JP3752267B2 - エポキシ化酵素遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はPenicillium decumbens（以下 P. decumbens と略す）のエポキシ化酵素に関する遺伝子の単離および特性確認並びにP. decumbens細胞を含む細胞の遺伝子工学的操作における上記遺伝子の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物は多用な有用物質を生産し、また様々な前駆物質を有用物質に変換することができる。産業的にこの能力を利用する場合、自然界より発見したばかりの微生物は往々にして活性が弱く、産業上の物質生産の為には能力向上を成し遂げなくてはならない。従来は変異処理によって誘導した突然変異体を膨大な費用と時間を掛け選別し育種する方法が主流であった。近年の遺伝子工学技術の発展により、目的の遺伝子をクローニングし、in vitroで遺伝子の改良操作を行い、微生物に導入し、期待する能力を向上させる事が可能となった。しかし、このためには様々な方法を用いて目的遺伝子を分離同定しなければならない。本発明に関しては、目的の酵素活性が検出できていないためその酵素蛋白質を同定すること及びその蛋白質をコードする遺伝子を分離する事が困難であった。また、糸状菌の遺伝子操作の分野では糸状菌を宿主として、ショツトガン方式で遺伝子を同定することも困難であった。
【０００３】
一方、本発明に用いたP. decumbensに於ては遺伝子再導入の方法が確立されておらず、たとえ目的遺伝子を分離できたとしても、P.decumbensに再導入し、その効果を明らかにできる技術も未解決であった。従って、少なくともP. decumbensの（Ｚ）−１−Ｐｒｏｐｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ（以下ｃＰＰＡと略す）をエポキシ化する酵素活性の向上に関し、遺伝子工学技術を用いた例はなかった。また、本発明のｃＰＰＡをホスホマイシン（（−）−（１Ｒ，２Ｓ）−（１，２−ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に変換する（化１）微生物は広く知られていたが、そのエポキシ化酵素やその酵素をコードする遺伝子に関しては、全く知られていなかった。
【化１】
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
ｃＰＰＡのエポキシ化酵素活性はまるごとの菌体では検出が可能であったが、無細胞抽出液では検出できていないことからこの酵素蛋白質の精製は非常に難しく大きな課題であった。また、ホスホマイシンの生合成に関与する酵素数も未解決であり、いく種類の遺伝子を解明すれば活性向上がなされるか明確ではなかった。一方、P. decumbensに遺伝子を導入する方法も解決できておらず、たとえ、目的遺伝子を得たとしてもその効果をP. decumbensに於て評価できる事は約束されてはいなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
P. decumbensに於て、ｃＰＰＡを添加して培養した場合に初めて誘導発現してくる蛋白質を発見した。この蛋白質を精製し、アミノ酸配列を決定し、対応する合成DNAプライマーを用いたリバースジェネティクス法により遺伝子の分離に成功した。更に、DNAの塩基配列を決定し、発現可能な領域を含む断片を決定し、糸状菌に導入するため、ハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとするプラスミドにサブクローンした。
【０００６】
一方、P. decumbensの形質転換系が確立されていなかった為、A. ニデュランスのプロトプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，ｐ１４７０（１９８４））を改良し、P. decumbensに適合する独自のプロトプラスト化条件及び再生条件を設定し、非常に狭い範囲のハイグロマイシン添加条件下でのみ形質転換株が得られる条件確立に至った。この新規条件を用いて、本発明の遺伝子を導入した。
【０００７】
微生物の寄託
本発明によるエポキシ化酵素遺伝子を含むｐＦＯＭ３（実施例５参照）で形質転換された株は大腸菌ＪＭ１０９の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４９４４のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子を用いる事により、P. decumbensのｃＰＰＡのエポキシ化活性を飛躍的に向上させ、あるいは遺伝子の改良により目的とするいかなる条件に於てもエポキシ化可能な状況を設定できる、あるいは遺伝子工学手法を駆使すれば、本発明の遺伝子を用いる事によって、目的とする細胞に於てｃＰＰＡのエポキシ化活性を発現増強させることが可能となる。具体的には、P. decumbensの形質転換株はｃＰＰＡをホスホマイシンに培養変換する能力が飛躍的に向上し親株の持つ能力の約4.3倍に向上するに至った。
【０００９】
【実施例】
実施例1 エポキシ化酵素の精製とアミノ酸配列決定
（１）ｃＰＰＡ添加により誘導発現される、蛋白質の精製
無細胞抽出液の調製の為、P. decumbensの胞子を３０ｍｌのSM-1培地（組成：１リットル当たりグルコース 30g, ニュウトリエント・ブロス 8g，酵母エキス 2g， モルトエキス 3g, pH7.0）で、28℃、48時間培養した。このうち1mlをSM-1培地に植継ぎ、28℃で48時間培養し、ｃＰＰＡを（終濃度：1000μg/ml）添加し、さらに28℃で48時間培養した。菌糸を20mM トリスー塩酸緩衝液(pH7.5) で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁した。氷冷下、SONIFIER cell Disruptor 350(ブランソン社)を用いて、2 分間の超音波処理を行った。これを7000gで10分間遠心分離し、無細胞抽出液を得た。
【００１０】
無細胞抽出液を、Multiphor II（ファルマシアバイオテク社製）により、二次元電気泳動を行った。一次元目はImmobiline DryStrip(pH4-7)(ファルマシアバイオテク社製)を用いて、泳動し、二次元目はExcelGel SDS gradient8-18(ファルマシアバイオテク社製)を用いて、泳動を行い、目的の蛋白質を精製した。尚、クマシーブレリエントブルーにより蛋白質染色を行い、単一スポットであることを確認した。得られた蛋白質の分子量は３１０００であった。
（２）部分アミノ酸配列決定
N末端アミノ酸配列決定のために、二次元電気泳動で精製した蛋白質を、polyvinylidene difluoride (PVDF) 膜（パーキンエルマー社製、ProBlott)にMultiphor IIを用いて転写した。更に、0.2% ポンソー S（シグマ社）1%酢酸溶液で染色し、プロテイン シーケンサModel 492(パーキンエルマー社)用いて、アミノ酸配列決定を行った。
【００１１】
