JP2803089B2

JP2803089B2 - ポリペプチドおよびその製造法

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Publication number: JP2803089B2
Application number: JP63130968A
Authority: JP
Inventors: 久真男豊島; 龍也堀内; 清志山内; 雅山本; 貢一五十嵐
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1987-06-01
Filing date: 1988-05-27
Publication date: 1998-09-24
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: EP0293793B1; NO882385D0; EP0293793A3; HUT47974A; NO882385L; JPH02460A; HU204566B; US5874247A; DE3882593D1; US5700678A; FI882516A; FI882516A0; CA1341390C; DE3882593T2; IL86455A0; EP0293793A2

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明はポリペプチドおよびその製造法に関する。さ
らに詳しくは、本発明はプロテインジスルフィドイソメ
ラーゼ活性を有するポリペプチドおよびその製造法に関
する。

従来技術および解決すべき課題ジスルフィド結合の形成がタンパク質の立体構造の保
持やそれに伴う活性発現にきわめて重要であることは一
般的に知られている。真核細胞ではジスルフィド結合は
小胞体でタンパク質翻訳と同時にもしくは翻訳後直ちに
形成される［J.Biol.Chem.,257,8847（1982）］。この
ジスルフィド結合はin vitroでも非酵素的に形成される
が、in vivoよりも反応速度がおそく、しかもin vitro
での条件がin vivoを反映していないことから、Anfinse
nらはin vivoでジスルフィドインターチェンジプロテイ
ンというタンパク質がジスルフィド結合の形成に機能し
ていると考えた［J.Biol.Chem.,238,628（1963）］。こ
の考えは現在でも依然として仮説であるが、in vicroに
おいて還元型やスクランブル型のリボヌクレアーゼ（と
もに不活性型）に作用して正しいジスルフィド結合の形
成を促進し活性型とする酵素が種々の真核生物において
発見され精製されている［Biochemistry,20,6594（198
1）;Biochem.J.,213,225（1983）;Biochem.J.,213,245
（1983）］。スクランブル型リボヌクレアーゼは変性条
件下で還元再酸化処理を行い調製したもので、活性型リ
ボヌクレアーゼが有する４対のジスルフィド結合が自由
に組み換えられて生成する種々の分子種の混合物である
［Biochem.J.,213,235（1983）］。不活性型リボヌクレ
アーゼを活性型とする酵素に対してはプロテインジスル
フィドイソメラーゼ（PDI,EC5.3.4.1）という名称が与
えられており、分子量52000〜62000の同一なサブユニッ
ト２個からなる二量体で等電点は4.0〜4.5である［Tren
ds in Biochem.Sci.,９,438（1984）;Methods in Enzym
ol.,107,281（1984）］。なお、既知のプロテインジス
ルフィドレダクターゼ（＝グルタチオンインシュリント
ランスヒドロゲナーゼ,EC1.8.4.2）はPDIと同一分子で
あると考えられている［Eur.J.Biochem.,,32,27（197
3）;Biochemistry,14,2115（1975）］。

1985年、Edmanらはラット肝PDIの相補DNAのクローニ
ングに成功し、その全塩基配列を明らかにした［Natur
e,317,267（1985）］。ラット肝PDIは489アミノ酸から
構成され、それにそのアミノ末端に19アミノ酸からなる
シグナルペピスドが付加されている。さらに、リボヌク
レオチドレダクターゼ反応など種々の酸化還元反応のコ
ファクターとして知られている大腸菌チオレドキシン
［Eur.J.Biochem.,６,475（1968）;Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,72,2305（1975）;Methods in Enzymol.,107,295
（1984）］と相同性のある領域をアミノ末端とカルボシ
キル末端近傍の２箇所にもっていた。各領域には２個の
Cysを持った相同の配列（Trp−Cys−Gly−Cys−Lys）が
存在し、これがジスルフィドとスルフヒドリルの交換を
通してPDI反応を触媒すると考えられている。なお、大
腸菌チオレドキシンが還元型およびスクランブル型リボ
ヌクレアーゼを基質としてPDI活性を示すことも最近報
告されている［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,7643（198
6）］。

PDIの利用価値としては大腸菌で生産される組換え型
タンパク質のリフォールディングへの適用が考えられ
る。近年の急速な遺伝子工学技術の進歩により真核生物
のタンパク質が大腸菌で大量生産されるようになった
が、この組換え型タンパク質は正しいジスルフィド結合
を欠いていたり、誤ったジスルフィド結合のかかり方を
もっていたりする［EMBO Journal,４,775（1985）;in G
enetic Engineering Vol.,4（Williamson,R.,ed）pp.12
7（1983）］。従って、正しいジスルフィド結合を有す
る活性型の組換え型タンパク質を得るにはリフォールデ
ィングの操作が必要である。この操作は現在レドックス
バッファーなどを用いた酸化還元反応で化学的に行われ
ているが、in vivoで機能している可能性があるPDIを利
用した方が正しいジスルフィド結合を特異的に形成でき
るであろう。特に多数のジスルフィド結合を有する組換
え型タンパク質にはきわめて有効であると考えられる。
また、PDIをコードする遺伝子を組換え体大腸菌に導入
して大腸菌内で組換え型タンパク質に作用させることも
可能である。

従来法によるPDIの製造法では材料の入手が困難であ
り取得できるPDIの量も限られているため、純度の高いP
DIを大量生産できる技術の開発が望まれている。ラット
およびウシPDIについては既にその遺伝子がクローニン
グされている［Nature,317,267（1985）］が、PDI遺伝
子を大腸菌などで発現させ活性型のPDIを精製取得した
例は今までのところ報告されていない。また、上記以外
の真核生物のPDIをクローニングした例は今までのとこ
ろ全く知られていない。

本発明者らは、甲状腺ホルモンT3（3,3′,5−トリヨ
ードチロニン（以下T3と略称する）と特異的に結合する
タンパク質（T3 Binding Protein,以下T3BPと略称す
る）の生物学的作用やタンパク化学的性質などについて
の研究を進めてきた。T3BPは哺乳動物細胞の細胞膜や細
胞質に存在し、またT3レセプターは細胞核に存在してい
ることが知られている。本発明者らの一部は、ウシ肝細
胞膜から精製取得したT3BPに対する抗体の作成に成功し
［Horiuchi,R.and Yamauchi,K.in Gunma Symposia on E
ndocrinology 23（Center for Academic Publication J
apan,Tokyo:VNU Science Press.BV.Utrecht）pp149−16
6（1986）］，遺伝子工学的手法を駆使してT3BPタンパ
ク質をコードする遺伝子をクローン化する努力を重ねて
きた。この過程の中で、上記の抗T3BP抗体をプローブと
して得られたウシ肝T3BPのcDNAが、ウシPDIタンパク質
をコードしている事実を発見した［国際公開番号WO88/0
5816号］。

