JP4261366B2 - 食物を毒する細菌を検出するためのプライマー及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は食品中の毒性物質（Poisoning)を検出するのに有用な配列番号：１〜４の新規なプライマーであって、配列番号：１及び２のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ）に対するものであり、配列番号：３及び４のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
スタフィロコッカス・アウレウスは公衆衛生の観点から食物を毒する最も重要な細菌種の一つであると長い間考えられてきた。それは自然界に普遍的であり、ヒト及び動物両方の共生生物である（非特許文献１）。それはスタフィロコッカスによる食物中毒を惹起する熱安定性のエンテロトキシンを生産することが知られている（非特許文献２）。従来、スタフィロコッカス・アウレウスは選択培地での亜テルル酸塩の還元能又はマンニトール醗酵能により、次いで形態学的、培養的及び生化学的特徴により検出されている（非特許文献３）。
スタフィロコッカスのエンテロトキシンの中で、エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）は食物中毒の大発生と専ら関連している。ＳＥＡはエンテロトキシン原であるばかりでなく優れた抗原活性を有し、これが臨床微生物学及び食物微生物学の分野でＳＥＡを最も重要な毒素としている。エンテロトキシンＡ（ｅｎｔＡ）をコードする遺伝子のヌクレオチド配列は決定され、エンテロトキシンのファミリー内にかなりの配列の相違があることも明らかにされた（非特許文献４）。
公衆衛生の観点から別の重要な食物を毒する細菌種はエルシニア・エンテロコリチカである。エルシニア・エンテロコリチカの株は土壌、水及び臨床の供給源に豊富な腸管侵襲性の病原体である。この細菌は真空パックされた及び凍結された食物試料の両方で生き残ることができる。エルシニア・エンテロコリチカの毒性は外膜タンパク質や熱安定性の低分子量エンテロトキシンなどの一連のプラスミドに保持され且つ染色体にコードされた遺伝的特性から生ずる（非特許文献５）。染色体の熱安定なエンテロトキシン（ｙｓｔ）遺伝子はエルシニア・エンテロコリチカの有毒な血清型と関連しており、従ってそれは有用な診断マーカーである（非特許文献６）。従来法は低温濃縮、選択培地での育種及び特徴的なウシの眼のコロニーに基づいて食物試料からエルシニア・エンテロコリチカを単離することを提唱した。
ヌクレオチド配列の利用可能性と共に数年にわたって検出システムになされた進歩により、純粋培養及び食物系におけるスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカの特異的遺伝子を検出するための、遺伝子特異的プライマーセットを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用に路が開かれた。
該毒素遺伝子のコード領域の内部のプライマーを設計し、エンテロトキシンＡのプライマーセットが用いられた場合、１０ｐｇの感度を達成できたジョンソンら（１９９１）の業績（非特許文献８）に言及しうる。エンテロトキシンＡのために設計されたプライマーは、ベトレーとメカラノス（１９８８）の遺伝子配列（非特許文献９）に基づき、前向きプライマーに対しては４９０と５０９の間の領域にまたがり、逆向きプライマーに対しては５９１と６１０の間の領域にまたがる。しかしながら、このプライマーの感度は純粋培養でのみ評価され、食物系でのその適用は示されなかった。さらに、そのＤＮＡ単離方法は面倒であり、酵素処理の工程及びフェノール：クロロホルム抽出の方法を含んでいた。
他のエンテロトキシン遺伝子群の配列を比較し、最も相同性の少ないそれらの領域を選択することによりエンテロトキシンＡのプライマーを設計したツェンら（１９９２）の業績（非特許文献１０）に言及しうる。ミルク試料及びビーフ試料においてそれぞれ１個〜１０個の細胞という感度が達成された。著者らにより採用された鋳型ＤＮＡの調製は骨が折れるものであり、プロテイナーゼＫ及びリゾスタフィンなどの特殊な酵素の使用、次いでフェノール：クロロホルム抽出を含んでいる。
ジョンソンら（１９９１）に類似のエンテロトキシンＡ特異的プライマーを使用したマックローリンら（２０００）の業績（非特許文献１１）に言及しうる。しかしながら、この研究は主としてスタフィロコッカス・アウレウス単離物の疫学的スクリーニングと関係しており、食物試料で達成された感度のレベルは極めて悪かった。
スタフィロコッカス・アウレウス由来のエンテロトキシンＡ断片を増幅するためにプライマーを使用したアタナッソヴァら（２００１）の業績（非特許文献１２）に言及しうる。使用されたプライマーの配列はジョンソンら（１９９１）のものに類似していた。このプライマーは生のブタ肉及び未調理の燻製ハムのエンテロトキシン生産性スタフィロコッカス・アウレウスの罹患率を研究するために専ら用いられた。試料は濃縮され、そのＤＮＡ単離法は長く面倒であった。該プライマーの感度を求めるための試みはなされなかった。
ヨーロッパやアメリカの血清型に属する病原性エルシニア・エンテロコリチカ株のエンテロトキシン（ｙｓｔ）遺伝子を増幅するためにプライマーを設計したイブラヒムら（１９９２）の業績（非特許文献１３）に言及しうる。しかしながら、この研究は疫学の道具としてＰＣＲを用いて病原性のエルシニア・エンテロコリチカ株の二つのクラスターの間を識別することを主な狙いとしていた。このプライマーの感度について及び食物系においてエルシニア・エンテロコリチカを検出するそれらの能力については試験されなかった。
プライマーがエルシニア・エンテロコリチカＷ１０２４のｙｓｔ遺伝子の配列に基づいて設計された、イブラヒムら（１９９７）の業績（非特許文献１４）に言及しうる。エルシニア・エンテロコリチカ０：３の純粋培養を用いこれらのプライマーについて報告された感度は１０2 ＣＦＵであった。食物系におけるエルシニア・エンテロコリチカ検出へのこれらのプライマーの適用は試みられなかった。
ｙｓｔ遺伝子特異的プライマーが発蛍光性の５’ヌクレアーゼＰＣＲ検定法で用いられた、ヴィシュヌブハトラら（２００１）の業績（非特許文献１５）に言及しうる。純粋培養及び人為的に添加されたブタの挽き肉でそれぞれ１０2 ＣＦＵ／ｍｌ及び１０3 ＣＦＵ／g の検出限界が達成された。しかしながら、その検出時間は濃縮工程を組み込んだため延長された。
