JP5678356B2

JP5678356B2 - Method for producing phenolic acid

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Publication number: JP5678356B2
Application number: JP2013527830A
Authority: JP
Inventors: 卓己岩崎; 西　達也; 達也西
Original assignee: GENARIS, INC.
Current assignee: GENARIS, INC.
Priority date: 2011-08-11
Filing date: 2011-08-11
Publication date: 2015-03-04
Anticipated expiration: 2031-08-11
Also published as: JPWO2013021503A1; WO2013021503A1

Description

本発明は、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ活性を有するタンパク質とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ活性を有するタンパク質を発現する微生物を用いて、有用化学品の合成原料として用いられている４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸およびゲンチジン酸を安価なフタル酸を原料として製造する方法に関する。 INDUSTRIAL APPLICABILITY The present invention is used as a raw material for synthesizing useful chemicals by using a protein having a phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase activity and a microorganism expressing a protein having a phthalate 4,5-dioxygenase / reductase activity. The present invention relates to a method for producing 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid and gentisic acid, which are inexpensive phthalic acids, as raw materials.

４−ヒドロキシフタル酸は感熱記録材料や樹脂などの合成原料として、３−ヒドロキシ安息香酸は医薬、殺菌剤、防腐剤および可塑剤の合成原料として、またゲンチジン酸は医薬や化粧品素材の合成原料として用いられている。これら化合物は芳香環にカルボキシル基と水酸基を有するフェノール酸であるが、フェノール酸を製造する際に、化学合成プロセスを用いて芳香環に水酸基を付加すると、製造コストが高くなるという問題点がある。 4-hydroxyphthalic acid is used as a synthetic raw material for heat-sensitive recording materials and resins, 3-hydroxybenzoic acid is used as a raw material for pharmaceuticals, fungicides, preservatives, and plasticizers, and gentisic acid is used as a synthetic raw material for pharmaceuticals and cosmetics. It is used. These compounds are phenolic acids having a carboxyl group and a hydroxyl group on the aromatic ring. However, when a phenolic acid is produced, adding a hydroxyl group to the aromatic ring using a chemical synthesis process has a problem that the production cost increases. .

フタル酸からの４−ヒドロキシフタル酸の生産を含めて、微生物または酵素を用いた４−ヒドロキシフタル酸の生産に関する報告例はない。 There are no reports on the production of 4-hydroxyphthalic acid using microorganisms or enzymes, including the production of 4-hydroxyphthalic acid from phthalic acid.

微生物または酵素を用いた３−ヒドロキシ安息香酸の生成については、シュードモナス・テストステロニ（Pseudomonas testosterone）NH1000株から４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素を精製し、本酵素が４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を持つことを報告している〔特許文献１〕。なお、本菌株の４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素の遺伝子はクローニングされていない。またバークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）DBO1株の４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素の遺伝子はクローニングされているが、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を持つことを報告されていない〔特許文献２〕。また古細菌の一種であるハロアーキュラ（Haloarcula）sp. D1株が４−ヒドロキシ安息香酸を３−ヒドロキシ安息香酸に変換する活性を持つことが報告されている〔特許文献３〕。なお、本菌株の３−ヒドロキシ安息香酸生成酵素の遺伝子はクローニングされていない。またフタル酸を原料とする３−ヒドロキシ安息香酸の生産法については報告がない。For the production of 3-hydroxybenzoic acid using microorganisms or enzymes, 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase was purified from Pseudomonas testosterone NH1000 strain, and this enzyme was produced from 4-hydroxyphthalic acid 3 -It has been reported to have the activity of converting to hydroxybenzoic acid [Patent Document 1]. The gene for 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase of this strain has not been cloned. The gene for 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase from Burkholderia cepacia DBO1 has been cloned, but has the activity to convert 4-hydroxyphthalate to 3-hydroxybenzoate. [Patent Document 2]. In addition, it has been reported that Haloarcula sp. D1 strain, which is a kind of archaea, has an activity of converting 4-hydroxybenzoic acid into 3-hydroxybenzoic acid [Patent Document 3]. In addition, the gene of 3-hydroxybenzoic acid synthase of this strain is not cloned. There is no report on the production method of 3-hydroxybenzoic acid from phthalic acid.

微生物または酵素を用いたゲンチジン酸の生成については、サリチル酸５−ヒドロキシラーゼがサリチル酸をゲンチジン酸に転換すること〔特許文献４〕、および３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼが３−ヒドロキシ安息香酸をゲンチジン酸に転換することが報告されているが〔特許文献５、６および７〕、フタル酸を原料とするゲンチジン酸の生産法については報告がない。 For the production of gentisic acid using microorganisms or enzymes, salicylic acid 5-hydroxylase converts salicylic acid to gentisic acid [Patent Document 4], and 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase converts 3-hydroxybenzoic acid. Although it has been reported to be converted to gentisic acid [Patent Documents 5, 6 and 7], there is no report on a method for producing gentisic acid using phthalic acid as a raw material.

上述の微生物または酵素を用いた３−ヒドロキシ安息香酸やゲンチジン酸の生産については、いずれも原料が高価であり、かつ生産量も低いので、工業的生産には適していない。一方、フタル酸は安価な化合物であり、オルソ系樹脂などの原料として大量に生産されている。またフタル酸エステルはプラスチックの可塑剤として大量に利用されている。廃棄物処理や環境保全の観点から、オルソ系樹脂やフタル酸エステルの加水分解により得られるフタル酸を再利用することが望まれている。 As for the production of 3-hydroxybenzoic acid and gentisic acid using the above-mentioned microorganisms or enzymes, since the raw materials are expensive and the production amount is low, they are not suitable for industrial production. On the other hand, phthalic acid is an inexpensive compound and is produced in large quantities as a raw material for ortho resins and the like. Phthalates are used in large quantities as plasticizers for plastics. From the viewpoint of waste disposal and environmental conservation, it is desired to reuse phthalic acid obtained by hydrolysis of ortho-based resins and phthalic acid esters.

Appl. Environ. Microbiol. 36, 264 (1978)Appl. Environ. Microbiol. 36, 264 (1978) J. Bacteriol. 180, 6529 (1998)J. Bacteriol. 180, 6529 (1998) Appl. Environ. Microbiol. 68, 6246 (2002)Appl. Environ. Microbiol. 68, 6246 (2002) J. Bacteriol. 184, 1547 (2002)J. Bacteriol. 184, 1547 (2002) Biochemistry 24, 1105（1987）Biochemistry 24, 1105 (1987) Appl. Environ. Microbiol. 73, 5146 (2007)Appl. Environ. Microbiol. 73, 5146 (2007) J. Basic Microbiol. 50, 599 (2010)J. Basic Microbiol. 50, 599 (2010)

本発明の課題は、廃棄ポリエステルの分解によっても得られる安価なフタル酸を原料として４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸およびゲンチジン酸を生産するための方法を提供することにある。 An object of the present invention is to provide a method for producing 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid and gentisic acid using cheap phthalic acid obtained also by decomposition of waste polyester as a raw material.

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ATCC17616株（バークホルデリア・セパシアDBO1株と同じ菌株）のフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質とから成るフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼによりフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させた後に、該溶液のpHと温度をそれぞれpH6.8以下かつ60℃以上にする、または該溶液のpHと温度をそれぞれpH11.5以上かつ温度を20℃以上にすることにより、より好ましくは、該溶液のpHと温度をそれぞれpH5.3以下かつ温度を80℃以上にする、または該溶液のpHと温度をそれぞれpH13以上かつ温度を40℃以上にすることにより、該水溶液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積できることを見出した（図１参照）。As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have found that phthalic acid 4, Burkholderia multivorans ATCC17616 strain (same strain as Burkholderia cepacia DBO1 strain) Generation and accumulation of 4,5-cis-dihydrodiol phthalate from phthalate by phthalate 4,5-dioxygenase consisting of 5-dioxygenase / oxygenase / protein and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase / protein More preferably, the pH and temperature of the solution are adjusted to pH 6.8 or lower and 60 ° C. or higher, respectively, or the pH and temperature of the solution are adjusted to pH 11.5 or higher and the temperature is 20 ° C. or higher, respectively. The pH and temperature of the solution are respectively pH 5.3 or lower and the temperature is 80 ° C. or higher, or the pH and temperature of the solution are pH 13 or higher and the temperature is 40 ° C. or higher, respectively. By, generates a 4-hydroxy phthalic acid aqueous solution, was found to be accumulated (see Fig. 1).

続いて、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株の４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素をクローニングし、大腸菌で発現させ、上記で調製した４−ヒドロキシフタル酸を混合したところ、本酵素は４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性、すなわち４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を保有しており、３−ヒドロキシ安息香酸を効率よく生産できることを見出した（図１参照）。さらに、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032株とポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）CJ2株から３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼをクローニングし、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素とともに大腸菌で発現させ、上記で調製した４−ヒドロキシフタル酸を混合したところ、ゲンチジン酸を効率よく生産できることを見出し（図１参照）、本発明を完成するに至った。Subsequently, 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase from Burkholderia multiborans ATCC17616 was cloned, expressed in E. coli, and mixed with 4-hydroxyphthalate prepared above. It has been found that it has an activity to convert -hydroxyphthalic acid to 3-hydroxybenzoic acid, that is, 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity, and can produce 3-hydroxybenzoic acid efficiently (see FIG. 1). ). In addition, 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase was cloned from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain and Polaromonas naphthalenivorans strain CJ2 to produce 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylate. When expressed in Escherichia coli together with the enzyme and the 4-hydroxyphthalic acid prepared above was mixed, it was found that gentisic acid could be produced efficiently (see FIG. 1), and the present invention was completed.

すなわち、本発明は以下の（１）〜（１２）に関する。 That is, the present invention relates to the following (1) to (12).

（１）以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、および以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に示すＤＮＡを保有し、フタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生産する能力を有する微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させた後に、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を４−ヒドロキシフタル酸に変換して、該水溶液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積させ、該水溶液から４−ヒドロキシフタル酸を採取することを特徴とする４−ヒドロキシフタル酸の製造法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）配列番号３に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。(1) possesses the following DNA (a), (b), (c) or (d) and DNA (e), (f), (g) or (h) below, After producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid in an aqueous solution using a microorganism capable of producing 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from acid, 4,5 -Converting cis-dihydrodiol phthalic acid into 4-hydroxyphthalic acid to produce and accumulate 4-hydroxyphthalic acid in the aqueous solution, and collecting 4-hydroxyphthalic acid from the aqueous solution 4 -A process for producing hydroxyphthalic acid.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, including a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 DNA encoding a protein having a function related to.
(C) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(D) Hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalate A DNA encoding a protein having a function related to conversion to an acid.
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(F) Conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, including a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 DNA encoding a protein having a function related to.
(G) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(H) Hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalate A DNA encoding a protein having a function related to conversion to an acid.

（２）前記微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程が、前記微生物菌体を含む培養液にフタル酸を添加し、該培養液中に４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程である、前記（１）記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 (2) The step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid in an aqueous solution using the microorganism adds phthalic acid to the culture solution containing the microbial cell, and the culture The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to the above (1), which is a step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid in the liquid.

（３）前記微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程が、前記微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程である、前記（１）記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 (3) The step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid in an aqueous solution using the microorganism includes the cultured cells of the microorganism or the treated product of the cultured cells and phthalic acid. In the aqueous medium, and 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid is produced and accumulated in the medium. The process for producing 4-hydroxyphthalic acid according to (1) above.

（４）４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を４−ヒドロキシフタル酸に変換する工程が、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を含む水溶液のpHと温度をそれぞれpH6.8以下かつ60℃以上にする、または該溶液のpHと温度をそれぞれpH11.5以上かつ20℃以上にする工程である、前記（１）から（３）のいずれか１項に記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 (4) The step of converting 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid into 4-hydroxyphthalic acid comprises adjusting the pH and temperature of the aqueous solution containing 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid to pH 6.8 or less and 60 respectively. The 4-hydroxyphthalic acid according to any one of the above (1) to (3), which is a step of adjusting the pH and temperature of the solution to 11.5 or higher and 20 ° C or higher, respectively. Manufacturing method.

（５）前記微生物が４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性が欠損または減弱している微生物であることを特徴とする、前記（１）から（４）のいずれか１項に記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 (5) The microorganism according to any one of (1) to (4), wherein the microorganism is a microorganism deficient or attenuated in 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase activity The manufacturing method of 4-hydroxyphthalic acid of description.

（６）前記微生物が、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性を欠損または減弱している宿主微生物に、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、および前記の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に示すＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、（５）記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造方法。 (6) A host microorganism that is deficient or attenuated in the activity of 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase, as shown in (a), (b), (c), or (d) DNA obtained by introducing the DNA shown in (e), (f), (g) or (h) by a transformation method, Production method.

（７）前記微生物が下記（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）または（ｐ）に示すＤＮＡを導入することによりフタル酸トランスポーター活性が増強している微生物であることを特徴とする、（１）から（６）のいずれか一項記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。
（ｍ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）配列番号７に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。(7) The microorganism is characterized in that the phthalate transporter activity is enhanced by introducing the DNA shown in (m), (n), (o) or (p) below: The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to any one of 1) to (6).
(M) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
(N) A DNA encoding a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and having phthalic acid transporter activity.
(O) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
(P) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encodes a protein having phthalic acid transporter activity .

（８）（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法により４−ヒドロキシフタル酸を生成させた後、４−ヒドロキシフタル酸に以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換し、該水溶液から３−ヒドロキシ安息香酸を採取することを特徴とする３−ヒドロキシ安息香酸の製造法。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつ４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号５に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。(8) After producing 4-hydroxyphthalic acid by the method according to any one of (1) to (7), the following (i), (j), (k) Alternatively, 4-hydroxyphthalic acid can be obtained by mixing a culture of a microorganism having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid or a treated product of the culture, which has the DNA shown in (l). Is converted into 3-hydroxybenzoic acid, and 3-hydroxybenzoic acid is collected from the aqueous solution.
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(J) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added, and having an activity of converting 4-hydroxyphthalic acid into 3-hydroxybenzoic acid DNA encoding a protein having the same.
(K) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(L) Hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and converts 4-hydroxyphthalic acid to 3-hydroxybenzoic acid DNA encoding a protein having an activity to convert.

（９）前記４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物が（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡを形質転換法により導入して得られたことを特徴とする、（８）記載の３−ヒドロキシ安息香酸の製造方法。 (9) A microorganism having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid is obtained by introducing the DNA shown in (i), (j), (k) or (l) by a transformation method. The method for producing 3-hydroxybenzoic acid according to (8), wherein

（１０）前記４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物の菌体を含む培養液、もしくは該微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を含む水性媒体の中に、（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法により得られた４−ヒドロキシフタル酸を添加し、混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換し、該培養液または該媒体から３−ヒドロキシ安息香酸を採取することを特徴とする３−ヒドロキシ安息香酸の製造法。 (10) A culture solution containing microbial cells having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid, or an aqueous medium containing cultured cells of the microorganisms or processed products of the cultured microbial cells 4-hydroxyphthalic acid obtained by the method according to any one of (1) to (7) is added and mixed to convert 4-hydroxyphthalic acid into 3-hydroxybenzoic acid. And 3-hydroxybenzoic acid is collected from the culture broth or the medium.

（１１）（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法により４−ヒドロキシフタル酸を生成させた後、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を４−ヒドロキシフタル酸に混合することにより、該水溶液中にゲンチジン酸を生成、蓄積させ、該水溶液からゲンチジン酸を採取することを特徴とするゲンチジン酸の製造法。 (11) After producing 4-hydroxyphthalic acid by the method according to any one of (1) to (7), the DNA shown in (i), (j), (k) or (l) In addition, a culture of a microorganism having a DNA encoding a protein having 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase activity and capable of producing gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid, or a processed product of the culture, A method for producing gentisic acid, characterized in that gentisic acid is produced and accumulated in the aqueous solution by mixing with 4-hydroxyphthalic acid, and gentisic acid is collected from the aqueous solution.

