JP5593037B2 - 細菌測定用プライマーおよび細菌測定方法 - Google Patents
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細菌由来の核酸を増幅するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、フォワードプライマーとリバースプライマーからなり、
前記フォワードプライマーが、配列番号41で示される配列、配列番号42で示される配列および配列番号43で示される配列からなるポリヌクレオチド並びにその相補鎖からなる群より少なくとも1選択され、且つその配列の連続する15塩基から24塩基からなるポリヌクレオチドであり、
前記リバースプライマーが、配列番号46で示される配列および配列番号47で示される配列からなるポリヌクレオチド並びにその相補鎖からなる群より少なくとも1選択され、且つその配列の連続する15塩基から24塩基からなるポリヌクレオチドである
プライマーセット
である。
サバ6検体、カレイ3検体、アジ3検体の鮮魚サンプルは東京都内の市場より購入し、氷上で実験室まで輸送した。表皮10 cm2を含む10 gを無菌的に採取し、生理的食塩水90mLにホモジナイズ後、適切な希釈液を作成しその100 μl をTSA-ASW平板に塗抹した。20℃で5日間の培養後、コロニー数を計数し、ランダムに選択した20コロニーを 純粋分離し、菌叢解析に供した。 菌株の同定は 16S rDNA の塩基配列解析によって行った (50〜500 bpあるいは50〜1400 bp)。
Murray and Thompson (1980)の方法に従って調製した各菌株のDNAを試料とし、tuf遺伝子の約880bpの部分断片をParadisら(2005)のプライマーによって増幅した。増幅産物はpT7 blue T-vector (Novagen, Madison, WI)にクローニングし、複数個のクローンを塩基配列解析した(primers; T7 and M13-M4, Takara)。塩基配列解析はBigDye terminator ready reaction kit V 3.1 (Applied Biosystems, Foster city, CA, USA) および ABI3130 genetic analyzer (Applied Biosystems)を用いて行った。得られた配列はGENETYX 7.0 software (Software development Co., Ltd, Tokyo, Japan)を用いて解析した。得られた配列を整列し(multiple alignment)、良好と思われた部位にプライマーtuf-769f および tuf-1068rを設計した。
PCR反応は以下の条件で行った; 12.5 μl SYBR Premix Ex Taq II (Takara Bio, Shiga, Japan), 0.5 μl 6-carboxy-X-rhodamine (ROX) reference dye (Takara Bio), 720 nmol/l の769f プライマー、560 nmol/lの 1068r プライマー、2 μlの測定対象溶液. 温度条件は95℃15秒→(95℃10秒-60℃1分)×35回→72℃5分。機器はABI 7900HT sequence detector (Applied Biosystems)を使用した。測定した蛍光値(Rn)をROXリファレンスの蛍光強度で補正し(Rn+)、ΔRn(Rn+-Rn−, Rn−=サイクル3〜15の蛍光値の平均)を算出した。検出サイクル数(Ct)はΔRnが閾値(Rn−算出時に用いた3〜15サイクルにおけるベースラインの標準偏差×10倍の蛍光値)に達したサイクル数とした。
Murray and Thompson (1980)の方法に従って調製した各菌株のDNAを試料とし、一定濃度(5 ng /μl)のDNA溶液を得た(濃度は吸光度より算出、Sambrook et al., 1989)。10倍段階希釈によって得た各濃度のDNA溶液の2 μlをPCRに供した。PCR増幅は3.0 % アガロースゲル電気泳動(NuSieve 3:1 agarose gel 、FMC Bioproducts, Rockland, ME, USA)により確認した。異なる菌株間のPCR増幅効率の比較は、DNA量とCt値をプロットした散布図の回帰直線の式を比較することで行った。具体的には、回帰直線の傾き(s)を用い、増幅効率(e)=101/s−1 により増幅効率を求めた。増幅効率eはXn = Xo × (1+e)n (Xn :標的DNA のサイクルnにおける濃度=コピー数、Xo:標的DNAの初期量、n:サイクル数)。すなわち、eの値は0〜1.0であり、増幅効率が100%であればeの値は1.0を取る。
