15等参照）。   In the present specification, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by RNAi effect” refers to a polynucleotide for suppressing the expression of an endogenous gene by RNA interference (RNAi). “RNAi” refers to a phenomenon in which, when a double-stranded RNA having the same or similar sequence as a target gene sequence is introduced into a cell, expression of the introduced foreign gene and target endogenous gene are both suppressed. . Examples of RNA used herein include double-stranded RNA that causes RNA interference of 21 to 25 bases in length, such as dsRNA (double strand RNA), siRNA (small interfering RNA), or shRNA (short hairpin RNA). . Such RNA can be locally delivered to a desired site by a delivery system such as a liposome, and can also be locally expressed using a vector capable of producing the double-stranded RNA. Methods for preparing and using such double-stranded RNA (dsRNA, siRNA or shRNA) are known from many literatures (Japanese Patent Publication No. 2002-516062; US Publication No. 2002 / 086356A; Nature Genetics). , 24 (2), 180-183, 2000 Feb .; Genesis, 26 (4), 240-244, 2000 April; Nature, 407: 6802, 319-20, 2002 Sep. 21; Genes & Dev., Vol. 16, (8), 948-958, 2002 Apr.15; Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 99 (8), 5515-5520, 2002 Apr. 16; Science, 296 (5567), 550-553 , 2002 Apr. 19; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 99: 9, 6047-6052, 2002 Apr. 30; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5), 497-500, 2002 May; Nature Biotechnology, Vol. 20 (5), 500-505, 2002 May; Nucleic Acids Res., 30:10, e46, 2002 May 15 etc.).

本明細書中、「DNAの転写産物を特異的に切断する活性を有するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、一般に、リボザイムのことをいう。リボザイムとは触媒活性を有するRNA分子のことをいい、ターゲットとするDNAの転写産物を切断することにより、その遺伝子の機能を阻害する。リボザイムの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、FEBS Lett. 228: 228, 1988； FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323: 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992など参照）。また、「DNAの発現を共抑制効果により抑制するRNAをコードするポリヌクレオチド」とは、「共抑制」によって、ターゲットとなるDNAの機能を阻害するヌクレオチドをいう。   In the present specification, “polynucleotide encoding RNA having an activity of specifically cleaving a transcript of DNA” generally refers to a ribozyme. A ribozyme is an RNA molecule having catalytic activity, which inhibits the function of the gene by cleaving the target DNA transcript. Various known literatures can also be referred to for ribozyme design (eg, FEBS Lett. 228: 228, 1988; FEBS Lett. 239: 285, 1988; Nucl. Acids. Res. 17: 7059, 1989; Nature 323). : 349, 1986; Nucl. Acids. Res. 19: 6751, 1991; Protein Eng 3: 733, 1990; Nucl. Acids Res. 19: 3875, 1991; Nucl. Acids Res. 19: 5125, 1991; Biochem Biophys Res Commun 186: 1271, 1992 etc.). In addition, “polynucleotide encoding RNA that suppresses DNA expression by co-suppression” refers to a nucleotide that inhibits the function of the target DNA by “co-suppression”.

本明細書中、「共抑制」とは、細胞中に、標的内在性遺伝子と同一もしくは類似した配列を有する遺伝子を形質転換により導入することにより、導入した外来遺伝子および標的内在性遺伝子の発現がいずれも抑制される現象のことをいう。共抑制効果を有するポリヌクレオチドの設計についても種々の公知文献を参照することができる（例えば、Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997、Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996など参照）。   In the present specification, “co-suppression” refers to the expression of a foreign gene and a target endogenous gene introduced by introducing a gene having a sequence identical or similar to the target endogenous gene into a cell by transformation. Both are phenomena that are suppressed. Various known literatures can also be referred to for designing a polynucleotide having a co-suppression effect (for example, Smyth DR: Curr. Biol. 7: R793, 1997, Martienssen R: Curr. Biol. 6: 810, 1996, etc.) reference).

２．本発明のタンパク質
本発明は、上記ポリヌクレオチド(a)〜(i)のいずれかにコードされるタンパク質も提供する。本発明の好ましいタンパク質は、配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、1もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質（光合成抑制因子）である。 2. Protein of the present invention The present invention also provides a protein encoded by any of the polynucleotides (a) to (i). A preferred protein of the present invention comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and has a photosynthetic inhibitory activity. It has a protein (photosynthesis inhibitor).

このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列において、上記したような数のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。また、このようなタンパク質としては、配列番号：２、４、６又は８のアミノ酸配列と上記したような相同性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質が挙げられる。   Such a protein comprises an amino acid sequence in which the number of amino acid residues as described above is deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8. Examples thereof include proteins having photosynthesis inhibitory activity. Examples of such a protein include a protein having an amino acid sequence having homology as described above with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 4, 6 or 8, and having a photosynthetic inhibitory activity.

このようなタンパク質は、「モレキュラークローニング第3版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、"Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)"、"Gene, 34, 315 (1985)"、"Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)"、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)"等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。   Such proteins are described in "Molecular Cloning 3rd Edition", "Current Protocols in Molecular Biology", "Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)", "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) "," Gene, 34, 315 (1985) "," Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985) "," Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 82, 488 (1985) "and the like.

本発明のタンパク質のアミノ酸配列において1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、挿入および／または付加されたとは、同一配列中の任意かつ1もしくは複数のアミノ酸配列中の位置において、1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入及び／又は付加があることを意味し、欠失、置換、挿入及び付加のうち2種以上が同時に生じてもよい。   The deletion, substitution, insertion and / or addition of one or more amino acid residues in the amino acid sequence of the protein of the present invention means that one or more amino acid residues in one and a plurality of amino acid sequences in the same sequence It means that there are amino acid residue deletion, substitution, insertion and / or addition, and two or more of deletion, substitution, insertion and addition may occur simultaneously.

以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の例を示す。同一群に含まれるアミノ酸残基は相互に置換可能である。A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2-アミノブタン酸、メチオニン、o-メチルセリン、t-ブチルグリシン、t-ブチルアラニン、シクロヘキシルアラニン； B群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2-アミノアジピン酸、2-アミノスベリン酸； C群：アスパラギン、グルタミン； D群：リジン、アルギニン、オルニチン、2,4-ジアミノブタン酸、2,3-ジアミノプロピオン酸； E群：プロリン、3-ヒドロキシプロリン、4-ヒドロキシプロリン； F群：セリン、スレオニン、ホモセリン； G群：フェニルアラニン、チロシン。   Examples of amino acid residues that can be substituted with each other are shown below. Amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other. Group A: leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, o-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine, cyclohexylalanine; Group B: aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid , Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid, 2-aminosuberic acid; group C: asparagine, glutamine; group D: lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid, 2,3-diaminopropionic acid; group E : Proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline; Group F: serine, threonine, homoserine; Group G: phenylalanine, tyrosine.

また、本発明のタンパク質は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。   The protein of the present invention can also be produced by chemical synthesis methods such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also.

３．本発明のベクター
次に、本発明は、上記したポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。本発明のベクターは、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（例えば、DNA）又は上記(j)〜（m）のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する。また、本発明のベクターは、通常、(ｘ)酵母細胞内で転写可能なプロモーター；(ｙ)該プロモーターにセンス方向またはアンチセンス方向で結合した、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）；及び(ｚ)RNA分子の転写終結およびポリアデニル化に関し、目的とする細胞などで機能するシグナルを構成要素として含む発現カセットを含むように構成される。
本発明においては、上記本発明のタンパク質を高発現させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を促進するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(a)〜(i)のいずれかに記載のポリヌクレオチド（DNA）の発現を抑制するようにこれらのポリヌクレオチドを該プロモーターに対してアンチセンス方向に導入する。また、上記本発明のタンパク質の発現を抑制させる場合は、上記(j)〜(m)のいずれかに記載のポリヌクレオチドが発現可能なようにベクターに導入することもできる。 3. Vectors of the present invention Next, the present invention provides a vector comprising the polynucleotide described above. The vector of the present invention contains the polynucleotide described in any one of (a) to (i) (for example, DNA) or the polynucleotide described in any one of (j) to (m) above. In addition, the vector of the present invention usually contains (x) a promoter that can be transcribed in yeast cells; (y) any one of the above (a) to (i) bound to the promoter in a sense direction or an antisense direction. The polynucleotide (DNA) as described; and (z) an transcription cassette and polyadenylation of an RNA molecule are configured to include an expression cassette containing as a component a signal that functions in a target cell or the like.
In the present invention, when the protein of the present invention is highly expressed, these promoters are used to promote the expression of the polynucleotide (DNA) described in any of (a) to (i) above. In the sense direction. In addition, when the expression of the protein of the present invention is to be suppressed, these polynucleotides are against the promoter so as to suppress the expression of the polynucleotide (DNA) according to any one of (a) to (i) above. And introduce it in the antisense direction. Moreover, when suppressing the expression of the protein of the present invention, it can be introduced into a vector so that the polynucleotide described in any of (j) to (m) above can be expressed.

本発明の組換えベクターは、本発明の上記ＤＮＡを適当なベクターに挿入することによって作成することができる。ベクターとしては、pBluescript系のベクター、pBI系のベクター、pUC系のベクターなどが使用できる。 pBluescript系のベクター、pBI系のベクターなどのバイナリーベクターは、アグロバクテリウムを介して植物に目的のＤＮＡを導入できるという点で好ましい。pBluescript系のベクターとしては、例えば、pBluescript SK(+)、pBluescript SK(-)、pBluescript II KS(+)、pBluescript II KS(-)、pBluescript II SK(+)、pBluescript II SK(-)などがあげられる。pBI系のベクターとしては、例えば、pBI121、pBI101、pBI101.2、pBI101.3、pBI221などがあげられる。 pUC系のベクターは、植物にＤＮＡを直接導入することができるという点で好ましい。
ベクターは、植物細胞内での恒常的な遺伝子発現を行うためのプロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（CaMV）の35Sプロモーター）を有するベクターや、外的な刺激（例えば、乾燥、紫外線の照射、塩ストレス）により誘導的に活性化されるプロモーターを有していてもよい。このようなプロモーターとしては、例えば、乾燥によって誘導されるシロイヌナズナのrab16遺伝子のプロモーター（Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1406 (1990)）、紫外線の照射によって誘導されるパセリのカルコン合成酵素遺伝子のプロモーター（Schulze-Lefert et al., EMBO J. 8, 651 (1989)）、塩ストレスによって誘導されるプロモーター（Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin. Plant Biol. 3, 217-223 (2000)）などがあげられる。 The recombinant vector of the present invention can be prepared by inserting the above DNA of the present invention into a suitable vector. As the vector, a pBluescript vector, a pBI vector, a pUC vector, and the like can be used. Binary vectors such as pBluescript vectors and pBI vectors are preferred in that the target DNA can be introduced into plants via Agrobacterium. Examples of pBluescript vectors include pBluescript SK (+), pBluescript SK (-), pBluescript II KS (+), pBluescript II KS (-), pBluescript II SK (+), and pBluescript II SK (-). can give. Examples of pBI vectors include pBI121, pBI101, pBI101.2, pBI101.3, pBI221, and the like. A pUC vector is preferable in that DNA can be directly introduced into a plant.
The vector may be a vector having a promoter (eg, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter) for constitutive gene expression in plant cells, or an external stimulus (eg, drying, UV irradiation, salt) It may have a promoter that is inducibly activated by stress). As such a promoter, for example, the Arabidopsis rab16 gene promoter induced by drying (Nundy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1406 (1990)), induced by ultraviolet irradiation. Parsley chalcone synthase gene promoter (Schulze-Lefert et al., EMBO J. 8, 651 (1989)), salt stress-induced promoter (Shinozaki, K. and Yamaguchi-Shinozaki, K., Curr. Opin) Plant Biol. 3, 217-223 (2000)).

さらに、本発明のベクターには、必要に応じて、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、ポリＡ付加シグナルなどを連結してもよい。
プロモーターとしては、植物細胞において機能することができれば植物由来のものでなくてもよい。具体的には、CaMV35Sプロモーター、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター（Pnos）、トウモロコシ由来のユビキチンプロモーター、イネ由来のアクチンプロモーター、タバコ由来のPRタンパク質プロモーターなどがあげられる。さらに、前述の外的な刺激により誘導的に活性化されるプロモーターもあげられる。
エンハンサーとしては、CaMV35Sプロモーター内の上流側の配列を含むエンハンサー領域があげられる。
ターミネーターとしては、前述のプロモーターにより転写された遺伝子の転写を終結できる配列であればよく、具体的には、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Tnos）、CaMVポリＡターミネーターなどがあげられる。 Furthermore, a promoter, an enhancer, a terminator, a poly A addition signal, and the like may be linked to the vector of the present invention as necessary.
The promoter may not be derived from a plant as long as it can function in plant cells. Specific examples include CaMV35S promoter, promoter of nopaline synthase gene (Pnos), ubiquitin promoter derived from corn, actin promoter derived from rice, and PR protein promoter derived from tobacco. Furthermore, the promoter activated inductively by the above-mentioned external stimulus is also mentioned.
The enhancer includes an enhancer region containing an upstream sequence in the CaMV35S promoter.
The terminator may be any sequence that can terminate the transcription of the gene transcribed by the above-mentioned promoter, and specific examples thereof include nopaline synthase gene terminator (Tnos), CaMV poly A terminator and the like.

