JP5719384B2 - 3dadccnkfacsアッセイ - Google Patents
3dadccnkfacsアッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP5719384B2 JP5719384B2 JP2012552346A JP2012552346A JP5719384B2 JP 5719384 B2 JP5719384 B2 JP 5719384B2 JP 2012552346 A JP2012552346 A JP 2012552346A JP 2012552346 A JP2012552346 A JP 2012552346A JP 5719384 B2 JP5719384 B2 JP 5719384B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- antibody
- natural killer
- cell
- tumor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/4915—Blood using flow cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
- G01N33/5017—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity for testing neoplastic activity
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
- G01N33/5047—Cells of the immune system
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Ecology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
a)第1の蛍光色素を用いて腫瘍の標的細胞を標識し、
b)ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞を混合し、
c)マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、
d)マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元細胞スフェロイドの形成を開始し、
e)マルチウェルプレートのウェルに免疫グロブリンを添加し、
f)約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
g)第2の蛍光色素でウェルの死滅細胞を標識し、
i)蛍光活性化細胞選別(FACS)により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。
a)少なくとも一の抗体を提供し、
b)第1の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識し、
c)ナチュラルキラー細胞と腫瘍標的細胞を混合し、
d)マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、
e)マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元細胞スフェロイドの形成を開始し、
f)マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を添加し、
g)約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
h)第2の蛍光色素と共にインキュベートしたウェルの各々の中の死滅細胞を標識し、
i)蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートの各ウェルを分析し、
j)エフェクター機能を有する抗体として、死細胞の生細胞に対する最高の比率、又は1以上の比率を有する抗体を決定する。
a)第1の蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞、
b)単離されたナチュラルキラー細胞、
c)96ウェルマルチウェルプレート、及び
d)ヨウ化プロピジウム。
本明細書にて、三次元スフェロイド又は凝集体の共培養アッセイの使用に基づく細胞分析技術が報告され、ここでスフェロイド又は凝集体は、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む。このアッセイは、単独並びにハイスループット形式における免疫グロブリンのインビト機能分析のための一実施態様において有用である。一実施態様において、3次元スフェロイド又は凝集体が、PolyHEMA(ポリ(ヒドロキシエチルメタクリル)酸)でコートされた96ウェル丸底マルチウェルプレートの各ウェルに配置される。更なる実施態様において、NK細胞は、正常な二倍体のヒトナチュラルキラー(NK)細胞である。一実施態様において、NK細胞は、負の選択手法を適用することにより、選択され、すなわち、細胞は選択工程中に触れられない(例えば、Horgan, K. et al., Curr. Prot. Immunol. (2009), Chapter 7, Unit 7.4. Immunomagnetic purification of T cell subpopulations, and Neurauter, A.A., et al., Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 106 (2007) 41-73を参照)。死細胞の正しい割合を定量することは、これらのNK細胞を用いることで可能であることが判明している。
a)緑色蛍光団CMFDA(5−クロロメチルフルオレセインジアセテート)でリンパ腫(標的)細胞を標識し、
b)90%以上の純度で、一実施態様では、ヒトの血液からヒト正常ナチュラルキラー(NK)細胞を単離し、
c)1:10から10:1の比率でNK細胞及びリンパ腫標的細胞を混合し、
d)マルチウェルプレートの若干のウェル又は全てのウェルの200μlあたり約104細胞を添加し、
e)マルチウェルプレートを遠心分離し、