エロモナス モラスコラム FI56、 シュワネラ フリギディマリナ FI20、およびスタフィロコッカス パステウリ FI64 のそれぞれの一夜培養液をトリプチケースソイ培地 (TSB,
Becton Dickinson)にて10倍段階希釈し、それぞれの1mlからDNAを抽出し、リアルタイムPCRに供した。DNA抽出はMag extractor DNA isolation kit (Toyobo, Co., Ltd, Tokyo, Japan)を用いた。この方法はブーム法 (Boom et al., 1990)を元にした方法である。要約すると、850 μl の溶解液(グアニジン塩酸塩を含む)で細菌細胞を溶解させ、40 μl のシリカコート磁性粒子を添加、10min攪拌を行った。この間にDNAはシリカへ吸着される。その後磁性粒子を3000 gの遠心で集め、洗浄液で2回、70%エタノールで2回の洗浄を行った。風乾した磁性粒子から50μlの滅菌蒸留水10min 攪拌によりDNAを溶出し、遠心上清をDNAサンプルとして使用した。溶出液は全て−20℃で保管した。
サバ30サンプル、アジ11サンプルおよびイワシ12サンプルを異なる日時に購入した。様々な菌数のサンプルを得るために、一部のサンプルは購入後すぐに5℃、10℃、もしくは20℃にて18時間、保管した。それぞれ10gのサンプルを90mlの生理食塩水でホモジナイズし、TSA-ASW寒天培地に塗抹して細菌数を求めると共に、ホモジナイズ液1mlから上述のMag-extractor DNA抽出キットでDNAを抽出した。抽出液2μlを上述のリアルタイムPCRに供し、得られたCt 値とTSA-ASW寒天培地による細菌数(対数に変換)を散布図にプロットした。回帰分析はMicrosoft Excel 2003 (Microsoft Corp., Co., Ltd., Redmond, WA, USA)により行った。
計47検体の鮮魚(23検体のアジ、8検体のサバ、9検体のイワシ、3検体のサンマ、2検体のカレイおよび2検体のカツオ)をあらたに市場より購入した。一部のサンプルは5 ℃, 10 ℃, または 20 ℃ で 18 h保管し、様々な菌数のサンプルを得た。細菌数測定とリアルタイムPCRは上述の通り行った。リアルタイムPCRのCt値から菌数を推計する際には以下の数式により行った;PCR法による細菌数推計値(対数値)= (37.599-Ct) × 2.75−1。 得られた平板菌数およびPCRによる推計菌数は常用対数値に変換し、散布図にプロットした。なお、一部のサンプルは菌叢把握のためTSA-ASW寒天よりコロニーを単離し、菌叢解析に供した。
ここにおいて決定および/または使用したtuf遺伝子の塩基配列情報は国際データベースに登録し、その番号は表4に表記した。
決定したtuf遺伝子の部分配列を多重整列した(表6)。その中で保存性の高いと思われた300bpの領域について詳細に見ると、DNAレベルで58.6 %(クリセオバクテリウム フォルムセンス FI55 対 ブラキバクテリウム チロファーメンタンス FI38) から 99.3% (スタフィロコッカス オーレウス 対 リステリア モノサイトゲネス)の相同性を保っていた。そこでこの領域の両端、塩基位置として769〜788bpおよび1048〜1068bpにユニバーサルプライマーを設計した(塩基位置の表記は大腸菌 K-12 MG1655株の配列に従う:登録番号AE000410)(表7)。プライマー設計に当たっては3’末端から10塩基内にミスマッチを含まないように縮重を考慮してデザインした (表8)。
3.4. 純菌株におけるCt値と菌数の比較
スタフィロコッカス オーレウス FI64、 エロモナス モラスコラム FI56、およびシュワネラ frigidimarina FI20 株の培養液からそれぞれ抽出したDNA溶液のCt値と、それぞれの細菌数は良好な相関を示した(図1)。回帰式はy = −3.29x+ 41.2, 相関係数は0.98 となった。グラフ中、白三角は、シュワネラ フリギディマリナ FI20、白四角は、スタフィロコッカス パステウリ FI64、黒丸は、エロモナス モラスコラム FI56である。