ペプチドマップ及びぺプチドのアミノ酸配列決定にはPVDF膜に転写された目的蛋白質のスポットを切断した後25mM トリスー塩酸緩衝液（pH8.5 ） 90μlとアセトニトリル10μlを加えて懸濁した。これに、１０ｐｍｏｌのLysyl エンドペプチダーゼ（和光純薬工業 ）加えた後、37℃で16時間インキュベートした。これをμＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ HPLCシステム（Perkin Elmer model 172、カラム：ＲＰ−３００，Ａｑｕａｐｏｒｅ，Ｃ−８，２．１ｍｍｘ２２０ｍｍ)を用いて目的のペプチドを分取した。更に、N末端アミノ酸配列決定と同様にして、部分ペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、N-末端、ペプチドＮｏ． 3、ペプチドＮｏ． ７、ペプチドＮｏ． １３、及び ペプチドＮｏ．15のアミノ酸配列は以下の様になった。但し、Ｘａａは不明のアミノ酸を表す。
【００１２】
N-末端アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
ペプタイド Ｎｏ． 3 Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
ペプタイド Ｎｏ． ７ Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
ペプタイド Ｎｏ． １３ Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
ペプタイド Ｎｏ． １５ Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
【００１３】
実施例2 部分アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマー作成とPCR法によるロングプライマーの増幅
（１）プライマーの作成
N末端アミノ酸配列及びペプチドのアミノ酸配列の結果より、次に示すPCR反応用合成DNAプライマーのデザインを決定した。
【００１４】
N末端アミノ酸配列ではＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ配列に相当する以下の二本のオリゴヌクレオチド（シークエンス N-1とシークエンス N-2）を合成しUpper プライマーとして使用した。
シークエンス N-1(17mer), 5’-AC[T, A]-CCX-GA[G,A]-CA[G,A]-AT[C,T,A]-G-[C]-3'
シークエンス N-2(17mer), 5'-AC[C,G]-CCX-GA[G,A]-CA[G,A] -AT[C,T,A]-G-[C]-3'
ペプタイド Ｎｏ． １５ではＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ配列に相当する以下の二本のヌクレオチド （シ−クエンス 15-1と シ−クエンス15-2）を合成しLower プライマーとして使用した。
シ−クエンス 15-1(17mer), 5'-GC[C,T]-TG[G,A]-AAX-CC[G,A]-TT[T,A]-C-[C]-3'
シ−クエンス15-2(17mer), 5'-GC[C,T]-TG[G,A]-AAX-CC[G,A]-TT[C,G]-C-[C]-3',
X:Inosine
【００１５】
染色体DNAの分離は菌体約10gを20mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で二回洗浄後、液体窒素で凍結しておき、ホモジナイザー(日本精機社: AM-3)を用いて２分間粉砕した。これを80mlのTESH 緩衝液（０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁後、染色体DNAを調製した。
PCR法によるDNA増幅はｒTaq DNA ポリメラーゼキット(宝酒造社製)によって行った。 増幅条件は熱変成が94℃で１分、アニーリングが50℃で２分、合成反応は72℃で３分で行い、30サイクル反応させた。増幅した約500bpのDNAをアガロース電気泳動後セファグラス・ バンドプレップ・キット（ファルマシアバイオテク社)を用いて切り出し、以下に示すハイブリダイズ用プローブとして供した。
【００１６】
実施例3 コスミド（pCRB8）によるgenomic DNAのクローニング
（１）パッケ−ジング
P. decumbensの染色体DNAをSau3AI（宝酒造製）で、10-20kbpの断片に部分消化した。pCRB8はBamHI（宝酒造製）で消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により末端脱リン酸化した。部分消化染色体DNA、BamHI消化pCRB8をライゲーション・キット（宝酒造製）を用いて連結した。連結DNAのλ ファージへのパッケイジングはλDNA in vitro パッケイジング・キット（アマーシャム社製）で行い、ファージ液を調製した。
【００１７】
（２）コスミドライブラリーの作成
E. coli JM109を宿主とし、希釈したファージ液を混合し感染させた。大腸菌は50μg/mlのアンピシリン添加プレートで一晩培養し、これをコスミドライブラリーとした。 ライブラリースクリーニングはECL Directのhybridization and detection キット（アマーシャム社製）でおこなった。コスミドライブラリーを、Ｈybond N+ナイロンメンブレン（アマーシャム社製）に転写し、0.5N NaOHで固定し、5XSSCで洗浄した。5% blocking reagent及び0.5M NaClを含むハイブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイズの後、標識したプローブを加えた。プローブにはPCR法で増幅したDNAを用いた。ハイブリダイズのシグナルはDetection reagentを加え励起し、HYPERfilm -ECL（アマーシャム社製）に感光させた。
以上のスクリーニングによって得られた陽性クローンは4個であった。そこで、これらの陽性クローンよりコスミドDNAを単離し、ハイブリダイズするDNA断片の解析を行った。
【００１８】
（３）サザンハイブリダイゼーションによる遺伝子座の決定
コスミドDNAをBamHIで消化の後、電気泳動を行い、泳動ゲル中のDNAをキャピラリーブロッティングでＨybond N+ナイロンメンブレンに転写した。メンブレンは前述の方法に基づきPCR法で増幅したDNAをプローブとして一晩ハイブリダイズを行った。この結果、3個のクローンが約6kbpのBamHI断片を有し、これは染色体のハイブリダイズの結果と一致した。
（４）遺伝子のサブクローニング
制限酵素地図作成のため6kbpのBamHI断片（図1）を、コスミドDNAより分離しBamHIで消化したpUC18と連結しpFOM1-14（図1）を作成した。
【００１９】
実施例4 イントロン配列決定及び蛋白質コード領域の決定
（１）ｍＲＮＡの調製
