JP2678249B2 - アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼製剤 - Google Patents
アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼製剤Info
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤に関する。
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤に関する。
［従来の技術］ アンチトロンビン−IIIは血漿中に存在するα２グロ
ブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は65,000
〜68,000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロン
ビンの凝固活性を強く阻害する。
ブリンに属する糖蛋白質の一種で、その分子量は65,000
〜68,000であり、プロテアーゼ阻害活性を有し、トロン
ビンの凝固活性を強く阻害する。
また、トロンビンに対する阻害作用のみならず、その
他の凝固因子、例えば、活性化Ｘ因子、活性化IX因子な
どに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミ
ンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告され
ている。
他の凝固因子、例えば、活性化Ｘ因子、活性化IX因子な
どに対する阻害作用をも有している。その他、プラスミ
ンやトリプシンに対する阻害作用のあることも報告され
ている。
これらの阻害作用は、一般にヘパリンの共存下でより
速やかに進行することが知られている。
速やかに進行することが知られている。
このような薬理作用を有するアンチトロンビン−III
は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症
（DIC）を目的として用いられるものである。
は、凝固異常亢進の補正、具体的には汎発性血管異常症
（DIC）を目的として用いられるものである。
［発明が解決しようとする課題］ ところで、アンチトロンビン−IIIの精製工程におい
て、パイロジェン又は夾雑蛋白の混在が危惧されてお
り、その除去方法が種々検討されている。また、血漿蛋
白成分に混在する可能性のある肝炎ウィルス等を不活化
するために行う60℃、10時間の液状加熱処理により生成
する熱変性蛋白の存在も新たな問題となりつつある。最
近、この熱変性蛋白を除去する方法として、固定化ヘパ
リンを用いて再処理する方法が提案されている（特開昭
63−23896号公報）。しかし、この方法はパイロジェン
の除去等にはあまり有効でないことが判明している。
て、パイロジェン又は夾雑蛋白の混在が危惧されてお
り、その除去方法が種々検討されている。また、血漿蛋
白成分に混在する可能性のある肝炎ウィルス等を不活化
するために行う60℃、10時間の液状加熱処理により生成
する熱変性蛋白の存在も新たな問題となりつつある。最
近、この熱変性蛋白を除去する方法として、固定化ヘパ
リンを用いて再処理する方法が提案されている（特開昭
63−23896号公報）。しかし、この方法はパイロジェン
の除去等にはあまり有効でないことが判明している。
そこで本発明者らはこれらの事情に鑑み、種々研究を
重ねた結果、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤を調製できるこ
とを見出し、本発明を完成した。
重ねた結果、ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
Iを含有し、ウィルスが不活化され、夾雑物質を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤を調製できるこ
とを見出し、本発明を完成した。
［課題を解決するための手段］ 本発明のアンチトロンビン−III製剤は、以下の性質
を有する。
を有する。
ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−IIIを含有す
る。
る。
ウィルスは不活化されている。
夾雑物質を実質的に含まない。
夾雑物質としては、パイロジェン、熱変性蛋白、アン
チトロンビン−III以外の血漿蛋白（例えば、セルロプ
ラスミン、トランスフェリン、アルブミン、ハプトグロ
ビン、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシ
ン、IgA、IgCなど）等が挙げられる。
チトロンビン−III以外の血漿蛋白（例えば、セルロプ
ラスミン、トランスフェリン、アルブミン、ハプトグロ
ビン、α２−マクログロブリン、α１−アンチトリプシ
ン、IgA、IgCなど）等が挙げられる。
アンチトロンビン−IIIの比活性は６〜７単位/mg蛋白
程度である。
程度である。
本発明のアンチトロンビン−III製剤は、具体的に
は、以下のようにアンチトロンビン−III含有水溶液を
疎水性基をリガンドとする不溶性担体を用いるクロマト
処理により精製されたアンチトロンビン−IIIを用いて
調製される。
は、以下のようにアンチトロンビン−III含有水溶液を
疎水性基をリガンドとする不溶性担体を用いるクロマト
処理により精製されたアンチトロンビン−IIIを用いて
調製される。
原料として使用されるアンチトロンビン−IIIは、ヒ
ト由来のもので、医薬として使用できる程度に精製され
