JP4918188B2 - サブミクロンの水中油型エマルジョンと合わせた微粒子の使用 - Google Patents
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Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は一般に、ワクチン組成物に関する。特に、本発明は捕捉型または吸着型抗原を含む生分解性の微粒子を、サブミクロンの水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョンと組み合わせて使用することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
弱毒化病原体またはサブユニットタンパク質抗原を含む多数のワクチン処方物が開発されてきた。従来のワクチン組成物はしばしば、免疫応答を高めるために免疫アジュバントを含む。例えば、蓄積（ｄｅｐｏｔ）アジュバントがしばしば使用され、これは投与された抗原を吸着および／または沈殿させ、そして注射部位に抗原を保持し得る。典型的な蓄積アジュバントには、アルミニウム化合物および油中水（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）エマルジョンが挙げられる。しかし、蓄積アジュバントは抗原性を増加するが、皮下または筋肉内に注射した場合、重篤な、持続性の局所反応（例えば、肉芽腫、膿瘍および瘢痕）を頻繁に引き起こす。リポ多糖類のような他のアジュバントは、注射および／またはライター症候群（インフルエンザ様症状、全身的な関節の不快感、そして時には前部ブドウ膜炎、関節炎および尿道炎）に対して、発熱性の応答を引き起こし得る。種々の疾患のワクチン組成物において、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａのようなサポニンもまた、免疫アジュバントとして使用されてきた。
【０００３】
より詳細には、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）は、実験ベースで、多くの抗原とともにうまく使用されてきた強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは３つの成分を含む：鉱油、乳化剤、および死菌ミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。水性抗原溶液は、油中水エマルジョンを作製するためにこれらの成分と混合される。ＣＦＡはアジュバントとして有効であるが、主にミコバクテリア成分の存在に起因して重篤な副作用（疹痛、膿瘍形成および発熱を含む）を引き起こす。従って、ＣＦＡはヒトおよび動物用ワクチンに使用されない。
【０００４】
フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）はＣＦＡと類似しているが、細菌性成分は含まない。ＩＦＡは合衆国では使用が許可されていないが、他ではインフルエンザおよびポリオのヒトワクチンにおいて、ならびに狂犬病、イヌジステンバーおよび***の動物ワクチンのために使用されてきた。しかし、ＩＦＡで使用される油および乳化剤の両方が、マウスに腫瘍を引き起こし得るという証拠が示されている。
【０００５】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）はミコバクテリアの細胞壁複合体の最小単位であることが見出され、これはＣＦＡを用いて観測されるアジュバント活性を生成する。例えば、Ｅｌｌｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７４）５９：１３１７を参照のこと。広範なアジュバント効力および副作用を示すいくつかのＭＤＰの合成アナログが生成されてきた。これらのアナログの概説については、Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ（１９７８）２５：６３を参照のこと。
【０００６】
ＭＤＰの代表的なアナログには、ＭＤＰのトレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８７）５：２２３）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：４１７）およびムラミルトリペプチドの親油性の誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９８１）Ｙ．Ｙａｍａｍｕｒａ ａｎｄ Ｓ．Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ．１６７）が挙げられる。
【０００７】
１つのＭＤＰの親油性の誘導体は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙ）−ホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）である。このムラミルトリペプチドはリン脂質末端を含み、これは脂質環境を有する分子の疎水性部分の会合を可能にし、一方、ムラミルペプチド部分は、水性環境と会合する。従って、ＭＴＰ−ＰＥは単独で、安定な水中油エマルジョンを生成するための乳化剤として作用し得る。ＭＴＰ−ＰＥは、０．００８％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する４％スクアレンのエマルジョン（ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低級油）と呼ばれる）で、有効な結果を伴う単純ヘルペスウイルスｇＤ抗原を送達するために、物質的安定性が乏しいにもかかわらず使用されてきた（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１７２０〜１７２７）。最近、４〜５％ｗ／ｖ スクアレン、０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．５％ Ｓｐａｎ（登録商標）８５、および必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する、安全な、高い免疫原性のサブミクロン水中油エマルジョンが、ワクチン組成物に使用するために開発されてきた。例えば、Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」：Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．偏）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７〜２９６を参照のこと。
【０００８】
このようなアジュバントの存在にもかかわらず、従来のワクチンは、しばしば、標的化された病原体に対する十分な防御を提供しない。この点に関して、細胞内の病原体（例えば、多数のウイルス）に対するワクチン接種は、免疫系の細胞性および体液性アーム（ａｒｍ）の両方を標的化するべきであるという証拠が出てきている。
【０００９】
より詳細には、細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）は、細胞内の病原体（例えば、ウイルスおよび悪性細胞によって生成される腫瘍特異的抗原）に対する細胞性免疫防御において重要な役割を果たす。ＣＴＬは、感染した細胞によって表に出されるＭＨＣクラスＩ分子とともにウイルスの抗原決定基を識別することによって、ウイルスに感染した細胞の細胞傷害性を媒介する。タンパク質の細胞質発現は、ＭＨＣクラスＩプロセシングおよび抗原性ペプチドのＣＴＬへの提示に不可欠である。しかし、死滅または弱毒化ウイルスを用いる免疫は、しばしば、細胞内感染を抑制するのに必要なＣＴＬを産生しない。さらに、顕著な遺伝子の異型接合性および／または免疫回避（ｅｓｃａｐｅ）変異体の選択を促進する速い突然変異速度を示すウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザ）に対する従来のワクチン接種技術は、問題がある。従って、ワクチン接種に対する代替技術が開発されてきた。
【００１０】
吸着または捕捉型抗原を有する粒子状のキャリアが、十分な免疫応答を引き出すための試みに使用されてきた。このようなキャリアは、免疫系に対して選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所リンパ節において、抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子はマクロファージによって摂取され得、サイトカイン放出を介して抗原提示を高め得る。特定のキャリアの例には、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される微粒子（ＰＬＧとして公知である）が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であり、一方、ＰＬＧ粒子は、乳酸およびグリコール酸とのエステル結合のランダムな非酵素的加水分解によって、生分解され、正常な代謝経路に沿って排出される。
【００１１】
最近の研究で、捕捉型抗原を有するＰＬＧ微粒子が細胞性免疫を引き起こし得ることが示された。例えば、マイクロカプセル化ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０は、マウスにおいて、ＨＩＶ−特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こすことが示された（Ｍｏｏｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１７４１〜１７４９）。同様に、微粒子でカプセル化されたオボアルブミンは、インビボで細胞性免疫応答をプライムすることが可能であり、経口で投与された場合、粘膜ＩｇＡ応答を引き起こし得ることが示された（Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：１４９〜１５４）。さらに、抗体およびＴ−細胞応答の両方が、ＰＬＧ−捕捉型Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をワクチン接種されたマウスにおいて引き起こされた（Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１５７６〜１５８２）。抗原特異的ＣＴＬ応答もまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイト周囲（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク由来のマイクロカプセル化された短い合成ペプチドを使用して、マウスにおいて引き起こされた。
【００１２】
しかし、捕捉または吸着型抗原を有する微粒子を、サブミクロンの水中油エマルジョンとともに使用することは、これまでには記載されていない。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、サブミクロンの水中油型エマルジョンと組み合わせての、生分解性微粒子（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から誘導されるもの）（捕捉されたまたは吸着された抗原を含む）の使用が、抗原の免疫抗原性を高めるのに役に立つ、という驚くべきかつ予想外の発見に基づく。このような組み合わせの使用は、広範な抗原の免疫抗原性を高めるための、安全で有効なアプローチを提供する。
【００１４】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、サブミクロン水中油型エマルジョン、および生分解性微粒子に捕捉されるまたは吸着される、選択された抗原を包含する組成物に関する。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）サブミクロン水中油型エマルジョン（４〜５％ｗ／ｖ スクアレン、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、および０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５（登録商標）、ならびに必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンを包含する）、ならびに（ｂ）生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された抗原、を包含する組成物に関する。
【００１６】
さらに別の実施態様において、本発明は、（ａ）サブミクロン水中油型エマルジョン、および（ｂ）生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された治療的に有効な量の抗原を、脊椎動物の被験体に投与する工程を包含する免疫処置の方法に関する
なおさらなる実施態様において、本発明は、生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された抗原と、サブミクロン水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する組成物を作製する方法に関する。
【００１７】
特に好ましい実施態様において、微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される。
【００１８】
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を参照することによって、当業者に容易に理解される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該分野内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）を参照のこと。
【００２０】
本明細書および添付の請求の範囲において使用されるように、単数形式「ａ］、「ａｎ］および「ｔｈｅ」は、本明細書が明白に他に示さない限り、複数の言及を含む。
【００２１】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が利用され、そして下記に示したように定義されることが意図される。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、用語「微粒子」とは、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして最も好ましくは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの、粒子のことを言う。好ましくは、微粒子は、針および毛細管を塞ぐことなしに、非経口投与を可能にする。微粒子のサイズは、当該分野において周知である技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法および／または走査型電子顕微鏡）によって、容易に測定される。
【００２３】
本明細書中で使用される微粒子は、滅菌可能な、非毒性および生分解性である物質から形成される。このような物質には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用するための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドまたはグリコール酸のコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グルコリド（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））、あるいはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導される。微粒子は、種々の分子量、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する、任意の種々のポリマー出発物質から誘導され得、上記の項目は大部分が選択の問題であり、一部は同時投与した抗原に依存する。これらのパラメータは以下でより十分に議論される。
【００２４】
「抗原」は、抗原が存在する場合、宿主の免疫系を刺激し、細胞性の抗原特異的な免疫応答、または体液性の抗体応答を生じる１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。正常には、エピトープは、約３〜１５の間の、一般的には、約５〜１５の間のアミノ酸を含む。本発明の目的のために、抗原は、任意のいくつかの公知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌に由来し得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍抗原をも意味する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を誘導する能力を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加および置換（一般に、実質上保存的な）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位指向的な変異誘発を通じてのような、意図的なものであってもよいし、抗原を産生する宿主の変異を通じるような偶発性のものであってもよい。
【００２５】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被検体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいう。その一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球細胞により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性のＴ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質に関連して存在し、そして細胞の表面上に発現される、ペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内における破壊、またはこのような微生物に感染された細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的な応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、機能の刺激を助けるために作用し、そして細胞の表面のＭＨＣ分子に関連するペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の活性をフォーカスする。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する分子を含む、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞により産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００２６】
細胞性免疫応答を誘発する組成物およびワクチンは、細胞表面で、ＭＨＣ分子に関連する抗原の提示により、脊椎動物の被験体を感作させるように働き得る。細胞媒介性の免疫応答は、細胞の表面で抗原を提示する細胞に指向されるか、またはその細胞近傍に指向される。さらに、抗原特異的なＴリンパ球は、産生され、免疫された宿主の将来の防御を可能にし得る。
【００２７】
細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイによるか、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球のアッセイによるような多くのアッセイによって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００２８】
従って、本明細書において用いられるような免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の１つ以上の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／またはサプレッサーＴ細胞および／または目的の組成物またはワクチンに存在する抗原を特異的に指向するγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するために働き得、および／または抗体−補体、または免疫された宿主へ防御を提供する抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し得る。このような応答は、当該分野で周知の、標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００２９】
サブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントと一緒に微粒子に捕捉または吸着された選択された抗原を含むワクチン組成物、またはサブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントと被験体に同時投与される微粒子に捕捉または吸着された抗原を含むワクチン組成物は、これが、サブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントなしに微粒子／抗原の等価の量により誘発された免疫応答よりも、免疫応答を誘発するより大きい能力を有する場合、「増強した免疫原性」を示す。従って、ワクチン組成物は、「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、この抗原は、より強力に免疫原性であるか、またはこれを投与された被験体において免疫応答を獲得するのにより少ない用量の抗原しか必要でないからである。このような増強された免疫原性は、動物への、微粒子／抗原組成物およびサブミクロンの水中油型エマルジョン、ならびに微粒子／抗原コントロールの投与することにより、そして、当該分野で周知のラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的アッセイを用いてこの２つに対する抗体の力価を比較することにより決定され得る。
【００３０】
本明細書において提供される用語、抗原の「有効量」または「薬学的に有効な量」は、所望の免疫学的応答および対応する治療的な効果を提供する、薬剤の無毒だが十分な量をいう。以下に指摘するように、必要な正確な量は、被験体の種、齢、および全身状態、処置される状態の重篤度、および目的の特定の抗原、投与の様式などに依存して、被験体の間で変わる。任意の個体例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を用いて当業者により決定され得る。