f)マルチウェルプレートのウェルに目的の免疫グロブリンを添加し、
g)マルチウェルプレートを最大72時間、一実施態様では、20時間から72時間インキュベートし、
h)ウェルにヨウ化プロピジウムを添加し、及び
i)FACSによりマルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析する。
− ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
− マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、
− マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
− マルチウェルプレートのウェルに免疫グロブリンを添加し、
− 約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。
− 第1の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識する。
− 第2の蛍光色素を用いて死細胞を標識し、及び
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する。
− ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
− マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり約104細胞を添加し、
− マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
− マルチウェルプレートの個々のウェルに抗体を添加し、
− 約20時間から約72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、及び
− エフェクター機能を有する抗体として、生存細胞に対する死細胞の比率を持つ抗体を決定する。
− 少なくとも一の抗体を提供し、及び
− 第1の蛍光色素を用いて腫瘍細胞を標識する。
その他の実施態様において、本方法は以下の工程を含む:
− マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を追加し、各ウェルに、最大で1つの抗体が添加され、
− 第2の蛍光色素と共にインキュベートしたウェルの各々の中の死滅細胞を標識し、
− 蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートの各ウェル中の細胞を分析し、
− エフェクター機能を有する抗体として、生存細胞に対する死細胞の最高比率を持つ抗体を決定する。
材料と方法
Raji細胞、SU−DHL4細胞及びZ138細胞株は、ATCC(マナッサス、バージニア州、米国)、DSMZ(ブラウンシュヴァイク、ドイツ)、及びM.Dyer教授(レスター大学、英国)からそれぞれ入手した。加湿インキュベーター中37℃で、10%FCS(Gibco社、カタログ番号10500−064)とペニシリン/ストレプトマイシン(Roche社、カタログ番号11074440001)を補充されて、Raji細胞およびSU−DHL4細胞は、RPMI1640培地(PAN Biotech, カタログ番号P04−18500)中で、Z138はDMEM培地(PAN Biotech,カタログ番号P04−02500)中で培養された。90%以上の細胞生存率を有する対数増殖期細胞が、NK細胞の共培養実験に使用された。
通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれた(Becton Dickinson,カタログ番号368484)。PBMCはフィコールの調製によって得られた(PAN Biotech カタログ番号P04−60125)。NK細胞を触れずに残すために、NK細胞は、NK細胞と負の選択キットを用いて精製した(Miltenyi,カタログ番号130−092−657)。短く言えば、フィコールで単離されたPBMCが、1x107細胞/40μlでMACSバッファーに再懸濁された。10μlのNK細胞ビオチン抗体カクテルが細胞に添加され、4℃で10分間インキュベートされ、その後30μlのMACSバッファーが添加された。その後、20μlのNK細胞マイクロビーズカクテルが細胞に添加され、4℃で15分間インキュベートされ、2mlのMACSバッファーが添加され、細胞は10分間300gで遠心分離された。ペレットは500μlのMACSバッファーに再懸濁され、500μlのMACSバッファーで先に平衡化された分離カラム上にロードされた。カラムは続いて500μlのMACSバッファーで3回洗浄され、CASY細胞カウンター(Schaerfe System)を使用して全溶出中で決定された。
通常の健康なドナーから全血がバキュテイナチューブ中へと取り除かれた(Becton Dickinson,カタログ番号368484)。PBMCはフィコールの調製によって得られた(PAN Biotech カタログ番号P04−60125)。単球を触れずに残すために、単球は、負の選択、単球濃縮キット(Stem Cell Technologies,カタログ番号19059)を用いて精製された。
CMFDA凍結乾燥物(インビトロジェン、カタログ番号C7025)がDMSOに再懸濁され、10mMストック溶液を得た。1×106リンパ腫細胞が、1μMのCMFDAを補った1mlの完全培地中、30分間、37℃でインキュベートされた。その後、細胞は、ペレット化され、完全培地で一回洗浄し、最終的に1×106細胞/mlで完全培地中に再懸濁した。
リンパ腫細胞株からの3Dスフェロイド/凝集体の生成
リンパ腫細胞数がCASY測定器(Schaerfe−Systems,Reutlingen)を用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に2.5×104細胞/ml(スフェロイド/凝集体あたり5000細胞)及び5×104細胞/ml(スフェロイド/凝集体あたり10000細胞)に希釈された。細胞懸濁液の容積200μlが、丸底(コーニング社、ニューヨーク、米国)または円錐形底(Nunc,Roskilde,オランダ)の96ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは95%エタノール(v/v)中の0.5%polyHEMA(Polysciences社、Eppelheim、ドイツ)50μlでプレコーティングされ、3日間37℃で空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機5810(エッペンドルフAG、ハンブルグ、ドイツ)を用いて、10分間1,000gでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、37℃、7%CO2で、標準的な細胞培養条件下で培養した。
