JP3556690B2 - 糖カルボン酸の製造法及び新規糖カルボン酸 - Google Patents

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規糖カルボン酸又はその塩および新規糖カルボン酸の製造法に関する。詳しくは、１級水酸基（ヒドロキシメチル基）をもつ糖類からシュードグルコノバクター（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ）属の菌又はその処理物を用いて、効率的に対応するカルボン酸を製造する方法、糖類の有するヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された形の新規糖カルボン酸、ヘミアセタール水酸基をもつ糖類の該ヘミアセタール水酸基を有する炭素原子を同じくシュードグルコノバクター属の菌又はその処理物を用いて、カルボキシル基に酸化して対応するカルボン酸を製造する方法及びヘミアセタール水酸基を有する炭素原子がカルボキシル基に酸化された形の新規糖カルボン酸に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒドロキシメチル基のカルボキシル基への酸化を触媒する微生物については、例えばアセトバクター属細菌〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．），第４２巻，２３３１項（１９７８）〕，グルコノバクター属細菌〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．），第４２巻，２０４５項（１９７８）〕あるいはシュードモナス属細菌等のアルコール脱水素酵素〔例えば、バイオケミカル・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ． ），第２２３巻，９２１項（１９８４）〕，メタノール細菌のメタノール脱水素酵素〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第５４巻、３１２３項（１９９０）〕等が知られているが、これらはいずれもその基質特異性が限られておりメタノール、エタノール等のアルコール類以外に作用するという報告はない。
【０００３】
又、Ｄ−ソルビトール、Ｌ−ソルボース（以下、これを単にソルボースと称することがある）等の糖類に作用してそのヒドロキシメチル基のカルボキシル基への酸化を触媒する微生物としてはグルコノバクター属細菌のＤ−ソルビトール脱水素酵素〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、第４６巻、１３５項（１９８２）〕、ソルボース脱水素酵素〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第５５巻、３６３項（１９９１）〕、グルコース脱水素酵素〔アグリカルチュラル・バイオロジカル・ケミストリー（Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）、第４４巻、１５０５項（１９８０）〕等が知られているが、これらは、いずれも、その基質特異性が限られており、汎用性という面からは不十分である。また、既にシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスと名付けた土壌分離細菌がＬ−ソルボースから著量の２−ケト−Ｌ−グロン酸を（特開昭６２−２２８２８８，特開昭６４−８５０８８参照）、又、Ｄ−グルコース等から２−ケト−Ｄ−グルカル酸を（特開昭６２−２２８２８７号参照）生成することを見いだしている。
【０００４】
一方、多糖類のうち、例えばデキストランは乳酸菌に属するロイコノストックメセンテロイド（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）などによって、シュークロースから生成するα１→６結合を主体とする高分子グルカンの総称であり、従来より化学修飾法が種々試みられているが、一般に使用される化学反応では位置選択的に高い反応率で、生成物を得ることが難しく、多数の副反応生成物を与えてしまう。このように、デキストランをはじめとする多くの多糖類は、このような分子量の異なる各種高分子の同族体で構成されるので、化学修飾では、いろいろの副反応が起こり生成物が複雑化し成績体の実体も明確化できない例が多い。〔“バイオトランスフォーメーションズ イン プリパラティブ オーガニック ケミストリー”（Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｈ． Ｇ． Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）参照〕
特に、従来よりデキストランと次亜鉛素酸ナトリウム、亜臭素酸ナトリウム，塩素，臭素，ヨウ素などの酸化剤により化学酸化することが試みられているが、その成績体について構造が必ずしも明確にされていないか、十分な裏付けがなされていない。例えばデキストランの化学酸化については例えばトスニ、コエルホおよびパテルによる日本出願（特許公開 昭６１−２３３００１）等に記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
上記のごとく、従来、微生物を用いた、ヒドロキシメチル基をもつ糖類などの化合物のカルボン酸への酸化は、その基質特異性から単糖類など、ごく限られたものであった。又、糖類とりわけ少糖類や多糖類のヘミアセタール水酸基部分やヒドロキシメチル基の化学酸化は上述の如く副反応が多く精製工程の煩雑化が避けられないことからより選択性の高い効率的酸化反応の技術が求められていた。かくして、本発明の目的は産業的、工業的に有用な物質を製造するため広い基質特異性を有する微生物を用いて、高収率、高選択的にヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子を酸化することによる糖カルボン酸の製造法を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記目的を達成すべく、各種微生物について鋭意研究を重ねた結果、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスが、ヒドロキシメチル基（−ＣＨ_２ＯＨ）及び／又はヘミアセタールＯＨをもつ炭素原子をもつ幅広い糖ならびにその誘導体のこれらの基を特異的に酸化し容易に高収率、高選択的に糖カルボン酸に酸化することを見い出した。また、これらの菌は驚くべきことに、極めて基質特異性が広く、かつ、極めて汎用性のある菌であることを見い出し、さらに検討を重ねて本発明を完成した。
すなわち本発明は、
１） ヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基を有する単糖類誘導体，少糖類又はその誘導体，多糖類又はその誘導体に、該ヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子をカルボキシル基に酸化する能力を有するシュードグルコノバクター属に属する微生物又はその処理物を作用させ、対応するカルボン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする糖カルボン酸又はその塩の製造法、及び
２）糖類及びその誘導体の有するヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された新規糖カルボン酸類に関する。
【０００７】
本発明で使用できるシュードグルコノバクター属に属する微生物としては、糖類のヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子をカルボキシル基に酸化する能力を有するシュードグルコノバクター属に属する微生物であればいずれでもよく、通常の変異誘発操作、例えばニトロソグアニジン等の変異剤処理、紫外線照射処理等あるいは、遺伝子組換え等により得られる変異株も含まれる。とりわけシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスの菌が好ましい。より具体的には、例えば、ヨーロッパ特許公開第２２１，７０７号に記載されている下記の菌株が代表例として挙げられる。
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株：ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４。
【０００８】
本発明の方法においては、シュードグルコノバクター属の微生物の菌体自体を作用させてもよく、あるいはその処理物を用いてもよい。処理物としては例えばこれらの微生物の培養液を用いることができる。更にこれらの微生物が産生する酵素を用いてもよい。但し、本発明のシュードグルコノバクター属の微生物の場合、通常酵素は菌体内に蓄積される。通常、菌体自身を用い、これを原料糖類に接触・作用させカルボン酸を生成せしめるのが好都合である。とりわけ、休止菌体を用いるのが好ましい。菌体またはその培養液は例えば、特開昭６４−８５０８８に記載の方法に従って製造することができる。
すなわち、スラントからシード培養を行い、ついで本培養を行い、醗酵ブロースを得るとともに、必要に応じて、この醗酵ブロースを遠心分離し、沈澱物を集め、ついで、食塩水溶液で数回洗浄し、得られた沈澱を菌体反応に供することができる。また該微生物は好気的条件下で、該菌株が利用しうる栄養源、すなわち炭素源（グルコース，蔗糖，スターチ等の炭水化物またはペプトン，イーストエキス等の有機物），窒素源（アンモニウム塩類，尿素やコーンスティープリカー，ペプトン等の無機、有機の窒素化合物），無機塩類（カリウム，ナトリウム，カルシウム，マグネシウム，鉄，マンガン，コバルト，銅リン酸，チオ硫酸等の塩類），および微量栄養素としてＣｏＡ，パントテン酸，ビオチン，チアミン，リボフラビン，ＦＭＮ（フラビンモノヌクレオシド）等のビタミン・補酵素類またはＬ−システイン，Ｌ−グルタミン酸等のアミノ酸またはそれらを含む天然物を含む液体培地で培養することができ、このようにして得られる培養液を本発明方法に用いてもよい。培養はｐＨ４〜９、好ましくはｐＨ６〜８で行うことが出来る。
【０００９】
培養時間は使用する微生物および培地の組成等によって種々異なるが、好ましくは、１０〜１００時間である。培養を行うのに好適な温度範囲は、１０〜４０℃，好ましくは、２５〜３５℃である。培養に際し、培地に希土類元素を添加することにより、より効率的に目的物を生成せしめることができる。培地に添加される希土類元素としては、スカンジュウム（Ｓｃ），イットリウム（Ｙ），ランタン（Ｌａ），セリウム（Ｃｅ），プラセオジウム（Ｐｒ），ネオジウム（Ｎｄ），サマリウム（Ｓｍ），ユウロピウム（Ｅｕ），ガドリニウム（Ｇｄ），テルビウム（Ｔｂ），ジスプロシウム（Ｄｙ），ホルミニウム（Ｈｏ），エルビウム（Ｅｒ），ツリウム（Ｔｍ），イッテルビウム（Ｙｂ）およびルテチウム（Ｌｕ）などが挙げられる。これらの希土類元素は金属末または金属片として添加してもよいし、塩化物，炭酸塩，硫酸塩，硝酸塩，酸化物あるいはシュウ酸塩のような化合物としても用いられる。それらは単独で用いてもよいし、二種類以上の希土類元素例えば、炭酸セリウムと塩化ランタンとを同時に使用することもできる。さらには諸元素の分離精製過程で得られる粗製物等も用いることができる。培地に添加される希土類元素の量は、用いる微生物の生育を抑制しない範囲で選択すればよく、通常０．０００００１〜０．１％（Ｗ／Ｖ），好ましくは０．０００１〜０．０５％（Ｗ／Ｖ）の範囲が効果的である。培地への添加法としては、予め培地に添加しておくのもよいが、培養途中に間欠的に添加しても、または連続的に添加してもよい。
【００１０】
本発明を実施するにあたり、反応に供する糖類を水または、水と混和できる溶媒、例えば、メタノール，アセトン，ポリエチレングリコールなどに溶解又は懸濁したものを用いて微生物と接触してもよい。使用する溶媒量は反応を遅延させない範囲で選択すればよく、基質濃度として、通常０．１〜２０％（Ｗ／Ｖ），好ましくは、１〜５％の範囲が効果的である。本発明の微生物による酸化反応を行うのに好適な温度範囲は、１０〜４０℃，好ましくは２５〜３５℃である。また反応は好気的条件下で行うのが好ましく、例えば、空気を０．１〜５リットル／分で通気しながら、必要に応じて、５０〜２０００回転で撹拌することもできる。反応時間は、反応に供する糖類に置換する１級水酸基及び／又はヘミアセタール水酸基の性質により異るが、５分〜３日間，通常、１時間〜２４時間である。この反応はｐＨを調整するのが好ましい。通常ｐＨ４〜９，好ましくはｐＨ６〜８の範囲で行うのが効果的である。ｐＨ調整に用いる塩基は、反応を阻害しないものなら、使うことができる。例えば、水酸ナトリウム，水酸化カリウム，炭酸カルシウム，水酸化マグネシウム，水酸化第１鉄などの無機塩，モルホリノエタンスルホン酸ナトリウム，モルホリノエタンスルホン酸カルシウムなどの有機塩なども使用することができる。また、所望により陰イオン交換樹脂を添加することにより、ｐＨを調整するための上記した、アルカリ金属塩などの中和剤を加える必要がなく、かつ反応を選択的に制御することができる。とりわけ選択的に反応させ１当量酸化体を得る場合に、この陰イオン交換樹脂を添加する方法は好適である。こゝで使用する陰イオン交換樹脂としては、生成したカルボン酸を吸着するものなら、陰イオン交換樹脂はいずれでもよい。とりわけスチレン系及びアクリル系陰イオン交換樹脂が好ましい。具体的には、例えばアンバーライト（商品名，オルガノ社）ＩＲＡ−４００，ＩＲＡ−４０１，ＩＲＡ−４０２，ＩＲＡ−４１０，ＩＲＡ−９００，ＩＲＡ−９１０，ＩＲＡ−３５，ＩＲＡ−６８，ＩＲＡ−９４Ｓなど、ダイヤイオン（商品名，三菱化成）ＳＡ−１０Ａ，ＳＡ−２０Ａ，ＰＡ−３０６，ＰＡ−３０８，ＰＡ−４０６，ＷＡ−１０，ＷＡ−１１，ＷＡ−２０，ＷＡ−３０などが挙げられる。
これら陰イオン交換樹脂は基質として加えた糖類（ヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基を有する単糖類誘導体、少糖類又はその誘導体、多糖類又はその誘導体）が、反応液中に消失したところで、撹拌を停止し、反応液と陰イオン交換樹脂を分離し、陰イオン交換樹脂を適当な溶離剤を加え、溶出し、目的物を得るものである。溶離剤として、食塩，アルカリ金属塩などの水溶液、あるいは、塩酸，硫酸，リン酸，クエン酸などの酸性水溶液などが挙げられる。このようにして溶離、蓄積された糖カルボン酸は公知の手段又はそれに準じる方法により採取、精製することができる。
【００１１】
本発明の方法により、１級水酸基（ヒドロキシメチル基）が特異的に酸化され、対応する糖カルボン酸を与える糖類として、Ｄ−グルコース，Ｄ−フラクトール，Ｄ−ガラクトース，Ｄ−リボース，Ｄ−マンノース，Ｌ−ソルボースなどの単糖類の誘導体〔例、Ｄ−グルコサミン，Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン，Ｎ−アセチル−キトビオース，トリ−Ｎ−アセチル−キトトリオース等のアミノ糖類，グルコシール−Ｌ−アスコルビン酸，Ｌ−アスコルビン酸などのアスコルビン酸関連化合物，イノシン，アデノシン，ウリジン，グアノシン，シチジン，チミジン，２−デオキシイノシン，２−デオキシアデノシン，２−デオキシウリジン，２−デオキシグアノシン，２−デオキシシチジン，２−デオキシチミジンなどの核酸関連化合物などならびにストレプトゾトシン（ストレプトゾシン）〕，シュークロース，ラクトース，パラチノース，ラフィノース，ラクトシュークロース，グルコシルシュークロース，ガラクトシルシュークロース，キシロビオースなどの少糖類、マルトトリオース，マルトテトラオース，イソマルトトリオース，パノース，マルチトールなどのデンプン系糖類、バリダマイシンＡなどのアミノ糖類，セロビオース，セロトリオース，セロヘキサオースなどのセロオリゴ糖類、ステビオシド，レバウディオシド−Ａ，レバウディオシド−Ｃ，レバウディオシド−Ｄ，レバウディオシド−Ｅ，ズルコシド−Ａ，ルブソシド〔下記式（ＩＩ）においてＲ_１＝β−Ｇｌｃ， Ｒ_２＝−β−Ｇｌｃ の化合物〕などのステビオール配糖体，モグロシド等の少糖類又はその誘導体及びシクロデキストリン，可溶性デンプン，デキストリン，デキストラン，β−１，３−グルカン等多糖類又はその誘導体が挙げられる。
尚、少糖類及び多糖類の誘導体としては、下記する本発明方法により少糖類、多糖類のヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸も含まれる。
【００１２】
本発明の方法により、ヘミアセタール水酸基部位が特異的に酸化されて糖カルボン酸を与える糖類としてデキストラン，セルロース，キチン，アミロース，アミロペクチン，マルトトリオース，パノース，イソマルトース，セロビオース，ラクトース，マルトース等が挙げられる。尚、少糖類及び多糖類の誘導体としては、例えばデキストラニルグルクロン酸のような上記した本発明方法により少糖類、多糖類の１級水酸基のヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸も含まれる。
これらの糖類から得られる糖カルボン酸のうち、
例えばパラチノースの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
シュークロースの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
Ｄ−トレハロースの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
マルトシル−β−シクロデキストリンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
ストレプトゾトシンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
ヘプチュロースのヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
式（Ｉ）
【化４】