たものであれば特に制限されるものではなく、例えば、
ヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾さ
れた血清等から精製することができる。上記アンチトロ
ンビン−IIIを調製するための出発原料としては、例え
ば、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる画分IV、
IV−１、IV−４またはIV−１＋IV−４、クエン酸含有血
漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣画分等が
使用される。アンチトロンビン−IIIの精製法として
は、例えば、特開昭48−35017号公報、特公昭59−7693
号公報に開示の方法が例示される。
ト由来のもので、医薬として使用できる程度に精製され
たものであれば特に制限されるものではなく、例えば、
ヒトの全血、血漿、血清または凝固した血液から圧搾さ
れた血清等から精製することができる。上記アンチトロ
ンビン−IIIを調製するための出発原料としては、例え
ば、血漿、コーンの冷エタノール法で得られる画分IV、
IV−１、IV−４またはIV−１＋IV−４、クエン酸含有血
漿から血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣画分等が
使用される。アンチトロンビン−IIIの精製法として
は、例えば、特開昭48−35017号公報、特公昭59−7693
号公報に開示の方法が例示される。
アンチトロンビン−III含有水溶液の蛋白濃度として
は、0.1〜10（W/V）％程度が例示される。
は、0.1〜10（W/V）％程度が例示される。
また、アンチトロンビン−III含有水溶液は、疎水性
クロマト処理に付す前に加熱処理（50〜70℃、５〜30時
間程度）を行っておくことが好ましい。
クロマト処理に付す前に加熱処理（50〜70℃、５〜30時
間程度）を行っておくことが好ましい。
上記精製に使用される疎水性基をリガンドとする不溶
性担体は以下のようなものである。
性担体は以下のようなものである。
疎水性基としては、アルキル基（炭素数１〜10程度、
好ましくは３〜５程度）、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。
好ましくは３〜５程度）、置換基を有していてもよいフ
ェニル基等が挙げられる。
不溶性担体としては、セルロース、アガロース、デキ
ストラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポ
リビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。
ストラン、ポリアクリルアミド、アミノ酸共重合体、ポ
リビニル系、ポリスチレン系等が挙げられる。
疎水性基をリガンドとする不溶性担体としては、アル
キル型セファロース（冷えば、オクチル型セファロース
等）、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル
（例えば、ブチル型ポリビニル等）等が市販されてお
り、これら以外のものについても市販品と同様な方法ま
たはこれに準ずる方法によって容易に製造することがで
きる。
キル型セファロース（冷えば、オクチル型セファロース
等）、フェニル型セファロース、アルキル型ポリビニル
（例えば、ブチル型ポリビニル等）等が市販されてお
り、これら以外のものについても市販品と同様な方法ま
たはこれに準ずる方法によって容易に製造することがで
きる。
上記不溶性担体を用いる精製工程は、一般にアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、疎水性基をリガンドとす
る不溶性担体に接触させることにより行われるが、その
方法としてはカラム法、バッチ法の何れにて行ってもよ
い。
ロンビン−III含有水溶液を、疎水性基をリガンドとす
る不溶性担体に接触させることにより行われるが、その
方法としてはカラム法、バッチ法の何れにて行ってもよ
い。
接触条件は、pH6〜９程度、塩濃度１〜5M程度が例示
される。このような条件を具備する溶媒としては、3M塩
化ナトリウム含有20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
5）、2M塩化ナトリウム含有50mMリン酸緩衝液（pH7.5）
等が例示される。
される。このような条件を具備する溶媒としては、3M塩
化ナトリウム含有20mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
5）、2M塩化ナトリウム含有50mMリン酸緩衝液（pH7.5）
等が例示される。
上記の精製方法を具体的に説明すると、バッチ法にて
行う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−III
含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマ
ト用担体に接触させる。その条件としては、該担体1ml
に対して該水溶液１〜100mlを用い、２〜20℃で30分〜
２時間程度混和させる方法が挙げられる。その後に遠心
分離にて上澄を回収する。
行う場合、上記条件に調整したアンチトロンビン−III
含有水溶液を、同じ条件で平衡化した当該疎水性クロマ
ト用担体に接触させる。その条件としては、該担体1ml
に対して該水溶液１〜100mlを用い、２〜20℃で30分〜
２時間程度混和させる方法が挙げられる。その後に遠心