genomic DNAに存在するイントロン配列を明らかにするため、mRNAを調製しcDNAを作成後クローニングした。mRNAはQuickPrep mRNA Purification キット (ファルマシアバイオテク社製）に従い調製した。凍結菌糸の粉砕物の0.5gに抽出緩衝液(グアニジウム・チオシアネート及びＮ−ラウリルザルコシン) と溶出緩衝液(10 mM トリス−塩酸, pH7.4 1mM EDTA)を加え、撹拌後、遠心分離により上澄み液を得た。これをオリゴ(dT)-セルローススピンカラムにチャージし高塩濃度緩衝液(10 mM トリス−塩酸 pH7.4, 1 mM EDTA, 0.5M NaCl)及び低塩濃度緩衝液（10 mM トリス−塩酸 pH7.4, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl)による洗浄後溶出緩衝液により、mRNAを溶出した。
【００２０】
（２）cDNAの調製
TimeSaver cDNA Synthesis キット(ファルマシアバイオテク社製）でcDNAを調製した。 First-Strand Reaction MixesにDTT 溶液と熱変成させたmRNA溶液と更にオリゴ(dT)12-18 プライマー を加え加温した。この溶液を、Second-Strand Reaction Mixesに加え加温したあと常温に戻した。これに、フェノールークロロホルムを加え撹拌した。遠心分離後上層の水溶液部分をスピンカラムに通し、遠心して溶離液を得た。これにEcoRI/NotI Adaptors 溶液 , PEG 緩衝液 , ATP 溶液 , T4-DNA リガーゼを加え16℃で反応後、65℃10分加温した。次に、5'末端の燐酸化を行う為に、ATP 溶液と T4 ポリヌクレオチッド・キナーゼ とを加え撹拌後、37℃ 10分、 65℃、10分加温した。その後室温に戻しフェノ−ル−クロロホルムを加え撹拌後遠心分離により、水層部分を得た。これをスピンカラムに添加し、遠心分離後溶出液を得た。この溶液をエタノール沈殿に供し最終的にDNAを5μlの水に溶解した。
【００２１】
（３）パッケージング
λ ファージへのパッケ−ジングはλgt11 クローニング キット (ストラタジーン社製)を用いた。 ライゲーション反応はDNA溶液にEcoR I digested, phosphatased λgt11アームズ , 10x ligation buffer(500mM トリス−塩酸 pH7.5, 70mM MgCl2, 10mM DTT) , 10mMγ-ATP(pH7.5) , T4 DNA リガーゼ を加え、4℃で終夜行った。パッケージングはGigapack II Packaging Extract(ストラタジーン社製）で行った。
（４）ライブラリーの作成
宿主細胞 にE. coli Y1088を用いた。TB Broth( 5g NaCl, 10g バクトトリプトン, pH7.4)に0.2%マルトース(ミリポアフィルター滅菌), 10mM MgSO4(オートクレーブ滅菌)を添加しておいた培地に植菌し37℃で終夜振盪培養を行った。集菌し、OD600=0.5になるよう、10mM MgSO4で懸濁調製した。この懸濁液に、クロロホルム保存中のファージ液を適切に希釈して添加した。NZYトップアガー (0.7% アガー)と共にNZY アガー(１リットル当たり 5g NaCl, 2g MgSO4・7H2O, 5g 酵母エキス, 10g NZ アミン, pH7.5 , 20g アガー)にまいた後、37℃で終夜培養し、プラーク を形成させた。
【００２２】
（５）プラークハイブリダイゼーションによるライブラリースクリーニング
ライブラリースクリーニングはECL direct nucleic acid labelling and detection systemsキット(アマーシャム社製)を用いて行なわれた。 フィルター（アマーシャム HybondTM-N+)をトップアガー上のプラークにのせ針で目印を付けた後はがし、予め0.4N NaOHで湿らせた濾紙に、プラークが吸着した面を上にしてのせ、5分変成させる。これを、5x SSCで洗浄し、濾紙上で風乾させた。
（６）ラベル化プローブの作成
PCR法で増幅したプローブを電気泳動し、目的のDNAバンドを含む寒天片を切り取った。これをSephaglasTM BandPrep キット(ファルマシア社製)を用いてDNAを抽出した。これをエッペンチューブに取り、100℃ 5分加熱し二本鎖DNAを単鎖化した。氷で冷却後、DNA labelling reagentを加え更にグルタ−ルアルデヒド溶液を加え、37℃ 10分加温した。Hybridization 緩衝液にNaCl 0.5M, blocking agent 5%(w/v)を添加し、良く溶解させた。これに、先のメンブランを浸し42℃ 60分プレハイブリを行った。これに、プローブ溶液を加え、42℃で4時間ハイブリダイセーションを行った。
【００２３】
（７）Washing
フィルターを６Ｍ 尿素入りのPrimary wash buffer(尿素 ６Ｍ，０．４％ＳＤＳ， ０．５ｘＳＳＣ）により、42℃で、20分 洗浄した。この次に、Secondary wash buffer(2x SSC)により、室温 10分の洗浄を二回繰り返した。
（８）Signal detection
濾紙上で水分を切ったフィルターを、等量のDetection solution 1と2を混合したものに浸し、サランラップにはさみ込んだ。これと、HYPERfilm -ECL(アマーシャム社製）とカセットに入れサンドイッチし60分間感光させた後、現像した。
（９）ファージDNAの調製
陽性プラークをピペットで吸い取り、 ファージ希釈緩衝液に加え良く撹拌した。希釈したあと、E. coli Y1088を用いて前項で述べた方法を繰り返しプラークを単一化した。単一化できたプラークを再度100μlの ファージ希釈緩衝液（１リットル当たりＮａＣｌ ５．８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５），ゼラチン １０ｇ）にとり撹拌後、E. coli Y1088の菌体懸濁液に加え、37℃、20分加温した。この全量を、NZY brothに植菌し、37℃で培養した。7-8時間後、E. coli Y1088が溶菌した。溶菌液にクロロホルムを添加し10分振盪後、3000rpmで遠心分離後、デブリスを除去した。上澄を30000rpm, 60分の遠心分離（６５Ｐ−７：日立工機社製）にかけ、透き通った硝子状のペレットを得た。これに、ファージ希釈緩衝液を加えて溶かした。プロテナーゼ K（1mg/ml，和光純薬工業製)のファージ希釈緩衝液を400μl添加し、37℃、2時間反応後、フェノール処理、エタノール沈殿後、TE 緩衝液に溶解した。このファージ DNAをEcoRIで切断し、挿入断片を調製した。これを、プラスミド pUC11９のEcoRI部位にトリミングしプラスミド(pFOC2)を作成し、塩基配列決定に供した。
【００２４】
実施例5 遺伝子の塩基配列解析
