JP4709971B2 - 細胞内へ核酸を導入する為の新規な分子並びに細胞内へ導入する核酸および細胞内へ核酸を導入する為の新規な方法 - Google Patents
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[1]核酸を細胞内に導入するための方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)RNA結合性タンパク質の全体または一部構造および膜透過性キャリアペプチドを含む、RNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質と、該RNA結合性タンパク質に対する認識配列および任意の配列を含むRNAとを結合させる工程;および
(2)該融合タンパク質と該RNAとの結合体を任意の細胞と混合する工程、ここで該融合タンパク質の構造中に含まれる膜透過性キャリアペプチドの性質により該融合タンパク質と結合した該RNAが該細胞内に導入される。
[2]RNA結合性タンパク質がU1Aタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素、sex−lethal蛋白質、伸長因子Tu、RRMモチーフを構造中に含むタンパク質から選択されるいずれかのタンパク質もしくはそれらに類似のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを特徴とする[1]に記載の方法。
[3]RNA結合性タンパク質がヒト由来U1Aタンパク質もしくはそれに類似のアミノ酸配列を持つタンパク質であることを特徴とする[2]に記載の方法。
[4]膜透過性キャリアペプチドが、ヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチド、Revペプチド、ネコヘルペスウィルスCoatタンパク質由来ペプチド、ポリアルギニンから選択されるいずれかのペプチドもしくはそれらに類似のアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする[1]に記載の方法。
[5]膜透過性キャリアペプチドが、ヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチドもしくはそれに類似のアミノ酸配列を持つペプチドであることを特徴とする[4]に記載の方法。
[6]RNA中の任意の配列が、ウィルスRNA、メッセンジャーRNA、トランスファーRNA、アンチセンスRNA、アプタマ−RNA、リボザイム、siRNA、miRNAから選択されるいずれか一つまたは複数の機能を持つ機能性RNAの配列であることを特徴とする[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[7][1]〜[6]のいずれかに記載の方法により核酸を細胞内に導入する工程を包含する、細胞内タンパク質合成または遺伝子発現抑制方法。
[8]RNA結合性タンパク質の全体または一部構造および膜透過性キャリアペプチドを含むRNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質であって、RNA結合性タンパク質ドメインと結合した該RNA結合性タンパク質に対する認識配列を含む任意のRNAを細胞内に導入する性質をもつことを特徴とする融合タンパク質。
[9]RNA結合性タンパク質がU1Aタンパク質、アミノアシルtRNA合成酵素、sex−lethal蛋白質、伸長因子Tu、RRMモチーフを構造中に含むタンパク質から選択されるいずれかのタンパク質であることを特徴とする[8]に記載のタンパク質。
[10]RNA結合性タンパク質がヒト由来U1Aタンパク質であることを特徴とする[9]に記載のタンパク質。
[11]膜透過性キャリアペプチドが、ヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチド、Revペプチド、ネコヘルペスウィルスCoatタンパク質由来ペプチド、ポリアルギニンから選択されるいずれかのペプチドであることを特徴とする[8]に記載のタンパク質。
[12]膜透過性キャリアペプチドが、ヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチドであることを特徴とする[11]に記載のタンパク質。
[13][8]〜[12]のいずれかに記載のタンパク質をコードする遺伝子。
ゲルシフトアッセイ
50mM 塩化ナトリウムを含有する10mM HEPES−KOH, pH7.6緩衝液に、最終濃度10μMのdsRNAと28μMのTAT−U1A融合タンパク質をどちらか一方あるいは両方を混合したものをそれぞれ5μl調製し、インキュベートを行った。TAT−U1Aタンパク質のアミノ酸配列を配列番号1に示す。配列番号1においてアミノ酸1〜10がヒスチジンタグ、14〜25がヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチド、26〜36がHAタグ、37〜132がヒト由来U1Aタンパク質にそれぞれ相当する。配列番号2にdsRNAの塩基配列を示す。配列番号2において塩基1〜22がヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列に相当する。
次に、50mM トリス, pH6.8、10mM 酢酸マグネシウム、65mM 酢酸アンモニウム、1mM エチレンジアミン四酢酸、1mM ジチオスレイトールを含む6%ポリアクリルアミドゲルに反応液をアプライし、電気泳動を行った。電気泳動を行ったゲルは、臭化エチジウムまたはクマシーブリリアントブルーを用いて、それぞれ核酸染色またはタンパク質染色を行った。
その核酸染色の結果を図2に示す。図2レーン2に示す、dsRNAとTAT−U1A融合タンパク質との混合反応液では、図2レーン3に示す、dsRNA単独反応液と比較して、RNAの染色シグナルが高分子量側にシフトしているのが確認された。また、タンパク質染色の結果を図3に示す。図3レーン2に示す、dsRNAとTAT−U1A融合タンパク質との混合反応液では、図2レーン1に示す、TAT−U1A融合タンパク質単独反応液と比較して、タンパク質の染色シグナルがシフトしているのが確認された。これらの分子量の増大は、dsRNAとTAT−U1A融合タンパク質とが互いに結合していることにより起こると考えられ、TAT−U1A融合タンパク質がdsRNAとの融合能を有していることが示唆された。
核酸の細胞への導入
1μMのテトラメチルローダミン標識dsRNAと、5μMのTAT−U1A融合タンパク質、もしくは1μMのテトラメチルローダミン標識dsRNAのみを、ウシ胎児血清添加ハムF12培地に添加した。この培地を用いて、細胞培養用ディッシュ上の70%コンフルエントのチャイニーズハムスター卵巣細胞の培地交換を行い、37℃で16時間培養した。その後、細胞をPBSで洗浄し、未反応の標識dsRNAおよびTAT−U1A融合タンパク質を除去した。蛍光顕微鏡観察により細胞中のテトラメチルローダミン標識dsRNAのシグナルを検出した。
