JP5719384B2 - ３ｄａｄｃｃｎｋｆａｃｓアッセイ - Google Patents

Description

本明細書において、リンパ腫細胞及びナチュラルキラー細胞から形成された三次元のスフェロイド又は凝集体に基づいた、新規な抗体依存性細胞傷害−ＦＡＣＳアッセイが報告される。このアッセイは、単一並びにハイスループット形式における治療用免疫グロブリンのインビト機能分析に有用である。

樹立された腫瘍細胞株の単層培養物は、基礎的腫瘍生物学の研究及び抗腫瘍薬の開発にしばしば使用されている。しかし、二次元のフラット培養モデルでは、３次元（３Ｄ）腫瘍構造の反映は不十分である。従って溶質拡散勾配のインビボでの開発に関連した特定の態様は、例えば、多細胞腫瘍スフェロイド又は凝集体モデルのような３次元培養系において研究されるのみである。腫瘍スフェロイド又は凝集体は、多細胞の層を介する拡散障壁のために制限された栄養供給により特徴付けられる無血管性腫瘍領域に良く似ている。

しかし、研究において３次元培養の広範な利用は、不便な生成及び取り扱いにより制限されている。従って、簡単かつ迅速な方法が、ハイスループット方式で懸濁培養における単一スフェロイド又は凝集体を生成するために開発された。同じ大きさで均質な球面形状を持つ単一スフェロイドは、９６ウェルプレートの均一なウェルに生成することができる。それは、化合物の取り扱い及びその後の分析のためのスフェロイドの回収について容易にアクセスできる標準培養形式である。均一な大きさと形状は、各スフェロイド又は凝集体においてほとんど同じ拡散勾配の開発を保証する(Ivascu, A. and Kubbies, M., J. Biomol. Screening 11 (2006) 922-932)。既知のスフェロイドの生成プロトコールは、マウス基底膜抽出物（ｒＢＭ）、スフェロイドの凝集体の圧縮を誘発する細胞外マトリックスタンパク質の混合物、の添加を含む。

Inami, K., et al. report antitumor activity of anti-C-ERC/mesothelin monoclonal antibody in vivo (Cancer Sci. 101 (2010) 969-974)。

３次元スフェロイド又は凝集体において腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞を組み合わせることで、免疫グロブリンの評価が、一方では、よりインビボ様とされ得、他方では、現在ではハイスループット解析に適している。

本明細書に報告される第一の態様は、抗体のエフェクター機能のインビトロ検出のための方法であって、腫瘍とナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体を免疫グロブリンとともにインキュベートする工程を含む。

一実施態様において、本方法は以下の工程を含む：
ａ）第１の蛍光色素を用いて腫瘍の標的細胞を標識し、
ｂ）ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞を混合し、
ｃ）マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり約１０^４細胞を添加し、
ｄ）マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元細胞スフェロイドの形成を開始し、
ｅ）マルチウェルプレートのウェルに免疫グロブリンを添加し、
ｆ）約２０時間から約７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
ｇ）第２の蛍光色素でウェルの死滅細胞を標識し、
ｉ）蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。

一実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、ヒトナチュラルキラー細胞であり、９０％以上の純度を有する。更なる実施態様において、ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞が１０：１から１：１０の割合で混合される。更なる実施態様において、その比は１：３から１：１０である。その他の実施態様において、その比は１：２から１：４である。一実施態様において、遠心分離は１００から１，０００ｒｐｍで１０分間である。更なる実施態様において、遠心分離は約１０００ｒｐｍである。一実施態様において、第２の蛍光色素は、ヨウ化プロピジウムである。一実施態様において、インキュベーションは約２０時間から約２８時間である。

一実施態様において、腫瘍細胞はリンパ腫細胞である。その他の実施態様において、リンパ腫細胞は、Ｒａｊｉ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、及びＺ１３８細胞を含む群から選択される。その他の実施態様において、抗体は、１００μｇ／ｍｌから０．００１μｇ／ｍｌのウェル中の最終濃度で添加される。更なる実施態様において、抗体は、２０μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌのウェル中の最終濃度で添加される。一実施態様において、抗体は、８μｇ／ｍｌから０１２μｇ／ｍｌのウェル中の最終濃度で添加される。

本明細書に報告される更なる態様は、多数の抗体と多数の腫瘍細胞のハイスループット解析のための、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体の使用である。