二、三の特許（特許文献１、特許文献２、その他）が現れた。これらでは、配列は１６ｓ及び２３ｓリボソームＲＮＡ（リボ核酸）及び病原性株を含むエルシニア・エンテロコリチカの検出に使用される付着侵襲遺伝子座（ａｉｌ）特異的プライマーに言及する。しかしながら、特許調査は、スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子に特異的なプライマー及びエルシニア・エンテロコリチカの熱安定なエンテロトキシンの遺伝子に特異的なプライマーについて記載した如何なる特許の存在も示さなかった。
これらの方法全ての欠点は、スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカのエンテロトキシン生産性株の検出における整合性、再現性及び感度の欠如であった。そのほかに、これらの方法は面倒であり、濃縮や複雑な酵素処理の長たらしい手順を含んでいる。殆どの方法で、適当な研究室の増殖培地での濃縮の工程が含まれ、それはＰＣＲ検出に使用するための標的ＤＮＡを生じ得る細胞数まで増殖させるためには８〜１５時間のインキュベーション又はエルシニア・エンテロコリチカの場合には１週間の時間を要しうる。これに反して、本発明は如何なる濃縮工程（単数又は複数）もなしに食物系中のスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカの直接検出を可能とする。
本発明の主な目的は病原性細菌であるスタフィロコッカス・アウレウスを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを開発することである。
本発明の別の主目的は病原性の熱安定な細菌であるエルシニア・エンテロコリチカを検出するためのオリゴヌクレオチドプライマーを開発することである。
本発明のさらに別の目的は食物を毒する細菌であるスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカの高感度且つ迅速な検出法を開発することである。
本発明のさらに別の目的は配列番号：１〜４のプライマーの調製法を開発することである。
本発明の概要
本発明は食品における毒性物質（poisoning)を検出するのに有用な配列番号：１〜４の新規なプライマーであって、配列番号：１及び２のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ）に対するものであり、配列番号：３及び４のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
本発明は食品における毒性物質（poisoning)を検出するのに有用な配列番号：１〜４の新規なプライマーであって、配列番号：１及び２のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ）に対するものであり、配列番号：３及び４のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
本発明の説明
従って、本発明は食品における毒性物質（poisoning)を検出するのに有用な配列番号：１〜４の新規なプライマーであって、配列番号：１及び２のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ）に対するものであり、配列番号：３及び４のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
従って、本発明は食品における毒性物質（poisoning)を検出するのに有用な配列番号：１〜４の新規なプライマーであって、配列番号：１及び２のプライマーが細菌スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ）に対するものであり、配列番号：３及び４のプライマーが細菌エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica)の熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）に対するものであるプライマー、及びこれらのプライマーを用いて食品を毒する該細菌種を高感度で検出する方法に関する。
本発明の一つの実施態様は、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３及び配列番号：４のオリゴヌクレオチドプライマーである。
本発明の別の一実施態様では、該プライマーが２０ヌクレオチドの大きさのものである。
本発明のさらに別の一実施態様では、配列番号：１及び配列番号：２のプライマーは食物を毒する細菌種であるスタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子（ｅｎｔＡ) を標的とする。
本発明のさらに別の一実施態様では、配列番号：３及び配列番号：４のプライマーはエルシニア・エンテロコリチカの熱安定なエンテロトキシン遺伝子（ｙｓｔ）を標的とする。
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号：１及び配列番号：３のプライマーは前向きプライマーである。
本発明のさらに別の実施態様は、配列番号：２及び配列番号：４のプライマーは逆向きプライマーである。
本発明のさらなる実施態様は、配列番号：１〜４のプライマーを調製する方法である。
本発明の別の実施態様は、細菌種スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞれのｅｎｔＡ遺伝子及びｙｓｔ遺伝子の保存された配列を同定することである。
本発明のさらに別の実施態様は、ソフトウェアプログラムを用いてプライマーを作成することである。
本発明のさらに別の実施態様では、ｅｎｔＡ遺伝子の保存された配列は７０〜３７０の間の領域に局在する。
本発明のさらに別の実施態様では、ｙｓｔ遺伝子の保存された配列は３７〜１９５の間の領域に局在する。
本発明のさらに別の実施態様では、ソフトウェアプログラムはプライマー３．０（Primer3.0)である。
本発明のさらなる実施態様は、配列番号：１及び２、及び／又は配列番号：３及び４の特定のプライマーを用いる食物系での食物を毒する細菌種スタフィロコッカス・アウレウス及び／又はエルシニア・エンテロコリチカの高感度且つ迅速な検出法である。
本発明の別の実施態様は、食物マトリックスを調製する工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、総微生物ＤＮＡを抽出する工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、該プライマーを用いてＰＣＲにより標的遺伝子のプロファイルを増幅する工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分析する工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、該細菌種を検出する工程である。