一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質はそのアミノ酸
配列においてヒトの蛋白質と非常に高い相同性があり、
アミノ酸の異なっている部分もその大部分はコドンのon
e point mutationによって導びかれるものである。従っ
て前記したウシT3BP（PDI）遺伝子のDNA配列は、ヒトPD
I遺伝子のDNA配列に極めて良く似ているものと推定され
る。そこで本発明者らはウシPDI遺伝子の一部をDNAプロ
ーブとして用いて、ヒトPDI遺伝子をヒト細胞よりクロ
ーニングし、該遺伝子を含む組換えDNAを構築し、該DNA
で形質転換された形質転換体を培養すると、ヒトPDIが
生産されることを見い出した。本発明者らはこれらの知
見に基づき、さらに研究した結果、本発明を完成した。

課題を解決するための手段本発明は、（１）第３図のアミノ酸配列をコードする
塩基配列（Ｉ）を含有する組み換えDNA,（２）塩基配列
（Ｉ）を含有するベクターで形質転換された形質転換
体，（３）第３図のアミノ酸配列を含有するポリペプチ
ド［以下、ヒトPDIまたはヒトPDI（II）と略称する］，
および（４）塩基配列（Ｉ）を含有するベクターで形質
転換された形質転換体を培養し、培養物中にヒトPDIを
生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするヒト
PDIの製造法を提供するものである。

塩基配列（Ｉ）としては、第３図のアミノ酸配列をコ
ードする塩基配列であればいかなるものであってもよい
が、第５図下段の塩基配列104（アミノ酸配列＋１のAla
をコードするコドンの第１塩基Ｇ）〜1573（アミノ酸配
列＋490のLeuをコードするコドンの第３塩基Ｇ）である
ことが好ましい。また、第５図下段の塩基配列104〜157
3の５′上流に翻訳開始コドンATGあるいは第５図下段の
塩基配列50（アミノ酸配列−18のMetをコードするコド
ンの第１塩基Ａ）〜103（アミノ酸配列−１のAspをコー
ドするコドンの第３塩基Ｃ）が付加された塩基配列も好
ましい。さらに、第５図下段の塩基配列104〜1573の5'
上流にGACあるいはATGGACが付加された塩基配列，第５
図下段の塩基配列107〜1573,および第５図下段の塩基配
列107〜1573の5'上流にATGが付加された塩基配列もあげ
られる。

ヒトPDI（II）としては、第３図のアミノ酸配列で示
されるポリペプチド，第３図のアミノ酸配列で示される
ポリペプチドのＮ末端にMetあるいは第５図上段アミノ
酸配列−18〜−１で示されるペプチドが付加されたポリ
ペプチド，第３図のアミノ酸配列で示されるポリペプチ
ドのＮ末端にAspあるいはMet−Aspが付加されたポリペ
プチド，第５図上段アミノ酸配列＋１のAlaが除去され
たポリペプチド，第５図上段アミノ酸放列＋１のAlaがM
etに置換されたポリペプチドがあげられる。これらのペ
プチドは糖が配位した糖蛋白であってもよく、また他の
ポリペプチドとの融合蛋白であってもよい。

本発明におけるヒトPDIのポリペプチドをコードする
塩基配列を有するDNAを含有する発現型ベクターは、た
とえば、（ｉ）ヒトPDIをコードするmRNAを分離し、（i
i）該RNAから単鎖の相補DHA（cDNA）を、次いで二重鎖D
NAを合成し、（iii）該相補DNAをファージまたはプラス
ミドに組み込み、（iv）得られた組み換えファージまた
はプラスミドで宿主を形質転換し、（ｖ）得られた形質
転換体を培養後、形質転換体から適当な方法、たとえば
抗T3BP抗体を用いたイムノアッセイ，放射性同位元素で
標識されたプローブを用いるプラーク・ハイブリダイゼ
ーションやコロニーハイブリダイゼーションにより目的
とするDNAを含有するファージまたはプラスミドを単離
し、（vi）そのファージまたはプラスミドから目的とす
るクローン化DNAを切り出し、（vii）該クローン化DNA
をビークル中のプロモーターの下流に連結する、ことに
より製造することができる。

ヒトPDIをコードするmRNAは、種々のヒトPDI産生細
胞、例えばヒト肝細胞，胎盤細胞などから得ることがで
きる。

ヒトPDI産生細胞からRNAを調製する方法としては、グ
アニジンチオシアネート法［Chirgwin,J.M.ら,Biochemi
stry,18,5294（1979）］などが挙げられる。

このようにして得られたRNAを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、たとえばOkayama,H.らの方法［Mol.Cell.Bio
l.,２,161（1982）および同誌，３,280（1983）］やGub
ler,U.とHoffman,B.J.の方法［Gene,25,263（1983）］
に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラスミドやファ
ージに組み込む。

cDNAを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来の322［Gene,２,95（1977）］,pBR325［Gene,４,12
1（1978）］,pUC12［Gene,19,259（1982）］,pUC13［Ge
ne,19,259（1982）］，枯草菌由来のpUB110［Biochem.B
iophys.Res.Commun.,112,678（1983）］などが挙げられ
るが、その他のものであっても、宿主内で複製保持され
るものであれば、いずれをも用いることができる。ま
た、cDNAを組み込むファージベクターとしては、たとえ
ばλgt 11［Young,R.,and Davis.R.,Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,80,1194（1983）］などが挙げられるが、その他
のものであっても、宿主内で増殖できるものであればよ
い。

プラスミドにcDNAを組み込む方法としては、たとえば
Maniatis,T.ら,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor
Laboratory,p.239（1982）に記載の方法などが挙げら
れる。また、ファージ・ベクターにcDNAを組み込む方法
としては、たとえばHyunh,T.V.らの方法［DNA cloning,
a practical approach,１,49（1985）］などが挙げられ
る。このようにして得られたプラスミドやファージ・ベ
クターは、適当な宿主たとえば大腸菌、枯草菌などに導
入する。

上記大腸菌の例としてはEscherichia coli K12 DH1
［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,60,160（1968）］,JM103［N
ucl.Acids.Res.,９,309（1981）］,JA221［J.Mol.Bio
l.,120,517（1978）］,HB101［J.Mol.Biol.,41,459（19
69）］,C600［Genetics,39,440（1954）］などが挙げら
れる。

上記枯草菌としては、たとえばBacillus subtilis MI
114［Gene,24,255（1983）］,207−21［J.Biochem.95,
87（1984）］などが挙げられる。

プラスミドで宿主を形質転換する方法としては、たと
えばManiatis,T.ら,Molecular Cloning,Cold Spring Ha
rbor Laboratory,p.249（1982）に記載のカルシウムク
ロライド法あるいはカルシウムクロライド／ルビジウム
クロライド法などが挙げられる。また、ファージ・ベク
ターはたとえば、増殖させた大腸菌にインビトロパッケ
ージング法を用いて導入することができる。

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の
方法、たとえばコロニー・ハイブリダイゼーション法
［Gene,10,63（1980）］，プラーク・ハイブリダイゼー
ション法［Science,196,180（1977）］およびDNA塩基配
列決定法［Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74,560（1977）;Nu
cl.Acids.Res.,９,309（1981）］を用い、求めるクロー
ンを選出する。