本明細書に報告されるその他の態様は、エフェクター機能を持つ抗体をインビトロで決定するための方法であり、以下を含む。
ａ）少なくとも一の抗体を提供し、
ｂ）第１の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識し、
ｃ）ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞を混合し、
ｄ）マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり約１０^４細胞を添加し、
ｅ）マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元細胞スフェロイドの形成を開始し、
ｆ）マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を添加し、
ｇ）約２０時間から約７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
ｈ）第２の蛍光色素と共にインキュベートしたウェルの各々の中の死滅細胞を標識し、
ｉ）蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートの各ウェルを分析し、
ｊ）エフェクター機能を有する抗体として、死細胞の生細胞に対する最高の比率、又は１以上の比率を有する抗体を決定する。

また本明細書に報告される態様は、キットであり、以下を含む：
ａ）第１の蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞、
ｂ）単離されたナチュラルキラー細胞、
ｃ）９６ウェルマルチウェルプレート、及び
ｄ）ヨウ化プロピジウム。

一実施態様において、マルチウェルプレートは、９６ウェルマルチウェルプレートである。

発明の詳細な記述
本明細書にて、三次元スフェロイド又は凝集体の共培養アッセイの使用に基づく細胞分析技術が報告され、ここでスフェロイド又は凝集体は、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。このアッセイは、単独並びにハイスループット形式における免疫グロブリンのインビト機能分析のための一実施態様において有用である。一実施態様において、３次元スフェロイド又は凝集体が、ＰｏｌｙＨＥＭＡ（ポリ（ヒドロキシエチルメタクリル）酸）でコートされた９６ウェル丸底マルチウェルプレートの各ウェルに配置される。更なる実施態様において、ＮＫ細胞は、正常な二倍体のヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一実施態様において、ＮＫ細胞は、負の選択手法を適用することにより、選択され、すなわち、細胞は選択工程中に触れられない（例えば、Horgan, K. et al., Curr. Prot. Immunol. (2009), Chapter 7, Unit 7.4. Immunomagnetic purification of T cell subpopulations, and Neurauter, A.A., et al., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 106 (2007) 41-73を参照)。死細胞の正しい割合を定量することは、これらのＮＫ細胞を用いることで可能であることが判明している。

腫瘍生物学の分野のインビトロ実験のほとんどは、単層培養で行われているが、これらが簡単で、取り扱いが便利であるためである。しかしながら、それらは異なる機能を研究するための貴重なモデルを提供するもの、単層培養においては、間質成分、細胞外マトリックス及び２次元（２Ｄ）培養物及び３次元（３Ｄ）の固形腫瘍の間の基本的な形状の差異の欠如に起因する腫瘍病理を反映が不十分である。細胞の三次元組織は、例えば細胞の分化、増殖及び生存に影響を与えるホルモン、成長因子、及び栄養素の分布と機能に関連した、細胞間および細胞−マトリックス相互作用の複雑なネットワークを提供する。

一実施態様において、凝集体からの３次元スフェロイドの生成のための方法は、培養培地への、ＥＳＨ（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ）マウス腫瘍（ｒＢＭ、マトリゲル^ＴＭ）から派生した再構成基底膜マトリックス、コラーゲン、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン（ナイドジェン）及びプロテオグリカンなどの細胞外マトリックス成分を含むタンパク質性ゲルの添加を含む。三次元構造は、腫瘍細胞の、線維芽細胞、免疫細胞及び内皮細胞との共培養を可能にし、インビトロでの腫瘍／ストロマ作用効果の調査を可能とする (Friedrich, J., et al., Int. J. Radiat. Biol. 83 (2007) 849-871)。

スピナー(Sutherland, R.M. and Durand, R.E., Recent Results Cancer Res. 95 (1984) 24-49)及びジャイレトリー回転法 (Moscona, A., Exp. Cell Res. 22 (1961) 455-475)において、トリプシン処理した細胞が、磁気攪拌機を備えた培養容器内に配置され、基質への細胞接着を阻害し、細胞間接着を有利にしている。より最近開発された技術では、スフェロイドが、反転したマイクロプレートのハンギングドロップで増殖される(Kelm, J.M., et al., Biotechnol. Bioeng. 83 (2003) 173-180)。しかし、すべてのこれらの方法は、長い培養時間、不均等サイズのスフェロイドの形成、又は困難な機械的接近性の何れかにより制限される。加えて、懸濁培養では、多くの腫瘍細胞株は、３次元の小型スフェロイドで成長が悪い(Mueller-Klieser, W., Crit. Rev. Oncol. Hematol. 36 (2000) 123-139)。