30検体のサバと11検体のアジ、12検体のイワシについてリアルタイムPCRのCt値と細菌数を散布図上にプロットした(図2)。回帰直線はy= −2.753x + 37.628(サバ) y = −2.8611x + 38.207 (アジ)および y=−2.937x + 37.833 (イワシ)となり、それぞれ相関係数は0.936、0.939、および0.937であった。これら3種類のプロットをまとめて1つの回帰直線とすると、y = −2.753x + 37.599 となり、魚種別の回帰直線とほぼ同一であった。そのため、この式よりリアルタイムPCRのCt値から細菌数への推計式を導いた; 当該PCR法による菌数推計値(対数値)/g =(37.599-Ct) /2.753。
リアルタイムPCRより推計した細菌数と平板菌数について、23検体のアジ、8検体のサバ、9検体のイワシ、2検体のカレイ、3検体のサンマ、2検体のカツオを試料として比較した。試料の細菌数はおよそ2.5〜9.0 log CFU/gの範囲であり、それぞれ平板菌数とリアルタイムPCR推計細菌数をプロットしたものが図3である。このプロットの回帰直線はy = 1.00x + 0.21 (相関係数0.94)であり、傾きの95 % 信頼区間は0.92 〜 1.08 、y切片の95%信頼区間は−0.27 〜 0.68となった。これより傾き、切片いずれも1および0と有意に異ならないことが示された(2手法が同等である場合、傾きは1、切片は0となる)。
tuf遺伝子にコードされているタンパク質伸長因子Tu(Ef-Tu)は、タンパク質合成の際にアミノアシル転移RNA(tRNA)をリボソームのA部位へ結合させるという重要な役割を担っている。このためその構造ひいては配列は生物間でよく保存されている。そのため細菌においては、tuf遺伝子はこれまで系統解析や種の識別などに利用されている。また、tuf 遺伝子は染色体上に 1もしくは2コピーである(Warren et al., 2001)。これらのことから、幅広い菌種を同一反応で定量するリアルタイムPCRに用いる遺伝子としてtuf遺伝子は優れていると考えられる。つまり、コピー数のバリエーションや配列のバリエーション等による定量結果への影響が少ないと期待されるためである。ここにおいて、我々は769〜1069bpの領域に保存性の高い領域を見出した。この領域は6つの β-シート 構造がβ-バレル構造の形成に関与しており、アミノアシルtRNAをEf-Tu/GTP複合体へ結合させる反応に関与している(Nissen et al., 1995)。すなわち機能上の重要性が高いため保存性が高いと考えられ、この領域にプライマーを設計した。
2.2.1 リアルタイムPCRによる畜肉菌数推計値と平板培地法による菌数との比較
計12検体の畜肉を都内小売店より購入した。細菌数測定はトリップチケースソイ寒天培地(ベクトンディッキンソン社)にて行い、リアルタイムPCRは上述の通り行った。リアルタイムPCRのCt値から菌数を推計する際には以下の数式により行った; 推定菌数(対数値)= (37.599-Ct) × 2.75−1。 得られた平板菌数およびPCRによる推計菌数は対数値に変換し、散布図にプロットした。
試料の細菌数はおよそ3.6〜8.0 log CFU/gの範囲であり、それぞれ平板菌数とリアルタイムPCR推計細菌数をプロットしたものが図5である。このプロットの回帰直線はy = 1.00x + 0.00(相関係数0.80)であり、良好な相関が示された。畜肉類に合わせてプロトコールを改良することでより良好な相関を確保できると見込まれる。
2.3.1 リアルタイムPCRによる野菜菌数推計値と平板培地法による菌数との比較
計25検体の生鮮野菜、生野菜サラダなど生野菜類からなる食品を都内小売店より購入した。細菌数測定はトリップチケースソイ寒天培地(ベクトンディッキンソン社)にて行い、リアルタイムPCRは上述の通り行った。リアルタイムPCRのCt値から菌数を推計する際には以下の数式により行った; 推定菌数(対数値)= (37.599-Ct) × 2.75−1。得られた平板菌数およびPCRによる推計菌数は対数値に変換し、散布図にプロットした。
リアルタイムPCRより推計した細菌数と平板菌数について、25検体の生野菜類および生野菜類からなる食品を試料として比較した。試料の細菌数はおよそ2.6〜9.1 log CFU/gの範囲であり、それぞれ平板菌数とリアルタイムPCR推計細菌数をプロットしたものが図6である。このプロットの回帰直線はy = 0.98x + 0.13 (相関係数0.85)であり、非常に良好な相関が確認された。
Boom, R., Sol, C.J.A., Salimans, M.M.M., Jansen, C.L., Dillen, P.M.E.W., Noordaa, J., 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 28, 495-503.