で表わされるマルトデキストリンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
式（ＩＩ）
【００１３】
【化５】

で表わされるステビオール配糖体の有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
式（ＩＩＩ）
【化６】

で表わされるバリダマイシンＡの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸、
モグロシドの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸並びにそれらの塩、
デキストランの有するヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された式（ＶＩＩＩ）
【化７】

（但し、式中、ｎ＝１〜５０，好ましくは１０〜１５）で表わされる糖カルボン酸〔すなわち、デキストラニルグルクロン酸（グルクロニルデキストリン、デキストラン−グルクロン酸とも称される）〕、その塩、又はそれらと金属塩との錯体あるいは複合体（以下単に複合体と称する）及び
デキストラニルグルクロン酸（デキストラン−グルクロン酸と称されることもある）が有するヘミアセタール水酸基を有する炭素原子がカルボキシル基に酸化された式（ＩＸ）
【化８】

（式中、ｎ＝１〜５０，好ましくは１０〜１５）で表わされる糖カルボン酸（すなわち、グルクロニルデキストラニルグルコン酸）、その塩又はそれらと金属塩との複合体等は産業上有用な新規化合物である。
【００１４】
上記の出発物質の糖類を、上記したシュードグルコノバクター属に属する菌体もしくはその処理物と接触させることにより酸化反応を行う際、該糖類は、１級水酸基やヘミアセタール水酸基の数やその性質を反映して、位置選択的、かつ段階的に酸化され、対応する糖カルボン酸を特異的に与えることも、このシュードグルコノバクター属に属する菌体あるいは処理物による酸化反応の特徴である。
目的物の分離が容易な場合等には、上記したシュードグルコノバクター属の微生物を、上記糖類含有培地中で培養してもよい。この場合の培養条件としては上記培養液を得る方法と同様な条件で行うことができる。
このようにして生成蓄積された糖カルボン酸は公知の手段又はそれに準じる方法により採取、精製することができる。例えば濾過、遠心分離、活性炭や吸着体処理、溶媒抽出、クロマトグラフィー、沈澱、塩析等の手段を単独で又は適宜組み合わせて適用して、目的物を単離、生成することができる。
上述のように、陰イオン交換樹脂の存在下で酸化を行なう場合、反応液と陰イオン交換樹脂を静地する方法，遠心分離法等により分離し、陰イオン交換樹脂を、溶離剤を用いて溶出処理し、目的物を含む溶出画分を集め、これを上記公知の手段又はそれに準じる方法に付し、目的とする糖カルボン酸を単離、精製する。
【００１５】
デキストランカルボン酸と鉄塩との複合体は通常、デキストランと鉄塩との複合体を製造する公知方法又はそれに準じて製造することができる。例えば、デキストランカルボン酸と水酸化第二鉄等鉄塩のゾルとを反応させることにより製造することもできる。より好ましくは透析により、脱塩、精製した水酸化鉄ゾルにデキストランカルボン酸を加えついでｐＨ８．０〜１０で、加温された温度条件たとえば１００℃〜１２０℃におけるオートクレーブなどで、３０分間加熱処理することにより、コロイド溶液または懸濁液が得られる。
この方法により、鉄は塩形成、キレート形成水和化などのプロセスなどにより、デキストランカルボン酸誘導体鉄塩複合体が形成される。後述するように、この水相中コロイド懸濁鉄塩複合体の元素鉄含有量は溶液状態の約５０〜２５０ｍｇ／ｍｌであり、所望により蒸発、濃縮などの操作により、低鉄分含有品から高鉄分含有鉄塩複合体を調製することもできる。このようにして得られた、高鉄分含有鉄塩複合体はそれ自体長期間極めて安定であり、特に水相中でそのコロイド状態が安定に保持される特性を有している。
このようにして得られたデキストランカルボン酸と水酸化第２鉄等の鉄塩との複合体は、注射用蒸留水、生理食塩水等で希釈して注射剤として非経口的に動物に投与してもよく、又、公知の製剤学的製造法に準じ、所望により製剤学的に許容される希釈剤、賦型剤を用い、錠剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、乳剤、液剤、プレミックス剤、シロップ剤等として経口的に投与することができる。又、一剤とした後直接又は担体に分散させたものと飼料、飲水等に混ぜて用いることができる。さらにそれぞれの物質を別途所望により製剤原料に許容される希釈剤、賦型剤等を用い、製剤化し用時希釈剤等を用いて一剤とした後、飼料、飲水等の中に混ぜて投与することもできる。さらに上記したようにそれぞれ別途製剤化したものを、別個に同時にまたは時間差をおいて、同一対象に対して同一経路または異なった経路で投与することもできる。
本発明の方法によりカルボン酸を遊離体で得ても、塩で得てもよく、塩で得られた場合は、慣用方法により遊離体に、又、塩で得られた場合は遊離体に変換できることはいうまでもない。又培地に鉄、リチウム、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム、カルシウム等のアルカリ土類金属を存在せしめることにより糖カルボン酸を生成蓄積しながらその塩を生成することもできる。更に、得られた生成物は、元素分析、融点、比旋光度、赤外線吸収スペクトル、ＮＭＲスペクトル、クロマトグラフィー等の慣用手段により同定できる。
【００１６】
このようにして得られた本発明の糖カルボン酸には、種々の用途、特性が認められる。例えば前記ステビオール配糖体としては例えば次のような化合物があげられ、これらを酸化して得られるグルクロン酸型ステビオール配糖体誘導体はいずれも新規物質である。
【表１】

