JP5042025B2 - 複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は一般に、複合物、複合物の製造方法、およびその使用方法に関する。本発明はまた、複合物を含むキットにも関する。
世界の統計によれば、毎年50億米国ドルという驚くほどの金額が熱傷ケアのために費やされている。英国(UK)では、約6億ポンドが慢性下肢潰瘍の処置のために毎年費やされている。米国(USA)では、創傷ケア製品に対する出費の推計値は約90億米国ドルである。創傷治癒の平均コストは、褥瘡に対する約27,000米国ドルから糖尿病性創傷に対する約36,000米国ドルまでの範囲にわたる。シンガポールでは、慢性創傷に対して費やされる推定金額は約1億8000万米国ドルである。
第1の局面によれば、
酸素に対して透過性であって微生物に対しては不透過性である半透過性障壁層;および
前記半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層;
を含む複合物が提供される。
酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層;
前記半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層である、少なくとも2つの足場繊維層;および
異なる細胞型を含む足場繊維層である、前記少なくとも2つの足場繊維層のそれぞれに提供される少なくとも1つの細胞、
を含む複合物が提供される。
半透過性障壁層上に繊維のエレクトロスピニングを行って足場繊維層を形成する段階;および
少なくとも1つの細胞を前記足場繊維層に播種する段階;
を含む、複合物を製造する方法が提供される。
本明細書で用いられる以下の単語および用語は、指示された意味を有するものとする。
複合物、複合物の調製方法、および複合物の使用方法の例示的で非限定的な態様を本明細書において開示する。本明細書に開示された態様は、皮膚再建の改善、感染に対する抵抗性の高さ、細胞増殖の増強および費用対効果の点で、先行技術の創傷ドレッシング材ならびに先行技術の組織工学的足場に比べて改善されている。
本複合物は、酸素に対しては透過性であるが、微生物および粉塵に対しては不透過性である半透過性障壁層を含む。半透過性障壁層は、生体材料、合成材料。または混合材料から構成され得る。
本複合物は、半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層を含む。足場繊維層は、図1の装置を用いて製造され得る。
複合物の足場繊維層は、半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって調製される。
動物の皮膚状態を処置するための複合物の使用方法が提供される。皮膚状態を処置するために用いられる複合物は、細胞が播種された複合物であってよい。1つの態様において、HDF細胞が播種された複合物が、皮膚状態を処置するために用いられる。
図1は、ナノファイバー足場層を製造するために用いたエレクトロスピニング装置の概略図である。エレクトロスピニングシステム300は、シリンジポンプ10、高圧電源20、可動性多重紡糸口金システム30およびナノファイバー収集器25を含む。シリンジポンプ10は、ナノファイバーを形成するために用いられる導電性液体を、一連の管(12a、12b、12c)を通して多重紡糸口金システム30へと送る。
上記のようにして製造された複合物は、皮膚状態を処置するために用いられる。図13を参照すると、自己層状皮膚再建(ALDR)法の諸段階が示されている。
ここで、本発明の非限定的な実施例および比較の例を、具体的な実施例を参照することによってさらに詳細に記載するが、それらは本発明の範囲を少しでも限定するものとはみなされるべきでない。
テガダーム(商標)などのポリウレタン材料中の接着剤は細胞死を招くと長い間推定されてきた。しかし、本発明者らは、驚いたことに、ケラチノサイト細胞がテガダーム(商標)上で生存し得るだけでなく、その上で実際に直接増殖し得ることを見いだした。
本実施例では、テガダーム(商標)の層の上にケラチノサイト細胞ではなくヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を直接播種する形で実施例1と同じことを行った。図6は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したヒト皮膚線維芽細胞のSEM像を示している。画像は1106倍の分解能で撮影した。図8は、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材の上で培養したHDF細胞の増殖と、組織培養プラスチック容器上での増殖の違いを図示した棒グラフである。増殖はMTSアッセイによって評価した。ここでもまた、本発明者らは、テガダーム(商標)膜材料が、HDF細胞の増殖を支持するために使用可能であり、皮膚状態を処置するための複合物中に用いるのに適した材料であることを見いだした。