固形腫細胞株からの3Dスフェロイド/凝集体の生成
単層細胞は単一の細胞懸濁液を生成するためにAccutase(PAAラボラトリーズ社、インスブルック、オーストリア)で分離された。細胞数がCASY測定器(Schaerfe−Systems,Reutlingen)を用いて決定され、細胞懸濁液は氷冷培地中に2.5×104細胞/ml(スフェロイド/凝集体あたり5000細胞)及び5×104細胞/ml(スフェロイド/凝集体あたり10000細胞)に希釈された。rBMは一晩氷上で解凍され、細胞懸濁液に氷冷ピペットチップで2.5%の最終濃度(v/v)で添加した。細胞懸濁液の容積200μlが、丸底(コーニング社、ニューヨーク、米国)または円錐形底(Nunc,Roskilde,オランダ)の96ウェルプレートの各ウェルに添加された。細胞接着を防ぐために、プレートは95%エタノール中の0.5%polyHEMA(Polysciences社、Eppelheim、ドイツ)50μlでプレコーティングされ、3日間37℃で空気乾燥された。スフェロイド形成は、スイングバケット付きエッペンドルフ遠心分離機5810(エッペンドルフAG、ハンブルグ、ドイツ)を用いて、10分間1,000gでのプレートの遠心分離によって開始された。プレートを加湿インキュベーターで、37℃、7%CO2で、標準的な細胞培養条件下で培養した。
凝集体/スフェロイドリンパ腫/NKの共培養および抗体とのインキュベーション
細胞の共培養と抗体添加の順序は変えることができる。典型的な共培養実験では、リンパ腫細胞(CMFDAで標識)およびNK細胞が、6穴プレートで示されるような比率で混合された。例えば、E:T(リンパ腫細胞に対するNK細胞)の比率が3:1は3+1の混合(例えば、75%NK細胞と25%のリンパ腫細胞)に対応する。200μlの細胞懸濁液がpolyHEMAで被覆された96ウェルV字プレートの単一ウェルに添加された(Nunc,カタログ番号249662)。PolyHEMAコーティング:95%エタノール中の0.5%ポリHEMAがウェルあたり50μl;37℃で72時間乾燥(Polysciences,カタログ番号18894)。プレートを1,000gで10分間遠心分離した。その後抗体は上記の濃度で添加され、細胞凝集体/スフェロイドは、加湿インキュベーターで37℃、7%CO2でインキュベートした。NK細胞以外の免疫細胞との腫瘍細胞の3D共培養を説明するために、Raji細胞のみと精製NK細胞と共培養されたRaji細胞の顕微鏡画像、並びに共培養されたRaji細胞と単球細胞の画像が図7に示されている。
生存細胞と細胞死の解析
実施例2及び3で説明したように、スフェロイド/凝集体は10,000細胞を用いて生成され、抗体と共にインキュベートした。生存リンパ腫腫瘍細胞の同定は以下の通りであった:同一の実験条件を表す個々のウェルからの個々の凝集体がプールされ、ピペッティングにより解離され、10分間、300gで遠心分離した。個々のスフェロイドがプールされ、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で1回洗浄され、Accutase溶液に再懸濁され、37℃でインキュベートされた。5分おきに、スフェロイド/凝集体がピペッティングして再懸濁され、解離は5分から15分以内に完了した。細胞は完全培地を用いて洗浄され、遠心分離され、細胞ペレットは完全培地中に再懸濁し、ヨウ化プロピジウムが1μg/mlの濃度で添加された(シグマ社、カタログ番号P4170)。蛍光分析は、FACS分析(ベクトン・ディッキンソン、Canto II測定器)によって行われた。
Claims (14)
- 腫瘍細胞とナチュラルキラー細胞を含む3次元スフェロイド又は凝集体を抗体とともにインキュベートすることを含む、抗体のエフェクター機能のインビトロ検出のための方法。
- (a)ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
(b)マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり104細胞を添加し、
(c)マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
(d)マルチウェルプレートのウェルに抗体を添加し、
(e)20時間から72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、
(f)蛍光活性化細胞選別により、マルチウェルプレートのウェル中の細胞を分析することにより、抗体のエフェクター機能を検出する
工程を含む、請求項1に記載の方法。 - ナチュラルキラー細胞がヒトのナチュラルキラー細胞であることを特徴とする、請求項2に記載の方法。
- ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞が10:1から1:10の比率で混合されることを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の方法。
- ナチュラルキラー細胞の腫瘍細胞に対する比率が2:1から4:1であることを特徴とする、請求項4に記載の方法。
- インキュベーションが20時間から28時間であることを特徴とする、請求項1から5の何れか一項に記載の方法。
- 遠心分離が1000rpmで10分間であることを特徴とする、請求項2から6の何れか一項に記載の方法。
- 腫瘍細胞がリンパ腫細胞であることを特徴とする、請求項1から7の何れか一項に記載の方法。
- リンパ腫細胞が、Raji細胞、又はSU−DHL4細胞、又はZ138細胞であることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 抗体が15μg/mlから0.1μg/mlの濃度で添加されることを特徴とする、請求項2から9の何れか一項に記載の方法。