本発明のさらに別の実施態様では、食物系はミルク、果実ジュース、及びアイスクリームを含む群から選択される。
本発明のさらに別の実施態様は、ジエチルエーテル、クロロホルム、尿素、及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む抽出混合液を用いてＤＮＡを抽出する工程である。
本発明のさらに別の実施態様では、ジエチルエーテルとクロロホルムは１：１〜１：５の範囲の割合である。
本発明のさらに別の実施態様では、尿素の濃度は１．０〜４．５Ｍの範囲である。
本発明のさらに別の実施態様では、ＳＤＳの濃度は０．３〜３．０％の範囲である。
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＣＲ反応混合液は６〜１５ｍＭの範囲のトリス塩酸（Tris HCl) 、４０〜６０ｍＭの範囲の塩化カリウム（ＫＣｌ）、０．３〜５．０ｍＭの範囲の塩化マグネシウム（MgCl2)、０．００２〜０．０５％の範囲のゼラチン、１００〜５００μＭの範囲の個々のデオキシヌクレオチド三リン酸、請求項１のそれぞれの特異的プライマー、０．３〜５．０単位の範囲のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．０２〜３．０％の範囲の鋳型ＤＮＡを含む。
本発明のさらに別の実施態様は、ＰＣＲにおいて９０〜９８℃の範囲の温度で１〜１０分の範囲の時間、ＤＮＡを変性させる工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、ＰＣＲにおいて好ましくは９３〜９５℃の範囲の温度で４〜６分の範囲の時間、ＤＮＡを変性させる工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、２５〜４５サイクルの範囲の増幅サイクルを用いてＰＣＲを行う工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、好ましくは３２〜３８サイクルの範囲の増幅サイクルを用いてＰＣＲを行う工程である。
本発明のさらに別の実施態様では、各サイクルにおける変性温度は９０〜９８℃の範囲であり、変性時間は３０〜８０秒の範囲である。
本発明のさらに別の実施態様では、各サイクルにおける変性温度は好ましくは９３〜９５℃の範囲であり、変性時間は５５〜６５秒の範囲である。
本発明のさらに別の実施態様は、ＰＣＲにおいて４０〜６５℃の範囲の温度で３０〜９０秒の範囲の時間、ＤＮＡをアニーリングさせる工程である。
本発明のさらに別の実施態様は、ＰＣＲにおいて好ましくは５３〜５６℃の範囲の温度で５５〜６５秒の範囲の時間、ＤＮＡをアニーリングさせる工程である。
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＣＲにおける伸長は６８〜７６℃の範囲の温度で４０〜８０秒の範囲の時間行われる。
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＣＲにおける伸長は好ましくは７０〜７４℃の範囲の温度で５５〜６５秒の範囲の時間行われる。
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＣＲにおける最後の伸長は６８〜７６℃の範囲の温度で２〜１５分の範囲の時間行われる。
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＣＲにおける最後の伸長は好ましくは５５〜６５℃の範囲の温度で６〜１０分の範囲の時間行われる。
本発明のさらに別の実施態様では、ゲル電気泳動はアガローズゲル上で行われる。
本発明のさらに別の実施態様では、アガローズゲルの濃度は１．０〜２．０％の範囲にある。
本発明のさらに別の実施態様は、０．２〜１．０μｇ／ｍｌの濃度範囲のエチジウムブロミドを用いてアガローズゲルを染色する工程である。
本発明のさらに別の実施態様では、染色されたゲルはＵＶトランスイルミネーターの下で観察される。
本発明のさらに別の実施態様では、該方法は１細胞程の少ない量で該細菌株を検出するために使用される。
本発明のさらに別の実施態様では、該方法は食物中毒の大発生を防止するのに役立つ。
本発明のさらに別の実施態様では、該方法は細菌株を検出する直接的方法である。
さらに、本発明は食物中のスタフィロコッカス・アウレウス（図２を参照）及びエルシニア・エンテロコリチカ（図１を参照）の検出のための改良法を提供する。この改良法は、
（ａ）下記の一組の新規な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する工程、
（ｉ）スタフィロコッカス・アウレウスの標的遺伝子エンテロトキシンＡを検出 するための
entA-1（F)5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3' （配列番号：１）及び
entA-2（R)5'TACCACCCGCACATTGATAA 3' （配列番号：２）
（ii) エルシニア・エンテロコリチカの熱安定性エンテロトキシンを検出する ための
yst-1 （F)5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' （配列番号：３）及び
yst-2 （R)5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' （配列番号：４）、
（ｂ）混合ミクロフローラ中のスタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシン Ａ遺伝子及びエルシニア・エンテロコリチカの熱安定エンテロトキシンに特異 的なプライマーを用いてスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エ ンテロコリチカの検出する工程（図３を参照）、
（ｃ）ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカを検出するための食物マトリックスを 調製する工程、
（ｄ）ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカからそれぞれ鋳型ＤＮＡを抽出する工 程、それは１：１〜１：３の割合のジエチルエーテル：クロロホルム、１．５ 〜３．５Ｍの尿素及び０．５〜２％のドデシル硫酸ナトリウムを用いて達成し うる、