これらを含む各種ステビオール配糖体の糖カルボン酸誘導体は、甘味質が改善され強甘味とさわやかな味質が認められた。低カロリー性、抗う蝕性、酵素に安定な高甘味食品素材として菓子類、清涼飲料水、漬物、冷菓等に従来の甘味料に準じて用いることができる。さらに易溶解性、低毒性、崩壊性、分解性等の点でもすぐれているので、味の改善が可能で矯味剤として用いることができる。例えば、錠剤、散剤等の製剤に、常法に従い添加、配合して用いることができる。またβ−マルトシル−β−シクロデキストリンの糖カルボン酸誘導体は、シクロデキストリン類での初めてのカルボン酸誘導体で、水に対する溶解性が、著しく改善された（溶解度＞２００ｇ／１００ｍｌ、水、２５℃）。従って、例えば、プロスタグランジン，ステロイド，バルビトール酸等の難溶性医薬品を本発明のシクロデキストリンの糖カルボン酸類で包接化することにより水溶性が向上し、注射剤として適用できる。このように糖カルボン酸類を包接剤として用いる場合、従来知られている包接剤と同様な方法で用いることができる。また、シュークロースを反応させて得られるβ−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸や、α−Ｄ−グルクロニル−（１→２）−β−Ｄ−６−フラクチュロン酸は、甘味のない新たな砂糖誘導体で、かつ、グルコシダーゼ，ペクチナーゼ，グルクロニダーゼ，インベルターゼにより分解されないことが判明した。シュークロースより酵素分解しにくい糖誘導体である。従って、難消化性，低カロリー性砂糖誘導体として菓子、ケーキ、冷菓等の食品素材として有用である。またそのカルシウム塩，マグネシウム塩，鉄塩はそれら金属イオンの吸収改善剤として有用である。従って、ビスケット等の菓子類、清涼飲料水等に添加し、骨粗しょう症予防の飲食品を得るのに用いることができる。
【００１７】
また、パラチノースを反応させて得られる β−Ｄ−フラクトシル−（６→１）−α−Ｄ−グルクロン酸，α−Ｄ−グルクロニル−（６→１）−α−Ｄ−フラクチュロン酸は、難消化性，低カロリー性の抗う触剤として用いられる。従って、チューイングガム等の菓子類をはじめとする各種食品に通常の甘味料、調味料と同様にして用いることができる。さらに、Ｄ−トレハロースを反応させて得られる α−Ｄ−グルクロニル−（１→１）−α−Ｄ−グルクロン酸は、難消化性保湿剤，抗体製剤の安定化剤として有用である。またＤ−グルコサミンを反応して得られる β−アミノ−２−デオキシ−Ｄ−グルクロン酸は保湿性のすぐれた化粧品の基材として有用である。
一方、イノシンなどのヌクレオシドを反応して得られる核酸誘導体のうち、特に、５′−カルボキシ−イノシン，５′−カルボキシ−アデノシンは、すぐれた呈味性を有し、かつ、酵素的に安定な呈味剤として有用であり、食品・調味料の成分として、とりわけ保存食品の調味に利用できる。
また２，７−アンヒドロ−β−Ｄ−アルトロ−ヘプチューロースを反応させて得られる １−カルボキシ−２，７−アンヒドロ−β−Ｄ−アルトロ−ヘプチュロースは、弱い甘味を有する鉄、カルシウム，マグネシウムの溶解補助剤としてビスケット等の菓子類、清涼飲料水等に用いることができる。ストレプトゾトシンの糖カルボン酸は、酵素に対して安定な抗菌剤，抗ガン剤として用いられる。又その抗菌作用を利用して、そのまま又は水等溶媒で希釈して病室や、手足の消毒・殺菌に用いることができる。モグロシドの糖カルボン酸誘導体は高甘味剤として有用であり、清涼飲料水、菓子等に利用できる。
【００１８】
マルトデキストリンを酸化して得られる糖カルボン酸は、難消化性、低カロリー食品素材として、菓子、ケーキ、冷菓等に常法により添加、配合して用いられる。
また、デキストランのヒドロキシメチル基をカルボキシル基に酸化して得られるデキストラニルグルクロン酸は、それ自体デキストランと同様なあるいはより安定でより機能的医薬品添加剤として有用であるばかりでなく、水酸化第２鉄ゾルの安定化剤として、優れた特性を発揮する。又、デキストラニルグルコン酸の有するヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化されるかあるいはデキストラニルグルクロン酸の有するヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子がカルボキシル基に酸化されたグルクロニルデキストラニルグルコン酸またはその塩は医薬用製剤素材として有用であり、又食品の粘性保持剤等として、デキストランと同様な使い方で使用できる。又、デキストラニルグルクロン酸及びグルクロニルデキストラニルグルコン酸又はこれらの塩と金属塩との複合体を作る金属塩としては例えば、第１価、第２価又は第３価の金属の塩が含まれ、例えば、カルシウム，マグネシウム，鉄，ナトリウム，リチウム，カリウム等の金属との塩が挙げられる。特に水酸化第二鉄等の鉄化合物との複合体は鉄の補給剤として動物の鉄欠乏性貧血に対し、抗貧血剤としてデキストランと鉄との複合剤と同様な方法で用いることができる。
またバリダマイシンＡは前記式（ＩＩＩ）で表わされる化合物でイネ紋枯病などに対する殺菌活性を有する化合物で本菌体反応による酸化体も、菌のグルコシダーゼに対して抵抗性を有し、作用持続型バリダマイシン誘導体が期待され、改善された持続性を有する農業用殺菌剤として有用である。アスコルビン酸誘導体の糖カルボン酸誘導体も酵素分解に対し安定性が改善されるので、酵素に対して安定な酸化防止剤として用いられる。酸化防止剤としては、アスコルビン酸と同様な方法で鉄食品等に添加、配合して用いることができる。
このように、種々の糖のヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基を有する炭素原子を酸化して得られる本発明の糖カルボン酸は、それぞれ原料の糖が有しない特性が付与され従来になかった有用性を有する。
【００１９】
本発明で得られるヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸誘導体は、一般に、基質であるヒドロキシメチル体と比較し、酵素的に安定でかつ、水に対する溶解性が向上し、かつ、所望により、金属塩にすることができ、食品用途などでは、難消化，カロリーになりにくい、などのダィエット食の素材、金属の吸収改善効果などが期待される。また、ステビオール配糖体（ステビオシド，レバウオシド，ルブソシド等）のカルボン酸は、驚くべきことに、ステビオシドやルブソシドが示す、にがみや後味の悪さがなくなり、清涼感のある甘味質で、砂糖の１００〜２５０倍の甘味を示し、実質的なカロリーのない、甘味剤として有用である。
また本発明のヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化されたシクロデキストリン誘導体のカルボン酸は、易溶解性，低毒性，崩壊性，分解性などの点ですぐれた特長を有するので、油溶性薬物，脂肪酸，塩基性薬物等の包摂化が可能である。このような包摂化によって活性成分の可溶化、安定化，味の改善が達成できるので矯味、矯臭剤として用いられる。また酵素分解性の特性を利用した製剤基剤としても有用である。より具体的には、例えば錠剤，カプセル剤，丸剤，散剤，顆粒剤，軟膏剤，注射剤，シロップ剤，懸濁剤，点鼻剤などの製剤用のより機能的な基剤としての利用が挙げられる。
このように本発明は、巾広い糖類のヒドロキシメチル基のカルボキシル基への酸化反応を可能にし、種々の新規糖カルボン酸を提供するものである。
又、本発明で得られるヘミアセタール水酸基がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸は基質であるヘミアセタール水酸基をもつ糖類と比較し、酵素的に安定で、かつ水に対する溶解性が向上し、かつ、所望により、金属塩にすることができ、食品用途では難消化、カロリーになりにくいなどのダイエット食の素材、金属の吸収改善効果などが期待される。また医薬品製剤用途では、活性成分の安定化、酵素分解性の特性を利用した腸溶剤などとして有用である。
【００２０】
【発明の効果】
本発明は巾広い糖類からヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子がカルボキシル基に特異的に酸化された糖カルボン酸が、高選択的に高収率で製造できる。得られたカルボン酸は、酵素に対する安定性がすぐれ、水に対する溶解性が向上する等のすぐれた特性を有する。
【００２１】
【実施例】
次に、実施例により、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１ β−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸ナトリウム塩の製造
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）ＴＨ１４−８６菌液の調製；
シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）ＴＨ１４−８６株スラントを２０ｍｌの下記培地に対して１白金耳加え、これを２００ｍｌのスムースフラスコで３０℃，１日間，回転振盪機を用いて、撹拌下培養する。ついで、２０ｍｌの培地当り前記培養液１ｍｌをとり、これを３０℃，２日間，振盪培養を行い、種培養とした。一方、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ ＩＦＯ １２１０８株のスラントを２０ｍｌの培地（下記）当り、１白耳，２００ｍｌのスムースフラスコに加え、３０℃，２日間振盪培養を行う。
次に、以下の本培養を行った。上記ＴＨ１４−８６株の種培養（Ｓｅｅｄ 培地）１００ｍｌおよび、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ のＳｅｅｄ 培地１．５ｍｌを９００ｍｌの下記本培養培地に加えついで、３０℃，約２０時間振盪培養し、Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ ＴＨ１４−８６の菌液とした。
菌体反応；
バイオット社製５リットル ジャーファーメンターに、シュークロース３０ｇを滅菌水２００ｍｌにとかした溶液を加え、これに前記のように調製した菌液１リットルを加え、ついで滅菌水８００ｍｌを加え、全量を２リットルとした。３２℃，８００回転（ｒｐｍ）で撹拌しながら、空気を１リットル／分で通気し、１０％ＮａＯＨ溶液でｐＨ＝６．３になるように、反応の進行にともない、自動的に滴加した。２時間で、モノカルボン酸に変換した。
【００２２】
分離，精製；
上記反応液２リットルを８０００回転で冷却遠心器で分離し、菌体を除き、上澄液を活性炭（特製しらさぎクロマト炭，４００ｇ）カラムクロマトに付し、水で洗浄（１．２リットル）後、さらに水３リットルで溶出し、目的物の画分を集め、減圧濃縮し、β−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸ナトリウム塩１９．７０ｇの白色粉末を得た。
Ｎａ−塩；ｉｎ Ｄ_２Ｏ（９０ＭＨｚ）δｐｐｍ ６１．３９， ６２．８４， ７１．４８， ７２．４２， ７３．０９， ７３．６５， ７４．６５， ７６．８８， ８２．０１， ９２．７０， １０４．１８， １７６．４９．β−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸のマグネシウム塩の製造
β−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸のナトリウム塩１．８９ｇを水１０ｍｌにとかし、ついで、１Ｒ−１２０（Ｈ^＋型）ｃｏｌｕｍｎ（５０ｍｌ）に通導し、通過液に酸化マグネシウム０．１０３ｇを加え、１０分間撹拌した。ついでミリポアフィルター（Ｔｙｐｅ ＧＳ ０．２２μｍ）で濾過し、濾液を濃縮し、得られた粘稠なシロップをエタノール・アセトンで白色粉末のβ−Ｄ−フラクトシル−（２→１）−α−Ｄ−グルクロン酸のマグネシウム塩１．４５ｇを得た。
元素分析 Ｃ_２４Ｈ_３８Ｏ_２４Ｍｇ・６Ｈ_２Ｏ
計算値 Ｃ，３４．２０； Ｈ，５．９８
実測値 Ｃ，３４．３３； Ｈ，５．８２
【００２３】
培地組成
〔ＴＨ１４−８６株用〕
Ｓｅｅｄ 培地（１回目、２回目共通）
ラクトース １％
酵母エキス（プロディベル） １
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．３
コーン・スティープ・リカー ３
ＣａＣＯ_３（スーパー） ２
ＣａＣＯ_３ 投入前
ｐＨ＝７．０
バチリス メガトリウム株用
〔Ｓｅｅｄ 培地〕
シュークロース ４％
プロフロ［Ｎ源，トレイダス・プロテイン（Ｔ＆Ｐ）社］ ４
Ｋ_２ＨＰＯ_４ ０．６５
ＫＨ_２ＰＯ_４ ０．５５
ＮａＣｌ ０．０５
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．０５
ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．００５
パントテン酸カルシウム ０．０２５
滅菌前 ｐＨ＝７．０
〔Ｍａｉｎ 培地〕
シュークロース ０．０５％ 別滅菌
コーン・スティープ・リカー ２ 別滅菌
（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４ ０．３ 別滅菌
ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ ０．１ 別滅菌
Ｖ． Ｂ_２ １ｍｇ／Ｌ
滅菌前 ｐＨ＝７．０
ソルボース １０％ 別滅菌
ＬａＣｌ_３ ０．０１％ 別滅菌
ＣａＣＯ_３（スーパー） ４％ 別滅菌
【００２４】
実施例２ α−Ｄ−グルクロニル−（１→２）−β−Ｄ−６−フラクチュロン酸の製造
実施例１と同様な方法でα−Ｄ−グルクロニル−（１→２）−β−Ｄ−フラクチュロン酸のナトリウム塩，マグネシウム塩，カルシウム塩を得た。
ナトリウム塩；白色粉末
^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）ｐｐｍ：６１．９８， ７１．９６， ７３．０２， ７３．３５；７３．６９， ７６．３７， ７７． ０３， ７９．８２， ９３．９７， １０５．８０， １７５．０３， １７５．７０．
マグネシウム塩；白色粉末
元素分析 Ｃ_１２Ｈ_１６Ｏ_１３Ｍｇ・５Ｈ_２Ｏ
計算値 Ｃ，２９．８６； Ｈ，５．４３
実測値 Ｃ，２９．７６； Ｈ，５．５１
カルシウム塩；白色粉末
元素分析 Ｃ_１２Ｈ_１６Ｏ_１３Ｃａ・３Ｈ_２Ｏ
計算値 Ｃ，３１．１７； Ｈ，４．８０
実測値 Ｃ，３１．２６； Ｈ，４．９９
【００２５】
実施例３
実施例１に記載したシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）菌液１リットルにパラチノース３０ｇ，滅菌水１リットルを加え、３２℃，８００回転で、空気を１．６リットル／分で通気しながら、１時間反応させ、ついでこの反応液を８０００回転で冷却遠心器で分離し、菌体を除き、上澄液を活性炭（特製しらさぎクロマト炭 ４００ｇ）カラムクロマトに付し、水で洗浄（２リットル）ついで、１０％メタノール水溶液（４リットル）で溶出、さらに５０％メタノール水溶液（４リットル）で溶出される画分を集め、濃縮し、凍結乾燥し、β−Ｄ−フラクトシル−（６→１）−α−Ｄ−グルクロン酸のナトリウム塩３５．８ｇを得た。
このナトリウム塩をＩＲ１２０（Ｈ型）カラムに通導し、通過液を濃縮してβ−Ｄ−フラクトシル−（６→１）−α−Ｄ−グルクロン酸を得た。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）ｐｐｍ：６３．３５， ６８．６０， ７１．７８， ７２．５２， ７２．７７， ７３．４５， ７５．１４，７５．９９， ７９．５３， ９８．８１， １０２．２１， １７６．９３．
元素分析 Ｃ_１２Ｈ_２０Ｏ_１２・４．５Ｈ_２Ｏ
計算値 Ｃ，３２．９６； Ｈ，６．６８
実測値 Ｃ，３３．１７； Ｈ，５．８４
【００２６】
実施例４
実施例３と同様な方法で、以下の出発原料〔（ ）内に記載〕を用いて、対応する糖カルボン酸を得た。
【００２７】
【表２】