本発明のＤＮＡをベクターに挿入するには、まず、精製されたＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、適当なベクターＤＮＡの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入する方法などが用いられる。   In order to insert the DNA of the present invention into a vector, first, a method in which the purified DNA is cleaved with a suitable restriction enzyme and inserted into a restriction enzyme site or a multicloning site of a suitable vector DNA is used.

４．本発明の形質転換体（形質転換植物細胞、形質転換植物体など）
本発明の形質転換植物細胞は、本発明の組換えベクターを植物細胞に導入することによって得ることができる。組換えベクターの植物細胞への導入は、従来公知の方法、例えば、植物に感染するウイルスや細菌を介して導入する方法（I. Potrylkus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)）、外来ＤＮＡを直接導入する方法などがあげられる。具体的には、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法などを用いることができる。これらの方法は、例えば、形質転換する宿主植物の種類などに応じて適宜決定できる。
植物に感染するウイルスとしては、カリフラワーモザイクウイルス、ジェミニウイルス、タバコモザイクウイルス、プロムモザイクウイルスなどが使用できる。細菌としては、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、アグロバクテリウム・リゾジェネスなどが使用できる。
アグロバクテリウムへのベクターの移行は、エレクトロポレーション法によって行うことができる。 4). Transformant of the present invention (transformed plant cell, transformed plant etc.)
The transformed plant cell of the present invention can be obtained by introducing the recombinant vector of the present invention into a plant cell. Introduction of a recombinant vector into a plant cell is carried out by a conventionally known method, for example, a method of introducing a virus or bacteria that infects a plant (I. Potrylkus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)), and a method for directly introducing foreign DNA. Specifically, an Agrobacterium method, a particle gun method, a PEG method, an electroporation method, or the like can be used. These methods can be appropriately determined depending on, for example, the type of host plant to be transformed.
As viruses that infect plants, cauliflower mosaic virus, gemini virus, tobacco mosaic virus, prom mosaic virus and the like can be used. As bacteria, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes, etc. can be used.
Transfer of the vector to Agrobacterium can be performed by electroporation.

植物細胞に外来ＤＮＡを直接導入する方法としては、例えば、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、ポリエチレングリコール法、融合法、高速バリスティックペネトレーション法等の従来公知の方法があげられる（I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)参照）。エレクトロポレーション法は、例えば、プロトプラストの培養が安定かつ容易であり、再生が容易な植物細胞に適用することが好ましい。また、パーティクルガン法は、宿主の限定を受けないため、例えば、アグロバクテリウムに感染し難い植物細胞や、プロトプラストの調製が困難な植物細胞に適用することが好ましい。なお、このようにエレクトロポレーション法を行う場合、前記組換えベクターを構成するベクターとしては、例えば、pUC18、pUC19、pBR322、pBR325、pBluescript 等が好ましい。単子葉植物の多くやアグロバクテリウムの感染しにくい双子葉植物に対しては、ＤＮＡ導入法として汎用されているアグロバクテリウムを用いた間接導入法が使用できないため、これらの直接導入法が有効である。   Examples of methods for directly introducing foreign DNA into plant cells include conventionally known methods such as a microinjection method, an electroporation method, a particle gun method, a polyethylene glycol method, a fusion method, and a high-speed ballistic penetration method ( I. Potrykus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42, 205 (1991)). The electroporation method is preferably applied, for example, to plant cells in which protoplast culture is stable and easy and regeneration is easy. In addition, since the particle gun method is not limited to the host, it is preferably applied to, for example, plant cells that are difficult to infect Agrobacterium or plant cells that are difficult to prepare protoplasts. In addition, when performing electroporation in this way, as a vector which comprises the said recombinant vector, pUC18, pUC19, pBR322, pBR325, pBluescript etc. are preferable, for example. For many monocotyledonous plants and dicotyledonous plants that are difficult to infect with Agrobacterium, the indirect introduction method using Agrobacterium, which is widely used as a DNA introduction method, cannot be used. It is.

次に、本発明のベククーを導入したアグロバクテリウム等から植物へＴ−ＤＮＡを導入して、植物の形質転換を行う。例えば、上述のようにしてベクターを導入したアグロバクテリウム株を植物細胞のカルスまたは組織片と数分間程度共存させた後、2N6−ASまたはN6COなどの培地中で、25〜28℃で3日間程度共存培養する。ここで共存培養する植物としては、共存培養の難易度に差があるものの種子植物が用いられる。特に、これまで形質転換の困難であった単子葉作物、すなわち、イネ、コムギ、オオムギ、トウモロコシ、シバなど、さらに樹木（ポプラやユーカリなど）なども対象となり得る。   Next, T-DNA is introduced into the plant from Agrobacterium or the like into which the vector of the present invention has been introduced, and the plant is transformed. For example, the Agrobacterium strain introduced with the vector as described above coexisted with the callus or tissue piece of plant cells for several minutes, and then in a medium such as 2N6-AS or N6CO for 3 days at 25-28 ° C. Incubate to the same extent. Here, as a plant to be co-cultured, a seed plant having a difference in difficulty of co-culture is used. In particular, monocotyledonous crops that have been difficult to transform so far, such as rice, wheat, barley, corn, and buckwheat, and trees (such as poplar and eucalyptus) can also be targeted.

上記のアグロバクテリウムとの共存培養の後、カルスまたは組織片は、適当な抗生物質を含む培地で選択培養を行う。例えば、ベクターに選択マーカーとしてハイグロマイシン耐性遺伝子を導入した場合には、ハイグロマイシン（10〜100μg/mL）とアグロバクテリウム除去のためのセフォタキシム（25μg/mL）またはカルベニシリン（500μg/mL）とを含む2N6−CHまたはN6Se培地を用いて、1〜3週間選択培養を行うことにより、形質転換したカルス体を選択的に得ることができる。選択的に得たカルス体を、N6S3−CH、MSreなどの適当な再分化培地を用いて再分化を誘導し、再分化個体を得る。以上のようにして、本発明のベクターを用いてＤＮＡ断片を植物に導入し形質転換することができる。   After co-culturing with the above-mentioned Agrobacterium, the callus or tissue piece is selectively cultured in a medium containing an appropriate antibiotic. For example, when a hygromycin resistance gene is introduced as a selection marker into a vector, hygromycin (10-100 μg / mL) and cefotaxime (25 μg / mL) or carbenicillin (500 μg / mL) for removing Agrobacterium are added. By performing selective culture for 1 to 3 weeks using the 2N6-CH or N6Se medium containing, transformed callus bodies can be selectively obtained. The callus body obtained selectively is induced to redifferentiate using an appropriate redifferentiation medium such as N6S3-CH or MSre to obtain redifferentiated individuals. As described above, a DNA fragment can be introduced into a plant and transformed using the vector of the present invention.

組換え個体の選抜は、マーカー遺伝子で抗生物質耐性遺伝子（例えば、ハイグロマイシン遺伝子）の発現を調べることによって行うことができる。また、得られた形質転換植物細胞および形質転換植物体の染色体ＤＮＡをそれぞれ調製し、例えば、目的ＤＮＡ配列に特異的なプライマーやプローブを用いたＰＣＲやサザンブロッティング法等により、前記目的ＤＮＡの発現が確認されれば、所望の形質転換植物細胞および形質転換植物体が得られたこととなる。   Selection of a recombinant individual can be performed by examining the expression of an antibiotic resistance gene (for example, a hygromycin gene) using a marker gene. Further, chromosomal DNAs of the obtained transformed plant cells and transformed plant bodies are prepared, respectively. For example, expression of the target DNA by PCR or Southern blotting using a primer or probe specific to the target DNA sequence. If confirmed, the desired transformed plant cell and transformed plant body were obtained.

なお、本発明においては、ターゲットとする上記遺伝子（DNA）を破壊することによって、上記ポリヌクレオチド（例えば、DNA）の発現または上記タンパク質の発現を抑制することができる。遺伝子の破壊は、ターゲットとする遺伝子における遺伝子産物の発現に関与する領域、例えば、コード領域やプロモーター領域の内部へ単一あるいは複数の塩基を付加あるいは欠失させたり、これらの領域全体を欠失させることにより行うことができる。このような遺伝子破壊の手法は、公知の文献を参照することができる（例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951(1979) 、Methods in Enzymology, 101, 202(1983)、特開平6-253826号公報など参照）。   In the present invention, the expression of the polynucleotide (eg, DNA) or the expression of the protein can be suppressed by destroying the target gene (DNA). Gene disruption involves adding or deleting single or multiple bases within a region involved in the expression of a gene product in a target gene, such as the coding region or promoter region, or deleting these entire regions. Can be performed. Such gene disruption methods can be referred to known literature (for example, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 4951 (1979), Methods in Enzymology, 101, 202 (1983), (See Kaihei 6-35826).

形質転換植物体が得られれば、その植物体から有性生殖または無性生殖により子孫を得ることができ、公知の方法によりクローンを得ることもできる。また、その植物体、その子孫もしくはクローンから、さらに子孫もしくはクローンを得ることもできる。   If a transformed plant body is obtained, offspring can be obtained from the plant body by sexual reproduction or asexual reproduction, and a clone can also be obtained by a known method. In addition, further progeny or clones can be obtained from the plant body, its progeny or clone.

本発明のベクターまたはポリヌクレオチドが導入されることで形質転換される植物としては、特に制限はなく、下等植物から高等植物まで全て含む。本発明で形質転換される植物としては、例えば、種子植物、シダ植物、コケ植物、地衣植物、多細胞の植物、作物植物、蔬菜植物、花卉植物、木本植物、観賞用植物、樹木植物（例えば、針葉樹、落葉樹など）などを挙げることができる。本発明の形質転換された植物は、単子葉または双子葉植物であってよい。農作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ライムギ、ダイズ、(インゲン)マメ、エンドウ、チコリー、トマト、ミカン、イチゴ、ワタ、タバコ、コーヒーノキ、チャ、ナタネ、ジャガイモ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、ゴムノキ、カンショ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロッコリー、カブ、ダイコン、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニンニク、ペッパー、セルリー、カボチャ、ペポカボチャ、アサ、ズッキーニ、リンゴ、ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、サクランボ、モモ、ネクタリン、アンズ、ブドウ、ラズベリー、ブラックベリー、パイナップル、アボガド、パパイヤ、マンゴー、バナナ、ソルガム、クローバー、ニンジン、アルファルファ、ナス、キュウリ、アラビドプシスなどが挙げられる。観賞用植物としては、例えば、キク、カーネーション、バラ、キンギョソウ、ラン、トルコギキョウ、フリージア、グラジオラス、カスミソウ、カランコエ、ユリ、ペラルゴニウム、ゼラニウム、シクラメン、カトレア、ペチュニア、トレニア、チューリップ、ガーベラ、アヤメ、ヤシ、スゲなどが挙げられる。樹木植物としては、例えば、例えば、マツ、トウヒ、モミ、ツガ、イチイ、イチョウが挙げられる。コケ植物としては、例えば、ヒメツリガネゴケが挙げられる。   The plant transformed by introducing the vector or polynucleotide of the present invention is not particularly limited, and includes all plants from lower plants to higher plants. Examples of the plant transformed by the present invention include seed plants, fern plants, moss plants, lichen plants, multicellular plants, crop plants, sugar beet plants, flower plants, woody plants, ornamental plants, tree plants ( For example, conifers, deciduous trees, etc.) can be mentioned. The transformed plants of the present invention may be monocotyledonous or dicotyledonous plants. Examples of crops include rice, corn, wheat, barley, rye, soybean, (green beans), peas, chicory, tomatoes, mandarin oranges, strawberries, cotton, tobacco, coffee, tea, rapeseed, potatoes, sugar beet, sugar cane, sunflower , Rubber tree, sweet potato, lettuce, cabbage, cauliflower, broccoli, turnip, radish, spinach, asparagus, onion, garlic, pepper, celery, pumpkin, peppo pumpkin, asa, zucchini, apple, pear, quince, melon, plum, cherry, Peach, nectarine, apricot, grape, raspberry, blackberry, pineapple, avocado, papaya, mango, banana, sorghum, clover, carrot, alfalfa, eggplant, cucumber, arabidopsis, etc. And the like. Examples of ornamental plants include chrysanthemum, carnation, rose, snapdragon, orchid, eustoma, freesia, gladiolus, gypsophila, kalanchoe, lily, pelargonium, geranium, cyclamen, cattleya, petunia, torenia, tulip, gerbera, iris, palm, Examples include sedges. Examples of tree plants include pine, spruce, fir, tsuga, yew, and ginkgo. An example of the moss plant is Physcomitrella patens.