（１２）前記４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物が、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られたことを特徴とする、（１１）記載のゲンチジン酸の製造方法。 (12) In addition to the DNA shown in (i), (j), (k) or (l), a microorganism having the ability to produce gentisic acid from the 4-hydroxyphthalic acid is capable of producing 3-hydroxybenzoic acid 6- The method for producing gentisic acid according to (11), which is obtained by introducing a DNA encoding a protein having hydroxylase activity by a transformation method.

（１３）前記４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物の菌体を含む培養液、もしくは該微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を含む水性媒体の中に、（１）から（７）のいずれか１項に記載の方法により得られた４−ヒドロキシフタル酸を添加し、混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸をゲンチジン酸に転換し、該培養液または該媒体からゲンチジン酸を採取することを特徴とする（１１）または（１２）記載のゲンチジン酸の製造法。
(13) In a culture solution containing a microbial cell having the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid, or an aqueous medium containing the microbial cell or a processed product of the microbial cell, The 4-hydroxyphthalic acid obtained by the method according to any one of (1) to (7) is added and mixed to convert 4-hydroxyphthalic acid into gentisic acid, and the culture solution or The method for producing gentisic acid according to (11) or (12), wherein gentisic acid is collected from the medium.

フタル酸から、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を経由して、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸およびゲンチジン酸を生産する経路を示す。3 shows a pathway for producing 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid and gentisic acid from phthalic acid via 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid.

以下に本発明を詳細に説明する。 The present invention is described in detail below.

本発明で用いられるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質としては、例えば、配列番号２で表される、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616
株由来のアミノ酸配列を有するタンパク質があげられる。本菌株はアメリカ・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、必要に応じてＡＴＣＣと略記する）から入手することができる。また、本発明で用いられるフタル酸ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をあげることができる。また、該タンパク質として、配列番号２のアミノ酸配列と90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をあげることができる。ここで、「フタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能」とはフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質とともにフタル酸と反応させたときに４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成しうる機能を意味する。 Examples of the phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein used in the present invention include, for example, Burkholderia multiborance ATCC17616 represented by SEQ ID NO: 2.
Examples include proteins having an amino acid sequence derived from a strain. This strain can be obtained from the American Type Culture Collection (hereinafter abbreviated as ATCC as necessary). Further, the phthalate dioxygenase / oxygenase protein used in the present invention consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and 4 from phthalic acid. , 5-cis-dihydrodiolphthalic acid can be mentioned as a protein having a function related to the conversion. Further, the protein comprises an amino acid sequence having 90 % or more, particularly preferably 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid. Proteins having a function related to Here, the “function related to the conversion of phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid” is 4,5 when reacted with phthalic acid together with phthalic acid 4,5-dioxygenase / reductase / protein. Means a function capable of producing cis-dihydrodiol phthalic acid;

本発明で用いられるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質としては、例えば、配列番号４で表される、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株
由来のアミノ酸配列を有するタンパク質があげられる。また、本発明で用いられるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質としては、配列番号４のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をあげることができる。また、該タンパク質として、配列番号４のアミノ酸配列と90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をあげることができる。ここで、「フタル酸から４，５−シス−ジヒドロ
ジオールフタル酸への転換に関わる機能」とはフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質とともにフタル酸と反応させたときに４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成しうる機能を意味する。 Examples of the phthalate 4,5-dioxygenase reductase protein used in the present invention include a protein having an amino acid sequence derived from Burkholderia multiborans ATCC17616 represented by SEQ ID NO: 4. The phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein used in the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and Mention may be made of proteins having a function relating to the conversion of phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid. Further, the protein comprises an amino acid sequence having 90 % or more, particularly preferably 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid Proteins having a function related to Here, the “function relating to the conversion of phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid” is 4,5 when reacted with phthalic acid together with phthalic acid 4,5-dioxygenase / oxygenase / protein. Means a function capable of producing cis-dihydrodiol phthalic acid;

本発明で用いられる４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質としては、例えば、配列番号６で表される、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株
由来のアミノ酸配列を有する４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素タンパク質があげられる。また、本発明で用いられる４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質としては、配列番号６のアミノ酸配列において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換または付加したアミノ酸配列からなり、かつ４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をあげることができる。また、該タンパク質として、配列番号６のアミノ酸配列と90％以上、特に好ましくは95％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をあげることができる。ここで、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性とは、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を意味する。 Examples of the protein having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity used in the present invention include an amino acid sequence derived from Burkholderia multiborance ATCC17616 strain represented by SEQ ID NO: 6, 4, 5 -Dihydroxyphthalate decarboxylase protein. The protein having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity used in the present invention comprises an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6. And a protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity. Examples of the protein include a protein comprising an amino acid sequence having 90 % or more, particularly preferably 95% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6, and having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity. be able to. Here, 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity means an activity of converting 4-hydroxyphthalic acid into 3-hydroxybenzoic acid.

本発明で用いられる３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質としては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032株のGenBank（以下、GenBankをＧＢと略す）アクセッション番号NP_602220のタンパク質、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）YS-314株のＧＢアクセッション番号ZP_05751298のタンパク質、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株のＧＢアクセッション番号YP_701838のタンパク質、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas napHthalenivorans）CJ2株のＧＢアクセッション番号ABM38442のタンパク質、ラストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropHa）H16株のＧＢアクセッション番号YP_729033のタンパク質、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ATCC17616株のＧＢアクセッション番号YP_001584411のタンパク質があげられる。これらの菌株は、ＡＴＣＣ、独立行政法人製品基盤技術基盤機構・生物遺伝資源部門（以下、必要に応じてＮＢＲＣと略記する）、または独立行政法人理化学研究筑波研究所・バイオリソースセンターなどから入手することができる。Examples of the protein having 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase activity used in the present invention include GenBank of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain (hereinafter, GenBank is abbreviated as GB) accession number NP_602220. protein, Corynebacterium efficiens (Corynebacterium efficiens) YS-314 strain of GB protein accession numbers ZP_05751298, Rhodococcus Josuti (Rhodococcus jostii) RHA1 shares of GB protein accession number YP_701838, Poraromonasu-naphthalenide borane scan (Polaromonas napHthalenivorans ) protein of GB accession number ABM38442 of CJ2 strain, protein of GB accession number YP_729033 of Ralstonia eutropHa H16 strain, Burkholderia multiborance ( Burkholderia multivorans ) protein of GB accession number YP_001584411 of ATCC17616 strain. Obtain these strains from ATCC, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Biogenetic Resource Division (hereinafter abbreviated as NBRC as necessary), RIKEN Tsukuba Research Institute, BioResource Center, etc. Can do.

上記のフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質、または３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質において、１または数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、各々の目的酵素活性を有するタンパク質は、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)（以下、モレキュラー・クローニング第２版と略す）、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)（以下、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーと略す）、Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982)、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982)、Gene, 34, 315 (1985)、Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985)、Proc.Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985)等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、各タンパク質において特定の位置に欠失、置換もしくは付加が導入されるようにＤＮＡに部位特異的変異を導入することにより取得することができる。欠失、置換または付加される１または数個というアミノ酸の数は、個々の酵素活性が維持される限り特に限定されないが、元のアミノ酸配列との違いの個数以内であることが望ましく、１〜20個が好ましく、１〜10個がより好ましく、１〜５個が特に好ましい。 Phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein, phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein, protein having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity, or 3-hydroxybenzoic acid 6 -A protein having hydroxylase activity consists of an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and each protein having the desired enzyme activity is Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (hereinafter abbreviated as Molecular Cloning 2nd Edition), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997) (hereinafter referred to as Current Protocols in Molecular Biology) (Abbreviated), Nucleic Acids Res., 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Res., 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985), etc. Using a mutagenesis method, it can be obtained by introducing a site-specific mutation into DNA such that a deletion, substitution or addition is introduced at a specific position in each protein. The number of one or several amino acids to be deleted, substituted or added is not particularly limited as long as the individual enzyme activity is maintained, but is preferably within the number of differences from the original amino acid sequence. 20 is preferable, 1-10 is more preferable, and 1-5 is particularly preferable.

本発明で用いられるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。 Examples of DNA encoding phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase / protein used in the present invention include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1.

本発明で用いられるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号３で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。 Examples of DNA encoding phthalate 4,5-dioxygenase / reductase / protein used in the present invention include DNA having the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.

本発明で用いられる４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号５で表される塩基配列を有するＤＮＡがあげられる。 Examples of DNA encoding a protein having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity used in the present invention include DNA having a base sequence represented by SEQ ID NO: 5.

本発明で用いられる３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡとしては、例えば、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のＧＢアクセッション番号NP_602220のタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号４４）、コリネバクテリウム・エフィシェンス（Corynebacterium efficiens）YS-314株のＧＢアクセッション番号ZP_05751298のタンパク質をコードするＤＮＡ、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）RHA1株のＧＢアクセッション番号YP_701838のタンパク質をコードするＤＮＡ、ポラロモナス・ナフタレニヴォランス（Polaromonas napHthalenivorans）CJ2株のＧＢアクセッション番号ABM38442のタンパク質をコードするＤＮＡ（配列番号４６）、ラストニア・ユートロファ（Ralstonia eutropHa）H16株のＧＢアクセッション番号YP_729033のタンパク質をコードするＤＮＡ、バークホルデリア・マルチボランス（Burkholderia multivorans）ATCC17616株のＧＢアクセッション番号YP_001584411のタンパク質をコードするＤＮＡがあげられる。Examples of DNA encoding a protein having 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase activity used in the present invention include a DNA encoding a protein of GB accession number NP_602220 of Corynebacterium glutamicum ATCC13032 strain (SEQ ID NO: 44). ), DNA encoding the protein of Corynebacterium efficiens YS-314 GB accession number ZP_05751298, DNA encoding the protein of GB accession number YP_701838 of Rhodococcus jostii RHA1, Poraromonasu-naphthalenide Voyage lance (Polaromonas napHthalenivorans) CJ2 strain GB accession No. DNA encoding the protein of ABM38442 of (SEQ ID NO: 46), Rasutonia eutropha (Ralstonia eutropha) H16 strain GB Accessible DNA encoding the protein of Deployment number YP_729033, Burkholderia multi-borane scan (Burkholderia multivorans) ATCC17616 strain DNA that encodes a protein of GB accession number YP_001584411 of the like.

本発明のＤＮＡには、各ＤＮＡがコードするタンパク質が本発明の目的の酵素活性を失わない範囲内で置換変異、欠失変異、挿入変異などの変異が導入されたＤＮＡ、例えば、配列番号１、３または５に表わされるＤＮＡの全部もしくは一部をプローブとして、ハイブリダイゼーション法によってストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも包含する。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡとは、具体的には、ＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、0.7〜1.0 MのNaClの存在下で65℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のSSC溶液（１倍濃度のSSC溶液の組成は、150 mM NaCl、15 mM クエン酸ナトリウムである）の中、65℃でフィルターを洗浄することにより同
定できるＤＮＡを意味する。なお、ハイブリダイゼーションの実験法は、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular Cloning, A laboratory manual)、第２版〔サンブルック(Sambrook)、フリッチ(Fritsch) 、マニアチス(Maniatis)編集、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press) 、1989年刊〕に記載されている。 In the DNA of the present invention, DNA into which mutations such as substitution mutations, deletion mutations and insertion mutations are introduced within a range in which the protein encoded by each DNA does not lose the target enzyme activity of the present invention, for example, SEQ ID NO: 1 DNA that hybridizes under stringent conditions by a hybridization method using all or part of the DNA represented by 3 or 5 as a probe is also included. The hybridizing DNA under stringent conditions, specifically, after using a filter immobilized with DNA, hybridization was performed at 65 ° C. in the presence of NaCl of 0.7 to 1.0 M, 0. It means DNA that can be identified by washing the filter at 65 ° C. in a 1-fold concentration SSC solution (composition of 1-fold concentration SSC solution is 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate). The hybridization experiment method is described in Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition [edited by Sambrook, Fritsch, Maniatis, Cold. Spring Harbor Laboratory Press, 1989].

４−ヒドロキシフタル酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、上記フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質をコードするＤＮＡおよびフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質をコードするＤＮＡを保有し、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物を用いることができる。すなわち前記（１）記載のＤＮＡを保有し、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生産する能力を有する微生物を用いることができる。このような性質を有する微生物は、前記（１）に記載したＤＮＡのうち１つ以上のＤＮＡを組換え技術を用いて宿主細胞に導入して得た形質転換体であってもよい。 The microorganism of the present invention used for the production of 4-hydroxyphthalic acid encodes the above-mentioned DNA encoding phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein. Any microorganism can be used as long as it has DNA and has the ability to produce 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid. That is, a microorganism having the DNA described in (1) and having the ability to produce 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid can be used. The microorganism having such properties may be a transformant obtained by introducing one or more of the DNAs described in (1) above into a host cell using a recombinant technique.

また、４−ヒドロキシフタル酸の生産に用いられる微生物としては、４，５−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素が存在すると、生成した４，５−ジヒドロジオールフタル酸が４，５−ジヒドロキシフタル酸に変換する可能性があることから、４，５−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性を失った、または減弱した微生物であることが望ましい。したがって、４，５−ジヒドロジオールフタル酸・ジヒドロゲナーゼ活性を有する微生物については、組換え技術などを用いて４，５−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素タンパク質（例えば、ＧＢアクセッション番号BAG45582やYP_001948118）をコードするＤＮＡに変異や欠失を導入することにより、４，５−ジヒドロジオールフタル酸・ジヒドロゲナーゼ活性を失った、または減弱した菌株を用いることが望ましい。または組換え技術などを用いて、４，５−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素タンパク質をコードするＤＮＡの転写に関わるプロモーターへの変異導入、または当該タンパク質の翻訳開始領域への変異導入、またはアンチセンスＲＮＡ法により、当該タンパク質の発現を欠損させた、または減弱させた菌株を用いることが望ましい。 In addition, as a microorganism used for producing 4-hydroxyphthalic acid, when 4,5-dihydrodiol phthalate dehydrogenase is present, the produced 4,5-dihydrodiol phthalic acid is converted to 4,5-dihydroxyphthalic acid. Because of the possibility of conversion, microorganisms that have lost or attenuated 4,5-dihydrodiol phthalate dehydrogenase activity are desirable. Therefore, for microorganisms having 4,5-dihydrodiol phthalate / dihydrogenase activity, 4,5-dihydrodiol phthalate dehydrogenase proteins (for example, GB accession numbers BAG45582 and YP_001948118) are used by using a recombinant technique. It is desirable to use strains that have lost or attenuated 4,5-dihydrodiol phthalate / dihydrogenase activity by introducing mutations or deletions into the DNA coding for. Alternatively, using recombinant technology, etc., introduction of mutation into a promoter involved in transcription of DNA encoding 4,5-dihydrodiol phthalate dehydrogenase protein, introduction of mutation into the translation initiation region of the protein, or antisense It is desirable to use a strain in which expression of the protein is deficient or attenuated by the RNA method.

４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保有し、かつ４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物を用いることができる。すなわち前記（７）記載のＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物を用いることができる。このような性質を有する微生物は、前記（８）に記載したＤＮＡを組換え技術を用いて宿主細胞に導入して得た形質転換体であってもよい。 The microorganism of the present invention used for the production of 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid has DNA encoding a protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity, and 4-hydroxyphthalic acid. Any microorganism can be used as long as it has the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from an acid. That is, a microorganism having the DNA described in (7) and having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid can be used. The microorganism having such properties may be a transformant obtained by introducing the DNA described in (8) above into a host cell using a recombinant technique.

４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸の生産に用いられる本発明の微生物としては、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保有し、かつ４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物であれば、いずれの微生物を用いることができる。すなわち前記（１０）記載のＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物を用いることができる。このような性質を有する微生物は、前記（１１）に記載したＤＮＡを組換え技術を用いて宿主細胞に導入して得た形質転換体であってもよい。 The microorganism of the present invention used for the production of gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid includes, in addition to DNA encoding a protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity, 6-hydroxy 3-hydroxybenzoic acid. Any microorganism can be used as long as it has a DNA encoding a protein having a ase activity and has the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid. That is, a microorganism having the DNA described in (10) and having the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid can be used. The microorganism having such properties may be a transformant obtained by introducing the DNA described in (11) above into a host cell using a recombinant technique.