- 抗体が8μg/mlから12μg/mlの濃度で添加されることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 多数の抗体と多数の腫瘍細胞との組合わせのエフェクター機能の決定のための、腫瘍細胞及びナチュラルキラー細胞を含む3次元スフェロイド又は凝集体の使用。
- (a)ナチュラルキラー細胞と腫瘍細胞を混合し、
(b)マルチウェルプレートのウェルに200μlあたり104細胞を添加し、
(c)マルチウェルプレートを遠心分離することにより、3次元スフェロイド又は凝集体の形成を誘導し、
(d)マルチウェルプレートの個々のウェルに提供された抗体の各々を添加し、
(e)20時間から72時間、マルチウェルプレートをインキュベートし、及び
(f)エフェクター機能を有する抗体として、死細胞の生細胞に対する1を超える比率を有する抗体を決定する
ことを含むエフェクター機能を持つ抗体をインビトロで決定するための方法。 - (a)蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞、
(b)単離されたナチュラルキラー細胞、
(c)96ウェルマルチウェルプレート、及び
(d)ヨウ化プロピジウム
を含む、抗体のエフェクター機能をインビトロで検出するためのキットであって、
(a)蛍光色素を用いて標識された腫瘍細胞と(b)単離されたナチュラルキラー細胞とが混合されて3次元スフェロイド又は凝集体を形成する、キット。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP10153277.8 | 2010-02-11 | ||
EP10153277 | 2010-02-11 | ||
PCT/EP2011/051633 WO2011098402A1 (en) | 2010-02-11 | 2011-02-04 | 3d adcc nk facs assay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013519360A JP2013519360A (ja) | 2013-05-30 |
JP5719384B2 true JP5719384B2 (ja) | 2015-05-20 |
Family
ID=42169475
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012552346A Active JP5719384B2 (ja) | 2010-02-11 | 2011-02-04 | 3dadccnkfacsアッセイ |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20120309016A1 (ja) |
EP (1) | EP2534480B1 (ja) |
JP (1) | JP5719384B2 (ja) |
KR (1) | KR101497196B1 (ja) |
CN (1) | CN102741695B (ja) |
BR (1) | BR112012016230A2 (ja) |
CA (1) | CA2787157A1 (ja) |
ES (1) | ES2459122T3 (ja) |
HK (1) | HK1174392A1 (ja) |
MX (1) | MX336473B (ja) |
RU (1) | RU2577702C2 (ja) |
WO (1) | WO2011098402A1 (ja) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20170061723A (ko) * | 2011-09-20 | 2017-06-05 | 주식회사 쿠라레 | 접착성 세포의 배양 방법 |
US10883083B2 (en) | 2013-08-02 | 2021-01-05 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Tissue-engineered three-dimensional model for tumor analysis |
CN103712967B (zh) * | 2013-12-27 | 2014-12-03 | 首都医科大学附属北京友谊医院 | 检测nk细胞活性的方法 |
AU2015261380B2 (en) | 2014-05-16 | 2021-04-15 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved culture method for organoids |
GB201421092D0 (en) | 2014-11-27 | 2015-01-14 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Culture medium |
GB201603569D0 (en) | 2016-03-01 | 2016-04-13 | Koninklijke Nederlandse Akademie Van Wetenschappen | Improved differentiation method |
KR101935989B1 (ko) | 2017-01-18 | 2019-01-07 | 서강대학교산학협력단 | 하이드로젤 마이크로웰을 이용한 멀티셀룰라 스페로이드의 제조 방법 |
KR20200116944A (ko) * | 2018-02-02 | 2020-10-13 | 웨이크 포리스트 유니버시티 헬스 사이언시즈 | 면역요법 관련 오가노이드 및 그의 제조 및 사용 방법 |
WO2023103785A1 (en) * | 2021-12-06 | 2023-06-15 | Wuxi Biologics (Shanghai) Co., Ltd. | 3d bioassays to measure antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0302435A1 (en) * | 1987-07-31 | 1989-02-08 | Neorx Corporation | Method for augmenting antibody-dependent cellular cytotoxicity |
