JP5252519B2 - 組換え低アレルゲン植物及び低アレルゲン植物マーカー - Google Patents
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Description
実施例で示すように、本発明者らは、イネにおいて、4番染色体上に位置するfloury-2(flo2)変異の原因遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAに含まれることを明らかにした。さらに、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを明らかにし、本明細書では、この遺伝子(即ち、DNA上で、エクソン、イントロン、5’非コード領域、及び3’非コード領域からなる転写領域、並びにその転写領域の転写を調節するエンハンサー/プロモーター領域からなる領域のことをいう。)をイネfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、他の植物において、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAと相同領域に含まれ、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子の相同遺伝子を、その植物におけるfloury-2遺伝子と呼ぶ。また、配列番号2に示されるアミノ酸配列に対し、1〜数個のアミノ酸が挿入、欠失、置換されたアミノ酸配列を有するペプチドであって、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドと同じ機能を有するペプチドをコードする遺伝子も、floury-2遺伝子と呼ぶものとする。
本発明の一実施態様は、flo2変異植物の新規製造方法である。従来は、植物に変異源を投与して、ランダムに染色体DNAに変異を導入し、以前から知られていたflo2変異植物(例えば、イネの場合EM36系統やEM37系統)と交配させ、相補しない変異体を選ぶという相補性検定によりflo2変異体を選択していた。しかし、本発明の発明者らによりflo2変異体における原因変異、及びflo2変異の原因遺伝子であるfloury-2遺伝子が同定され、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることができるようになった。
本発明の他の実施態様は、遺伝子組換え低アレルゲン植物の新規製造方法である。
flo2変異イネでは、食物アレルギーの主因である16kDaアレルゲンタンパク質の発現が減少していることが明らかになっている(上記特許文献2参照)。従って、上記のようにflo2変異植物を製造することにより、遺伝子組換え低アレルゲン植物を製造することができる。
本発明のさらに別の実施態様は、floury-2遺伝子の遺伝子関連物質である低アレルゲン植物またはfloury-2変異植物のマーカーである。ここで、遺伝子関連物質とは、DNA、RNA、タンパク質、またはそれらの一部を含み、遺伝子が転写されてから最終産物になるまでの過程に関係する分子であって、さらに、機能の低下を検出するために用いることができる物質のことをいう。
ここでも、対象となる植物は、特に限定されないが、低アレルゲン植物の開発が期待されている、イネ、麦、ソバ等の植物が好ましい。
==flo2遺伝子座の詳細なマッピング==
これまでに、flo2遺伝子座は、4番染色体上にあることが明らかになっていた。そこで、DNAマーカーを用い、flo2遺伝子座の詳細なマッピングを行った。
72.4-5-1(In): ATGTGTGGTGTTTGAGCATC(配列番号3)
72.4-3-1(In): TTCTCGAATGCAATAGCGCC(配列番号4)
72.4-5-1(Jp): CTGTGTGGTGTTTGTGCACC(配列番号5)
72.4-3-1(Jp): TTCTCGTACGCGATTGCGAC(配列番号6)
85-5-1(In):CCAGGATCTTGGGGCCTTCA(配列番号7)
85-3-4(In):CTCCGGCTCTCTGTCGTCAC(配列番号8)
85-5-1(Jp):CCAGGATCTTGGGGCCTTGA(配列番号9)
85-3-4(Jp):CTCCGGCTCTCTACCGTCGC(配列番号10)
これらの結果より、flo2遺伝子座は105cM付近にあることが示唆されたので、その近傍でPCRを行うことにより、より詳細なマッピングを行った。
106-5-3(In):ACCGTTGACTTTTTAGCACA(配列番号11)
106-3-2(In):CCATGCCAACGTTTGACTAT(配列番号12)
106-5-3(Jp):ACCGTTAACTTTTTAGCATA(配列番号13)
106-3-2(Jp):CCGTGCTAACGTTTGACTGT(配列番号14)
105-5-3(In):CTTGTGTTTTGCAATCCTCT(配列番号15)
105-3-1(In):CCTTAGATGAACTTATTCTT(配列番号16)
105-5-3(Jp):CTTGTGTTTTTCAATCCTTT(配列番号17)
105-3-1(Jp):CCTTAGATAAACTTATTCCT(配列番号18)
37kbのDNAに対し、ORFの検索を行ったところ、(A)OSJNBa0033G05.19(297)、(B)OSJNBa0033G05.20(802)、(C)OSJNBa0033G05.21(575)、(D)OSJNBa0070011.2(1721)の4つの遺伝子(A)〜(D)が37kb 内に存在し、flo2遺伝子の候補になった(カッコ内はアミノ酸数)。そこで、flo2変異型EM37変異体の塩基配列を決定したところ、(D)OSJNBa0070011.2遺伝子において、配列番号1に示すDNAの第9981番目のGがAに置換し、その結果、本来828番目のトリプトファンをコードするコドンが、ストップコドンに変異していた(図2)。一方、他の3つの遺伝子には、変異は無かった。
A:GTCATGGGCGGGTCCAAG(配列番号31)
GGCAGGCTCTGTCGAAAC(配列番号32)
B:TTGGTTATGCTGGTCCTT(配列番号33)
TGGGCTCTAAGAACTAGAC(配列番号34)
C:GAAGATCTGCCAGCAATGG(配列番号35)
GCGAATCACGGAAGATTGG(配列番号36)
D−1:CTCAATACTCGGAGTGGTT(配列番号37)
TATTGGCAGGCATGTTCTC(配列番号38)