【００２８】
【表３】

【００２９】
【表４】

【００３０】
【表５】

【００３１】
【表６】

【００３２】
実施例５
実施例１に記載したシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）菌液１リットルに、ステビア抽出物（ステビオシドを主成分とするステビオール配糖体）３０ｇをバイオット社製５リットルのジャーファーメンターに入れ、ついで滅菌水１リットルを加えて反応液とした。これを３２℃，８００回転で撹拌しながら、空気を１．６リットル／分で通気し、１０％ ＮａＯＨ溶液でｐＨ＝６．３になるように、反応の進行にともない、自動的に滴加した。１．５時間で、基質の消失が認められたので、反応を止め、ついで、反応液２リットルを８０００回転で冷却遠心器で分離し、菌体を除き、上澄液をＨＰ−２０（芳香族系合成吸着剤、三菱化成）カラム（１． ８リットル）に通導し、Ｈ_２Ｏ（８リットル）で洗浄後、５０％ＥｔＯＨ（５リットル）で溶出される画分より、グルクロン酸型ステビオール配糖体混合物が得られた。濃縮後、凍結乾燥により、白色粉末１９．２８ｇを得た。本品は強い甘味とさわやかな味質が認められた。
【００３３】
本品を下記条件でＨＰＬＣに付した。