このようにして、クローン化されたヒトPDIをコード
する塩基配列を含有するDNAを有するベクターを保持す
る微生物が得られる。

後述の実施例１で得られたEscherichia coli K12 DH5
α/pT3BP−３が保持するプラスミドpT3BP−３は、ヒトP
DIをコードする塩基配列を含有するDNAを有する。該DNA
の制限酵素切断位置を第４図に示す。第４図に示すよう
に該DNAは全長約2.4Kbpであり、制限酵素BamH I,EcoR
I,Cla I,Hind III,Pst Iにより断片に切断される。

次に、該微生物からプラスミドやファージ・ベクター
を単離する。

該単離法としては、アルカリ抽出法［Birmboim,H.C.
ら,Nucl..Acids Res.,１,1513（1979）］などが挙げら
れる。

上記クローン化されたヒトPDIをコードする塩基配列
を含有するDNAを有するプラスミドまたはファージ・ベ
クターは目的によりそのまま、または所望により制限酵
素で消化して使用することができる。

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型
ベクターを得ることができる。

ベクターとしては、上記大腸菌由来のプラスミド
（例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13,ptrp781），枯草菌
由来プラスミド（例、pUB110,pTM5,pC194），酵母由来
プラスミド（例、pSH19,pSH15,pGLD906,pGLD906−1,pCD
X,pKSV−10），あるいはλファージなどのバクテリオフ
ァージおよびレトロウイルス，ワクシニアウイルスなど
の動物ウイルスなどが挙げられる。

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのAT
Gを有し、また３′末端には翻訳終始コドンとしてのTA
A,TGAまたはTAGを有していてもよい。さらに該遺伝子を
発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本
発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現
に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればい
かなるものでもよい。

また、形質転換する際の宿主が大腸菌である場合は、
trpプロモーター,lacプロモーター,racプロモーター，
λP_Lプロモーター,lppプロモーターなどが、宿主が枯草
菌である場合は、SP 01プロモーター,SP 02プロモータ
ー,pen Pプモモーターなど、宿主が酵母である場合は、
PHO 5プロモーター,PGKプロモーター,GAP（GLD）プロモ
ーター,ADHプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主
が大腸菌でプロモーターがtrpプロモーターまたはλP_L
プロモーターであることが好ましい。

宿主が動物細胞である場合には、SV40由来のプロモー
ター，レトロウイルスのプロモーターなどが挙げられ、
とりわけSV40由来のプロモーターが好ましい。

このようにして作製された塩基配列（Ｉ）を含むDNA
を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造する。

宿主としては、大腸菌，枯草菌，放線菌などの原核生
物や酵母，カビ，動物細胞などの真核生物が挙げられ
る。

上記大腸菌，枯草菌の具体例としては、前記したもの
と同様のものが挙げられる。

上記酵母の具体例としては、たとえばSaccharomyces
cerevisiae AH22,AH22R^-,NA87−11A,DKD−5Dなどが挙げ
られる。

上記動物細胞の具体例としては、たとえば、サル細胞
COS−7,Vero,チャイニーズハムスター細胞CHO,マウスＬ
細胞などが挙げられる。

上記大腸菌を形質転換するには、たとえばProc.Natl.
Acad.Sci.USA,69,2110（1972）やGese,17,107（1982）
などに記載の方法に従って行われる。

枯草菌を形質転換するには、たとえばMolec.Gen.Gene
t.,168,111（1979）などに記載の方法に従って行われ
る。

酵母を形質転換するには、たとえばProc.Natl.Acad.S
ci.USA,75,1929（1978）に記載の方法に従って行われ
る。

動物細胞を形質転換するには、たとえばVirology,52,
456（1973）に記載の方法に従って行われる。

このようにして、塩基配列（Ｉ）を含有するベクター
で形質転換された形質転換体が得られる。

宿主が大腸菌，枯草菌，放線菌，酵母，カビである形
質転換体を培養する際、培養に使用される培地としては
液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の成育
に必要な炭素源，窒素源，無機物その他が含有せしめら
れる。炭素源としては、たとえばグルコース，デキスト
リン，可溶性澱粉，ショ糖など、窒素源としては、たと
えばアンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスティープ・
リカー，ペプトン，カゼイン，肉エキス，大豆粕，バレ
イショ抽出液などの無機または有機物質，無機物として
は塩化カルシウム，リン酸二水素ナトリウム，塩化マグ
ネシウムなどが挙げられる。

培地のpHは約５〜８が望ましい。

宿主が大腸菌の場合、用いる培地は、たとえばグルコ
ース，カザミノ酸を含むM9培地［Miller,J.Exp.Mol.Gen
et.,p.431,Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1
972］が好ましい。培養は通常約14〜43℃で約３〜24時
間行い、必要により、通気や撹拌を加えることもでき
る。

宿主が枯草菌の場合、培養は通常約30〜40℃で約６〜
24時間行い、必要により通気や撹拌を加えることもでき
る。

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばBurkholder最小培地［Bostian,K.L.ら,P
roc.Natl.Acad.Sci.USA,77,4505（1980）］あるいはそ
れを改変した低Pi培地［Biochem.Biophys.Res.Commun.,
138,268（1986）］などが挙げられる。培地のpHは約５
〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約20℃〜35℃
で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加え
る。

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血清を含むMEM
培地［Science,122,501（1952）］,DMEM培地［Virolog
y,８,396（1959）］,RPMI11640培地［J.Am.Med.Assoc.,
199,519（1967）］,199培地［Proc.Soc.Exp.Biol.Med.,
73,1（1950）］、などが挙げられる。pHは約６〜８であ
るのが好ましい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時
間行い必要に応じて通気や撹拌を加える。

本発明のヒトPDIタンパク質は細胞内または細胞外に
生成、蓄積する。細胞内PDIを培養物から抽出するに際
しては、培養後公知の方法で細胞を集め、塩酸グアニジ
ンや尿素などの蛋白変性剤を含む緩衝液やトライトン−
100などの界面活性剤を含む緩衝液中に細胞を懸濁させ
たのち、遠心分離によりヒトPDIを含む上澄液を得る方
法、あるいはガラスビーズによる破砕，超音波処理，リ
ゾチームなどの酵素処理や凍結融解放によって細胞を破
壊したのち、遠心分離によりヒトPDIを含む上澄液を得
る方法などを適宜用い得る。

これらの上澄液や細胞外に生成，蓄積したヒトPDIを
分離，精製するには自体公知の分離，精製法を適切に組
み合わせて実施すればよい。これらの公知の分離，精製
法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度の差を利用
する方法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法およびSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分
子量の差を利用する方法，イオン交換クロマトグラフィ
ーなどの荷電の差を利用する方法，アフィニティークロ
マトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法，逆
相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用
する方法，等電点電気泳動法などの等電点の差を利用す
る方法，ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど
の特異的吸着性を利用する方法などが挙げられる。特に
ヒトPDIタンパク質は酸性タンパク質であると考えられ
るため、ジエチルアミノエチル（DEAE）セルロース,DEA
Eトヨパール（Toyopearl），カルボキシメチル（CM）セ
ルロース,CMトヨパールなどのイオン交換クロマトグラ
フィーが該蛋白質の精製に有効である。

