JP4625698B2 - 循環マクロファージの決定および／または分類方法ならびにその方法を実施するための分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、異種抗原による循環マクロファージの決定および／または分類方法、ならびにそのような方法を実施するための分析装置に関する。

前立腺組織に由来する細胞の電子顕微鏡による分析は、Sinha，Wilson，Gleason「Immunoelectron microscopic localization of prostatic-specific antigen in human prostate by the protein A-gold complex（プロテインA-金複合体を用いるヒト前立腺における前立腺特異抗原の免疫電子顕微鏡による位置特定）」Cancer，1987，60，1288-91によって知られており、この文献では、正常前立腺組織、前立腺癌組織および前立腺肥大組織が金標識PSA抗体と共にインキュベートされた。これらの分析により、金粒子は細胞質、細胞内顆粒、RESおよびリソソーム中に位置することが明らかになった。腫瘍の最終分化が進むにつれて、膜構造中に現れる金粒子が増える。これは、腫瘍細胞の最終分化が進むにつれて、PSA（前立腺特異抗原）が膜構造に組み込まれることを示していると解釈された。この分析のもう一つの側面において、金粒子は顆粒球およびマクロファージにも認められた。

フローサイトメトリー分析により、循環血液中にPSA陽性細胞が見つかった。しかし先行技術による分析では、マクロファージの表面だけがPSA染色された。

マクロファージ中にPSA分子のmRNAが見つからなかったという事実から導かれる唯一の結論は、PSA分子だけが取り込まれていて、微小転移巣の除去は起こっていないということである。Brandt，Griwatz，Brinkmann「Circulating prostate-specific antigen／CD 14-double-positive cells；a biomarker indicating low risk for hematogeneous metastasis of prostate cancer（循環前立腺特異抗原／CD14二重陽性細胞：前立腺癌の血行性転移の危険性が低いことを示す生体マーカー）」J. Natl. Cancer Inst. 1997；89，174を参照されたい。

ある程度秩序だった細胞クラスターを形成している組織結合型細胞の悪性変化を腫瘍と呼ぶことは知られている。これらの腫瘍細胞は組織の秩序を無視し、無制限に増殖して、その大きさを増すと共に周辺組織、周辺器官に浸潤することによって拡大するか、または器官の境界を越えて血流およびリンパ系に入って増殖する。

腫瘍が血流またはリンパ系に到達すると、これらの系による単一細胞または細胞クラスターの流出が起こり、細胞は転移巣（すなわち身体の異なる部位に位置する転移巣）として付着することがありうる。転移巣はさらに増殖し、身体が衰えてその疾患のために衰弱するまで身体のエネルギーを消費してしまう危険がある。

そのような腫瘍が発生する過程で、腫瘍細胞は、その増殖を助ける役割を果たす物質を産生する。また、腫瘍増殖のマーカーとして利用できる物質が放出される場合もある。このマーカーは腫瘍マーカーと呼ばれる。しかし、これらのマーカーは腫瘍に特異的なわけではなく、血中に測定される濃度の高さでしかない。なぜなら、健常な細胞もそのような物質を放出しうるからである。したがって、腫瘍マーカーを腫瘍の検出に利用することはできず、疾患または治療の経過を管理するためにしか利用できない。特異的腫瘍マーカーの一つに、前立腺特異抗原（PSA）があり、これが血中に一定濃度で見いだされる場合、それは前立腺癌が存在することを示す。しかし、血中PSA値の増加は、前立腺の良性肥大でも起こりうる。

今まで腫瘍疾患は、主として、超音波断層法、コンピュータ断層法、***X線像などの画像に基づく方法によって診断されてきた。しかし確定診断は、腫瘍陽性組織標本検査および治療計画の策定後まで下されない。

人体の免疫系は腫瘍疾患に向けられる。この免疫系は、様々な機能を果たす一連の様々な異なる細胞タイプから構成されている。なかでも、マクロファージは、異常物質を認識し貧食すると共に、その物質を個々の成分に分解するという作業を遂行する必要がある。次に、取り込まれた細胞の断片は、他の免疫細胞の表面に提示され、免疫反応の対象となる構造をその免疫細胞が認識できるようにする。

人体を直接的に検査しなくても、循環マクロファージの特徴を初期段階で決定できるようになることが、強く求められている。

本発明の目的は、循環マクロファージの特徴の決定かつ／または分類を可能にする方法ならびに分析装置を提供することにある。

本発明によれば、貧食された腫瘍細胞の抗原または断片を循環マクロファージ中に検出することができるので、直接的かつ特異的な腫瘍検出が可能になると考えられる。

本発明では、全血試料を採取し、次に勾配遠心分離を行ってマクロファージを単離する。次に、マクロファージ細胞を穿孔処理し、その細胞を、少なくとも1つの選択された抗体で、細胞内染色する。

次に、それ自体公知のフローサイトメトリーを使って、細胞の特徴を単一レベルで記録する。

フローサイトメトリーを使用すると、液流中の細胞を計数し、その物理的および分子的特徴を分析することができる。正確にいうと、蛍光色素で標識した抗体などの試料を利用して、細胞または細胞集団の特徴の決定を単一レベルで実施し、記録する。