本品の^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）ｐｐｍ：１７７．８７（ｅｓｔｅｒ）， １７１．８４（ＣＯＯ⁻）に、カルボニル炭素のシグナルが認められ、カルボキシ基に基づく、炭素の新生を認めた。ＨＰＬＣの知見から、本品は、ステビオシドのＣ_１９位に結合するグルコースと、Ｃ_１３位に結合するグルコースがグルクロン酸型に変換した化合物を主成分とすることが判った。
【００３４】
実施例６
実施例５と同様の方法で、ステビア抽出物（ステビオシドを主成分とするステビオール配糖体）３０ｇに、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌液１リットル、３２℃，８００回転、空気を１．６リットル／分で通気する条件で、酸化反応させ、５％ＮａＯＨ溶液５９ｍｌ（約２当量の酸化に相当）を滴下によって加えたところで、反応を停止した。所要酸化反応時間は２１時間であった。反応終了後、反応液を遠心濾過し、菌体を除去したあと、上清液（１８５０ｍｌ）を精製（実施例５と同様の方法）し、白色粉末のグルクロン酸型ステビオール配糖体混合物のＮａ 塩１３．０ｇを得た。本品は強い甘味とさわやかな味質が認められた。
ＨＰＬＣ；カラム ＯＤＰ，温度３５℃
移動層；ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝３：７の溶液にトリフロロ酢酸を０．１％添加
流速；１ｍｌ／分
ＨＰＣＬパターン（ＲＩ検出）を〔図２〕に示した。
【００３５】
実施例７
実施例５と同様の方法で、ステビオシド３０ｇを基質として、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌による酸化を行った。５％水酸化ナトリウム３０ｍｌを消費し、その反応時間は９０分であった。反応液を、精製し白色粉末２０ｇを得た。本品は高甘味かつ、清涼感のある甘味を呈した。
本品のＨＰＣＬパターン（ＲＩ検出）を〔図３〕に示した。この白色粉末４００ｍｇを逆相系カラムＯＤＰ−５０カラム（φ２１．５×３００ｍｍ 旭化成）と０．１％トリフロロ酢酸を含む水／アセトニトリル（７２：２８）の溶離液系を用い、主要成分を分取し、ついで凍結乾燥により白色粉末１２４ｍｇを得た。本品はメタノール：水＝９：１の混合溶媒から再結晶し、無色針状晶が得られた。
融点 ２２６−２３０℃（分解）．
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ−^１：３５００〜３２５０，１７１５，１６０５，１０８０−１０１０，８９０．
【表７】

元素分析 Ｃ_３８Ｈ_５７Ｏ_１９Ｎａ・１．５Ｈ_２Ｏ
計算値 Ｃ，５２．５９； Ｈ，６．９７
実測値 Ｃ，５２．５６； Ｈ，７．１５
以上から、本反応で得られた主要酸化生成物は前記式（ＩＩ）においてＲ_１＝−β−Ｇｌｃ−２−β−Ｇｌｃ，Ｒ_２＝−β−Ｇｌｃ ＵＡの化合物のナトリウム塩つまり下記式（ＩＶ）で表わされる １３−Ｏ−β−ソホロシル，１９−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニルステビオール ナトリウム塩であると結論した。
【化９】

【００３６】
実施例８
実施例５と同様の方法で，ステビオシド３０ｇを基質としてシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌による酸化を行った。８０分間で、５％水酸化ナトリウム溶液を６７ｍｌ消費した、反応液を精製し白色粉末３２ｇを得た。本品は高甘味でかつ清涼感のある甘味を呈した。本品のＨＰＣＬパターン（ＲＩ検出）を〔図４〕に示した。この白色粉末１ｇから、逆相系カラムＯＤＰ−５０（φ２１．５×３００ｍｍ 旭化成）と２％酢酸／アセトニトリルのグラディエント系を用いたＨＰＣＬの手法を用いて、主要酸化生成物を０．２２ｇを分取した。本品の二次イオン質量分析（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ． ＳＩ−ＭＳ）でｍ／ｚ８６９（Ｍ＋２Ｈ_２０・Ｈ^＋）のピークが観察できた。
^１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ_６−ピリジン）ｐｐｍ：１５．１２， １８．９５， ２０．２１， ２１．６９， ２７．７８， ３７．９１， ３７．９６， ３９．３３， ３９．４１， ４０．３５， ４２．１２， ４３．５８， ４３．９１， ４７．２３， ５３．５５， ５６．８６， ６２．５７， ７０．０７， ７１．５４， ７２．４９， ７２．７５， ７５．７５， ７６．１６， ７６．７９， ７６．８３， ７７．５１， ７７．７２， ７７．７８， ８６．００， ８６．９７， ９５．０７， ９７．６０， １０３．８９， １０３．９４， １５３．５０， １７１．２６， １７１．８９， １７６．２３．
以上の知見から本品は前記式（ＩＩ）において、Ｒ_１＝−β−Ｇｌｃ−２−β−Ｇｌｃ ＵＡ，Ｒ_２＝−β−Ｇｌｃ ＵＡの化合物のナトリウム塩つまり下記式（Ｖ）で表される１３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニル−β−Ｄ−グルコシル，１９−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニルステビオール ２ナトリウム塩と結論した。
【化１０】

【００３７】
実施例９
実施例５の方法に従って、ステビオシド３０ｇをバイオット社製５リットルのジャーファーメンターに入れ、ついで滅菌水１．６リットルを加えて反応液とした。これを３２℃，８００回転で撹拌しながら、空気を１リットル／分で通気し、炭酸カルシウム２０ｇを加え、４時間反応させた。ついで、反応液２リットルを８０００回転で冷却遠心器で分離し、菌体を除き、上澄液をＨＰ−２０（芳香族系合成吸着剤、三菱化成）カラム（１．８リットル）に通導し、Ｈ_２Ｏ（８リットル）で洗浄後、５０％エタノール（５リットル）で溶出される画分より、ウロン酸型ステビオシドのカルシウム塩が得られた。濃縮後、凍結乾燥により、白色粉末１２．９８ｇを得た。これをメタノールから再結晶し無色粉末状晶を得た。本品は弱い甘味が認められた。
本品の^１３Ｃ−ＮＭＲ（ｄ_６−ピリジン）ｐｐｍ；１５．９３， １９．７４， ２０．９２， ２１．００， ２８．５８， ３８．６６， ３８．７１， ４０．０６， ４１．０４， ４１．８６， ４２．００， ４２．９１， ４４．３３， ４８．１９， ５４．５０， ５７．６３， ７３．１１， ７３．３０， ７３．４５， ７３．９７， ７４．０８， ７６．５３， ７７．７２， ７７．８６， ７７．８９，７８．３４， ７８．３９， ８４．７９， ８６．７９， ９５．８４， ９８．２１， １０５．４６， １０７．０２， １５３．７０， １７１．９３， １７２．１８， １７２．９５， １７６．７８．
以上の知見から、本品は前記式（ＩＩ）において、Ｒ_１＝−β−Ｇｌｃ ＵＡ−２−β−Ｇｌｃ ＵＡ，Ｒ_２＝−β−Ｇｌｃ ＵＡの化合物のカルシウム塩つまり下記式（ＶＩ）で表される１３−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニル−β−Ｄ−グルクロニル−１９−Ｏ−β−Ｄ−グルクロニルステビオール カルシウム塩と結論した。
【化１１】

【００３８】
実施例１０
実施例５と同様の方法で、レバウディオシドーＡ１０ｇを基質として、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌体１５．８ｇ、滅菌水２０００ｍｌを加え３２℃，８００回転、空気１．６リットル／分の条件で撹拌しながら行い、反応は２％ＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨ６．３にコントロールした。２％ＮａＯＨ２３ｍｌを消費したところで反応を停止し、遠心分離を行い上清を分離した。反応時間は１３５分を要した。上清液を実施例５と同様な精製法により、処理し、白色粉末１０．１６ｇを得た。
本品のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を〔図５〕に示した。
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３３４０， １７２０， １６１０， １４１０， １０７０ また本品は高甘味で、清涼感のあるすぐれた甘味質である。
【００３９】
実施例１１
実施例１に記載したシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌液１リットルにステビオシド３０ｇをバイオット社５リットルのジャーファーメンターに入れ、ついで滅菌水１リットルを加え、さらに、アンバーライト ＩＲＡ−６８（以下単にＩＲＡ−６８と略す）２００ミリリットルを加えて反応液とした。これを３２℃，８００回転で撹拌しながら、空気１．６リットル／分で通気した。２時間で、上澄液にステビオシドが認められなくなったので、反応を停止し、遠心分離により、上清とＩＲＡ−６８とを分け、ＩＲＡ−６８は、カラム（φ４×２４ｃｍ）につめ、ついで、２Ｎ−食塩水２リットルで溶出し、溶出画分をＨＰ−２０のカラム（０．５リットル）に通導した。水１リットルで洗浄後、５０％メタノール０．８リットルで溶出し、濃縮乾涸し、白色粉末９．２０ｇを得た。
本品をメタノール：水＝９：１の混合溶媒から再結晶し無色針状晶を得た。
ｍｐ．２２６−２３０℃（分解）
本品は実施例７に示した、１３−Ｏ−β−ソホロシル−１９−Ｏ−β−グルクロニルステビオール ナトリウム塩（ＩＶ）と認定した。
【００４０】
実施例１２
実施例１１に記載した方法に順じて、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌液１リットルにステビア抽出物（少なくとも６種のステビオール配糖体混合物）３０ｇをバイオット社５リットルのジャーファーメンターに入れ、ついで滅菌水１リットルを加え、さらにＩＲＡ−６８ ２００ミリリットルを加えて反応液とした。これを３２℃，８００回転で撹拌しながら、空気を１．６リットル／分で通気した。２時間で、上清液にステビオシドが認められなくなったので反応を停止し、遠心分離により、上清とＩＲＡ−６８とを分け、ＩＲＡ−６８はカラム（φ４×２５ｃｍ）につめ、ついで２Ｎ−ＮａＣｌ １リットルで溶出し、溶出画分をＨＰ−２０カラム（０．５リットル）に通導した。水１リットルで洗浄後５０％メタノール１リットルで溶出し濃縮乾涸し白色粉末８．９ｇを得た。
本品のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を〔図６〕に示す。
ＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３５００〜３２００， １７２０， １７０５， １６１０， １４００ を示した。
【００４１】
実施例１３
糖転移ステビア配糖体（ＳＫスィート、山陽国策パルプ（株）製造）３０ｇを実施例６と同様の方法で、酸化し、精製処理し、白色粉末２８．３ｇを得た。本品の^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）で、カルボニル炭素の領域に８本のシグナル（１７９．５０，１７９．４６， １７９．４０， １７９．３７， １７９．３２， １７９．２６， １７７．１０， １７７．０７ ｐｐｍ）が観察されたことから、少なくとも糖の１級酸基の１つ以上がカルボン酸に変換したことが認められた。本品は、清涼感のあるさわやかな甘味を呈した。
【００４２】
実施例１４
羅漢果の果実に含まれる高甘味配糖体モグロシドＶ、２００ｍｇを実施例１１に記載した方法に順じて、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌１０ｍｌ分（０．３２ｇ）を水３ｍｌに懸濁して加え、ついでＩＲＡ−６８ ５ｍｌを加えた。この混合液を、３０℃，２２９回転で５時間半撹拌した。反応液を静置して、上清を除いたあと、ＩＲＡ−６８をカラムにつめ、水洗（５０ｍｌ）後、０．０１Ｎ ＨＣｌで溶出、溶出画分を集め、凍結乾燥し、白色粉末（３２ｍｇ）を得た。本品はＩＲ（ＫＢｒ）ｃｍ^−１：３３００， １６００， １４１０， １０６０−１０００ であることから、糖鎖がグルクロン酸型に変換されたものと確認した。本品は砂糖のような甘味を呈した。
【００４３】
実施例１５
ルブソシド１．０ｇを滅菌水６０ｍｌにとかし、これに、ＩＲＡ−６８ １３ｍｌを加え、ついで、実施例１に記載したシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス（Ｐｓｕｅｄｏｇｌｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）菌液３０ｍｌを加え、３２℃，６００回転／分で撹拌しながら、空気を６０リットル／分で通気し、２４０分間撹拌しながら反応させた。反応液から、ＩＲＡ−６８をとり出し、カラムに充填し、水１５ｍｌで水洗したあと、２Ｎ−ＮａＣｌ溶液をＳＶ０．５で２００ｍｌを用いて溶出し、溶出液をＨＰ−２０カラム（２０ｍｌ）に吸着し、水１５０ｍｌで洗った後、５０％ＭｅＯＨ溶液（１００ｍｌ）で、ＳＶ０．５で溶出、溶出液を濃縮乾固し、析出物をメタノールから再結晶し、無色粒状晶０．４８ｇを得た。
ｍ．ｐ． １８４−１８８℃（分解）
元素分析 Ｃ_３２Ｈ_４７Ｏ_１４Ｎａ・５Ｈ_２Ｏ
理論値 Ｃ，４９．９９； Ｈ，７．４７
実測値 Ｃ，５０．０５； Ｈ，７．５４
【表８】