【００３１】
本明細書において用いられる「処置」は、以下のいずれかをいう：（ｉ）伝統的なワクチンでのような感染または再感染の防御、（ｉｉ）症状の軽減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原の実質的なまたは完全な排除。処置は、予防的に（感染の前に）または治療的に（感染後に）作用され得る。
【００３２】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的にまたはそうでなければ所望されなくはない物質を意味する。すなわち、この物質は、どんな所望されない生物学的効果も生じることなしに、またはこの物質を含む組成物のどんな成分も有害な様式で相互作用することなしに、微粒子アジュバント処方物と共に個体に投与され得る。
【００３３】
「生理学的なｐＨ」または「生理学的な範囲のｐＨ」は、約７．２〜８．０を含む範囲のｐＨ、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲のｐＨを意味する。
【００３４】
「脊椎動物の被験体」は、ｃｏｒｄａｔａ亜門の任意のメンバーを意味する。これは、（制限なく）以下を含む：ヒトおよび他の霊長類（これには、チンパンジーおよび他の類人猿のような非ヒト霊長類ならびにサルの種を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌやネコのような愛玩動物；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、七面鳥および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどの愛玩用、野生および狩猟用のトリを含む鳥類。この用語は、特別な年齢を意味しない。従って、成人（成体）および新生児（新生仔）の両方の個体が包含されることが意図される。上記の系は、上記の任意の脊椎動物種において使用を意図される。なぜならば、これらの脊椎動物すべての免疫系は同様に働くからである。
【００３５】
（ＩＩ．発明を実施するための形態）
本発明は、サブミクロンの水中油型エマルジョンと組み合わせた、捕捉されたまたは吸着された抗原を有する微粒子の使用が、抗原がそれ自身弱い免疫原性である場合でさえ、強力な免疫応答を提供するという発見に基づく。本発明のサブミクロンの水中油型アジュバントは、所望の微粒子／抗原を含むワクチン組成物に組み込まれ得るか、または微粒子／抗原含有組成物と同時にか、直前にか、もしくは引き続きのいずれかで別々に投与され得る。さらに、本発明の処方物は、インビボで産生される抗原の活性を増強するために（すなわち、ＤＮＡ免疫と一緒に）用いられ得る。
【００３６】
本明細書において記載されるワクチン組成物の個々の成分および方法は、公知であるが、このような組み合わせが、成分が別々に用いられた場合に得られるレベルを超えて抗原の有効性を増強することは予期せぬことであり、そして驚くべきことであった。
【００３７】
本発明の方法は、細胞媒介性免疫および／または体液性抗体応答を提供する。従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書に記載された系は、例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子と発現した抗原の会合を提供し得、結果として、目的の抗原に対するインビボの細胞性免疫応答が、増加され得、これはＣＴＬの産生を刺激し、この抗原の将来の認識を可能にする。さらに、本方法は、ヘルパーＴ細胞により抗原特異的応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が所望される任意の抗原との使用を見出す。これには、抗体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープを誘発し得る、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫病原由来の抗原が挙げられる。このような抗原は、ヒトウイルスおよび動物ウイルスによりコードされる抗原を含むがこれらに限定されない、そして構造的または非構造的タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００３８】
この技術は、通常わずかな免疫応答しか誘発しない、細胞内のウイルスおよび腫瘍細胞抗原に対して免疫するために特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための用途を見出す。このタンパク質には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の１型および２型由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶのｇＢおよびｇＨを含む）；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原を含む。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）１２５〜１６９頁、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総説について；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１〜１５７４、種々のＨＳＶ−１にコードされるタンパク質の考察について；米国特許第５，１７１，５６８号 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢおよびｇＤタンパク質ならびにこれらをコードする遺伝子の考察について；Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１、ＥＢＶゲノムのタンパク質コード配列の同定について；ならびにＤａｖｉｓｏｎ およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６、ＶＺＶの総説について：を参照のこと）。
【００３９】
肝炎ウイルスファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原はまた、本明細書中に記載の技術において都合良く使用され得る。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法が公知であるのと同様に、公知である。例えば、国際出願番号ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、Ｅ１（またＥとしても知られる）およびＥ２（またＥ２／ＮＳＩとしても知られる）を含むいくつかのウイルスタンパク質ならびにＮ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）をコードする（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の議論について、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらの各タンパク質ならびにそれらの抗原性フラグメントは、本方法における使用を見い出す。
【００４０】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本方法において都合良く使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原であるｓＡｇ、ならびにプレ表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列であるプレＳ１およびプレＳ２（以前はプレＳと呼ばれた）、ならびに上記の組み合せ（例えば、ｓＡｇ／プレＳ１、ｓＡｇ／プレＳ２、ｓＡｇ／プレＳ１／プレＳ２、およびプレＳ１／プレＳ２））は、本明細書中で使用を見い出す。例えば、ＨＢＶ構造の議論について、「ＨＢＶワクチン−実験室から認可まで：ケーススタディ」Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，１５９〜１７６頁；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００４１】
他のウイルス（ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイスルなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる））の科のメンバー由来のタンパク質を含むがこれらに限定されない）由来の抗原（とりわけ単離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来の抗原を含むがこれらに限定されない）はまた、本願の方法において使用を見い出す。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。例えば、これらのウイルスおよび他のウイルスの説明について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００４２】
より詳しくは、任意の上記ＨＩＶ単離体（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質は、公知でありそして報告されている（例えば、種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ配列の比較について、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）。そして、任意のこれらの単離体由来の抗原は、本方法において使用を見い出す。さらに、本発明は、任意の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む、任意の種々のＨＩＶ単離体由来の他の免疫原性タンパク質に等しく適用できる。
【００４３】
上記で説明したように、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、Ａ型インフルエンザのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生ずるために特に興味深いものである。多数のインフルエンザＡ型ＨＡサブタイプは、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、任意のこれらの単離体由来のタンパク質はまた、本明細書中に記載の免疫処置技術において使用され得る。
【００４４】
本明細書中に記載の方法はまた、多数の細菌性抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原性状態（髄膜炎菌Ａ、ＢおよびＣ、Ｂ型ヘモフィルスインフルエンザ（ＨＩＢ）ならびにヘリコバクターピロリを含むが、これらに限定されない）を引き起こす生物体由来の細菌性抗原）を用いた使用を見い出す。寄生生物性抗原の例は、マラリアおよびライム病を引き起こしている生物学体由来の寄生生物性抗原を含む。
【００４５】
さらに、本明細書中に記載の方法は、種々の悪性癌の処置のための手段を提供する。例えば、本発明の系は、問題となる癌に対して特異的な特定のタンパク質に対する体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答を増大させるために使用され得る（例えば、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカー）。このような腫瘍抗原は、とりわけ、ＭＡＧＥ１、２、３、４など（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２〜８９）を含む任意の種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）；任意の種々のチロシナーゼ；ＭＡＲＴ１（Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原）、ｒａｓ変異体；ｐ５３変異体；ｐ９７メラノーマ抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）を含む。
【００４６】
本発明が広範な疾患の予防または処置のために使用され得ることは、容易に理解できる。
【００４７】
選択される抗原は、引き続く送達のための、微粒子に捕捉されるか、または吸着される。本発明において有用な微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ
Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから市販され、容易に入手できる。例えば、本明細書中で微粒子を形成するために有用なポリマーには、ポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエーテル；ポリ無水物；およびポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（本明細書で両方とも「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒドロキシブチレート））、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ］または「ＰＬＧＡ」として表される））、あるいは、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導されるものが挙げられる。本明細書中で使用する特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所定の抗原についての適切な分子量は、当業者によって容易に測定される。このため、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜２５０，０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般的に、約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。
【００４８】
ＰＬＧのようなコポリマーが微粒子を形成するために使用される場合、本明細書で使用される種々のラクチド：グリコリド比があり、そしてこの比は、大部分が選択の問題であり、一部は同時投与した抗原および所望の分解速度に依存する。例えば、５０：５０ＰＬＧポリマー（５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含有する）は、速い吸収コポリマーを提供するが、７５：２５ＰＬＧはより遅く分解し、そして８５：１５および９０：１０は、さらにより遅く、これは増加したラクチド成分に起因する。ラクチド：グリコリドの適切な比は、問題の抗原および疾患の性質に基づいて、容易に当業者によって測定される。さらに、微粒子と種々のラクチド：グリコリド比との混合物は、所定の抗原に対して所望の放出の動力学を達成し、そして第一および第二両方の免疫反応を提供するために、処方物における使用を見出す。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマーの分子量およびポリマーの結晶化度のようなファクターによって、制御され得る。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、数多くの供給源（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬを含む）から市販され、容易に入手可能である。これらのポリマーはまた、当該分野に周知である技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７〜８５８に記載される）を使用して、乳酸成分の単純な重縮合によって合成され得る。
【００４９】
抗原／微粒子は、当該分野において周知の任意のいくつかの方法を使用して、調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒蒸発技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号、およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５〜１１０３に記載される）が、微粒子を形成するために、本明細書中で使用され得る。これらの技術は、抗原を含有する（抗原が微粒子内に捕捉される場合）、ポリマー溶液の液滴からなる第１のエマルジョンの形成を包含し、これは引き続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含有する連続水層と混合される。
【００５０】
さらに詳細には、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発システムは、微粒子を形成するために使用され得、これは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５〜９６９、およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２に記載される。この技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロリド（またメチレンクロリドおよびジクロロメタンと呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と混合される。ポリマーは、有機溶媒中に、約２〜１５％、より好ましくは約４〜１０％、そして最も好ましくは６％溶液で提供される。ほぼ同量の抗原溶液（例えば、水溶液）が添加され、そしてポリマー／抗原溶液は、例えばホモジナイザーを使用して、乳化される。このエマルジョンを、次いで、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドンのような多量のエマルジョン安定化剤の水溶液と混合する。このエマルジョン安定化剤は、より典型的には、約２〜１５％溶液、典型的には約４〜１０％溶液で提供される。次いで、この混合物を均質化し、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンが生成する。次いで、有機溶媒をエバポレートする。
【００５１】
処方物パラメータは、小さい（＜５μｍ）および大きい（＞３０μｍ）微粒子の調製を可能にするために、操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２〜３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、減少した攪拌はより大きな微粒子を生じ、内側相の体積における増加も同様の結果である。小さな粒子は乞高濃度のＰＶＡを有する低い水相体積によって生成される。
【００５２】
微粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーション（例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ 第２版、Ｗｉｌｅｙ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載される）；空気−懸濁コーティング技術、例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング（例えば、Ｈａｌｌら、（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、１３３〜１５４頁 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９〜１３９に記載される）；イオンゲル化（例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８〜９１０によって記載される）を使用して形成され得る。
【００５３】
上記技術はまた、吸着された抗原を有する微粒子の生成に適用可能である。この実施態様において、微粒子は上記で説明されるように形成されるが、しかし形成後に抗原が微粒子と混合される。
【００５４】
粒径は、例えば、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組込んだ分光器を使用する、レーザー光散乱によって決定され得る。一般に、粒径は室温で決定され、そして問題の試料の多重分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｓｅｓ）（例えば、５〜１０回）と関連して、粒子直径の平均値を得る。また、粒径は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に測定される。
【００５５】
この微粒子を使用する前に、抗原含有量を一般に決定し、従って適切な量の微粒子が被験体に送達され得、その結果十分な免疫反応を誘発する。
【００５６】
微粒子の抗原含有量は当該分野で公知の方法（例えば、微粒子の破壊および捕捉された抗原の抽出）に従って決定され得る。例えば、微粒子は以下に記載されるようにジメチルクロリド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）および蒸留水中に抽出されたタンパク質に溶解され得る（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９１）８：７１３；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：２９７８；およびＥｌｄｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９０）１１：２０５）。
【００５７】
あるいは、微粒子は５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する０．１ＭのＮａＯＨ中に分散され得る。試料を攪拌し、遠心分離し、そして適切なアッセイを用いて目的の抗原について上清をアッセイした。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）１０３：３７−４５を参照のこと。
【００５８】
上記で説明したように、サブミクロン水中油型エマルジョン処方物がまた、抗原／微粒子の送達前、送達と同時、または送達後のいずれかで脊椎動物の被験体に投与される。
【００５９】
本明細書中で使用されるサブミクロン水中油型エマルジョンは、非毒性、代謝可能なオイルおよび市販の乳化剤を含有する。例えば、非毒性、代謝可能なオイルには、植物油、魚油、動物油または合成的に調製されたオイルが挙げられるがこれらに限定されない。鱈肝油、鮫肝油、および鯨油のような魚油が好ましく、鮫肝油で発見されたスクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有するものが特に好ましい。オイル成分は約０．５％〜約２０％の量で、好ましくは約１５％までの量で、より好ましくは約１％〜約１２％の量で、最も好ましくは約１％〜約４％のオイルで存在する（体積％）。
