JP5101758B1 - 可溶性lr11の免疫学的測定方法 - Google Patents
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Abstract
生物由来試料中の可溶性LR11の免疫学的測定方法であって、当該試料をスルホベタイン型両性界面活性剤及びアミドスルホベタイン型両性界面活性剤から選ばれる1種以上で処理することを特徴とする可溶性LR11の免疫学的測定方法。
【選択図】図1
Description
従って、本発明の課題は、従来法で測定された試料間の相対関係に影響を与えずに、測定時間が短縮された、より実用的な生物試料中の可溶性LR11の免疫学的測定方法を提供することである。
また、LR11の高次構造を認識するモノクローナル抗体を得るためには、ヒトLR11全長遺伝子が挿入されたベクターの使用が最適であるが、前記LR11タンパク質の断片(ペプチド)をコードする遺伝子が挿入されたベクターも使用することができる。
DNA免疫法は、上記ベクターを単独又は混合して、従来公知の様々な遺伝子導入法(例えば筋肉注射、エレクトロポレーション、又は遺伝子銃等)のいずれかを用いて、免疫する動物(マウス、又はラット等)の皮下に注入し、免疫する動物由来の細胞内に取り込ませることにより実施できる。
で表される化合物が好ましい。
なお、本明細書における「試料希釈液」とは、生物由来試料中の可溶性LR11の濃度を免疫反応に好適な濃度又は含量に、直接又は間接的に調整(希釈)するための試液をいう。「前処理液」又は「第一試薬(液)」など、名称の如何を問わない。
免疫学的測定方法としては、前記したように、抗原抗体反応を利用した可溶性LR11の測定方法であれば特に制限されないが、異なる抗原認識部位を有する、少なくとも2種の抗体を用いて免疫複合体を形成させる工程を含む測定方法が好ましい。異なる抗原認識部位を有する、少なくとも2種の抗体を用いて免疫複合体を形成させる工程を含む測定方法としては、例えば、サンドイッチELISA(酵素標識免疫吸着測定法)、免疫比濁法(TIAやLTIA)、イムノクロマトグラフ法等が挙げられる。前記例示した態様から明らかなように、本発明の免疫学的測定方法は、ヘテロジーニアス系であってもホモジーニアス系であってもよい。要は、本発明の両性界面活性剤で処理した試料が、一度以上、抗可溶性LR11抗体との間で抗原抗体反応が行われるように設計されていればよい。
本明細書において、抗原抗体反応を「一次反応」、「二次反応」のように区別して記載する場合があるが、それは、反応ステップが複数ある等、その実施態様の説明のために記載したものであって、本発明を限定することは意図していない。
前記したように、本発明において「定量」の語は、いわゆる「定量」と「半定量」の両方の概念を含み、また、さらに、臨床診断における疾病罹患の判断基準になるように検出感度が設定されている場合等には、可溶性LR11存在の有無を検出する、いわゆる「定性」の概念も包含している。
ビオチン標識抗体も公知の方法によって作製できるが、市販のビオチン化試薬(例えば、PIERCE社製、Sulfo−NHS−Biotinylation Kit)を用いることでさらに容易に作製することができる。
酵素標識アビジンも公知の方法によって作製できるが、市販品(例えば、PIERCE社製、StreptAvidin, Horseradish Peroxidase Conjugated)を使用することもできる。
当該免疫学的測定用試薬は、抗可溶性LR11抗体と、上記特定の両性界面活性剤とを含むが、これら成分が、試料希釈液と測定試薬、あるいは第一試薬と第二試薬として別々の状態、又は混合された状態であってもよい。また、当該試薬には、可溶性LR11の検出に用いる任意の構成要素、例えば緩衝液、安定化剤や反応容器等を含んでいてもよい。
サンドイッチELISAの場合、例えば、本発明の両性界面活性剤を含有する試料希釈液、本発明の両性界面活性剤を含有する標識抗体液、本発明の両性界面活性剤を乾燥状態で含有する抗可溶性LR11抗体が固定化されたマイクロプレートが挙げられる。LTIAの場合、例えば、本発明の両性界面活性剤を含有するが抗可溶性LR11抗体が固定化されたラテックス粒子を含有しない試液、本発明の両性界面活性剤を含有し、かつ抗可溶性LR11抗体が固定化されたラテックス粒子を含有する試液が挙げられる。イムノクロマトグラフ法の場合、例えば、本発明の両性界面活性剤を含有する試料希釈液、サンプルパッドあるいは標識抗体含有パッドに本発明の界面活性剤を含浸させたイムノクロマト用ストリップ(試験片)を挙げることができる。
また、可溶性LR11免疫学的測定用キットとしては、使用する測定系に即した前記免疫学的測定用試薬を適宜組み合わせて使用することができ、必要であれば測定系の成立に必要な他の試薬あるいは添付文書なども含むことがある。
(1)サンドイッチELISA用マイクロプレートの作製