（ｅ）総容量２５μｌのＰＣＲ反応混合液を調製する工程、それは８〜１２ｍＭのト リスＨＣｌ、４５〜５５ｍＭのＫＣｌ、０．５〜３．０ｍＭのＭｇＣｌ2 、０ ．００５〜０．０２％のゼラチン、１５０〜３００μｌの個々のデオキシヌク レオシド三リン酸、３０〜６０ピコモルの各特異的プライマー、０．５〜２． ０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及び１〜３μｌの鋳型ＤＮＡから成るも のであってもよい、
（ｆ）スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れを検出するための標的遺伝子を増幅する工程、それは９０〜９８℃での２〜 ８分間の最初の変性、各サイクルが９０〜９８℃での４０〜７０秒間の変性、 ５０〜６０℃での４０〜８０秒間のアニーリング、及び６８〜７６℃での４５ 〜７５秒間の伸長から成る２８〜４０回の増幅サイクル、及び６８〜７６℃で ４〜１２分間の最後の伸長で行われうる、
（ｇ）ＰＣＲ産物を分析する工程、それは１．２〜１．８％のアガローズゲル電気泳 動、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで染色することによるＰＣＲ産物 の可視化、及びＵＶトランスイルミネーターの下での観察によって達成しうる 、
（ｈ）スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れの最小細胞数を検出する工程、それはＰＣＲにより食物マトリックス中で行 われ、高い感度を示しうる、
を含む。
（ａ）下記の一組の新規な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを設計する工程、
（ｉ）スタフィロコッカス・アウレウスの標的遺伝子エンテロトキシンＡを検出 するための
entA-1（F)5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3' （配列番号：１）及び
entA-2（R)5'TACCACCCGCACATTGATAA 3' （配列番号：２）
（ii) エルシニア・エンテロコリチカの熱安定性エンテロトキシンを検出する ための
yst-1 （F)5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' （配列番号：３）及び
yst-2 （R)5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' （配列番号：４）、
（ｂ）混合ミクロフローラ中のスタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシン Ａ遺伝子及びエルシニア・エンテロコリチカの熱安定エンテロトキシンに特異 的なプライマーを用いてスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エ ンテロコリチカの検出する工程（図３を参照）、
（ｃ）ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカを検出するための食物マトリックスを 調製する工程、
（ｄ）ミルク、アイスクリーム及び果実ジュース中のスタフィロコッカス・アウレウ ス及びエルシニア・エンテロコリチカからそれぞれ鋳型ＤＮＡを抽出する工 程、それは１：１〜１：３の割合のジエチルエーテル：クロロホルム、１．５ 〜３．５Ｍの尿素及び０．５〜２％のドデシル硫酸ナトリウムを用いて達成し うる、
（ｅ）総容量２５μｌのＰＣＲ反応混合液を調製する工程、それは８〜１２ｍＭのト リスＨＣｌ、４５〜５５ｍＭのＫＣｌ、０．５〜３．０ｍＭのＭｇＣｌ2 、０ ．００５〜０．０２％のゼラチン、１５０〜３００μｌの個々のデオキシヌク レオシド三リン酸、３０〜６０ピコモルの各特異的プライマー、０．５〜２． ０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、及び１〜３μｌの鋳型ＤＮＡから成るも のであってもよい、
（ｆ）スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れを検出するための標的遺伝子を増幅する工程、それは９０〜９８℃での２〜 ８分間の最初の変性、各サイクルが９０〜９８℃での４０〜７０秒間の変性、 ５０〜６０℃での４０〜８０秒間のアニーリング、及び６８〜７６℃での４５ 〜７５秒間の伸長から成る２８〜４０回の増幅サイクル、及び６８〜７６℃で ４〜１２分間の最後の伸長で行われうる、
（ｇ）ＰＣＲ産物を分析する工程、それは１．２〜１．８％のアガローズゲル電気泳 動、０．５μｇ／ｍｌのエチジウムブロミドで染色することによるＰＣＲ産物 の可視化、及びＵＶトランスイルミネーターの下での観察によって達成しうる 、
（ｈ）スタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカそれぞ れの最小細胞数を検出する工程、それはＰＣＲにより食物マトリックス中で行 われ、高い感度を示しうる、
を含む。
本発明の好ましい実施態様では、エンテロトキシンＡ遺伝子及び熱安定なエンテロトキシン遺伝子の有効な増幅は９３〜９５℃での４〜６分間の最初の変性、各サイクルが９３〜９５℃での５５〜６５秒間の変性、５３〜５６℃での５５〜６５秒間のアニーリング、及び７０〜７４℃での５５〜６５秒間の伸長から成る３２〜３８回の増幅サイクル、及び５５〜６５℃で６〜１０分間の最後の伸長で行われうる。
本発明の好ましい別の一実施態様では、該ＰＣＲは食物中のスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカの細胞１個〜１０6 個を直接検出しうる。
本発明のさらに別の一実施態様では、本特許は食物中のスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカを検出するための改良されたＰＣＲの使用に関する。ポリメラーゼ連鎖反応はスタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子及びエルシニア・エンテロコリチカの熱安定性エンテロトキシンを選択的に増幅するために使用された。ミルク、アイスクリーム及び果実ジュースの試料には、それぞれ１〜１，０００，０００個の範囲の種々の細胞数のスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカを添加した。食物マトリックス中に存在するスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカから鋳型ＤＮＡを抽出する方法は界面活性剤及び有機溶媒を用いて標準化した。ＰＣＲ反応混合液及び増幅条件は特定の増幅について最適化した。ＰＣＲ産物の可視化により、この方法を使用することによりミルク、アイスクリーム及び果実ジュースの試料中の１個〜１，０００，０００個の範囲の数の細胞を検出することが可能であることが明らかになった。