以上のデータから、その構造を（ＶＩＩ）と表わされると結論した。
【化１２】

また本品（ＶＩＩ）は、にがみのない、砂糖のような良好な高甘味物質であった。
【００４４】
実施例１６
塩酸フルスルチアミン １０ｍｇ
ビタミンＢ_２ ２ｍｇ
タウリン １０００ｍｇ
安息香酸 ３０ｍｇ
パラオキシ安息香酸ブチル ２．５ｍｇ
グルクロン酸型ステビオシドナトリウム塩（ＩＶ） ５０ｍｇ
クエン酸 １００ｍｇ
グリシン ５００ｍｇ
上記組成に従い、下記方法によりドリンク剤を得た。すなわち約７０℃に加温した水約３０ｍｌにパラオキシ安息香酸ブチル、安息香酸を溶解し、約２５℃まで冷却後、塩酸フルスルチアミン，ビタミンＢ_２，タウリン，甘味料としてのグルクロン酸型ステビオシド，クエン酸，グリシンを溶解し、１Ｎ−かせいソーダを添加し、ｐＨを３．５としたのち、水を加えて全量５０ｍｌとする。
【００４５】
実施例１７
沈降炭酸カルシウム３０ｇ，炭酸マグネシウム５ｇ，乳糖５８．５ｇ，ヒドロキシプロピルセルロース６ｇを均一に混合し、水３００ｍｌを加え、上記の混合物を造粒する。得られた顆粒を乾燥した後粉砕する。得られた粉末と矯味剤としてのグルクロン酸型ステビオシド０．０５ｇ及びステアリン酸マグネシウム０．５ｇを添加して混合し、常法に従って打錠することによって、直径８．５ｍｍで１錠２００ｍｇの錠剤を得た。
【００４６】
実施例１８
実施例１に記載したシュードグルコノバクター サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）菌液１．５リットルにデキストラン−４（分子量：４０００〜６０００；エキストラシンテーゼ社（仏国）製）３０ｇをバイオット社製５リットルのジャーファンメンターに入れ、ついで滅菌水１．７リットルを加え反応液とした。これを３２℃，６００回転／分で撹拌しながら、空気を１．６リットル／分で通気し、０．５％ＮａＯＨ溶液でｐＨ＝６．３になるように反応の進行にともない自動的に滴加した。３時間で反応を止めついで、反応液１２．０リットルを８０００回転で冷却遠心器で分離し、菌体を除き、上澄液１．９８リットルを得た。この上澄液をセルロースアセテートメンブランフィルター（φ０．２〜μｍ）で濾過し、再度除菌化した濾液を、アンバーライト ＩＲＡ−６８（ＯＨ型）カラム（５０ｍｌ）に通導し、少量の水（１００ｍｌ）で洗い、通過液２リットルを得た。この通過液をＨＰ−２０カラム（９００ｍｌ）に通導した。ついで、水２リットルで溶離し、初めの通過液７００ｍｌはすて、ついで溶出される液３．３リットルを集め、これに濃塩酸１３．８ｍｌを加え、酸性とし、これを、セルロースアセテートメンブランフィルター（φ０．２μｍ）で濾過し、濾液をセファビーズ（商品名）ＳＰ２０５（三菱化成社製）１０００ｍｌに通導した。ついで、０．０５Ｍ塩酸７００ｍｌ，水２リットルで洗浄後、２０％ＭｅＯＨ溶液２リットルで溶出し、目的物の画分を得た。これを減圧濃縮し、デキストラニル−グルクロン酸の白色粉末１４ｇを得た。本品のＨＰＬＣ（条件：アサヒパックＧＳ３２０（φ７．６ｍｍ×５０ｍｍ；旭化成社製）、移動相；水１ｍｌ／ｍｉｎ，検出；ＲＩ（ウォータース４１０）及び２００ｎｍ（東ソー ＵＶ−８０２０）サンプル０．５％水溶液２０μｌ 注入）でＲｔ＝８．４８に単一のピークを示した。（原料のデキストラン４のＲｔ＝１０．８３であった）
本品の構造確認のため、酵素消化処理実験を行った。本品の１．５％水溶液１００μｌ にグルコアミラーゼ（和光純薬製）溶液（４ｍｇ／ｍｌ）１００μｌ を加え、３０℃，１昼夜インキュベーションを行い、この酵素処理液をＨＰＬＣで検討を行った。対象実験として、デキストラン−４も同様にグルコアミラーゼ処理を行った。その結果、本品はグルコアミラーゼ消化を受けないことが分った。一方デキストラン−４は、グルコアミラーゼ消化を受け、基質は消失し、グルコースが新生した。このことから、本品は、上記式（ＶＩＩＩ）（但し、式中、ｎ＝１５）で示されるデキストラニルグルクロン酸と確認した。
【００４７】
実施例１９
実施例１に準じて、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）Ｋ５９１Ｓ菌株をバクトペプトン１％，イーストエキス１％からなるペプトンイースト培地（ＰＹ）培地を用いて、３０℃、２３０回転の振とう下ｐＨ７．５で３日間培養を行った。ついで、メイン培養に移し、ペプトンイースト培地（ＰＹ培地）で、０．１％の塩化カルシウムを添加し、３０℃、２３０ｒｐｍ で振とうしながら、４８時間培養した。ついで、培養液を１００００回転で、１０分間遠心分離し、集菌し、ついで水５００ｍｌで洗菌し、ブロース１リットル当り、７．５９ｇの菌体を得た。ついで、デキストラン−４（分子量４０００〜６０００；エキストラシンテーゼ社（仏国）製）３０ｇを水１リットルにとかし、ついで湿菌体５６ｇを水１リットルに懸濁した液を加え、３２℃、８００ｒｐｍ で撹拌しながら、空気を１分間６０ｍｌで通気し、０．１％ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．３に制御しながら６．５時間反応させた。反応液を遠心分離し、上清２リットルを分取し、メンブランフィルターで濾過除菌し、ＨＰ−２０カラム（９００ｍｌ）に通導し、水２０００ｍｌで溶出した。通過液に最終濃度０．０５Ｍになるように、濃塩酸を加え、酸性とし、メンブランフィルターで濾過したあと、濾液をＳＰ−２０５カラム（１００ｍｌ）に通導し、初め、０．０５Ｍ ＨＣｌ（１０００ｍｌ）、ついで水（２０００ｍｌ）で洗浄後、２０％ＭｅＯＨ（２０００ｍｌ）で溶出される画分を集め、濃縮後、凍結乾燥し、１４ｇの白色粉末のデキストラニルグルコン酸を得た。本品のＨＰＬＣ〔条件：アサヒパックＧＳ３２０（φ７．６ｍｍ×５０ｍｍ：旭化成社製）、移動相：水１ｍｌ／ｍｉｎ，ＲＩ（ウォータース４１０）及び２００ｎｍ（東ソーＵＶ−８０２０）、サンプル０．５％％水溶液２０μｌ 注入〕でＲｔ＝８．７０に単一のピークを示した。本品を前記した条件でグルコアミラーゼ消化を行ったところ、容易に消化され、グルコースとグルコシルグルコン酸を検出することができた。従って、本化合物をデキストラニルグルコン酸と確認した。
【００４８】
実施例２０
実施例１９と同様にして、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ Ｓａｃｃｈａｒｏｋｅｔｏｇｅｎｅｓ）菌を培養しこの菌体（湿菌体）５０ｇをデキストラニルグルクロン酸（実施例１８で記載の方法で調製した）３０ｇを水１リットルに溶解させた溶液に加え、３２℃、８００ｒｐｍ で撹拌しながら、空気を１分間６０ｍｌで通気し、０．１％ＮａＯＨ溶液でｐＨ６．３に制御しながら、２１時間反応させた。反応液を遠心分離し、上清２リットルを分取し、メンブランフィルターで濾過除菌し、ＨＰ−２０カラム（９００ｍｌ）に通導し、水１．５リットルで溶出し、目的画分を集め、濃縮後凍結乾燥し１５ｇの上記式（ＩＸ）で表わされるグルクロニルデキストラニルグルコン酸のナトリウム塩の白色粉末１２ｇを得た。
ＨＰＬＣ：Ｒｔ＝９．１２ １ピーク
ＨＰＬＣ条件；カラム：ＧＳ−３２０
移動相：Ｈ_２Ｏ，流速１ｍｌ／分
検 出：ＲＩ
^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）δｐｐｍ： １７９．５５４， １７８．１１９， １７２．４３４ に観察され、その強度が１：０．５：０．５で、その帰属は、グルクロン酸部のカルボニル炭素を１７９．５５４ とし、他はグルコン酸部（１部ラクトン型を想定）のカルボニル炭素とした。
【００４９】
実施例２１