D−2:TTAGGCCGTGTGGTAGAG(配列番号39)
GGACCACAAACTGCTACA(配列番号40)
を用い、94℃で30秒−55℃で30秒−72℃で3分のサイクルを30サイクル行なった。図3に示すように、野生型と比べ、EM37においては、OSJNBa0070011.2遺伝子(D)の発現は低下していた。他の遺伝子に関しては、遺伝子AはEM37の方が発現量が高く、遺伝子Bは両者とも発現が極めて低く、遺伝子B、遺伝子Cともに発現量に変化がなかった。
Claims (26)
- 遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するRNAi用またはアンチセンスRNA用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする製造方法。 - 遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するRNAi用またはアンチセンスRNA用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。 - floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項1又は2に記載の製造方法。
- 遺伝子組換え低アレルゲンイネの製造方法であって、配列番号1に示すDNAの第9981番目のGをAに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。
- floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するRNAi用またはアンチセンスRNA用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする製造方法。 - floury-2変異イネの製造方法であって、相同組換え用floury-2遺伝子、floury-2遺伝子に対するRNAi用またはアンチセンスRNA用核酸をゲノムに導入することにより、floury-2遺伝子の機能を特異的に低下させることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする製造方法。 - floury-2遺伝子の発現を低下させることにより、floury-2遺伝子の機能を低下させることを特徴とする請求項5又は6に記載の製造方法。
- floury-2変異イネの製造方法であって、配列番号1に示すDNAの第9981番目のGをAに置換した相同組換え用floury-2遺伝子をゲノムに導入することを特徴とする方法。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の製造方法によって製造された遺伝子組換え低アレルゲンイネ。
- 請求項5〜8のいずれかに記載の製造方法によって製造されたfloury-2変異イネ。
- 請求項9または10に記載のイネの種子。
- 単離された、floury-2遺伝子のDNA、RNA、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とするマーカー。 - 単離された、floury-2遺伝子のDNA、RNA、タンパク質、またはそれらの一部である低アレルゲンイネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。 - 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする方法。 - 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 - 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする方法。 - 低アレルゲンイネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 - 単離された、floury-2遺伝子のDNA、RNA、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とするマーカー。 - 単離された、floury-2遺伝子のDNA、RNA、タンパク質、またはそれらの一部であるfloury-2変異イネのマーカーであって、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするマーカー。 - floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする方法。 - floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の機能の増減を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 - floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とする方法。 - floury-2変異イネの同定方法であって、
floury-2遺伝子の発現を調べることを含み、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とする方法。 - 低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用PCRプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号1に示される塩基配列を有するDNAであることを特徴とするキット。 - 低アレルゲンイネまたはfloury-2変異イネを同定するためのキットであって、
floury-2遺伝子の発現検出用PCRプライマーペア、またはfloury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を含有し、
前記floury-2遺伝子が、配列番号2に示されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする遺伝子であることを特徴とするキット。 - floury-2遺伝子産物の発現検出用抗体を用いたイムノクロマト法(Immunochromatography)によってfloury-2遺伝子産物を検出できる検出器を備えていることを特徴とする請求項24又は25に記載のキット。
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