JP4261366B2 - 食物を毒する細菌を検出するためのプライマー及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は食品における毒性物質(poisoning)を検出するのに有用な配列番号:1〜4の新規なプライマーであって、配列番号:1及び2のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンA遺伝子(entA)に対するものであり、配列番号:3及び4のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子(yst)に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
従って、本発明は食品における毒性物質(poisoning)を検出するのに有用な配列番号:1〜4の新規なプライマーであって、配列番号:1及び2のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンA遺伝子(entA)に対するものであり、配列番号:3及び4のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子(yst)に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
(a)下記の一組の新規な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する工程、
(i)スタフィロコッカス・アウレウスの標的遺伝子エンテロトキシンAを検出 するための
entA-1(F)5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3' (配列番号:1)及び
entA-2(R)5'TACCACCCGCACATTGATAA 3' (配列番号:2)
(ii) エルシニア・エンテロコリチカの熱安定性エンテロトキシンを検出する ための
yst-1 (F)5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' (配列番号:3)及び
yst-2 (R)5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' (配列番号:4)、
(b)混合ミクロフローラ中のスタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシン A遺伝子及びエルシニア・エンテロコリチカの熱安定エンテロトキシンに特異 的なプライマーを用いてスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エ ンテロコリチカの検出する工程(図3を参照)、
(c)ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカを検出するための食物マトリックスを 調製する工程、
(d)ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカからそれぞれ鋳型DNAを抽出する工 程、それは1:1〜1:3の割合のジエチルエーテル:クロロホルム、1.5 〜3.5Mの尿素及び0.5〜2%のドデシル硫酸ナトリウムを用いて達成し うる、
(e)総容量25μlのPCR反応混合液を調製する工程、それは8〜12mMのト リスHCl、45〜55mMのKCl、0.5〜3.0mMのMgCl2 、0 .005〜0.02%のゼラチン、150〜300μlの個々のデオキシヌク レオシド三リン酸、30〜60ピコモルの各特異的プライマー、0.5〜2. 0単位のTaqDNAポリメラーゼ、及び1〜3μlの鋳型DNAから成るも のであってもよい、
(f)スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れを検出するための標的遺伝子を増幅する工程、それは90〜98℃での2〜 8分間の最初の変性、各サイクルが90〜98℃での40〜70秒間の変性、 50〜60℃での40〜80秒間のアニーリング、及び68〜76℃での45 〜75秒間の伸長から成る28〜40回の増幅サイクル、及び68〜76℃で 4〜12分間の最後の伸長で行われうる、
(g)PCR産物を分析する工程、それは1.2〜1.8%のアガローズゲル電気泳 動、0.5μg/mlのエチジウムブロミドで染色することによるPCR産物 の可視化、及びUVトランスイルミネーターの下での観察によって達成しうる 、
(h)スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れの最小細胞数を検出する工程、それはPCRにより食物マトリックス中で行 われ、高い感度を示しうる、
を含む。
entA - 1 (F) 5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3'(配列番号:1)
entA - 2 (R) 5'TACCACCCGCACATTGATAA 3'(配列番号:2)
yst - 1 (F) 5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' (配列番号:3)
yst - 2 (R) 5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' (配列番号:4)
M 18970.S.アウレウスのエンテロト・・・[gi:153120]関連配列,タンパク質,PubMed,タクソノミー
ローカス STATOXAA 774bp DNA リニア BCT26-APR-1993
ディフィニション S.アウレウスのエンテロトキシンA(entA)遺伝子,完全cds
アクセッション M18970
バージョン M18970.1 GI:153120
キーワード エンテロトキシン
ソース S.アウレウス(株FRI337)DNA,クローンpMJB[9,38]
生物 スタフィロコッカス・アウレウス
細菌;Firmicutes;Bacillus/Clostridium group;Bacillales;
Staphylococcus
リファレンス 1(塩基1から774)
著者ら ベトレー,エム.ジェイ.及びメカラノス,ジェイ.ジェイ.
表題 A型スタフィロコッカスエンテロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列
雑誌 J.Bacteriol.170,34〜41(1988)
メドライン 88086892
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..774
/organism= "Staphylococcus aureus"
/db xref= "taxon:1280"
シグナルペプチド 1..72
/note= "Staphylococcal enterotoxin A signal peptide"
CDS 1..774
/note= "Staphylococcal enterotoxin A precursor"
/codon start=1
/transl table=11
/protein id= "AAA26681.1"
/db xref= "GI:153121"
/product= "Staphylococcal enterotoxin A"
Base Count 299a 97c 144g 234t
Origin HincII部位の上流 47 bp
X65999.Y.エンテロコリチカ・・・[gi:48611]関連配列, タンパク質, 分類
ローカス YEYSTG 216 bp DNA リーニア BCT 06-OCT-1992
ディフィニション Y.エンテロコリチカのエンテロトキシンに対するyst 遺伝子
アクセッション X65999
バージョン X65999.1 GI:48611
キーワード エンテロトキシン
ソース エルシニア・エンテロコリチカ
生物 エルシニア・エンテロコリチカ
細菌;Proteobacteria; gamma subdivision; Enterobacteriaceae;
Yersinia
リファレンス 1(塩基1から216)
著者ら スタックブラント,イー.