この使用の新規性は食物系に存在するスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカのＰＣＲによる直接検出のために設計されたプライマーを使用することである。そのほかに、この使用はスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカのエンテロトキシン生産性／病原性株を検出することができる。この使用は迅速であり、且つ食物マトリックス中の１個の細胞でさえ検出することを可能にする感度を有しており、如何なる濃縮工程をも凌駕する。
本発明のさらに別の１実施態様では、本発明の主目的は食物中のスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカを検出するために改良された使用を提供することである。本発明の方法は標的生物であるスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカの特異的遺伝子の保存された領域に対して設計されたプライマーを使用する。本発明は食物から直接該生物の鋳型ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）を調製するための単純且つ有効な方法を提供する。この方法はまたそれぞれの生物中の標的遺伝子の検出に特異的なＰＣＲ条件を使用し、食物系中の極めて少ない数の標的生物を検出し、この方法の感度を極めて高くしている。
本出願の発明は以下の実施例によりさらに例示するが、これは本発明の範囲を制限するものと解すべきではない。
スタフィロコッカス・アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプライマーはソフトウェアプログラム・プライマー３．０を用いて遺伝子配列（Ｍ１８９７０）に基づいて設計した。このプライマーセットはその配列を下記に示す遺伝子の３０１塩基対（ｂｐ）断片を増幅する。培地及び他の溶液の滅菌は１２１℃で２０分間オートクレーブにより達成した。
entA - 1 (F) 5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3'（配列番号：１）
entA - 2 (R) 5'TACCACCCGCACATTGATAA 3'（配列番号：２）
entA - 1 (F) 5'GGTAGCGAGAAAAGCGAAGA 3'（配列番号：１）
entA - 2 (R) 5'TACCACCCGCACATTGATAA 3'（配列番号：２）
スタフィロコッカス・アウレウスＦＲＩ７２２の標準株の１００μｌ部分を滅菌した１０ｍｌの脳心臓滲出（ＢＨＩ）ブロスに接種し、１４０rpm の培養シェイカー中で３７℃で１８時間インキュベートした。細胞を４℃で１０分間、10,000 rpmで遠心分離することにより収穫した。その細胞を10ｍｌの滅菌0.85％食塩水に懸濁して１０9 コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞濃度を得た。この貯蔵物から、９ｍｌの滅菌0.85％食塩水中に連続希釈を行い、１０8 から１０1 ＣＦＵ／ｍｌまでの範囲の細胞濃度を得た。それぞれの希釈物はそれぞれの食物試料中に添加するために使用した。
低温滅菌したミルク、アイスクリーム及び果実ジュースをそれぞれ２０ｍｌずつ滅菌したスクリューキャップ付きのチューブ（２５×１２５ｍｍ寸法）に採り、テストのための試料として用いた。１．５ｍｌの滅菌ミクロ遠心管のそれぞれに、上記の食物試料のそれぞれ０．４ｍｌをスタフィロコッカス・アウレウスの０．８５％食塩水懸濁液の０．４ｍｌと混ぜて、１０6 、１０5 、１０4 、１０3 、１０2 、１０1 、１０0 ＣＦＵ／ｍｌの範囲の最終細胞濃度を得た。各チューブにジエチルエーテルとクロロホルムをそれぞれ０．２５ｍｌ添加し、３０秒間ヴォルテックスで攪拌した。該試料は２５℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その水相を新たな1.5 ｍｌ滅菌ミクロ遠心管に移し、０．５ｍｌの６Ｍ尿素及び０．１ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウムを添加した。
上記試料を３７℃で２０分間インキュベートし、次いで２５℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その上清は棄て、該試料に０．２ＮのＮａＯＨを０．１ｍｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＤＮＡは１．０ｍｌの冷無水エタノール及び０．１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ4. 8）を添加し、この試料を−２０℃に２時間保持することにより沈殿させた。試料を４℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その上清を棄て、１．０ｍｌの冷70％エタノールを添加し該試料を４℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離することによりＤＮＡ調製物中の過剰の塩を除去した。その上清を棄て、ＤＮＡペレットを風乾し、滅菌超限外ろ過水１５μｌに再懸濁した。
増幅は、ミルク試料からのＤＮＡ調製品を２μｌ含む総反応容量２５μｌで行った。その反応混合液は、１×ＰＣＲ緩衝液（10ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ9. 0、50ｍＭのＫＣｌ、1.5 ｍＭのＭｇＣｌ2 、0.01％のゼラチン）、２００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸、５０ピコモルの各プライマー及び１．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼから成るものであった。鋳型ＤＮＡは最初９４℃で５分間変性させた。続いて、プログラム可能なサーモサイクラーで全部で３５回の増幅サイクルを行った。各サイクルは９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング及び７２℃で１分間の伸長から成るものであった。最後のサイクルの次に７２℃で８分間の最終伸長を続けて行なった。