なお、本発明において、詳細な実験操作は、特に述べる場合を除き、モレキュラー・クローニング第３版、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法などの公知の方法により、または市販のキットの取扱い説明書に記載の方法により行うことができる。   In the present invention, unless otherwise specified, detailed experimental procedures are described in Molecular Cloning 3rd Edition, Ausbel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley and Sons (1987-1997). ), Glover DM and Hames BD, DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), etc. It can be performed by the method described in the instruction manual.

以下、実施例によって本発明の詳細を述べるが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。   EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates the detail of this invention, this invention is not limited to a following example.

（実験の概要）
本実験ではまず、光合成を行うようになった緑化カルスを誘導するための培地の条件検討を行った。次に、アクティベーションタギングによって緑化誘導されなくなったカルス、つまり緑化に関与する遺伝子の発現を負に制御する遺伝子が活性化した変異体の選抜を行った。その結果、T-DNAの導入によりスルホニルウレア耐性となり、さらに緑化条件（GCIMプレート上）にもかかわらず緑化しない形質転換カルスを目視で選抜した。そして、選抜した形質転換カルスをスルホニルウレア（Dr.Ehrenstorfer）(最終濃度100 ng/ml)、バンコマイシン（メルク・ホエイ）（最終濃度100 μg/ml）、クラフォラン（最終濃度100 μg/ml）の薬剤を含むGCIM選抜プレートで培養し、盛んに増殖を繰り返すものを候補カルスとした（図1）。 (Summary of experiment)
In this experiment, first, the conditions of the medium for inducing the greening callus that started photosynthesis were examined. Next, a callus that was no longer induced by activation tagging, that is, a mutant in which a gene that negatively controls the expression of a gene involved in greening was activated was selected. As a result, transformed calli that became sulfonylurea resistant by introduction of T-DNA and did not green despite the greening conditions (on the GCIM plate) were visually selected. Then, the selected transformed calli were added with sulfonylurea (Dr. Ehrenstorfer) (final concentration 100 ng / ml), vancomycin (Merck whey) (final concentration 100 μg / ml), and kuraforan (final concentration 100 μg / ml). A candidate callus was cultured on the GCIM selection plate containing the cells and repeatedly proliferated (Fig. 1).

また、アクティベーションタギング法によって得られた候補カルスは、エンハンサーを含むT-DNAがランダムに導入され、T-DNA上のエンハンサーの近傍遺伝子を活性化することによって緑化しないカルスが得られたと考えられる。そこで、候補カルスのT-DNAの導入場所、原因遺伝子の特定を行った。
本発明者らは、種々の探索を行った結果、4種類の新規な光合成抑制遺伝子（SUG101［配列番号：１］，SUG102［配列番号：３］，SUG103［配列番号：５］，SUG104［配列番号：７］）を同定することに成功した。 In addition, the candidate callus obtained by the activation tagging method was considered to be a callus that did not turn green when T-DNA containing an enhancer was randomly introduced and a gene near the enhancer on the T-DNA was activated. . Therefore, the place of introduction of T-DNA and the causative gene of candidate callus were identified.
As a result of various searches, the present inventors have found that four kinds of novel photosynthetic suppression genes (SUG101 [SEQ ID NO: 1], SUG102 [SEQ ID NO: 3], SUG103 [SEQ ID NO: 5], and SUG104 [sequence] Number: 7]) was successfully identified.

（材料および方法）
１：生育条件
人工気象機 (Biotron NC220, Nksystem) を用い，22℃，湿度40-60％，照度3,000〜5,000 luxの連続白色光条件下で，３週間生育させた (Materials and methods)
1: Growing condition Using an artificial weather machine (Biotron NC220, Nksystem), it was grown for 3 weeks under continuous white light conditions of 22 ° C, humidity 40-60%, and illuminance 3,000-5,000 lux.

培地
(1)MS培地 1 L
ムラシゲ スクーグ培地用混合塩類（SIGMA）4.6 g、スクロース（Wako）20 g、1,000×ビタミンストック（チアミン塩酸塩300 mg、ニコチン酸500 mg、ピリドキシン酸500 mgをDDWに加え100 mlにした）1 mlに、DDWを加えメスアップし、2N KOHでpHを5.8に調製後、ゲランガム(Wako)4 gを加え、121℃、20分でオートクレーブ後シャーレに分注した。 Culture medium
(1) MS medium 1 L
Murashige Skog medium mixed salt (SIGMA) 4.6 g, sucrose (Wako) 20 g, 1,000 x vitamin stock (thiamine hydrochloride 300 mg, nicotinic acid 500 mg, pyridoxine acid 500 mg added to DDW to make 100 ml) 1 ml DDW was added to make up the volume, and after adjusting the pH to 5.8 with 2N KOH, 4 g of gellan gum (Wako) was added, and the mixture was autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes and dispensed into a petri dish.

(2)CIM (カルス誘導培地) 1 L
MS培地の組成に、2.4-D*1（最終濃度500 ng/ml）カイネチン*2（最終濃度50 ng/ml）を加え、ゲランガムを3 g加え、121℃、20分でオートクレーブ後シャーレに分注した。
*1 保存溶液(10 mg/ml)は、2.4-D（Wako）0.2 gをDMSO 20 mlに溶かして調整した。
*2 保存溶液(1 mg/ml)は、カイネチン（Wako）0.02 gをDMSO 20 mlに溶かして調整した。 (2) CIM (callus induction medium) 1 L
Add 2.4-D * 1 (final concentration: 500 ng / ml) kinetin * 2 (final concentration: 50 ng / ml) to the composition of the MS medium, add 3 g of gellan gum, autoclave at 121 ° C for 20 minutes, and dispense into a petri dish. Noted.
* 1 The stock solution (10 mg / ml) was prepared by dissolving 0.2 g of 2.4-D (Wako) in 20 ml of DMSO.
* 2 The stock solution (1 mg / ml) was prepared by dissolving 0.02 g of kinetin (Wako) in 20 ml of DMSO.

(3)GCIM (緑化カルス誘導培地) 1 L
MS培地の組成に、2,4-D(最終濃度50 ng/ml)、カイネチン(最終濃度4 μg/ml)を加え、ゲランガムを4 g加え、121℃、20分でオートクレーブ後シャーレに分注した。 (3) GCIM (greening callus induction medium) 1 L
Add 2,4-D (final concentration 50 ng / ml) and kinetin (final concentration 4 μg / ml) to the composition of the MS medium, add 4 g of gellan gum, and dispense into a petri dish after autoclaving at 121 ° C for 20 minutes. did.

(4)SIM (カルス誘導培地) 1 L
MS培地の組成に、IAA（最終濃度150 ng/ml）カイネチン（最終濃度5 μg/ml）、ゲランガム3 gを加え、121℃、20分でオートクレーブした。その後50℃に冷やし、60℃、30分間のインキュベート済のココナッツミルク(SIGMA)を20 ml加え、シャーレに分注した。保存溶液(1 mg/ml)は、3-インドール酢酸(IAA)(Wako)10 mgを少量の1N NaOHで溶かした後、10 mlの脱イオン水に溶かして調製した。 (4) SIM (callus induction medium) 1 L
IAA (final concentration 150 ng / ml) kinetin (final concentration 5 μg / ml) and 3 g of gellan gum were added to the composition of the MS medium, and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was cooled to 50 ° C., 20 ml of coconut milk (SIGMA) that had been incubated at 60 ° C. for 30 minutes was added and dispensed into a petri dish. A stock solution (1 mg / ml) was prepared by dissolving 10 mg of 3-indoleacetic acid (IAA) (Wako) with a small amount of 1N NaOH and then dissolving in 10 ml of deionized water.

(5)RIM (カルス誘導培地) 1 L
MS培地の組成に、IAA（最終濃度500 ng/ml）、ゲランガム3 gを加え、121℃、20分でオートクレーブ後シャーレに分注した。 (5) RIM (callus induction medium) 1 L
To the composition of the MS medium, IAA (final concentration 500 ng / ml) and 3 g of gellan gum were added and dispensed into a petri dish after autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes.

２：植物ホルモン濃度による緑化カルスの作製
シロイヌナズナ野生系統Colの根をMS固形培地で1週間生育し、MS液体培地でさらに2週間振とう培養した。この培養したColの根を、植物ホルモン2,4-D（オーキシン）の濃度50、100、500 (ng/ml)の3点各々についてカイネチン（サイトカイニン）の濃度500、2000、4000、6000 (ng/ml)の4点、計12種類のプレート（A〜L）と、対照として2,4-Dの濃度500 ng/ml、カイネチンの濃度50 ng/mlのプレートMとに移植し、5週間培養した。 2: Production of green callus by plant hormone concentration Roots of wild Arabidopsis thaliana line Col were grown for 1 week in MS solid medium and further cultured with shaking in MS liquid medium for 2 weeks. The cultivated Col roots were cultivated at concentrations of kinetin (cytokinin) of 500, 2000, 4000, and 6000 (ng) at three concentrations of plant hormones 2,4-D (auxin) of 50, 100, and 500 (ng / ml). / ml), 12 types of plates (A to L) in total, and as a control, plate M with 2,4-D concentration of 500 ng / ml and kinetin concentration of 50 ng / ml, for 5 weeks Cultured.

３：シロイヌナズナ野生系統への形質転換
バイナリーベクターを導入したアグロバクテリウム (GV3101) を、スペクチノマイシン100 μg/mL、ゲンタマイシン25 μg/mL、リファンピシン50 μg/mL を含むLB 液体培地1.5 mLに植菌し、28℃ 約170 rpmで、約22時間培養を行った。遠心して集菌した菌を、infiltration medium約80 mLに懸濁させた。 3: Agrobacterium (GV3101) into which a binary vector for transformation into Arabidopsis thaliana was introduced was planted in 1.5 mL of LB liquid medium containing 100 μg / mL spectinomycin, 25 μg / mL gentamicin, and 50 μg / mL rifampicin. The cells were cultured at 28 ° C. and about 170 rpm for about 22 hours. Bacteria collected by centrifugation were suspended in about 80 mL of infiltration medium.

MS培地にて約2週間育成させたシロイヌナズナ野生系統Colをロックウールに移し、さらに約2週間育成させ、開花直前の蕾が出てきた頃の株を用いた。その株を直接上記の懸濁液に浸して3分置いて感染させ、形質転換を行った。

infiltration medium
Murashige Skoog 培地用混合塩類
1000×vitamin stock 2 mL
sucrose 100 g
1 mg/mL benzylamino purine 20 μL
silicon L-774.3 g 400 mL
（超純水で全量2 L。） The Arabidopsis wild line Col grown for about 2 weeks in MS medium was transferred to rock wool, further grown for about 2 weeks, and the strain at the time when the buds just before flowering appeared was used. The strain was directly immersed in the above suspension for 3 minutes to infect and transformed.

infiltration medium
Murashige Skoog Mixed salt for medium
1000 × vitamin stock 2 mL
sucrose 100 g
1 mg / mL benzylamino purine 20 μL
silicon L-774.3 g 400 mL
(Total 2 L with ultrapure water.)

４：TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)によるT-DNA導入部位の確認
TAIL-PCRは、既知の配列に特異的プライマーと非特異的（任意）プライマーを組み合わせて使用することによって、既知配列(T-DNA)に隣接する未知DNA配列を特異的に増幅する方法である。 4: Confirmation of T-DNA introduction site by TAIL-PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR)
TAIL-PCR is a method that specifically amplifies an unknown DNA sequence adjacent to a known sequence (T-DNA) by using a specific primer and a non-specific (arbitrary) primer in combination with the known sequence. .

(1)Clean PCRによるDNA抽出
4つの候補カルス(約5 mm弱)を1.5 mlチューブに入れ、DNA抽出液200 μlを加えてすり潰して撹拌した後、100%エタノール400 μlを加えて撹拌し、15,000 rpm、4℃、10分間遠心した。上清を取り除き、ペレットにTE buffer 200 μlを加えて再び遠心し、上澄液をDNA溶液とした。 (1) DNA extraction by Clean PCR
Place 4 candidate calli (approximately 5 mm or less) in a 1.5 ml tube, add 200 μl of DNA extract, crush and stir, add 400 μl of 100% ethanol, stir, 15,000 rpm, 4 ° C, 10 min Centrifuged. The supernatant was removed, 200 μl of TE buffer was added to the pellet and centrifuged again, and the supernatant was used as a DNA solution.