塩化第２鉄・６水和物の５０％水溶液５０ｍｌを３０℃に加温し、ついで２４％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液５０ｍｌを１分間０．４ｍｌの速度でよく撹拌しながら滴加する。ついで、実施例１８で得たデキストラニルグルクロン酸を用いた１０％デキストラニルグルクロン酸溶液５０ｍｌを、３ｍｌ／分の速度で滴加し、１６％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液を０．４ｍｌ／分の速度で加え、ｐＨ４．３に調整した。次に、エタノール２００ｍｌを加え、強く撹拌しスラリー状にし、遠心分離（５０００ｒｐｍ）し、沈殿を集めついで、水４０ｍｌに溶かし、６０ｍｌのエタノールでよくかくはんし、遠心分離し可溶物を除き、沈殿物に水２０ｍｌを加え、よく分散させ、減圧下、エバポレーターでよくエタノールを除き、１０％ＮａＯＨ溶液で０．２ｍｌ／分で速度でよく撹拌しながら加え、ｐＨ５〜６に調整し、１００℃，２０分間加熱し、ついで、フェノールを４ｍｇ／ｍｌになるように加え、デキストラニルグルクロン酸水酸化鉄ゾル溶液２２ｍｌを得た。本品の１ｍｌの幼若ブタへの筋肉内投与により貧血症状を著しく改善する効果が認められた。デキストラニルグルコン酸水酸化鉄ゾルも同様な方法で製造することができ、また幼若ブタの貧血を著しく改善する効果が認められた。
【００５０】
実施例２２
デキストラニルグルコン酸の水酸化鉄ゾルの製造法 塩化第２鉄（ＦｅＣｌ_３・６Ｈ_２Ｏ）１００ｇを１００ｍｌの水に溶解させ、この溶液をＢｒａｎｓｏｎ Ｂ−２２０で超音波処理を１時間行い、充分溶解させる。ついで、水を加え、２００ｍｌとし、５００ｍｌのビーカーに溶液を移す。ついで２４％炭酸ソーダ溶液２００ｍｌをよく撹拌しながら３０℃，０．８ｍｌ／分の速度で添加し淡黄褐色の水酸化鉄ゾルを調製した。
このようにして調製した水酸化鉄ゾル１００ｍｌを分取し、３００ｍｌのビーカーに移し、３０℃でよく撹拌しながら、１０％デキストラニルグルコン酸溶液５０ｍｌを徐々に加える。ついで、１６％ＮａＣＯ_３溶液を、極めてゆっくり、０．１〜０．２ｍｌ／分の速度で加え、ｐＨを４．３に調整した。ついで、エタノール２００ｍｌを撹拌しながら加え、生じた沈澱を遠心分離し、上清と分け、沈澱を水８０ｍｌを加え、よく懸濁させたあと、エタノール１２０ｍｌを加え、再沈澱させ、沈澱物を遠心分離し、分取する。この操作をさらにもう一回繰り返して得た沈澱物を水２０ｍｌで懸濁、よく撹拌し１０％ＮａＯＨ溶液を０．１〜０．２ｍｌ／分の速度で加え、ｐＨを６．０になるまで加えた。この溶液を１２０℃１０分間、オートクレーブ処理し、防腐剤としてフェノール（１％含となるように）を加え、ついで、エバポレーターで濃縮し、デキストラニルグルコン酸の水酸化鉄ゾル溶液を調整した。本品は、安定した水酸化鉄ゾルを形成した。その性状を分析したところ、以下のとおりであった。
総鉄塩濃度：２００ｍｇ／ｍｌ，粘度；３２ｃＰ，電導度４７ｍＳ／ｃｍであった。
【００５１】
実施例２３
デキストラニルグルクロン酸の透析法による鉄塩化 塩化第２鉄・６水和物の５０％水溶液５０ｍｌを３０℃に加温し、ついで２４％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液５０ｍｌを１分間０．３０ｍｌの速度でよく撹拌しながら滴加し、やや黒味がかった黄土色の水酸化鉄ゾル（ｐＨ１．５４）を得た。この水酸化鉄ゾルを、透析膜（ｄｉａｌｙｓｅｓ ｔｕｂｅ）に移し、超純水中で一夜透析した。透析後の水酸鉄ゾルは約１７０ｍｌ、ｐＨ４．４７黒褐色を呈した。ついで、この透析処理した水酸鉄ゾルに、実施例１８で得たデキストラニルグルクロン酸の１０％水溶液５０ｍｌを加え、よく撹拌し、１６％Ｎａ_２ＣＯ_３溶液でｐＨ４．３に調整した。これを１００℃、３０分間オートクレーブ処理した後、１０％ＮａＯＨ溶液を加え、ｐＨ１２に調整し、再度１２１℃、２０分間オートクレーブ処理をし、完全溶解させ、黒褐色のデキストラニルグルクロン酸の水酸化第２鉄塩複合体が得られた。次いでこれを透析膜で一夜透析後濃縮しこれに、フェノールを４ｍｇ／ｍｌになるように加え、デキストラニルグルクロン酸水酸化第２鉄塩複合体の注射剤２２ｍｌを得た。本品は安定したゾル溶液であり、その性状を分析したところ以下のとおりであった。
総鉄塩濃度：２０１ｍｇ／ｍｌ，粘度２３．９ｃＰ，電導度３．７ｍＳ／ｃｍであった。
本品の１ｍｌの幼若ブタへの筋肉内投与により貧血症状を著しく改善する効果が認められた。デキストラニルグルクロン酸水酸化第２鉄塩複合体も同様な方法で製造することができ、また幼若ブタの貧血を著しく改善する効果が認められた。
【００５２】
実施例２４
実施例１１と同様にして、シュードグルコノバクター サッカロケトゲネス菌液１リットルにレバウディオシド−Ａ３０ｇをバイオット社製５リットルのジャーファーメンターに入れ、ついで滅菌水１．５リットルを加え、さらにＩＲＡ−６８ ４００ｍｌを加えて、反応液とした。これを３２℃、６００回転で撹拌しながら、空気１．６リットル／分で通気した。１時間で、上澄液にレバウディオシド−Ａが認められなくなったので、反応を停止し、遠心分離により上清とＩＲＡ−６８とを分け、ＩＲＡ−６８はカラム（φ４×４０ｃｍ）につめ、ついで２Ｎ−食塩水（８．１リットル）で溶出し、溶出画分をＨＰ−２０（１リットル）カラムに通導、吸着せしめ、水洗（８リットル）後、１０％〜５０％エタノールで溶出することにより、目的とするグルクロン酸型レバウディオシド−Ａのナトリウム塩が得られた。濃縮後、凍結乾燥することにより、無色粉末１９．６ｇを得た。これをＭｅＯＨ−Ｈ_２Ｏから再結晶することにより、無色針状晶１０．６ｇを得た。ｍ．ｐ．２２０℃（分解）本品のＨＰＬＣ（ＯＤＰカラム，アセトニトリル：水＝３０：７０）はＲｔ＝９．７０に１本のピークを与えた。本品の^１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ_２Ｏ）ｐｐｍ：１８．０６， ２１．５２， ２２．９１， ２４．１９， ３０．８９， ３９．５１， ４０．１５， ４２．０２， ４３．０１， ４３．７３， ４４．５８， ４６．６９， ４６．７９， ４９．８９， ５６．１７， ５９．６４， ６３．５１， ６３．７１， ６４．３７， ７１．３６， ７２．４３， ７３．１４， ７４．４０， ７４．６７， ７６．２９， ７６．９９， ７８．１２， ７８．７０， ７８．７２，７８．８１， ７８．９３， ７９．２７， ７９．３８， ８１．４９， ８７．９９， ９０．３１， ９６．６４， ９８．７０， １０４．８７， １０５．０６， １０７．３２， １５５．９９， １７７．７９， １８１．６４
以上の知見から、本品は、前記式（ＩＩ）において、
【化１３】

の化合物のナトリウム塩つまり下記式（Ｘ）で表わされると結論した。
【化１４】

【００５３】
試験例
実施例４で得た６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ 塩（１）の各種酵素に対する安定性試験を下記方法により行った。比較対照として、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンを用いた。
試験方法
１０ｍＭの供試シクロデキストリン水溶液に、下記酵素の所定量をそれぞれ加えた後、３７℃の温浴中で静置する。５００μｌ ずつサンプルを分取し、１００℃で１５分間加熱することにより酵素を失活させた後、遠心分離（１５，０００ｒ．ｐ．ｍ． ５分）する。さらにミリポアＵＳＹ−１（分画分子量１０，０００）で濾過する。１０倍に希釈して下記条件によりＨＰＬＣ分析に付した。
ＨＰＬＣ 分析条件；
カラム；ＮＨ２Ｐ−５０（Ａｓａｈｉｐａｋ）
移動相；ＣＨ_３ＣＮ：Ｈ_２Ｏ＝４８：５２にＰＩＣ試薬０．００５Ｍを添加した。
流 速；０．８ｍｌ／分
検 出；ＲＩ
上記操作で得られた各試料のＨＰＩＣから、１２０分までの時間ごとのシクロデキストリンの残存率を求めた。
【００５４】
使用酵素と酵素濃度；
【表９】