以下に、ＤＮＡのクローニングと形質転換株の作製方法について詳しく述べる。 Hereinafter, a method for cloning DNA and a method for producing a transformant will be described in detail.

上述したバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株、コリネバクテリウム・エフィシェンスYS-314株、ロドコッカス・ジョスティRHA1株、ポラロモナス・ナフタレニヴォランスCJ2株、ラストニア・ユートロファH16株などの細菌は、上記の微生物分譲機関が推奨する培養条件または通常用いられる公知の方法により培養する。培養後、公知の方法（例えば、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジーに記載の方法）により、該微生物の染色体ＤＮＡを単離し精製する。この染色体ＤＮＡから合成ＤＮＡを用いて、ハイブリダイゼイション法またはＰＣＲ法などにより、目的のタンパク質をコードするＤＮＡを含む断片を取得することができる。 Burkholderia multiborance ATCC17616, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium efficiens YS-314, Rhodococcus josti RHA1, Polaromonas naphthalenivorans CJ2, Lastonia Eutropha H16 Such bacteria are cultured under the culture conditions recommended by the above-mentioned microorganism distribution agency or by commonly used known methods. After culturing, the chromosomal DNA of the microorganism is isolated and purified by a known method (for example, the method described in Current Protocols in Molecular Biology). From this chromosomal DNA, a fragment containing DNA encoding the target protein can be obtained by a hybridization method or a PCR method using a synthetic DNA.

目的のタンパク質をコードするＤＮＡは化学合成することによっても得ることができる。該合成ＤＮＡは、たとえばバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株由来のフタル酸４，５ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質をコードするＤＮＡの配列番号１で表される塩基配列、およびバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株由来のフタル酸４，５ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質をコードするＤＮＡの配列番号３で表される塩基配列、およびバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株由来の４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡの配列番号５で表される塩基配列に基づいて設計することができる。また、３−ヒドロキシ安息香酸−６−ヒドロキシゲナーゼ活性を有するタンパク質をコードする合成ＤＮＡとしては、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13032株のＧＢアクセッション番号NP_602220のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、コリネバクテリウム・エフィシェンスYS-314株のＧＢアクセッション番号ZP_05751298のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、ロドコッカス・ジョスティRHA1株のＧＢアクセッション番号YP_701838のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、ポラロモナス・ナフタレニヴォランスCJ2株のＧＢアクセッション番号ABM38442のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、ラストニア・ユートロファH16株のＧＢアクセッション番号YP_729033のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株のＧＢアクセッション番号YP_001584411のタンパク質をコードするＤＮＡの塩基配列に基づいて設計することができる。 DNA encoding the protein of interest can also be obtained by chemical synthesis. The synthetic DNA is, for example, a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 of DNA encoding phthalate 4,5 dioxygenase / oxygenase protein derived from Burkholderia multiborans ATCC17616, and Burkholderia multiborane The nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 of DNA encoding phthalate 4,5 dioxygenase / reductase protein derived from the ATCC17616 strain, and 4-hydroxyphthalate 1-derived from Burkholderia multiborans ATCC17616 strain 1- It can be designed based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 of DNA encoding a protein having decarboxylase activity. Synthetic DNA encoding a protein having 3-hydroxybenzoic acid-6-hydroxygenase activity includes a base sequence of DNA encoding the protein of GB accession number NP_602220 of Corynebacterium glutamicum ATCC13032, corynebacteria Um-efficiens YS-314 GB accession number ZP_05751298 DNA-encoding base sequence, Rhodococcus josti RHA1 strain GB accession-number YP_701838 DNA base sequence, Polaromonas naphthalenivolans Base sequence of DNA encoding the protein of GB accession number ABM38442 of CJ2 strain, Base sequence of DNA encoding the protein of GB accession number YP_729033 of Lastonia Eutropha H16 strain, Burkholderia multi It can be designed based on the nucleotide sequence of the DNA encoding the protein of GB accession No. YP_001584411 lance ATCC17616 strain.

上記ＤＮＡを連結するベクターとしては、エシェリヒア・コリK12株などにおいて自立複製可能なベクターであればプラスミドベクター、ファージベクター等いずれも使用可能であるが、具体的には、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、ZAP Express〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 58 (1992)〕、pBluescript II SK(+)〔ストラタジーン社製、Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)〕、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。 As a vector for ligating the above DNA, any plasmid vector, phage vector, etc. can be used as long as they are vectors capable of autonomous replication in Escherichia coli K12 strain. Specifically, pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC18, pBR322, pHelix1 (manufactured by Roche Diagnostics), ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5, 58 (1992)), pBluescript II SK (+) (Stratagene, Nucleic Acids Res., 17, 9494 (1989)], pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can be used.

該ベクターに上記で取得したＤＮＡを連結して得られる組換えＤＮＡの宿主に用いるエシェリヒア・コリは、エシェリヒア・コリに属する微生物であればいずれでも用いることができるが、具体的には、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli） XL1-Blue MRF'〔ストラタジーン社製、Strategies, 5, 81 (1992)〕、エシェリヒア・コリC600〔Genetics, 39, 440 (1954)〕、エシェリヒア・コリY1088〔Science, 222,778 (1983)〕、エシェリヒア・コリY1090〔Science, 222, 778 (1983)〕、エシェリヒア・コリNM522〔J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)〕、エシェリヒア・コリK802〔J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)〕、エシェリヒア・コリJM105〔Gene, 38, 275 (1985)〕、エシェリヒア・コリJM109、エシェリヒア・コリBL21等をあげることができる。Any Escherichia coli used as a host for the recombinant DNA obtained by ligating the DNA obtained above to the vector can be used as long as it is a microorganism belonging to Escherichia coli. Escherichia coli XL1-Blue MRF '(Stratagene, Strategies, 5, 81 (1992)), Escherichia coli C600 (Genetics, 39, 440 (1954)), Escherichia coli Y1088 (Science, 222,778 ( 1983), Escherichia coli Y1090 (Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 (J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)), Escherichia coli K802 (J. Mol. Biol. , 16, 118 (1966)], Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)], Escherichia coli JM109, Escherichia coli BL21, and the like.

ロドコッカス（Rhodococcus）属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ポラロモナス（Polaromonas）属、ラルストニア（Ralstonia）属またはバークホルデリア（Burkholderia属）に属する微生物の中に、上記ＤＮＡを導入するときは、これら微生物の中で自立複製可能なベクターを用いる。好ましくは、該微生物のいずれかとエシェリヒア・コリK12株の両方の微生物の中で自立複製可能なシャトル・ベクターを用いて、組換えＤＮＡを宿主となる該微生物に導入することができる。Rhodococcus (Rhodococcus) genus Comamonas (Comamonas) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Pseudomonas (Pseudomonas) genus, Poraromonasu (Polaromonas) genus, in a microorganism belonging to Ralstonia (Ralstonia) genus or Burkholderia (Burkholderia spp.) In addition, when introducing the DNA, a vector capable of autonomous replication among these microorganisms is used. Preferably, the recombinant DNA can be introduced into the host microorganism by using a shuttle vector capable of autonomous replication in both microorganisms of both the microorganism and Escherichia coli K12 strain.

組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕等をあげることができる。 As a method for introducing recombinant DNA, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 ( 1972)], electroporation method [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)] and the like.

上記のようにして得られた形質転換体から組換えＤＮＡを抽出し、該組換えＤＮＡに含まれる本発明のＤＮＡの塩基配列を決定することができる。塩基配列の決定には、通常用いられる塩基配列解析方法、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)〕または3730xl型ＤＮＡアナライザー（アプライド・バイオシステムズ社製）等の塩基配列分析装置を用いることができる。 A recombinant DNA can be extracted from the transformant obtained as described above, and the base sequence of the DNA of the present invention contained in the recombinant DNA can be determined. For determination of the base sequence, a commonly used base sequence analysis method such as dideoxy method [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] or 3730xl type DNA analyzer (Applied Biosystems), etc. Can be used.

また、上記において決定されたＤＮＡの塩基配列に基づいて、パーセプティブ・バイオシステムズ社製8905型ＤＮＡ合成装置等を用いて化学合成することによっても目的とするＤＮＡを調製することもできる。 The target DNA can also be prepared by chemical synthesis using a 8905 type DNA synthesizer manufactured by Perceptive Biosystems based on the DNA base sequence determined above.

上記のフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質、フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質および／または３−ヒドロキシ安息香酸−６−ヒドロキシゲナーゼ活性を有するタンパク質を発現する形質転換体は、下記の方法を用いて上記のＤＮＡを宿主細胞中で発現させることによって得られる。 Phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein, phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein, protein having 4-hydroxyphthalate 1-decarboxylase activity and / or 3-hydroxybenzoic acid A transformant expressing a protein having -6-hydroxygenase activity can be obtained by expressing the above DNA in a host cell using the following method.

上記タンパク質をコードするＤＮＡを用いる際には、必要に応じて、本発明のタンパク質をコードする部分を含む適当な長さのＤＮＡ断片を調製することができる。また、該タンパク質をコードする部分の塩基配列を、宿主の発現に最適なコドンとなるように、塩基を置換することにより、該タンパク質の生産率を向上させることもできる。本発明のＤＮＡを発現する形質転換体は、上記ＤＮＡ断片を適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えＤＮＡを作製し、該組換えＤＮＡを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより取得することができる。 When using DNA encoding the above protein, a DNA fragment having an appropriate length containing a portion encoding the protein of the present invention can be prepared as necessary. Further, the production rate of the protein can be improved by substituting the base in the base sequence of the protein-encoding portion so as to be an optimal codon for host expression. A transformant expressing the DNA of the present invention is a recombinant DNA produced by inserting the above DNA fragment downstream of a promoter of an appropriate expression vector, and the recombinant DNA is adapted to a host suitable for the expression vector. It can be obtained by introduction into cells.

本発明のタンパク質を発現させる宿主としては、細菌、酵母、動物細胞、昆虫細胞、植物細胞等、目的とする遺伝子を発現できるものであればいずれも用いることができる。好ましくは、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の代謝能を有していない微生物を用いることができる。より好ましくは、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の代謝能を有していないエシェリヒア属（Escherichia）、ロドコッカス（Rhodococcus）属、コマモナス（Comamonas）属、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属、シュードモナス（Pseudomonas）属、ポラロモナス（Polaromonas）属、ラルストニア（Ralstonia）属またはバークホルデリア（Burkholderia属）の細菌をあげることができる。さらに好ましくは、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）K-12株をあげることができる。As the host for expressing the protein of the present invention, any bacteria, yeast, animal cell, insect cell, plant cell and the like that can express the target gene can be used. Preferably, a microorganism that does not have the ability to metabolize 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid can be used. More preferably, 4,5-cis - Escherichia having no metabolism of dihydrodiol phthalate (Escherichia), Rhodococcus (Rhodococcus) genus Comamonas (Comamonas) genus Corynebacterium (Corynebacterium) genus Pseudomonas ( Pseudomonas) genus Poraromonasu (Polaromonas) the genus of bacteria Ralstonia (Ralstonia) genus or Burkholderia (Burkholderia sp). More preferably, Escherichia coli K-12 strain can be mentioned.

発現ベクターとしては、上記宿主細胞において自立複製可能ないしは染色体中への組込みが可能で、本発明のＤＮＡを転写できる位置にプロモーターを含有しているものが用いられる。 As the expression vector, a vector that can replicate autonomously in the host cell or can be integrated into a chromosome and contains a promoter at a position where the DNA of the present invention can be transcribed is used.

細菌等の原核生物を宿主細胞として用いる場合は、本発明のＤＮＡを含有してなる組換えＤＮＡは原核生物中で自立複製可能であると同時に、プロモーター、リボソーム結合配列、本発明のＤＮＡ、転写終結配列、より構成された組換えＤＮＡであることが好ましい。プロモーターを制御する遺伝子が含まれていてもよい。 When a prokaryotic organism such as a bacterium is used as a host cell, the recombinant DNA containing the DNA of the present invention can replicate autonomously in the prokaryotic organism, and at the same time, a promoter, a ribosome binding sequence, the DNA of the present invention, a transcription It is preferably a recombinant DNA composed of a termination sequence. A gene that controls the promoter may also be included.

本発明のタンパク質、または、該タンパク質と他のタンパク質との融合タンパク質をコードするＤＮＡを大腸菌などの微生物に導入し、発現するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ColE1由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばpUC系のプラスミドやpBR322系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加および／または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。より具体的には、ベクターとしては、例えば、pUC19〔Gene, 33, 103 (1985)〕、pUC18、pBR322、pHelix1（ロシュ・ダイアグノスティクス社製）、pKK233-2（アマシャム・ファルマシア・バイオテク社製）、pSE280（インビトロジェン社製）、pGEMEX-1（プロメガ社製）、pQE-8（キアゲン社製）、pET-3（ノバジェン社製）pBluescriptII SK(+)、pBluescript II KS(+)（ストラタジーン社製）、pSTV28（タカラバイオ社製）、pUC118（タカラバイオ社製）等を用いることができる。 As a vector for introducing and expressing a DNA encoding the protein of the present invention or a fusion protein of the protein and another protein into a microorganism such as Escherichia coli, a so-called multi-copy type is preferable, and it is derived from ColE1. Examples include plasmids having a replication origin, such as pUC series plasmids, pBR322 series plasmids, and derivatives thereof. Here, the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion, addition and / or inversion. In addition, the modification here includes modification by mutation treatment with a mutation agent, UV irradiation, or natural mutation. More specifically, examples of the vector include pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC18, pBR322, pHelix1 (manufactured by Roche Diagnostics), pKK233-2 (manufactured by Amersham Pharmacia Biotech) ), PSE280 (Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (Qiagen), pET-3 (Novagen) pBluescriptII SK (+), pBluescript II KS (+) (Stratagene) PSTV28 (manufactured by Takara Bio Inc.), pUC118 (manufactured by Takara Bio Inc.) and the like can be used.

プロモーターとしては、大腸菌（エシェリヒア・コリ）等の宿主細胞中で発現できるものであればいかなるものでもよい。例えば、trpプロモーター（Ｐtrp）、lacプロモーター（Ｐlac）、ＰLプロモーター、ＰRプロモーター等の、T7プロモーターなどの大腸菌やファージ等に由来するプロモーター、およびtacプロモーター、lacT7プロモーターのように人為的に設計改変されたプロモーター等、およびシュードモナス・プチダのTOLプラスミドのXylSタンパク質により制御されるPmプロモータを用いることができる。 As the promoter, any promoter can be used so long as it can be expressed in a host cell such as Escherichia coli (Escherichia coli). For example, artificially designed and modified such as trp promoter (Ptrp), lac promoter (Plac), PL promoter, PR promoter, etc., promoters derived from E. coli such as T7 promoter, phages, etc., and tac promoter, lacT7 promoter Pm promoter controlled by the XylS protein of the TOL plasmid of Pseudomonas putida can be used.

リボソーム結合配列であるシャイン−ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば5〜18塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。本発明の組換えＤＮＡにおいては、本発明のＤＮＡの発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、構造遺伝子の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。 It is preferable to use a plasmid in which the distance between the Shine-Dalgarno sequence, which is a ribosome binding sequence, and the initiation codon is adjusted to an appropriate distance (for example, 5 to 18 bases). In the recombinant DNA of the present invention, a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the DNA of the present invention, but it is preferable to place the transcription termination sequence immediately below the structural gene.

組換えＤＮＡの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972) 〕、エレクトロポレーション法〔Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)〕、接合伝達法〔J. G. C. Ottow, Ann. Rev.Microbiol., Vol.29, p.80 (1975)〕、細胞融合法〔M.H. Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)〕等をあげることができる。 As a method for introducing recombinant DNA, any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into the host cell. For example, a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 69, 2110 (1972)], electroporation (Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988)), conjugation transfer (JGC Ottow, Ann. Rev. Microbiol., Vol. 29, p.80 (1975)), cells Fusion method [MH Gabor, J. Bacteriol., Vol.137, p.1346 (1979)] and the like can be mentioned.