DNA抽出液
200 mM Tris-HCl (pH 7.5)
250 mM NaCl
25 mM EDTA
0.5% SDS

TE buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA DNA extract
200 mM Tris-HCl (pH 7.5)
250 mM NaCl
25 mM EDTA
0.5% SDS

TE buffer
10 mM Tris-HCl (pH 8.0)
1 mM EDTA

(2)TAIL-PCR
DNA溶液を用いて、T-DNA上のライトボーダー側に特異的なプライマーRB1、RB2、RB3（それぞれ配列番号：９、１０、１１）、レフトボーダー側に特異的なプライマーLB1、LB2、LB3（それぞれ配列番号：１２、１３、１４）、非特異的なランダムプライマー12種類（配列番号１５〜２６）を用いTAIL-PCR用プログラムにてPCRを行った。プライマーの名称、配列および配列番号は、下記表１に示す。 (2) TAIL-PCR
Using DNA solution, specific primers RB1, RB2, and RB3 (SEQ ID NOs: 9, 10, and 11 respectively) on the right border side on T-DNA, and primers LB1, LB2, and LB3 (specifically on the left border side) PCR was performed with the program for TAIL-PCR using SEQ ID NO: 12, 13, 14) and 12 kinds of non-specific random primers (SEQ ID NOs: 15 to 26), respectively. The name, sequence and sequence number of the primer are shown in Table 1 below.

５：TAIL-PCRによって増幅されたDNAのシークエンス
TAIL-PCRによって増幅されたDNAのシークエンスを行なった。増幅されたDNAを鋳型にしてBig Dye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)のプレミックス、RB3およびLB3プライマーを用いて、シークエンス用標準PCRプログラムにてPCR反応を行なった。反応液を真空乾燥させ、残渣をTemplate Suppression Reagent (Applied Biosystems)に溶解させ、ABI PRISM（登録商標） 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いてシークエンスを行った。 5: Sequence of DNA amplified by TAIL-PCR
The DNA amplified by TAIL-PCR was sequenced. Using the amplified DNA as a template, PCR reaction was performed with a standard PCR program for sequencing using premixes of Big Dye (registered trademark) Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems), RB3 and LB3 primers. The reaction solution was vacuum-dried, the residue was dissolved in Template Suppression Reagent (Applied Biosystems), and sequenced using ABI PRISM (registered trademark) 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

６：マイクロアレイによるT-DNA近傍遺伝子の発現量の確認
(1)RNA抽出
QIAGEN RNeasy（登録商標） Plant Mini Kit(50)を用いた。2-1-6のカルス、2-1-6の緑化カルスと4つの候補カルスをそれぞれ200 mg用意した。これらのサンプルを、液体窒素で凍らせ、すり潰した後、450 μlのBuffer RLT（RLT 1 mlに対してメルカプトエタノール10 μl）を加えた。それをカラムに入れ、12,000 rpm、2分間遠心分離した。沈殿を吸わないように上清のみ1.5 mlチューブに入れた。その上清の半量の100％エタノールを加えピペッティングし、カラムに入れ、10,000 rpm、15秒間遠心分離した。下の液は捨て、700 μlのRW1を加え、10,000 rpm、15秒間遠心分離し、新しいコレクションチューブに変えた。500 μlのBuffer RPEを加え、10,000 rpm、15秒間遠心分離した。この操作を3回繰り返した。そして、新しいコレクションチューブに変え、乾燥させるためふたを開けたまま、10,000 rpm、1分間遠心分離した。30 μlのRNase-free waterを加え、1分間放置した後、10,000 rpm、1分間遠心分離した。 6: Confirmation of T-DNA expression level by microarray
(1) RNA extraction
QIAGEN RNeasy (registered trademark) Plant Mini Kit (50) was used. 200 mg each of 2-1-6 callus, 2-1-6 green callus and 4 candidate callus were prepared. These samples were frozen in liquid nitrogen and ground, and then 450 μl of Buffer RLT (10 μl of mercaptoethanol for 1 ml of RLT) was added. It was placed in a column and centrifuged at 12,000 rpm for 2 minutes. Only the supernatant was put in a 1.5 ml tube so as not to suck the precipitate. Half of the supernatant 100% ethanol was added and pipetted, placed in a column, and centrifuged at 10,000 rpm for 15 seconds. The lower solution was discarded, 700 μl of RW1 was added, centrifuged at 10,000 rpm for 15 seconds, and changed to a new collection tube. 500 μl Buffer RPE was added and centrifuged at 10,000 rpm for 15 seconds. This operation was repeated three times. Then, it was changed to a new collection tube and centrifuged at 10,000 rpm for 1 minute with the lid open for drying. 30 μl of RNase-free water was added and left for 1 minute, followed by centrifugation at 10,000 rpm for 1 minute.

(2)マイクロアレイ
回収したRNAを用いて、AFFYMETRIX社製のマイクロアレイArabidopsis Genome ATH1 Arrayで解析を行った。 (2) Microarray Using the recovered RNA, analysis was performed with the microarray Arabidopsis Genome ATH1 Array manufactured by AFFYMETRIX.

７：リアルタイムRT-PCRによるT-DNA近傍遺伝子の発現量の確認
(1)RNA抽出
RNA抽出後、DNase処理を行った。反応液は、RNA溶液を10 μl等量、10×DNase Buffer 10 μl、DNase 3 μlおよびRNase free waterにて総量100 μlとし、これを37℃、30分間反応させた。100 μlのクロロホルムを加え5分間ボルテックスし、室温で15,000 rpm、10分間遠心し、上層を回収した。回収した上層に1/10倍量の3 M酢酸ナトリウム、2.5倍量の100％エタノールを加え、1分間ボルテックスし、-80℃で1時間放置した。その後、4℃、15,000 rpm、10分間遠心し上清を除いた。70％エタノールを加え、4℃、15,000 rpm、10分間遠心し上清を除いた。得られたペレットを風乾させ、10 μlの蒸留水(DW)に溶かした。 7: Confirmation of T-DNA expression level by real-time RT-PCR
(1) RNA extraction
After RNA extraction, DNase treatment was performed. The reaction solution was 10 μl equal volume of RNA solution, 10 × DNase Buffer 10 μl, DNase 3 μl and RNase free water to make a total volume of 100 μl, and this was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. 100 μl of chloroform was added, vortexed for 5 minutes, and centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes at room temperature to recover the upper layer. To the collected upper layer, 1/10 volume of 3 M sodium acetate and 2.5 volumes of 100% ethanol were added, vortexed for 1 minute, and left at -80 ° C. for 1 hour. Thereafter, the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 10 minutes at 4 ° C. 70% ethanol was added, and the supernatant was removed by centrifugation at 4 ° C, 15,000 rpm for 10 minutes. The obtained pellet was air-dried and dissolved in 10 μl of distilled water (DW).

(2)cDNA合成
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR(AMV) (Roche)を用いた。DNase処理をおこなったRNA溶液1 μl当量、Anchored oligo(dt)18 Primer 1 μlおよび水で総量13 μlとし、65℃、10分間インキュベートした。これに、Transcriptor RT Reaction Buffer 4 μl、Protector RNase Inhibitor 0.5 μl、Deoxynucleotide Mix 2 μl、Transcriptor Reverse Transcriptase 0.5 μlを加え、55℃、30分間インキュベートした。さらに、酵素を失活させるために、85℃、5分間インキュベートした。 (2) cDNA synthesis
Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit for RT-PCR (AMV) (Roche) was used. The RNA solution was treated with DNase (1 μl equivalent), Anchored oligo (dt) 18 Primer (1 μl) and water to make a total volume of 13 μl, and incubated at 65 ° C. for 10 minutes. To this, 4 μl of Transcriptor RT Reaction Buffer, 0.5 μl of Protector RNase Inhibitor, 2 μl of Deoxynucleotide Mix and 0.5 μl of Transcriptor Reverse Transcriptase were added and incubated at 55 ° C. for 30 minutes. Furthermore, in order to inactivate the enzyme, it incubated at 85 degreeC for 5 minutes.

(3)リアルタイムRT-PCR反応
試薬はSYBR（登録商標）Premix EX TaqTM（TaKaRa）を用い、合成したcDNAを鋳型とし、標準プロトコールに従ってLight-Cycler（Roche）を使用してリアルタイムRT-PCRを行った。プライマー(下記表1：配列番号４５〜９６)は測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムDNAの混入を確認するために、イントロンを挟むように22〜25 merの長さで、産物が150〜250 bp程度のサイズになるように設計した。内部標準としてはアクチンを使用した（プライマーの配列番号：４３及び４４）。 (3) Real-time RT-PCR reaction Using SYBR (registered trademark) Premix EX Taq ™ (TaKaRa) as a reagent, using the synthesized cDNA as a template and light-cycler (Roche) according to the standard protocol, perform real-time RT-PCR. went. Primers (Table 1 below: SEQ ID NOs: 45-96) are highly specific for the gene to be measured, and have a length of 22-25 mer so as to sandwich introns in order to confirm contamination of genomic DNA. Was designed to have a size of about 150 to 250 bp. Actin was used as an internal standard (primer SEQ ID NOs: 43 and 44).

８：形質転換のための遺伝子の作製
各候補遺伝子を強制発現べクターに連結するために開始コドンからストップコドンまでをKOD-plus（TOYOBO）を用いてPCRにより増幅した。このとき用いたFdプライマーの3'側にはSmaIサイト、Rvプライマーの5'側にSacIサイトを付加した（下記の表２のインサート増幅用プライマー、配列番号：３５〜４２）。PCR産物をゲル回収し、EcoRV処理したpBlueScript KS+（STRATAGENE）とライゲーションさせ、ヒートショックでE.Coli DH5（TOYOBO）に形質転換した。形質転換されたDH5よりプラスミドを回収し、シーケンスを確認後、SmaI処理およびSacI処理を行った。処理されたSUG候補遺伝子断片をゲルで分離して回収し、これをインサートとして用いた。このインサートを組み込むためのベクターとしては、pSMAB704をSmaI処理およびSacI処理してゲルで分離して回収したものを用いた。これらのインサートおよびベクターを混合し、ライゲーションして、SUG候補遺伝子-pSMAB704を得た。エレクトロポレーション法でアグロバクテリウム (GV3101) の形質転換を行った。pSMAB704に含まれる薬剤マーカーを利用して、スペクチノマイシン100 mg/mL を含むLB固形培地で生育してきたコロニーを形質転換候補株として回収した。そのクローンよりプラスミドを回収した。回収したプラスミドを、制限酵素処理、DNAシークエンスにより所望の配列を有することを確認した。 8: Gene of genes for transformation In order to link each candidate gene to the forced expression vector, the start codon to the stop codon were amplified by PCR using KOD-plus (TOYOBO). The SmaI site was added to the 3 ′ side of the Fd primer used at this time, and the SacI site was added to the 5 ′ side of the Rv primer (primer for insert amplification in Table 2 below, SEQ ID NOs: 35 to 42). The PCR product was gel-collected, ligated with pBlueScript KS + (STRATAGENE) treated with EcoRV, and transformed into E. Coli DH5 (TOYOBO) by heat shock. A plasmid was recovered from the transformed DH5, and after confirming the sequence, SmaI treatment and SacI treatment were performed. The treated SUG candidate gene fragment was recovered by separation with a gel and used as an insert. As a vector for incorporating this insert, pSMAB704 treated with SmaI and SacI, separated by gel and recovered was used. These inserts and vectors were mixed and ligated to obtain SUG candidate gene-pSMAB704. Agrobacterium (GV3101) was transformed by electroporation. Using the drug marker contained in pSMAB704, colonies that grew on the LB solid medium containing 100 mg / mL of spectinomycin were recovered as transformation candidate strains. The plasmid was recovered from the clone. The recovered plasmid was confirmed to have the desired sequence by restriction enzyme treatment and DNA sequencing.

９：SUG101〜SUG104候補遺伝子破壊系統の入手
SUG候補遺伝子が遺伝子破壊された植物体の表現型を調べるために、遺伝子破壊系統の検討を行った。遺伝子破壊種子のストック・センターであるSALKで検索し、SALK_108673C（SUG101候補遺伝子破壊）、SALK_008299（SUG102候補遺伝子破壊）、 SALK_090207・SALK_080893（SUG103候補遺伝子破壊）、SALK_061454（SUG104候補遺伝子破壊）を入手した。 9: Obtaining SUG101 to SUG104 candidate gene disruption lines
In order to investigate the phenotypes of plants in which SUG candidate genes were disrupted, we examined gene disruption lines. SALK_108673C (SUG101 candidate gene disruption), SALK_008299 (SUG102 candidate gene disruption), SALK_090207 / SALK_080893 (SUG103 candidate gene disruption), SALK_061454 (SUG104 candidate gene disruption) were obtained by searching at SALK, the stock center for gene disrupted seeds .