【００６０】
アジュバントの水性部分は緩衝化された生理食塩水または純水（ｕｎａｄｕｌｔｅｒｒａｔｅｄ ｗａｔｅｒ）であり得る。組成物の非経口的な投与が意図されるので、張度（例えば、重量モル浸透圧濃度）が基本的に通常の生理学的流体と同一であるように最終濃度を調製することが好ましい。なぜなら、組成物と生理学的流体との間で異なるイオン濃度による投与後の膨潤または組成物の急速な吸収を防ぐためである。水よりはむしろ生理食塩水が使用される場合、通常の生理学的な条件と適合するｐＨを維持するために生理食塩水を緩衝化することが好ましい。また、特定の事例において、特定の組成物物含量の安定性を確立するためにｐＨを特定のレベルに維持することが必要とされ得る。従って、一般に、組成物のｐＨをｐＨ６〜８にし、そしてｐＨは、任意の生理学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、重炭酸または炭酸緩衝液など）を用いて維持され得る。一般に、水溶性薬剤の量は組成物を所望の最終容量に導くために必要な量で存在する。
【００６１】
水中油型処方物における使用に適した乳化剤には以下が挙げられるが、これらに限定されない：ソリビタン−ベース非イオン性界面活性剤（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）またはＡｒｌａｃｅｌｌ（登録商標）の名で市販されているもの；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）の名で知られている市販のポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステル；Ｍｙｒｊ（登録商標）の名で市販のポリオキシエチレン脂肪酸；Ｂｒｉｊ（登録商標）の名で知られているようなポリオキシエチレン脂肪酸エーテルであって、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから誘導されるもの；など。これらの物質は、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥを含む多数の商業的な供給源から容易に入手可能である。これらの乳化剤は単独または併用して使用され得る。通常、乳化剤は０．０２％〜約２．５％、好ましくは、０．０５％〜約１％、および最も好ましくは０．０１％〜約０．５（重量％）（ｗ／ｗ）の量で存在する。一般に、使用されるオイルの約２０〜３０重量％の量で存在する。
【００６２】
また、エマルジョンは、ムラミルぺプチドのような他の免疫刺激剤を含む（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＯ−ＰＥ）、などが挙げられるが、これらには限定されない）。免疫刺激細菌性細胞壁成分（モノリン脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ））がまた、存在し得る。本発明と共に使用される、種々の適切なサブミクロン水中油型エマルジョン処方物の記載に関しては、以下を参照のこと：例えば、国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、第１９版、１９９５；Ｖａｎ Ｎｅｓｔら、「Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら、編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、頁５７−６２（１９９２）；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）頁２７７−２９６。
【００６３】
サブミクロン粒子（すなわち、直径が１ミクロンン未満の粒子、および大きさがナノメーターの範囲である粒子）を生成するために、多数の技術が使用され得る。例えば、市販の乳化剤に、高圧下で狭い開口部を通して流体に応力を掛けることによって発生する高いせん断応力の原理による操作を用い得る。市販の乳化剤の例には以下が挙げられるが、これらには限定されない：Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，ＩＮＣ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）、およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）。個々の乳化剤に使用される適切な圧力は容易に、当業者によって決定される。例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒが使用される場合、５０００〜３０，０００ｐｓｉでの操作によって約１００〜７５０ｎｍの直径を有する油滴が生成される。
【００６４】
油滴の大きさは、オイルに対する界面活性剤の比（この比が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）、作動圧力（作動圧力が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）、温度（温度が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）を変えること、および両親媒性免疫刺激剤の添加（このような薬剤の添加は液滴の大きさを減少させる）によって変化され得る。実際の液滴の大きさは、特定の界面活性剤、オイルおよび免疫刺激剤（任意）によって、ならびに特定の選択された操作条件と共に変化する。液滴の大きさは、サイジング装置（例えば、市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造される）の使用によって確認され得、そして上記の指針を使用し、実質的に全油滴が直径において１ミクロン未満、好ましくは直径が約０．８ミクロン未満、および最も好ましくは直径が約０．５ミクロン未満となるまで、パラメータを変化し得る。よって、実質的に全体が少なくとも約８０％未満（数による）、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％未満を意図する。粒径の分布は典型的にＧａｕｓｓｉａｎであり、したがって、平均の直径は上述の制限よりも小さい。
【００６５】
本明細書中で使用される特に好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンはスクアレン／水エマルジョンであり、このエマルジョンは必要に応じて、異なる量のＭＴＰ−ＰＥ（例えば、「ＭＦ５９」として公知である、サブミクロン水中油型エマルジョン（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号；Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５、頁２７７−２９６）を含む。ＭＦ５９は、４〜５％ ｗ／ｖのスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、および０．５％ ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５（登録商標）含有し、そして必要に応じて異なる量のＭＴＰ−ＰＥを含有する（微細流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に処方される）。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量、および最も好ましくは、０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。従って、ＭＦ５９−０は、ＭＴＰ−ＰＥのない上記サブミクロン水中油型エマルジョンを意味し、一方、ＭＦ５９−１００は、１用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。ＭＦ６９は、本明細書中で使用される別のサブミクロン水中油型エマルジョンであり、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、および０．７５％ｗ／ｖのＳｐａｎ８５（登録商標）、必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに、別のサブミクロン水中油型エマルジョンはＳＡＦであり、これは１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、５％の プルロニック−ブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ） ポリマー Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰであって、これらはまた、サブミクロンエマルジョンへと微細流動化される。
【００６６】
一旦、サブミクロン水中油型エマルジョンが処方されると、これが微粒子の送達前、送達と同時、または送達後のいずれかで脊椎動物被験体に投与され得る。免疫前に微粒子を投与する場合、このアジュバント処方物は免疫前５〜１０日、好ましくは免疫前３〜５日、および最も好ましくは、免疫前１〜３日または２日で関心の抗原と共に投与され得る。別々に投与される場合、サブミクロン水中油型処方物は、微粒子組成物として同一の送達部位または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。
【００６７】
同時送達が所望される場合、サブミクロン水中油型処方物は微粒子組成物と共に含まれ得る。一般に、微粒子およびサブミクロン水中油型エマルジョンは、単純な混合、攪拌、または振盪によって併され得る。他の技術（例えば、２成分の混合物を迅速に小さな開口部（例えば、皮下用針）を通すような工程）はまた、ワクチン組成物を提供するために使用され得る。
【００６８】
併用される場合、組成物の種々の成分が広範な比で存在し得る。例えば、微粒子およびエマルジョン成分は典型的に、容量比において１：５０〜５０：１、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１で使用される。しかし、特定の目的に関しては、他の比がより適切であり得る。例えば、特定の抗原が微粒子中に取り込まれることが困難であり、かつ低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有する場合、より高い相対的量の抗原成分が要求される。
【００６９】
一旦処方したら、本発明の組成物を一般には注射によって非経口的に、投与する。この組成物を、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかに注射し得る。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。多数回用量スケジュールは、ワクチン摂取の最初のクールが、１〜１０の別々の用量を用いてであり得、続いて、免疫応答を維持および／または増強するために選ばれた所定の続きの時間間隔（例えば、２回目の用量については１〜４ヶ月、および必要ならば続きの用量は数ヶ月後に）で他の用量が与えられ得るスケジュールである。ブーストは、一次免疫応答のために与えられる微粒子／サブミクロン油−水−エマルジョンを用いたものであり得るか、または抗原を含む異なる処方物を用いたものであり得る。投与量摂生はまた、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、そして医者の判断に依存する。さらに、疾患の予防が所望される場合、一般的にワクチンは、目的の病原体での一次感染より前に投与される。例えば、症状または再発の減少などの処置が所望される場合、ワクチンは、一般的には一次感染に続いて投与される。
【００７０】
一般にこの組成物は、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【００７１】
この組成物は、「治療有効量」の目的の抗原を含む。すなわち、サブミクロン水中油型エマルジョンと組み合せた場合、症状を予防、減少または除去するために十分な免疫学的応答を被験体に生じさせる量の抗原が組成物中に含まれることである。正確な必要量は、他の因子の中でも、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的状態；被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される防御の程度；処置される状態の重篤度；選択された特定の抗原およびその投与様式に依存して異なる。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的試行を通じて決定され得る比較的広範な範囲に入る。例えば、本発明の目的のために、有効用量は、１用量あたりで送達される抗原について、代表的には約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲である。
【００７２】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。実施例は、例示的な目的のためのみに提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図されない。
【００７３】
使用される数（例えば、量、温度など）について正確さを保証するように試行されたが、いくらかの実験的誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。
【００７４】
（実施例１：ｐ２４抗原捕捉微粒子の調製）
微粒子を処方するために使用する材料は、以下の通りである：
（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）。ラクチド対グリコリドのモル比は５０：５０、平均分子量＝７０〜１００ｋＤａ（５０：５０ ＰＬＧＡ高粘性ポリマー）（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）；
（２）８％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）３−８３（Ｍｏｗｉｏｌ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）水に、酢酸エチルを６ｍｌ添加して、ねじ口瓶内で１０分間攪拌することにより１０％飽和させたもの；および
（３）３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中のｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２。６．１ｍｇの抗原／ｍｌの濃度であり、２０：１のスクロース：タンパク質を含む。
【００７５】
Ｐ２４ｇａｇ微粒子を、以下の溶媒抽出技術により調製した。微粒子を作製するために、２．５８ｇのポリマー溶液を、０．８ｍｌの抗原溶液と共に３０秒間超音波処理した。一次エマルジョンを、６０グラムの飽和ＰＶＡ溶液と共に、２０ｍｍプローブを有する卓上型ホモジナイザーを使用して、１０Ｋｒｐｍで１時間、ホモジナイズした。得られたエマルジョンに、直ちに２．５リットルの水を添加し、溶媒抽出のために２時間攪拌し、３８μメッシュに通して濾過し、遠心分離により３度洗浄し、そして水浴超音波処理機で１分間、間断的に超音波処理して、次いでレーザー回折測定により大きさを合わせた。その微粒子の直径の大きさの平均は、１０μｍであった。その微粒子を凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。
【００７６】
（実施例２：ＭＦ５９を含むｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
１０頭のヒヒを、２つの群に分け（１群あたり５頭）、そして表１に示した処方物を投与した。群１について、等量のアジュバントＭＦ５９−０およびｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２（クエン酸／Ｔｒｉｓ緩衝液中の）を組合せて、０．７ｍｌの全量を得た。その組成物を穏やかに混合し、そして５００μｌ（１００μｇ ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２／投与量を得た）のワクチンを、大腿筋に筋肉内（ＩＭ）注射した。群２について、１．５ｍｌの２×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、実施例１で作製した４６．８ｍｇのＰＬＧ捕捉ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２処方物に添加した。その物質を、約３０秒間ボルテックスして、全てのビーズを懸濁した。１．５ｍｌのＭＦ５９−０を、再懸濁したビーズに添加して、３ｍｌの全量を得た。その組成物を穏やかに混合し、そして５００μｌ（１００μｇ ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２／投与量を得た）のワクチンを、大腿筋にＩＭ注射した。
【００７７】
両群の動物を、初回の注射後、４週間隔で２度、５００μｌのワクチン組成物でブーストした。２回目のブースト後の２週目（初回免疫後１０週目）で、血清を収集し、そして、本質的に以下に示すように、ＩｇＧ力価を標準的ＥＬＩＳＡにより評価した。
【００７８】
表１に示されるように、含有ｐ２４／ｇａｇ／ｓｆ２＋ＭＦ５９は、非含有ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２＋ＭＦ５９より、有意に大きく抗体応答を誘発した。
【００７９】
【表１】
（実施例３：ｇｐ１２０／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の調製）
微粒子を処方するために使用する材料は、以下の通りである：
（１）ラクチド対グリコリドのモル比が５０：５０で構成され、８０ｋダルトンの平均分子量を有する、３．０ｇのポリマー、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｒｅｓｏｍｅｒ ＲＧ５０５）を、５０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ，ＨＰＬＣグレード、Ａｌｄｒｉｃｈより入手）に溶解した；
（２）１６ｇのポリビニルアルコール（平均分子量１３〜２３Ｋダルトン、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）を、２００ｍｌの脱イオン水に溶解した；および
（３）ＨＩＶ ｇｐ１２０ｓｆ２抗原（Ｃｈｉｒｏｎ、臨床グレード）を、３０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０の緩衝液中、７．２ｍｇ抗原／ｍｌの濃度で使用した。
【００８０】
微粒子を、以下のように調製した。３０ｍｌのガラスの密な壁の（ｈｅａｖｙ−ｗａｌｌｅｄ）試験管内で、１．６７ｍｌのＨＩＶ ｇｐ１２０ｓｆ２抗原を、１６．７ｍｌのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）溶液に添加した。その溶液を、１０ｍｍ直径発生器を備えた、小型手動ホモジナイザーを使用して、２３，０００ＲＰＭで、３分間ホモジェナイズした。次いで、そのホモジネートを２０ｍｍ直径発生器を備えた卓上型ホモジナイザーを使用して、１２，０００ＲＰＭ、全ホモジナイズ時間３分間でホモジナイズしながら１５０ｍｌガラスビーカー中の６６．８ｍｌのポリビニルアルコール溶液にゆっくり注いだ。得られた二重（ｄｏｕｂｌｅ）エマルジョンを含むビーカーに、小型磁気攪拌子を備えた。次いで、これを周囲温度で、中程度（約１０００ＲＰＭ）の攪拌速度下で一晩放置し、ＤＣＭ溶媒をエバポレートさせた。本方法で調製して得られた微粒子を洗浄して、余分なＰＶＡおよび未捕捉の抗原を除去した。微粒子の調製物を約４５０ｍｌの脱イオン水で希釈し、遠心分離して微粒子をペレット化し、上清をデカントし、そして微粒子を約３０ｍｌの脱イオン水に再懸濁することを繰り返して（全３回）、洗浄を完了した。最後の再懸濁の工程後、微粒子を凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。
【００８１】
凍結乾燥した微粒子の小サンプル（１０〜３０ｍｇ）を利用して、粒子の大きさの分布および抗原含量を測定した。このように調製した微粒子の大きさの分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ機器を使用する動的レーザー光散乱法により測定し、そして０．６μｍの大きさの中央値を有することを決定した。抗原含量（％負荷）を、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液中に微粒子のサンプルを溶解することにより測定し、次いで、標準バイシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、タンパク質含量を測定した。微粒子の％負荷を、この方法で測定し、そして０．７重量％のタンパク質を含むことを決定した。
【００８２】
（実施例４：ヒヒにおけるＭＦ５９を含むｇｐ１２０／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
実施例２に記載されるように、ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２に代えてｇｐ１２０／ｓｆ２を使用して、同様の実験を実施した。特に、ｇｐ１２０／ｓｆ２をＭＦ５９−０と組合せ、そして上記のように、群１のヒヒに対して５０μｇ投与した。さらに、実施例１のＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２を、記載のようにＭＦ−５９と組合せ、そして群２の動物に対して５０μｇ投与した。
【００８３】