組換えＤＮＡ技術などを用いて、上記いずれか１つ以上のタンパク質の生産量が野生株と比較して増強した微生物を作製し、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸の生産量をあげることができる。具体的には、上記いずれかのタンパク質をコードする遺伝子を発現させるためのプロモーターとして天然のプロモーターよりも転写活性が強いプロモーターを用いる、あるいは該タンパク質をコードする遺伝子の転写を終結するためのターミネーターとして天然のターミネーターよりも転写終結活性が強いターミネーターを用いる、あるいは発現ベクターとして高コピー数ベクターを利用すること、相同組換えで染色体上に組み込むことなどがあげられる。 Using recombinant DNA technology or the like, a microorganism having an increased production amount of any one or more of the above proteins compared to the wild type strain is prepared, and 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid is produced. The production amount of 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid can be increased. Specifically, a promoter having a transcription activity stronger than that of a natural promoter is used as a promoter for expressing a gene encoding any of the above proteins, or as a terminator for terminating transcription of a gene encoding the protein. Examples include using a terminator having a transcription termination activity stronger than that of a natural terminator, using a high copy number vector as an expression vector, or incorporating it into a chromosome by homologous recombination.

以上のようにして得られるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質を発現している微生物を用いることにより、フタル酸から４−ヒドロキシフタル酸を製造することができる。すなわち当該微生物を液体培地で培養し、培養液中に0.1 mM〜1 Mのフタル酸を加えることにより、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させた後、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を４−ヒドロキシフタル酸に変換する操作、例えば、該培養液中のpHを硫酸や塩酸などの酸の添加によりpH6.8以下、好ましくはpH5.3以下にし、さらに該培養液中の温度を60℃以上、好ましくは70℃以上、より好ましくは80℃以上にして、一定時間、好ましくは１時間以上放置することにより、該培養液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積させることができる。該培養液中への酸の添加の代わりに、アンモニア水や水酸化ナトリウム溶液などのアルカリ溶液の添加によりpH11.5以上、好ましくはpH13以上にした後、該培養液中の温度を20℃以上、好ましくは30℃以上、より好ましくは40℃以上にして一定時間放置することによっても、該培養液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積させ、該培養液から４−ヒドロキシフタル酸を採取することもできる。本発明の微生物を培地に培養する方法は、微生物の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。 By using a microorganism expressing phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase / protein obtained as described above, 4-hydroxyphthalate is converted from phthalate. Acid can be produced. That is, the microorganism is cultured in a liquid medium, and 0.1 mM to 1 M phthalic acid is added to the culture solution to generate and accumulate 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid. -An operation for converting dihydrodiol phthalic acid to 4-hydroxyphthalic acid, for example, the pH in the culture solution is adjusted to pH 6.8 or less, preferably pH 5.3 or less by adding an acid such as sulfuric acid or hydrochloric acid, and the culture is further performed. The temperature in the liquid is set to 60 ° C. or higher, preferably 70 ° C. or higher, more preferably 80 ° C. or higher, and left for a certain period of time, preferably 1 hour or longer to produce 4-hydroxyphthalic acid in the culture liquid. Can be accumulated. Instead of adding an acid to the culture solution, the pH in the culture solution is adjusted to 20 ° C. or more after the pH is adjusted to 11.5 or more, preferably 13 or more by adding an alkaline solution such as aqueous ammonia or sodium hydroxide solution. Also, 4-hydroxyphthalic acid is produced and accumulated in the culture broth by allowing it to stand at a temperature of 30 ° C. or higher, more preferably 40 ° C. or higher for a certain period of time, and 4-hydroxyphthalic acid is collected from the culture broth. You can also The method of culturing the microorganism of the present invention in a medium can be performed according to a usual method used for culturing microorganisms.

上記の微生物を培養した後、フタル酸を含む水性媒体中に、該微生物の培養菌体もしくは該培養菌体の処理物を加えることにより、該媒体中に４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させた後、上述のように、該溶液のpHと温度をpH6.8以下かつ温度を60℃以上にする、またはpH11.5以上かつ温度を20℃以上にすることにより、該水溶液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積させ、該媒体から４−ヒドロキシフタル酸を採取することもできる。 After culturing the above-mentioned microorganism, by adding the cultured cells of the microorganism or a processed product of the cultured cells to an aqueous medium containing phthalic acid, 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid is added to the medium. As described above, the pH and temperature of the solution are adjusted to pH 6.8 or lower and the temperature is set to 60 ° C. or higher, or the pH is set to 11.5 or higher and the temperature is set to 20 ° C. or higher. It is also possible to produce and accumulate 4-hydroxyphthalic acid in an aqueous solution and collect 4-hydroxyphthalic acid from the medium.

また、このような微生物を増殖させて、フタル酸を細胞内に取り込ませて４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸と４−ヒドロキシフタル酸を製造する場合には、フタル酸の輸送能を有する微生物を用いることが好ましい。野生型微生物のフタル酸の輸送能が小さい、または野生型微生物がフタル酸の輸送能を有していない場合には、フタル酸の輸送に関わるトランスポータータンパク質を組換えＤＮＡ技術などを用いて導入した微生物を用いることができる。フタル酸の輸送に関わるトランスポータータンパク質としては、フタル酸輸送活性を示すトランスポータータンパク質であれば、いずれも用いることができるが、バークホルデリア・マルチボランスATCC17616のフタル酸トランスポーター遺伝子ophD〔J. Bacterol. 181, 6197 (1999)〕を用いることが好ましい。該フタル酸トランスポーター遺伝子を宿主細胞に発現させることにより、フタル酸の輸送能を野生株と比較して増強することができる。フタル酸トランスポーター遺伝子としては以下のようなＤＮＡが包含される。
（ｍ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）配列番号７に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。Moreover, when such microorganisms are grown and phthalic acid is taken up into cells to produce 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid and 4-hydroxyphthalic acid, they have the ability to transport phthalic acid. It is preferable to use a microorganism. When wild-type microorganisms have low phthalic acid transport capacity, or when wild-type microorganisms do not have phthalic acid transport capacity, transporter proteins involved in phthalic acid transport are introduced using recombinant DNA technology, etc. Microorganisms can be used. As the transporter protein involved in phthalic acid transport, any transporter protein exhibiting phthalic acid transport activity can be used, but the phthalate transporter gene ophD [J of Burkholderia multiboranes ATCC17616 Bacterol. 181, 6197 (1999)] is preferably used. By expressing the phthalic acid transporter gene in a host cell, the phthalic acid transport ability can be enhanced compared to the wild type. Examples of the phthalate transporter gene include the following DNA.
(M) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
(N) A DNA encoding a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and having phthalic acid transporter activity.
(O) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
(P) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encodes a protein having phthalic acid transporter activity .

上記の４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質を発現している微生物を用いることにより、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を製造することができる。すなわち上記の方法により４−ヒドロキシフタル酸を水溶液中に蓄積させた後、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質を発現している微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換し、該水溶液中から３−ヒドロキシ安息香酸を採取することができる。 3-hydroxybenzoic acid can be produced from 4-hydroxyphthalic acid by using a microorganism expressing a protein having the above-mentioned 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity. That is, after 4-hydroxyphthalic acid is accumulated in an aqueous solution by the above method, cultured cells of microorganisms expressing a protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity or treatment of the cultured cells By mixing the product, 4-hydroxyphthalic acid can be converted to 3-hydroxybenzoic acid, and 3-hydroxybenzoic acid can be collected from the aqueous solution.

上記の４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質を発現している微生物の菌体を含む培養液、もしくは該微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を含む水性媒体の中に、上記の方法により採取した４−ヒドロキシフタル酸を添加し、混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換し、該培養液または該媒体から３−ヒドロキシ安息香酸を採取することができる。 A culture solution containing a microbial cell expressing the above-mentioned protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity, or an aqueous medium containing the cultured microbial cell or a processed product of the cultured microbial cell 4-hydroxyphthalic acid collected by the above method is added and mixed to convert 4-hydroxyphthalic acid into 3-hydroxybenzoic acid, and 3-hydroxybenzoic acid is converted from the culture solution or the medium. Can be collected.

上記の方法により４−ヒドロキシフタル酸を水溶液中に蓄積させた後、４−ヒドロキシフタル酸１−脱炭酸酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を混合することにより、該水溶液中にゲンチジン酸を生成、蓄積させ、該水溶液からゲンチジン酸を採取することができる。 After accumulating 4-hydroxyphthalic acid in an aqueous solution by the above method, in addition to DNA encoding a protein having 4-hydroxyphthalic acid 1-decarboxylase activity, 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase activity A cultivated microbial cell having the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid or a treated product of the cultured microbial cell is mixed with the gentisic acid in the aqueous solution. Can be produced and accumulated, and gentisic acid can be collected from the aqueous solution.

上記の微生物の菌体を含む培養液、もしくは該微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を含む水性媒体の中に、上記の方法により採取した４−ヒドロキシフタル酸を添加し、混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸をゲンチジン酸に転換し、該培養液または該媒体からゲンチジン酸を採取することができる。 4-Hydroxyphthalic acid collected by the above method is added to a culture solution containing the above-mentioned microorganism cells or an aqueous medium containing the cultured cells of the microorganism or a processed product of the cultured cells, and mixed. By doing so, 4-hydroxyphthalic acid can be converted into gentisic acid, and gentisic acid can be collected from the culture medium or the medium.

本発明の微生物の培養は、炭素源、窒素源、無機塩、各種ビタミン等を含む通常の栄養培地で行うことができ、炭素源としては、例えばブドウ糖、ショ糖、果糖等の糖類、エタノール、メタノール等のアルコール類、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸等の有機酸類、廃糖蜜等が用いられる。窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウム、尿素等がそれぞれ単独または混合して用いられる。また、無機塩としては、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸二水素カリウム、硫酸マグネシウム等が用いられる。この他にペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリカー、カザミノ酸、ビオチン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に添加することができる。４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸を生産するための原料としては、フタル酸を添加する。添加するフタル酸は、無水フタル酸でも、フタル酸ナトリウムなどのフタル酸塩でもよい。 The culture of the microorganism of the present invention can be performed in a normal nutrient medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, various vitamins, etc., and examples of the carbon source include sugars such as glucose, sucrose, and fructose, ethanol, Alcohols such as methanol, organic acids such as citric acid, malic acid and succinic acid, and molasses are used. As the nitrogen source, for example, ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea or the like is used alone or in combination. Examples of inorganic salts that can be used include potassium monohydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate, and magnesium sulfate. In addition, nutrients such as various vitamins such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, casamino acid, and biotin can be added to the medium. Phthalic acid is added as a raw material for producing 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid. The phthalic acid to be added may be phthalic anhydride or a phthalate such as sodium phthalate.

培養は、通常、通気攪拌、振とう等の好気条件下で行う。培養温度は、本発明の微生物が生育し得る温度であれば特に制限はなく、また、培養途中のpHについても本発明の微生物が生育し得るpHであれば特に制限はない。培養中のpH調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。 The culture is usually carried out under aerobic conditions such as aeration stirring and shaking. The culture temperature is not particularly limited as long as the microorganism of the present invention can grow, and the pH during the culture is not particularly limited as long as the microorganism of the present invention can grow. The pH adjustment during the culture can be performed by adding an acid or an alkali.

該培養菌体の処理物として、本発明の微生物を担体に固定化したものを用いてもよい。その場合には、培養物から回収されたまま、あるいは適当な緩衝液、例えば0.02〜0.2 M程度のリン酸緩衝液（pH6〜10）等で洗浄された菌体を使用することができる。また、培養物から回収された菌体を、超音波、圧搾等の手段で破砕して得られる破砕物、該破砕物を水等で抽出して得られる本発明のタンパク質を含有する抽出物、該抽出物をさらに硫安塩析、カラムクロマトグラフィー等の処理を行って得られる本発明のタンパク質の部分精製成分等を担体に固定化したものも、本発明の４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸およびゲンチジン酸の製造に使用することができる。 As a processed product of the cultured cells, one obtained by immobilizing the microorganism of the present invention on a carrier may be used. In that case, cells recovered from the culture or washed with an appropriate buffer such as a phosphate buffer (pH 6 to 10) of about 0.02 to 0.2 M can be used. In addition, the microbial cells recovered from the culture, crushed material obtained by crushing by means of ultrasonic waves, pressing, etc., an extract containing the protein of the present invention obtained by extracting the crushed material with water, The extract obtained by further subjecting the extract to a partially purified component of the protein of the present invention obtained by subjecting the extract to further treatment with ammonium sulfate salting out, column chromatography, etc. is also supported by the 4,5-cis-dihydrodiol phthalate of the present invention. It can be used for the production of acids, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid and gentisic acid.

これら菌体、菌体破砕物、抽出物または精製酵素の固定化は、それ自体既知の通常用いられている方法に従い、アクリルアミドモノマー、アルギン酸、またはカラギーナン等の適当な担体に菌体等を固定化させる方法により行うことができる。 Immobilization of these cells, disrupted cells, extracts, or purified enzymes is carried out by immobilizing the cells on an appropriate carrier such as acrylamide monomer, alginic acid, or carrageenan according to a commonly used method known per se. It can be performed by the method of making it.

反応に用いる水性媒体は、フタル酸を含有する水溶液または適当な緩衝液、例えば0.02〜0.2 M程度のリン酸緩衝液（pH6〜10）とすることができる。この水性媒体には、さらに菌体の細胞膜の物質透過性を高める必要のあるときには、トルエン、キシレン、非イオン性界面活性剤等を0.05〜2.0％（w/v）添加することもできる。 The aqueous medium used for the reaction can be an aqueous solution containing phthalic acid or a suitable buffer, for example, a phosphate buffer (pH 6 to 10) of about 0.02 to 0.2 M. When it is necessary to further increase the substance permeability of the cell membrane of the microbial cell, 0.05 to 2.0% (w / v) of toluene, xylene, nonionic surfactant, etc. can be added to this aqueous medium.

水性媒体中の反応原料となるフタル酸の濃度は、0.1 mM〜1 M程度が適当である。上記の水性媒体における酵素反応温度およびpHは特に限定されないが、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃が適当であり、反応液中のpHは5〜10、好ましくは6〜9付近とすることができる。また、pHの調整は、酸またはアルカリを添加して行うことができる。発明で使用する酵素は、菌体抽出液をそのまま、またはそれから遠心分離、濾過等で集め、これを水または緩衝液に懸濁して得ることができる。このようにして得られた酵素をフタル酸の存在下、反応させるが、反応液中のフタル酸の濃度は酵素の活性を阻害しない範囲で可能な限り高くするのが有利である。反応は静置、攪拌、振盪のいずれの方法で行ってもよい。また、酵素を適当な支持体に固定化してカラムに充填し、フタル酸を含む溶液を流す方法も利用できる。反応は、通常10〜60℃、好ましくは15〜50℃、pH5〜9、好ましくはpH6〜9で行う。 A suitable concentration of phthalic acid as a reaction raw material in the aqueous medium is about 0.1 mM to 1 M. The enzyme reaction temperature and pH in the above-mentioned aqueous medium are not particularly limited, but usually 10 to 60 ° C., preferably 15 to 50 ° C. is appropriate, and the pH in the reaction solution is 5 to 10, preferably about 6 to 9 can do. The pH can be adjusted by adding acid or alkali. The enzyme used in the invention can be obtained by collecting the bacterial cell extract as it is or by collecting it by centrifugation, filtration or the like and suspending it in water or a buffer solution. The enzyme thus obtained is reacted in the presence of phthalic acid, and it is advantageous that the concentration of phthalic acid in the reaction solution is as high as possible within the range not inhibiting the activity of the enzyme. The reaction may be performed by any method of standing, stirring and shaking. In addition, a method in which an enzyme is immobilized on a suitable support, packed in a column, and a solution containing phthalic acid is allowed to flow. The reaction is usually carried out at 10-60 ° C, preferably 15-50 ° C, pH 5-9, preferably pH 6-9.