研究においてハイスループット形式でのスフェロイド又は凝集体の使用は、その後の生化学的または細胞分析のために簡単にアクセス可能であるマルチウェルプレートフォーマット中に、同様の拡散勾配と細胞の生理機能を持つ均質なサイズのスフェロイドを迅速に生成する標準化されたプロトコルを必要とする。更にそのようなプロトコルは、さまざまな種類の腫瘍細胞株に適用可能であるべきである。

この必要性は、本明細書で報告される方法で達成することができることが見出されている。従って、本明細書で報告される一態様は、抗体のエフェクター機能の検出のためのアッセイであり、以下を含む。
ａ）緑色蛍光団ＣＭＦＤＡ（５−クロロメチルフルオレセインジアセテート）でリンパ腫（標的）細胞を標識し、
ｂ）９０％以上の純度で、一実施態様では、ヒトの血液からヒト正常ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を単離し、
ｃ）１：１０から１０：１の比率でＮＫ細胞及びリンパ腫標的細胞を混合し、
ｄ）マルチウェルプレートの若干のウェル又は全てのウェルの２００μｌあたり約１０^４細胞を添加し、
ｅ）マルチウェルプレートを遠心分離し、
ｆ）マルチウェルプレートのウェルに目的の免疫グロブリンを添加し、
ｇ）マルチウェルプレートを最大７２時間、一実施態様では、２０時間から７２時間インキュベートし、
ｈ）ウェルにヨウ化プロピジウムを添加し、及び
ｉ）ＦＡＣＳによりマルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析する。

リンパ腫細胞及びナチュラルキラー細胞の組み合わせにより、感受性の抗体依存性細胞傷害アッセイを提供することができることが見出されている。一実施態様において、抗体のエフェクター機能の検出は、抗体の抗体依存性細胞傷害の検出又は決定である。さらに、腫瘍及び免疫エフェクター機能細胞の三次元アッセイのセットアップもまた有利である。一実施態様において、本明細書で報告された方法は、インビトロの方法である。その他の実施態様において、腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞の混合は、三次元スフェロイドの形成をもたらす。

図１及び２において、ＦＡＣＳにより分析された生細胞及び死細胞の分布が示される。図１ａは、ＣＭＦＤＡで標識され、ＦＡＣＳ分析によって決定された生存Ｒａｊｉ細胞及び死滅Ｒａｊｉ細胞の分布を示している。生存Ｒａｊｉ細胞はＦＡＣＳ図の右下の部分に配置されている。図１ｂおよび１ｃは、添加された抗体の非存在下でのＲａｊｉ細胞とナチュラルキラー細胞の共培養の生細胞と死細胞の分布を示す。生存ナチュラルキラー細胞がＦＡＣＳ図の左下部に配置され、生存Ｒａｊｉ細胞がＦＡＣＳ図の右下部に配置され、死滅ナチュラルキラー細胞がＦＡＣＳ図の左上部に配置され、及び死滅Ｒａｊｉ細胞がＦＡＣＳ図の右上部に配置されている。図１ｂ（Ｒａｊｉ細胞のＮＫ細胞に対するの比が１：１）および１ｃ（Ｒａｊｉ細胞のＮＫ細胞に対するの比が１：１０）から、抗体の非存在下でナチュラルキラー細胞に対するＲａｊｉ細胞の比に関係無く、生存リンパ腫細胞及び死滅リンパ腫細胞のそれぞれの割合は有意に変化しない。

図２ａは、抗体とのインキュベーション後の生存Ｒａｊｉ細胞及び死滅Ｒａｊｉ細胞のＦＡＣＳ分析を示す。図１ａのＦＡＣＳ図と比較すると、Ｒａｊｉ細胞を抗体のみでインキュベートすることによって、死滅細胞の割合が、抗体の直接的な細胞死誘導機能により増加することが分かる。ＮＫ細胞の存在下で、死滅Ｒａｊｉ細胞の数は、ＡＤＣＣエフェクター機能のためさらに増加する（右上のクラスタ：図２ｂのＲａｊｉ／ＮＫ比が１：１及び図２ｃのＲａｊｉ／ＮＫ比が１：１０）。ナチュラルキラー細胞の添加により、アッセイの感度を増加させることができることが分かる。

一実施態様では、アッセイにおいて、マルチウェルプレートを１０分間、１０００ｇで遠心分離する。遠心中に各ウェル内のすべての細胞がウェルの底にペレット化される。このことは、各ウェル内の単一のスフェロイド叉は凝集体の形成の開始のための等しい細胞数を保証する。