ＰＣＲ産物はアガローズゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ産物の１０μｌ部分を負荷色素２．０μｌと混ぜ、１．５％のアガローズゲルに載せ、１×ＴＡＥ緩衝液中で１２０ボルトで２時間電気泳動にかけた。ゲルをエチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、蒸留水で脱染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で調べた。１００−塩基対の梯子を分子のサイズマーカーとして使用した。ゲル中の増幅プロファイルをＣＣＤカメラに基づくゲル・ドキュメンテーション・システムで文書化した。
１〜１，０００，０００の範囲のスタフィロコッカス・アウレウス細胞を含む個々の食物試料についてＰＣＲが行われたとき、エンテロトキシンＡ遺伝子に対する３０１塩基対の特異的アンプリコンを観察した。
エルシニア・エンテロコリチカの熱安定なエンテロトキシン遺伝子に対するオリゴヌクレオチドプライマーは、ソフトウェアプログラム・プライマー３．０を用いて該遺伝子配列（Ｘ 65999) に基づき設計した。このプライマーセットはその配列が以下に記載されている遺伝子の１５９塩基対（ｂｐ）断片を増幅する。培地及び他の溶液の滅菌は１２１℃で２０分間オートクレーブすることにより達成した。
yst - 1 (F) 5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' （配列番号：３）
yst - 2 (R) 5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' （配列番号：４）
yst - 1 (F) 5'TCTTCATTTGGAGCATTCGG 3' （配列番号：３）
yst - 2 (R) 5'ATTGCAACATACATCGCAGC 3' （配列番号：４）
エルシニア・エンテロコリチカＭＴＣＣ８５９の標準株の１００μｌ部分を滅菌した１０ｍｌの脳心臓滲出（ＢＨＩ）ブロスに接種し、１４０rpm の培養シェイカー中で３２℃で１８時間インキュベートした。細胞を４℃で１０分間、10,000 rpmで遠心分離することにより収穫した。この細胞を10ｍｌの滅菌0.85％食塩水に懸濁して１０9 コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞濃度を得た。この貯蔵物から、９ｍｌの滅菌0.85％食塩水中に連続希釈を行い、１０8 から１０1 ＣＦＵ／ｍｌまでの範囲の細胞濃度を得た。それぞれの希釈物はそれぞれの食物試料中に添加するために使用した。
低温滅菌したミルク、アイスクリーム及び果実ジュースをそれぞれ２０ｍｌずつ滅菌したスクリューキャップ付きのチューブ（２５×１２５ｍｍ寸法）に採り、テストのための試料として用いた。１．５ｍｌの滅菌ミクロ遠心管のそれぞれに、上記の食物試料のそれぞれ０．４ｍｌをエルシニア・エンテロコリチカの0.85％食塩水懸濁液の０．４ｍｌと混ぜて、１０6 、１０5 、１０4 、１０3 、１０2 、１０1 、１０0 ＣＦＵ／ｍｌの範囲の最終細胞濃度を得た。各チューブにジエチルエーテルとクロロホルムをそれぞれ０．２５ｍｌ添加し、３０秒間ヴォルテックスで攪拌した。該試料は２５℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その水相を新たな1.5 ｍｌ滅菌ミクロ遠心管に移し、０．５ｍｌの６Ｍ尿素及び０．１ｍｌの１０％ドデシル硫酸ナトリウムを添加した。
上記試料を３７℃で２０分間インキュベートし、次いで２５℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その上清は棄て、該試料に０．２ＮのＮａＯＨを０．１ｍｌ添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。ＤＮＡは１．０ｍｌの冷無水エタノール及び０．１ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ4. 8）を添加し、この試料を−２０℃に２時間保持することにより沈殿させた。試料を４℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離した。その上清を棄て、１．０ｍｌの冷70％エタノールを添加し、該試料を４℃で１５分間、10,000 rpmで遠心分離することによりＤＮＡ調製物中の過剰の塩を除去した。その上清を棄て、ＤＮＡペレットを風乾し、滅菌超限外ろ過水１５μｌに再懸濁した。
増幅は、ミルク試料からのＤＮＡ調製品を２μｌ含む総反応容量２５μｌで行った。その反応混合液は、１×ＰＣＲ緩衝液（10ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ9. 0、50ｍＭのＫＣｌ、1.5 ｍＭのＭｇＣｌ2 、0.01％のゼラチン）、２００μＭのそれぞれのデオキシヌクレオシド三リン酸、５０ピコモルの各プライマー及び１．０単位のＴａｑＤＮＡポリメラーゼから成るものであった。鋳型ＤＮＡは最初９４℃で５分間変性させた。続いて、プログラム可能なサーモサイクラーで全部で３５回の増幅サイクルを行った。各サイクルは９４℃で１分間の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング及び７２℃で１分間の伸長から成るものであった。最後のサイクルの次に７２℃で８分間の最終伸長を続けて行なった。
ＰＣＲ産物はアガローズゲル電気泳動で分析した。ＰＣＲ産物の１０μｌ部分を負荷色素２．０μｌと混ぜ、１．５％のアガローズゲルに載せ、１×ＴＡＥ緩衝液中で１２０ボルトで２時間電気泳動にかけた。ゲルをエチジウムブロミド（０．５μｇ／ｍｌ）で染色し、蒸留水で脱染色し、ＵＶトランスイルミネーター上で調べた。１００−塩基対の梯子を分子のサイズマーカーとして使用した。ゲル中の増幅プロファイルをＣＣＤカメラに基づくゲル・ドキュメンテーション・システムで文書化した。
１〜１，０００，０００の範囲のエルシニア・エンテロコリチカ細胞を含む個々の食物試料についてＰＣＲが行われたとき、熱安定なエンテロトキシンに対する１５９塩基対の特異的アンプリコンを観察した。
Ａ．データベースから選択されたＳ．アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子のＤＮＡ配 列の詳細は以下の通りである。
Ｍ 18970．Ｓ．アウレウスのエンテロト・・・［gi：153120］関連配列，タンパク質，PubMed，タクソノミー
ローカス ＳＴＡＴＯＸＡＡ 774bp ＤＮＡ リニア ＢＣＴ26-APR-1993
ディフィニション S.アウレウスのエンテロトキシンＡ（entA）遺伝子，完全ｃｄｓ