分離にて上澄を回収する。
カラム法にて行う場合、上記条件に調整したアンチト
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且
つカラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開
し、非吸着画分を回収する。
ロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化され且
つカラム充填された当該疎水性クロマト用担体にて展開
し、非吸着画分を回収する。
好ましくは、上記で得られた非吸着画分を、さらに陰
イオン交換体で処理し吸着画分を回収する工程に付して
精製するのがよい。
イオン交換体で処理し吸着画分を回収する工程に付して
精製するのがよい。
陰イオン交換体としては、DEAE系（例えば、DEAE−ア
ガロース、DEAE−デキストラン、DEAE−セルロースな
ど）、QAE系（例えば、QAE−アガロース、QAE−デキス
トランなど）等が挙げられる。
ガロース、DEAE−デキストラン、DEAE−セルロースな
ど）、QAE系（例えば、QAE−アガロース、QAE−デキス
トランなど）等が挙げられる。
接触条件はpH6〜８程度、塩濃度0.01〜0.1M程度が例
示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.05
M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）等が
挙げられる。
示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.05
M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）等が
挙げられる。
また溶出条件はpH6〜８程度、塩濃度0.1〜0.3M程度が
例示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.
17M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）等
が挙げられる。
例示され、このような条件を具備する溶媒としては、0.
17M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）等
が挙げられる。
その方法としてはカラム法、バッチ法のいずれで行っ
てもよい。
てもよい。
バッチ法にて行う場合、上記接触条件に調製したアン
チトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化し
た当該陰イオン交換体に接触させる。その条件として
は、該交換体1mlに対して該水溶液１〜100mlを用い、２
〜20℃で30分〜２時間程度混和した後に遠心分離して、
該交換体を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶
媒を添加する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心
分離して上澄を回収する。
チトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で平衡化し
た当該陰イオン交換体に接触させる。その条件として
は、該交換体1mlに対して該水溶液１〜100mlを用い、２
〜20℃で30分〜２時間程度混和した後に遠心分離して、
該交換体を回収する。さらに、該交換体に上記溶出用溶
媒を添加する。混和条件は接触時と同じであるが、遠心
分離して上澄を回収する。
一方、カラム法にて行う場合、上記の接触条件に調製
したアンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で
平衡化され、且つカラムに充填された当該陰イオン交換
体に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラム
洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。
したアンチトロンビン−III含有水溶液を、同じ条件で
平衡化され、且つカラムに充填された当該陰イオン交換
体に通し、非吸着画分を廃棄する。必要に応じてカラム
洗浄した後、溶出用溶媒を流して溶出画分を回収する。
こうして得られたアンチトロンビン−IIIは、必要に
応じてさらに精製した後、製剤化される。製剤として
は、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これ
ら製剤化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、等張化
剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段に
より行うことができる。また、該製剤は静注、皮下注射
等の注射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射
用蒸留水等に溶解して用いられる。
応じてさらに精製した後、製剤化される。製剤として
は、水溶液、懸濁剤、凍結乾燥製剤等が挙げられ、これ
ら製剤化は、医薬上許容される添加剤（希釈剤、等張化
剤、界面活性剤等）を適宜混合し、製剤上の常套手段に
より行うことができる。また、該製剤は静注、皮下注射
等の注射剤として用いられ、凍結乾燥製剤は用時に注射
用蒸留水等に溶解して用いられる。
［発明の効果］ 本発明の製剤によれば、アンチトロンビン−III含有
水溶液に含まれるパイロジェン、夾雑蛋白、加熱処理に