また、上記水性媒体に、反応時に抗酸化剤または還元剤を添加すると、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸の生成収率が一層向上する場合がある。抗酸化剤／還元剤としては、アスコルビン酸、イソアルコルビン酸、システイン、亜硫酸ナトリウムや亜硫酸水素ナトリウムなどの亜硫酸塩、チオ硫酸ナトリムなどのチオ硫酸塩が挙げられる。添加濃度は、抗酸化剤／還元剤の種類によって異なるが、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜5％（w/v）、好ましくは0.005〜1％である。 Moreover, when an antioxidant or a reducing agent is added to the aqueous medium during the reaction, the production yield of 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid is further increased. May improve. Antioxidants / reducing agents include ascorbic acid, isoalcorbic acid, cysteine, sulfites such as sodium sulfite and sodium bisulfite, and thiosulfates such as sodium thiosulfate. The addition concentration varies depending on the type of antioxidant / reducing agent, but it should be added at a concentration that does not inhibit the formation of 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid, or gentisic acid. Is usually 0.001 to 5% (w / v), preferably 0.005 to 1%.

また、上記水性媒体に、反応時に酸化剤を添加すると、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸の生成収率が一層向上する場合がある。酸化剤としては、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム等の硝酸塩、塩化第二鉄や硫酸第二鉄等の金属塩、ハロゲン、ペルオクソ酸等が挙げられ、好ましくは、亜硝酸ナトリウム、塩化第二鉄、硫酸第二鉄が挙げられる。添加濃度は、酸化剤の種類によって異なるが、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸、４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸の生成を阻害しない濃度で加えることが望ましく、通常0.001〜0.05％（w/v）、好ましくは0.005〜0.02％である。 In addition, when an oxidizing agent is added to the aqueous medium during the reaction, the production yield of 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid may be further improved. is there. Examples of the oxidizing agent include nitrates such as sodium nitrite and potassium nitrite, metal salts such as ferric chloride and ferric sulfate, halogen, peroxo acid, etc., preferably sodium nitrite, ferric chloride, A ferric sulfate is mentioned. The addition concentration varies depending on the type of oxidizing agent, but it is desirable to add it at a concentration that does not inhibit the formation of 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid. 0.001 to 0.05% (w / v), preferably 0.005 to 0.02%.

培養終了後の培養液または反応液中からの４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸は、酢酸エチル等の有機溶剤によって抽出することにより単離・精製することができる。また、必要に応じて遠心分離等により該培養液から菌体等の不溶成分を除いた後、例えば、活性炭を用いる方法、イオン交換樹脂を用いる方法、結晶化法、沈殿法等の方法を単独でまたは組み合わせることによって４−ヒドロキシフタル酸、３−ヒドロキシ安息香酸またはゲンチジン酸を採取することができる。 4-Hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid from the culture solution or reaction solution after completion of the culture can be isolated and purified by extraction with an organic solvent such as ethyl acetate. In addition, after removing insoluble components such as cells from the culture solution by centrifugation or the like as necessary, for example, a method using activated carbon, a method using an ion exchange resin, a crystallization method, a precipitation method, etc. 4-hydroxyphthalic acid, 3-hydroxybenzoic acid or gentisic acid can be collected in or in combination.

以下に本発明の方法を実施例により具体的に述べるが、本発明はこれに限定されるものではない。 The method of the present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited thereto.

実施例１．培養菌体を用いたフタル酸からの４−ヒドロキシフタル酸の生産
フタル酸代謝に関わるフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼとフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼの２種類のタンパク質をコードするＤＮＡを以下のようにして取得するとともに、これら２種類のタンパク質を発現する菌株を用いてフタル酸から４−ヒドロキシフタル酸の生産を行った。
１．フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質のクローニング
（１）ポリシストロン型発現プラスミドの構築
大腸菌 MG1655株、大腸菌 JM109株、大腸菌 JM109（DE3）株や大腸菌 BL21（DE3）株で上記遺伝子を各遺伝子の転写・翻訳効率に依存しない効率よい発現を行うために、目的遺伝子の転写は疑似遺伝子に依存し、疑似遺伝子の翻訳効率を維持した状態で目的遺伝子も翻訳される発現系の構築を行った。より具体的にはpUC19（タカラバイオ社製）にターミネーター配列を挿入するため、配列番号９〜14で表される６本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpUC19制限酵素KpnI部位と制限酵素EcoRI部位の間に挿入したプラスミドpUC1LT1を構築した。次いで、pUC1LT1の制限酵素PvuII部位と制限酵素HindIII部位間を削除したpULTDL1を構築した。pULTDL1にT7プロモーター配列と疑似遺伝子及び目的遺伝子を連結するための制限酵素PacI部位を挿入するために、配列番号15〜20で表される６本の合成ＤＮＡを合成した。これら合成ＤＮＡをpULTDL1の制限酵素SpHI部位と制限酵素SalI部位の間に挿入した発現プラスミドpUTPELT19を構築した。次いでpUTPELT19の制限酵素BglII部位と制限酵素と制限酵素PacI部位間を配列番号21で表される配列にPCR法を用いて変更した発現プラスミドpUTPEaLT19を構築した。
さらにXylS-Pmプロモーターを利用した誘導発現系を構築するため、XylS-Pmプロモーター領域のＤＮＡを取得することにした。XylS-Pmプロモーター領域は国立遺伝学研究所から入手したプラスミドpJB866を鋳型として、配列番号22と23で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いて、XylS-Pmプロモーターの全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。Taq DNAポリメラーゼによって増幅ＤＮＡ断片の3'末端にＡ残基を付加した後、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、ｐT7BlueのＴベクターに組み込むことにより、XylS-Pmプロモーターの全領域を保持するプラスミドpT7-xylS_Pmを構築した。pT7-xylS_Pmから制限酵素SbfI部位と制限酵素BamHIによりXylS-Pmプロモーターの領域を切り出し、pUTPEaLT19の制限酵素SbfI部位と制限酵素BglII部位（BamHIとBglIIは突出末端が対合する）に組み込むことにより、pUXPEaLT19を造成した。Example 1. Production of 4-hydroxyphthalic acid from phthalic acid using cultured cells Encodes two proteins, phthalate 4,5-dioxygenase oxygenase and phthalate 4,5-dioxygenase reductase, which are involved in phthalate metabolism The DNA to be obtained was obtained as follows, and 4-hydroxyphthalic acid was produced from phthalic acid using strains expressing these two types of proteins.
1. Cloning of phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein (1) Construction of polycistronic expression plasmid Escherichia coli MG1655, Escherichia coli JM109, Escherichia coli JM109 (DE3) In order to efficiently express the above genes in the E. coli and E. coli BL21 (DE3) strains without depending on the transcription / translation efficiency of each gene, the transcription of the target gene depends on the pseudogene and the translation efficiency of the pseudogene is maintained. We constructed an expression system that also translated the target gene. More specifically, in order to insert a terminator sequence into pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), six synthetic DNAs represented by SEQ ID NOs: 9 to 14 were synthesized. Plasmid pUC1LT1 was constructed by inserting these synthetic DNAs between the pUC19 restriction enzyme KpnI site and the restriction enzyme EcoRI site. Subsequently, pULTDL1 was constructed by deleting the restriction enzyme PvuII site and the restriction enzyme HindIII site of pUC1LT1. Six synthetic DNAs represented by SEQ ID NOs: 15 to 20 were synthesized in order to insert a restriction enzyme PacI site for linking a T7 promoter sequence, a pseudo gene and a target gene into pULTDL1. An expression plasmid pUTPELT19 was constructed in which these synthetic DNAs were inserted between the restriction enzyme SpHI site and the restriction enzyme SalI site of pULTDL1. Subsequently, an expression plasmid pUTPEaLT19 in which the restriction enzyme BglII site, the restriction enzyme, and the restriction enzyme PacI site of pUTPELT19 were changed to the sequence represented by SEQ ID NO: 21 using the PCR method was constructed.
Furthermore, in order to construct an inducible expression system using the XylS-Pm promoter, it was decided to obtain DNA of the XylS-Pm promoter region. The XylS-Pm promoter region is the plasmid pJB866 obtained from the National Institute of Genetics as a template, and DNA primers having the sequences represented by SEQ ID NOs: 22 and 23 are used to convert the entire region of the XylS-Pm promoter into PrimeSTAR DNA polymerase. Amplified by the PCR reaction used. After adding an A residue to the 3 'end of the amplified DNA fragment with Taq DNA polymerase, the amplified DNA fragment is purified by gel electrophoresis and incorporated into the T vector of pT7Blue to retain the entire XylS-Pm promoter region. Plasmid pT7-xylS_Pm was constructed. By cutting out the region of the XylS-Pm promoter from the pT7-xylS_Pm with the restriction enzyme SbfI site and the restriction enzyme BamHI, and incorporating it into the restriction enzyme SbfI site and the restriction enzyme BglII site of pUTPEaLT19 (BamHI and BglII pair at the protruding end) pUXPEaLT19 was created.

（２）フタル酸ジオキシゲナーゼ遺伝子のクローニング
バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株のフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼophA2とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼophA1をコードするＤＮＡを得ることにした。ophA2遺伝子とophA1遺伝子の塩基配列については、ナショナル・センター・フォア・バイオテクノロジー・インフォメーション（以下、ＮＣＢＩと略記する）のジェンバンク（GenBank）データベースから、ＧＢアクセッション番号NC_010805における塩基番号548114〜546783と539662〜538694の配列（配列番号１と３）として得た。バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株の染色体ＤＮＡは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（以下、ＡＴＣＣと略記する）から入手した。該染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、ophA2遺伝子は配列番号24と25、ophA1遺伝子は配列番号26と27で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いて、配列番号２と４に示されるアミノ酸配列を有するフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼとフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼタンパク質をコードしているophA2遺伝子とophA1遺伝子の全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。増幅ＤＮＡ断片をQIAquick PCR精製キット（キアゲン社製）を用いて回収した。ophA1遺伝子を制限酵素PacI部位と制限酵素NotIによりPCR産物から切り出し、上記（１）で造成した発現ベクターpUXPEaLT19に組込むことにより、pUXPEaLT_ophA1を造成した。pUXPEaLT_ophA1の制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位に制限酵素SwaI部位と制限酵素NotIによりPCR産物から切り出したophA2遺伝子を挿入したpUXPEaLT_ophA1A2を構築した。(2) Cloning of phthalate dioxygenase gene Obtaining DNA encoding phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase ophA2 and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase ophA1 from Burkholderia multiborans ATCC17616 strain I made it. For the nucleotide sequences of the ophA2 gene and the ophA1 gene, from the GenBank database of National Center for Biotechnology Information (hereinafter abbreviated as NCBI), nucleotide numbers 548114 to 546783 in GB accession number NC_010805 Obtained as the sequence of 539662 to 538694 (SEQ ID NOs: 1 and 3). Chromosomal DNA of Burkholderia multiborance ATCC17616 strain was obtained from American Type Culture Collection (hereinafter abbreviated as ATCC). Using the chromosomal DNA (100 ng) as a template, the amino acids shown in SEQ ID NOs: 2 and 4 using DNA primers having the sequences shown in SEQ ID NOs: 24 and 25 for the ophA2 gene and SEQ ID NOs: 26 and 27 for the ophA1 gene The entire ophA2 gene and ophA1 gene encoding the phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase proteins are amplified by PCR using PrimeSTAR DNA polymerase. It was. The amplified DNA fragment was recovered using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen). The ophA1 gene was excised from the PCR product with the restriction enzyme PacI site and the restriction enzyme NotI and incorporated into the expression vector pUXPEaLT19 constructed in (1) above to construct pUXPEaLT_ophA1. pUXPEaLT_ophA1A2 was constructed by inserting the restriction enzyme SwaI site and the restriction enzyme NotI into the restriction enzyme PmeI and restriction enzyme NotI sites of pUXPEaLT_ophA1.

（３）フタル酸トランスポーターのクローニング
大腸菌K-12株のフタル酸取り込み能が弱いことがわかったので、フタル酸の取り込みを促進するフタル酸トランスポーターを発現させることにより、フタル酸取り込み能を強化することを試みた。具体的には、フタル酸からの菌体内へのフタル酸の取り込みを促進させる効果があるバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株のフタル酸トランスポーターophDをコードするＤＮＡを得ることにした。ophD遺伝子の塩基配列については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、アクセッション番号NC_010805における塩基番号539901〜541247の配列（配列番号７）として得た。ＡＴＣＣから入手したバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株の染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、配列番号28と配列番号29で表される配列を有する２種類のＤＮＡプライマーを用いて、配列番号８に示されるアミノ酸配列を有するフタル酸トランスポータータンパク質をコードしているophD遺伝子の全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。Taq DNAポリメラーゼによって増幅ＤＮＡ断片の3'末端にＡ残基を付加した後、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7BlueのＴベクターに組み込むことにより、ophD遺伝子の全領域を保持するプラスミドpTOPHD1を構築した。さらに配列番号30と31に示す１対の合成ＤＮＡ、および配列番号32と33で表される１対の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によりophD遺伝子内部に２箇所ある制限酵素NotI部位を破壊したプラスミドpTOPHD_dNABを造成した。pTOPHD_dNABから制限酵素PacIと制限酵素NotIによりophD遺伝子を切り出し、大腸菌中で発現ベクターpUXPEaLT19と共存可能な発現ベクターpRTCKMの制限酵素PacIと制限酵素NotIに組み込むことでプラスミドpRTCKM_ophDおよびpRTCRK_ophDを造成した。プラスミドpRTCKM_ophDにおいては、挿入したophD遺伝子の発現は、制限酵素PacIサイトの上流にあるカナマイシン耐性遺伝子のプロモーターの制御下にある。また、pRTCRK_ophDにおいてはコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株由来のrplK遺伝子プロモーターの制御下にある。
発現ベクターpRTCKMは、プラスミドベクターpRTC_SfiIのSfiIサイトに配列番号34に示す配列を有する合成ＤＮＡ由来のＤＮＡが挿入されたプラスミドである。なお、配列番号34に示したＤＮＡの配列は、その両末端にpRTC_SfiI由来のSfiIサイトの配列も含んでいる。上述のプラスミドpRTCKM_ophDの造成に用いた制限酵素PacI部位と制限酵素NotI部位は、配列番号7に示す配列においては、それぞれ塩基番号227と塩基番号245に存在する。
また、プラスミドベクターpRTC_SfiIは、プラスミドベクターpREP4（インビトロジェン社から製品番号V004-50として入手可能）をもとに下記の手順で造成した。pREP4を制限酵素HindIIIで切断した後、平滑末端化して連結、pREP4DHを造成した。さらにpREP4DHを制限酵素XbaIで切断した後、平滑末端化して連結し、pREP4DHXを造成した。pREP4DHXを鋳型に配列番号35と36で表される1組の合成DNAを用いたPCR法により、末端に制限酵素SfiI部位を導入したＰＣＲ増幅断片を得た。得られた断片を制限酵素BamHIで消化・連結することで、pRTC_SfiIを造成した。
発現ベクターpRTCRKは、以下のようにして、pRTCKMの制限酵素SbfI部位と制限酵素BglII部位にコリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株のrplK遺伝子プロモーター領域を挿入して構築した。すなわち、まずrplK遺伝子プロモーター領域の塩基配列をＮＣＢＩのＧＢデータベースからアクセッション番号NC_006958における塩基番号498398〜498577の配列（配列番号37）として得た。続いて、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株の染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、配列番号38、39で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用い、PrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。増幅ＤＮＡ断片をQIAquick PCR精製キット（キアゲン社製）を用いて回収した。制限酵素SbfI部位と制限酵素BglIIによりPCR産物から切り出し、上記で造成した発現ベクターpRTCKMに組込むことにより、pRTCRKを造成した。(3) Cloning of phthalic acid transporter It was found that Escherichia coli K-12 has a weak phthalic acid uptake ability, so the phthalic acid uptake ability is enhanced by expressing a phthalic acid transporter that promotes uptake of phthalic acid. Tried to do. Specifically, it was decided to obtain a DNA encoding the phthalic acid transporter ophD of Burkholderia multiborance ATCC17616 strain, which has an effect of promoting the incorporation of phthalic acid from phthalic acid into cells. The base sequence of the ophD gene was obtained from the NCBI GB database as the base number 539901-541247 sequence (SEQ ID NO: 7) at the accession number NC_010805. Using two types of DNA primers having the sequences represented by SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29 using the chromosomal DNA (100 ng) of Burkholderia multiborance ATCC17616 obtained from ATCC as a template, SEQ ID NO: 8 The entire region of the ophD gene encoding the phthalate transporter protein having the amino acid sequence shown in (1) was amplified by a PCR reaction using PrimeSTAR DNA polymerase. A plasmid that retains the entire region of the ophD gene by adding an A residue to the 3 ′ end of the amplified DNA fragment with Taq DNA polymerase, purifying the amplified DNA fragment by gel electrophoresis, and incorporating it into the T vector of pT7Blue. pTOPHD1 was constructed. Furthermore, a plasmid in which two restriction enzyme NotI sites in the ophD gene are destroyed by PCR using a pair of synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 30 and 31 and a pair of synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 32 and 33 pTOPHD_dNAB was created. Plasmids pRTCKM_ophD and pRTCRK_ophD were constructed by excising the ophD gene from pTOPHD_dNAB with restriction enzymes PacI and NotI and incorporating them into the restriction enzymes PacI and NotI of the expression vector pRTCKM that can coexist with the expression vector pUXPEaLT19 in E. coli. In the plasmid pRTCKM_ophD, the expression of the inserted ophD gene is under the control of the promoter of the kanamycin resistance gene upstream of the restriction enzyme PacI site. In pRTCRK_ophD, it is under the control of the rplK gene promoter derived from Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
The expression vector pRTCKM is a plasmid in which a DNA derived from a synthetic DNA having the sequence shown in SEQ ID NO: 34 is inserted into the SfiI site of the plasmid vector pRTC_SfiI. Note that the DNA sequence shown in SEQ ID NO: 34 includes the sequence of the SfiI site derived from pRTC_SfiI at both ends. In the sequence shown in SEQ ID NO: 7, the restriction enzyme PacI site and the restriction enzyme NotI site used for the construction of the plasmid pRTCKM_ophD described above exist at base number 227 and base number 245, respectively.
The plasmid vector pRTC_SfiI was constructed according to the following procedure based on the plasmid vector pREP4 (available from Invitrogen as product number V004-50). pREP4 was cleaved with the restriction enzyme HindIII, then blunt-ended and ligated to construct pREP4DH. Further, pREP4DH was cleaved with the restriction enzyme XbaI, blunt-ended and ligated to construct pREP4DHX. A PCR amplified fragment in which a restriction enzyme SfiI site was introduced at the end was obtained by PCR using pREP4DHX as a template and a pair of synthetic DNAs represented by SEQ ID NOs: 35 and 36. PRTC_SfiI was constructed by digesting and ligating the obtained fragment with the restriction enzyme BamHI.
The expression vector pRTCRK was constructed by inserting the rplK gene promoter region of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain into the restriction enzyme SbfI site and the restriction enzyme BglII site of pRTCKM as follows. That is, first, the base sequence of the rplK gene promoter region was obtained from the NCBI GB database as the base number 498398-498577 sequence (SEQ ID NO: 37) at the accession number NC_006958. Subsequently, the chromosomal DNA (100 ng) of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was used as a template, DNA primers having the sequences represented by SEQ ID NOs: 38 and 39 were used, and amplified by PCR reaction using PrimeSTAR DNA polymerase. It was. The amplified DNA fragment was recovered using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen). PRTCRK was constructed by excising from the PCR product with the restriction enzyme SbfI site and the restriction enzyme BglII and incorporating it into the expression vector pRTCKM constructed above.

