JP2678249B2 - アンチトロンビン−▲iii▼製剤 - Google Patents
アンチトロンビン−▲iii▼製剤Info
- Publication number
- JP2678249B2 JP2678249B2 JP63155740A JP15574088A JP2678249B2 JP 2678249 B2 JP2678249 B2 JP 2678249B2 JP 63155740 A JP63155740 A JP 63155740A JP 15574088 A JP15574088 A JP 15574088A JP 2678249 B2 JP2678249 B2 JP 2678249B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antithrombin
- iii
- heat
- aqueous solution
- fraction
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤に関する。
ブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は65,000
〜68,000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロン
ビンの凝固活性を強く阻害する。
他の凝固因子、例えば、活性化X因子、活性化IX因子な
どに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミ
ンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告され
ている。
速やかに進行することが知られている。
は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症
(DIC)を目的として用いられるものである。
て、パイロジェン又は夾雑蛋白の混在が危惧されてお
り、その除去方法が種々検討されている。また、血漿蛋
白成分に混在する可能性のある肝炎ウィルス等を不活化
するために行う60℃、10時間の液状加熱処理により生成
する熱変性蛋白の存在も新たな問題となりつつある。最
近、この熱変性蛋白を除去する方法として、固定化ヘパ
リンを用いて再処理する方法が提案されている(特開昭
63−23896号公報)。しかし、この方法はパイロジェン
の除去等にはあまり有効でないことが判明している。
重ねた結果、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤を調製できるこ
とを見出し、本発明を完成した。
を有する。
る。
チトロンビン−III以外の血漿蛋白(例えば、セルロプ
ラスミン、トランスフェリン、アルブミン、ハプトグロ
ビン、α2−マクログロブリン、α1−アンチトリプシ
ン、IgA、IgCなど)等が挙げられる。
程度である。
は、以下のようにアンチトロンビン−III含有水溶液を
疎水性基をリガンドとする不溶性担体を用いるクロマト
処理により精製されたアンチトロンビン−IIIを用いて
調製される。
ト由来のもので、医薬として使用できる程度に精製され
たものであれば特に制限されるものではなく、例えば、
ヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾さ
れた血清等から精製することができる。上記アンチトロ
ンビン−IIIを調製するための出発原料としては、例え
ば、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる画分IV、
IV−1、IV−4またはIV−1+IV−4、クエン酸含有血
漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣画分等が
使用される。アンチトロンビン−IIIの精製法として
は、例えば、特開昭48−35017号公報、特公昭59−7693
号公報に開示の方法が例示される。
は、0.1〜10(W/V)%程度が例示される。
クロマト処理に付す前に加熱処理(50〜70℃、5〜30時
間程度)を行っておくことが好ましい。
性担体は以下のようなものである。
好ましくは3〜5程度)、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。
ストラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポ
リビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。
キル型セファロース(冷えば、オクチル型セファロース
等)、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル
(例えば、ブチル型ポリビニル等)等が市販されてお
り、これら以外のものについても市販品と同様な方法ま
たはこれに準ずる方法によって容易に製造することがで
きる。
ロンビン−III含有水溶液を、疎水性基をリガンドとす
る不溶性担体に接触させることにより行われるが、その
方法としてはカラム法、バッチ法の何れにて行ってもよ
い。
される。このような条件を具備する溶媒としては、3M塩
化ナトリウム含有20mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.
5)、2M塩化ナトリウム含有50mMリン酸緩衝液(pH7.5)
等が例示される。
行う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−III
含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマ
ト用担体に接触させる。その条件としては、該担体1ml
に対して該水溶液1〜100mlを用い、2〜20℃で30分〜
2時間程度混和させる方法が挙げられる。その後に遠心
分離にて上澄を回収する。
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且
つカラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開
し、非吸着画分を回収する。
イオン交換体で処理し吸着画分を回収する工程に付して
精製するのがよい。
ガロース、DEAE−デキストラン、DEAE−セルロースな
ど)、QAE系(例えば、QAE−アガロース、QAE−デキス
トランなど)等が挙げられる。
示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.05
M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)等が
挙げられる。
例示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.
