JP2683934B2 - 免疫測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は臨床検査における免疫測定法、さらに詳しく
は固相と螢光粒子を用いた抗原抗体反応による免疫測定
方法に関するものである。

（従来の技術） 免疫測定方法の一つとしてラテックス免疫測定法はい
わゆるスライドガラス法と呼ばれる定性免疫測定法の外
に抗原抗体反応によって起る凝集を濁度の変化としてと
らえ、この変化を比濁法によって光学的に測定する定量
的免疫測定方法（例えばLPIA（Latex Photometric Immu
noassay）「検査と技術」誌第12巻,7号,581頁（198
4）、特開昭53−24015号、特開昭59−187264号など）、
さらに抗原抗体に関与したラテックス粒子の２個以上凝
集したものに着目し、ラテックスの凝集の度合いを電気
抵抗式あるいは光学式パーティクルカウンターを介して
数値化して測定する方法（例えばPACIA（Particle Coun
ting Immunoassay）,J.of Immuno.、Meth.,第18巻,33頁
（1977）,FCM（フローサイトメトリー）特開昭62−8156
7号）などがある。またこれら定量的測定を行なうため
に、特殊な比濁計や電気抵抗式あるいは光学式パーティ
クルカウンターなどの装置が種々用いられる。

（本発明が解決しようとする問題点） 比濁法を用いる測定方法は、現在汎用されている免疫
測定法の一つである酵素免疫測定（EIA）等に比較し
て、反応に要する時間が短かく、高度に自動化された装
置がある等の特徴を持つが、ラジオイムノアッセイ（RI
A）やEIAにくらべ免疫反応に関する感度が低く、高感度
を要する微量成分の検出には適切でない。またこの測定
方法は光学的に濁度を測定するため光散乱に影響を与え
る検体中の共存物質、例えば乳び血清、自己免疫複合体
等が測定結果に大きな影響を与えるという欠点を持って
いる。これらの影響を回避するために近赤外線を用いて
測定する方法や濁度の時間に対する変化率を計測するい
わゆるレート法を採用する等の工夫がなされているが、
未だ免疫反応における充分な感度が得られているとはい
えない。

一方、パーティクルカウンターを用いる測定方法はラ
テックス粒子の凝集物を計測するものであり、パーティ
クルカウンターの性能からくる制約により、通常１μｍ
程度のラテックス粒子が用いられ、原理的には極めて高
感度が期待できる。ラテックス粒子は微小なほど凝集反
応が迅速に進行するが、この凝集した粒子に由来するシ
グナルは小さく、この場合にも比濁法と同じようなラテ
ックス以外の共存物質はノイズを作り出す原因となるこ
と、また一般にこの方法を実施する際の装置は構造上極
めて細いノズル中に検体液を流す必要があるため、ゴミ
等によるノズルのつまりを生じやすい。また細いノズル
は流動状態における凝集を測定するため、凝集物がノズ
ルの通過の際分解をひき起すという欠点を持っていた。

また、粒子に螢光粒子を用い溶媒中に生ずる凝集像を
螢光顕微鏡・TVカメラを介して画像処理法により定量す
る方法は、原理的には極めて高感度であり、ノズルレベ
ルも検体の乳び等の影響を受けず充分低くすることが可
能であるが、粒子計数の速度が遅いため、粒度分布解析
に関与する粒子が全体に対し極めてわずかであり、少量
の凝集しか生じないような希薄な溶液状態においては凝
集が検出される確立が低く、実質的に感度の向上に限度
があった。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、従来のこれらの欠点の全てを完全に回避し
た固相と螢光粒子例えば螢光ラテックスの結合を観察す
ることによって達成される新規な高感度なさらには迅速
な免疫測定方法を提供することである。

本発明に使用する抗原または抗体を感作した螢光粒子
は特開昭62−81566号、特開昭62−81567号、特開昭62−
116264号、などに開示されている方法で製造してもよ
く、この螢光粒子例えば螢光ラテックスとしては前記に
開示されているポリスチレン以外にもスチレン−ブタジ
エン共重合体、スチレン−アクリル酸共重合体など、さ
らに螢光物質としてはフルオレセインやローダミン等の
有機螢光物質、シアン化白金やアルカリ土類金属の硫化
物等の無機螢光物質を単独または混合して用いることが
できる。

また螢光粒子としてはナフタールイミド型やベンゾト
リアゾール型の螢光染料の微結晶をそのまま抗原抗体感
作の担体として用いることもできる。

また本発明における固相としては、通常EIAのELISA用
に用いられるポリスチレン系の平底のマイクロプレー
ト、HLAタイピングに用いられる平底マイクロプレート
等が好適である。これらのプレートの平底のものは倒立
顕微鏡を用いることによってプレート面に結合した螢光
粒子を観察するのに便利である。