２．フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・オキシゲナーゼ・タンパク質とフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼ・レダクターゼ・タンパク質の大腸菌内での発現
上記１の（２）で造成したpUXPEaLT_ophA1A2の制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位に上記（３）で造成したプラスミドpRTCRK_ophDのrplKプロモーター領域とフタル酸トランスポーター遺伝子ophDを含む制限酵素SwaI部位から制限酵素NotI部位を挿入してpUXP_ophA1A2-RKP_ophDを構築した。本プラスミドを大腸菌JM109に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109（pUXP_ophA1A2-RKP_ophD）を造成した。この形質転換体は、宿主である大腸菌JM109が４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素を欠損しており、かつプラスミド上にも４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素遺伝子を保有していないので、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性を完全に欠損している。この形質転換体を、2 mlのＬＢ液体培地（10 g/l トリプトン（Difco社製）、5 g/l 乾燥酵母エキス（Difco社製）、10 g/l 塩化ナトリウム）で一晩培養し、前培養とした。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100 mg/lになるように加えた。20 mlのＬＢ培地にアンピシリンを最終濃度100 mg/lになる様に加えた後、前培養液を3/100容量接種し、37℃で培養し対数増殖期にｍ−トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加して30℃で3時間タンパク質生産誘導を行った。2. Expression of phthalate 4,5-dioxygenase / oxygenase protein and phthalate 4,5-dioxygenase / reductase protein in E. coli Restriction enzyme PmeI site of pUXPEaLT_ophA1A2 constructed in (2) above and restriction enzyme NotI The restriction enzyme NotI site was inserted into the site from the restriction enzyme SwaI site containing the rplK promoter region of the plasmid pRTCRK_ophD constructed in (3) above and the phthalate transporter gene ophD to construct pUXP_ophA1A2-RKP_ophD. This plasmid was introduced into E. coli JM109 by a transformation method to construct recombinant E. coli JM109 (pUXP_ophA1A2-RKP_ophD). In this transformant, Escherichia coli JM109 as a host is deficient in 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase and the 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase gene is also present on the plasmid. Therefore, 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase activity is completely deficient. This transformant was cultured overnight in 2 ml of LB liquid medium (10 g / l tryptone (Difco), 5 g / l dry yeast extract (Difco), 10 g / l sodium chloride), Pre-cultured. Ampicillin was added to a final concentration of 100 mg / l to maintain the plasmid. After adding ampicillin to 20 ml of LB medium to a final concentration of 100 mg / l, inoculate 3/100 volume of the preculture, and culture at 37 ° C. The protein production was induced at 30 ° C. for 3 hours after adding to mM.

３．４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の生産
上記実施例１の２でフタル酸４，５−ジオキシゲナーゼを誘導発現させた組換え大腸菌JM109（pUXP_ophA1A2-RKP_ophD）を用いて、フタル酸からの４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の生産を試みた。フタル酸４，５−ジオキシゲナーゼを誘導発現させた菌体を集菌し、１％グルコースを含む50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH 6.8）で洗浄した後、菌体を吸光度600 nmで5.0になるように50 mM リン酸カリウム緩衝液に懸濁した。この菌体懸濁液に対してフタル酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）を終濃度で30 mMになるように添加し、30℃、290 rpmの条件で48時間反応させた。反応開始後0、24、48時間の反応液から2μl採取し、5μlの1 N HCl と0.6 mlの酢酸エチルを加え、激しく5分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを4μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、196μlの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。４−ヒドロキシフタル酸の同定は、標品の４−ヒドロキシフタル酸（和光純薬工業株式会社より購入）と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。一方、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の同定は、質量分析計からの精密質量値をもとに同定した。

ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表１に示すＨＰＬＣ分離条件で組換え大腸菌の変換産物の分析を行った結果、反応48時間で添加したフタル酸の約98％が消失し、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸に転換することがわかった。さらに、少量の４−ヒドロキシフタル酸も生成することが判明した。3. Production of 4,5-cis-dihydrodiol phthalate Using recombinant Escherichia coli JM109 (pUXP_ophA1A2-RKP_ophD) in which phthalate 4,5-dioxygenase was induced and expressed in 2 of Example 1 above, An attempt was made to produce 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid. Bacterial cells in which phthalate 4,5-dioxygenase is induced to be expressed are collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8) containing 1% glucose, and the cells are brought to 5.0 at an absorbance of 600 nm. The suspension was suspended in 50 mM potassium phosphate buffer. Phthalic acid (purchased from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.) was added to this bacterial cell suspension so as to have a final concentration of 30 mM, and reacted at 30 ° C. and 290 rpm for 48 hours. 2 μl was collected from the reaction solution at 0, 24, and 48 hours after the start of the reaction, 5 μl of 1 N HCl and 0.6 ml of ethyl acetate were added, and the mixture was vigorously suspended for 5 minutes and centrifuged. 200 μl of the upper layer (ethyl acetate layer) separated into two layers was taken and transferred to a new 1.5 ml tube and centrifuged. The dried sample was vigorously suspended in 4 μl of acetonitrile and diluted with 196 μl of water. After filtering with a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE). The identification of 4-hydroxyphthalic acid is the same as the standard 4-hydroxyphthalic acid (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) by combining the retention time of high performance liquid chromatography with the accurate mass value from the mass spectrometer. I went. On the other hand, 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid was identified based on the accurate mass value from the mass spectrometer.

As a result of analyzing the conversion product of recombinant E. coli under the HPLC separation conditions shown in Table 1, using an LC-TOF type mass spectrometer, about 98% of the phthalic acid added in 48 hours of reaction disappeared. It was found to convert to 5-cis-dihydrodiol phthalic acid. Furthermore, it has been found that a small amount of 4-hydroxyphthalic acid is also produced.

４．４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸から４−ヒドロキシフタル酸への転換
（１）８０℃と９０℃での転換実験
上述の実施例１の３で得られた４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を含む溶液を50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）で6倍に希釈した。希釈後の４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の濃度は、フタル酸の消失量と４−ヒドロキシフタル酸の濃度から約4.7mMと推測された。この４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸溶液50μlに対して、硫酸を終濃度で5%、塩酸を終濃度で1 N、水酸化ナトリウムを終濃度で1 Nになるようにそれぞれ加えて、80℃または90℃で１時間反応させた。反応０時間および１時間の反応溶液から10μlを採取した。続いて、硫酸および塩酸を添加した場合には5μlの1 N HCl 、または水酸化ナトリウムを添加した場合には25μlの1 N HCl を加えた後、0.25 mlの酢酸エチルを加えて、激しく1分間懸濁した。遠心後、二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200μl採取し、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを4μlのアセトニトリルに懸濁し、196μlの水で希釈した。続いて、孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。
ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表1に示すＨＰＬＣ分離条件で組換え大腸菌の代謝産物の分析を行った結果、硫酸、塩酸、水酸化ナトリウムのいずれの添加においても４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸の96.5〜99.8％が消失し、3.79〜4.3 mMの４−ヒドロキシフタル酸が検出された。4. Conversion from 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid to 4-hydroxyphthalic acid (1) Conversion experiment at 80 ° C. and 90 ° C. 4,5-cis-obtained in Example 1-3 above A solution containing dihydrodiol phthalic acid was diluted 6-fold with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8). The concentration of 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid after dilution was estimated to be about 4.7 mM from the disappearance of phthalic acid and the concentration of 4-hydroxyphthalic acid. To 50 μl of this 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid solution, sulfuric acid was added to a final concentration of 5%, hydrochloric acid to a final concentration of 1 N, and sodium hydroxide to a final concentration of 1 N, respectively. The reaction was carried out at 80 ° C. or 90 ° C. for 1 hour. 10 μl was taken from the reaction solution at 0 hours and 1 hour. Then add 5 μl of 1 N HCl when adding sulfuric acid and hydrochloric acid, or 25 μl of 1 N HCl when adding sodium hydroxide, then add 0.25 ml of ethyl acetate and vigorously for 1 min. Suspended. After centrifugation, 200 μl of the upper layer (ethyl acetate layer) separated into two layers was collected, transferred to a new 1.5 ml tube, and centrifuged. The dried sample was suspended in 4 μl of acetonitrile and diluted with 196 μl of water. Subsequently, after filtration through a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE).
As a result of analysis of recombinant E. coli metabolites under the HPLC separation conditions shown in Table 1 using an LC-TOF type mass spectrometer, it was found that any addition of sulfuric acid, hydrochloric acid, or sodium hydroxide resulted in 4,5-cis. -96.5-99.8% of dihydrodiol phthalic acid disappeared and 3.79-4.3 mM 4-hydroxyphthalic acid was detected.

５．４−ヒドロキシフタル酸の生産の効率化
（１）pHと温度の検討
上述のように、酸性またはアルカリ性の条件で加熱することにより、４−ヒドロキシフタル酸が生成することがわかったので、反応溶液のpHを2.5、3.4、5.3、6.8、8.1、10.2、11.5、13.0にし、温度を20℃から100℃までの10℃刻みで変化させ、反応１時間での4-ヒドロキシフタル酸の生成量を調べた。具体的には、上記実施例１の３と同じ条件で調製した菌体懸濁液に対してフタル酸を終濃度で30 mMになるように添加し、30℃、290 rpmの条件で48時間反応させた。反応後、50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）で6倍に希釈した。続いて、反応溶液のpHは95% 硫酸もしくは10 N NaOHを加えることにより調節した後、４−ヒドロキシフタル酸への転換反応（全量50μl）を、反応中の蒸発を抑制するために、サーマルサイクラーを用いて行った。なお、各反応温度の条件はサーマルサイクラーにより調節を行った。反応０時間および１時間の反応溶液から10μlを採取した。続いて、硫酸および塩酸を添加した場合には5μlの1 N HCl 、または水酸化ナトリウムを添加した場合には25μlの1 N HCl を加えた後、0.25 mlの酢酸エチルを加えて、激しく1分間懸濁した。遠心後、二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200μl採取し、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを4μlのアセトニトリルに懸濁し、196μlの水で希釈した。続いて、孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。
ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表1に示すＨＰＬＣ分離条件で各サンプルの分析を行った。表２に生成した４−ヒドロキシフタル酸の量（mM）を示した。

表２に示すように、酸性条件では、反応溶液のpHと温度をそれぞれpH6.8以下かつ60℃以上にすることにより、4-ヒドロキシフタル酸の生成量が増加することがわかった。さらに、アルカリ性条件では、反応溶液のpHと温度をそれぞれpH11.5以上かつ20℃以上にすることにより、4-ヒドロキシフタル酸の生成量が増加することがわかった。より好ましくは、該溶液のpHと温度をそれぞれpH5.3以下かつ温度を80℃以上にする、または該溶液のpHと温度をそれぞれpH13以上かつ温度を40℃以上にすることにより、該反応液中に著量の４−ヒドロキシフタル酸が生成し蓄積することを見出した。5. Efficiency of production of 4-hydroxyphthalic acid (1) Examination of pH and temperature As described above, it was found that heating under acidic or alkaline conditions produces 4-hydroxyphthalic acid. The pH of the reaction solution is adjusted to 2.5, 3.4, 5.3, 6.8, 8.1, 10.2, 11.5, 13.0, and the temperature is changed in increments of 10 ° C from 20 ° C to 100 ° C to produce 4-hydroxyphthalic acid in 1 hour of reaction. The amount was examined. Specifically, phthalic acid was added to a bacterial cell suspension prepared under the same conditions as 3 in Example 1 to a final concentration of 30 mM, and the conditions were 30 ° C. and 290 rpm for 48 hours. Reacted. After the reaction, it was diluted 6-fold with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8). Subsequently, the pH of the reaction solution was adjusted by adding 95% sulfuric acid or 10 N NaOH, and then the conversion to 4-hydroxyphthalic acid (total amount 50 μl) was performed in order to suppress evaporation during the reaction. It was performed using. In addition, the conditions of each reaction temperature were adjusted with the thermal cycler. 10 μl was taken from the reaction solution at 0 hours and 1 hour. Then add 5 μl of 1 N HCl when adding sulfuric acid and hydrochloric acid, or 25 μl of 1 N HCl when adding sodium hydroxide, then add 0.25 ml of ethyl acetate and vigorously for 1 min. Suspended. After centrifugation, 200 μl of the upper layer (ethyl acetate layer) separated into two layers was collected, transferred to a new 1.5 ml tube, and centrifuged. The dried sample was suspended in 4 μl of acetonitrile and diluted with 196 μl of water. Subsequently, after filtration through a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE).
Each sample was analyzed under the HPLC separation conditions shown in Table 1 using an LC-TOF mass spectrometer. Table 2 shows the amount (mM) of 4-hydroxyphthalic acid produced.