図３に、アッセイにおける個々の成分、すなわちＲａｊｉ細胞、ナチュラルキラー細胞及び抗体の添加順序の効果が示されている。これらの３つのすべての成分の添加は、並行して、わずかだが有意差無く、より高い細胞死の比率を生じたことが分かる。しかし、インビボの状況をより密接に模倣するために、一実施態様では、アッセイは、試験されるべき抗体を添加する前に、リンパ腫−ＮＫ細胞の３次元スフェロイド又は凝集体の形成を含む。

本明細書中に報告されているように、アッセイは、任意の腫瘍（ターゲット）細胞を用いて行うことができる。一実施態様において、腫瘍細胞はリンパ腫細胞である。更なる実施態様において、リンパ腫細胞は、Ｒａｊｉ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、及びＺ１３８細胞から選択される。

一実施態様において、粘着して成長している癌又は肉腫細胞を腫瘍細胞として使用する場合、３次元スフェロイドの形成は、液体再構成基底膜（ｒＢＭ）の存在下で行われる。一実施態様において、２．５％ｒＢＭ（ｖ／ｖ）の濃度が使用される。この実施態様において、すべての細胞が丸い形状を持つ１つの異なるスフェロイドに組み込まれた。形成及び圧縮は培養時間の２４時間後に完了した。従って、一実施態様において、インキュベーションは約２０時間から約２８時間である。ｒＢＭの低濃度のスフェロイドにすべての細胞の取り込みを確保しておらず、高濃度では、スフェロイドの丸い形状を損なう。１０分後、遠心分離工程では、ウェル内の全ての細胞が１つの平坦なペレットに組み込まれる。３時間後、ある程度の圧縮が、ＲＢＭの存在下および非存在下で明らかになる。ｒＭＢ無しでは、６時間と２４時間後に、凝集体の更なる引き締めは見られなかった。一実施態様において、腫瘍細胞はＲａｊｉ細胞であり、ｒＢＭは、本方法の全工程において存在しない。

一実施態様において、５０００細胞が１０％ＦＣＳ（ウシ胎仔血清）及び２．５％ｒＢＭ（ｖ／ｖ）を含むＲＰＭＩ１６４０中で遠心分離した。スフェロイドのサイズを、２４時間の培養期間の後に分析した。全てのスフェロイドは形状が規則的で、均一な丸い形状を提示し、狭いサイズ変動を示す。

図４において、本明細書で報告されるように、アッセイは異なるリンパ腫腫瘍（ターゲット）細胞株と、異なる抗体濃度で行われる。本明細書で報告されるように、アッセイは同じ効率で異なるリンパ腫細胞株を用いて行うことができることが分かる。更に、アッセイは１０μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌの抗体濃度で行うことができることが分かる。従って、一実施態様では、本明細書で報告されるアッセイは、０．１μｇ／ｍｌから１５μｇ／ｍｌの濃度で抗体を添加すること、更なる実施態様では、８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの濃度で抗体を添加することを含む。

図５に、本明細書中で報告されているように、ナチュラルキラー細胞に対するリンパ腫細胞の比率に応じてアッセイの感度が表示される。ナチュラルキラー細胞に対するリンパ腫（ターゲット）細胞の比率が１：１から１：１０は、ＮＫ細胞のＡＤＣＣエフェクター機能を示すことが分かる。従って、一実施態様では、ナチュラルキラー細胞のリンパ腫細胞の比率は１：１から１：１０であり、その他の実施態様では、１：３から１：１０であり、更なる実施態様では、１：２から１：４である。

本明細書で報告したようなアッセイにより、狭いサイズ分布と均質な球形状を持つ単一の三次元スフェロイド又は凝集体が、単一ウェル叉はマルチウェルプレートの複数のウェルに、２４時間の培養期間中に並行して、産生させることができる。これは、化合物の取り扱い及びその後の分析のためのスフェロイドの回収について容易にアクセスできる標準培養形式であり得ることが示されている。スフェロイド又は凝集体のほとんど均一な大きさと形状は、各スフェロイドにおける類似した拡散勾配の発生を保証する。従って、本明細書で報告される１つの態様は、上記で概説したようなアッセイを含む、自動化又はハイスループットアッセイである。スフェロイドの生成プロトコールは、マウス基底膜抽出物（ｒＢＭ）、スフェロイドの凝集体の圧縮を誘発する細胞外マトリックスタンパク質の混合物、の添加を含む。

図６に、３次元スフェロイドの生成のための典型的なスキームが示されている。

本明細書に、腫瘍とナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体を抗体とともにインキュベートすることを含む、抗体のエフェクター機能のインビトロ検出のための方法が報告される。