感作に用いられる抗原または抗体は限定的でなく、あ
らゆる抗原、抗体が使用できる。例えばそれらのものは
各種腫瘍マーカー、HBsなどの抗原、IgG,IgMなどの抗体
またはその分解物などであっても良い。感作方法は物理
的な吸着や、粒子上の官能基を利用した化学的反応が使
用できる。

用いられる螢光粒子の大きさは、通常ラテックス凝集
反応に用いられる粒径例えば１μｍより小さい方向に対
し、ほとんど制限は無い。それは各粒子が発する螢光量
が計測可能となる量であればよく、すなわち充分に強い
励起光を照射し、さらに粒子が充分に強い螢光を発し、
その粒径に関係なく点光源として観測できるものであれ
ば良い。

本発明を実施するための簡単な測定装置は螢光顕微鏡
とカメラをもって構成される。測定は、抗原抗体反応に
より固相へ結合した螢光粒子を、カメラで写しとり写真
上の点光源をカウントするものである。しかし好ましい
装置は螢光顕微鏡とそれに付加したTVカメラとこれに画
像処理装置を結合したものをもって構成される。第１図
は本発明を実施するための装置の概略図である。

本発明を実施するための装置は螢光顕微鏡２と付加し
たTVカメラ３で画像を写しとり、その画像データを処理
する画像処理装置４をもって構成しているが、さらに反
応を行なうためのキュベット１、測定結果を数値化する
ためのマイクロコンピュータ５、励起光を与えるための
紫外線源としては、例えば高圧水銀灯６、画像をモニタ
ーし、計算結果を表示するテレビ、計算結果を記録する
プリンターなどを付加することが望ましい。

本発明を実施するための装置をさらに詳しく説明すれ
ば、ここで用いられる反応キュベットは透明プラスチッ
クで構成されているところの平底のELISA用マイクロプ
レートあるいはHLAタイピング用のマイクロプレート等
である。また通常螢光顕微鏡を用いた自動測定にはオー
トフォーカス、オートステージを付加されたものを使用
するのが便利である。

上記反応キュベットと螢光顕微鏡とを用いた状態で得
られる画像はマイクロプレート底面に結合した螢光粒子
および溶液中に浮遊する螢光粒子であるが、反応の後、
反応液に黒色の色素を添加することによって、マイクロ
プレートに結合した螢光粒子の像を効率良く得ることが
できる。

感作した抗原および抗体を含むキュベット中の反応液
は、撹拌することが好ましく、その結果早く効率良く結
果を得ることができる。

励起光を与える装置としては高圧水銀灯などが用いら
れる。励起波長、強さの選択は螢光粒子に含まれる螢光
物質によって変化させることができる。さらに得られた
画像はTVカメラを介して画像処理装置に送られる。画像
処理装置はTVカメラからの出力を受取るビデオ入力部、
各々の画面のデータを記録するデジタル画像メモリー
部、そのデータを必要に応じてコンピュータに送るデー
タ出力部よりなり、その出力を処理するマイクロコンピ
ュータが付加されている。

次に画像処理の方法の一例について説明する。得られ
る画像はプレート底面に結合した螢光粒子の像とプレー
トに結合はしていないが画像取込時に偶然に固相表面に
位置していた螢光粒子像の両方である。

そこである位置で時間だけをづらして複数枚の画像を
取込む。プレートに結合している螢光粒子はその間に取
込まれた全ての画像にその像が存在し、偶然に固相表面
に位置していた螢光粒子像は画面毎に違って取込まれ
る。従ってこの複数枚の画像データの各々の画像の輝度
の平均値を求めると、事実上プレートに結合している螢
光粒子像のみを選び出すことができる。そして免疫成分
の力価と結合螢光粒子の数との関係をプロットし検量線
を描くことができる。

（作 用） 本発明は、螢光粒子を用いることにより、通常の免疫
測定法、特にラテックス凝集法などで問題になる共存物
質の影響を回避することができる。

これらの共存物質は本測定法における励起光の照射に
対して、螢光粒子に匹敵する強度の螢光を発することは
ない。またこれらの共存物質が螢光粒子の発する螢光を
散乱する２次的影響が理論的には考えられるが、これら
の効果は顕微鏡における測定が極めて薄い固相表面に近
い部分を層状に計測するため実際には全く問題にならな
い。このため螢光粒子とプレート固相表面の結合に関す
る情報が選択的に画像処理法によって得ることができ
る。