As shown in Table 2, under acidic conditions, it was found that the amount of 4-hydroxyphthalic acid produced increased when the pH and temperature of the reaction solution were adjusted to pH 6.8 or lower and 60 ° C. or higher, respectively. Furthermore, it was found that the production amount of 4-hydroxyphthalic acid increases when the pH and temperature of the reaction solution are adjusted to pH 11.5 or higher and 20 ° C. or higher, respectively, under alkaline conditions. More preferably, the pH and temperature of the solution are set to pH 5.3 or lower and the temperature is set to 80 ° C. or higher, respectively, or the pH and temperature of the solution are set to pH 13 or higher and the temperature is set to 40 ° C. or higher, respectively. It was found that a significant amount of 4-hydroxyphthalic acid was produced and accumulated therein.

６. ４−ヒドロキシフタル酸の生産
上記5の結果を基に、上記3での本培養を20 mlから1Lに変更して30 mMのフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成させた。４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸溶液195 mlに硫酸を添加してpHを5.3に調整した後、90℃で120分間保温した。加熱処理後、塩酸を加えてpH1.5に調整した。酢酸エチル200 mlを加えて激しく懸濁し、上層（酢酸エチル層）の分取を3回行い、酢酸エチル層590mlを得た。これをロータリーエバポレーターで乾固した。残渣を超純水 15 mlに懸濁し、pH7.0になるように水酸化ナトリウムで調整した。得られた4-ヒドロキシフタル酸溶液1μlを12μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、587μlの水で希釈した。孔径0.2μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。
ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表1に示すＨＰＬＣ分離条件で変換産物の分析を行った結果、得られた溶液中の４−ヒドロキシフタル酸濃度は216.9 mMであり、また４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸は検出限界以下であった。6. Production of 4-hydroxyphthalic acid Based on the results in 5 above, the main culture in 3 above was changed from 20 ml to 1 L to produce 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from 30 mM phthalic acid. I let you. Sulfuric acid was added to 195 ml of the 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid solution to adjust the pH to 5.3, and then the mixture was kept at 90 ° C. for 120 minutes. After the heat treatment, hydrochloric acid was added to adjust the pH to 1.5. 200 ml of ethyl acetate was added and suspended vigorously, and the upper layer (ethyl acetate layer) was separated three times to obtain 590 ml of an ethyl acetate layer. This was dried with a rotary evaporator. The residue was suspended in 15 ml of ultrapure water and adjusted with sodium hydroxide to pH 7.0. 1 μl of the resulting 4-hydroxyphthalic acid solution was vigorously suspended in 12 μl of acetonitrile and diluted with 587 μl of water. After filtering with a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE).
As a result of analyzing the conversion product using the LC-TOF mass spectrometer under the HPLC separation conditions shown in Table 1, the concentration of 4-hydroxyphthalic acid in the obtained solution was 216.9 mM, and 4,5 -Cis-dihydrodiol phthalic acid was below the detection limit.

実施例２．培養菌体を用いた４−ヒドロキシフタル酸からの３−ヒドロキシ安息香酸の生産
１．４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素遺伝子のクローニング
バークホルデリア・マルチボランスATCC17616株の４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素が４−ヒドロキシフタル酸の１位のカルボキシル基に作用して脱炭酸反応を行うことは知られていないが、この脱炭酸反応の可能性を調べるために、当該脱炭酸酵素の遺伝子ophCをコードするＤＮＡを得ることにした。ophC遺伝子の塩基配列については、ＮＣＢＩのＧＢデータベースから、アクセッション番号NC_010805における塩基番号541294〜542286の配列（配列番号５）として得た。ＡＴＣＣから入手したバークホルデリア・マルチボランスATCC17616株の染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、配列番号40と41で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いて、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素タンパク質をコードしているophC遺伝子の全領域をPrimeSTAR DNAポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。Taq DNAポリメラーゼによって増幅ＤＮＡ断片の3'末端にＡ残基を付加した後、増幅ＤＮＡ断片をゲル電気泳動法により精製し、pT7BlueのＴベクターに組み込むことにより、ophC遺伝子の全領域を保持するプラスミドpTOPHC1を構築した。さらに配列番号42と43に示す１対の合成ＤＮＡを用いたＰＣＲ法によりophC遺伝子内部に1箇所ある制限酵素NotI部位を破壊したプラスミドpTOPHCdNを造成した。pTOPHCdNから制限酵素PacIと制限酵素NotIによりophC遺伝子を切り出し、上記実施例１の１（１）で造成した発現ベクターpUXPEaLT19に組込むことにより、pUXPEaLT_ophCdNを造成した。Example 2 Production of 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid using cultured cells 1.4 Cloning of 1,5-dihydroxyphthalate decarboxylase gene 4,5-dihydroxy of Burkholderia multiborans ATCC17616 strain Although it is not known that phthalate decarboxylase acts on the carboxyl group at the 1-position of 4-hydroxyphthalic acid to perform decarboxylation, in order to investigate the possibility of this decarboxylation, the decarboxylase It was decided to obtain DNA encoding the gene ophC. The base sequence of the ophC gene was obtained from the NCBI GB database as the base number 541294 to 542286 sequence (SEQ ID NO: 5) at the accession number NC_010805. The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 using a DNA primer having the sequences represented by SEQ ID NOs: 40 and 41 using the chromosomal DNA (100 ng) of Burkholderia multiborance ATCC17616 obtained from ATCC as a template The entire region of the ophC gene encoding a 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase protein having the above was amplified by a PCR reaction using PrimeSTAR DNA polymerase. A plasmid that retains the entire region of the ophC gene by adding an A residue to the 3 ′ end of the amplified DNA fragment with Taq DNA polymerase, purifying the amplified DNA fragment by gel electrophoresis, and incorporating it into the T vector of pT7Blue. pTOPHC1 was constructed. Further, a plasmid pTOPHCdN was constructed in which the restriction enzyme NotI site in the ophC gene was destroyed by PCR using a pair of synthetic DNAs shown in SEQ ID NOs: 42 and 43. The pUXPEaLT_ophCdN was constructed by excising the ophC gene from pTOPHCdN with the restriction enzymes PacI and NotI and incorporating it into the expression vector pUXPEaLT19 constructed in 1 (1) of Example 1 above.

２．４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素タンパク質の大腸菌内での発現
上記実施例１の１で造成したpUXPEaLT_ophCdNを上記実施例１の３で造成したプラスミドpRTCKM_ophDを保持する大腸菌JM109株に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109（pUXPEaLT_ophCdN, pRTCKM_ophD）を造成した。この形質転換体を、プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/l を添加した2 mlのＬＢ液体培地で一晩培養した。この培養液をアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/l を添加した3 mlのＬＢ培地に３％接種し、37℃で培養した後、対数増殖期にｍ−トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加し、さらに30℃で３時間培養を続けることにより、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素タンパク質を発現させた。2. Expression of 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase protein in Escherichia coli pUXPEaLT_ophCdN constructed in 1 of Example 1 above is transformed into E. coli JM109 strain carrying plasmid pRTCKM_ophD constructed in 3 of Example 1 above Recombinant E. coli JM109 (pUXPEaLT_ophCdN, pRTCKM_ophD) was constructed by the method. This transformant was cultured overnight in 2 ml of LB liquid medium supplemented with ampicillin at a final concentration of 100 mg / l and kanamycin at a final concentration of 50 mg / l to maintain the plasmid. This culture solution was inoculated into 3 ml of LB medium supplemented with ampicillin at a final concentration of 100 mg / l and kanamycin at a final concentration of 50 mg / l, cultured at 37 ° C., and then m-toluic acid in the logarithmic growth phase. Was added to a final concentration of 1 mM, and the culture was further continued at 30 ° C. for 3 hours to express 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase protein.

３．４−ヒドロキシフタル酸からの３−ヒドロキシ安息香酸の生産
上記２で４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素を誘導発現させた形質転換体JM109(pUXPEaLT_ophCdN, pRTCKM_ophD)を用いて、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸の生産を行った。誘導発現処理を行った菌体を集菌し、50 mM リン酸カリウム緩衝液（pH6.8）で洗浄した後、吸光度600 nmで5.0になるように50 ｍＭリン酸カリウム緩衝液（pH6.8、1％グルコース含有）に懸濁した。この菌体懸濁液を30℃、290 rpmで５分間保温した後、購入品または上記実施例１−６の調製品である４−ヒドロキシフタル酸を終濃度で30 mMになるように添加し、30℃、1000 rpmで反応させた。反応0、2、18、24時間の反応溶液から2 μlをとり、5 μlの1N HCl と0.6 mlの酢酸エチルを加え、激しく５分間懸濁し、遠心に供した。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200 μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを4 μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、196 μlの水で希釈した。孔径0.2 μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。４−ヒドロキシフタル酸と３−ヒドロキシ安息香酸の同定は、標品の４−ヒドロキシフタル酸または３−ヒドロキシ安息香酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。
ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表１に示すＨＰＬＣ分離条件で組換え大腸菌の代謝産物の分析を行った。分析の結果、投入した４−ヒドロキシフタル酸は購入品および上記実施例１−６での調製品の区別なく、反応24時間で99.9％が消失し、28.3 mM（購入品の場合）と29.8 mM（上記実施例１−６の調製品の場合）の３−ヒドロキシ安息香酸の生産が確認された。3. Production of 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid Using the transformant JM109 (pUXPEaLT_ophCdN, pRTCKM_ophD) in which 4,5-dihydroxyphthalic acid decarboxylase was induced and expressed in 2 above, 4-hydroxy 3-hydroxybenzoic acid was produced from phthalic acid. The cells subjected to inducible expression treatment are collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8), and then 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8) so that the absorbance is 5.0 at 600 nm. And 1% glucose). After this cell suspension is kept at 30 ° C. and 290 rpm for 5 minutes, 4-hydroxyphthalic acid, which is a purchased product or the preparation of Example 1-6 above, is added to a final concentration of 30 mM. The reaction was performed at 30 ° C. and 1000 rpm. 2 μl was taken from the reaction solution of reaction 0, 2, 18 and 24 hours, 5 μl of 1N HCl and 0.6 ml of ethyl acetate were added, vigorously suspended for 5 minutes, and subjected to centrifugation. 200 μl of the upper layer (ethyl acetate layer) separated into two layers was taken, transferred to a new 1.5 ml tube, and centrifuged. The dried sample was vigorously suspended in 4 μl of acetonitrile and diluted with 196 μl of water. After filtering with a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE). The identification time of 4-hydroxyphthalic acid and 3-hydroxybenzoic acid is higher than that of the standard 4-hydroxyphthalic acid or 3-hydroxybenzoic acid (purchased from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.). And the accurate mass values from the mass spectrometer were combined.
Using an LC-TOF mass spectrometer, metabolites of recombinant E. coli were analyzed under the HPLC separation conditions shown in Table 1. As a result of analysis, 99.9% of the 4-hydroxyphthalic acid added disappeared after 24 hours of reaction without distinguishing between the purchased product and the preparation in Example 1-6 above, and 28.3 mM (in the case of purchased product) and 29.8 mM. Production of 3-hydroxybenzoic acid (in the case of the preparation of Example 1-6 above) was confirmed.

実施例４．培養菌体を用いた４−ヒドロキシフタル酸からのゲンチジン酸の生産
１．３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ遺伝子のクローニング
３−ヒドロキシ安息香酸からゲンチジン酸への水酸化を触媒する3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼをコードするDNAとして、コリネバクテリウム・グルタミカムATCC 13032株のcg3354（NC_006958における塩基番号3202427〜3203755、配列番号44）とポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans） CJ2株の3-ヒドロキシ安息香酸 6-ヒドロキシラーゼ遺伝子nagX（ＮＣＢＩのＧＢアクセッション番号NC_008781における塩基番号3338173〜3339375、配列番号46）を得ることにした。これら菌株はＮＢＲＣおよびＡＴＣＣから入手した。ATCC 13032株の染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、配列番号48、49で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いて、配列番号45に示されるアミノ酸配列を有する3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼ・タンパク質をコードしているcg3354遺伝子の全領域を、CJ2株の染色体ＤＮＡ（100 ng）を鋳型として、配列番号50、51で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いて、配列番号47に示されるアミノ酸配列を有する3-ヒドロキシ安息香酸6-ヒドロキシラーゼ・タンパク質をコードしているnagX遺伝子の全領域をPrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。増幅ＤＮＡ断片をQIAquick PCR精製キット（キアゲン社製）を用いて回収した。cg3354遺伝子とnagX遺伝子を制限酵素PacI部位と制限酵素NotIによりPCR産物から切り出し、上記（実施例１−１）で造成した発現ベクターpUXPEaLT19に組込むことにより、pUXPEaLT_cg3354及びpUXPEaLT_nagXを造成した。
上記実施例３−１で造成したpTOPHCdN（10 ng）を鋳型として、配列番号52、41で表される配列を有するＤＮＡプライマーを用いてophC遺伝子の上流に制限酵素SwaI部位を付加した配列番号53で表されるDNA配列を、PrimeSTAR ＤＮＡポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応により増幅させた。増幅ＤＮＡ断片をQIAquick PCR精製キット（キアゲン社製）を用いて回収した。上記で造成したpUXPEaLT_cg3354およびpUXPEaLT_nagXの制限酵素PmeI部位と制限酵素NotI部位との間に、PCR産物から制限酵素SwaIと制限酵素NotIにより切り出したophC遺伝子を挿入してpUXPEaLT_cg3354ophCおよびpUXPEaLT_nagXophCを構築した。Example 4 Production of gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid using cultured bacterial cells Cloning of 1.3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase gene 3-Hydroxybenzoic acid catalyzing hydroxylation of 3-hydroxybenzoic acid to gentisic acid As DNA encoding acid 6-hydroxylase, cg3354 (base numbers 3202427 to 3303755 in NC_006958, SEQ ID NO: 44) of Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 strain and Polaromonas naphthalenivorans CJ2 strain 3- It was decided to obtain hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase gene nagX (base numbers 3338173 to 3339375 in GB accession number NC_008781 of NCBI, SEQ ID NO: 46). These strains were obtained from NBRC and ATCC. Using a chromosomal DNA (100 ng) of ATCC 13032 strain as a template and a DNA primer having the sequence represented by SEQ ID NOs: 48 and 49, 6-hydroxy 3-hydroxybenzoate having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 45 The entire region of the cg3354 gene encoding the lyase protein was transferred to SEQ ID NO: 47 using a chromosomal DNA (100 ng) of CJ2 strain as a template and DNA primers having the sequences represented by SEQ ID NOs: 50 and 51. The entire region of the nagX gene encoding 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase protein having the amino acid sequence shown was amplified by a PCR reaction using PrimeSTAR DNA polymerase. The amplified DNA fragment was recovered using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen). pUXPEaLT_cg3354 and pUXPEaLT_nagX were constructed by excising the cg3354 gene and the nagX gene from the PCR product with the restriction enzyme PacI site and the restriction enzyme NotI and incorporating them into the expression vector pUXPEaLT19 constructed as described above (Example 1-1).
Using pTOPHCdN (10 ng) constructed in Example 3-1 as a template and using a DNA primer having the sequences represented by SEQ ID NOs: 52 and 41, SEQ ID NO: 53 was added with a restriction enzyme SwaI site upstream of the ophC gene Was amplified by a PCR reaction using PrimeSTAR DNA polymerase. The amplified DNA fragment was recovered using a QIAquick PCR purification kit (Qiagen). PUXPEaLT_cg3354ophC and pUXPEaLT_nagXophC were constructed by inserting the ophC gene excised from the PCR product with restriction enzymes SwaI and NotI between the restriction enzyme PmeI site and the restriction enzyme NotI site of pUXPEaLT_cg3354 and pUXPEaLT_nagX constructed as described above.