96穴マイクロプレート(NUNC社製)に、150mmol/L NaCl含有20mmol/L リン酸緩衝液(以下、「PBS」という)(pH7.2)で10μg/mLに希釈した抗可溶性LR11モノクローナル抗体(M3抗体)を1ウェル当たり100μL添加し、室温で2時間静置し、M3抗体を固相化した。96穴マイクロプレートを400μLの0.05%Tween20(登録商標)含有PBS(以下、「PBST」という)で洗浄後、10%スクロース、1%BSA含有PBST(以下、「BSA−PBST」という)を1ウェル当たり200μL添加し、室温で2時間ブロッキングした。ウェル内の液を除去後、デシケーター内で一晩乾燥し、乾燥剤と共にアルミ袋に密封して使用まで冷蔵保存した。
下記する界面活性剤を、それぞれ5.0%となるよう添加したPBSを試料希釈液として用い、ヒト血清(TENNESSEE BLOOD SERVICES INC社より購入。MEGA−9を使用する従来法で測定した可溶性LR11濃度は 3.9ng/mL。以下、当該ヒト血清を「試験血清」ということがある)を11倍希釈して測定試料液とした(測定試料液中の界面活性剤の濃度は、試料希釈液中の濃度の10/11倍濃度)。各測定試料液を(1)で作製したマイクロプレートに1ウェル当たり100μL添加して室温で16時間静置した(前記したように、このときの固相化抗可溶性LR11抗体と測定試料中の可溶性LR11との抗原抗体反応を、「一次反応」ということがある)。
(比較例:N−アシル−N−メチルグルカミンとして)
・MEGA−9:カタログ番号M015、同仁化学研究所社製
(実施例)
・SB10:カタログ番号D4266、SIGMA−ALDRICH社製
・SB12:カタログ番号A1460、Applichem社製
・SB14:カタログ番号A1162、Applichem社製
・CHAPS:カタログ番号C008、同仁化学研究所社製
・CHAPSO:カタログ番号C020、同仁化学研究所社製
SB10、SB12、SB14、CHAPS、CHAPSOのいずれを使用した場合においても、MEGA−9と同様又はそれ以上の吸光度が得られた(図1。なお、図中の吸光度は試料吸光度より試薬ブランク吸光度を差し引いた正味吸光度で表示している)。以上より、本発明の両性界面活性剤は、妨害物質の影響を回避して生物由来試料中の可溶性LR11の測定が可能であることがわかった。
(1)方法
SB10、SB12、SB14、CHAPS及びCHAPSO、それぞれについて、0.04%、0.08%、0.16%、0.31%、0.63%、1.25%、2.5%、または5.0%となるよう添加したPBSを試料希釈液として用い、試験血清を11倍希釈して測定試料液とした(測定試料液中の各界面活性剤の濃度は試料希釈液中の濃度の10/11倍濃度)。一次反応を室温、16時間とすることをはじめ、実施例1と同様の操作により試料中の可溶性LR11の測定を行った。
SB10(□)では、0.63%付近の濃度から測定された試料吸光度と試薬ブランク吸光度との差が明瞭になり、1.25%付近から5.0%まで、吸光度がほぼ一定になった。
SB12(◇)では、0.16%付近の濃度から測定された試料吸光度と試薬ブランク吸光度との差が明瞭になり、0.63%付近で吸最大の吸光度に達し、0.63%から付近から5.0%まで吸光度がほぼ一定になった。
SB14(△)では、0.08%付近の濃度から測定された試料吸光度と試薬ブランク吸光度との差が明瞭になり、1.25%付近から5.0%まで、吸光度がほぼ一定になった。
CHAPS(■)及びCHAPSO(▲)では、0.63%付近の濃度から測定された試料吸光度と試薬ブランク吸光度との差が明瞭になり、2.5%付近から5.0%まで、吸光度がほぼ一定になった(図2。なお、図中の吸光度は試薬ブランク吸光度を差し引く前の吸光度で表示している)。
以上より、本発明の両性界面活性剤は、いずれも広い濃度範囲で可溶性LR11の免疫学的測定に使用可能であることが確認された。
(1)方法
実施例2の結果より、SB10、SB12、SB14、CHAPS、CHAPSOが、それぞれ1.5%、0.63%、3.6%、5.0%、5.0%になるよう添加したPBSを試料希釈液として用い、試験血清を11倍希釈して測定試料液とした(測定試料液中の各界面活性剤の濃度は試料希釈液中の濃度の10/11倍濃度)。一次反応を1時間とし、二次反応を2時間とした以外は実施例1と同様の方法で可溶性LR11の測定を行った。比較例として、MEGA−9が5.0%となるように添加したPBSを試料希釈液として用い、前記と同様の操作にて可溶性LR11の測定を行った。
いずれの両性界面活性剤を用いた場合でも、MEGA−9を用いた比較例の吸光度よりも大きい吸光度を示した。以上より、本発明の両性界面活性剤を用いれば、一次反応を室温、1時間に短縮した場合であっても、MEGA−9を使用する従来法と比較して、可溶性LR11をより高感度に検出することが可能であることがわかった(図3。なお、図中の吸光度は試料吸光度より試薬ブランク吸光度を差し引いた正味吸光度で表示している)。