一実施態様において、本方法は以下の工程を含む：
− ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
− マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり約１０^４細胞を添加し、
− マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
− マルチウェルプレートのウェルに免疫グロブリンを添加し、
− 約２０時間から約７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。

更なる実施態様において、本方法は、以下の工程を第一工程として更に包含する：
− 第１の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識する。

その他の実施態様において、本方法は以下の工程を含む：
− 第２の蛍光色素を用いて死細胞を標識し、及び
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。

一実施態様において、ナチュラルキラー細胞は、ヒトナチュラルキラー細胞である。また一実施態様において、ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞が１０：１から１：１０の割合で混合される。更なる実施態様において、その比は１：２から１：４である。

一実施態様において、インキュベーションは約２０時間から約２８時間である。

一実施態様において、遠心分離は１，０００ｒｐｍで１０分間である。

一実施態様において、腫瘍細胞はリンパ腫細胞である。更なる実施態様において、リンパ腫細胞は、Ｒａｊｉ細胞、又はＳＵ−ＤＨＬ４細胞、又はＺ１３８細胞である。

一実施態様において、抗体は、１５μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加される。その他の実施態様において、抗体は、８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの濃度で添加される。

本明細書に報告されるその他の態様は、多数の抗体と多数の腫瘍細胞との組合わせのエフェクター機能の決定のための、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体の使用である。

本明細書に報告される更なる態様は、エフェクター機能を持つ抗体をインビトロで決定するための方法であり、以下の工程を含む。
− ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
− マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり約１０^４細胞を添加し、
− マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
− マルチウェルプレートの個々のウェルに抗体を添加し、
− 約２０時間から約７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、及び
− エフェクター機能を有する抗体として、生存細胞に対する死細胞の比率を持つ抗体を決定する。

一実施態様において、本方法は加えて以下の第一工程を含む：
− 少なくとも一の抗体を提供し、及び
− 第１の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識する。
その他の実施態様において、本方法は以下の工程を含む：
− マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を追加し、各ウェルに、最大で１つの抗体が添加され、
− 第２の蛍光色素と共にインキュベートしたウェルの各々の中の死滅細胞を標識し、
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートの各ウェル中の細胞を分析し、
− エフェクター機能を有する抗体として、生存細胞に対する死細胞の最高比率を持つ抗体を決定する。

本明細書に報告されるアッセイ及び方法は、国際公開第２００５／０４４８５９（参照により本明細書に援用される）に報告される抗ＣＤ２０抗体に例示される。この抗体は、本発明を例示するためだけに選ばれており、制限として解釈されるべきではない。本発明の範囲は特許請求の範囲に記載される。

以下の実施例及び図面は、本発明、添付の特許請求の範囲に記載されているの真の範囲、の理解を助けるために提供される。変更は、本発明の精神を逸脱することなく、記載された手順で行うことができることが理解される。

抗体の非存在下で生存細胞と死滅Ｒａｊｉ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＦＡＣＳ分析。象限：左下：生存ＮＫ細胞、左上：死滅ＮＫ細胞、右下：生存Ｒａｊｉ細胞細胞、右上：死滅Ｒａｊｉ細胞。パネルＡ：Ｒａｊｉ細胞細胞のみ、パネルＢ：１：１の比率でのＲａｊｉ細胞とＮＫ細胞、パネルＣ：１：１０のＲａｊｉ細胞とＮＫ細胞。 添加された抗ＣＤ２０抗体（１０μｇ／ｍｌ）の非存在下での生存細胞と死滅Ｒａｊｉ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のＦＡＣＳ分析。象限：左下：生存ＮＫ細胞、左上：死滅ＮＫ細胞、右下：生存Ｒａｊｉ細胞細胞、右上：死滅Ｒａｊｉ細胞。パネルＡ：Ｒａｊｉ細胞細胞のみ、パネルＢ：１：１の比率でのＲａｊｉ細胞とＮＫ細胞、パネルＣ：１：１０の比率でのＲａｊｉ細胞とＮＫ細胞。 リンパ腫細胞、ＮＫ細胞、抗体適用スケジュールの変化によるリンパ腫／スフェロイド凝集体の共培養の最適化。リンパ腫細胞：Ｒａｊｉ細胞。 抗ＣＤ２０抗体濃度の関数としての、ＮＫ細胞の存在下での生存リンパ腫細胞の割合。パネルＡ：Ｒａｊｉ細胞、パネルＢ：ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、パネルＣ：Ｚ１３８細胞。リンパ腫細胞に対するＮＫ細胞の比（Ｅ：Ｔ比）は３：１。 エフェクター（ＮＫ）：標的（リンパ腫）の比の関数としての、抗ＣＤ２０抗体濃度の存在下での生存リンパ腫細胞の割合。パネルＡ：Ｒａｊｉ細胞、パネルＢ：ＳＵ−ＤＨＬ４細胞、パネルＣ：Ｚ１３８細胞。抗ＣＤ２０抗体濃度：１０μｇ／ｍｌ。 概略的な例示的方法。 Ｒａｊｉ細胞のみ及び精製ＮＫ細胞と共培養したＲａｊｉ細胞の顕微鏡画像。