17M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)等
が挙げられる。
てもよい。
チトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化し
た当該陰イオン交換体に接触させる。その条件として
は、該交換体1mlに対して該水溶液1〜100mlを用い、2
〜20℃で30分〜2時間程度混和した後に遠心分離して、
該交換体を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶
媒を添加する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心
分離して上澄を回収する。
したアンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で
平衡化され、且つカラムに充填された当該陰イオン交換
体に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラム
洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。
応じてさらに精製した後、製剤化される。製剤として
は、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これ
ら製剤化は、医薬上許容される添加剤(希釈剤、等張化
剤、界面活性剤等)を適宜混合し、製剤上の常套手段に
より行うことができる。また、該製剤は静注、皮下注射
等の注射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射
用蒸留水等に溶解して用いられる。
水溶液に含まれるパイロジェン、夾雑蛋白、加熱処理に
より生成した熱変性蛋白等が効果的に除去された精製ア
ンチトロンビン−IIIを含有するので、安全性に優れた
アンチトロンビン−III製剤を提供することができる。
するが、本発明はこれらによってなんら限定されるもの
ではない。
ペースト10kgを生理食塩水100に懸濁し、硫酸バリウ
ムを5(W/V)%になるように加え、室温で30分間撹拌
し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸
着させて除去した。この上澄液をpH6.5に調整し、ポリ
エチレングリコール#4,000を13(W/V)%になるように
加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチ
レングリコール#4,000を30(W/V)%になるように加
え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷
生理食塩水約20に溶解し、予め生理食塩水で調整され
たヘパリンセファロースのカラムに注入し、アンチトロ
ンビン−IIIをカラムに吸着させた。このカラムを0.4M
の塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、
2.0Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してく
る部分を回収した。
リウムを0.6Mの濃度に加え、pH7.8に調整した後、60℃
で10時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム(最終
濃度3M)及びクエン酸ナトリウム(最終濃度20mM)を添
加し、pH7.5に調整した。一方、3M塩化ナトリウム含有2
0mMクエン酸ナトリウム緩衝液(pH7.5)で平衡化したブ
チル型ポリビニル系担体(ブチル−トヨパール650、東
洋曹達(株)製)にアンチトロンビン−III含有水溶液
を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を
回収した。続いて、0.9%塩化ナトリウム溶液に対して
一夜透析を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−IIIの
1(W/V)%水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心
分離を行って澄明な液とした。
ンニトール2(W/V)%とクエン酸ナトリウム0.2(W/
V)%を加え、塩化ナトリウムが0.5%になるように少量
の冷蒸留水希釈し、1Nの水酸化ナトリウムでpH7.6に調
整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、
500単位ずつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とし
た。
を用いる以外は全て実施例1に準じて処理を行い、実施
例1と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
低温で処理して血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣
画分を用いる以外は全て実施例1に準じて処理を行い、
実施例1と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
後、DEAE−デキストラン処理を施した。
トロンビン−III含有水溶液を、塩化ナトリウム0.05M、
クエン酸ナトリウム0.01M、pH7となるように調製した
後、0.05M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液(pH
7)で平衡化したDEAE−デキストラン(DEAE−セファデ
ックスA−50、ファルマシア社製)に通した。さらに同
じ溶媒でカラムを洗浄した後、0.17M塩化ナトリウム含
有0.01Mクエン酸緩衝液(pH7)で溶出し、溶出画分を回
収した。以下、実施例1に準じて製剤化処理を行いアン
チトロンビン−III製剤を調製した。
て、静注又は点滴静注する。なお、1単位は、正常人血
漿1mlに含まれるアンチトロンビン−III量に相当する。
前後のアンチトロンビン−III含有画分中のパイロジェ
ンを調べる試験を2回行った(各々第1サンプル及び第
2サンプルと称する)。なお、試験方法は日本薬局方収
載の発熱性物質試験法によった。その結果を第1表に示
す。
より合計温度が低下し、パイロジェンが実質的に除去さ
れていることが判明した。
後のアンチトロンビン−III含有画分中の総蛋白量及び
アンチトロンビン−III活性を測定し、比活性を算出し
た。総蛋白量はケルダール法により測定した。また、ア
ンチトロンビン−III活性(AT−III活性)はトロンビン
と試料とを28℃で5分間反応させ、これにフィブリンを
