JP2020519294A - ウイルスベクター産生 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2017年5月12日に出願された米国仮出願第62/505,540号の出願日の35 U.S.C. § 119(e)下の利益を主張する。この関連出願の内容の全体は、本明細書に援用される。
ウイルスベクター媒介遺伝子導入は、遺伝子機能および遺伝子治療を研究するための価値のあるツールである。しかしながら、ある導入遺伝子を含むウイルスベクターの産生(例として、パッケージング細胞に毒性であるか、または、ウイルスベクターのパッケージング系と非適合性である導入遺伝子産物)は、いくつかの課題(例えば、極めて低い力価またはウイルスベクターの非産生)に直面している。
いくつかの側面において、本開示は、細胞傷害性および/またはウイルスベクターパッケージング系と不適合性である導入遺伝子産物を含むベクター(例として、ウイルスベクター)の効率的な産生を可能にするために、ベクターパッケージングプロセスの間に、RNA分解(例として、低分子−ヘアピンRNA(shRNA)、人工のmiRNA(amiRNA)等々によって媒介されるような)により導入遺伝子発現を消失させることに関する。
いくつかの態様において、宿主細胞から単離されたウイルス粒子から発現される導入遺伝子は、機能的である。
本開示の側面は、部分的に、ベクターパッケージング(例として、宿主細胞中の組み換えウイルス粒子のパッケージング)の間に、RNA干渉または同様の経路(shRNAまたは人工のmiRNA、amiRNAのいずれか)によって導入遺伝子発現を消滅させることが、効率的なベクター産生を生じるという発見に関する。以下の例に記載されるとおり、細胞傷害性導入遺伝子(例として、EGFP−(GR)80またはApoL1)を保有するレンチウイルスベクターは、ウイルスベクターパッケージングの間に導入遺伝子特異的阻害性核酸(例として、shRNAまたはmiRNA)を発現するプラスミドのコトランスフェクションを実施することによって産生された。本明細書に記載の方法を使用する、これらの例示の遺伝子を含むウイルス粒子の効率的な産生は、細胞傷害性遺伝子が通常、従来のウイルス粒子産生方法によってパッケージングすることが困難であるので、驚くべきことである。
本明細書において用いられる場合、用語「核酸」とは、DNA、RNAなどの連結されたヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。いくつかの態様において、導入遺伝子のDNAは、メッセンジャーRNA(mRNA)転写産物に翻訳される。本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、人工的に産生されることを意味する(例として、人工的に産生された核酸、または人工的に産生されたタンパク質(カプシドタンパク質など))。核酸に関して本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、以下を意味する:(i)in vitroで、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、増幅される;(ii)クローニングにより組み換え的に生成される;(iii)切断およびゲル分離などにより、精製される;または(iv)例えば化学合成により、合成される。単離された核酸は、当該分野において周知の組み換えDNA技術により、容易に操作可能であるものである。したがって、5’および3’制限部位が知られているか、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のプライマー配列が開示されているベクター中に含まれるヌクレオチド配列は、単離されていると考えられるが、その天然の宿主中でそのネイティブな状態において存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、必ずしもその必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、それが存在する細胞中の材料のうちのわずかなパーセンテージのみを含んでもよいという点において、純粋ではない。しかし、当該用語が本明細書において用いられる場合、かかる核酸は単離されている。なぜならば、それは当業者に公知の標準的な技術により容易に操作可能であるからである。タンパク質またはペプチドに関して本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、人工的に(例えば、化学合成により、組み換えDNA技術などにより)産生されたタンパク質またはペプチドを指す。
低分子ヘアピンRNA(shRNA)は、堅固なヘアピンターンを有する人工のRNA分子である。一般に、shRNAは、ループ配列によってアンチセンス鎖(例として、ガイド鎖)に接続されるセンス鎖(例として、パッセンジャー鎖)含む二重鎖を有するステム部分をコードする単一核酸を包含する、自己相補的な「ステム−ループ」構造に配置される。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、相補性を共有する。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、100%の相補性を共有する。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の相補性を共有する。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、塩基対のミスマッチに起因して相補性を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘアピン形成RNAのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、少なくとも1、少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10のミスマッチを有する。一般に、ステム(ループと比べて)の最初の2〜8ヌクレオチドは、「シード」残基と称され、標的の認識および結合において重要な役割を果たす。ステム(ループと比べて)の最初の残基は、「アンカー」残基と称される。いくつかの態様において、ヘアピン形成RNAは、アンカー残基においてミスマッチを有する。