より生成した熱変性蛋白等が効果的に除去された精製ア
ンチトロンビン−IIIを含有するので、安全性に優れた
アンチトロンビン−III製剤を提供することができる。
水溶液に含まれるパイロジェン、夾雑蛋白、加熱処理に
より生成した熱変性蛋白等が効果的に除去された精製ア
ンチトロンビン−IIIを含有するので、安全性に優れた
アンチトロンビン−III製剤を提供することができる。
［実施例］ 本発明をより詳細に説明するため実施例を挙げて説明
するが、本発明はこれらによってなんら限定されるもの
ではない。
するが、本発明はこれらによってなんら限定されるもの
ではない。
実施例１ コーンの冷アルコール分画法で得られた画分IV−１の
ペースト10kgを生理食塩水100に懸濁し、硫酸バリウ
ムを５（W/V）％になるように加え、室温で30分間撹拌
し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸
着させて除去した。この上澄液をpH6.5に調整し、ポリ
エチレングリコール＃4,000を13（W/V）％になるように
加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチ
レングリコール＃4,000を30（W/V）％になるように加
え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷
生理食塩水約20に溶解し、予め生理食塩水で調整され
たヘパリンセファロースのカラムに注入し、アンチトロ
ンビン−IIIをカラムに吸着させた。このカラムを0.4M
の塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、
2.0Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してく
る部分を回収した。
ペースト10kgを生理食塩水100に懸濁し、硫酸バリウ
ムを５（W/V）％になるように加え、室温で30分間撹拌
し、微量に存在するプロトロンビンを硫酸バリウムに吸
着させて除去した。この上澄液をpH6.5に調整し、ポリ
エチレングリコール＃4,000を13（W/V）％になるように
加え、生じた沈澱を遠心分離して除き、さらにポリエチ
レングリコール＃4,000を30（W/V）％になるように加
え、生じた沈澱を遠心分離して回収した。この沈澱を冷
生理食塩水約20に溶解し、予め生理食塩水で調整され
たヘパリンセファロースのカラムに注入し、アンチトロ
ンビン−IIIをカラムに吸着させた。このカラムを0.4M
の塩化ナトリウム溶液で洗浄して不純蛋白を除いた後、
2.0Mの塩化ナトリウム溶液をカラムに流して溶出してく
る部分を回収した。
このアンチトロンビン−IIIの水溶液にクエン酸ナト
リウムを0.6Mの濃度に加え、pH7.8に調整した後、60℃
で10時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム（最終
濃度3M）及びクエン酸ナトリウム（最終濃度20mM）を添
加し、pH7.5に調整した。一方、3M塩化ナトリウム含有2
0mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で平衡化したブ
チル型ポリビニル系担体（ブチル−トヨパール650、東
洋曹達（株）製）にアンチトロンビン−III含有水溶液
を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を
回収した。続いて、0.9％塩化ナトリウム溶液に対して
一夜透析を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−IIIの
１（W/V）％水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心
分離を行って澄明な液とした。
リウムを0.6Mの濃度に加え、pH7.8に調整した後、60℃
で10時間の加熱処理を施した後、塩化ナトリウム（最終
濃度3M）及びクエン酸ナトリウム（最終濃度20mM）を添
加し、pH7.5に調整した。一方、3M塩化ナトリウム含有2
0mMクエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）で平衡化したブ
チル型ポリビニル系担体（ブチル−トヨパール650、東
洋曹達（株）製）にアンチトロンビン−III含有水溶液
を接触させたのちに上記緩衝液で展開し、未吸着画分を
回収した。続いて、0.9％塩化ナトリウム溶液に対して
一夜透析を行いつつ濃縮してアンチトロンビン−IIIの
１（W/V）％水溶液を得、必要に応じて、濾過又は遠心
分離を行って澄明な液とした。
このアンチトロンビン−IIIの１（W/V）％水溶液にマ
ンニトール２（W/V）％とクエン酸ナトリウム0.2（W/
V）％を加え、塩化ナトリウムが0.5％になるように少量
の冷蒸留水希釈し、1Nの水酸化ナトリウムでpH7.6に調
整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、
500単位ずつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とし
た。
ンニトール２（W/V）％とクエン酸ナトリウム0.2（W/
V）％を加え、塩化ナトリウムが0.5％になるように少量
の冷蒸留水希釈し、1Nの水酸化ナトリウムでpH7.6に調
整した後、滅菌したミリポアフィルターで除菌濾過し、
500単位ずつ分注し、凍結乾燥を行って乾燥製剤とし
た。