実施例１
（１）：緑化カルス作製方法の検討およびスクリーニング
最初に緑化カルス作製条件を検討するために、ホルモン濃度の検討を行った。MS培地で生育させたColの根を植物ホルモン2,4-Dおよびカイネチンの各濃度のCIMに移し5週間培養した結果、2,4-Dの濃度が50 ng/ml、カイネチンの濃度が4 μg/mlの条件でカルスが最も緑化していた。この方法では、カルスは約1ヶ月で緑化した。
この条件下で、T-DNAを導入した候補カルスの選抜を行い、T-DNAの挿入によりスルホニルウレア耐性になった形質転換カルスを4,000個得た。その中から緑化しないカルスを60個得た。これを新しい緑化培地に継代し、その中から増幅し続けた候補カルスを6個得た。その後2ヶ月ごとに新しい培地に継代をい、最終的の4つの候補カルスを得た（図1）。これら変異系統をsug(suppressed greening of calli)変異体とし,それぞれ候補カルスsug101, sug102, sug103, sug104と命名した。 Example 1
(1): Examination and screening of greening callus production method First, hormone concentration was examined in order to examine the greening callus production conditions. The roots of Col grown in MS medium were transferred to CIM with the concentrations of plant hormones 2,4-D and kinetin and cultured for 5 weeks. As a result, the concentration of 2,4-D was 50 ng / ml and the concentration of kinetin was 4. The callus was the most green at μg / ml. With this method, callus greened in about one month.
Under these conditions, candidate calli into which T-DNA was introduced were selected, and 4,000 transformed calli that became resistant to sulfonylurea by insertion of T-DNA were obtained. Among them, 60 calli not greening were obtained. This was subcultured to a new greening medium, and 6 candidate calli that continued to be amplified were obtained. Subsequent passages to fresh media every 2 months resulted in the final 4 candidate calli (Figure 1). These mutant lines were designated as sug (suppressed greening of calli) mutants and named as candidate callus sug101, sug102, sug103, and sug104, respectively.

（２）：ゲノム上におけるT-DNA導入部位の確認
上記のようにして獲得した各変異体に対してTAIL-PCRを行った。使用したプライマーの名称及び配列を以下に示す。
 (2): Confirmation of T-DNA introduction site on genome TAIL-PCR was performed on each mutant obtained as described above. The names and sequences of the primers used are shown below.

候補カルスsug101に対してTAIL-PCRを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定したところ、ライトボーダー側からのシークエンスより、chromosome1 BAC F16N3上にT-DNAの導入が確認できた。一方、レフトボーダー側からはT-DNAの導入部位に関する情報は得られなかった。ライトボーダー側では、chromosome1 BAC F16N3 127508 bpからの配列と一致したので、その上流と下流にプライマーを設計し（それぞれ配列番号：２７及び２８）、そのプライマーとRB1またはLB1プライマー（それぞれ配列番号：９及び１２）を用いてPCRを行ったところ、ライトボーダー側、レフトボーダー側共に増幅産物が確認できた。さらに、その増幅産物に対してシークエンスを行ったところ、ライトボーダー側では127514 bpから、レフトボーダー側では127543 bpからゲノムDNA配列が確認できた。このことから、候補カルスsug101は、chromosome1 BAC F16N3上の127514 bpから127543 bpの間の39 bpが欠損し、そこにレフトボーダー側がゲノムDNAの下流に向かうようにT-DNAが挿入されていることが示唆された（図2.A）。   TAIL-PCR was performed on the candidate callus sug101, and the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment was determined. From the sequence from the right border side, it was confirmed that T-DNA was introduced onto chromosome1 BAC F16N3. On the other hand, no information on the T-DNA introduction site was obtained from the left border side. On the right border side, since it matched the sequence from chromosome1 BAC F16N3 127508 bp, primers were designed upstream and downstream (SEQ ID NO: 27 and 28, respectively), and the primer and RB1 or LB1 primer (SEQ ID NO: 9 respectively) And 12), amplification products could be confirmed on both the right border side and the left border side. Furthermore, when the amplified product was sequenced, the genomic DNA sequence was confirmed from 127514 bp on the right border side and 127543 bp on the left border side. From this, the candidate callus sug101 lacks 39 bp between 127514 bp and 127543 bp on chromosome1 BAC F16N3, and T-DNA is inserted so that the left border side is downstream of the genomic DNA. Was suggested (Figure 2.A).

候補カルスsug102に対してTAIL-PCRを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定したところ、ライトボーダー側からのシークエンスより、chromosome1 BAC T13M11上にT-DNAの導入が確認できた。一方、レフトボーダー側からはT-DNAの導入部位に関する情報は得られなかった。ライトボーダー側では、chromosome1 BAC T13M11 64600 bpからの配列と一致したので、その上流と下流にプライマーを設計し（それぞれ配列番号：２９及び３０）、そのプライマーとRB1またはLB1プライマー（それぞれ配列番号：９及び１２）を用いてPCRを行ったところ、ライトボーダー側、レフトボーダー側共に増幅産物が確認できた。さらに、その増幅産物に対してシークエンスを行ったところ、ライトボーダー側では64606 bpから、レフトボーダー側では64617 bpからゲノムDNA配列が確認できた。このことから、候補カルスsug102は、chromosome1 BAC F16N3上の64606 bpから64617 bpの間の10 bpが欠損し、そこにレフトボーダー側がゲノムDNAの下流に向かうようにT-DNAが挿入されていることが示唆された（図3.A）。   TAIL-PCR was performed on the candidate callus sug102 and the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment was determined. As a result, the introduction of T-DNA onto chromosome1 BAC T13M11 was confirmed from the sequence from the right border side. On the other hand, no information on the T-DNA introduction site was obtained from the left border side. On the right border side, since it matched the sequence from chromosome1 BAC T13M11 64600 bp, primers were designed upstream and downstream (SEQ ID NOs: 29 and 30 respectively), and the primer and RB1 or LB1 primer (SEQ ID NO: 9 respectively) And 12), amplification products could be confirmed on both the right border side and the left border side. Furthermore, when the amplified product was sequenced, the genomic DNA sequence was confirmed from 64606 bp on the right border side and from 64617 bp on the left border side. From this, the candidate callus sug102 lacks 10 bp between 64606 bp and 64617 bp on chromosome1 BAC F16N3, and T-DNA is inserted so that the left border side is downstream of the genomic DNA. Was suggested (Fig. 3.A).

候補カルスsug103に対してTAIL-PCRを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定したところ、ライトボーダー側からのシークエンスより、chromosome3 TAC clone K7L4上にT-DNAの導入が確認できた。一方、レフトボーダー側からはT-DNAの導入部位に関する情報は得られなかった。ライトボーダー側では、chromosome3 TAC clone K7L4 12074 bpからの配列と一致したので、その上流と下流にプライマーを設計し（それぞれ配列番号：３１及び３２）、そのプライマーとRB1またはLB1プライマー（それぞれ配列番号：９及び１２）を用いてPCRを行ったところ、ライトボーダー側、レフトボーダー側共に増幅産物が確認できた。さらに、その増幅産物に対してシークエンスを行ったところ、ライトボーダー側では12073 bpから、レフトボーダー側では11967 bpからゲノムDNA配列が確認できた。このことから、候補カルスsug103は、chromosome3 TAC clone K7L4上の11967 bpから12073 bpの間の106 bpが欠損し、そこにレフトボーダー側がゲノムDNAの上流に向かうようにT-DNAが挿入されていることが示唆された（図4.A）。   TAIL-PCR was performed on the candidate callus sug103, and the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment was determined. From the sequence from the right border side, it was confirmed that T-DNA had been introduced onto chromosome3 TAC clone K7L4. On the other hand, no information on the T-DNA introduction site was obtained from the left border side. On the light border side, since it matched the sequence from chromosome3 TAC clone K7L4 12074 bp, primers were designed upstream and downstream (SEQ ID NO: 31 and 32, respectively), and the primer and RB1 or LB1 primer (SEQ ID NO: respectively) When PCR was performed using 9 and 12), amplification products could be confirmed on both the right border side and the left border side. Furthermore, when the amplified product was sequenced, the genomic DNA sequence was confirmed from 12073 bp on the right border side and from 11967 bp on the left border side. From this, the candidate callus sug103 lacks 106 bp between 11967 bp and 12073 bp on the chromosome3 TAC clone K7L4, and T-DNA is inserted so that the left border side is upstream of the genomic DNA. (Figure 4.A).

候補カルスsug104に対してTAIL-PCRを行い、得られた増幅断片の塩基配列を決定したところ、ライトボーダー側からのシークエンスより、chromosome2 clone T8I13上にT-DNAの導入が確認できた。一方、レフトボーダー側からはT-DNAの導入部位に関する情報は得られなかった。ライトボーダー側では、chromosome2 clone T8I13 18083 bpからの配列と一致したので、その上流と下流にプライマーを設計し（それぞれ配列番号：３３及び３４）、そのプライマーとRB1またはLB1プライマー（それぞれ配列番号：９及び１２）を用いてPCRを行ったところ、ライトボーダー側、レフトボーダー側共に増幅産物が確認できた。さらに、その増幅産物に対してシークエンスを行ったところ、ライトボーダー側では18082 bpから、レフトボーダー側では18026 bpからゲノムDNA配列が確認できた。このことから、候補カルスsug104は、chromosome2 clone T8I13上の18026 bpから18082 bpの間の56 bpが欠損し、そこにレフトボーダー側がゲノムDNAの上流に向かうようにT-DNAが挿入されていることが示唆された（図5.A）。   TAIL-PCR was performed on the candidate callus sug104, and the nucleotide sequence of the obtained amplified fragment was determined. As a result, the introduction of T-DNA onto chromosome2 clone T8I13 was confirmed from the sequence from the right border side. On the other hand, no information on the T-DNA introduction site was obtained from the left border side. On the right border side, since it matched the sequence from chromosome2 clone T8I13 18083 bp, primers were designed upstream and downstream (SEQ ID NO: 33 and 34, respectively), and the primer and RB1 or LB1 primer (SEQ ID NO: 9 respectively) And 12), amplification products could be confirmed on both the right border side and the left border side. Furthermore, when the amplified product was sequenced, the genomic DNA sequence was confirmed from 18082 bp on the right border side and from 18026 bp on the left border side. From this, the candidate callus sug104 is deficient in 56 bp between 18026 bp and 18082 bp on chromosome2 clone T8I13, and the T-DNA is inserted so that the left border side is upstream of the genomic DNA. Was suggested (Fig. 5.A).

（３）T-DNA近傍遺伝子の発現量の確認
親系統2-1-6の緑化カルスと4つの候補カルスからRNAを抽出し、マイクロアレイを行った。それぞれの候補カルスについて、T-DNA挿入付近の遺伝子の発現量を緑化カルスと比較した。また、マイクロアレイで確認できなかったT-DNA挿入付近の遺伝子をリアルタイムRT-PCRを行い、その発現量を緑化カルスと比較した。 (3) Confirmation of expression level of genes near T-DNA RNA was extracted from the greening callus of parental strain 2-1-6 and four candidate callus and microarrayed. About each candidate callus, the expression level of the gene near T-DNA insertion was compared with the greening callus. In addition, real-time RT-PCR was performed on genes near the T-DNA insertion that could not be confirmed by microarray, and the expression level was compared with that of greening callus.

マイクロアレイとリアルタイムRT-PCRの結果から、T-DNAが挿入された近傍遺伝子の発現量を確認した。特に、ライトボーダー、レフトボーダーに最も近い遺伝子から確認し、T-DNAから20 kbpの範囲の遺伝子に注目した。   Based on the results of microarray and real-time RT-PCR, the expression level of the nearby gene inserted with T-DNA was confirmed. In particular, we confirmed the genes closest to the right border and left border, and focused on genes in the range of 20 kbp from T-DNA.

候補カルスsug101では、ライトボーダーに最も近い遺伝子At1g47520の発現量は2.64倍であった。レフトボーダーに最も近い遺伝子At1g47510の発現量は6.07倍であった。その隣に位置する遺伝子At1g47500の発現量は3.48倍であった。At1g47495はマイクロアレイで情報が得られなかったので、リアルタイムRT-PCRを行ったが、発現が確認出来なかった（図2.B）。よって候補カルスsug101の原因遺伝子はAt1g47510 (配列番号：１及びこの配列がコードするアミノ酸の配列番号：2)とした。   In the candidate callus sug101, the expression level of the gene At1g47520 closest to the right border was 2.64 times. The expression level of the gene At1g47510 closest to the left border was 6.07 times. The expression level of the gene At1g47500 located next to it was 3.48 times. Since At1g47495 could not obtain information by microarray, real-time RT-PCR was performed, but expression could not be confirmed (FIG. 2.B). Therefore, the causal gene of candidate callus sug101 was At1g47510 (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 of the amino acid encoded by this sequence).

候補カルスsug102では、ライトボーダーに最も近い遺伝子At1g61770の発現量は1.52倍であった。レフトボーダーに最も近い遺伝子At1g61780の発現量は2.14倍であった。T-DNAから20 kbpの範囲で見てみると、14 kbp離れた遺伝子At1g61740の発現量は3.48倍であった（図3.B）。よって候補カルスsug102の原因遺伝子はAt1g61740およびAt1g61780 (配列番号：3及びこの配列がコードするアミノ酸の配列番号：4)とした。   In the candidate callus sug102, the expression level of the gene At1g61770 closest to the right border was 1.52 times. The expression level of the gene At1g61780 closest to the left border was 2.14 times. Looking at the range of 20 kbp from T-DNA, the expression level of the gene At1g61740, 14 kbp away, was 3.48 times (Fig. 3.B). Therefore, the causal genes of candidate callus sug102 were At1g61740 and At1g61780 (SEQ ID NO: 3 and the amino acid sequence encoded by this sequence: 4).