pFOM1-14をHindIII及びXbaIで消化し、遺伝子の全長を含む2.3kbpの断片を切り出した。これをpUC11９に連結し、大腸菌JM109に形質転換し、陽性なクローンからプラスミドpFOM3（図1）を単離した。塩基配列解析用鋳型DNAにはpFOM3及び前項に示したpFOC2を用いた。塩基配列解析装置は、A.L.F. DNA シークエンサー II（ファルマシアバイオテック社）を用いた。シーケンシングゲルは、同社製のReady mix gel、又はAT Biochem社製のハイドロリンク・ロングレンジャーなるアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（N, N, N', N' -テトラメチルエチレンジアミン, 尿素, 過硫酸アンモン）はいづれもA.L.Fグレードの試薬(ファルマシアバイオテック社製)を用いた。塩基配列解読反応は、Auto Read sequencing キット又はAuto cycle sequencing キット（ファルマシアバイオテック社製）を用いた。
【００２５】
まず、pFOM3を2N NaOHで変成後、エタノールにより沈殿化した。これを鋳型として、M13 Universal、ReverseまたはFITC標識合成プライマーWATF-01−10（WATF-01 (5'-ACCACTCTAA TGGGTACCTC CTC-3'), WATF-02 (5'-ACGAGTCGGT GCTCTTCAGC ACG-3'), WATF-03 (5'-TCAACTATAA ACAGCCCCAC GGC-3'), WATF-04 (5'-GGACGACCCG GAAGTGGTGCTAG-3'), WATF-05 (5'-TGAAGGGAAG GATTATTCGG AAG-3'), WATF-06 (5'-GCTAGCACCACTTCCGGGTC GTC-3'), WATF-07 (5'-GCGCGAAAAG AGTATGACGG CCC-3'), WATF-08 (5'-TCCTTCCCTT CAATCCGTTC TAC-3'), WATF-09 (5'-CCGATGTGGT CGTACGCCGG GGC-3'), WATF-10 (5'-ATCACAGCAG GCCGATTCGC ACG-3')）をアニールさせ、T7、TthまたはTaq ポリメラーゼで伸長反応を行った。合成産物はReady mix gel、又はHydrolink long rengerゲルを用いて泳動し、解析した。その結果、HindIII−XbaI断片2329bpを配列表2の様に決定した。
【００２６】
実施例6 セルフクローニングの為のプラスミド作製(pFOM4)及びP. decumbensの形質転換
（１）プラスミド（ｐＦＯＭ４）の作成
実施例５にしめすpFOM3のXba1部位に、ハイグロマイシン耐性カセットを更に連結し、pFOM4（図２）を作製した。
（２）P. decumbensの形質転換
P. decumbensの胞子保存液をS#1培地（１リットル当たりグリセリン、3０ｇ, ニュウトリエント・ブロス8ｇ, モルト・エキス ３ｇ, 酵母エキス ２ｇ, グルタミン酸ナトリウム １ｇ ）に植え、48時間振盪培養を行った。生育した菌糸を2mlS#1培地に移植し更に24時間培養した。得られた菌糸を35%ソルビトール溶液10mlに懸濁し再度遠心分離に供した。得られた菌糸を終濃度として、アクロモペプチダーゼ（3mg/ml）,Lysing enzyme （3mg/ml）,及びキチナーゼ（1mg/ml）を含む35%ソルビトール溶液に懸濁させた。これをL字管に入れゆっくり振盪しながら34℃で3時間反応させプロトプラストを形成させた。綿濾過により未反応の菌糸を除去した後、遠心分離によりプロトプラストを集め、これを10mlの0.5M サッカロース緩衝液（０．５Ｍサッカロース，10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5， 10mM CaCl2）に懸濁させた。これを遠心分離にかけ、得られたペレットを1mlの0.5M サッカロース緩衝液に懸濁した。このプロトプラスト溶液100μlと10μlのDNA(10μg)溶液に400μlのPEG 緩衝液（60% PEG4000, 10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5,10mM CaCl2)を加え良く懸濁させた。
【００２７】
更に、0.5M サッカロース緩衝液を10ml加え攪拌後、遠心分離に供した。得られたペレットを35%ソルビトール液 1mlに懸濁した。これを、以下の組成の再生培地｛PDA 3.9% ラフィノース 30%( Hygromycin 25μｇ/ml)｝に塗布した後、軟寒天培地（PDA1.3% ラフィノース 30%）を重層した。26℃で 5日間の培養によりハイグロマイシン耐性を獲得した形質転換株を得た。
【００２８】
実施例7 形質転換株の変換活性解析
P. decumbensの胞子保存液をSM-1培地に植菌し28℃で48時間振盪培養した。このうち1mlをSM-1培地に植継ぎ、28℃で48時間培養し、ｃＰＰＡを終濃度が4000μg/mlとなるように添加し、更に7日間28℃でロータリーシェカーにより培養を続けた。遠心分離により培養上澄液を得、これを東ソ−イオンクロマトグラフィーシステム（東ソ−社製）に供し、ｃＰＰＡが変換されて生じるホスホマイシンを定量した。その結果、P. decumbensの野生株では、生産されたホスホマイシンが800μg/mlであったが、遺伝子組み換え株では、1140-3420μg/mlとその変換活性が約4.3倍に向上していた（表1）。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２７７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
【００３１】
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：２３２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ
存在位置：１００７−２０２９
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ
存在位置：１２９５−１４２１
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ
存在位置：１８５５−１９１６
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ
存在位置：１−６
他の情報：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ
存在位置：２３２４−２３２９
他の情報：Ｘｂａ Ｉ
【図面の簡単な説明】
【図１】６．０ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片の制限酵素地図とｐＦＯＭ３及びｐＦＯＭ１−１４の関係を示した地図
【図２】プラスミドｐＦＯＭ４の制限酵素地図
【産業上の利用分野】
本発明はPenicillium decumbens（以下 P. decumbens と略す）のエポキシ化酵素に関する遺伝子の単離および特性確認並びにP. decumbens細胞を含む細胞の遺伝子工学的操作における上記遺伝子の用途に関する。
【０００２】
【従来の技術】