その結果を図4に示す。図4Aに示す、標識dsRNAのみを添加した条件では、細胞内で標識dsRNAのシグナルが全く観察されなかったのに対し、図4Bに示す、標識dsRNAとTAT−U1A融合タンパク質を共に添加したものでは、細胞内での標識dsRNAのシグナルが検出された。このことから、TAT−U1A融合タンパク質の作用により、標識dsRNAは細胞内に導入されたと考えられ、TAT−U1A融合タンパク質にdsRNAを効率的に細胞内に導入する能力があることが示唆された。
2 融合タンパク質中の膜透過性キャリアペプチド由来の部分
3 RNA中のRNA結合性タンパク質に対する認識配列
4 RNA中の任意の配列
SEQ ID NO:2: dsRNA
Claims (11)
- インビトロで核酸を細胞内に導入するための方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)配列番号1のアミノ酸37〜132の配列からなるヒト由来U1Aタンパク質および配列番号1のアミノ酸14〜25の配列からなるヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチドを含む、RNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質と、配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAとを結合させる工程;および
(2)該融合タンパク質と該RNAとの結合体を任意の細胞と混合する工程、ここで該融合タンパク質の構造中に含まれる該ヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチドの性質により該融合タンパク質と結合した該RNAが該細胞内に導入される。 - インビトロで核酸を細胞内に導入するための方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)配列番号1のアミノ酸37〜132の配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなるRNA結合性タンパク質および配列番号1のアミノ酸14〜25の配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなる膜透過性キャリアペプチドを含む、RNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質と、配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAとを結合させる工程;および
(2)該融合タンパク質と該RNAとの結合体を任意の細胞と混合する工程、ここで該融合タンパク質の構造中に含まれる該膜透過性キャリアペプチドの性質により該融合タンパク質と結合した該RNAが該細胞内に導入される。 - インビトロで核酸を細胞内に導入するための方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)配列番号1のアミノ酸配列からなるRNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質と、配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAとを結合させる工程;および
(2)該融合タンパク質と該RNAとの結合体を任意の細胞と混合する工程、ここで該融合タンパク質の有する膜透過性により該融合タンパク質と結合した該RNAが該細胞内に導入される。 - インビトロで核酸を細胞内に導入するための方法であって、以下の工程を包含する方法:
(1)配列番号1のアミノ酸配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなるRNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質と、配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAとを結合させる工程;および
(2)該融合タンパク質と該RNAとの結合体を任意の細胞と混合する工程、ここで該融合タンパク質の有する膜透過性により該融合タンパク質と結合した該RNAが該細胞内に導入される。 - ヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAが、ウィルスRNA、メッセンジャーRNA、トランスファーRNA、アンチセンスRNA、アプタマ−RNA、リボザイム、siRNAおよびmiRNAからなる群から選択されるRNA分子として機能するRNA配列を一つまたは複数含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法により核酸を細胞内に導入する工程を包含する、細胞内タンパク質合成または遺伝子発現抑制方法。
- 配列番号1のアミノ酸37〜132の配列からなるヒト由来U1Aタンパク質および配列番号1のアミノ酸14〜25の配列からなるヒト免疫不全ウィルス由来のTATペプチドを含む、RNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質であって、該融合タンパク質の構造中に含まれる該ヒト由来U1Aタンパク質と結合した配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAを細胞内に導入する性質をもつことを特徴とする融合タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸37〜132の配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなるRNA結合性タンパク質および配列番号1のアミノ酸14〜25の配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなる膜透過性キャリアペプチドを含む、RNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質であって、該融合タンパク質の構造中に含まれる該RNA結合性タンパク質と結合した配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAを細胞内に導入する性質をもつことを特徴とする融合タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列からなるRNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質であって、該融合タンパク質と結合した配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAを細胞内に導入する性質をもつことを特徴とする融合タンパク質。
- 配列番号1のアミノ酸配列の10%以内のアミノ酸残基が置換、欠失もしくは付加されているアミノ酸配列からなるRNA結合性および膜透過性を有する融合タンパク質であって、該融合タンパク質と結合した配列番号2の塩基1〜22の配列であるヒト由来U1Aタンパク質に対する認識配列を含むRNAを細胞内に導入する性質をもつことを特徴とする融合タンパク質。
- 請求項7〜10のいずれか1項に記載の融合タンパク質をコードする遺伝子。
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