表題 直接的サブミッション
雑誌 Submitted (06-MAY-1992) E. Stackebrandt, Dept of Microbiology,
University of Queensland, St.Lucia, Qld, Australia 4072
リファレンス 2(塩基1から216)
著者ら イブラヒム,エイ.,リーサック,ダブリュー.,パイク,エス.,及び
スタックブラント,イー.
表題 ポリメラーゼ連鎖反応:病原性エルシニア・エンテロコリチカ株の二つの クラスター間を識別するための疫学的道具
雑誌 FEMS Microbiol.Lett.97, 63−66(1992)
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..216
/organism= "Yersinia enterocolitica"
/strain= "serotype 0:8"
/db xref= "taxon:630"
遺伝子 1..216
/gene= "yst"
CDS 1..216
/gene= "yst"
/codon start=1
/transl table=11
/product= "enterotoxin"
/protein id= "CAA46801.1"
/db xref= "GI:48612"
/db xref= "SWISS-PROT:P07593"
Origin
Claims (26)
- 配列番号:1と2の特異的プライマー及び配列番号:3と4の特異的プライマーのセットを用いて、食物系中の食物を毒する細菌種であるスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカを同時に、予め濃縮することなく、高感度且つ迅速に検出する方法であって、
(a)食物マトリックスを調製する工程、
(b)総微生物DNAを抽出する工程、
(c)該プライマーセットを用いるPCRにより標的遺伝子のプロファイルを増幅する工程、
(d)ゲル電気泳動によりPCR産物を分析する工程、及び
(e)該細菌株を検出する工程、
を含む方法。 - 食物系が、ミルク、果実ジュース及びアイスクリームからなる群から選択される、請求項1記載の方法。
- ジエチルエーテル、クロロホルム、尿素及びドデシル硫酸ナトリウム(SDS)を含む抽出混合液を用いてDNAを抽出する、請求項1記載の方法。
- ジエチルエーテルとクロロホルムが1:1〜1:5の範囲の割合である、請求項3記載の方法。
- 尿素の濃度が1.0〜4.5Mの範囲である、請求項3記載の方法。
- SDSの濃度が0.3〜3.0%の範囲である、請求項3記載の方法。
- PCR反応混合液が、6〜15mMの範囲のトリス塩酸(Tris HCl)、40〜60mMの範囲の塩化カリウム(KCl)、0.3〜5.0mMの範囲の塩化マグネシウム(MgCl2)、0.002〜0.05%の範囲のゼラチン、100〜500μMの範囲の個々のデオキシヌクレオチド三リン酸、配列番号:1と2の特異的プライマー及び配列番号:3と4の特異的プライマーのセット、0.3〜5.0単位の範囲のTaqDNAポリメラーゼ、0.02〜3.0%の範囲の鋳型DNAを含む、請求項1記載の方法。
- PCRにおいて90〜98℃の範囲の温度で1〜10分間の範囲の時間DNAを変性させる、請求項1記載の方法。
- PCRにおいて93〜95℃の範囲の温度で4〜6分間の範囲の時間DNAを変性させる、請求項8記載の方法。
- 25〜45サイクルの範囲の増幅サイクルでPCRを行う、請求項1記載の方法。
- 32〜38サイクルの範囲の増幅サイクルでPCRを行う、請求項10記載の方法。
- 各サイクルの変性温度が、30〜80秒の範囲の時間、90〜98℃の範囲である、請求項1記載の方法。
- 各サイクルの変性温度が、55〜65秒の範囲の時間、93〜95℃の範囲である、請求項12記載の方法。
- PCRにおいて40〜65℃の範囲の温度で30〜90秒の範囲の時間DNAをアニーリングする、請求項1記載の方法。
- PCRにおいて53〜56℃の範囲の温度で55〜65秒の範囲の時間DNAをアニーリングする、請求項14記載の方法。
- PCRにおける伸長が、68〜76℃の範囲の温度で40〜80秒の範囲の時間行われる、請求項1記載の方法。
- PCRにおける伸長が、70〜74℃の範囲の温度で55〜65秒の範囲の時間行われる、請求項16記載の方法。
- PCRにおける最後の伸長が、68〜76℃の範囲の温度で2〜15分間の範囲の時間行われる、請求項1記載の方法。
- PCRにおける最後の伸長が、55〜65℃の範囲の温度で6〜10分間の範囲の時間行われる、請求項18記載の方法。
- ゲル電気泳動がアガローズゲル上で行われる、請求項1記載の方法。
- アガローズゲルの濃度が1.0〜2.0%の範囲である、請求項20記載の方法。
- アガローズゲルが0.2〜1.0μg/mlの範囲の濃度のエチジウムブロミドで染色される、請求項20記載の方法。
- 染色したゲルがUVトランスイルミネーターの下で観察される、請求項22記載の方法。
- 1個の細胞程度の少ない量で該細菌株を検出するために使用される、請求項1記載の方法。
- 食物中毒の爆発的発生を防止するのに役立つ、請求項1記載の方法。
- 細菌株を検出する直接的方法である、請求項1記載の方法。
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