実施例２ 画分IV−１ペーストの代わりに、画分IV−１＋IV−４
を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実施
例１と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、実施
例１と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
実施例３ 画分IV−１ペーストの代わりに、クエン酸含有血漿を
低温で処理して血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣
画分を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、
実施例１と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
低温で処理して血液凝固第VIII因子を回収した後の残渣
画分を用いる以外は全て実施例１に準じて処理を行い、
実施例１と同様なアンチトロンビン−III製剤を得た。
実施例４ 実施例１と同様にして疎水性クロマト処理を行った
後、DEAE−デキストラン処理を施した。
後、DEAE−デキストラン処理を施した。
即ち、実施例１で得られた疎水性クロマト処理アンチ
トロンビン−III含有水溶液を、塩化ナトリウム0.05M、
クエン酸ナトリウム0.01M、pH7となるように調製した
後、0.05M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH
7）で平衡化したDEAE−デキストラン（DEAE−セファデ
ックスＡ−50、ファルマシア社製）に通した。さらに同
じ溶媒でカラムを洗浄した後、0.17M塩化ナトリウム含
有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）で溶出し、溶出画分を回
収した。以下、実施例１に準じて製剤化処理を行いアン
チトロンビン−III製剤を調製した。
トロンビン−III含有水溶液を、塩化ナトリウム0.05M、
クエン酸ナトリウム0.01M、pH7となるように調製した
後、0.05M塩化ナトリウム含有0.01Mクエン酸緩衝液（pH
7）で平衡化したDEAE−デキストラン（DEAE−セファデ
ックスＡ−50、ファルマシア社製）に通した。さらに同
じ溶媒でカラムを洗浄した後、0.17M塩化ナトリウム含
有0.01Mクエン酸緩衝液（pH7）で溶出し、溶出画分を回
収した。以下、実施例１に準じて製剤化処理を行いアン
チトロンビン−III製剤を調製した。
実施例５ 実施例４で得られたアンチトロンビン−III 乾燥粉末 500単位 塩化ナトリウム 50mg クエン酸ナトリウム 52mg 上記処方の製剤を、用時、注射用蒸留水20mlに溶解し
て、静注又は点滴静注する。なお、１単位は、正常人血
漿1mlに含まれるアンチトロンビン−III量に相当する。
て、静注又は点滴静注する。なお、１単位は、正常人血
漿1mlに含まれるアンチトロンビン−III量に相当する。
実験例１ （１）パイロジェンの除去 実施例１に準じて、疎水性クロマト処理を行い、その
前後のアンチトロンビン−III含有画分中のパイロジェ
ンを調べる試験を２回行った（各々第１サンプル及び第
２サンプルと称する）。なお、試験方法は日本薬局方収
載の発熱性物質試験法によった。その結果を第１表に示
す。
前後のアンチトロンビン−III含有画分中のパイロジェ
ンを調べる試験を２回行った（各々第１サンプル及び第
２サンプルと称する）。なお、試験方法は日本薬局方収
載の発熱性物質試験法によった。その結果を第１表に示
す。
上記第１表に示されるように、疎水性クロマト処理に
より合計温度が低下し、パイロジェンが実質的に除去さ
れていることが判明した。
より合計温度が低下し、パイロジェンが実質的に除去さ
れていることが判明した。
（２）夾雑蛋白の除去 （ａ）比活性 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分中の総蛋白量及び
アンチトロンビン−III活性を測定し、比活性を算出し
た。総蛋白量はケルダール法により測定した。また、ア
ンチトロンビン−III活性（AT−III活性）はトロンビン
と試料とを28℃で５分間反応させ、これにフィブリンを
加えた時に凝固時間がどの程度延長されるかを測定し、
予め作製しておいた検量線よりその力価を算出したもの
である。但し、１単位は正常人血漿1ml中に含まれるア
ンチトロンビン−III量に相当する。得られた結果を第
２表に示す。
後のアンチトロンビン−III含有画分中の総蛋白量及び
アンチトロンビン−III活性を測定し、比活性を算出し
た。総蛋白量はケルダール法により測定した。また、ア
ンチトロンビン−III活性（AT−III活性）はトロンビン
と試料とを28℃で５分間反応させ、これにフィブリンを
加えた時に凝固時間がどの程度延長されるかを測定し、
予め作製しておいた検量線よりその力価を算出したもの
である。但し、１単位は正常人血漿1ml中に含まれるア
ンチトロンビン−III量に相当する。得られた結果を第
２表に示す。
第２表に示されるように、疎水性クロマト処理によ
り、AT−III活性及び比活性の上昇が認められ、特に比
活性は4.9（単位/mg蛋白）から6.4（単位/mg蛋白）とな
った。
り、AT−III活性及び比活性の上昇が認められ、特に比
活性は4.9（単位/mg蛋白）から6.4（単位/mg蛋白）とな
った。
（ｂ）夾雑血漿蛋白の除去 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分中に夾雑する血漿