アクセッション Ｍ１８９７０
バージョン Ｍ１８９７０．１ ＧＩ：１５３１２０
キーワード エンテロトキシン
ソース S.アウレウス（株ＦＲＩ３３７）ＤＮＡ，クローンｐＭＪＢ［９，３８］
生物 スタフィロコッカス・アウレウス
細菌；Firmicutes；Bacillus/Clostridium group；Bacillales；
Staphylococcus
リファレンス １（塩基１から７７４）
著者ら ベトレー，エム．ジェイ．及びメカラノス，ジェイ．ジェイ．
表題 Ａ型スタフィロコッカスエンテロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列
雑誌 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，３４〜４１（１９８８）
メドライン ８８０８６８９２
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..774
/organism= "Staphylococcus aureus"
/db xref= "taxon:1280"
シグナルペプチド 1..72
/note= "Staphylococcal enterotoxin A signal peptide"
ＣＤＳ 1..774
/note= "Staphylococcal enterotoxin A precursor"
/codon start=1
/transl table=11
/protein id= "AAA26681.1"
/db xref= "GI:153121"
Ｍ 18970．Ｓ．アウレウスのエンテロト・・・［gi：153120］関連配列，タンパク質，PubMed，タクソノミー
ローカス ＳＴＡＴＯＸＡＡ 774bp ＤＮＡ リニア ＢＣＴ26-APR-1993
ディフィニション S.アウレウスのエンテロトキシンＡ（entA）遺伝子，完全ｃｄｓ
アクセッション Ｍ１８９７０
バージョン Ｍ１８９７０．１ ＧＩ：１５３１２０
キーワード エンテロトキシン
ソース S.アウレウス（株ＦＲＩ３３７）ＤＮＡ，クローンｐＭＪＢ［９，３８］
生物 スタフィロコッカス・アウレウス
細菌；Firmicutes；Bacillus/Clostridium group；Bacillales；
Staphylococcus
リファレンス １（塩基１から７７４）
著者ら ベトレー，エム．ジェイ．及びメカラノス，ジェイ．ジェイ．
表題 Ａ型スタフィロコッカスエンテロトキシン遺伝子のヌクレオチド配列
雑誌 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７０，３４〜４１（１９８８）
メドライン ８８０８６８９２
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..774
/organism= "Staphylococcus aureus"
/db xref= "taxon:1280"
シグナルペプチド 1..72
/note= "Staphylococcal enterotoxin A signal peptide"
ＣＤＳ 1..774
/note= "Staphylococcal enterotoxin A precursor"
/codon start=1
/transl table=11
/protein id= "AAA26681.1"
/db xref= "GI:153121"
mat peptide 73..771
/product= "Staphylococcal enterotoxin A"
Ｂａｓｅ Ｃｏｕｎｔ 299ａ 97ｃ 144ｇ 234ｔ
Ｏｒｉｇｉｎ HincII部位の上流 47 bp
/product= "Staphylococcal enterotoxin A"
Ｂａｓｅ Ｃｏｕｎｔ 299ａ 97ｃ 144ｇ 234ｔ
Ｏｒｉｇｉｎ HincII部位の上流 47 bp
上記の配列から選択されたＳ．アウレウスのエンテロトキシンＡ遺伝子の保存された領域の配列は以下に示す。本出願で述べた前向き及び逆向きプライマーにより挟まれるこの領域は太い文字で示してある。これらのプライマーは食物系で高感度の検出を達成するように設計された。
Ｂ．データベースから選択されたＹ．エンテロコリチカの熱安定なエンテロトキシン遺伝子のＤＮＡ配列の詳細は以下の通りである。
Ｘ６５９９９．Ｙ．エンテロコリチカ・・・［gi:48611］関連配列, タンパク質, 分類
ローカス ＹＥＹＳＴＧ 216 bp DNA リーニア BCT 06-OCT-1992
ディフィニション Y.エンテロコリチカのエンテロトキシンに対するyst 遺伝子
アクセッション Ｘ６５９９９
バージョン Ｘ６５９９９．１ ＧＩ：４８６１１
キーワード エンテロトキシン
ソース エルシニア・エンテロコリチカ
生物 エルシニア・エンテロコリチカ
細菌；Proteobacteria; gamma subdivision; Enterobacteriaceae;
Yersinia
リファレンス １（塩基１から２１６）
著者ら スタックブラント，イー．
表題 直接的サブミッション
雑誌 Submitted (06-MAY-1992) E. Stackebrandt, Dept of Microbiology,
University of Queensland, St.Lucia, Qld, Australia 4072
リファレンス ２（塩基１から２１６）
著者ら イブラヒム，エイ．，リーサック，ダブリュー．，パイク，エス．，及び
スタックブラント，イー．
表題 ポリメラーゼ連鎖反応：病原性エルシニア・エンテロコリチカ株の二つの クラスター間を識別するための疫学的道具
雑誌 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．97, 63−66（1992）
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..216
/organism= "Yersinia enterocolitica"
/strain= "serotype 0:8"
/db xref= "taxon:630"
遺伝子 1..216
/gene= "yst"
ＣＤＳ 1..216
/gene= "yst"
/codon start=1
/transl table=11
/product= "enterotoxin"
/protein id= "CAA46801.1"
/db xref= "GI:48612"
/db xref= "SWISS-PROT:P07593"
Ｘ６５９９９．Ｙ．エンテロコリチカ・・・［gi:48611］関連配列, タンパク質, 分類