実施例１
材料と方法

細胞株：
Ｒａｊｉ細胞、ＳＵ−ＤＨＬ４細胞及びＺ１３８細胞株は、ＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）、ＤＳＭＺ（ブラウンシュヴァイク、ドイツ）、及びＭ．Ｄｙｅｒ教授（レスター大学、英国）からそれぞれ入手した。加湿インキュベーター中３７℃で、１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号１０５００−０６４）とペニシリン／ストレプトマイシン（Ｒｏｃｈｅ社、カタログ番号１１０７４４４０００１）を補充されて、Ｒａｊｉ細胞およびＳＵ−ＤＨＬ４細胞は、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ， カタログ番号Ｐ０４−１８５００）中で、Ｚ１３８はＤＭＥＭ培地（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ，カタログ番号Ｐ０４−０２５００）中で培養された。９０％以上の細胞生存率を有する対数増殖期細胞が、ＮＫ細胞の共培養実験に使用された。

ＮＫ細胞の生成：
通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれた（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号３６８４８４）。ＰＢＭＣはフィコールの調製によって得られた（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号Ｐ０４−６０１２５）。ＮＫ細胞を触れずに残すために、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞と負の選択キットを用いて精製した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ，カタログ番号１３０−０９２−６５７）。短く言えば、フィコールで単離されたＰＢＭＣが、１ｘ１０^７細胞／４０μｌでＭＡＣＳバッファーに再懸濁された。１０μｌのＮＫ細胞ビオチン抗体カクテルが細胞に添加され、４℃で１０分間インキュベートされ、その後３０μｌのＭＡＣＳバッファーが添加された。その後、２０μｌのＮＫ細胞マイクロビーズカクテルが細胞に添加され、４℃で１５分間インキュベートされ、２ｍｌのＭＡＣＳバッファーが添加され、細胞は１０分間３００ｇで遠心分離された。ペレットは５００μｌのＭＡＣＳバッファーに再懸濁され、５００μｌのＭＡＣＳバッファーで先に平衡化された分離カラム上にロードされた。カラムは続いて５００μｌのＭＡＣＳバッファーで３回洗浄され、ＣＡＳＹ細胞カウンター（Ｓｃｈａｅｒｆｅ Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して全溶出中で決定された。

ＮＫ細胞調製物の純度は、一定分量のＭＡＣＳ溶出液を染色することによって決定した。短く言えば、約２ｘ１０^５細胞が１００μｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳに再懸濁され、抗ＣＤ５６ＰＥ抗体及び抗ＣＤ３ＦＴＩＣ抗体の各々１０μｌで（各々はＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号５５５５１６及び５５５３３９）４℃で１５分間染色された。その後、２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳが細胞に添加され、４００ｇで５分間遠心分離された。ペレットは０．５ｍｌのＲＰＭＩ１６４０／１０％ＦＣＳに再懸濁され、リンパ球散乱ゲート内のＣＤ５６陽性だがＣＤ３陰性である細胞画分の割合が、ＦＡＣＳスキャン又はＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ測定器を用いて分析された（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）。

単球の精製：
通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれた（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，カタログ番号３６８４８４）。ＰＢＭＣはフィコールの調製によって得られた（ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ カタログ番号Ｐ０４−６０１２５）。単球を触れずに残すために、単球は、負の選択、単球濃縮キット（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号１９０５９）を用いて精製された。

リンパ腫細胞のＣＭＦＤＡ染色：
ＣＭＦＤＡ凍結乾燥物（インビトロジェン、カタログ番号Ｃ７０２５）がＤＭＳＯに再懸濁され、１０ｍＭストック溶液を得た。１×１０^６リンパ腫細胞が、１μＭのＣＭＦＤＡを補った１ｍｌの完全培地中、３０分間、３７℃でインキュベートされた。その後、細胞は、ペレット化され、完全培地で一回洗浄し、最終的に１×１０^６細胞／ｍｌで完全培地中に再懸濁した。