結果
６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ 塩（１）のおよび６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンの各酵素による残存率の経時変化を〔図１１〕〜〔図１４〕に示す。
（１）は、α−アミラーゼ，グルコアミラーゼ，プルラナーゼの酵素処理に対して、対照とした６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンに比し、安定であることが判明した。
一方プルラナーゼの酵素処理に対する検討では、対照とした６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンが約６０％分解されるのに対して、（１）は、安定であった。
【図面の簡単な説明】
【図１】は実施例５で得られたグルクロン酸型ステビオール配糖体混合物のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図２】は実施例６で得られたグルクロン酸型ステビオール配糖体混合物のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図３】は実施例７で得られたグルクロン酸型ステビオール配糖体ナトリウム塩のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図４】は実施例８で得られたグルクロン酸型ステビオール配糖体２ナトリウム塩のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図５】は実施例１０で得られたレバウディオシド−Ａの１当量酸化体のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図６】は実施例１２で得られたグルクロン酸型ステビオール配糖体混合物のＨＰＬＣパターン（ＲＩ検出）を示す。
【図７】は実施例４で得られた６−Ｏ−（２−カルボキシエチル）−β−シクロデキストリンＮａ 塩と６，６−ジ−Ｏ−（２−カルボキシエチル）−β−シクロデキストリンの^１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δｐｐｍ のチャートを示す。
【図８】は実施例４で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル−（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−α−シクロデキストリンの^１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δｐｐｍ のチャートを示す。
【図９】は実施例４で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル−β−シクロデキストリンの^１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δｐｐｍ のチャートを示す。
【図１０】は実施例４で得られた６−Ｏ−（２−カルボキシ２−ハイドロキシエチル）−β−シクロデキストリンＮａ 塩と６，６−ジ−Ｏ−（２−カルボキシ２−ハイドロキシエチル）−β−シクロデキストリンＮａ 塩の^１３Ｃ−ＮＭＲ（２７０ＭＨｚ，Ｄ_２Ｏ）δｐｐｍ のチャートを示す。
【図１１】は試験例で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ塩及び対照の６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンのα−アミラーゼに対する安定性試験の結果を示し、両化合物をα−アミラーゼ処理した場合の残存率の経時変化を示す。
【図１２】は試験例で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ塩及び対照の６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンのグルコアミラーゼに対する安定性試験の結果を示し、両化合物をグルコアミラーゼ処理した場合の残存率の経時変化を示す。
【図１３】は試験例で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ塩及び対照の６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンのプルラナーゼに対する安定性試験の結果を示し、両化合物をプルラナーゼ処理した場合の残存率の経時変化を示す。
【図１４】は試験例で得られた６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリンＮａ塩及び対照の６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリンのβ−グルクロニダーゼに対する安定性試験の結果を示し、両化合物をβ−グルクロニダーゼ処理した場合の残存率の経時変化を示す。
【符号の説明】
〔図１１〕〜〔図１４〕において、●は６−Ｏ−α−マルトシル−シクロデキストリンを、▲は６−Ｏ−α−Ｄ−グルクロニル（１→４）−α−Ｄ−シクロデキストリンＮａ塩を示す。

Claims (23)

1. ヒドロキシメチル基及び／又はヘミアセタール水酸基を有するＤ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−キトビオース、トリ−Ｎ−アセチル−キトトリオース、グルコシール−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸、イノシン、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シチジン、チミジン、２−デオキシイノシン、２−デオキシアデノシン、２−デオキシウリジン、２−デオキシグアノシン、２−デオキシシチジン、２−デオキシチミジン、ストレプトゾトシン、シュークロース、ラクトース、パラチノース、ラフィノース、ラクトシュークロース、グルコシルシュークロース、ガラクトシルシュークロース、キシロビオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトトリオース、パノース、マルチトール、バリダマイシンＡ、セロビオース、セロトリオース、セロヘキサオース、ステビオシド、レバウディオシド−Ａ、レバウディオシド−Ｃ、レバウディオシド−Ｄ、レバウディオシド−Ｅ、ズルコシド−Ａ、ルブソシド、モグロシド、シクロデキストリン、可溶性デンプン、デキストリン、デキストラン、β - １，３−グルカン、セルロース、キチン、アミロース、アミロペクチン、イソマルトース、マルトース、デキストラニルグルクロン酸、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、６，６−ジ−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−（２，３−ジ−ハイドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン又は６，６−ジ−Ｏ−（２，３−ジ−ハイドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンに、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物あるいはその微生物の培養液又はその微生物が産生する酵素を作用させ、対応するカルボン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする糖カルボン酸又はその塩の製造法。
2. ヒドロキシメチル基を有するＤ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン、Ｎ−アセチル−キトビオース、トリ−Ｎ−アセチル−キトトリオース、グルコシール−Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸、イノシン、アデノシン、ウリジン、グアノシン、シチジン、チミジン、２−デオキシイノシン、２−デオキシアデノシン、２−デオキシウリジン、２−デオキシグアノシン、２−デオキシシチジン、２−デオキシチミジン、ストレプトゾトシン、シュークロース、ラクトース、パラチノース、ラフィノース、ラクトシュークロース、グルコシルシュークロース、ガラクトシルシュークロース、キシロビオース、マルトトリオース、マルトテトラオース、イソマルトトリオース、パノース、マルチトール、バリダマイシンＡ、セロビオース、セロトリオース、セロヘキサオース、ステビオシド、レバウディオシド−Ａ、レバウディオシド−Ｃ、レバウディオシド−Ｄ、レバウディオシド−Ｅ、ズルコシド−Ａ、ルブソシド、モグロシド、シクロデキストリン、可溶性デンプン、デキストリン、デキストラン、β - １，３−グルカン、６−Ｏ−α−マルトシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、６，６−ジ−Ｏ−（３−ヒドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−α−Ｄ−グルコシル−β−シクロデキストリン、６−Ｏ−マルトシル−α−シクロデキストリン、６−Ｏ−（２，３−ジ−ハイドロキシプロピル）−β−シクロデキストリン又は６，６−ジ−Ｏ−（２，３−ジ−ハイドロキシプロピル）−β−シクロデキストリンに、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，Ｉ ＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物あるいはその微生物の培養液又はその微生物が産生する酵素を作用させ、対応するカルボン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする糖カルボン酸又はその塩の製造法。
3. シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物を作用させる請求項１又は２記載の製造法。
4. マルトシル−β−シクロデキストリンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
5. ２−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｌ−アスコルビン酸の有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
6. ストレプトゾトシンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
7. ヘプチュロースのヒドロキシメチル基がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
8. 式（Ｉ）
   

   

   で表わされるマルトデキストリンの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
9. 式（II）
   

   

   で表わされるステビオール配糖体の有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
10. ステビオール配糖体が式（II）においてＲ_１＝−β−Ｇｌｃ−２−β−Ｇｌｃ，Ｒ_２＝−β−Ｇｌｃであるステビオシドである請求項９に記載の糖カルボン酸又はその塩。
11. ステビオール配糖体が式（II）において
    

    

    であるレバウディオシド−Ａである請求項９に記載の糖カルボン酸又はその塩。
12. バリダマイシンＡの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
13. モグロシドの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
14. デキストランの有するヒドロキシメチル基の少なくとも１つがカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
15. 請求項１４記載の糖カルボン酸又はその塩と、鉄塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる金属塩との複合体。
16. ヘミアセタール水酸基を有するデキストラン、セルロース、キチン、アミロース、アミロペクチン、マルトトリオース、パノース、イソマルトース、セロビオース、ラクトース、マルトース又はデキストラニルグルクロン酸に、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物あるいはその微生物の培養液又はその微生物が産生する酵素を作用させ、対応するカルボン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする糖カルボン酸又はその塩の製造法。
17. シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株 （ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物を作用させる請求項１６記載の製造法。
18. ヘミアセタール水酸基を有する多糖類がデキストランである請求項１６記載の製造法。
19. ヘミアセタール水酸基を有する多糖類の誘導体がデキストラニルグルクロン酸である請求項１６記載の製造法。
20. デキストラニルグルクロン酸の有する少なくとも１つのヘミアセタール水酸基をもつ炭素原子がカルボキシル基に酸化された糖カルボン酸又はその塩。
21. 請求項２０記載の糖カルボン酸又はその塩と、鉄塩、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩から選ばれる金属塩との複合体。
22. デキストラニルグルクロン酸と水酸化第２鉄ゾルを反応させることを特徴とするデキストラニルグルクロン酸と水酸化第二鉄との複合体の製造法。
23. ヒドロキシメチル基を有するシュークロースに、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＫ５９１ｓ株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３０，ＩＦＯ １４４６４）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２９，ＩＦＯ １４４６５）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネスＴＨ １４−８６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１２８，ＩＦＯ １４４６６）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−１５株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３２，ＩＦＯ １４４８２）、シュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス１２−４株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３１，ＩＦＯ １４４８３）及びシュードグルコノバクター・サッカロケトゲネス２２−３株（ＦＥＲＭ ＢＰ−１１３３，ＩＦＯ １１４８４）から選ばれる微生物あるいはその微生物の培養液又はその微生物が産生する酵素を作用させ、対応するカルボン酸を生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする糖カルボン酸又はその塩の製造法。

Images