US5314804A (en) * | 1992-03-24 | 1994-05-24 | Serim Research Corporation | Test for Helicobacter pylori |
IL159475A0 (en) * | 2001-06-21 | 2004-06-01 | Altus Biologics Inc | Spherical protein particles, compositions containing the same and methods for the production thereof |
EP1648507B1 (en) * | 2003-07-24 | 2017-01-25 | Innate Pharma S.A. | Methods and compositions for increasing the efficiency of therapeutic antibodies using nk cell potentiating compounds |
ME01775B (me) | 2003-11-05 | 2011-02-28 | Glycart Biotechnology Ag | Cd20 antitijela sa povećanim afinitetom vezivanja za fc receptor i efektornom funkcijom |
EP1977241B1 (en) * | 2006-01-04 | 2010-08-11 | Novartis AG | Antibody-dependent cellular cytotoxicity assay |
JP5282040B2 (ja) * | 2007-09-28 | 2013-09-04 | オリンパス株式会社 | Fc受容体遺伝子導入NK細胞を用いた抗体依存性細胞傷害のアッセイ方法 |
-
2011
- 2011-02-04 MX MX2012008950A patent/MX336473B/es unknown
- 2011-02-04 CN CN201180008240.0A patent/CN102741695B/zh active Active
- 2011-02-04 WO PCT/EP2011/051633 patent/WO2011098402A1/en active Application Filing
- 2011-02-04 KR KR1020127023590A patent/KR101497196B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2011-02-04 CA CA2787157A patent/CA2787157A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-04 RU RU2012138554/15A patent/RU2577702C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2011-02-04 EP EP11702212.9A patent/EP2534480B1/en active Active
- 2011-02-04 JP JP2012552346A patent/JP5719384B2/ja active Active
- 2011-02-04 US US13/577,309 patent/US20120309016A1/en not_active Abandoned
- 2011-02-04 BR BR112012016230A patent/BR112012016230A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2011-02-04 ES ES11702212.9T patent/ES2459122T3/es active Active
-
2013
- 2013-02-07 HK HK13101713.9A patent/HK1174392A1/zh unknown
-
2016
- 2016-05-06 US US15/148,938 patent/US10330669B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2012138554A (ru) | 2014-03-20 |
US20160252493A1 (en) | 2016-09-01 |
HK1174392A1 (zh) | 2013-06-07 |
EP2534480B1 (en) | 2014-03-19 |
CN102741695A (zh) | 2012-10-17 |
ES2459122T3 (es) | 2014-05-08 |
CN102741695B (zh) | 2015-08-26 |
MX2012008950A (es) | 2014-02-27 |
US10330669B2 (en) | 2019-06-25 |
KR101497196B1 (ko) | 2015-02-27 |
BR112012016230A2 (pt) | 2019-09-24 |
MX336473B (es) | 2016-01-20 |
CA2787157A1 (en) | 2011-08-18 |
EP2534480A1 (en) | 2012-12-19 |
RU2577702C2 (ru) | 2016-03-20 |
US20120309016A1 (en) | 2012-12-06 |
JP2013519360A (ja) | 2013-05-30 |
KR20120125369A (ko) | 2012-11-14 |
WO2011098402A1 (en) | 2011-08-18 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5719384B2 (ja) | 3dadccnkfacsアッセイ | |
Lea | Caco-2 cell line | |
RU2615439C2 (ru) | 3d in vitro двухфазный костно-хрящевой конструкт | |
JP5822287B2 (ja) | ヒト肝幹細胞、その調製方法、分化誘導方法及び利用方法 | |