微生物は多用な有用物質を生産し、また様々な前駆物質を有用物質に変換することができる。産業的にこの能力を利用する場合、自然界より発見したばかりの微生物は往々にして活性が弱く、産業上の物質生産の為には能力向上を成し遂げなくてはならない。従来は変異処理によって誘導した突然変異体を膨大な費用と時間を掛け選別し育種する方法が主流であった。近年の遺伝子工学技術の発展により、目的の遺伝子をクローニングし、in vitroで遺伝子の改良操作を行い、微生物に導入し、期待する能力を向上させる事が可能となった。しかし、このためには様々な方法を用いて目的遺伝子を分離同定しなければならない。本発明に関しては、目的の酵素活性が検出できていないためその酵素蛋白質を同定すること及びその蛋白質をコードする遺伝子を分離する事が困難であった。また、糸状菌の遺伝子操作の分野では糸状菌を宿主として、ショツトガン方式で遺伝子を同定することも困難であった。
【０００３】
一方、本発明に用いたP. decumbensに於ては遺伝子再導入の方法が確立されておらず、たとえ目的遺伝子を分離できたとしても、P.decumbensに再導入し、その効果を明らかにできる技術も未解決であった。従って、少なくともP. decumbensの（Ｚ）−１−Ｐｒｏｐｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ（以下ｃＰＰＡと略す）をエポキシ化する酵素活性の向上に関し、遺伝子工学技術を用いた例はなかった。また、本発明のｃＰＰＡをホスホマイシン（（−）−（１Ｒ，２Ｓ）−（１，２−ｅｐｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｏｎｉｃ ａｃｉｄ）に変換する（化１）微生物は広く知られていたが、そのエポキシ化酵素やその酵素をコードする遺伝子に関しては、全く知られていなかった。
【化１】
【発明が解決しようとする課題】
ｃＰＰＡのエポキシ化酵素活性はまるごとの菌体では検出が可能であったが、無細胞抽出液では検出できていないことからこの酵素蛋白質の精製は非常に難しく大きな課題であった。また、ホスホマイシンの生合成に関与する酵素数も未解決であり、いく種類の遺伝子を解明すれば活性向上がなされるか明確ではなかった。一方、P. decumbensに遺伝子を導入する方法も解決できておらず、たとえ、目的遺伝子を得たとしてもその効果をP. decumbensに於て評価できる事は約束されてはいなかった。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
P. decumbensに於て、ｃＰＰＡを添加して培養した場合に初めて誘導発現してくる蛋白質を発見した。この蛋白質を精製し、アミノ酸配列を決定し、対応する合成DNAプライマーを用いたリバースジェネティクス法により遺伝子の分離に成功した。更に、DNAの塩基配列を決定し、発現可能な領域を含む断片を決定し、糸状菌に導入するため、ハイグロマイシン耐性遺伝子を選択マーカーとするプラスミドにサブクローンした。
【０００６】
一方、P. decumbensの形質転換系が確立されていなかった為、A. ニデュランスのプロトプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，ｐ１４７０（１９８４））を改良し、P. decumbensに適合する独自のプロトプラスト化条件及び再生条件を設定し、非常に狭い範囲のハイグロマイシン添加条件下でのみ形質転換株が得られる条件確立に至った。この新規条件を用いて、本発明の遺伝子を導入した。
【０００７】
微生物の寄託
本発明によるエポキシ化酵素遺伝子を含むｐＦＯＭ３（実施例５参照）で形質転換された株は大腸菌ＪＭ１０９の受託番号 ＦＥＲＭ Ｐ−１４９４４のもと工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。
【０００８】
【発明の効果】
本発明の遺伝子を用いる事により、P. decumbensのｃＰＰＡのエポキシ化活性を飛躍的に向上させ、あるいは遺伝子の改良により目的とするいかなる条件に於てもエポキシ化可能な状況を設定できる、あるいは遺伝子工学手法を駆使すれば、本発明の遺伝子を用いる事によって、目的とする細胞に於てｃＰＰＡのエポキシ化活性を発現増強させることが可能となる。具体的には、P. decumbensの形質転換株はｃＰＰＡをホスホマイシンに培養変換する能力が飛躍的に向上し親株の持つ能力の約4.3倍に向上するに至った。
【０００９】
【実施例】
実施例1 エポキシ化酵素の精製とアミノ酸配列決定
（１）ｃＰＰＡ添加により誘導発現される、蛋白質の精製
無細胞抽出液の調製の為、P. decumbensの胞子を３０ｍｌのSM-1培地（組成：１リットル当たりグルコース 30g, ニュウトリエント・ブロス 8g，酵母エキス 2g， モルトエキス 3g, pH7.0）で、28℃、48時間培養した。このうち1mlをSM-1培地に植継ぎ、28℃で48時間培養し、ｃＰＰＡを（終濃度：1000μg/ml）添加し、さらに28℃で48時間培養した。菌糸を20mM トリスー塩酸緩衝液(pH7.5) で洗浄後、10mlの同緩衝液に懸濁した。氷冷下、SONIFIER cell Disruptor 350(ブランソン社)を用いて、2 分間の超音波処理を行った。これを7000gで10分間遠心分離し、無細胞抽出液を得た。
【００１０】
無細胞抽出液を、Multiphor II（ファルマシアバイオテク社製）により、二次元電気泳動を行った。一次元目はImmobiline DryStrip(pH4-7)(ファルマシアバイオテク社製)を用いて、泳動し、二次元目はExcelGel SDS gradient8-18(ファルマシアバイオテク社製)を用いて、泳動を行い、目的の蛋白質を精製した。尚、クマシーブレリエントブルーにより蛋白質染色を行い、単一スポットであることを確認した。得られた蛋白質の分子量は３１０００であった。
（２）部分アミノ酸配列決定
N末端アミノ酸配列決定のために、二次元電気泳動で精製した蛋白質を、polyvinylidene difluoride (PVDF) 膜（パーキンエルマー社製、ProBlott)にMultiphor IIを用いて転写した。更に、0.2% ポンソー S（シグマ社）1%酢酸溶液で染色し、プロテイン シーケンサModel 492(パーキンエルマー社)用いて、アミノ酸配列決定を行った。
【００１１】
ペプチドマップ及びぺプチドのアミノ酸配列決定にはPVDF膜に転写された目的蛋白質のスポットを切断した後25mM トリスー塩酸緩衝液（pH8.5 ） 90μlとアセトニトリル10μlを加えて懸濁した。これに、１０ｐｍｏｌのLysyl エンドペプチダーゼ（和光純薬工業 ）加えた後、37℃で16時間インキュベートした。これをμＰｒｅｐａｒａｔｉｖｅ HPLCシステム（Perkin Elmer model 172、カラム：ＲＰ−３００，Ａｑｕａｐｏｒｅ，Ｃ−８，２．１ｍｍｘ２２０ｍｍ)を用いて目的のペプチドを分取した。更に、N末端アミノ酸配列決定と同様にして、部分ペプチドのアミノ酸配列を決定した。その結果、N-末端、ペプチドＮｏ． 3、ペプチドＮｏ． ７、ペプチドＮｏ． １３、及び ペプチドＮｏ．15のアミノ酸配列は以下の様になった。但し、Ｘａａは不明のアミノ酸を表す。