開示された態様に従って複合物を作製した。この複合物では、テガダーム(商標)創傷ドレッシング材を半透過性障壁層として用いた。図1の装置を用いて、テガダーム(商標)材料に対してナノファイバー足場層のエレクトロスピニングを行った。電界強度10kVを用い、針半径は0.21mm、スピニング溶液の流速は0.8ml/hrおよび電界距離は12cmとした。ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)を繊維形成性材料として用いた。導電性溶液は、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)をクロロホルムおよびメタノールの混合溶媒(クロロホルムの容積3:メタノールの容積1)中に溶解させ、10wt%のPCL溶液を作ることによって調製した。この導電性溶液を用いて、テガダーム(商標)材料の上にナノファイバーを形成させた。このようにして作製された複合物をTG-NF複合物と呼ぶ。
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF)を、実施例3のTG-NF複合物の足場繊維層の上に播種した。細胞を21日間にわたって増殖させた。HDF細胞は、8カ月齢の中国人乳児(Cell Research Corporation)から入手した。HDFを単層として播き、10%FBS(ウシ胎仔血清)および1%抗生物質溶液(ペニシリン-ストレプトマイシン)を含むDMEM中でコンフルエントになるまで培養した。培地は 3日毎に交換し、培養物は5%CO2を含む加湿インキュベーター内で37℃で維持した。培地および試薬はすべてResearch Biolabs(Sigma, St Louis, MO, USA)から購入した。
特性決定のために、PCLナノファイバー構築物およびTG-NF構築物に、金をスパッターコーティングした(BAL-TEC;SCD 005 Sputter Coater;Germany)。構築物の形態画像の撮影は、加速電圧15kVで電界放射型走査電子顕微鏡(FEI Co.;XL30 FEG SEM;USA)を用いて行った。
PCL足場構築物およびTG-構築物の上での細胞の形態を第3日、第7日および第21日にFESEMにより調べた。第3日(図11aおよび11bを参照)の時点では、HDFは集密度約10%にようやく達したことが認められた。これは、21日の期間にわたる増殖を観察するために、この検討に用いたHDF播種密度が低いことに起因した。細胞は特徴的な紡錘形をしていて、増殖の過程でナノファイバー性基質にまたがって引き伸ばされていることが認められた。
PCLナノファイバー足場構築物およびTG-NF構築物を4%ホルマリン中で固定し、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)で染色した。その後、個別に染色した基質を、構造物全体を液体窒素中に浸漬することにより、二層のOCT包埋媒質(Leica;Germany)の間に包埋した。クリオスタット(Leica CM3050S;Germany)を用いて連続切片(5μm)を切り出し、倒置光学顕微鏡(Leica DM IRB;Germany)により観察した。
線維芽細胞は足場依存性細胞であるため、エレクトロスピニングを行ったナノファイバー性構築物の高度に特異的な表面特性および多孔性は、基質内部での細胞およびその細胞外マトリックス(ECM)の接着ならびに移動を補助するのではないかと推測した。
Y.Z. Zhangら[26]を参照すれば、骨髄ストロマ細胞(BMSC)が、ゼラチン/PCL複合物足場内部で、深さ114μmまで増殖し得ることが認められている。本発明者らは、細胞の増殖および浸透のために適した足場材料としての、ゼラチンおよびPCLポリマーの使用方法について調べた。ゼラチンには数多くの長所があり、これには生物由来であること、生分解能、生体適合性および比較的低コストで販売されていることが含まれる。ゼラチンはまた、創傷ドレッシング、薬物送達のための担体および密封剤として薬学および生物医学の分野で広く用いられるものとしてそれ自体確立している[26-27]。
画像解析ソフトウエア(ImageJ, National Institute of Health, USA)を用いて、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物ナノファイバーの直径は300〜700nmの範囲にあり(ナノファイバーの80%)、平均直径は500±120nmであることが認められた。3時間のエレクトロスピニングにより、厚さが約30μmであるナノファイバー性マットを得た。かさ密度が公知であることから(1.34g/cm3)、ゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物ナノファイバー足場の多孔度は、式:
多孔度=(1-d/D)×100%
によって得ることができ、式中、dおよびDはそれぞれ見かけ上の密度およびかさ密度を表す[28]。
エレクトロスピニングが行われたゼラチン/TFE/PCLテガダーム(商標)複合物の力学的特性を、卓上一軸性試験機(INSTRON 3345)を用いて測定した。これは10-N荷重計をクロスヘッド速度10mm/分として周囲条件下で用いて行った。すべての試料は、足場構築物から寸法20×10mmの長方形の形状として調製し、デジタル式マイクロメーターを用いた測定で平均の厚さは120μmであった。この特性決定手順に大して4つの試料を試験した。具体的な試料の調製方法は、Z.M. Huangら[27]に記述された通りである。
図18からの細胞生存度による細胞活性の光学密度から示されるように、HDF細胞の生存度は、ゼラチン/PCLナノファイバー足場上では7日間にわたり、PCL足場と比較して大きく増加することが認められた。この結果は、図18からの細胞数算定試験によって立証され得る。ゼラチン/PCL複合物足場上の細胞数は、通常のPCL足場上でのそれと比較して約80%増加することが観察されている。興味深いことに、図18からは、ゼラチン/PCL複合物足場について、細胞培養第7日までに光学密度が停滞し始めたことが認められる。これは細胞増殖が停止したことを意味するのではなく、その速度が遅くなったことを意味する。それについて考えられる理由は、この時期には、細胞は細胞増殖または細胞外マトリックスの成長を通じて複合物足場中への浸透に働いているということである。
開示された複合物が、皮膚熱傷などの皮膚状態の処置のために非常に有用であることが理解されるであろう。足場層の中に播種された皮膚細胞が皮膚の治癒を補助することが理解されるであろう。さらに、本複合物は、特に身体が自らを修復することができない状況下で、皮膚の上に防御障壁を形成し、皮膚、皮下、および表皮組織の感染を防ぐ。
Claims (35)
- 酸素に対して透過性であって微生物に対しては不透過性である半透過性障壁層;および
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成された足場繊維層;
を含み、該半透過性障壁層が足場繊維層から脱着可能である、複合物。 - 少なくとも1つの細胞が足場繊維層内に提供される、請求項1記載の複合物。
- 少なくとも1つの細胞が皮膚細胞である、請求項2記載の複合物。
- 皮膚細胞がヒト皮膚線維芽細胞である、請求項3記載の複合物。
- 少なくとも1つの細胞が半透過性障壁層の上に提供される、請求項1記載の複合物。
- 半透過性障壁層がポリマーで構成されている、請求項1記載の複合物。
- ポリマーが、ポリセルロース、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリイミド、ポリアミド、樹脂、ナイロン、ポリシリコン、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリアミド、ポリシリコーン、コポリマー、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項6記載の複合物。
- 半透過性障壁層が、テガダーム(Tegaderm)(商標)、ダーマグラフト(Dermagraft)(商標)、トランスサイト(TransCyte)(商標)、インテグラ(Integra)(商標)およびバイオブレン(Biobrane)(商標)からなる群より選択される少なくとも1つの材料で構成されている、請求項1記載の複合物。
- 半透過性材料が足場繊維層から脱着可能である、請求項1記載の複合物。
- 動物またはヒトの皮膚に対する接着を可能にするために半透過性障壁層の上に接着剤が提供される、請求項1記載の複合物。
- 接着剤が、ゼラチン接着剤、樹脂を基剤にした接着剤、フェノールを基剤にした接着剤、アルデヒドを基剤にした接着剤、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項10記載の複合物。
- 半透過性障壁層の平均孔径が、1μm〜50μm、2μm〜40μm、3μm〜30μm、4μm〜20μm、および5μm〜10μmからなる群より選択される範囲にある、請求項1記載の複合物。
- 足場繊維層が、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される材料で構成される、請求項1記載の複合物。
- 足場繊維層の繊維が同軸繊維である、請求項1記載の複合物。
- 足場繊維層の繊維のサイズが、マイクロサイズの繊維およびナノサイズの繊維のうち少なくとも1つである、請求項1記載の複合物。