両群の動物を、初回の注射後４週目で、５００μｌのワクチン組成物でブーストした。血清サンプルを、初回投与の４週後（４ｗｐ１）、ならびに２回目の投与４週後（４ｗｐ２）および２回目の投与後（８ｗｐ２）に採取して、そしてＩｇＧ力価を、以下のようにＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｕ９６、ｃａｔ♯４４９８２４）を、１ウェルあたり１００μｌの、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０中の２μｇ／ｍｌのｇｐ１２０／ｓｆ２抗原で覆った。そのプレートを４℃で一晩インキュベートした。最初に１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（希釈液）、ｐＨ７．５中に１：５０〜１：１０００に希釈したヒヒ血清サンプルを、ＥＬＩＳＡプレート（血清サンプルあたり１列）の上面から底面まで、希釈液で１：２に連続的に希釈することによってサンプルを最初の希釈液より１、２、４、８、１６、３２、６４、および１２８倍高い率で希釈し、ウェルあたり１００μｌサンプルの最終容量にした。希釈液のみ（ブランク）を含む列、および標準血清（標準）を含む列を、各プレートについての比較の目的のために含んだ。ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液で広範に洗浄後、ウェルあたり１００μｌの１：５０００希釈したＧｏａｔ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰ結合体溶液（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋｅ Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ、ｃａｔ♯５５４３２）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で広範に洗浄した。１００μｌの過酸化ＴＭＢ発色液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｔｔｙ ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。呈色反応を、約３分間発色させ、ウェルあたり５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して停止させた。プレートを４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを使用して読み取った。各プレートについて得られたＯＤを、ブランクの列からの平均値を使用した基底ＯＤから減算した。各血清サンプルについての力価を、得られたデータを対数関数に適合して決定した、ＯＤ０．５を達成するために必要な希釈率として表した。
【００８４】
表２に示すように、全ての群で捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２＋ＭＦ５９は、非捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２＋ＭＦ５９より大きい抗体応答を誘発し、初回投与後４週目で見られた応答は、有意により高かった。
【００８５】
【表２】
（実施例５：マウスにおけるＭＦ５９を含むｇｐ１２０／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
ＰＬＧ微粒子に含有させる場合、または吸着させる場合およびＭＦ５９と同時投与させる場合の、ＨＩＶ ｇｐ１２０の免疫応答を刺激する能力をまた、以下のようにマウスにおいて試験した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜７週齢）を、４つの群に分け、そして１０μｇのＨＩＶ ｇｐ１２０および表３に示されるアジュバントを含む５０μｌのワクチン組成物を筋肉内投与した。種々の組成物は、上記の実施例４に記載されるように調製した。
【００８６】
【表３】
動物を、初回注射後４週目および８週目でブーストした。血清を注射後２、６、１０、および１２週目に採取し、そしてＩｇＧ力価を、標準的ＥｌＩＳＡにより（本質的に実施例４に記載されるように）評価した。
【００８７】
得られたものを、表４および図１に示す。全ての場合において、ＩｇＧ力価は、ＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０＋ＭＦ５９を投与した群において、他の群におけるＩｇＧ力価より高く、そしてＭＦ５９単独で投与した群より有意に高かった。注射後１０週目で、ＩｇＧ力価は、ＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０＋ＭＦ５９を投与した群において、他の全ての群と比較して有意に高かった。
【００８８】
【表４】
（実施例６：マウスにおけるＭＦ５９を含むＨＣＶ Ｅ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
ＰＬＧ微粒子に捕捉させる場合、または吸着させる場合およびＭＦ５９と同時投与させる場合の、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２抗原の免疫応答を刺激する能力を、以下のように試験した。マウスを、６つの群に分け、そして５μｇのＨＣＶ Ｅ２抗原および表５に示されるアジュバントを含む５０μｌのワクチン組成物を筋肉内投与した。組成物を、本質的に、上記に記載されるように調製した。
【００８９】
動物を、初回注射後４週目および６週目でブーストした。血清を注射後２、６、１０、および１２週目に採取し、そしてＩｇＧ力価を、標準的ＥｌＩＳＡにより（本質的に上記に記載されるように）評価した。
【００９０】
表６に示されるように、ＰＬＧ微粒子中に吸着させたか、または捕捉させたかのいずれのＨＣＶ Ｅ２、およびＭＦ５９と同時投与されたＨＣＶ Ｅ２についての抗体力価は、ＰＬＧまたはＭＦ５９を単独で投与した場合にみられた力価より高かった。
【００９１】
【表５】
【００９２】
【表６】
従って、抗原捕捉微粒子および抗原吸着微粒子を有する、サブミクロンの水中油型エマルジョンの使用を開示する。本発明の好ましい実施態様は、詳細に記載されているが、添付の請求の範囲に記載されるような本発明の思想および範囲を逸脱することなく、明らかな変化がされ得ることは理解される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｇｐ１２０；ｇｐ１２０＋ＭＦ５９；捕捉したｇｐ１２０を有するＰＬＧ；および捕捉したｇｐ１２０を有するＰＬＧ＋ＭＦ５９を用いて免疫したマウスにおける、最初のワクチン接種後の２、６および１０週での、総ＩｇＧ力価を示す。
（技術分野）
本発明は一般に、ワクチン組成物に関する。特に、本発明は捕捉型または吸着型抗原を含む生分解性の微粒子を、サブミクロンの水中油型（ｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ）エマルジョンと組み合わせて使用することに関する。
【０００２】
（発明の背景）
弱毒化病原体またはサブユニットタンパク質抗原を含む多数のワクチン処方物が開発されてきた。従来のワクチン組成物はしばしば、免疫応答を高めるために免疫アジュバントを含む。例えば、蓄積（ｄｅｐｏｔ）アジュバントがしばしば使用され、これは投与された抗原を吸着および／または沈殿させ、そして注射部位に抗原を保持し得る。典型的な蓄積アジュバントには、アルミニウム化合物および油中水（ｗａｔｅｒ−ｉｎ−ｏｉｌ）エマルジョンが挙げられる。しかし、蓄積アジュバントは抗原性を増加するが、皮下または筋肉内に注射した場合、重篤な、持続性の局所反応（例えば、肉芽腫、膿瘍および瘢痕）を頻繁に引き起こす。リポ多糖類のような他のアジュバントは、注射および／またはライター症候群（インフルエンザ様症状、全身的な関節の不快感、そして時には前部ブドウ膜炎、関節炎および尿道炎）に対して、発熱性の応答を引き起こし得る。種々の疾患のワクチン組成物において、Ｑｕｉｌｌａｊａ ｓａｐｏｎａｒｉａのようなサポニンもまた、免疫アジュバントとして使用されてきた。
【０００３】
より詳細には、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）は、実験ベースで、多くの抗原とともにうまく使用されてきた強力な免疫刺激剤である。ＣＦＡは３つの成分を含む：鉱油、乳化剤、および死菌ミコバクテリア（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）。水性抗原溶液は、油中水エマルジョンを作製するためにこれらの成分と混合される。ＣＦＡはアジュバントとして有効であるが、主にミコバクテリア成分の存在に起因して重篤な副作用（疹痛、膿瘍形成および発熱を含む）を引き起こす。従って、ＣＦＡはヒトおよび動物用ワクチンに使用されない。
【０００４】
フロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）はＣＦＡと類似しているが、細菌性成分は含まない。ＩＦＡは合衆国では使用が許可されていないが、他ではインフルエンザおよびポリオのヒトワクチンにおいて、ならびに狂犬病、イヌジステンバーおよび***の動物ワクチンのために使用されてきた。しかし、ＩＦＡで使用される油および乳化剤の両方が、マウスに腫瘍を引き起こし得るという証拠が示されている。
【０００５】
ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）はミコバクテリアの細胞壁複合体の最小単位であることが見出され、これはＣＦＡを用いて観測されるアジュバント活性を生成する。例えば、Ｅｌｌｏｕｚら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９７４）５９：１３１７を参照のこと。広範なアジュバント効力および副作用を示すいくつかのＭＤＰの合成アナログが生成されてきた。これらのアナログの概説については、Ｃｈｅｄｉｄら、Ｐｒｏｇ．Ａｌｌｅｒｇｙ（１９７８）２５：６３を参照のこと。
【０００６】
ＭＤＰの代表的なアナログには、ＭＤＰのトレオニル誘導体（Ｂｙａｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９８７）５：２２３）、ＭＤＰのｎ−ブチル誘導体（Ｃｈｅｄｉｄら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．３５：４１７）およびムラミルトリペプチドの親油性の誘導体（Ｇｉｓｌｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（１９８１）Ｙ．Ｙａｍａｍｕｒａ ａｎｄ Ｓ．Ｋｏｔａｎｉ編、Ｅｘｃｅｒｐｔａ Ｍｅｄｉｃａ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、ｐ．１６７）が挙げられる。
【０００７】
１つのＭＤＰの親油性の誘導体は、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙ）−ホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）である。このムラミルトリペプチドはリン脂質末端を含み、これは脂質環境を有する分子の疎水性部分の会合を可能にし、一方、ムラミルペプチド部分は、水性環境と会合する。従って、ＭＴＰ−ＰＥは単独で、安定な水中油エマルジョンを生成するための乳化剤として作用し得る。ＭＴＰ−ＰＥは、０．００８％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０を含有する４％スクアレンのエマルジョン（ＭＴＰ−ＰＥ−ＬＯ（低級油）と呼ばれる）で、有効な結果を伴う単純ヘルペスウイルスｇＤ抗原を送達するために、物質的安定性が乏しいにもかかわらず使用されてきた（Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８８）１４１：１７２０〜１７２７）。最近、４〜５％ｗ／ｖ スクアレン、０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、０．５％ Ｓｐａｎ（登録商標）８５、および必要に応じて種々の量のＭＴＰ−ＰＥを含有する、安全な、高い免疫原性のサブミクロン水中油エマルジョンが、ワクチン組成物に使用するために開発されてきた。例えば、Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」：Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．偏）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５，ｐｐ．２７７〜２９６を参照のこと。
【０００８】
このようなアジュバントの存在にもかかわらず、従来のワクチンは、しばしば、標的化された病原体に対する十分な防御を提供しない。この点に関して、細胞内の病原体（例えば、多数のウイルス）に対するワクチン接種は、免疫系の細胞性および体液性アーム（ａｒｍ）の両方を標的化するべきであるという証拠が出てきている。
【０００９】
より詳細には、細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）は、細胞内の病原体（例えば、ウイルスおよび悪性細胞によって生成される腫瘍特異的抗原）に対する細胞性免疫防御において重要な役割を果たす。ＣＴＬは、感染した細胞によって表に出されるＭＨＣクラスＩ分子とともにウイルスの抗原決定基を識別することによって、ウイルスに感染した細胞の細胞傷害性を媒介する。タンパク質の細胞質発現は、ＭＨＣクラスＩプロセシングおよび抗原性ペプチドのＣＴＬへの提示に不可欠である。しかし、死滅または弱毒化ウイルスを用いる免疫は、しばしば、細胞内感染を抑制するのに必要なＣＴＬを産生しない。さらに、顕著な遺伝子の異型接合性および／または免疫回避（ｅｓｃａｐｅ）変異体の選択を促進する速い突然変異速度を示すウイルス（例えば、ＨＩＶまたはインフルエンザ）に対する従来のワクチン接種技術は、問題がある。従って、ワクチン接種に対する代替技術が開発されてきた。
【００１０】
吸着または捕捉型抗原を有する粒子状のキャリアが、十分な免疫応答を引き出すための試みに使用されてきた。このようなキャリアは、免疫系に対して選択された抗原の複数のコピーを提示し、そして局所リンパ節において、抗原の捕捉および保持を促進する。この粒子はマクロファージによって摂取され得、サイトカイン放出を介して抗原提示を高め得る。特定のキャリアの例には、ポリメチルメタクリレートポリマーから誘導されるキャリア、ならびにポリ（ラクチド）およびポリ（ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される微粒子（ＰＬＧとして公知である）が挙げられる。ポリメチルメタクリレートポリマーは非分解性であり、一方、ＰＬＧ粒子は、乳酸およびグリコール酸とのエステル結合のランダムな非酵素的加水分解によって、生分解され、正常な代謝経路に沿って排出される。
【００１１】
最近の研究で、捕捉型抗原を有するＰＬＧ微粒子が細胞性免疫を引き起こし得ることが示された。例えば、マイクロカプセル化ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１２０は、マウスにおいて、ＨＩＶ−特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を引き起こすことが示された（Ｍｏｏｒｅら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１７４１〜１７４９）。同様に、微粒子でカプセル化されたオボアルブミンは、インビボで細胞性免疫応答をプライムすることが可能であり、経口で投与された場合、粘膜ＩｇＡ応答を引き起こし得ることが示された（Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：１４９〜１５４）。さらに、抗体およびＴ−細胞応答の両方が、ＰＬＧ−捕捉型Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原をワクチン接種されたマウスにおいて引き起こされた（Ｖｏｒｄｅｒｍｅｉｅｒら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９５）１３：１５７６〜１５８２）。抗原特異的ＣＴＬ応答もまた、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｂｅｒｇｈｅｉのスポロゾイト周囲（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）タンパク由来のマイクロカプセル化された短い合成ペプチドを使用して、マウスにおいて引き起こされた。
【００１２】
しかし、捕捉または吸着型抗原を有する微粒子を、サブミクロンの水中油エマルジョンとともに使用することは、これまでには記載されていない。
【００１３】
（発明の開示）
本発明は、サブミクロンの水中油型エマルジョンと組み合わせての、生分解性微粒子（例えば、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から誘導されるもの）（捕捉されたまたは吸着された抗原を含む）の使用が、抗原の免疫抗原性を高めるのに役に立つ、という驚くべきかつ予想外の発見に基づく。このような組み合わせの使用は、広範な抗原の免疫抗原性を高めるための、安全で有効なアプローチを提供する。
【００１４】
したがって、１つの実施態様において、本発明は、サブミクロン水中油型エマルジョン、および生分解性微粒子に捕捉されるまたは吸着される、選択された抗原を包含する組成物に関する。
【００１５】
別の実施態様において、本発明は、（ａ）サブミクロン水中油型エマルジョン（４〜５％ｗ／ｖ スクアレン、０．２５〜０．５％ｗ／ｖ Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標）、および０．５％ｗ／ｖ Ｓｐａｎ８５（登録商標）、ならびに必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンを包含する）、ならびに（ｂ）生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された抗原、を包含する組成物に関する。
【００１６】
さらに別の実施態様において、本発明は、（ａ）サブミクロン水中油型エマルジョン、および（ｂ）生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された治療的に有効な量の抗原を、脊椎動物の被験体に投与する工程を包含する免疫処置の方法に関する
なおさらなる実施態様において、本発明は、生分解性微粒子に捕捉されるか、または吸着される、選択された抗原と、サブミクロン水中油型エマルジョンとを混合する工程を包含する組成物を作製する方法に関する。
【００１７】
特に好ましい実施態様において、微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、好ましくはポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）またはポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から誘導される。
【００１８】
本発明のこれらのおよび他の実施態様は、本明細書中の開示を参照することによって、当業者に容易に理解される。
【００１９】
（発明の詳細な説明）
本発明の実施は、他に示されなければ、当該分野内の、化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を利用する。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０年）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋおよびＮ．Ｋａｐｌａｎ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ならびにＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９年）を参照のこと。
【００２０】
本明細書および添付の請求の範囲において使用されるように、単数形式「ａ］、「ａｎ］および「ｔｈｅ」は、本明細書が明白に他に示さない限り、複数の言及を含む。
【００２１】
（Ｉ．定義）
本発明の記載において、以下の用語が利用され、そして下記に示したように定義されることが意図される。
【００２２】
本明細書中で使用されるように、用語「微粒子」とは、直径が約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径が約２００ｎｍ〜約３０μｍ、そして最も好ましくは直径が約５００ｎｍ〜約１０μｍの、粒子のことを言う。好ましくは、微粒子は、針および毛細管を塞ぐことなしに、非経口投与を可能にする。微粒子のサイズは、当該分野において周知である技術（例えば、光子相関分光法、レーザー回折法および／または走査型電子顕微鏡）によって、容易に測定される。
【００２３】
本明細書中で使用される微粒子は、滅菌可能な、非毒性および生分解性である物質から形成される。このような物質には、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカプロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ無水物が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明で使用するための微粒子は、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、特にポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）またはＤ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドまたはグリコール酸のコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グルコリド（「ＰＬＧ」または「ＰＬＧＡ」））、あるいはＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導される。微粒子は、種々の分子量、そしてＰＬＧのようなコポリマーの場合、種々のラクチド：グリコリド比を有する、任意の種々のポリマー出発物質から誘導され得、上記の項目は大部分が選択の問題であり、一部は同時投与した抗原に依存する。これらのパラメータは以下でより十分に議論される。
【００２４】
「抗原」は、抗原が存在する場合、宿主の免疫系を刺激し、細胞性の抗原特異的な免疫応答、または体液性の抗体応答を生じる１つ以上のエピトープを含む分子を意味する。正常には、エピトープは、約３〜１５の間の、一般的には、約５〜１５の間のアミノ酸を含む。本発明の目的のために、抗原は、任意のいくつかの公知のウイルス、細菌、寄生虫および真菌に由来し得る。この用語はまた、任意の種々の腫瘍抗原をも意味する。さらに、本発明の目的のために、「抗原」は、タンパク質が免疫学的応答を誘導する能力を維持する限り、天然の配列に対して、欠失、付加および置換（一般に、実質上保存的な）のような改変を含むタンパク質をいう。これらの改変は、部位指向的な変異誘発を通じてのような、意図的なものであってもよいし、抗原を産生する宿主の変異を通じるような偶発性のものであってもよい。
【００２５】