マイクロRNA(miRNA)は、転写後のサイレンシングによって細胞内遺伝子発現を調節する、低分子の非コーディングRNAである。miRNAが標的mRNA配列に部分的に相補的であるとき、これらは、典型的には、標的mRNAの安定性を低減し、翻訳を阻害する。対照的に、miRNAは、mRNA標的にほぼ完全に相補的であるとき、mRNAは切断され、その大規模な破壊を引き起こす。miRNAは、転写後レベルで、全身送達され、普遍的に発現される導入遺伝子の組織特異的調節を達成できる。miRNAは、異なる組織および細胞型において、別個の発現プロファイルを有し、細胞内遺伝子および細胞内機能の転写後プロファイルを差示的に調節する。したがって、本明細書に提供される方法は、細胞における導入遺伝子発現をサイレンシングするためにmiRNAを使用する。
ウイルスベクターは、プラスミドおよび遺伝子材料の細胞への送達のための強力なツールを提供する。ウイルス媒介送達を用いる用途のためにプラスミドDNAを適応させることは、神経細胞などの伝統的にトランスフェクトが困難な細胞中の遺伝子情報の送達を包含する、研究のための多数の利点を提供している。ウイルスは、自然に、宿主細胞に感染し、これらにウイルスゲノムを複製するように指示する。科学者は、代替的なゲノム(例として、核酸または導入遺伝子をコードするプラスミド)(これらは、一旦ウイルスが宿主細胞に感染すると、複製され得る)をウイルスに提供することによって、このプロセスを利用してきた。要するに、研究者は、組み換えウイルスを産生するために、宿主細胞にプラスミドを導入することができる。
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス−1(HIV−1)に由来する。レンチウイルスゲノムは、DNAに逆転写され、次いで、宿主細胞ゲノムに組み込まれる一本鎖RNAからなる。レンチウイルスは、***細胞および非***細胞の両方に感染することができ、これらを遺伝子治療のための魅力的なツールとしている。
本開示の単離された核酸は、組み換えアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター(rAAVベクター)であってもよい。いくつかの態様において、本開示によって記載されるような単離された核酸は、第1のアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位配列(ITR)またはそのバリアントを含む領域(例として、第1領域)を含む。単離された核酸(例として、組み換えAAVベクター)は、カプシドタンパク質へパッケージングされて、対象へ投与され、および/または選択された標的細胞へ送達されてもよい。「組み換えAAV(rAAV)ベクター」は、典型的には、最小限には、導入遺伝子およびその調節配列、および5’および3’AAV末端逆位配列(ITR)から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他に開示されるように、阻害性核酸(例として、shRNA、miRNA、等々)についての1以上のタンパク質および/または1以上の結合部位をコードする1以上の領域を含んでもよい。導入遺伝子はまた、本開示において他に記載されるように、例えば、タンパク質および/または発現制御配列(例として、ポリAテール)をコードする領域を含む。
アデノウイルスゲノムは、複数の重度にスプライシングされた転写産物を含む、非エンベロープの大きな(36−kb)二本鎖DNA(dsDNA)分子である。アデノウイルスは、高いパッケージング能力(〜8キロベース)を有し、***および非***細胞の広範な範囲を標的とすることができる。アデノウイルスは、宿主ゲノムには組み込まれず、よって宿主細胞中で一過的な導入遺伝子発現を生成するのみである。アデノウイルスゲノムのいずれかの末端において、末端反復配列(ITR)が存在する。アデノウイルスゲノムによってコードされる遺伝子は、初期(E1−E4)および後期(L1−L5)転写産物に分けられる。ほとんどのヒトアデノウイルスベクターは、細胞に侵入するのにコクサッキーアデノウイルス受容体を使用する、Ad5ウイルス型に基づいている。
レトロウイルス(ほとんど一般にγ−レトロウイルス)は、ウイルスゲノムおよびいくつかの構造タンパク質および酵素タンパク質(逆転写酵素およびインテグラーゼを包含する)から構成されるRNAウイルスである。一旦宿主細胞の内側へ入ると、レトロウイルスは、ウイルスゲノムからDNAプロウイルスを産生するために逆転写酵素を使用する。次いで、インテグラーゼタンパク質は、目的の核酸(単数または複数)をコードするウイルスゲノムの産生のために、このプロウイルスを宿主ゲノムに組み込む。レトロウイルスは、相対的に高い量のDNA(8キロベースまで)をパッケージングすることができるが、非***細胞に感染することはできず、宿主細胞ゲノムに無作為に挿入する。
「宿主細胞」とは、目的の物質を内部に持つか、またはこれを内部に持つことができる、または、目的の核酸をウイルス粒子にパッケージングすることができる、任意の細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞の例は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、サル細胞、昆虫細胞、植物細胞、または細菌細胞を包含する。昆虫細胞の例は、これらに限定されないが、Spodoptera frugiperda(例として、Sf9、Sf21)、Spodoptera exigua、Heliothis virescens、Helicoverpa zea、Heliothis subflexa、Anticarsia gemmatalis、Trichopulsia ni (例として、High-Five細胞)、Drosophila melanogaster (例として、S2、S3)、Antheraea eucalypti、Bombyx mori、Aedes alpopictus、Aedes aegyptii、およびその他を包含する。細菌細胞の例は、これらに限定されないが、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、およびPseudomonas fluorescensを包含する。酵母細胞の例は、これらに限定されないが、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pombe、Pichia pastoris、Bacillus sp.、Aspergillus sp.、Trichoderma sp.、およびMyceliophthora thermophila C1を包含する。植物細胞の例は、これらに限定されないが、Nicotiana sp.、Arabidopsis thaliana、Mays zea、Solanum sp.、またはLemna spを包含する。