- 足場繊維層の厚さが、0.05mm〜5mm、0.05mm〜4mm、0.05mm〜3mm、0.05mm〜2mm、0.05mm〜1.5mm、0.08mm〜1.5mm、0.1mm〜1.5mm、0.2mm〜1.5mm, 0.5mm〜1.5mm、および0.8mm〜1.5mmからなる群より選択される、請求項1記載の複合物。
- 少なくとも1つの細胞が、胚性幹細胞、胚性生殖幹細胞、胎児性組織由来上皮細胞、間葉細胞、内皮幹/前駆細胞、骨髄由来間葉幹/前駆細胞、臍帯血由来間葉幹/前駆細胞、脂肪組織由来間葉幹/前駆細胞、毛包表皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、角膜縁上皮幹細胞、爪床胚細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、腱細胞、頬粘膜および口腔粘膜のケラチノサイト、ならびに線維芽細胞、靱帯線維芽細胞、および歯周靱帯線維芽細胞からなる群より選択される、請求項2記載の複合物。
- 足場繊維層がゼラチンを含む、請求項1記載の複合物。
- 酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層上への繊維のエレクトロスピニングを行う段階を含み、該半透過性障壁層が該繊維から脱着可能である、複合物の製造方法。
- エレクトロスピニングが融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーを用いる段階を含み、ポリマーの濃度が該エレクトロスピニングの間、繊維を形成するのに十分に高い、請求項19記載の方法。
- 融解したポリマーまたは溶液中にあるポリマーが、コラーゲン、ゼラチン、ケラチン、キトサン、ポリペプチド、タンパク質、ポリ-ε-カプロラクトン(PCL)、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアミド、ポリ乳酸、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項20記載の方法。
- 溶液の溶媒が有機溶媒である、請求項20記載の方法。
- 有機溶媒が、アルコール、ケトン、アルデヒド、およびハロゲン化アルキルからなる群より選択される、請求項22記載の方法。
- エレクトロスピニングが、5kV〜25kV、5kV〜20kV、5kV〜15kV、5kV〜10kV、6kV〜15kV、6kV〜14kVおよび8kV〜12kvVからなる群より選択される範囲にある強度を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
- エレクトロスピニングが、5cm〜25cm、5cm〜20cm、5cm〜15cm、5cm〜10cm、5cm〜25cm、10cm〜25cm、および10cm〜15cmからなる群より選択される範囲にある距離を有する電界を印加する段階を含む、請求項19記載の方法。
- エレクトロスピニングが、繊維を形成するためにシリンジ針を用いる段階を含む、請求項19記載の方法。
- 0.1mm〜2mm、0.1mm〜1mm、0.1mm〜0.5mm、0.1mm〜0.3mm、0.2mm〜2mm、および0.2mm〜1.2mmからなる群より選択される範囲にある半径を有するシリンジを選択する段階を含む、請求項26記載の方法。
- 酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層を選択する段階を含む、請求項27記載の方法。
- 酸素に対して透過性であって微生物に対して不透過性である半透過性障壁層;
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層;および
該足場繊維層内に提供される皮膚細胞;
を含み、該半透過性障壁層が該足場繊維層から脱着可能である、接着性パッチ。 - 半透過性障壁層;
該半透過性障壁層の片面に対する繊維のエレクトロスピニングによって形成される足場繊維層である、少なくとも2つの足場繊維層;および
異なる細胞型または同一の細胞型を含む足場繊維層である、該少なくとも2つの足場繊維層のそれぞれに提供される少なくとも1つの細胞;
を含み、該半透過性障壁層が該少なくとも2つの足場繊維層から脱着可能である、複合物。 - 半透過性障壁層に対する繊維のエレクトロスピニングを行って足場繊維層を形成する段階;および
少なくとも1つの細胞を該足場繊維層に播種する段階;
を含み、該半透過性障壁層が該足場繊維層から脱着可能である、複合物を製造する方法。 - 動物の皮膚状態を処置するための薬剤の製造における、請求項29記載の接着性パッチの使用。
- 皮膚状態が熱傷である、請求項32記載の使用。
- 請求項29記載の接着性パッチを、皮膚状態を有する動物の皮膚に対して接着性パッチを適用するための説明書とともに含む、動物の皮膚状態を処置するためのキット。
- 前記皮膚状態が熱傷である、請求項34記載のキット。
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