(1)方法
SB10、SB12、SB14をそれぞれ1.5%、0.63%、3.6%となるよう添加したPBSを試料希釈液として用い、5種類のヒト血清(TENNESSEE BLOOD SERVICES INC社より購入。MEGA−9を使用する従来法で測定した可溶性LR11濃度は、3.8ng/mL、3.9ng/mL、5.4ng/mL、8.0ng/mL及び9.8ng/mL。)を11倍希釈して測定試料液とした(測定試料液中の各界面活性剤の濃度は試料希釈液中の濃度の10/11倍濃度)。一次反応を1時間とし、二次反応を2時間とした以外は実施例1と同様の方法で可溶性LR11の測定を行った。
比較例として、MEGA−9が5.0%となるように添加したPBSを試料希釈液として用い、前記と同様の操作にて可溶性LR11の測定を行った。
実施例、および比較例の結果と、MEGA−9(5.0%)を使用し、一次反応を16時間、二次反応を4時間として測定したときの測定値との相関性を確認した。
MEGA−9(比較例)あるいは本発明の両性界面活性剤を用い、一次反応:1時間、二次反応:2時間として可溶性LR11を測定した結果(縦軸)と、MEGA−9を用い、一次反応:16時間、二次反応:4時間とした従来法で測定した結果(横軸)の相関性を図4に示した。なお、図中の吸光度は試料吸光度より試薬ブランク吸光度を差し引いた正味吸光度で表示している。
比較例である、5.0% MEGA−9、一次反応:1時間、二次反応:2時間の条件(■)では、9.8ng/mLの試料と5.4ng/mLの試料の吸光度は、9.8ng/mLの方が高かったもののその差は僅かであり、8.0ng/mLの試料の吸光度は、9.8ng/mLの試料の吸光度よりも高く、3.8及び3.9ng/mLの試料の吸光度は、5.4ng/mLの試料の吸光度より極端に低かった。
これに対して、本発明の両性界面活性剤を用い、一次反応:1時間、二次反応:2時間として可溶性LR11を測定したところ、いずれの両性界面活性剤(SB10(◇)、SB12(□)、SB14(△))を用いた場合でも、測定された各血清試料の吸光度は従来法の測定値の高低の順に一致しており、濃度依存的な結果であった(図4)。
(1)方法
CHAPS、CHAPSOそれぞれを、5.0%となるよう添加したPBSを試料希釈液として用い、6種類のヒト血清(TENNESSEE BLOOD SERVICES INC社より購入。MEGA−9を使用する従来法で測定した可溶性LR11濃度は、3.1ng/mL、5.2ng/mL、6.7ng/mL、7.2ng/mL及び8.7ng/mL、9.5ng/mL。)を11倍希釈して測定試料液とした(測定試料液中の各界面活性剤の濃度は試料希釈液中の濃度の10/11倍濃度)。一次反応を1時間とし、二次反応を2時間とした以外は実施例1と同様の方法で可溶性LR11の測定を行った。
実施例の結果と、比較例としてMEGA−9が5.0%となるように添加したPBSを試料希釈液として用い、一次反応を16時間、二次反応を4時間として測定したときの測定値との相関性を確認した。
MEGA−9(比較例)あるいは本発明の両性界面活性剤を用い、一次反応:1時間、二次反応:2時間として可溶性LR11を測定した結果(縦軸)と、MEGA−9を用い、一次反応:16時間、二次反応:4時間とした従来法で測定した結果(横軸)の相関性を図5に示した。なお、図中の吸光度は試料吸光度より試薬ブランク吸光度を差し引いた正味吸光度で表示している。
本発明の両性界面活性剤を用い、一次反応:1時間、二次反応:2時間として可溶性LR11を測定したところ、いずれの両性界面活性剤(CHAPS(◆)、CHAPSO(□))を用いた場合でも、測定された各血清試料の吸光度は従来法の測定値の高低の順に一致しており、濃度依存的な結果であった(図5)。
Claims (7)
- 生物由来試料中の可溶性LR11の免疫学的測定方法であって、当該試料をスルホベタイン型両性界面活性剤及びアミドスルホベタイン型両性界面活性剤から選ばれる1種以上で処理することを特徴とする可溶性LR11の免疫学的測定方法。
- 生物由来試料が、血液、血漿、血清、髄液又は尿である請求項1又は2記載の免疫学的測定方法。
- 免疫学的測定方法が、抗原認識部位の異なる、少なくとも2種の抗体を用いて免疫複合体を形成させる工程を含むものである請求項1〜3のいずれか1項記載の免疫学的測定方法。
- 抗可溶性LR11抗体と、スルホベタイン型両性界面活性剤及びアミドスルホベタイン型界面活性剤から選ばれる1種以上とを含むことを特徴とする可溶性LR11免疫学的測定用試薬。
- 請求項5または6に記載の免疫学的測定用試薬を含む可溶性LR11の免疫学的測定用キット。
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