抗原または組成物に対する「免疫学的応答」は、目的の組成物に存在する分子に対する体液性免疫応答および／または細胞性免疫応答の被検体における発生である。本発明の目的のために、「体液性免疫応答」は、抗体分子により媒介される免疫応答をいう。その一方、「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球および／または他の白血球細胞により媒介される免疫応答である。細胞性免疫の１つの重要な局面は、細胞溶解性のＴ細胞（「ＣＴＬ」）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によりコードされるタンパク質に関連して存在し、そして細胞の表面上に発現される、ペプチド抗原に対して特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の細胞内における破壊、またはこのような微生物に感染された細胞の溶解の誘導および促進を補助する。細胞性免疫の別の局面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的な応答を含む。ヘルパーＴ細胞は、機能の刺激を助けるために作用し、そして細胞の表面のＭＨＣ分子に関連するペプチド抗原を提示する細胞に対する非特異的なエフェクター細胞の活性をフォーカスする。「細胞性免疫応答」はまた、サイトカイン、ケモカイン、ならびにＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来する分子を含む、活性化Ｔ細胞および／または他の白血球細胞により産生される他のそのような分子の産生をいう。
【００２６】
細胞性免疫応答を誘発する組成物およびワクチンは、細胞表面で、ＭＨＣ分子に関連する抗原の提示により、脊椎動物の被験体を感作させるように働き得る。細胞媒介性の免疫応答は、細胞の表面で抗原を提示する細胞に指向されるか、またはその細胞近傍に指向される。さらに、抗原特異的なＴリンパ球は、産生され、免疫された宿主の将来の防御を可能にし得る。
【００２７】
細胞媒介性の免疫学的応答を刺激する特定の抗原または組成物の能力は、リンパ球増殖（リンパ球活性化）アッセイ、ＣＴＬ細胞傷害性アッセイによるか、または感作された被験体における抗原に特異的なＴリンパ球のアッセイによるような多くのアッセイによって決定され得る。このようなアッセイは、当該分野において周知である。例えば、Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５１：４１８９〜４１９９；Ｄｏｅら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）２４：２３６９〜２３７６；および以下の実施例を参照のこと。
【００２８】
従って、本明細書において用いられるような免疫学的応答は、ＣＴＬの産生、および／またはヘルパーＴ細胞の産生または活性化を刺激するものであり得る。目的の抗原はまた、抗体媒介性の免疫応答を誘発し得る。従って、免疫学的応答は、以下の１つ以上の効果を含み得る：Ｂ細胞による抗体の産生；および／またはサプレッサーＴ細胞および／または目的の組成物またはワクチンに存在する抗原を特異的に指向するγδＴ細胞の活性化。これらの応答は、感染力を中和するために働き得、および／または抗体−補体、または免疫された宿主へ防御を提供する抗体依存細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し得る。このような応答は、当該分野で周知の、標準的なイムノアッセイおよび中和アッセイを用いて決定され得る。
【００２９】
サブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントと一緒に微粒子に捕捉または吸着された選択された抗原を含むワクチン組成物、またはサブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントと被験体に同時投与される微粒子に捕捉または吸着された抗原を含むワクチン組成物は、これが、サブミクロンの水中油型のエマルジョンアジュバントなしに微粒子／抗原の等価の量により誘発された免疫応答よりも、免疫応答を誘発するより大きい能力を有する場合、「増強した免疫原性」を示す。従って、ワクチン組成物は、「増強された免疫原性」を示し得る。なぜなら、この抗原は、より強力に免疫原性であるか、またはこれを投与された被験体において免疫応答を獲得するのにより少ない用量の抗原しか必要でないからである。このような増強された免疫原性は、動物への、微粒子／抗原組成物およびサブミクロンの水中油型エマルジョン、ならびに微粒子／抗原コントロールの投与することにより、そして、当該分野で周知のラジオイムノアッセイおよびＥＬＩＳＡのような標準的アッセイを用いてこの２つに対する抗体の力価を比較することにより決定され得る。
【００３０】
本明細書において提供される用語、抗原の「有効量」または「薬学的に有効な量」は、所望の免疫学的応答および対応する治療的な効果を提供する、薬剤の無毒だが十分な量をいう。以下に指摘するように、必要な正確な量は、被験体の種、齢、および全身状態、処置される状態の重篤度、および目的の特定の抗原、投与の様式などに依存して、被験体の間で変わる。任意の個体例における適切な「有効」量は、慣用的な実験法を用いて当業者により決定され得る。
【００３１】
本明細書において用いられる「処置」は、以下のいずれかをいう：（ｉ）伝統的なワクチンでのような感染または再感染の防御、（ｉｉ）症状の軽減または排除、および（ｉｉｉ）問題の病原の実質的なまたは完全な排除。処置は、予防的に（感染の前に）または治療的に（感染後に）作用され得る。
【００３２】
「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」とは、生物学的にまたはそうでなければ所望されなくはない物質を意味する。すなわち、この物質は、どんな所望されない生物学的効果も生じることなしに、またはこの物質を含む組成物のどんな成分も有害な様式で相互作用することなしに、微粒子アジュバント処方物と共に個体に投与され得る。
【００３３】
「生理学的なｐＨ」または「生理学的な範囲のｐＨ」は、約７．２〜８．０を含む範囲のｐＨ、より代表的には、約７．２〜７．６を含む範囲のｐＨを意味する。
【００３４】
「脊椎動物の被験体」は、ｃｏｒｄａｔａ亜門の任意のメンバーを意味する。これは、（制限なく）以下を含む：ヒトおよび他の霊長類（これには、チンパンジーおよび他の類人猿のような非ヒト霊長類ならびにサルの種を含む）；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌやネコのような愛玩動物；マウス、ラットおよびモルモットのようなげっ歯類を含む実験動物；ニワトリ、七面鳥および他のキジ類のトリ、アヒル、ガチョウなどの愛玩用、野生および狩猟用のトリを含む鳥類。この用語は、特別な年齢を意味しない。従って、成人（成体）および新生児（新生仔）の両方の個体が包含されることが意図される。上記の系は、上記の任意の脊椎動物種において使用を意図される。なぜならば、これらの脊椎動物すべての免疫系は同様に働くからである。
【００３５】
（ＩＩ．発明を実施するための形態）
本発明は、サブミクロンの水中油型エマルジョンと組み合わせた、捕捉されたまたは吸着された抗原を有する微粒子の使用が、抗原がそれ自身弱い免疫原性である場合でさえ、強力な免疫応答を提供するという発見に基づく。本発明のサブミクロンの水中油型アジュバントは、所望の微粒子／抗原を含むワクチン組成物に組み込まれ得るか、または微粒子／抗原含有組成物と同時にか、直前にか、もしくは引き続きのいずれかで別々に投与され得る。さらに、本発明の処方物は、インビボで産生される抗原の活性を増強するために（すなわち、ＤＮＡ免疫と一緒に）用いられ得る。
【００３６】
本明細書において記載されるワクチン組成物の個々の成分および方法は、公知であるが、このような組み合わせが、成分が別々に用いられた場合に得られるレベルを超えて抗原の有効性を増強することは予期せぬことであり、そして驚くべきことであった。
【００３７】
本発明の方法は、細胞媒介性免疫および／または体液性抗体応答を提供する。従って、従来の抗体応答に加えて、本明細書に記載された系は、例えば、クラスＩ ＭＨＣ分子と発現した抗原の会合を提供し得、結果として、目的の抗原に対するインビボの細胞性免疫応答が、増加され得、これはＣＴＬの産生を刺激し、この抗原の将来の認識を可能にする。さらに、本方法は、ヘルパーＴ細胞により抗原特異的応答を誘発し得る。従って、本発明の方法は、細胞性免疫応答および／または体液性免疫応答が所望される任意の抗原との使用を見出す。これには、抗体、Ｔ細胞ヘルパーエピトープおよびＴ細胞細胞傷害性エピトープを誘発し得る、ウイルス、細菌、真菌および寄生虫病原由来の抗原が挙げられる。このような抗原は、ヒトウイルスおよび動物ウイルスによりコードされる抗原を含むがこれらに限定されない、そして構造的または非構造的タンパク質のいずれかに対応し得る。
【００３８】
この技術は、通常わずかな免疫応答しか誘発しない、細胞内のウイルスおよび腫瘍細胞抗原に対して免疫するために特に有用である。例えば、本発明は、ヘルペスウイルスファミリー由来の広範な種々のタンパク質に対する免疫応答を刺激するための用途を見出す。このタンパク質には、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の１型および２型由来のタンパク質（例えば、ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２の糖タンパク質ｇＢ、ｇＤおよびｇＨ）；水痘‐帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）およびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原（ＣＭＶのｇＢおよびｇＨを含む）；ならびにＨＨＶ６およびＨＨＶ７のような他のヒトヘルペスウイルス由来の抗原を含む。（例えば、Ｃｈｅｅら、Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（Ｊ．Ｋ．ＭｃＤｏｕｇａｌｌ編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ １９９０）１２５〜１６９頁、サイトメガロウイルスのタンパク質コード内容の総説について；ＭｃＧｅｏｃｈら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９：１５３１〜１５７４、種々のＨＳＶ−１にコードされるタンパク質の考察について；米国特許第５，１７１，５６８号 ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２のｇＢおよびｇＤタンパク質ならびにこれらをコードする遺伝子の考察について；Ｂａｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１０：２０７〜２１１、ＥＢＶゲノムのタンパク質コード配列の同定について；ならびにＤａｖｉｓｏｎ およびＳｃｏｔｔ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８６）６７：１７５９〜１８１６、ＶＺＶの総説について：を参照のこと）。
【００３９】
肝炎ウイルスファミリーのウイルス（Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）およびＧ型肝炎ウイルス（ＨＧＶ）を含む）由来の抗原はまた、本明細書中に記載の技術において都合良く使用され得る。例として、ＨＣＶのウイルスゲノム配列は、この配列を得るための方法が公知であるのと同様に、公知である。例えば、国際出願番号ＷＯ ８９／０４６６９；ＷＯ ９０／１１０８９；およびＷＯ ９０／１４４３６を参照のこと。このＨＣＶゲノムは、Ｅ１（またＥとしても知られる）およびＥ２（またＥ２／ＮＳＩとしても知られる）を含むいくつかのウイルスタンパク質ならびにＮ末端ヌクレオカプシドタンパク質（「コア」と呼ばれる）をコードする（Ｅ１およびＥ２を含むＨＣＶタンパク質の議論について、Ｈｏｕｇｈｔｏｎら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（１９９１）１４：３８１−３８８を参照のこと）。これらの各タンパク質ならびにそれらの抗原性フラグメントは、本方法における使用を見い出す。
【００４０】
同様に、ＨＤＶ由来のδ抗原の配列は公知であり（例えば、米国特許第５，３７８，８１４号を参照のこと）、そしてこの抗原はまた、本方法において都合良く使用され得る。さらに、ＨＢＶ由来の抗原（例えば、コア抗原、表面抗原であるｓＡｇ、ならびにプレ表面（ｐｒｅｓｕｒｆａｃｅ）配列であるプレＳ１およびプレＳ２（以前はプレＳと呼ばれた）、ならびに上記の組み合せ（例えば、ｓＡｇ／プレＳ１、ｓＡｇ／プレＳ２、ｓＡｇ／プレＳ１／プレＳ２、およびプレＳ１／プレＳ２））は、本明細書中で使用を見い出す。例えば、ＨＢＶ構造の議論について、「ＨＢＶワクチン−実験室から認可まで：ケーススタディ」Ｍａｃｋｅｔｔ，Ｍ．およびＷｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ，１５９〜１７６頁；ならびに米国特許第４，７２２，８４０号、同第５，０９８，７０４号、同第５，３２４，５１３号；Ｂｅａｍｅｓら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９５）６９：６８３３−６８３８、Ｂｉｒｎｂａｕｍら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９０）６４：３３１９−３３３０；ならびにＺｈｏｕら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９１）６５：５４５７−５４６４を参照のこと。
【００４１】
他のウイルス（ピコルナウイルス科（例えば、ポリオウイスルなど）；カルシウイルス科；トガウイルス科（例えば、風疹ウイルス、デング熱ウイルスなど）；フラビウイルス科；コロナウイルス科；レオウイルス科；ビルナウイルス科；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、狂犬病ウイルスなど）；フィロウイルス科；パラミクソウイルス科（例えば、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳウイルスなど）；オルトミクソウイルス科（例えば、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスなど）；ブンヤウイルス科；アレナウイルス科；レトロウイルス科（例えば、ＨＴＬＶ−Ｉ；ＨＴＬＶ−ＩＩ；ＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶ、ＡＲＶ、ｈＴＬＲなどとしても知られる））の科のメンバー由来のタンパク質を含むがこれらに限定されない）由来の抗原（とりわけ単離体ＨＩＶIIIb、ＨＩＶSF2、ＨＩＶLAV、ＨＩＶLAI、ＨＩＶMN）；ＨＩＶ−１CM235、ＨＩＶ−１US4；ＨＩＶ−２；サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）由来の抗原を含むがこれらに限定されない）はまた、本願の方法において使用を見い出す。さらに、抗原はまた、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）およびダニ媒介脳炎ウイルス由来であり得る。例えば、これらのウイルスおよび他のウイルスの説明について、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第３版（Ｗ．Ｋ．Ｊｏｋｌｉｋ編、１９８８）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓおよびＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編、１９９１）を参照のこと。
【００４２】
より詳しくは、任意の上記ＨＩＶ単離体（ＨＩＶの種々の遺伝的サブタイプのメンバーを含む）由来のｇｐ１２０エンベロープタンパク質は、公知でありそして報告されている（例えば、種々のＨＩＶ単離体のエンベロープ配列の比較について、Ｍｙｅｒｓら、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ（１９９２）；Ｍｙｅｒｓら、Ｈｕｍａｎ Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ａｉｄｓ、１９９０、Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ、Ｎｅｗ Ｍｅｘｉｃｏ：Ｌｏｓ Ａｌａｍｏｓ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；およびＭｏｄｒｏｗら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８７）６１：５７０−５７８を参照のこと）。そして、任意のこれらの単離体由来の抗原は、本方法において使用を見い出す。さらに、本発明は、任意の種々のエンベロープタンパク質（例えば、ｇｐ１６０およびｇｐ４１）、ｇａｇ抗原（例えば、ｐ２４ｇａｇおよびｐ５５ｇａｇ）、ならびにｐｏｌ領域由来のタンパク質を含む、任意の種々のＨＩＶ単離体由来の他の免疫原性タンパク質に等しく適用できる。
【００４３】
上記で説明したように、インフルエンザウイルスは、本発明が特に有用であるウイルスの別の例である。特に、Ａ型インフルエンザのエンベロープ糖タンパク質ＨＡおよびＮＡは、免疫応答を生ずるために特に興味深いものである。多数のインフルエンザＡ型ＨＡサブタイプは、同定されている（Ｋａｗａｏｋａら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９０）１７９：７５９−７６７；Ｗｅｂｓｔｅｒら、「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ａｍｏｎｇ ｔｙｐｅ Ａ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ」１２７〜１６８頁、Ｐ．ＰａｌｅｓｅおよびＤ．Ｗ．Ｋｉｎｇｓｂｕｒｙ（編）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。従って、任意のこれらの単離体由来のタンパク質はまた、本明細書中に記載の免疫処置技術において使用され得る。
【００４４】
本明細書中に記載の方法はまた、多数の細菌性抗原（例えば、ジフテリア、コレラ、結核、破傷風、百日咳、髄膜炎および他の病原性状態（髄膜炎菌Ａ、ＢおよびＣ、Ｂ型ヘモフィルスインフルエンザ（ＨＩＢ）ならびにヘリコバクターピロリを含むが、これらに限定されない）を引き起こす生物体由来の細菌性抗原）を用いた使用を見い出す。寄生生物性抗原の例は、マラリアおよびライム病を引き起こしている生物学体由来の寄生生物性抗原を含む。
【００４５】
さらに、本明細書中に記載の方法は、種々の悪性癌の処置のための手段を提供する。例えば、本発明の系は、問題となる癌に対して特異的な特定のタンパク質に対する体液性免疫応答および細胞媒介性免疫応答を増大させるために使用され得る（例えば、活性化癌遺伝子、胎児抗原、または活性化マーカー）。このような腫瘍抗原は、とりわけ、ＭＡＧＥ１、２、３、４など（Ｂｏｏｎ，Ｔ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ（１９９３年３月）：８２〜８９）を含む任意の種々のＭＡＧＥ（メラノーマ関連抗原Ｅ）；任意の種々のチロシナーゼ；ＭＡＲＴ１（Ｔ細胞によって認識されるメラノーマ抗原）、ｒａｓ変異体；ｐ５３変異体；ｐ９７メラノーマ抗原；ＣＥＡ（癌胎児抗原）を含む。
【００４６】
本発明が広範な疾患の予防または処置のために使用され得ることは、容易に理解できる。
【００４７】
選択される抗原は、引き続く送達のための、微粒子に捕捉されるか、または吸着される。本発明において有用な微粒子を製造するための生分解性ポリマーは、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ
Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬから市販され、容易に入手できる。例えば、本明細書中で微粒子を形成するために有用なポリマーには、ポリヒドロキシ酪酸；ポリカプロラクトン；ポリオルトエーテル；ポリ無水物；およびポリ（α−ヒドロキシ酸）（例えば、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）（本明細書で両方とも「ＰＬＡ」として知られる）、ポリ（ヒドロキシブチレート））、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびグリコリドのコポリマー（例えば、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（本明細書中で「ＰＬＧ］または「ＰＬＧＡ」として表される））、あるいは、Ｄ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから誘導されるものが挙げられる。本明細書中で使用する特に好ましいポリマーは、ＰＬＡおよびＰＬＧポリマーである。これらのポリマーは、種々の分子量で利用可能であり、そして所定の抗原についての適切な分子量は、当業者によって容易に測定される。このため、例えば、ＰＬＡについて、適切な分子量は、約２０００〜２５０，０００のオーダーである。ＰＬＧについて、適切な分子量は、一般的に、約１０，０００〜約２００，０００、好ましくは約１５，０００〜約１５０，０００、そして最も好ましくは約５０，０００〜約１００，０００の範囲である。
【００４８】
ＰＬＧのようなコポリマーが微粒子を形成するために使用される場合、本明細書で使用される種々のラクチド：グリコリド比があり、そしてこの比は、大部分が選択の問題であり、一部は同時投与した抗原および所望の分解速度に依存する。例えば、５０：５０ＰＬＧポリマー（５０％Ｄ，Ｌ−ラクチドおよび５０％グリコリドを含有する）は、速い吸収コポリマーを提供するが、７５：２５ＰＬＧはより遅く分解し、そして８５：１５および９０：１０は、さらにより遅く、これは増加したラクチド成分に起因する。ラクチド：グリコリドの適切な比は、問題の抗原および疾患の性質に基づいて、容易に当業者によって測定される。さらに、微粒子と種々のラクチド：グリコリド比との混合物は、所定の抗原に対して所望の放出の動力学を達成し、そして第一および第二両方の免疫反応を提供するために、処方物における使用を見出す。本発明の微粒子の分解速度はまた、ポリマーの分子量およびポリマーの結晶化度のようなファクターによって、制御され得る。種々のラクチド：グリコリド比および分子量を有するＰＬＧコポリマーは、数多くの供給源（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ ａｎｄ Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬを含む）から市販され、容易に入手可能である。これらのポリマーはまた、当該分野に周知である技術（例えば、Ｔａｂａｔａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．（１９８８）２２：８３７〜８５８に記載される）を使用して、乳酸成分の単純な重縮合によって合成され得る。