候補カルスsug103では、ライトボーダーに最も近い遺伝子At3g15240の発現量は84.4倍と52.0倍であった。At3g15240の遺伝子はマイクロアレイにおいてプローブIDが2つあった。したがって、2つのプローブIDがAt3g15240の遺伝子に対応している。レフトボーダーに最も近い遺伝子At3g15220の発現量は1.74倍であった（図4.B）。よって候補カルスsug103の原因遺伝子はAt3g15240 (配列番号：5及びこの配列がコードするアミノ酸の配列番号：6)とした。   In the candidate callus sug103, the expression level of the gene At3g15240 closest to the right border was 84.4 times and 52.0 times. The At3g15240 gene had two probe IDs in the microarray. Therefore, two probe IDs correspond to the gene of At3g15240. The expression level of the gene At3g15220 closest to the left border was 1.74 times (Fig. 4.B). Therefore, the causal gene of the candidate callus sug103 was At3g15240 (SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 of the amino acid encoded by this sequence).

候補カルスsug104では、ライトボーダーにもっとも近い遺伝子At2g47220の発現量は2.83倍であった。レフトボーダーに最も近い遺伝子At2g47210の発現量は1.21倍であった。その隣に位置する遺伝子At2g47200の発現量は17.1倍であった（図5.B）。よって候補カルスsug104の原因遺伝子はAt2g47200 (配列番号：7及びこの配列がコードするアミノ酸の配列番号：8)とした。
それぞれの候補カルスより得られた各原因遺伝子のヌクレオチド配列およびコードされるアミノ酸配列を以下に記載する。 In the candidate callus sug104, the expression level of the gene At2g47220 closest to the right border was 2.83 times. The expression level of the gene At2g47210 closest to the left border was 1.21 times. The expression level of the gene At2g47200 located next to the gene was 17.1 times (FIG. 5.B). Therefore, the causal gene of the candidate callus sug104 was At2g47200 (SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence encoded by this sequence: 8).
The nucleotide sequence and encoded amino acid sequence of each causative gene obtained from each candidate callus are described below.

配列番号：１
SUG101候補遺伝子 (At1g47510)
1 ATGCCGACAA TGGGGAATAA GAATTCGATG TGTGGGTTAA AAAGGTTTCC
51 GAACTACAAG AAGTCTCCGA TCGGTTCATT TGCGAAAAAC TCATCATCTC
101 ACGACGGTAT TAAAACAATC GAAGCTGTTA ACAGTTGCAG TTTTTCTAGA
151 AAAGCAGATC TTTGCATCCG TATCATCACA TGGAACATGA ATGGAAATGT
201 TTCGTATGAG GATTTAGTTG AGCTTGTTGG CAAAGAAAGG AAGTTCGATT
251 TGCTTGTCGT TGGCTTGCAA GAAGCTCCCA AAGCAAACGT TGATCAACTT
301 TTGCAGACAG CTTCATCTCC AACTCACGAG CTTCTTGGGA AGGCGAAATT
351 GCAATCGGTC CAGTTATATT TGTTTGGGCC AAAGAATTCA CATACATTAG
401 TAAAAGAATT AAAGGCAGAG AGATATTCGG TAGGAGGATG TGGAGGTTTA
451 ATAGGAAGAA AAAAAGGAGC CGTGGCTATT CGTATTAACT ACGATGACAT
501 CAAAATGGTT TTTATCTCTT GCCATCTCTC TGCTCATGCA AAAAAAGTGG
551 ATCAAAGAAA TACGGAGTTA AGACACATAG CAAATTCACT ATTACCAAGA
601 GACAAAAGGA AACGTGACCT TACTGTTTGG CTAGGAGATC TAAATTACAG
651 GATCCAAGAT GTCTCTAACC ATCCTGTTCG ATCTCTTATC CAAAACCATC
701 TTCAATCTGT TCTTGTGAGT AAAGATCAAC TCTTGCAAGA AGCGGAGAGA
751 GGCGAAATAT TCAAAGGTTA CTCTGAAGGA ACTTTAGGGT TTAAACCAAC
801 CTACAAGTAC AATGTAGGAA GCAGCGACTA TGATACAAGC CATAAGATCA
851 GGGTTCCAGC TTGGACAGAT AGGATCTTAT TCAAGATCCA AGATACTGAT
901 AATATTCAAG CAACTCTTCA CTCTTATGAT TCCATAGACC AAGTATATGG
951 TTCTGATCAT AAGCCTGTCA AAGCGGATCT TTGCTTGAAG TGGGTCAACA
1001 GTTAA SEQ ID NO: 1
SUG101 candidate gene (At1g47510)
1 ATGCCGACAA TGGGGAATAA GAATTCGATG TGTGGGTTAA AAAGGTTTCC
51 GAACTACAAG AAGTCTCCGA TCGGTTCATT TGCGAAAAAC TCATCATCTC
101 ACGACGGTAT TAAAACAATC GAAGCTGTTA ACAGTTGCAG TTTTTCTAGA
151 AAAGCAGATC TTTGCATCCG TATCATCACA TGGAACATGA ATGGAAATGT
201 TTCGTATGAG GATTTAGTTG AGCTTGTTGG CAAAGAAAGG AAGTTCGATT
251 TGCTTGTCGT TGGCTTGCAA GAAGCTCCCA AAGCAAACGT TGATCAACTT
301 TTGCAGACAG CTTCATCTCC AACTCACGAG CTTCTTGGGA AGGCGAAATT
351 GCAATCGGTC CAGTTATATT TGTTTGGGCC AAAGAATTCA CATACATTAG
401 TAAAAGAATT AAAGGCAGAG AGATATTCGG TAGGAGGATG TGGAGGTTTA
451 ATAGGAAGAA AAAAAGGAGC CGTGGCTATT CGTATTAACT ACGATGACAT
501 CAAAATGGTT TTTATCTCTT GCCATCTCTC TGCTCATGCA AAAAAAGTGG
551 ATCAAAGAAA TACGGAGTTA AGACACATAG CAAATTCACT ATTACCAAGA
601 GACAAAAGGA AACGTGACCT TACTGTTTGG CTAGGAGATC TAAATTACAG
651 GATCCAAGAT GTCTCTAACC ATCCTGTTCG ATCTCTTATC CAAAACCATC
701 TTCAATCTGT TCTTGTGAGT AAAGATCAAC TCTTGCAAGA AGCGGAGAGA
751 GGCGAAATAT TCAAAGGTTA CTCTGAAGGA ACTTTAGGGT TTAAACCAAC
801 CTACAAGTAC AATGTAGGAA GCAGCGACTA TGATACAAGC CATAAGATCA
851 GGGTTCCAGC TTGGACAGAT AGGATCTTAT TCAAGATCCA AGATACTGAT
901 AATATTCAAG CAACTCTTCA CTCTTATGAT TCCATAGACC AAGTATATGG
951 TTCTGATCAT AAGCCTGTCA AAGCGGATCT TTGCTTGAAG TGGGTCAACA
1001 GTTAA

配列番号：2（アミノ酸１文字表記）
SUG101候補遺伝子がコードするタンパク質
1 MPTMGNKNSM CGLKRFPNYK KSPIGSFAKN SSSHDGIKTI EAVNSCSFSR
51 KADLCIRIIT WNMNGNVSYE DLVELVGKER KFDLLVVGLQ EAPKANVDQL
101 LQTASSPTHE LLGKAKLQSV QLYLFGPKNS HTLVKELKAE RYSVGGCGGL
151 IGRKKGAVAI RINYDDIKMV FISCHLSAHA KKVDQRNTEL RHIANSLLPR
201 DKRKRDLTVW LGDLNYRIQD VSNHPVRSLI QNHLQSVLVS KDQLLQEAER
251 GEIFKGYSEG TLGFKPTYKY NVGSSDYDTS HKIRVPAWTD RILFKIQDTD
301 NIQATLHSYD SIDQVYGSDH KPVKADLCLK WVNS SEQ ID NO: 2 (amino acid single letter code)
Protein encoded by SUG101 candidate gene
1 MPTMGNKNSM CGLKRFPNYK KSPIGSFAKN SSSHDGIKTI EAVNSCSFSR
51 KADLCIRIIT WNMNGNVSYE DLVELVGKER KFDLLVVGLQ EAPKANVDQL
101 LQTASSPTHE LLGKAKLQSV QLYLFGPKNS HTLVKELKAE RYSVGGCGGL
151 IGRKKGAVAI RINYDDIKMV FISCHLSAHA KKVDQRNTEL RHIANSLLPR
201 DKRKRDLTVW LGDLNYRIQD VSNHPVRSLI QNHLQSVLVS KDQLLQEAER
251 GEIFKGYSEG TLGFKPTYKY NVGSSDYDTS HKIRVPAWTD RILFKIQDTD
301 NIQATLHSYD SIDQVYGSDH KPVKADLCLK WVNS

配列番号：3
SUG102候補遺伝子 (AT1g61780)
1 ATGGTTTGCG ATAAGTGTGA GAAGAAGTTA TCGAAAGTGA TAGTTCCTGA
51 TAAGTGGAAG GATGGTGCTC GTAATGTAAC TGAAGGTGGT GGTCGTAAAA
101 TCAATGAGAA TAAGCTTCTC TCCAAGAAGA ATAGATGGTC ACCTTACAGT
151 ACCTGTACCA CAAAATGTAT GATCTGCAAG CAGCAAGTGC ATCAAGATGG
201 TAAATACTGT CACACATGTG CCTATAGCAA AGGAGTGTGC GCAATGTGCG
251 GGAAGCAAGT GTTGGACACC AAGATGTACA AGCAAAGCAA TGTATAA SEQ ID NO: 3
SUG102 candidate gene (AT1g61780)
1 ATGGTTTGCG ATAAGTGTGA GAAGAAGTTA TCGAAAGTGA TAGTTCCTGA
51 TAAGTGGAAG GATGGTGCTC GTAATGTAAC TGAAGGTGGT GGTCGTAAAA
101 TCAATGAGAA TAAGCTTCTC TCCAAGAAGA ATAGATGGTC ACCTTACAGT
151 ACCTGTACCA CAAAATGTAT GATCTGCAAG CAGCAAGTGC ATCAAGATGG
201 TAAATACTGT CACACATGTG CCTATAGCAA AGGAGTGTGC GCAATGTGCG
251 GGAAGCAAGT GTTGGACACC AAGATGTACA AGCAAAGCAA TGTATAA

配列番号：4（アミノ酸１文字表記）
SUG102候補遺伝子がコードするタンパク質
1 MVCDKCEKKL SKVIVPDKWK DGARNVTEGG GRKINENKLL SKKNRWSPYS
51 TCTTKCMICK QQVHQDGKYC HTCAYSKGVC AMCGKQVLDT KMYKQSNV SEQ ID NO: 4 (amino acid single letter code)
Protein encoded by SUG102 candidate gene
1 MVCDKCEKKL SKVIVPDKWK DGARNVTEGG GRKINENKLL SKKNRWSPYS
51 TCTTKCMICK QQVHQDGKYC HTCAYSKGVC AMCGKQVLDT KMYKQSNV