上記で得られるヒトPDI蛋白質の活性（PDI活性）は、
基質として還元型およびスクランブル型リボヌクレアー
ゼを用いて活性型リボヌクレアーゼに変換する速度を測
定することにより求められる［Biochem.J.,159,377（19
76）;Proc.Natl.Acad.Sci.USA,83,7643（1986）;Method
s in Enzymology,107,281（1984）;J.Biol.Chem.,234,1
512（1959）］。

作用および効果本発明のヒトPDIタンパク質は、任意の目的タンパク
質中に存在するスルフヒドリルおよびジスルフィド間の
交換反応を触媒して最も安定性が高い天然型のジスルフ
ィド結合を形成する。さらに詳しくは、該タンパク質は
溶存酸素や酸素型グルタチオン（GSSG）−還元型グルタ
チオン（GSH）混合物やジチオスレイトール（DTT）,2−
メルカプトエタノール，アスコルビン酸などの還元剤の
存在下で、還元タンパク質に作用して天然型のジスルフ
ィド結合を形成する反応を触媒したり、既にジスルフィ
ド結合とりわけ非天然型のジスルフィド結合を有する酸
化型タンパク質に作用して天然型のジスルフィド結合を
再形成する反応を触媒する。

従って、分子中にジスルフィド結合を有するタンパク
質を遺伝子組換え技術を用いて製造するに際して、とり
わけ組み換えDNAの宿主が大腸菌，枯草菌やバチルス・
ブレビス（Bacillus brevis）などの原核細胞である場
合に、そのタンパク分子中に天然型ジスルフィド結合を
効率よく形成する目的でヒトPDIタンパク質を使用し得
る。上記タンパク質としては、インターフェロン−α，
インターフェロン−β，インターフェロン−γ，インタ
ーロイキン−1,インターロイキン−2,B細胞増殖因子（B
GF）,B細胞分化因子（BDF），マクロファージ活性化因
子（MAF），リンホトキシン（LT），腫瘍壊死因子（TN
F）などのサイトカインや、トランスホーミンググロー
スファクター（TGF），エリスロポエチン，上皮細胞増
殖因子（EGF），フイブロブラスト増殖因子（FGF），イ
ンスリン，ヒト成長ホルモンなどのペプチドタンパクホ
ルモンや、Ｂ型肝炎ウイルス抗原などの病原微生物抗原
タンパク質や、ペプチダーゼやリゾームなどの酸素や、
ヒト血清アルブミン，免疫グロブリンなどの血中タンプ
ク成分が挙げられる。

ここで用いられる該PDIタンパク質は、精製タンパク
質でも部分精製タンパク質でもよく、細胞内や細胞外に
生成，蓄積する上記の目的タンパク質やその精製標品に
該PDIタンパク質を直接作用させればよい。該PDIタンパ
ク質をコードする組換えDNAを含有する宿主に、上記の
目的タンパク質をコードする組み換えDNAを二重に感染
させた形質転換体を用いて反応させることもできる。

明細書および図面で用いる記号の意義は第１表に示す
とおりである。

第１表 PBS :リン酸緩衝食塩液 DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 mRNA:メッセンジャーRNA dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニルアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アサパラギン Gln :グルタミンなお、本発明のPDIタンパク質においては、そのアミ
ノ酸配列の一部（５％程度まで）が修飾（付加，除去，
その他のアミノ酸への置換など）されていてもよい。

実施例以下に参考例をおよび実施例を示して本発明をさらに
詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるべきの
もではない。

参考例１ウシ肝臓mRNA由来のcDNAライブラリーの作製ウシ肝臓よりRNAをグアニジンイソチオシアネート法
［Chirgwin,J.M.ら,Biochemisty,18,5294（1979）］を
用いて抽出した。このRNAよりポリ（Ａ）RNAをオリゴdT
セルロースカラムクロマトグラフィーにより精製した
［AvivとLeder,Poco.Natl.Acad.Sci.USA,69,1408（197
2）］。

このポリ（Ａ）RNAを鋳型としてcDNAをGubler,UとHof
fman,B.J.の方法［Gene,25,263（1983）］で調製し、次
にHuynh,T.V.らの方法［DNA Cloning I,a practical ap
proch,１,49（1985）］に従って上記cDNAにEcoR Iリン
カーを付加したのち、λgt11のEcoR I部位にクローニン
グし、cDNAライブラリーを作製した。

参考例２ウシPDIcDNAを含むプラスミドの単離とその
塩基配列の決定大腸菌Y1096に参考例１で得たλgt11のcDNAライブラ
リーを感染させたのち、Ｌブロスの軟寒天プレートにま
いた。プラークが出現しはじめた時に、IPTG（Isopropy
lthiogalactoside）を含むニトロセルロース膜をプレー
トの上にのせ、３時間インキュベーションした。次に、
ニトロセルロース膜をはずし、TBS緩衝液（50mM Tris p
H7.9,150mM,NaCl）で洗浄し、つづいて３％ゼラチン溶
液につけた。

このように処理したニトロセルロース膜をT3結合蛋白
質に対する抗体（anti−BLT₃R）溶液［Horiuchi,R.and
Yamauchi,K.,Gunma Symposia on Endocrinology,23,p.1
49（1986）］に浸し、抗原抗体反応させた。次に、該膜
を蒸留水とTBS緩衝液で洗浄した後、２次抗体と反応さ
せ、発色する陽性クローンλgt11 T3BP−１を選択し
た。λgt11 T3BP−１中のcDNAをEcoR Iで切り出し、プ
ラスミドpUC19［Gene,33,103（1985）］のEcoR I部位に
リクローニングし、プラスミドpT3BP−１を作製した。
該プラスミドに含まれるcDNA部分のうち、制限酵素EcoR
I−Pvu II断片をDNAプローブに用いて、５×10⁵個の実
施例１に記載のcNDAライブラリーを再度スクリーニング
して、陽性のクローンを選択した。

このようにして得られたクローンの一つであるλgt11
T3BP−２からSac I−Kpn IでcDNAを切り出し、プラス
ミドpUC19のSac I−Kpn I部分にリクローニングし、プ
ラスミドpT3BP−２を作製した。（なお、λgt11 H3BP−
２にクローニングされたcDNAの５′末端側EcoR I認識部
位は破壊されていた） E.coli K12 DH5αをプラスミドpT3BP−２で形質転換
させ、得られた組み換え体E.coli K12 DH5α/pT3BP−２
よりプラスミドpT3BP−２をアルカリ法［Birnboim,H.C.
and Doly,J.,Nucl.Acids Res.,11,1513（1979）］によ
って抽出精製した。このプラスミドに含まれるcDNA部位
は全長約2.8Kbpであり、その簡単な制限酵素地図を第１
図に示した。

このcDNA部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド合
成鎖停止法［Messing,J.ら、Nucl.Acids Res.,９,309
（1981）］によって決定した。決定された塩基配列より
推測されるアミノ酸配列を第２図に示した。

該ポリペプチドのアミノ酸配列は、ラットPDIのそれ
と90％以上の相同性を有しているが、甲状腺ホルモン結
合能を有するチロキシン結合グロブリン（TBG），チロ
キシン結合プレアルブミン（TBPA）やＣ−erbA蛋白質の
アミノ酸配列との相同性は認められなかった。