実施例２
リンパ腫細胞株からの３Ｄスフェロイド／凝集体の生成
リンパ腫細胞数がＣＡＳＹ測定器（Ｓｃｈａｅｒｆｅ−Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ）を用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に２．５×１０^４細胞／ｍｌ（スフェロイド／凝集体あたり５０００細胞）及び５×１０^４細胞／ｍｌ（スフェロイド／凝集体あたり１００００細胞）に希釈された。細胞懸濁液の容積２００μｌが、丸底（コーニング社、ニューヨーク、米国）または円錐形底（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，オランダ）の９６ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは９５％エタノール（ｖ／ｖ）中の０．５％ｐｏｌｙＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、ドイツ）５０μｌでプレコーティングされ、３日間３７℃で空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機５８１０（エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて、１０分間１，０００ｇでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、３７℃、７％ＣＯ２で、標準的な細胞培養条件下で培養した。

実施例３
固形腫細胞株からの３Ｄスフェロイド／凝集体の生成
単層細胞は単一の細胞懸濁液を生成するためにＡｃｃｕｔａｓｅ（ＰＡＡラボラトリーズ社、インスブルック、オーストリア）で分離された。細胞数がＣＡＳＹ測定器（Ｓｃｈａｅｒｆｅ−Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ）を用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に２．５×１０^４細胞／ｍｌ（スフェロイド／凝集体あたり５０００細胞）及び５×１０^４細胞／ｍｌ（スフェロイド／凝集体あたり１００００細胞）に希釈された。ｒＢＭは一晩氷上で解凍され、細胞懸濁液に氷冷ピペットチップで２．５％の最終濃度（ｖ／ｖ）で添加した。細胞懸濁液の容積２００μｌが、丸底（コーニング社、ニューヨーク、米国）または円錐形底（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，オランダ）の９６ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは９５％エタノール中の０．５％ｐｏｌｙＨＥＭＡ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ、ドイツ）５０μｌでプレコーティングされ、３日間３７℃で空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機５８１０（エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ、ドイツ）を用いて、１０分間１，０００ｇでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、３７℃、７％ＣＯ２で、標準的な細胞培養条件下で培養した。

実施例４
凝集体／スフェロイドリンパ腫／ＮＫの共培養および抗体とのインキュベーション
細胞の共培養と抗体添加の順序は変えることができる。典型的な共培養実験では、リンパ腫細胞（ＣＭＦＤＡで標識）およびＮＫ細胞が、６穴プレートで示されるような比率で混合された。例えば、Ｅ：Ｔ（リンパ腫細胞に対するＮＫ細胞）の比率が３：１は３＋１の混合（例えば、７５％ＮＫ細胞と２５％のリンパ腫細胞）に対応する。２００μｌの細胞懸濁液がｐｏｌｙＨＥＭＡで被覆された９６ウェルＶ字プレートの単一ウェルに添加された（Ｎｕｎｃ，カタログ番号２４９６６２）。ＰｏｌｙＨＥＭＡコーティング：９５％エタノール中の０．５％ポリＨＥＭＡがウェルあたり５０μｌ；３７℃で７２時間乾燥（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，カタログ番号１８８９４）。プレートを１，０００ｇで１０分間遠心分離した。その後抗体は上記の濃度で添加され、細胞凝集体／スフェロイドは、加湿インキュベーターで３７℃、７％ＣＯ２でインキュベートした。ＮＫ細胞以外の免疫細胞との腫瘍細胞の３Ｄ共培養を説明するために、Ｒａｊｉ細胞のみと精製ＮＫ細胞と共培養されたＲａｊｉ細胞の顕微鏡画像、並びに共培養されたＲａｊｉ細胞と単球細胞の画像が図７に示されている。

実施例５
生存細胞と細胞死の解析
実施例２及び３で説明したように、スフェロイド／凝集体は１０，０００細胞を用いて生成され、抗体と共にインキュベートした。生存リンパ腫腫瘍細胞の同定は以下の通りであった：同一の実験条件を表す個々のウェルからの個々の凝集体がプールされ、ピペッティングにより解離され、１０分間、３００ｇで遠心分離した。個々のスフェロイドがプールされ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄され、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液に再懸濁され、３７℃でインキュベートされた。５分おきに、スフェロイド／凝集体がピペッティングして再懸濁され、解離は５分から１５分以内に完了した。細胞は完全培地を用いて洗浄され、遠心分離され、細胞ペレットは完全培地中に再懸濁し、ヨウ化プロピジウムが１μｇ／ｍｌの濃度で添加された（シグマ社、カタログ番号Ｐ４１７０）。蛍光分析は、ＦＡＣＳ分析（ベクトン・ディッキンソン、Ｃａｎｔｏ ＩＩ測定器）によって行われた。