配列番号：5
SUG103候補遺伝子 (At3g15240)
1 ATGGTGGGCT CGGAACATCA TCACCATCAT CAACAACATC ATCATCAAAA
51 CCATCAGCAG CAGCAACAAA GGAGCAAAGA AGCTTTAGGG ATGGTGGCTC
101 TCCACGACGC CCTGAGAACT GTTTGTCTCA ACACCGACTG GACTTACTCT
151 GTCTTCTGGT CCATCCGTCC CCGTCCGAGA GTTCGAGGCG GTGGCAACGG
201 CTGCAAAGTT GGCGACGACA ATGGAAGCTT GATGTTGATG TGGGAAGATG
251 GATACTGCAG AGGAAGAGGA GGAACAGAAG GTTGCTATGG AGACATGGAA
301 GGAGAAGATC CTGTTCGTAA ATCTTTCAGC AAGATGTCTA TTCAGTTATA
351 TAATTATGGC GAAGGGTTAA TGGGGAAGGT TGCTTCTGAC AAATGCCATA
401 AATGGGTTTT CAAGGAACAA ACTGAATCTG AATCTAATGC CTCTAGTTAC
451 TGGCAAAGCT CATTCGATGC TATTCCTTCA GAGTGGAATG ATCAGTTCGA
501 ATCTGGGATT CGGACCATAG CTGTTATTCA AGCCGGACAT GGCCTTTTAC
551 AACTTGGTTC TTGCAAGATT ATACCTGAAG ATCTGCACTT TGTTCTTCGG
601 ATGAGGCACA CGTTTGAATC ACTTGGCTAC CAATCCGGAT TTTACCTCTC
651 TCAGCTCTTC TCCTCAAACC GAACCACTTC GTCTTCAAAC ACACCGCTCA
701 TGGCCTCGAA CCACCCTCTA CTACCTACAC AGACTCAGCC ATTGCAACCC
751 ACTCTTCCCC ACTACAACTG GAGTGGTACG AGCCAACGAC CAATGATGCC
801 TCAAACCTCT TTGCCTACCT ACCAGCCTCA CATGACTATG CCTTTCCCAG
851 TAATGCCACA CTCAAACAAA GAACAAGACC CTGACGTGAA ATGGCCCACG
901 GGCCTATCTT TCTTCAATGC GTTGACTAAC AATGTCAACG CTAAGCTTCT
951 GTTTGATTCA GAGGGGTTAG GTGACAAAAC AGACCACCAG AACCAGAGCC
1001 AGGAACAGAG CAACTCTGAG AGTCAAGCGA ATCCGAGCGA GTTCTTGAGC
1051 CTTGATAGTC ACCACCGAAA CATGAGTTTC TTAGAGTGA SEQ ID NO: 5
SUG103 candidate gene (At3g15240)
1 ATGGTGGGCT CGGAACATCA TCACCATCAT CAACAACATC ATCATCAAAA
51 CCATCAGCAG CAGCAACAAA GGAGCAAAGA AGCTTTAGGG ATGGTGGCTC
101 TCCACGACGC CCTGAGAACT GTTTGTCTCA ACACCGACTG GACTTACTCT
151 GTCTTCTGGT CCATCCGTCC CCGTCCGAGA GTTCGAGGCG GTGGCAACGG
201 CTGCAAAGTT GGCGACGACA ATGGAAGCTT GATGTTGATG TGGGAAGATG
251 GATACTGCAG AGGAAGAGGA GGAACAGAAG GTTGCTATGG AGACATGGAA
301 GGAGAAGATC CTGTTCGTAA ATCTTTCAGC AAGATGTCTA TTCAGTTATA
351 TAATTATGGC GAAGGGTTAA TGGGGAAGGT TGCTTCTGAC AAATGCCATA
401 AATGGGTTTT CAAGGAACAA ACTGAATCTG AATCTAATGC CTCTAGTTAC
451 TGGCAAAGCT CATTCGATGC TATTCCTTCA GAGTGGAATG ATCAGTTCGA
501 ATCTGGGATT CGGACCATAG CTGTTATTCA AGCCGGACAT GGCCTTTTAC
551 AACTTGGTTC TTGCAAGATT ATACCTGAAG ATCTGCACTT TGTTCTTCGG
601 ATGAGGCACA CGTTTGAATC ACTTGGCTAC CAATCCGGAT TTTACCTCTC
651 TCAGCTCTTC TCCTCAAACC GAACCACTTC GTCTTCAAAC ACACCGCTCA
701 TGGCCTCGAA CCACCCTCTA CTACCTACAC AGACTCAGCC ATTGCAACCC
751 ACTCTTCCCC ACTACAACTG GAGTGGTACG AGCCAACGAC CAATGATGCC
801 TCAAACCTCT TTGCCTACCT ACCAGCCTCA CATGACTATG CCTTTCCCAG
851 TAATGCCACA CTCAAACAAA GAACAAGACC CTGACGTGAA ATGGCCCACG
901 GGCCTATCTT TCTTCAATGC GTTGACTAAC AATGTCAACG CTAAGCTTCT
951 GTTTGATTCA GAGGGGTTAG GTGACAAAAC AGACCACCAG AACCAGAGCC
1001 AGGAACAGAG CAACTCTGAG AGTCAAGCGA ATCCGAGCGA GTTCTTGAGC
1051 CTTGATAGTC ACCACCGAAA CATGAGTTTC TTAGAGTGA

配列番号：6（アミノ酸１文字表記）
SUG103候補遺伝子がコードするタンパク質
1 MVGSEHHHHH QQHHHQNHQQ QQQRSKEALG MVALHDALRT VCLNTDWTYS
51 VFWSIRPRPR VRGGGNGCKV GDDNGSLMLM WEDGYCRGRG GTEGCYGDME
101 GEDPVRKSFS KMSIQLYNYG EGLMGKVASD KCHKWVFKEQ TESESNASSY
151 WQSSFDAIPS EWNDQFESGI RTIAVIQAGH GLLQLGSCKI IPEDLHFVLR
201 MRHTFESLGY QSGFYLSQLF SSNRTTSSSN TPLMASNHPL LPTQTQPLQP
251 TLPHYNWSGT SQRPMMPQTS LPTYQPHMTM PFPVMPHSNK EQDPDVKWPT
301 GLSFFNALTN NVNAKLLFDS EGLGDKTDHQ NQSQEQSNSE SQANPSEFLS
351 LDSHHRNMSF LE SEQ ID NO: 6 (single amino acid notation)
Protein encoded by SUG103 candidate gene
1 MVGSEHHHHH QQHHHQNHQQ QQQRSKEALG MVALHDALRT VCLNTDWTYS
51 VFWSIRPRPR VRGGGNGCKV GDDNGSLMLM WEDGYCRGRG GTEGCYGDME
101 GEDPVRKSFS KMSIQLYNYG EGLMGKVASD KCHKWVFKEQ TESESNASSY
151 WQSSFDAIPS EWNDQFESGI RTIAVIQAGH GLLQLGSCKI IPEDLHFVLR
201 MRHTFESLGY QSGFYLSQLF SSNRTTSSSN TPLMASNHPL LPTQTQPLQP
251 TLPHYNWSGT SQRPMMPQTS LPTYQPHMTM PFPVMPHSNK EQDPDVKWPT
301 GLSFFNALTN NVNAKLLFDS EGLGDKTDHQ NQSQEQSNSE SQANPSEFLS
351 LDSHHRNMSF LE

配列番号：7
SUG104候補遺伝子 (At2g47200)
1 ATGGCGTCGA TAGTGATGCT CCTTAGAGCA CTGATGAGTT GCCGTCTTAC
51 GCCTAAAGAC GAGCCGGAGA CATCGGATTC TTCTTCGTCT GCTGCGAAAC
101 TTTACAGAAA TATCGTCGGA GACGAAAACG TGACAAGGAA GAGAATTTCA
151 GTGGTTGATA CATCGCATCT TGGCGATAAT CACGAGTTTA TTATCGAAAC
201 TACGTGTGGA AGCAACGATA TGGATGAAGG GTTTTACTGG ATCATCGTCA
251 GGAATCACTT GATGTGA SEQ ID NO: 7
SUG104 candidate gene (At2g47200)
1 ATGGCGTCGA TAGTGATGCT CCTTAGAGCA CTGATGAGTT GCCGTCTTAC
51 GCCTAAAGAC GAGCCGGAGA CATCGGATTC TTCTTCGTCT GCTGCGAAAC
101 TTTACAGAAA TATCGTCGGA GACGAAAACG TGACAAGGAA GAGAATTTCA
151 GTGGTTGATA CATCGCATCT TGGCGATAAT CACGAGTTTA TTATCGAAAC
201 TACGTGTGGA AGCAACGATA TGGATGAAGG GTTTTACTGG ATCATCGTCA
251 GGAATCACTT GATGTGA

配列番号：8（アミノ酸１文字表記）
SUG104候補遺伝子がコードするタンパク質
1 MASIVMLLRA LMSCRLTPKD EPETSDSSSS AAKLYRNIVG DENVTRKRIS
51 VVDTSHLGDN HEFIIETTCG SNDMDEGFYW IIVRNHLM SEQ ID NO: 8 (single amino acid code)
Protein encoded by SUG104 candidate gene
1 MASIVMLLRA LMSCRLTPKD EPETSDSSSS AAKLYRNIVG DENVTRKRIS
51 VVDTSHLGDN HEFIIETTCG SNDMDEGFYW IIVRNHLM

実施例２：SUG101〜104候補遺伝子の強制発現による光合成遺伝子発現への影響
上記の４種の候補遺伝子（SUG101〜104候補遺伝子）を強制発現させたシロイヌナズナをそれぞれ作製した。SUG101〜104候補遺伝子のクローニングのために使用したプライマーを、以下の表２に示す。
SUG101〜104候補遺伝子の形質転換体それぞれ100mgからmRNAを調製後、cDNAを合成しリアルタイムRT-PCRを行った。このリアルタイムRT-PCRにおいて、SUG候補遺伝子プライマー（表３、配列番号：４５〜９２）を用いた。これらのプライマー(表３：配列番号４５〜９６)は測定する遺伝子に対して特異性が高く、かつゲノムDNAの混入を確認するために、イントロンを挟むように22〜25 merの長さで、産物が150〜250 bp程度のサイズになるように設計した。内部標準としてはアクチンを使用した（プライマーの配列番号：４３及び４４）。
各遺伝子の発現量を、内部標準として配列番号：４３及び４４を用いたアクチン遺伝子（ACT2遺伝子）の増幅産物によって補正を行った後、野生型Col-0との相対値で表した（図6）。その結果、At1g47510の形質転換体のAt1g47510発現量は、Col-0と比べ316倍増加していた。At1g61780の形質転換体のAt1g61780発現量は、Col-0と比べ106倍増加していた。At3g15240の形質転換体のAt1g47510発現量は、Col-0と比べ2,148倍増加していた。At2g47200の形質転換体のAt1g47510発現量は、Col-0と比べ6,326倍増加していた。 Example 2: Effect of forced expression of SUG101-104 candidate genes on photosynthetic gene expression Arabidopsis thaliana in which the above four candidate genes (SUG101-104 candidate genes) were forcibly expressed was prepared. The primers used for cloning the SUG101-104 candidate genes are shown in Table 2 below.
After preparing mRNA from 100 mg of each of the transformants of SUG101 to 104 candidate genes, cDNA was synthesized and real-time RT-PCR was performed. In this real-time RT-PCR, SUG candidate gene primers (Table 3, SEQ ID NOs: 45 to 92) were used. These primers (Table 3: SEQ ID NOs: 45 to 96) are highly specific to the gene to be measured, and have a length of 22 to 25 mer so as to sandwich an intron in order to confirm contamination of genomic DNA. The product was designed to have a size of about 150 to 250 bp. Actin was used as an internal standard (primer SEQ ID NOs: 43 and 44).
The expression level of each gene was corrected with the amplification product of the actin gene (ACT2 gene) using SEQ ID NOs: 43 and 44 as an internal standard, and then expressed as a relative value to wild-type Col-0 (FIG. 6). ). As a result, the expression level of At1g47510 in the transformant of At1g47510 was increased by 316 times compared to Col-0. The expression level of At1g61780 in the transformant of At1g61780 was increased 106-fold compared to Col-0. The expression level of At1g47510 in the transformant of At3g15240 was increased by 2,148 times compared to Col-0. The expression level of At1g47510 in the transformant of At2g47200 was increased by 6,326 times compared to Col-0.

光合成遺伝子として、クロロフィルa/b-結合タンパク質遺伝子 (CAB) およびリブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼＳサブユニット遺伝子 (RBCS) の発現量を測定するため、表３に示すプライマー（配列番号：９３〜９６）を用いて、リアルタイムRT-PCRを行った。各遺伝子の発現量を上記のように内部標準ACT2遺伝子によって補正を行った後、Col-0との相対値で表した（図7）。   In order to measure the expression levels of chlorophyll a / b-binding protein gene (CAB) and ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase / oxygenase S subunit gene (RBCS) as photosynthesis genes, primers shown in Table 3 (SEQ ID NO: : 93-96), real-time RT-PCR was performed. After the expression level of each gene was corrected with the internal standard ACT2 gene as described above, it was expressed as a relative value to Col-0 (FIG. 7).

これらの結果、SUG101候補遺伝子-pSMAB704形質転換体のCAB遺伝子発現物量は、Col-0の0.37倍、RBCS遺伝子発現量は0.25倍であった。
SUG102候補遺伝子-pSMAB704形質転換体のCAB遺伝子発現量は、Col-0の0.55倍、RBCS遺伝子発現量は0.33倍であった。
SUG103候補遺伝子-pSMAB704形質転換体のCAB遺伝子発現量は、Col-0の0.51倍、RBCS遺伝子発現量は0.37倍であった。
SUG104候補遺伝子-pSMAB704形質転換体のCAB遺伝子発現量は、Col-0の0.49倍、RBCS遺伝子発現量は0.33倍であった。これらの結果は、それぞれの形質転換体において光合成は大きく低下していたことを示唆する。 As a result, the CAB gene expression level of the SUG101 candidate gene-pSMAB704 transformant was 0.37 times that of Col-0, and the RBCS gene expression level was 0.25 times.
The CAB gene expression level of the SUG102 candidate gene-pSMAB704 transformant was 0.55 times that of Col-0 and the RBCS gene expression level was 0.33 times.
The CAB gene expression level of the SUG103 candidate gene-pSMAB704 transformant was 0.51 times that of Col-0, and the RBCS gene expression level was 0.37 times.
The CAB gene expression level of the SUG104 candidate gene-pSMAB704 transformant was 0.49 times that of Col-0, and the RBCS gene expression level was 0.33 times. These results suggest that photosynthesis was greatly reduced in each transformant.