プラスミドpT3BP−２を保持するEscherichia coli K1
2 DH5α/pT3BP−２）は財団法人発酵研究所（IFO）に受
託番号IFO 14563として寄託され、また、通商産業省工
業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に受託番号FEPM
BP−1595として寄託されている。

なお、pT3BP−１に含まれるcDNAのEcoR I−Pvu II断
片はpT3BP−２をKpn IおよびSac I処理した後、EcoR I
およびPvu II処理することにより得ることもできる。

実施例１ヒトPDI cDNAを含むプラスミドの単離とそ
の塩基配列の決定ヒト胎盤mRNAをもとに作製されたλgt11のcDNAライブ
ラリー（Toyobo Co.,Ltd.Japanより購入）を、大腸菌Y1
096を宿主として、軟寒天プレート上に約１×10⁵クロー
ンずつ４枚まき、これをニトロセルロースフィルター
（ミリポア社,HATFフィルター）上に移した後、0.5N Na
OH溶液に溶解し露出変性したファージDNAをフィルター
上に乾燥固定した（Maniatisら，「モレキュラー・クロ
ーニング（Molecular Cloning）」Cold Spring Harbor
Laboratory,p.320,1982）。一方、参考例２に記載のプ
ラスミドpT3BP−１に含まれるcDNA部分のうち、制限酵
素EcoR IおよびPvu IIで切断して得られるDNA断片をニ
ックトランスレーション法（Maniatisら，同上p.109）
により³²P標識しプローブとした。

標識したプローブと、DNAを固定したフィルターを、
標識プローブを含む、５×SSPE（0.9M NaCl,50mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.4）,5mM EDTA）,50％ホルムア
ミド,5×Denhardt液,0.1％SDS,100μg/ml変性サケ***D
NA溶液10ml中で42℃,16時間，会合反応を行い、反応
後、フィルターを２×SSC（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015
Mクエン酸ナトリウム）,0.1％SDS溶液中で室温で30分ず
つ２回,1×SSC,0.1％SDS溶液中で68℃で30分ずつ２回洗
浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオオ
ートグラムをとり、プローブと反応するクローンを検索
した。この方法により得られたクローンλgt11 T3BP−
３よりDavisらの方法（Davisら，「アドバンスト・バク
テリアル・ジェネティクス（Advanced Bacterial Genet
ics）」Cold Spring Harbor Laboratory 1980）により
ファージDNAを抽出した。次にλgt11 T3BP−３からEcoR
IでcDNAを切り出し、プラスミドpUC19のEcoR I部位に
リクローニングし、プラスミドpT3BP−３を作製した。
E.coli K12 DH5αをプラスミドpT3BP−３で形質転換さ
せ、得られた組換え体E.coli K12 DH5α/pT3BP−３より
プラスミドpT3BP−３をアルカリ法［Birnboim,H.C.and
Doly,J.,Nucl.Acids Res.,11,1513（1979）］によって
抽出精製した。このプラスミドに含まれるcDNA部分は全
長約2.4Kbpであり、その簡単な制限酵素地図を第４図に
示した。

このcDNA部分の塩基配列をジデオキシヌクレオチド合
成鎖停止法［Messing,J.ら,Nucl.Acids Res.,９,309（1
981）］によって決定した。決定された塩基配列より推
測されるアミノ酸配列を第５図に示した。

プラスミドpT3BP−３を保持するEscherichia coli K1
2 DH5α（Escherichia coli K12 DH5α/pT3BP−３）はI
FOに受託番号IFO 14610として寄託され、またFRIに受託
番号FERM BP−1841（FERM P−9386より移管）として寄
託されている。

実施例２動物細胞用発現プラスミドの構築：プラスミドpT3BP−3DNAを制限酵素EcoR Iで分解し、
第４図に示した2.4KbpのcDNAを分離した。このDNAを、
特開昭61−63282号公報に記載のプラスミドpTB106のイ
ンターロイキン−２遺伝子領域の５′末端側のPst I切
断部位及び３′末端側のBamH I切断部位をEcoR Iに変換
しインターロイキン−２遺伝子領域を除去したプラスミ
ドpTB389を制限酵素EcoR Iで切断し５′末端のリン酸基
をアルカリ性ホスファターゼ処理により除去したものと
混合し、T4DNAリガーゼを作用させて、プラスミドpHB74
5を構築した（第６図）。

実施例３ヒトPDIをコードする遺伝子の動物細胞にお
ける発現：サルCOS−７細胞を10％胎児牛血清を含むDMEM培地で
単層培養した後、同培地で培地交換した。交換の４時間
後に公知の方法［Grahanら,Virology,52,456（1973）］
に伴いプラスミドpTB745のDNA 10μｇを含むカルシウム
ホスフェートゲルを調製し細胞に添加し、pTB745感染CO
S−７細胞を得た。さらにその４時間後グリセロール処
理して0.5％胎児牛血清を含む培地で上記pTB745感染COS
−７細胞の培養を続けた。

48時間後に、pTB745感染COS−７細胞を3.5％ホルマリ
ンを含むPBSで室温で15分間固定した。その後0.1％サポ
ニンを含むPBSで室温で10分間処理した後、前記した抗
ウシT3BPウサギ抗体を４℃で２時間反応させた。PBSで
未反応抗体をよく洗い落した後、FITCラベル抗ウサギIg
Gヒツジ抗体を一晩反応させ、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を第７図に示したが、対照のCOS細胞に比べ、ヒトP
DI遺伝子を導入した細胞では明らかに強い蛍光が観察さ
れ、COS細胞中でヒトPDI蛋白が合成されていることが判
明した。

実施例４ヒトPDI遺伝子の大腸菌用発現プラスミドの
構築：前記実施例１で得られたヒトPDIcDNAを含むプラスミ
ドpT3BP−３を制限酵素Ava Iで切断し、ヒトPDIをコー
ドする領域の前半を含む0.85Kbp DNA切断を得た。このD
NA断片を用いて、dATP,dCTP,dGTPおよびdTTPの存在下に
DNAポリメラーゼ（Klenowフラグメント）反応を行い、A
va I切断部位を平滑化した。このDNAにリン酸化反応後
の合成オリゴヌクレオチド ^５′AATTCTATGGCGC³′および ^５′GCGCCATAG³′を T4DNAリガーゼにより結合させ、EcoR IおよびCla Iで
切断して0.49Kbp DNA断片を分離精製した。また別にプ
ラスミドpT3BP−３をCla IおよびPst Iで切断し、PDIを
コードする領域の後半を含む1.47Kbp DNA断片を調製し
た。一方、trpプロモーターを有するプラスミドptrp781
［kurokawa,T.らNucleic Acids Res.,11:3077−3085（1
983）］DNAをEcoR IおよびPst Iで切断し、trpプロモー
ター、テトラサイクリン耐性遺伝子およびプラスミド複
製開始部位を含む約3.2Kbp DNAを分離した。ヒトPDIを
コードする遺伝子を含む前記0.49Kbp EcoR I−Cla I DN
A断片および1.47Kbp Cla I−Pst I DNA断片と、この3.2
Kbp EcoR I−Pst I DNA断片をT4DNAリガーゼ反応により
結合させ、ヒトPDI発現プラスミドpTB766を構築した
（第８図）。このプラスミドを用いて大腸菌K12DH1株お
よびMM294株を形質転換させることによりプラスミドpTB
766を含む菌株Escherichia coli K12 DH1/pTB766および
MM294/pTB766を得た。