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Paradis, S., Boissinot, M., Paquette, N., Belanger, S.D., Martel, E.A., Boudreau, D.K., Picard, F.J., Ouellette, M., Roy, P.H., Bergeron, M., 2005. Phylogeny of the Enterobacteriaceae based on genes encoding elongation factor Tu and F-ATPase β-subunit. Int J Syst Evol Microbiol 55, 2013-2025.
Murray, M.G., Thompson, W.F., 1980. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucl Acids Res 8, 4321-4325
Sambrook, J.E., Fritsch, F. and Maniatis, T.S. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edn. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B.F.C., Nyborg, J., 1995. Crystal structure of the ternary complex of the Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464-1472.
Warren, C., Lathe, III., and Bork, P., 2001. Evolution of tuf genes: ancient duplication, differential loss and gene conversion. FEBS Lett 502, 113-116.
Claims (8)
- 細菌由来の核酸を増幅するプライマーセットであって、前記プライマーセットは、フォワードプライマーとリバースプライマーからなり、
前記フォワードプライマーが、配列番号1で示される配列、配列番号2で示される配列、配列番号3で示される配列、配列番号4で示される配列、配列番号5で示される配列、配列番号6で示される配列、配列番号7で示される配列、配列番号8で示される配列、配列番号9で示される配列、配列番号10で示される配列、配列番号11で示される配列、配列番号12で示される配列、配列番号13で示される配列、配列番号14で示される配列、配列番号15で示される配列、配列番号16で示される配列、配列番号17で示される配列、配列番号18で示される配列、配列番号19で示される配列、配列番号20で示される配列、配列番号21で示される配列および配列番号22で示される配列からなるフォワードプライマーセットであり、
前記リバースプライマーが、配列番号23で示される配列、配列番号24で示される配列、配列番号25で示される配列、配列番号26で示される配列、配列番号27で示される配列、配列番号28で示される配列、配列番号29で示される配列、配列番号30で示される配列、配列番号31で示される配列、配列番号32で示される配列、配列番号33で示される配列、配列番号34で示される配列、配列番号35で示される配列および配列番号36で示される配列からなるリバースプライマーセットである
プライマーセット。 - 請求項1に記載のプライマーセットであって、当該プライマーセットによる細菌の増幅が、複数種類の細菌に由来する核酸についての網羅的な増幅であるプライマーセット。
- 前記細菌が、ファーミキュート、アクチノバクテリア、バクテロイデテスおよびプロテオバクテリアからなる群より少なくとも1選択される請求項1または2に記載のプライマーセット。
- 前記細菌が、アシネトバクター、エロモナス、アルテロモナス、バチルス、ブラキバクテリウム、ブロコトリクス、バルクホルデリア、クリセオバクテリウム、サイトロバクター、コルウェリア、エンテロバクター、エルウィニア、フラボバクテリウム、ジャニバクター、クレブシエラ、コクリア、ラクトバチルス、ラクトコッカス、リステリア、ミクロバクテリウム、ミクロコッカス、モルガネラ、パラコッカス、フォトバクテリウム、プラノマイクロビウム、シュードアルテロモナス、シュードモナス、サイクロバクター、サイクロモナス、ラハネラ、ロージア、サリニバクテリウム、サルモネラ、シネリア、セジョンジア、セラチア、シュワネラ、スフィンゴバクテリウム、スフィンゴモナス、スタフィロコッカス、ビブリオ、ザントモナスおよびエルシニアからなる群より少なくとも1選択される請求項1または2に記載のプライマーセット。
- 細菌を測定する方法であって、請求項1〜4の何れか1項に記載のプライマーセットで試料核酸を増幅すること、および増幅産物から当該細菌を検出することを具備する方法。
- 請求項5に記載の方法であって、更に、当該細菌を検出結果から細菌数を決定することを具備する方法。
- 請求項6に記載の方法であって、前記試料核酸が複数種類の細菌由来の核酸を含む方法。
- 請求項6に記載の方法であって、前記複数種類の細菌由来の核酸が網羅的に増幅される方法。
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