２．４−ヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素タンパク質と３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ・タンパク質の大腸菌内での発現
実施例１−１で造成したpUXPEaLT_cg3354ophCもしくはpUXPEaLT_nagXophCを実施例１−３で造成したプラスミドpRTCKM_ophDを保持する大腸菌JM109株に形質転換法により導入し、組換え大腸菌JM109(pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD)およびJM109(pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD)を造成した。これら
形質転換体を、2 mlのＬＢ液体培地〔10 g/l トリプトン（Difco社製）、5 g/l 乾燥酵母エキス（Difco社製）、10 g/l 塩化ナトリウム〕で一晩培養した。プラスミドを維持するためにアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/lになるように加えた。3 mlのＬＢ培地にアンピシリンを最終濃度100 mg/l、カナマイシンを最終濃度50 mg/l加えた後、3/100容量接種し、37℃、290 rpmで培養を行った。対数増殖期にｍ−トルイル酸を終濃度1 mMになるように添加し、30℃で3時間タンパク質の生産誘導を行った。2. Expression of 4-hydroxyphthalate decarboxylase protein and 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase protein in Escherichia coli pUXPEaLT_cg3354ophC or pUXPEaLT_nagXophC constructed in Example 1-1 was constructed in Example 1-3 Recombinant E. coli JM109 (pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD) and JM109 (pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD) were constructed by transformation into E. coli strain JM109 carrying pRTCKM_ophD. These transformants were cultured overnight in 2 ml of LB liquid medium [10 g / l tryptone (Difco), 5 g / l dry yeast extract (Difco), 10 g / l sodium chloride]. In order to maintain the plasmid, ampicillin was added to a final concentration of 100 mg / l and kanamycin was added to a final concentration of 50 mg / l. After adding ampicillin at a final concentration of 100 mg / l and kanamycin at a final concentration of 50 mg / l to 3 ml of LB medium, 3/100 volumes were inoculated and cultured at 37 ° C. and 290 rpm. In the logarithmic growth phase, m-toluic acid was added to a final concentration of 1 mM, and protein production was induced at 30 ° C. for 3 hours.

３．４−ヒドロキシフタル酸からのゲンチジン酸の生産
上記２で４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素と３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼを誘導発現させた組換え大腸菌JM109(pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD)およびJM109(pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD)を用いて、４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸の生産を行った。これらの菌体を集菌し、50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8）で洗浄した後、吸光度600 nmで5.0になるように50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH6.8、1％グルコース含有）に懸濁した。この菌体懸濁液を30℃、1000 rpmで5分間保温した後、購入品または上記実施例１−６の調製品である４−ヒドロキシフタル酸を終濃度で30 mMになるように添加し、30℃、1000 rpmで反応させた。反応0、2、18、24時間の反応溶液から2 μlをとり、5μlの1 N HCl と0.6 mlの酢酸エチルを加え、激しく５分間懸濁し、遠心にかけた。二層に分かれた上層（酢酸エチル層）を200 μlとり、新しい1.5 mlチューブに移し、遠心乾燥機にかけた。乾固したサンプルを4 μlのアセトニトリルで激しく懸濁し、196 μlの水で希釈した。孔径0.2 μmのフィルターで濾過した後、ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計（Waters社、LCT Premier XE）による分析に供した。４−ヒドロキシフタル酸とゲンチジン酸の同定は、標品の４−ヒドロキシフタル酸またはゲンチジン酸（シグマアルドリッチジャパン株式会社より購入）と比較して、高速液体クロマトグラフィーの保持時間と質量分析計からの精密質量値を合わせて行った。
ＬＣ−ＴＯＦ型質量分析計を用いて、表１に示すＨＰＬＣ分離条件で組換え大腸菌の代謝産物の分析を行った。組換え大腸菌JM109(pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD)を用いてゲンチジン酸の生産を行った場合、投入した４−ヒドロキシフタル酸は購入品および上記実施例１−６の調製品ともに、反応24時間で99.9％が消失し、30.0 mM（購入品の場合）と29.4 mM（上記実施例１−６の調製品の場合）のゲンチジン酸の生産が確認された。４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素のみが作用して生成する3-ヒドロキシ安息香酸は検出限界以下であった。一方、JM109(pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD)を用いた場合、反応24時間で４−ヒドロキシフタル酸の96.6％（購入品の場合）と55.4％（上記実施例１−６の調製品の場合）が消失し、それぞれ23.7 mM（購入品の場合）と14.2 mM（上記実施例１−６の調製品の場合）のゲンチジン酸が生産された。なお、４，５−ジヒドロキシフタル酸脱炭酸酵素のみが作用して生成する３−ヒドロキシ安息香酸は4.2 mM（購入品の場合）と1.1 mM（上記実施例１−６の調製品の場合）が検出された。3. Production of gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid Recombinant Escherichia coli JM109 (pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD) in which 4,5-dihydroxyphthalic acid decarboxylase and 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase were induced and expressed in 2 above And JM109 (pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD) was used to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid. These cells are collected and washed with 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8), and then 50 mM potassium phosphate buffer (pH 6.8, 1% glucose) so that the absorbance is 5.0 at 600 nm. Contained). After this cell suspension is kept at 30 ° C. and 1000 rpm for 5 minutes, 4-hydroxyphthalic acid, which is a purchased product or the preparation of Example 1-6 above, is added to a final concentration of 30 mM. The reaction was performed at 30 ° C. and 1000 rpm. 2 μl was taken from the reaction solution of reaction 0, 2, 18, and 24 hours, 5 μl of 1 N HCl and 0.6 ml of ethyl acetate were added, and the mixture was vigorously suspended for 5 minutes and centrifuged. 200 μl of the upper layer (ethyl acetate layer) separated into two layers was taken, transferred to a new 1.5 ml tube, and centrifuged. The dried sample was vigorously suspended in 4 μl of acetonitrile and diluted with 196 μl of water. After filtering with a filter having a pore size of 0.2 μm, it was subjected to analysis by an LC-TOF mass spectrometer (Waters, LCT Premier XE). The identification of 4-hydroxyphthalic acid and gentisic acid is based on the retention time and mass spectrometer of high performance liquid chromatography compared to the standard 4-hydroxyphthalic acid or gentisic acid (purchased from Sigma-Aldrich Japan Co., Ltd.). The exact mass value was adjusted.
Using an LC-TOF mass spectrometer, metabolites of recombinant E. coli were analyzed under the HPLC separation conditions shown in Table 1. When gentisic acid was produced using recombinant E. coli JM109 (pUXPEaLT_cg3354ophC, pRTCKM_ophD), the 4-hydroxyphthalic acid added was 99.9% in the reaction 24 hours in both the purchased product and the preparation of Example 1-6 above. It disappeared, and production of gentisic acid of 30.0 mM (in the case of a purchased product) and 29.4 mM (in the case of the preparation of Example 1-6 above) was confirmed. 3-hydroxybenzoic acid produced by the action of only 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase was below the detection limit. On the other hand, when JM109 (pUXPEaLT_nagXophC, pRTCKM_ophD) was used, 96.6% of 4-hydroxyphthalic acid (in the case of purchased product) and 55.4% (in the case of the preparation of Example 1-6 above) disappeared in 24 hours of reaction. 23.7 mM (in the case of a purchased product) and 14.2 mM (in the case of the preparation of Example 1-6 above), respectively, of gentisic acid were produced. The 3-hydroxybenzoic acid produced by the action of only 4,5-dihydroxyphthalate decarboxylase is 4.2 mM (in the case of a purchased product) and 1.1 mM (in the case of the preparation of Example 1-6 above). was detected.

本発明によれば、バイオプロセス法によりフタル酸を原料として４−ヒドロキシフタル酸を安価に製造する方法、フタル酸を原料として３−ヒドロキシ安息香酸を安価に製造する方法、ならびにフタル酸を原料としてゲンチジン酸を安価に製造する方法を提供することができる。 According to the present invention, a method for producing 4-hydroxyphthalic acid at low cost from phthalic acid as a raw material by a bioprocess method, a method for producing 3-hydroxybenzoic acid at low cost from phthalic acid as a raw material, and phthalic acid as a raw material A method for producing gentisic acid at a low cost can be provided.

Claims

以下の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、および以下の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に示すＤＮＡを保有し、フタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生産する能力を有する微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させた後に、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を４−ヒドロキシフタル酸に変換して、該水溶液中に４−ヒドロキシフタル酸を生成、蓄積させ、該水溶液から４−ヒドロキシフタル酸を採取することを特徴とする４−ヒドロキシフタル酸の製造法。
（ａ）配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｂ）配列番号２に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｃ）配列番号１に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｄ）配列番号１に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｅ）配列番号４に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｆ）配列番号４に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｇ）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｈ）配列番号３に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸への転換に関わる機能を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 It contains the DNA shown in the following (a), (b), (c) or (d), and the DNA shown in the following (e), (f), (g) or (h). 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid is produced from 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid in aqueous solution using a microorganism capable of producing 5,5-cis-dihydrodiol phthalic acid. 4-hydroxyphthalic acid is obtained by converting dihydrodiol phthalic acid into 4-hydroxyphthalic acid to produce and accumulate 4-hydroxyphthalic acid in the aqueous solution, and collecting 4-hydroxyphthalic acid from the aqueous solution. Acid production method.
(A) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
(B) conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, including a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 DNA encoding a protein having a function related to.
(C) DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1.
(D) Hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalate A DNA encoding a protein having a function related to conversion to an acid.
(E) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
(F) Conversion from phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid, including a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 DNA encoding a protein having a function related to.
(G) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3.
(H) Hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3, and phthalic acid to 4,5-cis-dihydrodiol phthalate A DNA encoding a protein having a function related to conversion to an acid.

前記微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程が、前記微生物菌体を含む培養液にフタル酸を添加し、該培養液中に４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程である、請求項１記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 The step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid in an aqueous solution using the microorganism comprises adding phthalic acid to the culture solution containing the microbial cells, The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to claim 1, which is a step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid.

前記微生物を用いて、水溶液中でフタル酸から４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程が、前記微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物およびフタル酸を水性媒体中に存在せしめ、該媒体中に４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を生成、蓄積させる工程である、請求項１記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 The step of producing and accumulating 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid from phthalic acid in an aqueous solution using the microorganism comprises culturing the microorganism or treated product of the microorganism and phthalic acid in an aqueous medium. The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to claim 1, which is a step of causing 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid to be produced and accumulated in the medium.

４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を４−ヒドロキシフタル酸に変換する工程が、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸を含む水溶液のpHと温度をそれぞれpH6.8以下かつ60℃以上にする、または該溶液のpHと温度をそれぞれpH11.5以上かつ20℃以上にする工程である、請求項１〜３のいずれか一項記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 The step of converting 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid to 4-hydroxyphthalic acid has a pH and temperature of an aqueous solution containing 4,5-cis-dihydrodiol phthalic acid of pH 6.8 or lower and 60 ° C. or higher, respectively. The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to any one of claims 1 to 3, which is a step of adjusting the pH and temperature of the solution to pH 11.5 or higher and 20 ° C or higher, respectively.

前記微生物が４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性が欠損または減弱している微生物であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。 The 4-hydroxyphthalic acid according to any one of claims 1 to 4, wherein the microorganism is a microorganism deficient or attenuated in 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase activity. Manufacturing method.

前記微生物が、４，５−シス−ジヒドロジオールフタル酸脱水素酵素活性を欠損または減弱している宿主微生物に、前記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に示すＤＮＡ、および前記の（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）または（ｈ）に示すＤＮＡを形質転換法により導入して得られることを特徴とする、請求項５記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造方法。 A host microorganism in which the microorganism is deficient or attenuated in 4,5-cis-dihydrodiol phthalate dehydrogenase activity, the DNA shown in (a), (b), (c) or (d), and The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to claim 5, which is obtained by introducing the DNA shown in (e), (f), (g) or (h) by a transformation method.

前記微生物が下記（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）または（ｐ）に示すＤＮＡを導入することによりフタル酸トランスポーター活性が増強している微生物であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の４−ヒドロキシフタル酸の製造法。
（ｍ）配列番号８に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｎ）配列番号８に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｏ）配列番号７に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｐ）配列番号７に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつフタル酸トランスポーター活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 The microorganism is a microorganism whose phthalate transporter activity is enhanced by introducing the DNA shown in the following (m), (n), (o) or (p): 6. The method for producing 4-hydroxyphthalic acid according to any one of 6 above.
(M) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
(N) A DNA encoding a protein comprising a sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8, and having phthalic acid transporter activity.
(O) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 7.
(P) DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 7 and encodes a protein having phthalic acid transporter activity .

請求項１から７のいずれか１項に記載の方法により４−ヒドロキシフタル酸を生成させた後、４−ヒドロキシフタル酸に以下の（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換し、該水溶液から３−ヒドロキシ安息香酸を採取することを特徴とする３−ヒドロキシ安息香酸の製造法。
（ｉ）配列番号６に示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｊ）配列番号６に示されるアミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換および／または付加された配列を含み、かつ４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（ｋ）配列番号５に示される塩基配列からなるＤＮＡ。
（ｌ）配列番号５に示される塩基配列の全部もしくは一部の配列に相補的な配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ４−ヒドロキシフタル酸を３−ヒドロキシ安息香酸に転換する活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。 After 4-hydroxyphthalic acid is produced by the method according to any one of claims 1 to 7, 4-hydroxyphthalic acid is converted into the following (i), (j), (k) or (l): By mixing a culture of a microorganism having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid or a treated product of the culture, the 4-hydroxyphthalic acid is converted into 3-hydroxybenzoic acid. A method for producing 3-hydroxybenzoic acid, which is converted to an acid and 3-hydroxybenzoic acid is collected from the aqueous solution.
(I) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6.
(J) comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 in which one or several amino acids are deleted, substituted and / or added, and having an activity of converting 4-hydroxyphthalic acid into 3-hydroxybenzoic acid DNA encoding a protein having the same.
(K) DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 5.
(L) Hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of a sequence complementary to all or part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and converts 4-hydroxyphthalic acid to 3-hydroxybenzoic acid DNA encoding a protein having an activity to convert.

前記４−ヒドロキシフタル酸から３−ヒドロキシ安息香酸を生産する能力を有する微生物が（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡを形質転換法により導入して得られたことを特徴とする、請求項８記載の３−ヒドロキシ安息香酸の製造方法。 A microorganism having the ability to produce 3-hydroxybenzoic acid from 4-hydroxyphthalic acid was obtained by introducing the DNA shown in (i), (j), (k) or (l) by a transformation method The method for producing 3-hydroxybenzoic acid according to claim 8, wherein:

請求項１から７のいずれか１項に記載の方法により４−ヒドロキシフタル酸を生成させた後、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを保有し、４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物の培養物または該培養物の処理物を４−ヒドロキシフタル酸に混合することにより、該水溶液中にゲンチジン酸を生成、蓄積させ、該水溶液からゲンチジン酸を採取することを特徴とするゲンチジン酸の製造法。 After producing 4-hydroxyphthalic acid by the method according to any one of claims 1 to 7, in addition to the DNA shown in (i), (j), (k) or (l), 3- A culture of a microorganism having a DNA encoding a protein having hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase activity and capable of producing gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid or a treated product of the culture is treated with 4-hydroxyphthalic acid To produce and accumulate gentisic acid in the aqueous solution, and then collect gentisic acid from the aqueous solution.

前記４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物が、（ｉ）、（ｊ）、（ｋ）または（ｌ）に示すＤＮＡに加えて、３−ヒドロキシ安息香酸６−ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを形質転換法により導入して得られたことを特徴とする、請求項１０記載のゲンチジン酸の製造方法。 In addition to the DNA shown in (i), (j), (k) or (l), the microorganism having the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid has an activity of 3-hydroxybenzoic acid 6-hydroxylase The method for producing gentisic acid according to claim 10 , wherein the gentisic acid is obtained by introducing a DNA encoding a protein having a phenotype by transformation.

前記４−ヒドロキシフタル酸からゲンチジン酸を生産する能力を有する微生物の菌体を含む培養液、もしくは該微生物の培養菌体または該培養菌体の処理物を含む水性媒体の中に、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法により得られた４−ヒドロキシフタル酸を添加し、混合することにより、４−ヒドロキシフタル酸をゲンチジン酸に転換し、該培養液または該媒体からゲンチジン酸を採取することを特徴とする請求項１０または１１記載のゲンチジン酸の製造法。 In a culture solution containing microbial cells having the ability to produce gentisic acid from 4-hydroxyphthalic acid, or an aqueous medium containing cultured cells of the microorganisms or processed products of the cultured microbial cells. The 4-hydroxyphthalic acid obtained by the method according to any one of 1 to 7 is added and mixed to convert 4-hydroxyphthalic acid into gentisic acid, and gentisic acid is converted from the culture solution or the medium. The method for producing gentisic acid according to claim 10 or 11 , wherein the gentisic acid is collected.