プラスミドpTB766を保持するEscherichia coli K12 M
M294（Escherichia coli MM294/pTB766）はIFOに受託番
号IFO 14611として寄託され、またFRIに受託番号FERM B
P−1842（FERMP−9391より移管）として寄託されてい
る。また、プラスミドptrp781を保持するEscherichia c
oli K12 DH1（Escherichia coli DH1/ptrp781）はIFOに
受託番号IFO 14546として、またFRIに受託番号FERM BP
−1591（FERM P−9055より移管）として寄託されてい
る。

実施例５大腸菌の³⁵S−メチオニンラベルと免疫沈降反応発現プラスミドpTB766を含む大腸菌MM294あるいはDH1
を８μg/mlテトラサイクリン,0.2％カザミノ酸,1％グル
コースを含むM9培地で37℃で培養し、Klett値が200のと
き、IAA（３β−インドリルアクリル酸）を25μg/mlに
なるように添加した。添加２時間後、³⁵S−メチオニン
を15μCi/mlとなるように加え、30分間合成される蛋白
質をラベルした。ラベル後、菌体を集め、0.15M NaCl溶
液で洗い、培養液の1/5量の10mM Tris−HCl pH8.0,10％
蔗糖溶液に菌体を懸濁し、フェニルメチルスルホニルフ
ルオライド（PMSF）,NaCl,EDTAをそれぞれ1mM,0.2M,10m
Mとなるように添加し、さらにリゾチームを150μg/mlに
加えて０℃、１時間作用させた。この懸濁液を31℃で２
分間処理したのち、軽く（約10秒間）超音波処理を行
い、遠心して菌体抽出液を得た。この抽出液に抗ウシT3
BPウサギ抗体［Horiuchi,R.and Yamauchi,K.,Gunma Sym
posia on Endocrinology,23,149（1986）］を加えて４
℃一晩反応させ、さらにStaphylococcal菌体（プロテイ
ンＡ）を加え、０℃、３時間、抗原・抗体結合物を菌体
に接合させた。菌体を50mM Tris−HCl pH7.4,5mM EDTA,
150mM NaCl,0.05％ノニデットＰ−40（シェル石油）,1m
g/mlオボアルブミン溶液を用いて遠心洗浄をくり返した
のち、電気泳動用試料溶液（0.0625M Tris−HCl,pH6.8,
2％SDS,5％２−メルカプトエタノール0.001％ブロモフ
ェノールブルー,10％グリセロール）中で100℃,5分間処
理して、結合物を溶出した。得られた免疫沈降物を10〜
20％グラジエントのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳
動を用いて解析した。泳動後、ゲルを50％トリクロロ酢
酸溶液で固定し、フルオログラフィー法を用いてラジオ
オートグラムをとった。第９図に示された結果から、発
現プラスミドを有する２種の菌株,DH1/pTB766,MM294/pT
B766のいずれにおいても予想される大きさ（約60KDa）
のPDIが産生されていることが明らかになった。

実施例６ヒトPDI遺伝子の酵母発現用プラスミドの構
築：前記実施例１で得られたヒトPDIcDNAを含むプラスミ
ドpT3BP−３を制限酵素Sac Iで消化した後、T4ポリメラ
ーゼ反応により平滑末端にしてGGTCGACCの配列をもつSa
l Iリンカーを結合し、さらに制限酵素Sal IとCla Iで
消化して0.65KbpのDNA断片を調製した。また、実施例２
に記載のプラスミドpTB745のDNAを制限酵素Sca IとCla
Iで消化して3.8KbpのDNA断片を分離した。さらにプラス
ミドpGLD906−１［Biochem.Biophys.Res.Commun.,138,2
68（1986）］のDNAを制限酵素Sal IとSca Iで消化して
調製した6.2KbpのDNA断片と上記の２本のDNA断片をT4DN
Aリガーゼを用いて結合し、酵母発現用プラスミドpTB76
7を構築した（第10図）。このプラスミドを用いてAH22R
^-株を形質転換させることによりプラスミドpTB767を含
む酵母株Saccharomyces cerevisiae AH22R^-/pTB767を得
た。

プラスミドpTB767を保持するSaccharomyces cerevisi
ae AH22R^-（Saccharomyces cerevisiae AH22R^-/pTB76）
はIFOに受託番号IFO 10425として寄託され、またFRIに
受託番号FERM BP−1843（FERM P−9603より移管）とし
て寄託されている。

実施例７酵母の³⁵S−メチオニンラベルと免疫沈降反
応：発現プラスミドpTB767を含む酵母AH22R^-を低Pi培地
［Biochem.Biophys.Res.Commun.,138,268（1986）］を
用いて37℃で一晩培養した後、³⁵S−メチオニンを20μC
i/mlとなるように加え、合成される蛋白質をラベルし
た。ラベル後菌体を集め、0.15M NaCl溶液で洗い、培養
液の1/5量の7Mグアニジン塩酸を加えた。０℃で１時間
おいて菌体をとかした後、10,000rpm10分間遠心した。
上清を10mM Tris・HCl（pH8.0）,1mM EDTA,200mM NaCl
および1mM PMSFを含む液に対し透析して、菌体抽出液を
得た。この抽出液に抗ウシT3BPウサギ抗体（実施例５に
記載）を加え、実施例５に記載の方法に従い免疫沈降物
を得て、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動およびラ
ジオオートグラムにより解析した。その結果、発現プラ
スミドを有する酵母AH22R^-/pTB767に特異的なポリペプ
チドの合成が認められ、ヒトPDIが産生されていること
が明らかになった。

なお、使用した低Pi培地の組成は以下のとおりであっ
た。

低Pi培地［１当たり］ KCl 1.5g グルコース 20 g アスパラギン 2 g Ｌ−ヒスチジン 100mg KI（1mg/ml） 100μ MgSO₄・7H₂O（500mg/10ml） 10ml CaCl₂・2H₂O（330mg/10ml） 10ml 微量元素溶液（ａ） 1ml ビタミン溶液（ｂ） 1ml 微量元素溶液（ａ）［１当たり］ CuSO₄・5H₂O 40mg FeSO₄・7H₂O 250mg MnSO₄・4H₂O 40mg （NH₄）₃PO₄・12MoO₃・3H₂O 20mg ZnSO₄・7H₂O 310mg ビタミン溶液（ｂ）［１当たり］イノシトール 10g チアミン 200mg ピリドキシン 200mg パントテン酸カルシウム 200mg ニアシン 200mg ビオチン 2mg 実施例８大腸菌MM294/pTB766由来PDIの精製実施例４で得られたヒトPDI発現プラスミドpTB766を
含む大腸菌MM294を5mg/のテトラサイクリン,10g/の
バクトトリプトン,5g/のバクトイーストエキスおよび
5g/の食塩からなる１の培地で37℃で11時間培養し
た。この培養液はさらに、2mg/のビタミンB₁,10g/
のグルコース,10g/のカザミノ酸を含むＭ−９培地20
に移しさらに37℃で９時間通気撹拌培養した。培養液
を遠心し、菌体385gを得た。