加えた時に凝固時間がどの程度延長されるかを測定し、
予め作製しておいた検量線よりその力価を算出したもの
である。但し、1単位は正常人血漿1ml中に含まれるア
ンチトロンビン−III量に相当する。得られた結果を第
2表に示す。
り、AT−III活性及び比活性の上昇が認められ、特に比
活性は4.9(単位/mg蛋白)から6.4(単位/mg蛋白)とな
った。
後のアンチトロンビン−III含有画分中に夾雑する血漿
蛋白の有無をオクタロニー法により調べた。その結果を
第3表に示す。
後のアンチトロンビン−III含有画分をゲル濾過にか
け、その溶出パターンを比較した、その結果を第1図に
示す。なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。
6.8) 検出法:280nmの吸光度 第1図に示されるように、処理前の画分は二峰性を示
す。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターン
からみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水
性クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、一峰性
となることが判明した。
換体処理を行って得られたアンチトロンビン−III含有
画分と、上記疎水性クロマト処理前のアンチトロンビン
−III含有水溶液について、夾雑血漿蛋白の有無をオク
タロニー法により調べた。蛋白濃度100mg/mlで実施し
た。その結果を第4表に示す。
製剤を注射用蒸溜水に溶解し、5匹のマウスに4,000単
位/kg相当量を尾静脈より投与して7日間観察を続けた
が、なんら異常は認められなかった。また、同じ溶解液
を家兎に5,000単位/kg投与し24時間観察したが、体温の
異常は認められなかった。
ビン−III含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。
Claims (4)
- 【請求項1】ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
I含有水溶液を、夾雑可能性のあるウイルスが不活化さ
れるのに十分な条件下で加熱処理を施した後、疎水基を
リガンドとする不溶性担体で処理し、夾雑物質を該担体
に吸着させ、未吸着画分を回収することからなる、ウイ
ルスが不活化され、夾雑物質として少なくともパイロジ
ェン及び不活化処理により生成した熱変性蛋白を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤。 - 【請求項2】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白及びアンチトロンビン−III以外の血漿蛋白を実質的
に含まない請求項(1)記載のアンチトロンビン−III
製剤。 - 【請求項3】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白、アルブミン、ハプトグロビン、α2−マクログロブ
リン、α1−アンチトリプシン及びIgAを実質的に含ま
ない請求項(1)又は請求項(2)記載のアンチトロン
ビン−III製剤。 - 【請求項4】疎水基をリガンドとする不溶性担体の疎水
基がアルキル基である請求項(1)記載のアンチトロン
ビン−III製剤。
Priority Applications (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63155740A JP2678249B2 (ja) | 1988-06-22 | 1988-06-22 | アンチトロンビン−▲iii▼製剤 |
CA000597405A CA1341379C (en) | 1988-04-28 | 1989-04-21 | Purified antithrombin-iii and methods of producing the same |
EP95108077A EP0682949A1 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Virus inactivated antithrombin-III preparation free from pyrogen and thermally denatured protein |
DE68925918T DE68925918T2 (de) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Methode zur Reinigung von Antithrombin-III und Antithrombin-III-Zusammensetzung enthaltend dieses Antithrombin-III |
EP89304085A EP0339919B1 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Method for purifying antithrombin-III and antithrombin-III preparation containing said antithrombin-III |
ES89304085T ES2084599T3 (es) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Metodo para purificar antitrombina iii y preparacion de antitrombina iii que contiene dicha antitrombina iii. |
KR1019890005684A KR0139049B1 (ko) | 1988-04-28 | 1989-04-28 | 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63155740A JP2678249B2 (ja) | 1988-06-22 | 1988-06-22 | アンチトロンビン−▲iii▼製剤 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH024717A JPH024717A (ja) | 1990-01-09 |
JP2678249B2 true JP2678249B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=15612402