【００１２】
N-末端アミノ酸配列 Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ
ペプタイド Ｎｏ． 3 Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
ペプタイド Ｎｏ． ７ Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ
ペプタイド Ｎｏ． １３ Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ
ペプタイド Ｎｏ． １５ Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｘａａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
【００１３】
実施例2 部分アミノ酸配列に対応する合成オリゴヌクレオチドプライマー作成とPCR法によるロングプライマーの増幅
（１）プライマーの作成
N末端アミノ酸配列及びペプチドのアミノ酸配列の結果より、次に示すPCR反応用合成DNAプライマーのデザインを決定した。
【００１４】
N末端アミノ酸配列ではＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｉｌｅ−Ａｌａ配列に相当する以下の二本のオリゴヌクレオチド（シークエンス N-1とシークエンス N-2）を合成しUpper プライマーとして使用した。
シークエンス N-1(17mer), 5’-AC[T, A]-CCX-GA[G,A]-CA[G,A]-AT[C,T,A]-G-[C]-3'
シークエンス N-2(17mer), 5'-AC[C,G]-CCX-GA[G,A]-CA[G,A] -AT[C,T,A]-G-[C]-3'
ペプタイド Ｎｏ． １５ではＧｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｌａ配列に相当する以下の二本のヌクレオチド （シ−クエンス 15-1と シ−クエンス15-2）を合成しLower プライマーとして使用した。
シ−クエンス 15-1(17mer), 5'-GC[C,T]-TG[G,A]-AAX-CC[G,A]-TT[T,A]-C-[C]-3'
シ−クエンス15-2(17mer), 5'-GC[C,T]-TG[G,A]-AAX-CC[G,A]-TT[C,G]-C-[C]-3',
X:Inosine
【００１５】
染色体DNAの分離は菌体約10gを20mM トリス−塩酸緩衝液（pH7.5）で二回洗浄後、液体窒素で凍結しておき、ホモジナイザー(日本精機社: AM-3)を用いて２分間粉砕した。これを80mlのTESH 緩衝液（０．２Ｍ トリス−塩酸（ｐＨ８．０），２０ｍＭ ＥＤＴＡ，５０ｍＭ ＮａＣｌ）に懸濁後、染色体DNAを調製した。
PCR法によるDNA増幅はｒTaq DNA ポリメラーゼキット(宝酒造社製)によって行った。 増幅条件は熱変成が94℃で１分、アニーリングが50℃で２分、合成反応は72℃で３分で行い、30サイクル反応させた。増幅した約500bpのDNAをアガロース電気泳動後セファグラス・ バンドプレップ・キット（ファルマシアバイオテク社)を用いて切り出し、以下に示すハイブリダイズ用プローブとして供した。
【００１６】
実施例3 コスミド（pCRB8）によるgenomic DNAのクローニング
（１）パッケ−ジング
P. decumbensの染色体DNAをSau3AI（宝酒造製）で、10-20kbpの断片に部分消化した。pCRB8はBamHI（宝酒造製）で消化し、アルカリフォスファターゼ（宝酒造製）により末端脱リン酸化した。部分消化染色体DNA、BamHI消化pCRB8をライゲーション・キット（宝酒造製）を用いて連結した。連結DNAのλ ファージへのパッケイジングはλDNA in vitro パッケイジング・キット（アマーシャム社製）で行い、ファージ液を調製した。
【００１７】
（２）コスミドライブラリーの作成
E. coli JM109を宿主とし、希釈したファージ液を混合し感染させた。大腸菌は50μg/mlのアンピシリン添加プレートで一晩培養し、これをコスミドライブラリーとした。 ライブラリースクリーニングはECL Directのhybridization and detection キット（アマーシャム社製）でおこなった。コスミドライブラリーを、Ｈybond N+ナイロンメンブレン（アマーシャム社製）に転写し、0.5N NaOHで固定し、5XSSCで洗浄した。5% blocking reagent及び0.5M NaClを含むハイブリダイゼーション緩衝液中でプレハイブリダイズの後、標識したプローブを加えた。プローブにはPCR法で増幅したDNAを用いた。ハイブリダイズのシグナルはDetection reagentを加え励起し、HYPERfilm -ECL（アマーシャム社製）に感光させた。
以上のスクリーニングによって得られた陽性クローンは4個であった。そこで、これらの陽性クローンよりコスミドDNAを単離し、ハイブリダイズするDNA断片の解析を行った。
【００１８】
（３）サザンハイブリダイゼーションによる遺伝子座の決定
コスミドDNAをBamHIで消化の後、電気泳動を行い、泳動ゲル中のDNAをキャピラリーブロッティングでＨybond N+ナイロンメンブレンに転写した。メンブレンは前述の方法に基づきPCR法で増幅したDNAをプローブとして一晩ハイブリダイズを行った。この結果、3個のクローンが約6kbpのBamHI断片を有し、これは染色体のハイブリダイズの結果と一致した。
（４）遺伝子のサブクローニング
制限酵素地図作成のため6kbpのBamHI断片（図1）を、コスミドDNAより分離しBamHIで消化したpUC18と連結しpFOM1-14（図1）を作成した。
【００１９】
実施例4 イントロン配列決定及び蛋白質コード領域の決定
（１）ｍＲＮＡの調製
genomic DNAに存在するイントロン配列を明らかにするため、mRNAを調製しcDNAを作成後クローニングした。mRNAはQuickPrep mRNA Purification キット (ファルマシアバイオテク社製）に従い調製した。凍結菌糸の粉砕物の0.5gに抽出緩衝液(グアニジウム・チオシアネート及びＮ−ラウリルザルコシン) と溶出緩衝液(10 mM トリス−塩酸, pH7.4 1mM EDTA)を加え、撹拌後、遠心分離により上澄み液を得た。これをオリゴ(dT)-セルローススピンカラムにチャージし高塩濃度緩衝液(10 mM トリス−塩酸 pH7.4, 1 mM EDTA, 0.5M NaCl)及び低塩濃度緩衝液（10 mM トリス−塩酸 pH7.4, 1 mM EDTA, 0.1 M NaCl)による洗浄後溶出緩衝液により、mRNAを溶出した。
【００２０】
（２）cDNAの調製