蛋白の有無をオクタロニー法により調べた。その結果を
第３表に示す。
後のアンチトロンビン−III含有画分中に夾雑する血漿
蛋白の有無をオクタロニー法により調べた。その結果を
第３表に示す。
（ｃ）ゲル濾過 実施例１に準じて疎水性クロマト処理を行い、その前
後のアンチトロンビン−III含有画分をゲル濾過にか
け、その溶出パターンを比較した、その結果を第１図に
示す。なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。
後のアンチトロンビン−III含有画分をゲル濾過にか
け、その溶出パターンを比較した、その結果を第１図に
示す。なお、ゲル濾過の条件は次のとおりである。
担体:TSKゲルG3000SW−XL（東ソー社製） 溶出液:0.2M塩化ナトリウム含有0.1Mリン酸緩衝液（pH
6.8） 検出法:280nmの吸光度 第１図に示されるように、処理前の画分は二峰性を示
す。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターン
からみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水
性クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、一峰性
となることが判明した。
6.8） 検出法:280nmの吸光度 第１図に示されるように、処理前の画分は二峰性を示
す。このうち、高分子画分は加熱処理前の溶出パターン
からみて、熱変性蛋白に基づくものと考えられる。疎水
性クロマト処理によりこの高分子画分は消失し、一峰性
となることが判明した。
（ｄ）夾雑血漿蛋白の除去 実施例４に準じて疎水性クロマト処理及び陰イオン交
換体処理を行って得られたアンチトロンビン−III含有
画分と、上記疎水性クロマト処理前のアンチトロンビン
−III含有水溶液について、夾雑血漿蛋白の有無をオク
タロニー法により調べた。蛋白濃度100mg/mlで実施し
た。その結果を第４表に示す。
換体処理を行って得られたアンチトロンビン−III含有
画分と、上記疎水性クロマト処理前のアンチトロンビン
−III含有水溶液について、夾雑血漿蛋白の有無をオク
タロニー法により調べた。蛋白濃度100mg/mlで実施し
た。その結果を第４表に示す。
実験例２ 実施例１で得られたアンチトロンビン−III凍結乾燥
製剤を注射用蒸溜水に溶解し、５匹のマウスに4,000単
位/kg相当量を尾静脈より投与して７日間観察を続けた
が、なんら異常は認められなかった。また、同じ溶解液
を家兎に5,000単位/kg投与し24時間観察したが、体温の
異常は認められなかった。
製剤を注射用蒸溜水に溶解し、５匹のマウスに4,000単
位/kg相当量を尾静脈より投与して７日間観察を続けた
が、なんら異常は認められなかった。また、同じ溶解液
を家兎に5,000単位/kg投与し24時間観察したが、体温の
異常は認められなかった。
第１図は、疎水性クロマト処理の前後でのアンチトロン
ビン−III含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。
ビン−III含有画分のゲル濾過溶出パターンを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−222421（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−23896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−100319（ＪＰ，Ａ)
Claims (4)
- 【請求項１】ヒト血漿に由来するアンチトロンビン−II
I含有水溶液を、夾雑可能性のあるウイルスが不活化さ
れるのに十分な条件下で加熱処理を施した後、疎水基を
リガンドとする不溶性担体で処理し、夾雑物質を該担体
に吸着させ、未吸着画分を回収することからなる、ウイ
ルスが不活化され、夾雑物質として少なくともパイロジ
ェン及び不活化処理により生成した熱変性蛋白を実質的
に含まないアンチトロンビン−III製剤。 - 【請求項２】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白及びアンチトロンビン−III以外の血漿蛋白を実質的
に含まない請求項（１）記載のアンチトロンビン−III
製剤。 - 【請求項３】夾雑物質として、パイロジェン、熱変性蛋
白、アルブミン、ハプトグロビン、α２−マクログロブ
リン、α１−アンチトリプシン及びIgAを実質的に含ま
ない請求項（１）又は請求項（２）記載のアンチトロン
ビン−III製剤。 - 【請求項４】疎水基をリガンドとする不溶性担体の疎水
基がアルキル基である請求項（１）記載のアンチトロン
ビン−III製剤。
Priority Applications (7)
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|---|---|---|---|
| JP63155740A JP2678249B2 (ja) | 1988-06-22 | 1988-06-22 | アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼製剤 |
| CA000597405A CA1341379C (en) | 1988-04-28 | 1989-04-21 | Purified antithrombin-iii and methods of producing the same |