図１ｂに示すように、生存リンパ腫細胞を同定した。ＰＩ及びＣＭＦＤＡ陽性細胞の右上の象限は死滅リンパ腫細胞を表し、ＰＩ陰性だがＣＭＦＤＡ陽性細胞の右下の象限は生存リンパ腫の腫瘍標的細胞画分を表す。左下の象限は生存ＮＫ細胞であり、一方死滅ＮＫ細胞は左上の象限に位置している。

代替設定では、アポトーシスアッセイを行うことができる。実施例２及び３で説明したように、スフェロイド／凝集体は１０，０００細胞を用いて生成され、抗体と共にインキュベートした。アポトーシスの解析では、スフェロイド／凝集体は、９６ウェル円錐底プレートに移され、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１回洗浄し、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液に再懸濁され、３７℃でインキュベートされた。５分おきに、スフェロイド／凝集体はピペッティングして再懸濁され、解離は、５分から１５分以内で完了した。８つのスフェロイド／凝集体からの単一細胞懸濁液がプールされ、補充した２ｍＭのＣａＣｌ_２（アネキシンＶ−ｆｌｕｏｓ染色キット、ロシュ・ダイアグノスティックス社、マンハイム、ドイツ）の存在下で、アネキシンＶ−ｆｌｕｏｓ及びヨウ化プロピジウムで染色された。１０，０００個の細胞の蛍光が、フローサイトメーター（ＦＡＣＳスキャン測定器、ベクトン・ディッキンソン、サンノゼ、カリフォルニア州、米国）を用いて取得された。象限の統計に、左下の象限に位置する生存細胞の数が、ドットプロット上に適用された。

死滅細胞と生存細胞の絶対数を得るために、スフェロイド／凝集体からの総細胞数は、フックス・ローゼンタール・細胞計数チャンバーを用いて計数し、アネキシンＶ−ｆｌｕｏｓ／ＰＩ染色から決定され、同一のスフェロイド／凝集体の生存細胞又は死滅細胞の割合が乗じられた。

Claims (14)

1. 腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体を抗体とともにインキュベートすることを含む、抗体のエフェクター機能のインビトロ検出のための方法。
2. （ａ）ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
   （ｂ）マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり１０^４細胞を添加し、
   （ｃ）マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
   （ｄ）マルチウェルプレートのウェルに抗体を添加し、
   （ｅ）２０時間から７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
   （ｆ）蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する
   工程を含む、請求項１に記載の方法。
3. ナチュラルキラー細胞がヒトのナチュラルキラー細胞であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞が１０：１から１：１０の比率で混合されることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の方法。
5. ナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞に対する比率が２：１から４：１であることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. インキュベーションが２０時間から２８時間であることを特徴とする、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
7. 遠心分離が１０００ｒｐｍで１０分間であることを特徴とする、請求項２から６の何れか一項に記載の方法。
8. 腫瘍細胞がリンパ腫細胞であることを特徴とする、請求項１から７の何れか一項に記載の方法。
9. リンパ腫細胞が、Ｒａｊｉ細胞、又はＳＵ−ＤＨＬ４細胞、又はＺ１３８細胞であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 抗体が１５μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項２から９の何れか一項に記載の方法。
11. 抗体が８μｇ／ｍｌから１２μｇ／ｍｌの濃度で添加されることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
12. 多数の抗体と多数の腫瘍細胞との組合わせのエフェクター機能の決定のための、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む３次元スフェロイド又は凝集体の使用。
13. （ａ）ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
    （ｂ）マルチウェルプレートのウェルに２００μｌあたり１０^４細胞を添加し、
    （ｃ）マルチウェルプレートを遠心分離することにより、３次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
    （ｄ）マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を添加し、
    （ｅ）２０時間から７２時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、及び
    （ｆ）エフェクター機能を有する抗体として、死細胞の生細胞に対する１を超える比率を有する抗体を決定する
    ことを含むエフェクター機能を持つ抗体をインビトロで決定するための方法。
14. （ａ）蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞、
    （ｂ）単離されたナチュラルキラー細胞、
    （ｃ）９６ウェルマルチウェルプレート、及び
    （ｄ）ヨウ化プロピジウム
    を含む、抗体のエフェクター機能をインビトロで検出するためのキットであって、
    （ａ）蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞と（ｂ）単離されたナチュラルキラー細胞とが混合されて３次元スフェロイド又は凝集体を形成する、キット。