【００４９】
抗原／微粒子は、当該分野において周知の任意のいくつかの方法を使用して、調製される。例えば、二重エマルジョン／溶媒蒸発技術（例えば、米国特許第３，５２３，９０７号、およびＯｇａｗａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（１９８８）３６：１０９５〜１１０３に記載される）が、微粒子を形成するために、本明細書中で使用され得る。これらの技術は、抗原を含有する（抗原が微粒子内に捕捉される場合）、ポリマー溶液の液滴からなる第１のエマルジョンの形成を包含し、これは引き続いて、粒子安定剤／界面活性剤を含有する連続水層と混合される。
【００５０】
さらに詳細には、水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）溶媒蒸発システムは、微粒子を形成するために使用され得、これは、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９３）１１：９６５〜９６９、およびＪｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２に記載される。この技術において、特定のポリマーは、有機溶媒（例えば、酢酸エチル、ジメチルクロリド（またメチレンクロリドおよびジクロロメタンと呼ばれる）、アセトニトリル、アセトン、クロロホルムなど）と混合される。ポリマーは、有機溶媒中に、約２〜１５％、より好ましくは約４〜１０％、そして最も好ましくは６％溶液で提供される。ほぼ同量の抗原溶液（例えば、水溶液）が添加され、そしてポリマー／抗原溶液は、例えばホモジナイザーを使用して、乳化される。このエマルジョンを、次いで、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）またはポリビニルピロリドンのような多量のエマルジョン安定化剤の水溶液と混合する。このエマルジョン安定化剤は、より典型的には、約２〜１５％溶液、典型的には約４〜１０％溶液で提供される。次いで、この混合物を均質化し、安定なｗ／ｏ／ｗ二重エマルジョンが生成する。次いで、有機溶媒をエバポレートする。
【００５１】
処方物パラメータは、小さい（＜５μｍ）および大きい（＞３０μｍ）微粒子の調製を可能にするために、操作され得る。例えば、Ｊｅｆｆｅｒｙら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９３）１０：３６２〜３６８；ＭｃＧｅｅら、Ｊ．Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐ．（１９９６）を参照のこと。例えば、減少した攪拌はより大きな微粒子を生じ、内側相の体積における増加も同様の結果である。小さな粒子は乞高濃度のＰＶＡを有する低い水相体積によって生成される。
【００５２】
微粒子はまた、噴霧乾燥およびコアセルベーション（例えば、Ｔｈｏｍａｓｉｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９６）４１：１３１；米国特許第２，８００，４５７号；Ｍａｓｔｅｒｓ，Ｋ．（１９７６）Ｓｐｒａｙ Ｄｒｙｉｎｇ 第２版、Ｗｉｌｅｙ編、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載される）；空気−懸濁コーティング技術、例えば、パンコーティングおよびＷｕｒｓｔｅｒコーティング（例えば、Ｈａｌｌら、（１９８０）Ｔｈｅ「Ｗｕｒｓｔｅｒ Ｐｒｏｃｅｓｓ」ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｔｈｅｏｒｙ，ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａ．Ｆ．Ｋｙｄｏｎｉｅｕｓ編）、第２巻、１３３〜１５４頁 ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦｌｏｒｉｄａおよびＤｅａｓｙ，Ｐ．Ｂ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．（１９８８）Ｓ（２）：９９〜１３９に記載される）；イオンゲル化（例えば、Ｌｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８０）２１０：９０８〜９１０によって記載される）を使用して形成され得る。
【００５３】
上記技術はまた、吸着された抗原を有する微粒子の生成に適用可能である。この実施態様において、微粒子は上記で説明されるように形成されるが、しかし形成後に抗原が微粒子と混合される。
【００５４】
粒径は、例えば、例えば、ヘリウム−ネオンレーザーを組込んだ分光器を使用する、レーザー光散乱によって決定され得る。一般に、粒径は室温で決定され、そして問題の試料の多重分析（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｎａｌｙｓｅｓ）（例えば、５〜１０回）と関連して、粒子直径の平均値を得る。また、粒径は走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）を使用して容易に測定される。
【００５５】
この微粒子を使用する前に、抗原含有量を一般に決定し、従って適切な量の微粒子が被験体に送達され得、その結果十分な免疫反応を誘発する。
【００５６】
微粒子の抗原含有量は当該分野で公知の方法（例えば、微粒子の破壊および捕捉された抗原の抽出）に従って決定され得る。例えば、微粒子は以下に記載されるようにジメチルクロリド（ｄｉｍｅｔｈｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅ）および蒸留水中に抽出されたタンパク質に溶解され得る（例えば、Ｃｏｈｅｎら、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．（１９９１）８：７１３；Ｅｌｄｒｉｄｇｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．（１９９１）５９：２９７８；およびＥｌｄｒｉｄｇｅら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（１９９０）１１：２０５）。
【００５７】
あるいは、微粒子は５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する０．１ＭのＮａＯＨ中に分散され得る。試料を攪拌し、遠心分離し、そして適切なアッセイを用いて目的の抗原について上清をアッセイした。例えば、Ｏ’Ｈａｇａｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．（１９９４）１０３：３７−４５を参照のこと。
【００５８】
上記で説明したように、サブミクロン水中油型エマルジョン処方物がまた、抗原／微粒子の送達前、送達と同時、または送達後のいずれかで脊椎動物の被験体に投与される。
【００５９】
本明細書中で使用されるサブミクロン水中油型エマルジョンは、非毒性、代謝可能なオイルおよび市販の乳化剤を含有する。例えば、非毒性、代謝可能なオイルには、植物油、魚油、動物油または合成的に調製されたオイルが挙げられるがこれらに限定されない。鱈肝油、鮫肝油、および鯨油のような魚油が好ましく、鮫肝油で発見されたスクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンを含有するものが特に好ましい。オイル成分は約０．５％〜約２０％の量で、好ましくは約１５％までの量で、より好ましくは約１％〜約１２％の量で、最も好ましくは約１％〜約４％のオイルで存在する（体積％）。
【００６０】
アジュバントの水性部分は緩衝化された生理食塩水または純水（ｕｎａｄｕｌｔｅｒｒａｔｅｄ ｗａｔｅｒ）であり得る。組成物の非経口的な投与が意図されるので、張度（例えば、重量モル浸透圧濃度）が基本的に通常の生理学的流体と同一であるように最終濃度を調製することが好ましい。なぜなら、組成物と生理学的流体との間で異なるイオン濃度による投与後の膨潤または組成物の急速な吸収を防ぐためである。水よりはむしろ生理食塩水が使用される場合、通常の生理学的な条件と適合するｐＨを維持するために生理食塩水を緩衝化することが好ましい。また、特定の事例において、特定の組成物物含量の安定性を確立するためにｐＨを特定のレベルに維持することが必要とされ得る。従って、一般に、組成物のｐＨをｐＨ６〜８にし、そしてｐＨは、任意の生理学的に受容可能な緩衝液（例えば、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、トリス緩衝液、重炭酸または炭酸緩衝液など）を用いて維持され得る。一般に、水溶性薬剤の量は組成物を所望の最終容量に導くために必要な量で存在する。
【００６１】
水中油型処方物における使用に適した乳化剤には以下が挙げられるが、これらに限定されない：ソリビタン−ベース非イオン性界面活性剤（例えば、Ｓｐａｎ（登録商標）またはＡｒｌａｃｅｌｌ（登録商標）の名で市販されているもの；Ｔｗｅｅｎ（登録商標）の名で知られている市販のポリオキシエチレンソルビタンモノエステルおよびポリオキシエチレンソルビタントリエステル；Ｍｙｒｊ（登録商標）の名で市販のポリオキシエチレン脂肪酸；Ｂｒｉｊ（登録商標）の名で知られているようなポリオキシエチレン脂肪酸エーテルであって、ラウリルアルコール、アセチルアルコール、ステアリルアルコールおよびオレイルアルコールから誘導されるもの；など。これらの物質は、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ’ｓ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥを含む多数の商業的な供給源から容易に入手可能である。これらの乳化剤は単独または併用して使用され得る。通常、乳化剤は０．０２％〜約２．５％、好ましくは、０．０５％〜約１％、および最も好ましくは０．０１％〜約０．５（重量％）（ｗ／ｗ）の量で存在する。一般に、使用されるオイルの約２０〜３０重量％の量で存在する。
【００６２】
また、エマルジョンは、ムラミルぺプチドのような他の免疫刺激剤を含む（Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル（ｎｏｒｍｕｒａｍｙｌ）−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｅ）（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル（ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ）−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ（ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｏｘｙ））−エチルアミン（ＭＴＯ−ＰＥ）、などが挙げられるが、これらには限定されない）。免疫刺激細菌性細胞壁成分（モノリン脂質Ａ（ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｉｐｉｄ）（ＭＰＬ）、ジミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、および細胞壁骨格（ＣＷＳ））がまた、存在し得る。本発明と共に使用される、種々の適切なサブミクロン水中油型エマルジョン処方物の記載に関しては、以下を参照のこと：例えば、国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、第１９版、１９９５；Ｖａｎ Ｎｅｓｔら、「Ａｄｖａｎｃｅｄ ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｗｉｔｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ」Ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ９２，Ｍｏｄｅｒｎ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｎｅｗ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂｒｏｗｎら、編）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、頁５７−６２（１９９２）；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）頁２７７−２９６。
【００６３】
サブミクロン粒子（すなわち、直径が１ミクロンン未満の粒子、および大きさがナノメーターの範囲である粒子）を生成するために、多数の技術が使用され得る。例えば、市販の乳化剤に、高圧下で狭い開口部を通して流体に応力を掛けることによって発生する高いせん断応力の原理による操作を用い得る。市販の乳化剤の例には以下が挙げられるが、これらには限定されない：Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）、Ｇａｕｌｉｎ Ｍｏｄｅｌ ３０ＣＤ（Ｇａｕｌｉｎ，ＩＮＣ．，Ｅｖｅｒｅｔｔ，ＭＡ）、およびＲａｉｎｎｉｅ Ｍｉｎｉｌａｂ Ｔｙｐｅ ８．３０Ｈ（Ｍｉｒｏ Ａｔｏｍｉｚｅｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄａｉｒｙ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｄｓｏｎ，ＷＩ）。個々の乳化剤に使用される適切な圧力は容易に、当業者によって決定される。例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒが使用される場合、５０００〜３０，０００ｐｓｉでの操作によって約１００〜７５０ｎｍの直径を有する油滴が生成される。
【００６４】
油滴の大きさは、オイルに対する界面活性剤の比（この比が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）、作動圧力（作動圧力が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）、温度（温度が増加するにつれて液滴の大きさが減少する）を変えること、および両親媒性免疫刺激剤の添加（このような薬剤の添加は液滴の大きさを減少させる）によって変化され得る。実際の液滴の大きさは、特定の界面活性剤、オイルおよび免疫刺激剤（任意）によって、ならびに特定の選択された操作条件と共に変化する。液滴の大きさは、サイジング装置（例えば、市販のＳｕｂ−Ｍｉｃｒｏｎ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍｏｄｅｌ Ｎ４ＭＤ）、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造される）の使用によって確認され得、そして上記の指針を使用し、実質的に全油滴が直径において１ミクロン未満、好ましくは直径が約０．８ミクロン未満、および最も好ましくは直径が約０．５ミクロン未満となるまで、パラメータを変化し得る。よって、実質的に全体が少なくとも約８０％未満（数による）、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、および最も好ましくは少なくとも約９８％未満を意図する。粒径の分布は典型的にＧａｕｓｓｉａｎであり、したがって、平均の直径は上述の制限よりも小さい。
【００６５】
本明細書中で使用される特に好ましいサブミクロン水中油型エマルジョンはスクアレン／水エマルジョンであり、このエマルジョンは必要に応じて、異なる量のＭＴＰ−ＰＥ（例えば、「ＭＦ５９」として公知である、サブミクロン水中油型エマルジョン（国際公開第ＷＯ９０／１４８３７号；Ｏｔｔら、「ＭＦ５９−−Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｓａｆｅ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ」ｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ：Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｎｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５、頁２７７−２９６）を含む。ＭＦ５９は、４〜５％ ｗ／ｖのスクアレン（例えば、４．３％）、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、および０．５％ ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５（登録商標）含有し、そして必要に応じて異なる量のＭＴＰ−ＰＥを含有する（微細流動化装置（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）（例えば、Ｍｏｄｅｌ １１０Ｙ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）を用いてサブミクロン粒子に処方される）。例えば、ＭＴＰ−ＰＥは、約０〜５００μｇ／用量、より好ましくは０〜２５０μｇ／用量、および最も好ましくは、０〜１００μｇ／用量の量で存在し得る。従って、ＭＦ５９−０は、ＭＴＰ−ＰＥのない上記サブミクロン水中油型エマルジョンを意味し、一方、ＭＦ５９−１００は、１用量あたり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含む。ＭＦ６９は、本明細書中で使用される別のサブミクロン水中油型エマルジョンであり、４．３％ｗ／ｖスクアレン、０．２５％ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ８０（登録商標）、および０．７５％ｗ／ｖのＳｐａｎ８５（登録商標）、必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含む。さらに、別のサブミクロン水中油型エマルジョンはＳＡＦであり、これは１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、５％の プルロニック−ブロック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ−ｂｌｏｃｋｅｄ） ポリマー Ｌ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰであって、これらはまた、サブミクロンエマルジョンへと微細流動化される。
【００６６】
一旦、サブミクロン水中油型エマルジョンが処方されると、これが微粒子の送達前、送達と同時、または送達後のいずれかで脊椎動物被験体に投与され得る。免疫前に微粒子を投与する場合、このアジュバント処方物は免疫前５〜１０日、好ましくは免疫前３〜５日、および最も好ましくは、免疫前１〜３日または２日で関心の抗原と共に投与され得る。別々に投与される場合、サブミクロン水中油型処方物は、微粒子組成物として同一の送達部位または異なる送達部位のいずれかに送達され得る。
【００６７】
同時送達が所望される場合、サブミクロン水中油型処方物は微粒子組成物と共に含まれ得る。一般に、微粒子およびサブミクロン水中油型エマルジョンは、単純な混合、攪拌、または振盪によって併され得る。他の技術（例えば、２成分の混合物を迅速に小さな開口部（例えば、皮下用針）を通すような工程）はまた、ワクチン組成物を提供するために使用され得る。
【００６８】
併用される場合、組成物の種々の成分が広範な比で存在し得る。例えば、微粒子およびエマルジョン成分は典型的に、容量比において１：５０〜５０：１、好ましくは１：１０〜１０：１、より好ましくは約１：３〜３：１、および最も好ましくは約１：１で使用される。しかし、特定の目的に関しては、他の比がより適切であり得る。例えば、特定の抗原が微粒子中に取り込まれることが困難であり、かつ低い免疫原性（ｉｍｍｕｎｇｅｎｉｃｉｔｙ）を有する場合、より高い相対的量の抗原成分が要求される。
【００６９】
一旦処方したら、本発明の組成物を一般には注射によって非経口的に、投与する。この組成物を、皮下、腹腔内、静脈内、または筋肉内のいずれかに注射し得る。投薬処置は、単回用量スケジュールまたは多数回用量スケジュールであり得る。多数回用量スケジュールは、ワクチン摂取の最初のクールが、１〜１０の別々の用量を用いてであり得、続いて、免疫応答を維持および／または増強するために選ばれた所定の続きの時間間隔（例えば、２回目の用量については１〜４ヶ月、および必要ならば続きの用量は数ヶ月後に）で他の用量が与えられ得るスケジュールである。ブーストは、一次免疫応答のために与えられる微粒子／サブミクロン油−水−エマルジョンを用いたものであり得るか、または抗原を含む異なる処方物を用いたものであり得る。投与量摂生はまた、少なくとも一部は、被験体の必要性により決定され、そして医者の判断に依存する。さらに、疾患の予防が所望される場合、一般的にワクチンは、目的の病原体での一次感染より前に投与される。例えば、症状または再発の減少などの処置が所望される場合、ワクチンは、一般的には一次感染に続いて投与される。
【００７０】
一般にこの組成物は、１つ以上の「薬学的に受容可能な賦形剤またはビヒクル」（例えば、水、生理食塩水、グリセロール、ポリエチレングリコール、ヒアルロン酸、エタノールなど）を含む。さらに、補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質など）がこのようなビヒクル中に存在し得る。
【００７１】
この組成物は、「治療有効量」の目的の抗原を含む。すなわち、サブミクロン水中油型エマルジョンと組み合せた場合、症状を予防、減少または除去するために十分な免疫学的応答を被験体に生じさせる量の抗原が組成物中に含まれることである。正確な必要量は、他の因子の中でも、処置される被験体；処置される被験体の年齢および一般的状態；被験体の免疫系が抗体を合成する能力；所望される防御の程度；処置される状態の重篤度；選択された特定の抗原およびその投与様式に依存して異なる。適切な有効量は、当業者によって容易に決定され得る。従って、「治療有効量」は、慣用的試行を通じて決定され得る比較的広範な範囲に入る。例えば、本発明の目的のために、有効用量は、１用量あたりで送達される抗原について、代表的には約１μｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１０μｇ〜約１ｍｇ、そして最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲である。