蛍光色素で標識された抗体を使って行われる抗原抗体反応が基本原理として役立つ。分析を行うには、単一懸濁液の細胞を、適当な波長を持つコヒーレントなレーザー光線に、流体力学的絞り込みによって誘導する。蛍光色素の電子が単色レーザー光線で励起されると、その電子は高いエネルギーレベルに移動する。レーザーパルス後に、電子は、エネルギーを光子の形で放射しながら、その基底レベルに戻る。光検出器によって検出される放射光子濃度は、各細胞に結合している抗体の量に比例する。さらに、細胞の大きさおよび内部構造、すなわち細胞質の顆粒構造、核の大きさなどに関する情報も、偏向光および散乱光によって得られる。

選択された抗原としては、前立腺特異抗原、サイトケラチンおよび／または上皮膜抗原を使用することができる。

本発明によれば、マクロファージにおけるPSA抗体の染色により、貧食された物質が前立腺関連であるかどうかを決定することができる。

上記の方法を実施するための分析装置は、採取した血液をヘパリン処理するための手段、マクロファージを単離するための勾配遠心分離器、細胞穿孔手段、前記の前処理済み細胞を蛍光色素抗体で細胞内染色するための機器、および腫瘍の初期診断を目的として単離・前処理済み細胞の細胞内構造を決定するためのコンピュータ支援評価ユニットを装備したフローサイトメーターからなる。

以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳しく例示する。

血液を採取し染色する工程では、例えば6mlの全血を使用し、それにヘパリン処理を施す。勾配遠心分離法を利用して、単球、マクロファージおよびリンパ球を単離する。

次の工程では、穿孔のために、ホルムアルデヒド固定とサポニンによる細胞の処理を行う。

次に、例えば次の一覧に挙げる、選択された抗体による細胞内染色の工程を行う：
PSA抗体Ab-1（クローンER-PRS）
パンサイトケラチン-FITC
上皮膜抗原（クローンE29）
アイソタイプコントロールIgG1（クローンDAK-GO1）
二次抗体FITCヤギ抗マウス（DAKO）。

分析を実施するまで細胞を再び固定し、次にフローサイトメトリーによって特徴づける。単球およびマクロファージにゲートをかけ、すなわち測定結果の一部分だけを評価に使用して、予備選択を行う。

次に、アイソタイプコントロールと染色をヒストグラム分析によって評価し、陽性細胞の量を、例えば百分率として求める。

マクロファージをサイトケラチンで染色すると、散在性前立腺腫瘍を持つ患者では、各個人の循環免疫細胞中に、組織細胞の構造の一部を見いだすことができる。これらの成分は免疫細胞が元から持っている内容物ではないので、それらは貧食（作用）によって取り込まれなければならない。記録されるサイトケラチンの曲線は、アイソタイプの曲線とは全く異なるので、非特異的影響は除外することができる。

マクロファージにおけるPSAの染色は、この特異マーカーも検出することができるので、貧食された物質が前立腺組織であることを示す。

要約すると、本明細書に記載の方法および付随する分析装置は、循環マクロファージの特徴の決定と分類のための新しい方法を提供し、その分類により、前立腺関連と考えうる事実に関する指標を得ることができる。

Claims (5)

1. 循環マクロファージの特徴を決定し、かつ／または分類する方法であって、
   ・採取した全血試料を、勾配遠心分離を行ってマクロファージを単離する工程、
   ・該マクロファージ細胞を穿孔処理する工程、
   ・該細胞を、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サイトケラチンおよび／または上皮膜抗原と、抗原抗体反応する少なくとも１つの選択された抗体で、細胞内染色する工程、および
   ・該前処理済み細胞のフローサイトメトリー分析を行い、続いて複数の細胞の統計学的評価を行う工程、を含む方法。
2. フローサイトメトリーを実施した後にアイソタイプコントロールと染色のヒストグラム分析を行うことを特徴とする、請求項１の方法。
3. 散在性前立腺腫瘍の貧食によって取り込まれた組織細胞の一部を人体外で検出するための請求項１または２に記載の方法。
4. 貧食によって取り込まれた前記物質が前立腺関連であるかどうかを、前記マクロファージにおける前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の前記染色によって決定することを特徴とする、請求項３の方法。
5. 請求項１に記載の循環マクロファージの特徴を決定し、かつ／または分類する方法を実施するための分析装置であって、
   採取した血液をヘパリン処理するための手段、
   マクロファージを単離するための勾配遠心分離器、
   該マクロファージ細胞を穿孔処理する細胞穿孔手段、
   前記前処理済み細胞を前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、サイトケラチンおよび／または上皮膜抗原と、抗原抗体反応する少なくとも１つの選択された抗体で、細胞内染色するための機器、および
   腫瘍の初期診断を目的として単離および前処理済み細胞の細胞内構造を決定するためのコンピュータ支援評価ユニットを装備したフローサイトメーターを備える分析装置。