菌体30gを0.15M NaCl−10mM EDTA−1mM PMSF−0.1mM
（ｐ−アミジノフェニル）メタンスルホニルフルオライ
ド塩酸塩（APMSF）−20mM Tris−HCl（pH7.4）150mgに
均一に懸濁し、０℃で超音波処理（１分間を４回）を行
い、遠心して菌体抽出液156mlを得た。

抽出液を0.15M NaCl−1mM CaCl₂−0.1mM APMSF−10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で平衡化したセルロ
ファインGCL−2000−sf（生化学工業株式会社）カラム
（６×102cm,2880ml）に負荷し、同一緩衝液で溶出し
て、ヒトPDI画分325mlを集めた。

次に上記溶出画分を0.15M NaCl−1mM CaCl₂−0.1mM A
PMSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で平衡化
したハイドロキシアパタイト（バイオ・ラット社，アメ
リカ）カラム（1.5×14cm,25ml）に通して、ヒトPDIを
吸着させ、カラムを上記平衡化緩衝液で洗浄した。次い
で10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）200mlと300mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）200mlとによる直線濃
度勾配溶出法によりヒトPDIを溶出した。

溶出液を0.1mM APMSF−10mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.8）に対して一夜透析し、上記緩衝液で平衡化し
たDEAE−トヨパール（東ソー）カラム（1.5×15cm,26.5
ml）に通して、ヒトPDIを吸着させ、カラムを上記緩衝
液で洗浄した。次いで、0.1mM APMSF−10mMリン酸ナト
リウム緩衝液（pH6.8）200mlと0.5M NaCl−0.1mM APMSF
−10mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）200mlとによる
直線濃度勾配溶出法によりヒトPDIを溶出した。

ヒトPDI画分を0.1mM APMSF−10mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH6.8）に対して一夜透析し、0.09M NaCl−10mM
リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.8）で平衡化したDEAE−N
PR HPLC用カラム（東ソー,0.46×3.5cm）に吸着させ、3
0分間でNaCl濃度を0.39Mまで上昇させることによりヒト
PDIを溶出した。ヒトPDI画分を分取し、除菌ろ過して、
蛋白濃度16μg/mlのヒトPDI精製標品液17.1mlを得た
（蛋白量1.8）。得られた精製標品はSDS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動で単一バンドを示した（第11図）。

実施例９大腸菌MM294/pTB766由来PDIの精製実施例８で得られた菌体30gを0.15M NaCl−10mM EDTA
−1mM PMSF−0.1mM APMSF−20mM Tris−HCl（pH7.4）16
0mlに均一に懸濁し、直径0.25〜0.50mmのガラスビーズ
の入ったビード・ビーター（バイオスペックプロダクト
社，アメリカ）で０℃にて30分間処理をした。この処理
液を遠心して抽出液84mlを得た。

抽出液を実施例８と同一の操作によりヒトPDIを精製
し、蛋白濃度111μg/mlのヒトPDI精製標品液9mlを得た
（蛋白量1.0mg）。

実施例10 PDIの蛋白化学的性質実施例８で得られたヒトPDIについて以下の蛋白化学
的性質を調べた。

（１）分子量還元条件下でSDS−ポリアルリルアミドスラブゲル電
気泳動を行った［Nature,227,680（1970）］あと、コマ
ジーブリリアントブルーＲ−250染色した結果、ヒトPDI
蛋白質は分子量約55000ダルトンにバンドを示した（第1
1図）。

（２）アミノ酸組成：ヒトPDI蛋白質を４％チオグリコール酸を含む6N塩酸
中110℃で24,48および72時間加水分解したのち日立835
型アミノ酸分析計を用い、ニンヒドリン法によりアミノ
酸組成を分析した。なお、セリンおよびスレオニン加水
分解を０時間に外挿して求めた。さらにシステインは過
ギ酸酸化したのち6N塩酸で加水分解し、アミノ酸分析計
によりシステイン酸として定量した。得られたアミノ酸
組成値を第２表に示す。

（３）アミノ末端アミノ酸配列分析ヒトPDI蛋白質102μｇ（1.85nmole）に気相プロティ
ンシークエネーター（アプライド・バイオシステムズ社
勢,470A型，アメリカ）を用いる自動エドマン分解法を
適用して、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。フェニルチ
オヒダントインアミノ酸（PTH−アミノ酸）はミクロパ
ックSP−ODSカラム（バリアン社，アメリカ）を用いるH
PLCにより同定した。各ステップで検出されたPTH−アミ
ノ酸を第３表に示す。

（４）カルボキシ未端アミノ酸分析ヒトPDI蛋白質151μｇ（2.75nmole）をヒドラジン分
解法［J.Biochem.,59,170（1966）］により分析した。
その結果、カルボキシ末端アミノ酸はロイシンであった
（回収率:46％）。

（５）紫外線吸収スペクトル第12図に示す如く、本物質は10mMリン酸ナトリウム緩
衝液（pH6.8）中で280nm付近に吸収極大をもち、250nm
付近に吸収極小をもつ典型的な蛋白質の吸収スペクトル
を示している。

実施例11 PDIによるスクランブル型リボヌクレアーゼ
のリフォールディング実施例８で得たヒトPDIについて、スクランブル型リ
ボヌクレアーゼのリフォールディング作用を測定した。

（１）材料スクランブル型リボヌクレアーゼ（SRNase）はHillso
nらの方法［Methods in Enzymology,107,281−294（198
4）］に従ってウシ膵臓リボヌクレアーゼを用いて調製
した。

（２）リボヌクレアーゼ（RNase）活性の測定 RNaseの活性は酵母poly RNAを基質とするKalniskyら
の方法［J.Biol.Chem.,234,1512−1516（1959）］に従
って測定した。

（３）緩衝液（ａ）10mM EDTAを含む100mMリン酸ナトリウム緩衝液
（pH7.8）。

（ｂ）0.2M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）。

（ｃ）0.1M酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）。

（４）測定法試験管内にヒトPDI溶液10μ（111μｇヒトPDI/m
l），緩衝液（ａ）168μおよび1mM DTT2μを混合
し、30℃の水浴上で５分間予備加温したのち、0.5mg/ml
のSRNaseを20μ添加し、30℃で60分間加温した。緩衝
液（ｂ）を800μ添加し、反応をストップさせた。

この反応液中のRNaseの活性は以下のようにして測定
した。すなわち、上記反応液200μを遠心チューブに
入れ、37℃で５分間予備加温した。１％になるように酵
母poly RNAを緩衝液（ｃ）に溶解した基質溶液も37℃
で５分間予備加温した。予備加温後、反応液の200μ
の基質溶液を加え、37℃で４分間反応させたのち、0.75
％酢酸ウラニウムを含む25％過塩素酸溶液200μを添
加した。添加後、遠心チューブを５分間氷冷し、16000r
pmで５分間遠心したのち、その上清を蒸留水で30倍に希
釈して、波長260nmにおける吸光度を測定した。