【００７２】
（ＩＩＩ．実験）
以下は、本発明を実施するための特定の実施態様の例である。実施例は、例示的な目的のためのみに提供され、そしていかなる方法においても本発明の範囲を制限することを意図されない。
【００７３】
使用される数（例えば、量、温度など）について正確さを保証するように試行されたが、いくらかの実験的誤差および偏差は、もちろん許容されるべきである。
【００７４】
（実施例１：ｐ２４抗原捕捉微粒子の調製）
微粒子を処方するために使用する材料は、以下の通りである：
（１）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）。ラクチド対グリコリドのモル比は５０：５０、平均分子量＝７０〜１００ｋＤａ（５０：５０ ＰＬＧＡ高粘性ポリマー）（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）；
（２）８％ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）３−８３（Ｍｏｗｉｏｌ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）水に、酢酸エチルを６ｍｌ添加して、ねじ口瓶内で１０分間攪拌することにより１０％飽和させたもの；および
（３）３０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５中のｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２。６．１ｍｇの抗原／ｍｌの濃度であり、２０：１のスクロース：タンパク質を含む。
【００７５】
Ｐ２４ｇａｇ微粒子を、以下の溶媒抽出技術により調製した。微粒子を作製するために、２．５８ｇのポリマー溶液を、０．８ｍｌの抗原溶液と共に３０秒間超音波処理した。一次エマルジョンを、６０グラムの飽和ＰＶＡ溶液と共に、２０ｍｍプローブを有する卓上型ホモジナイザーを使用して、１０Ｋｒｐｍで１時間、ホモジナイズした。得られたエマルジョンに、直ちに２．５リットルの水を添加し、溶媒抽出のために２時間攪拌し、３８μメッシュに通して濾過し、遠心分離により３度洗浄し、そして水浴超音波処理機で１分間、間断的に超音波処理して、次いでレーザー回折測定により大きさを合わせた。その微粒子の直径の大きさの平均は、１０μｍであった。その微粒子を凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。
【００７６】
（実施例２：ＭＦ５９を含むｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
１０頭のヒヒを、２つの群に分け（１群あたり５頭）、そして表１に示した処方物を投与した。群１について、等量のアジュバントＭＦ５９−０およびｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２（クエン酸／Ｔｒｉｓ緩衝液中の）を組合せて、０．７ｍｌの全量を得た。その組成物を穏やかに混合し、そして５００μｌ（１００μｇ ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２／投与量を得た）のワクチンを、大腿筋に筋肉内（ＩＭ）注射した。群２について、１．５ｍｌの２×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を、実施例１で作製した４６．８ｍｇのＰＬＧ捕捉ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２処方物に添加した。その物質を、約３０秒間ボルテックスして、全てのビーズを懸濁した。１．５ｍｌのＭＦ５９−０を、再懸濁したビーズに添加して、３ｍｌの全量を得た。その組成物を穏やかに混合し、そして５００μｌ（１００μｇ ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２／投与量を得た）のワクチンを、大腿筋にＩＭ注射した。
【００７７】
両群の動物を、初回の注射後、４週間隔で２度、５００μｌのワクチン組成物でブーストした。２回目のブースト後の２週目（初回免疫後１０週目）で、血清を収集し、そして、本質的に以下に示すように、ＩｇＧ力価を標準的ＥＬＩＳＡにより評価した。
【００７８】
表１に示されるように、含有ｐ２４／ｇａｇ／ｓｆ２＋ＭＦ５９は、非含有ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２＋ＭＦ５９より、有意に大きく抗体応答を誘発した。
【００７９】
【表１】
微粒子を処方するために使用する材料は、以下の通りである：
（１）ラクチド対グリコリドのモル比が５０：５０で構成され、８０ｋダルトンの平均分子量を有する、３．０ｇのポリマー、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ Ｒｅｓｏｍｅｒ ＲＧ５０５）を、５０ｍｌのジクロロメタン（ＤＣＭ，ＨＰＬＣグレード、Ａｌｄｒｉｃｈより入手）に溶解した；
（２）１６ｇのポリビニルアルコール（平均分子量１３〜２３Ｋダルトン、ＩＣＮ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ａｕｒｏｒａ、ＯＨ）を、２００ｍｌの脱イオン水に溶解した；および
（３）ＨＩＶ ｇｐ１２０ｓｆ２抗原（Ｃｈｉｒｏｎ、臨床グレード）を、３０ｍＭ クエン酸ナトリウム、ｐＨ６．０の緩衝液中、７．２ｍｇ抗原／ｍｌの濃度で使用した。
【００８０】
微粒子を、以下のように調製した。３０ｍｌのガラスの密な壁の（ｈｅａｖｙ−ｗａｌｌｅｄ）試験管内で、１．６７ｍｌのＨＩＶ ｇｐ１２０ｓｆ２抗原を、１６．７ｍｌのポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）溶液に添加した。その溶液を、１０ｍｍ直径発生器を備えた、小型手動ホモジナイザーを使用して、２３，０００ＲＰＭで、３分間ホモジェナイズした。次いで、そのホモジネートを２０ｍｍ直径発生器を備えた卓上型ホモジナイザーを使用して、１２，０００ＲＰＭ、全ホモジナイズ時間３分間でホモジナイズしながら１５０ｍｌガラスビーカー中の６６．８ｍｌのポリビニルアルコール溶液にゆっくり注いだ。得られた二重（ｄｏｕｂｌｅ）エマルジョンを含むビーカーに、小型磁気攪拌子を備えた。次いで、これを周囲温度で、中程度（約１０００ＲＰＭ）の攪拌速度下で一晩放置し、ＤＣＭ溶媒をエバポレートさせた。本方法で調製して得られた微粒子を洗浄して、余分なＰＶＡおよび未捕捉の抗原を除去した。微粒子の調製物を約４５０ｍｌの脱イオン水で希釈し、遠心分離して微粒子をペレット化し、上清をデカントし、そして微粒子を約３０ｍｌの脱イオン水に再懸濁することを繰り返して（全３回）、洗浄を完了した。最後の再懸濁の工程後、微粒子を凍結乾燥し、そして−２０℃で保存した。
【００８１】
凍結乾燥した微粒子の小サンプル（１０〜３０ｍｇ）を利用して、粒子の大きさの分布および抗原含量を測定した。このように調製した微粒子の大きさの分布を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ機器を使用する動的レーザー光散乱法により測定し、そして０．６μｍの大きさの中央値を有することを決定した。抗原含量（％負荷）を、０．１Ｍ水酸化ナトリウム、１％ドデシル硫酸ナトリウム溶液中に微粒子のサンプルを溶解することにより測定し、次いで、標準バイシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を使用して、タンパク質含量を測定した。微粒子の％負荷を、この方法で測定し、そして０．７重量％のタンパク質を含むことを決定した。
【００８２】
（実施例４：ヒヒにおけるＭＦ５９を含むｇｐ１２０／ｓｆ２抗原捕捉微粒子の免疫原性）
実施例２に記載されるように、ｐ２４ｇａｇ／ｓｆ２に代えてｇｐ１２０／ｓｆ２を使用して、同様の実験を実施した。特に、ｇｐ１２０／ｓｆ２をＭＦ５９−０と組合せ、そして上記のように、群１のヒヒに対して５０μｇ投与した。さらに、実施例１のＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２を、記載のようにＭＦ−５９と組合せ、そして群２の動物に対して５０μｇ投与した。
【００８３】
両群の動物を、初回の注射後４週目で、５００μｌのワクチン組成物でブーストした。血清サンプルを、初回投与の４週後（４ｗｐ１）、ならびに２回目の投与４週後（４ｗｐ２）および２回目の投与後（８ｗｐ２）に採取して、そしてＩｇＧ力価を、以下のようにＥＬＩＳＡにより評価した。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ Ｕ９６、ｃａｔ♯４４９８２４）を、１ウェルあたり１００μｌの、５０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０中の２μｇ／ｍｌのｇｐ１２０／ｓｆ２抗原で覆った。そのプレートを４℃で一晩インキュベートした。最初に１００ｍＭリン酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５Ｍ塩化ナトリウム緩衝液（希釈液）、ｐＨ７．５中に１：５０〜１：１０００に希釈したヒヒ血清サンプルを、ＥＬＩＳＡプレート（血清サンプルあたり１列）の上面から底面まで、希釈液で１：２に連続的に希釈することによってサンプルを最初の希釈液より１、２、４、８、１６、３２、６４、および１２８倍高い率で希釈し、ウェルあたり１００μｌサンプルの最終容量にした。希釈液のみ（ブランク）を含む列、および標準血清（標準）を含む列を、各プレートについての比較の目的のために含んだ。ＥＬＩＳＡプレートを、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００溶液で広範に洗浄後、ウェルあたり１００μｌの１：５０００希釈したＧｏａｔ抗サルＩｇＧ−ＨＲＰ結合体溶液（Ｏｒｇａｎｏｎ Ｔｅｋｎｉｋｅ Ｃｏｒｐ．、Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ、ｃａｔ♯５５４３２）を添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレートを再度、０．０５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００で広範に洗浄した。１００μｌの過酸化ＴＭＢ発色液（Ｋｉｒｋｅｇａａｒｄ＆Ｐｅｔｔｙ ｌａｂｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を各ウェルに添加した。呈色反応を、約３分間発色させ、ウェルあたり５０μｌの２Ｍ ＨＣｌを添加して停止させた。プレートを４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダーを使用して読み取った。各プレートについて得られたＯＤを、ブランクの列からの平均値を使用した基底ＯＤから減算した。各血清サンプルについての力価を、得られたデータを対数関数に適合して決定した、ＯＤ０．５を達成するために必要な希釈率として表した。
【００８４】
表２に示すように、全ての群で捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２＋ＭＦ５９は、非捕捉ｇｐ１２０／ｓｆ２＋ＭＦ５９より大きい抗体応答を誘発し、初回投与後４週目で見られた応答は、有意により高かった。
【００８５】
【表２】
ＰＬＧ微粒子に含有させる場合、または吸着させる場合およびＭＦ５９と同時投与させる場合の、ＨＩＶ ｇｐ１２０の免疫応答を刺激する能力をまた、以下のようにマウスにおいて試験した。Ｂａｌｂ／Ｃマウス（６〜７週齢）を、４つの群に分け、そして１０μｇのＨＩＶ ｇｐ１２０および表３に示されるアジュバントを含む５０μｌのワクチン組成物を筋肉内投与した。種々の組成物は、上記の実施例４に記載されるように調製した。
【００８６】
【表３】
【００８７】
得られたものを、表４および図１に示す。全ての場合において、ＩｇＧ力価は、ＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０＋ＭＦ５９を投与した群において、他の群におけるＩｇＧ力価より高く、そしてＭＦ５９単独で投与した群より有意に高かった。注射後１０週目で、ＩｇＧ力価は、ＰＬＧ捕捉ｇｐ１２０＋ＭＦ５９を投与した群において、他の全ての群と比較して有意に高かった。
【００８８】
【表４】
ＰＬＧ微粒子に捕捉させる場合、または吸着させる場合およびＭＦ５９と同時投与させる場合の、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）Ｅ２抗原の免疫応答を刺激する能力を、以下のように試験した。マウスを、６つの群に分け、そして５μｇのＨＣＶ Ｅ２抗原および表５に示されるアジュバントを含む５０μｌのワクチン組成物を筋肉内投与した。組成物を、本質的に、上記に記載されるように調製した。
【００８９】
動物を、初回注射後４週目および６週目でブーストした。血清を注射後２、６、１０、および１２週目に採取し、そしてＩｇＧ力価を、標準的ＥｌＩＳＡにより（本質的に上記に記載されるように）評価した。
【００９０】
表６に示されるように、ＰＬＧ微粒子中に吸着させたか、または捕捉させたかのいずれのＨＣＶ Ｅ２、およびＭＦ５９と同時投与されたＨＣＶ Ｅ２についての抗体力価は、ＰＬＧまたはＭＦ５９を単独で投与した場合にみられた力価より高かった。
【００９１】
【表５】
【表６】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、ｇｐ１２０；ｇｐ１２０＋ＭＦ５９；捕捉したｇｐ１２０を有するＰＬＧ；および捕捉したｇｐ１２０を有するＰＬＧ＋ＭＦ５９を用いて免疫したマウスにおける、最初のワクチン接種後の２、６および１０週での、総ＩｇＧ力価を示す。
Claims (33)
- サブミクロンの水中油型エマルジョン、および
生分解性微粒子に含まれた選択された抗原
を含む、組成物。 - 前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群から選択される、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から形成される、請求項１に記載の組成物。
- 前記微粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成される、請求項２に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、４〜５％ ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、および０．５％ ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５（登録商標）を含む、請求項１〜３のいずれかの項に記載の組成物。
- 請求項４に記載の組成物であって、前記サブミクロンの水中油型エマルジョンは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンをさらに含む、組成物。
- 前記選択された抗原が、ウイルス性抗原である、請求項１〜４のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が、ｇｐ１２０である、請求項６に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が、ｐ２４ｇａｇである、請求項６に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が、Ｃ型肝炎ウイルスＥ２である、請求項６に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が、前記微粒子中に捕捉されている、請求項１〜９のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が前記微粒子に吸着されている、請求項１〜９のいずれかの項に記載の組成物。
- 組成物であって、
（ａ）４〜５％ ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、および０．５％ ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５（登録商標）を含む、サブミクロンの水中油型エマルジョン、および
（ｂ）ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）微粒子に含まれた選択された抗原
を含む、組成物。 - 請求項１２に記載の組成物であって、前記サブミクロンの水中油型エマルジョンは、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ−エチルアミンをさらに含む、組成物。
- 前記選択された抗原が、前記微粒子中に捕捉されている、請求項１２に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が前記微粒子に吸着されている、請求項１２に記載の組成物。
- 脊椎動物の被験体を免疫するための組成物であって、
（ａ）サブミクロンの水中油型エマルジョン、および
（ｂ）生分解性微粒子に含まれた治療的に有効量の選択された抗原
を含む、組成物。 - 前記微粒子が、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）およびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）からなる群から選択される、ポリ（α−ヒドロキシ酸）から形成される、請求項１６に記載の組成物。
- 前記微粒子が、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）から形成される、請求項１７に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、４〜５％ ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜０．５％ ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ ８０（登録商標）、および０．５％ ｗ／ｖのＳｐａｎ ８５（登録商標）を含む、請求項１６〜１８のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミンをさらに含む、請求項１９に記載の組成物。
- 前記選択された抗原がウイルス性抗原である、請求項１６〜１９のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原がｇｐ１２０である、請求項２１に記載の組成物。
- 前記選択された抗原がｐ２４ｇａｇである、請求項２１に記載の組成物。
- 前記選択された抗原がＣ型肝炎ウイルスＥ２である、請求項２１に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が前記微粒子中に捕捉されている、請求項１６〜２４のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記選択された抗原が前記微粒子に吸着されている、請求項１６〜２４のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、前記微粒子より前に投与される、請求項１６〜２６のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、前記微粒子の後に投与される、請求項１６〜２６のいずれかの項に記載の組成物。
- 前記サブミクロンの水中油型エマルジョンが、前記微粒子と実質的に同時に投与される、請求項１６〜２６のいずれかの項に記載の組成物。
- 脊椎動物の被験体の免疫のための薬剤の製造における、請求項１〜１５のいずれかの項に記載の組成物の使用。
- 組成物を作製する方法であって、
サブミクロンの水中油型エマルジョンと、生分解性微粒子に含まれた選択された抗原とを合わせる工程
を包含する、方法。 - 前記選択された抗原が前記微粒子中に捕捉されている、請求項３１に記載の方法。
- 前記選択された抗原が前記微粒子に吸着されている、請求項３１に記載の方法。
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| CA2266656A1 (en) * | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
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| US20040202680A1 (en) * | 1997-01-30 | 2004-10-14 | O'hagan Derek | Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof |
| DK0991403T3 (da) * | 1997-01-30 | 2003-07-28 | Chiron Corp | Anvendelse af mikropartikler med adsorberet antigen til stimulering af immunresponser |
| US7393630B2 (en) * | 1997-12-16 | 2008-07-01 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions |
| EP1042001B1 (en) * | 1997-12-16 | 2002-04-03 | Chiron Corporation | Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions |
| JP4812942B2 (ja) * | 1999-02-26 | 2011-11-09 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス エスアールエル | ＣＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドを用いるＮｅｉｓｓｅｒｉａ抗原殺菌活性の増強 |
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| EP1221968B1 (en) * | 1999-10-13 | 2010-01-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Method of obtaining cellular immune responses from proteins |
| ATE319810T1 (de) * | 1999-11-19 | 2006-03-15 | Zycos Inc | Durchflussverfahren zur herstellung von mikropartikeln |