ローカス ＹＥＹＳＴＧ 216 bp DNA リーニア BCT 06-OCT-1992
ディフィニション Y.エンテロコリチカのエンテロトキシンに対するyst 遺伝子
アクセッション Ｘ６５９９９
バージョン Ｘ６５９９９．１ ＧＩ：４８６１１
キーワード エンテロトキシン
ソース エルシニア・エンテロコリチカ
生物 エルシニア・エンテロコリチカ
細菌；Proteobacteria; gamma subdivision; Enterobacteriaceae;
Yersinia
リファレンス １（塩基１から２１６）
著者ら スタックブラント，イー．
表題 直接的サブミッション
雑誌 Submitted (06-MAY-1992) E. Stackebrandt, Dept of Microbiology,
University of Queensland, St.Lucia, Qld, Australia 4072
リファレンス ２（塩基１から２１６）
著者ら イブラヒム，エイ．，リーサック，ダブリュー．，パイク，エス．，及び
スタックブラント，イー．
表題 ポリメラーゼ連鎖反応：病原性エルシニア・エンテロコリチカ株の二つの クラスター間を識別するための疫学的道具
雑誌 ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．97, 63−66（1992）
フィーチャーズ Location/Qualifiers
source 1..216
/organism= "Yersinia enterocolitica"
/strain= "serotype 0:8"
/db xref= "taxon:630"
遺伝子 1..216
/gene= "yst"
ＣＤＳ 1..216
/gene= "yst"
/codon start=1
/transl table=11
/product= "enterotoxin"
/protein id= "CAA46801.1"
/db xref= "GI:48612"
/db xref= "SWISS-PROT:P07593"
Ｂａｓｅ Ｃｏｕｎｔ 52a 44ｃ 56ｇ 64t
Ｏｒｉｇｉｎ
Ｏｒｉｇｉｎ
上に示した配列から選択されたＹ．エンテロコリチカの熱安定なエンテロトキシン遺伝子の保存された領域の配列を以下に示す。本出願で述べた前向き及び逆向きプライマーにより挟まれる領域は太字で示してある。これらのプライマーは食物系における高感度の検出を達成するように設計された。
Claims (26)
- 配列番号：１と２の特異的プライマー及び配列番号：３と４の特異的プライマーのセットを用いて、食物系中の食物を毒する細菌種であるスタフィロコッカス・アウレウス及びエルシニア・エンテロコリチカを同時に、予め濃縮することなく、高感度且つ迅速に検出する方法であって、
（ａ）食物マトリックスを調製する工程、
（ｂ）総微生物ＤＮＡを抽出する工程、
（ｃ）該プライマーセットを用いるＰＣＲにより標的遺伝子のプロファイルを増幅する工程、
（ｄ）ゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を分析する工程、及び
（ｅ）該細菌株を検出する工程、
を含む方法。 - 食物系が、ミルク、果実ジュース及びアイスクリームからなる群から選択される、請求項１記載の方法。
- ジエチルエーテル、クロロホルム、尿素及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む抽出混合液を用いてＤＮＡを抽出する、請求項１記載の方法。
- ジエチルエーテルとクロロホルムが１：１〜１：５の範囲の割合である、請求項３記載の方法。
- 尿素の濃度が１．０〜４．５Ｍの範囲である、請求項３記載の方法。
- ＳＤＳの濃度が０．３〜３．０％の範囲である、請求項３記載の方法。
- ＰＣＲ反応混合液が、６〜１５ｍＭの範囲のトリス塩酸（Ｔｒｉｓ ＨＣｌ）、４０〜６０ｍＭの範囲の塩化カリウム（ＫＣｌ）、０．３〜５．０ｍＭの範囲の塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．００２〜０．０５％の範囲のゼラチン、１００〜５００μＭの範囲の個々のデオキシヌクレオチド三リン酸、配列番号：１と２の特異的プライマー及び配列番号：３と４の特異的プライマーのセット、０．３〜５．０単位の範囲のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、０．０２〜３．０％の範囲の鋳型ＤＮＡを含む、請求項１記載の方法。
- ＰＣＲにおいて９０〜９８℃の範囲の温度で１〜１０分間の範囲の時間ＤＮＡを変性させる、請求項１記載の方法。
- ＰＣＲにおいて９３〜９５℃の範囲の温度で４〜６分間の範囲の時間ＤＮＡを変性させる、請求項８記載の方法。
- ２５〜４５サイクルの範囲の増幅サイクルでＰＣＲを行う、請求項１記載の方法。
- ３２〜３８サイクルの範囲の増幅サイクルでＰＣＲを行う、請求項１０記載の方法。
- 各サイクルの変性温度が、３０〜８０秒の範囲の時間、９０〜９８℃の範囲である、請求項１記載の方法。
- 各サイクルの変性温度が、５５〜６５秒の範囲の時間、９３〜９５℃の範囲である、請求項１２記載の方法。
- ＰＣＲにおいて４０〜６５℃の範囲の温度で３０〜９０秒の範囲の時間ＤＮＡをアニーリングする、請求項１記載の方法。
- ＰＣＲにおいて５３〜５６℃の範囲の温度で５５〜６５秒の範囲の時間ＤＮＡをアニーリングする、請求項１４記載の方法。
- ＰＣＲにおける伸長が、６８〜７６℃の範囲の温度で４０〜８０秒の範囲の時間行われる、請求項１記載の方法。
- ＰＣＲにおける伸長が、７０〜７４℃の範囲の温度で５５〜６５秒の範囲の時間行われる、請求項１６記載の方法。
- ＰＣＲにおける最後の伸長が、６８〜７６℃の範囲の温度で２〜１５分間の範囲の時間行われる、請求項１記載の方法。
- ＰＣＲにおける最後の伸長が、５５〜６５℃の範囲の温度で６〜１０分間の範囲の時間行われる、請求項１８記載の方法。
- ゲル電気泳動がアガローズゲル上で行われる、請求項１記載の方法。
- アガローズゲルの濃度が１．０〜２．０％の範囲である、請求項２０記載の方法。
- アガローズゲルが０．２〜１．０μｇ／ｍｌの範囲の濃度のエチジウムブロミドで染色される、請求項２０記載の方法。
- 染色したゲルがＵＶトランスイルミネーターの下で観察される、請求項２２記載の方法。
- １個の細胞程度の少ない量で該細菌株を検出するために使用される、請求項１記載の方法。
- 食物中毒の爆発的発生を防止するのに役立つ、請求項１記載の方法。
- 細菌株を検出する直接的方法である、請求項１記載の方法。
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