通常のラテックス凝集法は、RIA,EIAの固相法と違っ
てB/F分離を行なえないため、操作が簡単であるという
利点を持ってはいるものの、例えば血清との反応におい
ては、その極めて複雑な成分の非特異的な反応による凝
集の併発がある程度避けられない。このため血清試料を
大巾に希釈して使用するなど、感度を或る程度犠牲にし
て安定性を増すなどの工夫をせざるを得ない。これに対
し、本発明ではプレート表面に感作した抗原または抗体
とそれに対応する抗体または抗原の反応を行なった後、
サンドイッチ式に感作螢光粒子を結合させる方法である
ため必要に応じB/F分離（洗浄）の操作を入れることが
可能である。すなわち、試料中の濃度が高く、測定限界
との間に充分に余裕のあるような測定項目については洗
浄操作を省略し、操作の簡易性に重点を置くこともでき
るし、試料中の濃度が低く、高感度な計測が必要な場合
は洗浄操作を組込むこともできる。

抗原と抗体との反応は、この反応液を撹拌することに
より迅速に短時間に行うことができる。

（実施例） 以下実施例により本発明をさらにくわしく説明する。

実施例１ 抗ヒトα−フェトプロテイン（AFP）モノク
ローナル抗体感作ラテックス試薬（感作ラテックス）の
調製 抗ヒトα−フェトプロテイン（AFP）モノクローナル
抗体のトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液
（トリス緩衝液）（抗体濃度:100μg/ml）1mlに、平均
粒径が0.3μｍの螢光ポリスチレンラテックス（ポリサ
イエンス社製，固形分濃度:2.5重量％）100μを加
え、37℃において１時間撹拌後、遠心分離（12,000rpm,
30分）を行なった。

分離した抗AFPモノクローナル抗体感作ラテックスを
牛血清アルブミンを1.0重量％含むトリス緩衝液にて３
回洗浄後、0.002重量％になるように懸濁させ感作ラテ
ックスを調製した。

実施例２ 抗ヒトAFPモノクローナル抗体感作プレート
試薬（感作プレート）の調製 酵素免疫測定法で用いられる平底プレート（Nunc社
製）に、実施例１で使用した抗ヒトAFPモノクローナル
抗体とは抗原認識部位の異なる抗ヒトAFPモノクローナ
ル抗体のリン酸緩衝液（抗体濃度:10μg/ml）50μ/we
llを加え、室温において４時間静置後、0.01重量％のTw
een20を含むリン酸緩衝生理食塩水（Tw−PBS）にて３回
洗浄した。

その後1.0重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩
衝液100μ/wellを加え、４℃において１晩静置後、Tw
−PBSにて３回洗浄し、感作プレートを調製した。

実施例３ 標準曲線の作成（１） 実施例２で調製した感作プレートに1.0重量％の牛血
清アルブミンを含むトリス緩衝液を40μ/well加え、
更に濃度の異なるAFPを含む標準AFP溶液10μ/wellを
添加して室温において１時間、抗原−抗体反応を行ない
続いて実施例１で調製した感作ラテックスを50μ/wel
l添加して、撹拌下室温において30分から180分抗原−抗
体反応を行なった。

その後、黒インクを200μ/well添加し、倒立型の螢
光顕微鏡にセットして、ISO 3200の超高感度フィルムを
使用して撮影後、感作プレートに吸着した感作ラテック
スの数を測定し、第２図に示す標準曲線を得た。

実施例４ 標準曲線の作成（２） 実施例２で調製した感作プレートに1.0重量％のBSAを
含むトリス緩衝液を50μ/wellを加え、更に濃度の異
なるヒトAFPを含む標準AFP溶液５μ/wellを添加後、
室温にて１時間抗原抗体反応を行い、続いて実施例１に
て調製した感作ラテックスを50μ/well加え、撹拌下
室温にて３時間抗原抗体反応を行った。

その後、黒インクを200μ/wellを添加し、螢光顕微
鏡にセットして、感作プレートに固定された感作ラテッ
クスの数をコンピュータによる画像処理法によって測定
し、表１に示す結果を得た。

実施例５ 標準曲線の作成（３） 実施例２で調製した感作プレートに1.0重量％のBASを
含むトリス緩衝液を50μ/wellを加え、更に濃度の異
なるヒトAFPを含む標準AFP溶液５μ/well及び実施例
１にて調製した感作ラテックスを50μ/wellを加え、
撹拌下室温にて10分間抗原抗体反応を行った。