TimeSaver cDNA Synthesis キット(ファルマシアバイオテク社製）でcDNAを調製した。 First-Strand Reaction MixesにDTT 溶液と熱変成させたmRNA溶液と更にオリゴ(dT)12-18 プライマー を加え加温した。この溶液を、Second-Strand Reaction Mixesに加え加温したあと常温に戻した。これに、フェノールークロロホルムを加え撹拌した。遠心分離後上層の水溶液部分をスピンカラムに通し、遠心して溶離液を得た。これにEcoRI/NotI Adaptors 溶液 , PEG 緩衝液 , ATP 溶液 , T4-DNA リガーゼを加え16℃で反応後、65℃10分加温した。次に、5'末端の燐酸化を行う為に、ATP 溶液と T4 ポリヌクレオチッド・キナーゼ とを加え撹拌後、37℃ 10分、 65℃、10分加温した。その後室温に戻しフェノ−ル−クロロホルムを加え撹拌後遠心分離により、水層部分を得た。これをスピンカラムに添加し、遠心分離後溶出液を得た。この溶液をエタノール沈殿に供し最終的にDNAを5μlの水に溶解した。
【００２１】
（３）パッケージング
λ ファージへのパッケ−ジングはλgt11 クローニング キット (ストラタジーン社製)を用いた。 ライゲーション反応はDNA溶液にEcoR I digested, phosphatased λgt11アームズ , 10x ligation buffer(500mM トリス−塩酸 pH7.5, 70mM MgCl2, 10mM DTT) , 10mMγ-ATP(pH7.5) , T4 DNA リガーゼ を加え、4℃で終夜行った。パッケージングはGigapack II Packaging Extract(ストラタジーン社製）で行った。
（４）ライブラリーの作成
宿主細胞 にE. coli Y1088を用いた。TB Broth( 5g NaCl, 10g バクトトリプトン, pH7.4)に0.2%マルトース(ミリポアフィルター滅菌), 10mM MgSO4(オートクレーブ滅菌)を添加しておいた培地に植菌し37℃で終夜振盪培養を行った。集菌し、OD600=0.5になるよう、10mM MgSO4で懸濁調製した。この懸濁液に、クロロホルム保存中のファージ液を適切に希釈して添加した。NZYトップアガー (0.7% アガー)と共にNZY アガー(１リットル当たり 5g NaCl, 2g MgSO4・7H2O, 5g 酵母エキス, 10g NZ アミン, pH7.5 , 20g アガー)にまいた後、37℃で終夜培養し、プラーク を形成させた。
【００２２】
（５）プラークハイブリダイゼーションによるライブラリースクリーニング
ライブラリースクリーニングはECL direct nucleic acid labelling and detection systemsキット(アマーシャム社製)を用いて行なわれた。 フィルター（アマーシャム HybondTM-N+)をトップアガー上のプラークにのせ針で目印を付けた後はがし、予め0.4N NaOHで湿らせた濾紙に、プラークが吸着した面を上にしてのせ、5分変成させる。これを、5x SSCで洗浄し、濾紙上で風乾させた。
（６）ラベル化プローブの作成
PCR法で増幅したプローブを電気泳動し、目的のDNAバンドを含む寒天片を切り取った。これをSephaglasTM BandPrep キット(ファルマシア社製)を用いてDNAを抽出した。これをエッペンチューブに取り、100℃ 5分加熱し二本鎖DNAを単鎖化した。氷で冷却後、DNA labelling reagentを加え更にグルタ−ルアルデヒド溶液を加え、37℃ 10分加温した。Hybridization 緩衝液にNaCl 0.5M, blocking agent 5%(w/v)を添加し、良く溶解させた。これに、先のメンブランを浸し42℃ 60分プレハイブリを行った。これに、プローブ溶液を加え、42℃で4時間ハイブリダイセーションを行った。
【００２３】
（７）Washing
フィルターを６Ｍ 尿素入りのPrimary wash buffer(尿素 ６Ｍ，０．４％ＳＤＳ， ０．５ｘＳＳＣ）により、42℃で、20分 洗浄した。この次に、Secondary wash buffer(2x SSC)により、室温 10分の洗浄を二回繰り返した。
（８）Signal detection
濾紙上で水分を切ったフィルターを、等量のDetection solution 1と2を混合したものに浸し、サランラップにはさみ込んだ。これと、HYPERfilm -ECL(アマーシャム社製）とカセットに入れサンドイッチし60分間感光させた後、現像した。
（９）ファージDNAの調製
陽性プラークをピペットで吸い取り、 ファージ希釈緩衝液に加え良く撹拌した。希釈したあと、E. coli Y1088を用いて前項で述べた方法を繰り返しプラークを単一化した。単一化できたプラークを再度100μlの ファージ希釈緩衝液（１リットル当たりＮａＣｌ ５．８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ，５０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５），ゼラチン １０ｇ）にとり撹拌後、E. coli Y1088の菌体懸濁液に加え、37℃、20分加温した。この全量を、NZY brothに植菌し、37℃で培養した。7-8時間後、E. coli Y1088が溶菌した。溶菌液にクロロホルムを添加し10分振盪後、3000rpmで遠心分離後、デブリスを除去した。上澄を30000rpm, 60分の遠心分離（６５Ｐ−７：日立工機社製）にかけ、透き通った硝子状のペレットを得た。これに、ファージ希釈緩衝液を加えて溶かした。プロテナーゼ K（1mg/ml，和光純薬工業製)のファージ希釈緩衝液を400μl添加し、37℃、2時間反応後、フェノール処理、エタノール沈殿後、TE 緩衝液に溶解した。このファージ DNAをEcoRIで切断し、挿入断片を調製した。これを、プラスミド pUC11９のEcoRI部位にトリミングしプラスミド(pFOC2)を作成し、塩基配列決定に供した。
【００２４】
実施例5 遺伝子の塩基配列解析
pFOM1-14をHindIII及びXbaIで消化し、遺伝子の全長を含む2.3kbpの断片を切り出した。これをpUC11９に連結し、大腸菌JM109に形質転換し、陽性なクローンからプラスミドpFOM3（図1）を単離した。塩基配列解析用鋳型DNAにはpFOM3及び前項に示したpFOC2を用いた。塩基配列解析装置は、A.L.F. DNA シークエンサー II（ファルマシアバイオテック社）を用いた。シーケンシングゲルは、同社製のReady mix gel、又はAT Biochem社製のハイドロリンク・ロングレンジャーなるアクリルアミド担体を使用した。ゲル作成用各種試薬（N, N, N', N' -テトラメチルエチレンジアミン, 尿素, 過硫酸アンモン）はいづれもA.L.Fグレードの試薬(ファルマシアバイオテック社製)を用いた。塩基配列解読反応は、Auto Read sequencing キット又はAuto cycle sequencing キット（ファルマシアバイオテック社製）を用いた。
【００２５】