本明細書において用いられる場合、用語「組み換え細胞」とは、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはRNAなどの生物学的に活性な核酸の産生をもたらすDNAセグメントなどの外因性DNAセグメントが導入されている細胞を指す。
本開示は、一般に、遺伝子発現ベクターの力価を改善するための、および、産生(例として、パッケージング)効率を増加させるための方法に関する。図1は、遺伝子発現ベクターのいくつかの非限定例を提供する。
Claims (32)
- 組み換えウイルス産生収率を制御するための方法であって、以下:
(i)宿主細胞に導入遺伝子を含む第1核酸を導入すること;
(ii)宿主細胞に干渉核酸を発現することができる第2核酸を導入すること、ここで、干渉核酸は導入遺伝子の発現を特異的に阻害する;
(iii)宿主細胞内で導入遺伝子を含む核酸を複製すること;および
(iv)任意に、宿主細胞から第1核酸を含むウイルス粒子を単離すること
を含む、前記方法。 - 宿主細胞は、ウイルスベクターパッケージング細胞である、請求項1に記載の方法。
- 宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 宿主細胞は、ヒト細胞、任意にHEK293T細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞は、昆虫細胞、任意にSpodoptera frugiperda (Sf9)細胞である、請求項1または2に記載の方法。
- 第1核酸は、レンチウイルス導入プラスミド、アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター、アデノウイルス(Ad)ベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 第1核酸は、レンチウイルス導入ベクターであり、少なくとも1つの末端反復配列(LTR)を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 第1核酸は、AAVベクターであり、少なくとも1つの逆位反復配列(ITR)を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- ITRは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、またはAAV9 ITRである、請求項8に記載の方法。
- AAVベクターは、少なくとも1つのΔITRまたはmTRを含む自己相補的なAAVベクターである、請求項8または9に記載の方法。
- 第1核酸は、レトロウイルス導入プラスミドであり、少なくとも1つの末端反復配列(LTR)を含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 導入遺伝子の発現は、宿主細胞中のウイルスベクターパッケージングと干渉する、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 導入遺伝子は、細胞傷害性であるか、または、宿主細胞のフィットネスに有害な生理化学的特徴(例として、導入遺伝子は、高い熱安定性を有する2次構造を形成するタンパク質をコードする)を1以上含む、請求項12に記載の方法。
- 第1核酸によってコードされる転写産物は、阻害性核酸のための1以上の結合部位を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の方法。
- 阻害性核酸は、マイクロRNA(miRNA)または人工のmiRNA(amiRNA)であり、任意に1以上の結合部位は、配列番号3および4から選択される配列を含む、請求項14に記載の方法。
- 1以上の結合部位の各々の配列は、宿主細胞の内在性のmiRNAによって認識されない、請求項14または15に記載の方法。
- 1以上の結合部位は、転写産物の最終コドンとポリAテールとの間に位置する、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上の結合部位は、転写産物の5’非翻訳領域(5’UTR)に位置する、請求項14〜16のいずれか一項に記載の方法。
- 第2核酸は、低分子ヘアピンRNA、miRNA、またはamiRNAを発現する、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 第2核酸は、導入遺伝子をコードする核酸に結合するmiRNAまたはamiRNAを発現する、請求項19に記載の方法。
- miRNAまたはamiRNAは、非ヒト細胞中で発現されるmiRNA配列を含む、請求項19または20に記載の方法。
- miRNAまたはamiRNAは、昆虫細胞または植物細胞中で発現されるmiRNA配列を含む、請求項19または20に記載の方法。
- miRNAまたはamiRNAは、植物細胞中で発現されるmiRNA配列を含む、請求項19または20に記載の方法。
- miRNAまたはamiRNAは、miR−333配列(配列番号1)またはmiR−856配列(配列番号2)を含み、任意にamiRNAは、miR−30足場を含む、請求項19〜23のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞は、1以上のアクセサリープラスミドをさらに含む、請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法。
- 1以上のアクセサリープラスミドの各々は、パッケージングプラスミド、Envコーディングプラスミド、Revコーディングプラスミド、Repコーディングプラスミド、またはCapコーディングプラスミドから選択される、請求項25に記載の方法。
- 第1核酸および第2核酸は、宿主細胞に同時に導入される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 第1核酸および第2核酸は、宿主細胞に個別に導入される、請求項1〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 第1核酸および第2核酸は、同じプラスミド上に位置する、請求項1〜27のいずれか一項に記載の方法。
- 導入遺伝子発現の阻害は、一過的である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 導入遺伝子発現の阻害は、持続性である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 宿主細胞から単離されたウイルス粒子から発現された導入遺伝子が、機能的である、請求項1〜31のいずれか一項に記載の方法。
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