実施例３：SUG101候補遺伝子破壊系統における光合成遺伝子発現への影響
遺伝子破壊種子のストック・センターであるSALKで検索し、SALK_108673C（SUG101候補遺伝子破壊）、SALK_008299（SUG102候補遺伝子破壊）、 SALK_090207・SALK_080893（SUG103候補遺伝子破壊）、SALK_061454（SUG104候補遺伝子破壊）を入手した。これらのうち、SALK_108673Cのみホモ接合種子であったため、今回実験に使用した。SUG101候補遺伝子破壊のホモ接合種子をMS培地に播種し、2週間経過した葉と、MS培地で2週間育成させたCol-0の葉をそれぞれ100 mg用いて、それぞれのCAB遺伝子発現量及びRBCS遺伝子発現量についてリアルタイムRT-PCRを行った。使用したプライマーは表３（配列番号：９３〜９６）に示す。発現量を内部標準ACT2遺伝子によって補正を行い、Col-0との相対値で表した。その結果、CAB遺伝子発現量はCol-0と比べ1.36倍、RBCS遺伝子発現量は4.3倍増加していた（図8）。これらの結果は、このSUG101候補遺伝子破壊のホモ接合体において、光合成が向上していたことを示唆する。 Example 3: Effect on Photosynthesis Gene Expression in SUG101 Candidate Gene Disrupted Lines Searched with SALK, the stock center of gene disrupted seeds, SALK_108673C (SUG101 candidate gene disruption), SALK_008299 (SUG102 candidate gene disruption), SALK_090207 / SALK_080893 ( SUG103 candidate gene disruption) and SALK_061454 (SUG104 candidate gene disruption) were obtained. Of these, only SALK_108673C was a homozygous seed and was used in this experiment. Homozygous seeds of SUG101 candidate gene disruption were sown in MS medium, 2 weeks passed and 100 mg of Col-0 leaves grown for 2 weeks in MS medium, each CAB gene expression level and RBCS Real-time RT-PCR was performed on the gene expression level. The primers used are shown in Table 3 (SEQ ID NOs: 93 to 96). The expression level was corrected by the internal standard ACT2 gene and expressed as a relative value to Col-0. As a result, the CAB gene expression level was increased 1.36 times and the RBCS gene expression level was 4.3 times that of Col-0 (FIG. 8). These results suggest that photosynthesis was improved in the homozygote of this SUG101 candidate gene disruption.

実施例４：遺伝子破壊系統のマイクロアレイ
GCIM で生育した野生株由来緑カルスに対して、GCIM で生育したsug変異白カルスで発現が共通に8倍以上上昇した遺伝子は93個であった。これらをMap.Man.binsにより分類したところ転写RNA調節、ストレス、輸送、タンパク質分解に関する遺伝子を多く認めた(表４)。
Example 4: Microarray of gene disruption lines
There were 93 genes whose expression was commonly increased 8 times or more in the sug mutant white callus grown in GCIM, compared to the wild-derived green callus grown in GCIM. When these were classified by Map.Man.bins, many genes relating to transcription RNA regulation, stress, transport, and proteolysis were recognized (Table 4).

（考 察）
緑化カルス作製方法の検討
緑化カルスを作製するために植物ホルモンの濃度検討を行った結果、2,4-Dの濃度が50 ng/ml、カイネチンの濃度が4 μg/mlで培養することによって、カルスを緑化することができた。2,4-Dの濃度を50、100、500(ng/ml)の3点、カイネチンの濃度を500、1000、2000、4000(ng/ml)の4点、計12種類で培養した場合でも同様の結果だった。したがって、2,4-Dの濃度が50 ng/ml、カイネチンの濃度が4 μg/mlのGCIM培地で培養すると緑化カルスを作製することができることを確認した。 (Discussion)
Examination of greening callus production method As a result of examining the concentration of plant hormones to produce greening callus, by culturing at 2,4-D concentration of 50 ng / ml and kinetin concentration of 4 μg / ml, Callus could be greened. Even when cultivated in a total of 12 types, 2,4-D concentration 50, 100, 500 (ng / ml) 3 points, kinetin concentration 500, 1000, 2000, 4000 (ng / ml) 4 points Similar results. Therefore, it was confirmed that green calli could be produced when cultured in a GCIM medium with a 2,4-D concentration of 50 ng / ml and a kinetin concentration of 4 μg / ml.

SUG遺伝子群の機能
SUG101，SUG102，SUG103，SUG104を強制発現させたいずれの形質転換系統もCABおよびRBCSの遺伝子発現が低下しており、これらのSUG遺伝子群が光合成抑制因子として機能していることが示唆された。また、SUG101遺伝子破壊系統においてCABおよびRBCSの遺伝子発現が増加しており、これはSUG101による光合成抑制機能が解除されたことに起因すると考えられる。 Functions of SUG genes
CAB and RBCS gene expression was decreased in all of the transformed lines in which SUG101, SUG102, SUG103, and SUG104 were forcibly expressed, suggesting that these SUG gene groups functioned as photosynthesis inhibitors. In addition, CAB and RBCS gene expression increased in the SUG101 gene disruption line, which is considered to be due to the cancellation of the photosynthetic suppression function by SUG101.

SUG101はAt1g47510(配列番号：１)によってコードされており、ホスファチジルイノシトール（PtdIns）の5位リン酸基を脱リン酸化する酵素At5PTase11である (配列番号：２)。At5PTase11はホスファチジルイノシトール2リン酸および3リン酸に特異的で、特にPtdIns(3,5)P2、PtdIns(4,5)P2、PtdIns(3,4,5)P3に積極的に働く。At5PTase11をノックダウンさせると、PtdIns(3)PやPtdIns(4)Pの発現量が減少する一方でイノシトール（Ins）(1,4,5)P3やInsP2が増加し、胚軸成長を抑制させるという報告 [6] があるが、本明細書中ではAt5PTase11が光合成にも関与している可能性のあることを開示している。したがって、このSUG101は非常に興味深い遺伝子である。   SUG101 is encoded by At1g47510 (SEQ ID NO: 1), and is an enzyme At5PTase11 that dephosphorylates the 5-position phosphate group of phosphatidylinositol (PtdIns) (SEQ ID NO: 2). At5PTase11 is specific for phosphatidylinositol diphosphate and triphosphate, and particularly positively acts on PtdIns (3,5) P2, PtdIns (4,5) P2, PtdIns (3,4,5) P3. When At5PTase11 is knocked down, the expression level of PtdIns (3) P and PtdIns (4) P decreases, while inositol (Ins) (1,4,5) P3 and InsP2 increase to suppress hypocotyl growth. Although there is a report [6], it is disclosed in this specification that At5PTase11 may be involved in photosynthesis. Therefore, this SUG101 is a very interesting gene.

SUG102候補遺伝子はAt1g61780である。At1g61780のアミノ酸配列(配列番号：４)は、動物の神経系に関与するcriptと非常に類似している。動物の神経系では、criptは受容体PSD95のPDZIIIドメインに特異的に結合し、シナプス間のシグナル伝達を行う [7]。神経系組織に存在するcriptの類似体が植物内にも存在することは非常に興味深いが、受容体であるPDZIIIドメインと類似するタンパク質は発見されていない。この遺伝子がコードするタンパク質やシグナル伝達経路等の解析は、At1g61780と光合成との関係性を明らかにするだけではなく、植物にも動物の神経系と似た回路が存在するという可能性があるため非常に興味深いものであると考えられる。   The SUG102 candidate gene is At1g61780. The amino acid sequence of At1g61780 (SEQ ID NO: 4) is very similar to the cript involved in the animal nervous system. In the animal nervous system, cript specifically binds to the PDZIII domain of the receptor PSD95 and signals between synapses [7]. It is very interesting that analogs of cript that exist in nervous system tissues also exist in plants, but no protein similar to the receptor PDZIII domain has been discovered. Analysis of the protein encoded by this gene, signal transduction pathway, etc. not only reveals the relationship between At1g61780 and photosynthesis, but also plants may have circuits similar to the nervous system of animals. It is considered very interesting.

SUG103候補遺伝子はAt3g15240(配列番号：５)である。At3g15240から翻訳されるタンパク質(配列番号：６)の機能についてはまだ知られていない。   The SUG103 candidate gene is At3g15240 (SEQ ID NO: 5). The function of the protein translated from At3g15240 (SEQ ID NO: 6) is not yet known.

SUG104候補遺伝子はAt2g47200(配列番号：７)である。At2g47200から合成されるタンパク質(配列番号：８)の機能もまだ知られていない。   The SUG104 candidate gene is At2g47200 (SEQ ID NO: 7). The function of the protein synthesized from At2g47200 (SEQ ID NO: 8) is not yet known.

光合成遺伝子発現における抑制因子群GCIM で生育した野生株由来緑カルスとCIMで生育した野生株由来白カルスを用いたマイクロアレイ実験において、白カルスにおいて8倍以上発現が上昇した遺伝子を93個見出した。これらの遺伝子は、光合成を行っていないカルスにおいて光合成を抑制している可能性がある。   In a microarray experiment using wild-derived green callus grown in the suppressor group GCIM and photosynthetic gene expression, and white strain-derived white callus grown in CIM, we found 93 genes whose expression was increased 8-fold or more in white callus. These genes may suppress photosynthesis in calli that are not photosynthesised.

（参考文献）
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本発明によれば、植物の光合成能を調節できるので、環境の浄化に有用な植物や、作物の生産性を向上させた植物などを作出することが可能となる。例えば、光合成能を増強させた植物は、光合成能力が高いため、光エネルギーを効率よく、作物の生産に利用することができる。また、植物が光合成を盛んに行うと、大気中の二酸化炭素を効率よく分解して、より多くの酸素を大気中に放出させることができるので、環境の浄化に有効である。   According to the present invention, since the photosynthetic ability of a plant can be adjusted, it is possible to produce a plant useful for environmental purification, a plant with improved crop productivity, and the like. For example, a plant with enhanced photosynthetic ability has high photosynthetic ability, so that light energy can be efficiently used for crop production. Moreover, when plants actively perform photosynthesis, carbon dioxide in the atmosphere can be efficiently decomposed and more oxygen can be released into the atmosphere, which is effective for environmental purification.

配列番号：１ SUG101 (At1g47510)
配列番号：２ SUG101
配列番号：３ SUG102 (AT1g61780)
配列番号：４ SUG102
配列番号：５ SUG103 (At3g15240)
配列番号：６ SUG103
配列番号：７ SUG104 (At2g47200)
配列番号：８ SUG104
配列番号：９〜９６ 合成プライマー SEQ ID NO: 1 SUG101 (At1g47510)
SEQ ID NO: 2 SUG101
SEQ ID NO: 3 SUG102 (AT1g61780)
SEQ ID NO: 4 SUG102
SEQ ID NO: 5 SUG103 (At3g15240)
SEQ ID NO: 6 SUG103
SEQ ID NO: 7 SUG104 (At2g47200)
SEQ ID NO: 8 SUG104
SEQ ID NO: 9-96 Synthetic primer

Claims (5)

(1) 配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
に係る遺伝子を欠損させる、光合成能を増強させた形質転換体を得るためのベクター。 (1) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity; or
(2) Deletion of a gene related to a polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity A vector for obtaining a transformant with enhanced photosynthetic ability. (1) 配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
にコードされるタンパク質の発現量を低下させる、光合成能を増強させた形質転換体を得るためのベクター。 (1) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity; or
(2) A protein encoded by a polynucleotide comprising a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity A vector for obtaining a transformant having an enhanced photosynthetic ability that reduces the expression level. 請求項１又は２に記載のベクターが導入された、光合成能を増強させた植物を作出するための形質転換体。 A transformant for producing a plant with enhanced photosynthetic ability, into which the vector according to claim 1 or 2 is introduced. (1) 配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
を植物細胞において欠損又は該ヌクレオチドの発現量を低減させる工程
を含む、光合成能が増強された形質転換体を得るための方法。 (1) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity; or
(2) A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity is deleted in plant cells A method for obtaining a transformant having enhanced photosynthetic ability, comprising a step of reducing the expression level of the nucleotide. (1) 配列番号：２のアミノ酸配列において、1〜数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；又は
(2) 配列番号：２のアミノ酸配列に対して９５%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ光合成抑制活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド
を植物細胞において欠損又は該ヌクレオチドの発現量を低減させる工程
を含む、光合成能を増強させる方法。
(1) a polynucleotide encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one to several amino acids are deleted, substituted, inserted and / or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity; or
(2) A polynucleotide containing a polynucleotide encoding a protein having an amino acid sequence having 95% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and having a photosynthetic inhibitory activity is deleted in plant cells A method for enhancing the photosynthetic ability, comprising a step of reducing the expression level of the nucleotide.
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