まず、pFOM3を2N NaOHで変成後、エタノールにより沈殿化した。これを鋳型として、M13 Universal、ReverseまたはFITC標識合成プライマーWATF-01−10（WATF-01 (5'-ACCACTCTAA TGGGTACCTC CTC-3'), WATF-02 (5'-ACGAGTCGGT GCTCTTCAGC ACG-3'), WATF-03 (5'-TCAACTATAA ACAGCCCCAC GGC-3'), WATF-04 (5'-GGACGACCCG GAAGTGGTGCTAG-3'), WATF-05 (5'-TGAAGGGAAG GATTATTCGG AAG-3'), WATF-06 (5'-GCTAGCACCACTTCCGGGTC GTC-3'), WATF-07 (5'-GCGCGAAAAG AGTATGACGG CCC-3'), WATF-08 (5'-TCCTTCCCTT CAATCCGTTC TAC-3'), WATF-09 (5'-CCGATGTGGT CGTACGCCGG GGC-3'), WATF-10 (5'-ATCACAGCAG GCCGATTCGC ACG-3')）をアニールさせ、T7、TthまたはTaq ポリメラーゼで伸長反応を行った。合成産物はReady mix gel、又はHydrolink long rengerゲルを用いて泳動し、解析した。その結果、HindIII−XbaI断片2329bpを配列表2の様に決定した。
【００２６】
実施例6 セルフクローニングの為のプラスミド作製(pFOM4)及びP. decumbensの形質転換
（１）プラスミド（ｐＦＯＭ４）の作成
実施例５にしめすpFOM3のXba1部位に、ハイグロマイシン耐性カセットを更に連結し、pFOM4（図２）を作製した。
（２）P. decumbensの形質転換
P. decumbensの胞子保存液をS#1培地（１リットル当たりグリセリン、3０ｇ, ニュウトリエント・ブロス8ｇ, モルト・エキス ３ｇ, 酵母エキス ２ｇ, グルタミン酸ナトリウム １ｇ ）に植え、48時間振盪培養を行った。生育した菌糸を2mlS#1培地に移植し更に24時間培養した。得られた菌糸を35%ソルビトール溶液10mlに懸濁し再度遠心分離に供した。得られた菌糸を終濃度として、アクロモペプチダーゼ（3mg/ml）,Lysing enzyme （3mg/ml）,及びキチナーゼ（1mg/ml）を含む35%ソルビトール溶液に懸濁させた。これをL字管に入れゆっくり振盪しながら34℃で3時間反応させプロトプラストを形成させた。綿濾過により未反応の菌糸を除去した後、遠心分離によりプロトプラストを集め、これを10mlの0.5M サッカロース緩衝液（０．５Ｍサッカロース，10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5， 10mM CaCl2）に懸濁させた。これを遠心分離にかけ、得られたペレットを1mlの0.5M サッカロース緩衝液に懸濁した。このプロトプラスト溶液100μlと10μlのDNA(10μg)溶液に400μlのPEG 緩衝液（60% PEG4000, 10mM トリス−塩酸緩衝液 pH7.5,10mM CaCl2)を加え良く懸濁させた。
【００２７】
更に、0.5M サッカロース緩衝液を10ml加え攪拌後、遠心分離に供した。得られたペレットを35%ソルビトール液 1mlに懸濁した。これを、以下の組成の再生培地｛PDA 3.9% ラフィノース 30%( Hygromycin 25μｇ/ml)｝に塗布した後、軟寒天培地（PDA1.3% ラフィノース 30%）を重層した。26℃で 5日間の培養によりハイグロマイシン耐性を獲得した形質転換株を得た。
【００２８】
実施例7 形質転換株の変換活性解析
P. decumbensの胞子保存液をSM-1培地に植菌し28℃で48時間振盪培養した。このうち1mlをSM-1培地に植継ぎ、28℃で48時間培養し、ｃＰＰＡを終濃度が4000μg/mlとなるように添加し、更に7日間28℃でロータリーシェカーにより培養を続けた。遠心分離により培養上澄液を得、これを東ソ−イオンクロマトグラフィーシステム（東ソ−社製）に供し、ｃＰＰＡが変換されて生じるホスホマイシンを定量した。その結果、P. decumbensの野生株では、生産されたホスホマイシンが800μg/mlであったが、遺伝子組み換え株では、1140-3420μg/mlとその変換活性が約4.3倍に向上していた（表1）。
【００２９】
【表１】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：２７７
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
【配列表】
配列番号：２
配列の長さ：２３２９
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
起源
生物名：Ｐ．ｄｅｃｕｍｂｅｎｓ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｐｅｐｔｉｄｅ
存在位置：１００７−２０２９
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ
存在位置：１２９５−１４２１
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｉｎｔｒｏｎ
存在位置：１８５５−１９１６
特徴を決定した方法：Ｅ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ
存在位置：１−６
他の情報：Ｈｉｎｄ ＩＩＩ
配列の特徴
特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ
存在位置：２３２４−２３２９
他の情報：Ｘｂａ Ｉ
【図面の簡単な説明】
【図１】６．０ｋｂ ＢａｍＨ Ｉ断片の制限酵素地図とｐＦＯＭ３及びｐＦＯＭ１−１４の関係を示した地図
【図２】プラスミドｐＦＯＭ４の制限酵素地図
Claims (7)
- 配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含むエポキシ化活性を 有するタンパク質。
- 配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列の１から２７７番の配列からなるエポキシ化活性を有するタンパク質。
- 請求項１〜２のいずれか一項に記載のアミノ酸配列をコードする、ＤＮＡ配列。
- ＤＮＡ配列が配列表の配列番号２に記載される塩基配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ配列。
- ＤＮＡ配列が配列表の配列番号２の１００７〜２０２９番の塩基配列を含む請求項３に記載のＤＮＡ配列。
- 請求項３〜５いずれか一項に記載のＤＮＡ配列を含んでなる、発現ベクター。
- 請求項６に記載の発現ベクターによって形質転換された微生物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13638495A JP3752267B2 (ja) | 1995-06-02 | 1995-06-02 | エポキシ化酵素遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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1995
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