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63155740A Expired - Lifetime JP2678249B2 (ja) | 1988-04-28 | 1988-06-22 | アンチトロンビン−▲iii▼製剤 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2678249B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5589516A (en) * | 1993-04-05 | 1996-12-31 | The Green Cross Corporation | Liquid preparation of antithrombin-III and stabilizing method therefor |
WO1995019789A1 (fr) * | 1994-01-21 | 1995-07-27 | The Green Cross Corporation | Agent de prevention ou de traitement des troubles moteurs |
US6375948B1 (en) | 1999-07-12 | 2002-04-23 | Kao Corporation | Treating method for suppressing hair growth |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AT379310B (de) * | 1983-05-20 | 1985-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines antithrombin iii-heparin- bzw. antithrombin iii-heparinoidkonzentrates |
US4749783A (en) * | 1986-07-11 | 1988-06-07 | Miles Laboratories, Inc. | Viral inactivation and purification of active proteins |
-
1988
- 1988-06-22 JP JP63155740A patent/JP2678249B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH024717A (ja) | 1990-01-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0378208B2 (en) | Production method for protein-containing composition | |
EP0037078B1 (en) | Process for heat treatment of aqueous solution containing human blood coagulation factor xiii | |
EP0224811B1 (en) | Improved method of preparing alpha-1-proteinase inhibitor | |
EP0077870A2 (en) | Process for heat treatment of aqueous solution containing human blood coagulation factor VIII | |
JPH0348169B2 (ja) | ||
CN106349387B (zh) | 一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中纯化α1-抗胰蛋白酶的方法 | |
AU2001273907A1 (en) | A method of producing IgG | |
JPS62108821A (ja) | アルフア−1−プロテイナ−ゼ阻害剤の製造方法 | |
CA1341269C (en) | Viral inactivation and purification of active proteins | |
JPH0559095B2 (ja) | ||
KR0139049B1 (ko) | 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 | |
JP2678249B2 (ja) | アンチトロンビン−▲iii▼製剤 | |
JP2729484B2 (ja) | アンチトロンビン−▲iii▼の精製方法 | |
US5989593A (en) | Method for producing antithrombin-III, method for purifying it, and preparation containing it | |
JP3615595B2 (ja) | C1−エステラーゼ阻害剤濃厚物(c1−inh)の調製法、および治療的使用のための得られた濃厚物 | |
JP3595466B2 (ja) | 精製アンチトロンビン−iiiおよびその製法 | |
JP4003235B2 (ja) | 静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 | |
JP4146525B2 (ja) | アンチトロンビン−iiiの精製法 | |
JP2775097B2 (ja) | 静注用免疫グロブリン製剤 | |
JP2618643B2 (ja) | 静注用免疫グロブリン製剤 | |
JPH10265407A (ja) | 免疫グロブリン製剤 | |
JPH107588A (ja) | 粗免疫グロブリン含有画分の精製法およびその精製法を用いた静注用免疫グロブリン製剤の製造方法 | |
KR19980042603A (ko) | 안티트롬빈-ⅲ의 제조방법, 이의 정제방법 및 이를 함유하는제제 | |
JPH1053534A (ja) | α2プラスミンインヒビターの製造方法 | |
JPH09157184A (ja) | アンチトロンビンiii含有組成物およびその製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070801 Year of fee payment: 10 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080801 Year of fee payment: 11 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080801 Year of fee payment: 11 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
EXPY | Cancellation because of completion of term |