以上の方法で、実施例８で得られたヒトPDIの活性を
測定した結果、第４表に示しとおりヒトPDIは活性の認
められなかったSRNaseを10^-5Mのジチオスレイトール（D
TT）存在下で明らかに活性を持ったRNaseに変換するこ
とが確認された。

実施例12 PDIによるスクランブル型組み換えインター
ロイキン−２のリフォールディング実施例８で得たヒトPDIについてスクランブル型組み
換えインターロイキン−２（rIL−２）のリフォールデ
ィング作用について測定した。

（１）材料スクランブルン型rIL−ＬはJ.L.Brawningらの方法［A
nal.Biochem.,155,123−128（1986）］に従ってrIL−２
［Biochem.Biophys.Res.Commun.,130,692−699（198
5）］を用いて調製した。

（２）IL−２活性の測定多田らによって改良されたマウスNKC3細胞を用いるMT
T変法［J.Immunol.Methods,93,157−165（1986）］によ
り測定した。

（３）緩衝液 30mM Tris−酢酸緩衝液（pH9.0）（４）測定法試験管内にヒトPDI溶液（111μg/ml）を20〜100μ
，緩衝液を1000μ,1mM DTTを30μ加え、液量が2
850μになるように蒸留水で希釈したのち、スクラン
ブル型rIL−２（200μg/ml）を150μ添加し、30℃で1
9時間反応させた。各試験管についてIL−２活性をMTT変
法により測定した。

その結果、第５表に示すとおりヒトPDI濃度に依存し
てスクランブル型rIL−２が活性型rIL−２に変換するこ
とが確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は参考例２で得られたpT3BP−１およびpT3BP−２
中にクローニングされたcDNAの簡単な制限酵素地図を示
す。図中、（１）はpT3BP−１にクローニングされたcDN
Aを、（２）はpT3BP−２にクローニングされたcDNAを示
す。略号A,E,H,PおよびＳはそれぞれAat II,EcoR I,Hin
c II,Pvu IIおよびSsp Iを示し、■は精製T3BPタンパク
質のトリプテック・ペプチド・マッピングにより得られ
たアミノ酸配列と一致する部分を示す。第２図は参考例２で得られたpT3BP−２中にクローニン
グされたcDNAの塩基配列およびその配列より推測される
アミノ酸配列を示す。第３図はヒトPDIのアミノ酸配列を示し、第４図は実施
例１で得られたpT3BP−３中にクローニングされたcDNA
の簡単な制限酵素地図を示す。第４図中、略号B,C,E,H
およびＰはそれぞれBamH I,Cla I,EcoR I,Hind IIIおよ
びPst Iを示す。第５図は実施例１で得られたpT3BP−３中にクローニン
グされたcDNA塩基配列およびその配列より推測されるア
ミノ酸配列を示す。第６図はヒトPDI遺伝子の動物細胞発現用プラスミドの
構築を示す。第７図はヒトPDI遺伝子を導入したCOS−７細胞で合成さ
れたヒトPDIを蛍光抗体法で検出した結果（蛍光顕微鏡
写真）を示す。（１）はPDI遺伝子導入細胞（生物）の
形態を示す蛍光顕微鏡写真を示し、（２）は対照とした
遺伝子非導入細胞（生物）の形態を示す蛍光顕微鏡写真
を示す。第８図はヒトPDI遺伝子の大腸菌発現プラスミドの構築
を示す。第９図は大腸菌で産生されたヒトPDIの免疫沈降法によ
る検出を示す。レーンＢおよびＤはそれぞれDH1/pTB766
およびMM294/pTB766を、レーンＡおよびＣはそれぞれDH
1/ptrp781およびMM294/ptrp781を示す。第10図はヒトPDI遺伝子の酵母発現用プラスミドの構築
を示す。第11図はPDIのSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を
示し、レーン１は精製PDIを、レーン２はマーカー蛋白
を示す。第12図は精製PDIの紫外線吸収スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/90 Ｃ１２Ｒ 1:19）微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１８４２微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１８４３微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１５９１微生物の受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１５９５ (72)発明者五十嵐貢一京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地の３ (56)参考文献ＥＭＢＯ．Ｊ．，６（３）（Ｍａｒｃｈ，1987）Ｐ．643−649 Ｎａｔｕｒｅ，317（6030）（1985），Ｐ．267−270 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/61 C12N 9/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含有する組み換えDNA。
【請求項２】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含有する、請求項１記載の組み換えDNA。
【請求項３】微生物中で複製可能なベクターである、請
求項１記載の組み換えDNA。
【請求項４】微生物が大腸菌である、請求項３記載の組
み換えDNA。
【請求項５】ベクターが大腸菌（Escherichia coli）MM
294/pTB766（IFO 14611,FERM BP−1842）またはサッカ
ロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）AH
22R^-/pTB767（IFO 10425,FERM BP−1843）が保持してい
るプラスミドである、請求項３記載の組み換えDNA。
【請求項６】ベクターが下記のアミノ酸配列をコードす
る塩基配列を含有する、請求項３記載の組み換えDNA。
【請求項７】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配列
を含有するベクターで形質転換された形質転換体。
【請求項８】形質転換体が微生物が大腸菌である、請求
項７記載の形質転換体。
【請求項９】大腸菌（Escherichia coli）MM294/pTB766
（IFO 14611,FERM BP−1842）またはサッカロミセス・
セレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）AH22R^-/pTB76
7（IFO 10425,FERM BP−1843）である、請求項７記載の
形質転換体。
【請求項１０】ベクターが下記のアミノ酸配列をコード
する塩基配列を含有する、請求項７記載の形質転換体。
【請求項１１】下記のアミノ酸配列を含有するポリペプ
チド。
【請求項１２】微生物から生産される、請求項11記載の
ポリペプチド。
【請求項１３】微生物が大腸菌である、請求項12記載の
ポリペプチド。
【請求項１４】下記のアミノ酸配列を有する、請求項11
記載のポリペプチド。
【請求項１５】下記のアミノ酸配列をコードする塩基配
列を含有するベクターで形質転換された転換転換体を培
養し、培養物中に該アミノ酸配列を含有するポリペプチ
ドを生成蓄積しめ、これを採取することを特徴とする該
ポリペプチドの製造法。
【請求項１６】形質転換体が大腸菌である、請求項15記
載の製造法。
【請求項１７】ポリペプチドが下記のアミノ酸配列を有
する、請求項15記載の製造法。
【請求項１８】形質転換体が大腸菌（Escherichia col
i）MM294/pTB766（IFO 14611,FERM BP−1842）またはサ
ッカロミセス・セレビシェ（Saccharomyces cerevisia
e）AH22R^-/pTB767（IFO 10425,FERM BP−1843）であ
る、請求項15記載の製造法。
【請求項１９】原核細胞で生産された真核生物のタンパ
ク質に下記のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを反
応させることを特徴とする、分子内に天然型ジスルフィ
ド結合を有する真核生物のタンパク質の製造方法。
【請求項２０】反応を還元剤の存在下で行う、請求項19
記載の製造方法。