| EP95108077A EP0682949A1 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Virus inactivated antithrombin-III preparation free from pyrogen and thermally denatured protein |
| DE68925918T DE68925918T2 (de) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Methode zur Reinigung von Antithrombin-III und Antithrombin-III-Zusammensetzung enthaltend dieses Antithrombin-III |
| EP89304085A EP0339919B1 (en) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Method for purifying antithrombin-III and antithrombin-III preparation containing said antithrombin-III |
| ES89304085T ES2084599T3 (es) | 1988-04-28 | 1989-04-25 | Metodo para purificar antitrombina iii y preparacion de antitrombina iii que contiene dicha antitrombina iii. |
| KR1019890005684A KR0139049B1 (ko) | 1988-04-28 | 1989-04-28 | 안티트롬빈-iii의 정제 방법 및 이 안티트롬빈-iii를 함유한 안티트롬빈-iii 제제 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63155740A JP2678249B2 (ja) | 1988-06-22 | 1988-06-22 | アンチトロンビン−▲ｉｉｉ▼製剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH024717A JPH024717A (ja) | 1990-01-09 |
| JP2678249B2 true JP2678249B2 (ja) | 1997-11-17 |
Family
ID=15612402
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2678249B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
Families Citing this family (3)
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|---|---|---|---|---|
| US5589516A (en) * | 1993-04-05 | 1996-12-31 | The Green Cross Corporation | Liquid preparation of antithrombin-III and stabilizing method therefor |
| WO1995019789A1 (fr) * | 1994-01-21 | 1995-07-27 | The Green Cross Corporation | Agent de prevention ou de traitement des troubles moteurs |
| US6375948B1 (en) | 1999-07-12 | 2002-04-23 | Kao Corporation | Treating method for suppressing hair growth |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AT379310B (de) * | 1983-05-20 | 1985-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur herstellung eines antithrombin iii-heparin- bzw. antithrombin iii-heparinoidkonzentrates |
| US4749783A (en) * | 1986-07-11 | 1988-06-07 | Miles Laboratories, Inc. | Viral inactivation and purification of active proteins |
-
1988
- 1988-06-22 JP JP63155740A patent/JP2678249B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008120801A1 (ja) | 2007-04-02 | 2008-10-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | アンチトロンビン組成物の製造方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH024717A (ja) | 1990-01-09 |
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