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| US7129222B2 (en) * | 2000-03-10 | 2006-10-31 | Dynavax Technologies Corporation | Immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
| US20030129251A1 (en) | 2000-03-10 | 2003-07-10 | Gary Van Nest | Biodegradable immunomodulatory formulations and methods for use thereof |
| US20040022814A1 (en) * | 2000-06-15 | 2004-02-05 | O'hagan Derek | Microparticles with adsorbent surfaces, methods of making same, and uses thereof |
| US20030138769A1 (en) * | 2000-08-16 | 2003-07-24 | Birkett Ashley J. | Immunogenic HBc chimer particles having enhanced stability |
| DE60118228T2 (de) * | 2000-09-28 | 2006-12-14 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Mikropartikel zur verabreichung von heterologen nukleinsäure |
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| JP2004527524A (ja) * | 2001-04-05 | 2004-09-09 | カイロン コーポレイション | 非経口初回抗原刺激後の粘膜追加免疫 |
| US8481043B2 (en) * | 2001-06-22 | 2013-07-09 | Cpex Pharmaceuticals, Inc. | Nasal immunization |
| US20030138458A1 (en) * | 2001-06-29 | 2003-07-24 | Michael Houghton | HCV E1E2 vaccine compositions |
| US7361352B2 (en) * | 2001-08-15 | 2008-04-22 | Acambis, Inc. | Influenza immunogen and vaccine |
| US20030175863A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-09-18 | Birkett Ashley J. | Influenza immunogen and vaccine |
| US20030185858A1 (en) * | 2001-08-15 | 2003-10-02 | Birkett Ashley J. | Immunogenic HBc chimer particles stabilized with an N-terminal cysteine |
| AR045702A1 (es) * | 2001-10-03 | 2005-11-09 | Chiron Corp | Composiciones de adyuvantes. |
| CN1620253A (zh) * | 2001-12-27 | 2005-05-25 | 创世纪集团公司 | 海豹油基脂质乳液及其用途 |
| ES2339762T3 (es) * | 2002-01-14 | 2010-05-25 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Vacuna contra el vih y procedimiento de uso. |
| US7351413B2 (en) * | 2002-02-21 | 2008-04-01 | Lorantis, Limited | Stabilized HBc chimer particles as immunogens for chronic hepatitis |
| US6861410B1 (en) * | 2002-03-21 | 2005-03-01 | Chiron Corporation | Immunological adjuvant compositions |
| EP1490083A1 (en) * | 2002-03-29 | 2004-12-29 | The Regents of the University of California | Microgel particles for the delivery of bioactive materials |
| WO2004004654A2 (en) * | 2002-07-03 | 2004-01-15 | Cambridge Scientific, Inc. | Vaccines to induce mucosal immunity |
| AU2003254792A1 (en) * | 2002-08-02 | 2004-02-23 | Sumitomo Pharmaceuticals Company, Limited | Bacterial cell wall skeleton component preparaion |
| KR20050052467A (ko) * | 2002-08-12 | 2005-06-02 | 다이나박스 테크놀로지 코퍼레이션 | 면역조절 조성물, 이의 제조방법 및 이의 이용방법 |
| US20060110736A1 (en) * | 2002-10-07 | 2006-05-25 | John Donnelly | Hiv vaccine formulations |
| EP1558122A4 (en) * | 2002-10-18 | 2011-04-13 | Charles N Ellis | METHOD OF EVALUATING THE HARDNESS OF PSORIASIS |
| EP1585542B1 (en) * | 2002-12-27 | 2012-06-13 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Immunogenic compositions containing phospholipid |
| CA2513418C (en) * | 2003-01-14 | 2016-04-19 | Chiron Corporation | Microparticles with adsorbed polynucleotide-containing species |
| DK1613346T3 (da) * | 2003-04-04 | 2013-01-07 | Pah Usa 15 Llc | Mikrofluidiske olie-i-vand-emulsioner og vaccinesammensætninger |
| US20070207211A1 (en) * | 2003-04-10 | 2007-09-06 | Pr Pharmaceuticals, Inc. | Emulsion-based microparticles and methods for the production thereof |
| JP2007524609A (ja) * | 2003-04-10 | 2007-08-30 | トランスフォーム・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | コンフォメーションに関する変種のプロファイリング、抗体組成物 |
| CN101410174B (zh) * | 2003-04-10 | 2011-04-06 | Pr药品有限公司 | 一种用于生产基于乳化的微观粒子的方法 |
| AU2004233851B2 (en) * | 2003-04-25 | 2009-07-30 | Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. | Compositions comprising cationic microparticles and HCV E1E2 DNA and methods of use thereof |
| ATE437633T2 (de) | 2003-06-02 | 2009-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Immunogene zusammensetzungen auf basis von biologisch abbaubaren mikroteilchen enthaltend ein diphtherie- und ein tetanustoxoid |
| US7208395B2 (en) * | 2003-06-26 | 2007-04-24 | Semiconductor Energy Laboratory Co., Ltd. | Laser irradiation apparatus, laser irradiation method, and method for manufacturing semiconductor device |
| JP2007528848A (ja) * | 2003-07-09 | 2007-10-18 | ヴァックスデザイン・コーポレーション | ワクチン接種ノードを用いるプログラムされた免疫応答 |
| WO2005009356A2 (en) * | 2003-07-15 | 2005-02-03 | Pr Pharmaceuticals, Inc. | Method for the preparation of controlled release formulations |
| WO2005009357A2 (en) * | 2003-07-23 | 2005-02-03 | Pr Pharmaceuticals, Inc. | Controlled release compositions |
| CA2564180A1 (en) * | 2004-04-22 | 2005-11-03 | Dainippon Sumitomo Pharma Co., Ltd. | Pharmaceutical preparation containing bacterial cell wall skeleton component |
| FR2873386B1 (fr) | 2004-07-22 | 2011-01-14 | Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Afssa | Composition vaccinale contre le rhodococcus equi |
| US9107813B2 (en) * | 2004-11-15 | 2015-08-18 | Derek T. O'Hagan | Immunogenic compositions containing anthrax antigen, biodegradable polymer microparticles, and polynucleotide-containing immunological adjuvant |
| AU2007318026B2 (en) | 2006-11-03 | 2013-04-18 | Merck Sharp & Dohme (Holdings) Pty Ltd | Canine Lyme disease vaccine |
| CL2008001806A1 (es) | 2007-06-20 | 2008-09-05 | Wyeth Corp | Composicion de vacuna en emulsion agua en aceite que comprende un antigeno y un adyuvante en la fase acuosa; y metodo de elaboracion. |
| CA2695399C (en) * | 2007-08-02 | 2017-10-17 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Multimeric multiepitope influenza vaccines |
| CN106310293A (zh) * | 2007-09-27 | 2017-01-11 | 免疫疫苗技术有限公司 | 在包括连续疏水相的载体中的脂质体在体内输送多核苷酸中的应用 |
| US20100209452A1 (en) * | 2007-10-03 | 2010-08-19 | Immunovaccine Technologies, Inc | Compositions comprising an antigen, an amphipathic compound and a hydrophobic carrier, and uses thereof |
| US8637053B2 (en) | 2007-12-03 | 2014-01-28 | President And Fellows Of Harvard College | Chlamydia antigens |
| US8815253B2 (en) * | 2007-12-07 | 2014-08-26 | Novartis Ag | Compositions for inducing immune responses |
| JP2011525477A (ja) * | 2008-03-04 | 2011-09-22 | リクイディア・テクノロジーズ・インコーポレーテッド | 免疫調節剤粒子および処置方法 |
| EP2296696B1 (en) | 2008-06-05 | 2014-08-27 | ImmunoVaccine Technologies Inc. | Compositions comprising liposomes, an antigen, a polynucleotide and a carrier comprising a continuous phase of a hydrophobic substance |
| US20110236489A1 (en) * | 2008-09-18 | 2011-09-29 | Novartis Ag | Vaccine adjuvant combinations |
| JP2012510289A (ja) | 2008-12-03 | 2012-05-10 | プロティア ワクチン テクノロジーズ リミテッド | グルタミルｔＲＮＡ合成酵素（ＧｔＳ）フラグメント |
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| EP2550362B1 (en) | 2010-03-25 | 2017-01-04 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
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| CN103517713A (zh) | 2011-02-22 | 2014-01-15 | 彼昂德瓦克斯医药有限公司 | 在改善的季节性和大流行性流感疫苗中的多聚体多表位多肽 |
| CA2832109C (en) | 2011-06-10 | 2021-07-06 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| US20130004640A1 (en) * | 2011-07-01 | 2013-01-03 | Pepsico, Inc. | Complex coacervates, methods and food products |
| US9636410B2 (en) | 2011-07-06 | 2017-05-02 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Cationic oil-in-water emulsions |
| US9655845B2 (en) | 2011-07-06 | 2017-05-23 | Glaxosmithkline Biologicals, S.A. | Oil-in-water emulsions that contain nucleic acids |
| AU2012216792A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-03-28 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing HIV-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| CN113876945A (zh) | 2011-10-06 | 2022-01-04 | 免疫疫苗技术有限公司 | 包括激活或增加tlr2活性的佐剂的脂质体组合物及其应用 |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| WO2013150518A1 (en) | 2012-04-01 | 2013-10-10 | Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences | Extracellular matrix metalloproteinase inducer (emmprin) peptides and binding antibodies |
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| WO2015151103A1 (en) | 2014-04-03 | 2015-10-08 | Biondvax Pharmaceuticals Ltd. | Compositions of multimeric-multiepitope influenza polypeptides and their production |
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Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5075109A (en) * | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| JPH0832638B2 (ja) * | 1989-05-25 | 1996-03-29 | カイロン コーポレイション | サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤 |
| DE69131709T2 (de) * | 1990-06-29 | 2000-05-25 | Chiron Corp., Emeryville | Liposomen enthaltende impfstoffzusammensetzungen |
| US5928865A (en) * | 1992-03-02 | 1999-07-27 | Chiron S.P.A. | Compositions comprising isolated Helicobacter pylori CagI polynucleotides and method of preparation thereof |
| WO1995011010A1 (en) * | 1993-10-22 | 1995-04-27 | Genentech, Inc. | Methods and compositions for microencapsulation of antigens for use as vaccines |
| US5961970A (en) * | 1993-10-29 | 1999-10-05 | Pharmos Corporation | Submicron emulsions as vaccine adjuvants |
| US5629167A (en) * | 1994-04-19 | 1997-05-13 | Biocine S.P.A. | Detection of antibodies against Chlamydia trachomatis pgp3 antigen in patient sera by enzyme-linked immunosorbent assay |
| US6355247B1 (en) * | 1994-06-02 | 2002-03-12 | Chiron Corporation | Nucleic acid immunization using a virus-based infection/transfection system |
| GB9412273D0 (en) * | 1994-06-18 | 1994-08-10 | Univ Nottingham | Administration means |
| SK165197A3 (en) * | 1995-06-07 | 1999-01-11 | Astra Ab | Nucleic acid and amino acid sequences relating to helicobacter pylori for diagnostics and therapeutics |
| GB9514285D0 (en) * | 1995-07-13 | 1995-09-13 | Univ Nottingham | Polymeric lamellar substrate particles for drug delivery |
| GB9518864D0 (en) * | 1995-09-14 | 1995-11-15 | Cambridge Res & Innovation | Oligonucleotides and their uses |
| GB9603314D0 (en) * | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Biocine Spa | Immunogenic detoxified mutant toxins |
| US5783567A (en) * | 1997-01-22 | 1998-07-21 | Pangaea Pharmaceuticals, Inc. | Microparticles for delivery of nucleic acid |
| EP1042001B1 (en) * | 1997-12-16 | 2002-04-03 | Chiron Corporation | Use of microparticles combined with submicron oil-in-water emulsions |
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