その後、黒インクを200μ/well添加し、螢光顕微鏡
にセットして、感作プレートに固定された感作ラテック
スの数をコンピュータによる画像処理法によって測定
し、表２に示す結果を得た。

実施例６ 全血及び血漿中のAFPの測定 実施例２で調製した感作プレートに1.0重量％のBASを
含むトリス緩衝液を50μ/well加え、更に濃度の異な
るヒトAFPを含む全血及び血漿を５μ/well（全血及び
血漿に精製したAFPを添加したもの）及び実施例１にて
調整した感作ラテックスを50μ/wellを加え、撹拌下
室温にて10分間抗原抗体反応を行った。

その後、黒インクを200μ/well添加し、螢光顕微鏡
にセットして、感作プレートに固定された感作ラテック
スの数をコンピュータによる画像処理法によって測定
し、表３に示す結果を得た。

実施例７ HBsモノクローナル抗体感作ラテックス（感
作ラテックス）試薬の調製 抗HBsモノクローナル抗体のトリス緩衝液（抗体濃度:
200μg/ml）1mlに、平均粒径が0.3μｍの蛍光ポリスチ
レンラテックス（ポリサイエンス社製、固形分濃度:2.5
重量％）100μｌを加え、37℃にて１時間撹拌後、遠心
分離（12,000rpm,30分）を行った。

分離した抗HBsモノクローナル抗体感作ラテックスをB
SA1重量％を含むトリス緩衝液にて３回洗浄後、0.002重
量％になるように懸濁させ感作ラテックスを調製した。

実施例８ 抗HBsモノクローナル抗体感作プレート（感
作プレート）試薬の調製 酵素免疫測定法で用いられる平底プレート（Nunc社
製）に、実施例７で使用した抗HBsモノクローナル抗体
とは抗原認識部位の異なる抗HBsモノクローナル抗体の
リン酸緩衝液（抗体濃度:10μg/ml）50μ/wellを加
え、室温において４時間静置後、0.01重量％のTw−PBS
にて３回洗浄した。

その後1.0重量％の牛血清アルブミンを含むリン酸緩
衝液100μ/wellを加え、４℃において１晩静置後、Tw
−PBSにて３回洗浄し、感作プレートを調製した。

実施例９ 標準曲線の作成（４） 実施例８で調製した感作プレートに1.0重量％のBASを
含むトリス緩衝液を50μ/well加え、更に濃度の異な
るHBsを含む標準HBs溶液５μ/wellを添加後、室温に
て１時間抗原抗体反応を行い、続いて実施例７にて調製
した感作ラテックスを50μ/wellを加え、撹拌下室温
にて３時間抗原抗体反応を行った。

その後、黒インクを200μ/wellを添加し、螢光顕微
鏡にセットして、感作プレートに固定された感作ラテッ
クスの数をコンピュータによる画像処理法によって測定
し、表４に示す結果を得た。

（発明の効果） 本発明は抗原抗体反応において、異なる時点における
反応画像を蛍光顕微鏡を介してカメラで撮影し、両反応
画像を比較し、異なる位置にある蛍光粒子を固相未結合
粒子として画像処理法により固相結合螢光粒子の数を抗
原または抗体量に関連づける免疫測定方法である。本発
明は、従来問題となっていた共存物質の影響を除き、迅
速なさらには高感度な測定方法であり、免疫測定の分野
に貢献するところが大きい。特にHBsの測定のように高
感度を要求される項目の測定にも充分対応できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法を実施するための装置の概略図、
第２図はAFP測定の標準曲線の一例を示すグラフであ
る。 1:キュベット、2:螢光顕微鏡、3:TVカメラ、4:画像処理
装置、5:マイクロコンピュータ、6:紫外線源

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 曽根 孝 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富 士レビオ株式会社内 (72)発明者 菊地 庸介 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富 士レビオ株式会社内 (72)発明者 高山 章子 東京都新宿区下落合４丁目６番７号 富 士レビオ株式会社内 審査官 山村 祥子 (56)参考文献 特開 昭59−160743（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−58237（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−213253（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−94264（ＪＰ，Ａ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】固相と蛍光粒子を用いた抗原抗体反応にお
   いて、異なる時点における反応画像を蛍光顕微鏡を介し
   てカメラで撮影し、両反応画像を比較し、異なる位置に
   ある蛍光粒子を固相未結合粒子として画像処理により排
   除することを特徴とする免疫測定方法。
2. 【請求項２】前記蛍光粒子は蛍光ラテックスである特許
   請求の範囲第１項記載の方法。
3. 【請求項３】前記カメラはTVカメラである特許請求の範
   囲第１項又は第２項に記載の方法。