van der Vlugt et al. | Toll-like receptor ligation for the induction of regulatory B cells | |
US20210277361A1 (en) | Method for evaluating anti-infective drugs, vaccines, etc. using immortalized monocytic cells and induced cells | |
Papp et al. | Life on a microarray: assessing live cell functions in a microarray format | |
CN107904278B (zh) | 检测药物对细胞增殖影响的方法 | |
AU2013298450B2 (en) | Method for culturing a subpopulation of circulating epithelial tumour cells from a body fluid | |
US20070065805A1 (en) | Cell migration assay | |
Campbell | Detection and enrichment of antigen-specific CD4+ and CD8+ T cells based on cytokine secretion | |
Desalvo et al. | Time-resolved microwell cell-pairing array reveals multiple T cell activation profiles | |
Cedillo-Alcantar et al. | On-Chip analysis of protein secretion from single cells using microbead biosensors | |
Choudhary et al. | A strategy to ensure safety of stem cell-derived retinal pigment epithelium cells | |
Jones et al. | Characterization of cell seeding and specific capture of B cells in microbubble well arrays | |
EP3203237B1 (en) | Urine-derived epithelial cell lines for diagnosis and therapy of an anti-bk-virus or anti-graft immune response | |
CN112921004B (zh) | 用于cd3受体激动剂检测的细胞株及其构建方法及cd3受体激动剂检测方法 | |
Schwietzer et al. | A tractable microscopy-and flow cytometry-based method to measure natural killer cell-mediated killing and infiltration of tumor spheroids | |
Baecher‐Allan et al. | The purification and functional analysis of human CD4+ CD25high regulatory T cells | |
Chan | Novel plate-based detection method for T cell activation/proliferation, migration, and cytotoxicity assay using image cytometry | |
Rahman et al. | In-vitro assays for immuno-oncology drug efficacy assessment and screening for personalized cancer therapy: scopes and challenges | |
Carannante et al. | Generation of tumor spheroids in microwells to study NK cell cytotoxicity, infiltration and phenotype | |
Ciraci et al. | CD34 human hematopoietic progenitor cell line, MUTZ-3, differentiates into functional osteoclasts | |
Luu et al. | Use of Inhibitory Compounds to Dissect the Molecular Pathways Involved in Regulatory B-Cell Differentiation | |
Co et al. | An Engineered 3D Co-culture Model of Primary Macrophages and Patient-Derived Tumour Cells to Explore Cellular Responses in the Graded Hypoxic Microenvironment of Pancreatic Cancer |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20140304 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140604 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150203 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150310 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150320 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5719384 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |