JP2020519294A - ウイルスベクター産生 - Google Patents

Abstract

いくつかの側面において、本開示は、ウイルスベクター産生の力価および収率を改善するための方法に関する。いくつかの態様において、方法は、ウイルスベクターのパッケージングの間の、導入遺伝子発現の一過的なサイレンシングを含む。

Description

関連出願
本出願は、2017年5月12日に出願された米国仮出願第62/505,540号の出願日の35 U.S.C. § 119(e)下の利益を主張する。この関連出願の内容の全体は、本明細書に援用される。

背景
ウイルスベクター媒介遺伝子導入は、遺伝子機能および遺伝子治療を研究するための価値のあるツールである。しかしながら、ある導入遺伝子を含むウイルスベクターの産生（例として、パッケージング細胞に毒性であるか、または、ウイルスベクターのパッケージング系と非適合性である導入遺伝子産物）は、いくつかの課題（例えば、極めて低い力価またはウイルスベクターの非産生）に直面している。

概要
いくつかの側面において、本開示は、細胞傷害性および／またはウイルスベクターパッケージング系と不適合性である導入遺伝子産物を含むベクター（例として、ウイルスベクター）の効率的な産生を可能にするために、ベクターパッケージングプロセスの間に、ＲＮＡ分解（例として、低分子−ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、人工のｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）等々によって媒介されるような）により導入遺伝子発現を消失させることに関する。

結果的にいくつかの側面において、本開示は、組み換えウイルス産生収率を制御または改善するための方法を提供し、宿主細胞に導入遺伝子を含む第１核酸を導入すること；宿主細胞に、干渉核酸を発現することができる第２核酸を導入することであって、ここで、干渉核酸は、導入遺伝子の発現を特異的に阻害する；宿主細胞内で導入遺伝子を含む核酸を複製すること；および、任意に、宿主細胞から第１核酸を含むウイルス粒子を単離することを含む。

いくつかの態様において、第１核酸および第２核酸は、宿主細胞に同時に導入される。いくつかの態様において、第１核酸および第２核酸は、宿主細胞に個別に導入される。いくつかの態様において、第１核酸および第２核酸は、同じプラスミドに位置することが理解されるべきである。いくつかの態様において、第２核酸による導入遺伝子発現の阻害は、一過的である。いくつかの態様において、第２核酸による導入遺伝子発現の阻害は、持続性である。

いくつかの態様において、宿主細胞は、ウイルスベクターパッケージング細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物の細胞である。いくつかの態様において、哺乳動物の細胞は、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、昆虫細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、昆虫細胞、例えばSpodoptera frugiperda(Sf9)細胞である。

いくつかの態様において、第１核酸は、レンチウイルス導入プラスミド、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、またはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、第１核酸は、レンチウイルス導入プラスミドであり、少なくとも１の末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。いくつかの態様において、第１核酸は、ＡＡＶベクターであり、少なくとも１の末端逆位配列（ＩＴＲ）を含む。いくつかの態様において、第１核酸は、レトロウイルス導入プラスミドであり、少なくとも１の末端反復配列（ＬＴＲ）を含む。

いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ ＩＴＲである。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターは、少なくとも１のΔＩＴＲまたは突然変異体ＩＴＲ（ｍＴＲ）を含む自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。

いくつかの態様において、導入遺伝子の発現は、宿主細胞において、ウイルスベクターのパッケージングに干渉する（例として、導入遺伝子の産物を介して）。いくつかの態様において、導入遺伝子は、細胞傷害性であるかまたは高い熱安定性を有する２次構造を形成する（例として、宿主細胞のフィットネスに有害な１以上の物理化学的特性を有する）。

いくつかの態様において、第１核酸によってコードされる転写産物は、阻害性核酸について１以上の結合部位を含む。いくつかの態様において、１以上の結合部位は、転写産物の最終コドンとポリＡテールとの間に位置している。いくつかの態様において、１以上の結合部位は、転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に位置している。いくつかの態様において、１以上の結合部位は、転写産物の最終コドンとポリＡテールとの間に位置し、かつ、１以上の結合部位は、転写産物の５’ＵＴＲに位置している。いくつかの態様において、１以上の結合部位は、ｍｉＲ−３３３結合部位（配列番号３）、ｍｉＲ−８６５結合部位（配列番号４）、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様において、１以上の結合部位は、１、２、または３の結合部位である。

いくつかの態様において、阻害性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。いくつかの態様において、阻害性核酸結合部位の配列は、宿主細胞の内在性のｍｉＲＮＡによって認識されない。

いくつかの態様において、第２核酸は、低分子ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはａｍｉＲＮＡを発現する。いくつかの態様において、第２核酸は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡを発現する。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、非ヒト細胞において発現されるｍｉＲＮＡ配列（例として、非ヒト細胞においてのみ自然に発現されるｍｉＲＮＡ配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、昆虫細胞または植物細胞において発現されるｍｉＲＮＡ配列（例として、昆虫細胞または植物細胞においてのみ自然に発現されるｍｉＲＮＡ配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、植物細胞において発現されるｍｉＲＮＡ配列（例として、植物細胞においてのみ自然に発現されるｍｉＲＮＡ配列）を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３３３配列（配列番号１）またはｍｉＲ−８５６配列（配列番号２）を含む。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０足場（例として、ｐｒｉ−ｍｉＲ３０ａ骨格配列(backbone sequence)などの骨格配列）を含む。いくつかの態様において、転写産物は、ｍｉＲ−３３３配列またはｍｉＲ−８５６配列についての１以上の結合部位を含む。

いくつかの態様において、宿主細胞は、１以上のアクセサリープラスミドをさらに含む。いくつかの態様において、１以上のアクセサリープラスミドは、パッケージングプラスミド、Ｅｎｖコーディングプラスミド、Ｒｅｖコーディングプラスミド、Ｒｅｐコーディングプラスミド、またはＣａｐコーディングプラスミドである。
いくつかの態様において、宿主細胞から単離されたウイルス粒子から発現される導入遺伝子は、機能的である。

図１は、ウイルスおよび非ウイルスのベクターの非限定例を示す。いくつかの態様において、図１で示されるベクターは、１以上の導入遺伝子の対象（例として、対象の細胞）への送達に有用である。

図２Ａ〜２Ｃは、ｒＡＡＶゲノム均一性および収率を損なう回文配列を示す。図２Ａは、ＣＭＶエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）、ＥＧＦＰレポーター遺伝子、およびベータ−グロビンポリＡ配列（ＰＡ）を含む自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）プラスミドの概略図を示す。Ｈ１プロモーターによって駆動されるＡｐｏｂを標的とするｓｈＲＮＡカセット、または、Ｕ６プロモーターによって駆動されるホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｆｌｕｃ）を標的とするｓｈＲＮＡカセットは、イントロン（イントロン−Ｒおよびイントロン−Ｆ）内にｍＴＲ（ｍ−Ｒおよびｍ−Ｆ）に隣接して、またはｗｔＴＲ（Ｗｔ−ＲおよびＷｔ−Ｆ）に隣接して、挿入された。図２Ｂは、Ｈ１プロモーターによって駆動されるｓｈＡｐｏｂ保有の、または、Ｕ６プロモーターによって駆動されるｓｈＦｌｕｃ（データは示さず）保有の、自己相補的なＡＡＶベクターゲノムのアガロースゲル分析を示す。カセットは各々、図の左側に示されるように６つの位置／配向で試験された。切断型ウイルスゲノムは、全てのｓｈＲＮＡカセットについてのレーンにおいて観察されたが、対照ロスカセットでは観察されなかった（ｓｈＲＮＡなし）。図２Ｃは、（図２Ａ）において記載されたベクターが、ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされ、ＥＧＦＰプライマー／プローブセットを使用するｑＰＣＲによって収率が査定された。同じｓｈＲＮＡカセットを保有する構築物は、公平な比較を保証するために、パッケージングされ、（同じ時間における）セットとして滴定された。２つのセットの構築物（Ｕ６−ｓｈＦｌｕｃおよびＨ１−ｓｈＡｐｏｂ）は、異なる時間にパッケージングされた。

図３は、第３世代のレンチウイルスベクター産生の概略図を示す。この態様において、４つの構築物（パッケージングプラスミド、Ｒｅｖコーディングプラスミド、Ｅｎｖコーディングプラスミド、導入遺伝子コーディングプラスミド）は、ベクターを産生するために、許容細胞株（例として、ＨＥＫ２９３）にトランスフェクトされる。

図４は、ＧＦＰ（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ、上図）または８０マーのグリシン−アルギニン（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０）ジアミノ酸反復ペプチドに融合されたＧＦＰのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで感染された細胞を示す。ＧＲ_８０は、細胞傷害性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）関連ペプチドである。蛍光イメージングは、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰと比較して低い、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０による細胞の形質導入を示し、ＧＦＰを含むベクターと比べて低い、細胞傷害性タンパク質（ＧＲ_８０）を含むベクターの複製またはパッケージング効率を指示する。

図５は、パッケージングに耐性の導入遺伝子（例として、細胞傷害性導入遺伝子または宿主細胞のフィットネスを低減させる導入遺伝子）を含むウイルスベクターの複製および／またはパッケージングを増加させるための手法の概略図を示す。パッケージング細胞は、ウイルスベクター産生プラスミド（単数または複数）およびパッケージングに耐性のある導入遺伝子（例として、細胞傷害性導入遺伝子または宿主細胞のフィットネスを低減する導入遺伝子）に特異的な干渉ＲＮＡ分子（例として、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、等々）を発現することができるプラスミドでコトランスフェクトされる。パッケージングの間の導入遺伝子発現の一過的なサイレンシング（例として、Ａｇｏ２などのＲＮＡｉ機構によって媒介される）は、ウイルスベクター複製およびパッケージングを増加させ、収率の増加を導く。

図６は、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０−特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＧＦＰ）を発現するプラスミドによる一過的な遺伝子発現サイレンシングの間にパッケージングされたＧＦＰ（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ、上図）、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０、またはＬｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０のいずれかを発現するレンチウイルスベクターで感染された細胞を示す。蛍光イメージングは、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰと比較して低い、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０による細胞の形質導入を示し、ＧＦＰを含むベクターと比べて低い、細胞傷害性タンパク質（ＧＲ_８０）を含むベクターの複製またはパッケージング効率を指示する。しかしながら、有意に増加した感染およびＧＦＰ−ＧＲ_８０の発現が、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０が形質導入された細胞で観察され、ベクターパッケージングの間の導入遺伝子発現の一過的なサイレンシングが、高い力価および機能的ウイルスベクターをもたらすことを指示する。

図７は、パッケージングに耐性がある導入遺伝子（例として、細胞傷害性導入遺伝子または宿主細胞のフィットネスを低減する導入遺伝子）を含むウイルスベクターの複製および／またはパッケージングを増加させるための２つの手法の概略図を示す。左側では、パッケージング細胞は、ウイルスベクター産生プラスミド（単数または複数）および導入遺伝子に特異的なｓｈＲＮＡを発現することができるプラスミドでコトランスフェクトされる。パッケージングの間の導入遺伝子発現の一過的なサイレンシング（例として、Ａｇｏ２などのＲＮＡｉ機構によって媒介される）は、ウイルスベクター複製およびパッケージングを増加させ、収率の増加を導く。右側では、１以上（例として、３）の人工のｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）結合部位は、パッケージングに耐性がある導入遺伝子（例として、細胞傷害性導入遺伝子または宿主細胞のフィットネスを低減させる導入遺伝子）を含むプラスミド内に操作される。パッケージング細胞は、ウイルスベクター産生プラスミド（単数または複数）および産生プラスミド内へ操作される結合部位に特異的なａｍｉＲＮＡを発現することができるプラスミドでコトランスフェクトされる。

図８は、漸増数のｍｉＲＮＡ結合部位が導入遺伝子構築物に組み込まれるときに、ＲＮＡｉ効能が増加することを実証する例示のデータを示す。この例において、０、１または３つのｍｉＲ−１２２結合部位がｎＬａｃＺ発現構築物に組み込まれた。Ｈｕｈ７細胞は、各構築物でトランスフェクトされ、ｎＬａｃＺ発現は測定された。データは、１または３つのｍｉＲ−１２２結合部位を有する構築物でトランスフェクトされた細胞における減少した導入遺伝子（ｎＬａｃＺ）発現を指示する。導入遺伝子発現の同様の減少が、マウス肝臓においても観察された。

図９は、人工のｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）とそれらの標的部位との間の相互作用による特定のおよび効率的な遺伝子サイレンシングを示す。細胞は、３３３Ｔまたは８５６Ｔのいずれかに特異的である複数のｍｉＲＮＡ結合部位（これは、公知の哺乳動物ｍｉＲＮＡによって結合されない配列である）を含むＥＧＦＰ構築物およびｍｉＲ−３３３またはｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドでコトランスフェクトされた。データは、ｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ対照プラスミドではなく、ｍｉＲ−３３３ ａｍｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ−３３３Ｔ発現のサイレンシングを指示する。データは、ｍｉＲ−３３３ ａｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ対照プラスミドではなく、ｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ−８５６Ｔ発現のサイレンシングを指示する。

図１０は、アポリポタンパク質Ｌ１（Ａｐｏｌ１）を発現することができるレンチウイルスベクターについての力価およびベクターパッケージングを改善するための方法に関する代表的なデータを示し、このタンパク質は、典型的には、従来のウイルスベクター産生手順を使用してパッケージングすることが困難である。３つのｍｉＲ−８５６結合部位（３ｘ８５６Ｔ）は、Ａｐｏｌ１発現構築物に組み込まれた。パッケージング細胞は、Ａｐｏｌ１発現構築物およびａｍｉＲ−８５６を発現するプラスミドでコトランスフェクトされた。データは、ベクター力価が漸増濃度のａｍｉＲ−８５６とともに増加することを示し、パッケージングの間の導入遺伝子（例として、Ａｐｏｌ１）発現の増加したサイレンシングが、Ｌｅｎｔｉ−Ａｐｏｌ１ベクター産生の効率を増加させることを指示する。

図１１は、対照Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰベクターではなく、Ｌｅｎｔｉ−Ａｐｏｌ１ベクターに感染した細胞の死滅によって示される、導入遺伝子発現のサイレンシングの間にパッケージングされたベクターによって発現されるアポリポタンパク質Ｌ１（例として、Ａｐｏｌ１）が機能的であることを指示する代表的なデータを示す。

詳細な記載
本開示の側面は、部分的に、ベクターパッケージング（例として、宿主細胞中の組み換えウイルス粒子のパッケージング）の間に、ＲＮＡ干渉または同様の経路（ｓｈＲＮＡまたは人工のｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡのいずれか）によって導入遺伝子発現を消滅させることが、効率的なベクター産生を生じるという発見に関する。以下の例に記載されるとおり、細胞傷害性導入遺伝子（例として、ＥＧＦＰ−（ＧＲ）８０またはＡｐｏＬ１）を保有するレンチウイルスベクターは、ウイルスベクターパッケージングの間に導入遺伝子特異的阻害性核酸（例として、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ）を発現するプラスミドのコトランスフェクションを実施することによって産生された。本明細書に記載の方法を使用する、これらの例示の遺伝子を含むウイルス粒子の効率的な産生は、細胞傷害性遺伝子が通常、従来のウイルス粒子産生方法によってパッケージングすることが困難であるので、驚くべきことである。

ウイルスベクター産生のための第２の手法はまた、本明細書に記載されている。簡潔には、ｓｈＲＮＡまたは人工のｍｉＲＮＡのいずれかについての３コピーの標的部位が、Ｌｅｎｔｉ−ＡｐｏＬ１プラスミド中のＡｐｏＬ１導入遺伝子の３’ＵＴＲに組み込まれた。これらの標的部位は、任意の公知の哺乳動物の内在性の低分子ＲＮＡ（例として、ｍｉＲＮＡ結合部位は、宿主細胞に対して直交性である）によって認識されないが、パッケージングプロセス中にコトランスフェクトされたプラスミドから発現されるｓｈＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ（例として、直交性ｓｈＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ）に特異的に感受性であるように設計された。「直交性(orthogonal)」阻害性核酸または核酸結合部位は、宿主細胞において自然に発現されないが、宿主細胞によって内在的に発現されるｍｉＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡ結合部位）と相互作用しない阻害性核酸（または、その同族の結合部位）の配列を指す。人工の低分子ＲＮＡ標的分子が包埋した導入遺伝子を有するウイルスベクターの産生は損なわれないことが観察された。その代わり、導入遺伝子発現は、対応するｓｈＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡの存在下で効率的にサイレンシングされる（例として、ウイルス粒子のパッケージングの間に一過的にサイレンシングされる）。結果的に、細胞傷害性導入遺伝子を含むウイルス粒子は、高い力価で首尾よく産生された。加えて、ＨＥＫ２９３細胞のウイルス粒子での感染は、大規模な細胞死を引き起こすことが観察され、パッケージングされたウイルスベクターの感染力および導入遺伝子機能の維持が指示された。

要約すると、一過的なＲＮＡサイレンシングによるベクター産生の間の細胞傷害性または非適合性の導入遺伝子の抑制は、高い力価および機能的なウイルスベクターの産生を可能にする。いくつかの態様においては、本開示によって記載される方法は、細胞傷害性または非適合性の導入遺伝子（例として、宿主細胞のフィットネスに有害な導入遺伝子）を保有するアデノウイルス、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、等々などのウイルスベクターのパッケージングに有用である。

核酸
本明細書において用いられる場合、用語「核酸」とは、DNA、RNAなどの連結されたヌクレオチドのポリマーを指す。いくつかの態様において、本開示のタンパク質および核酸は、単離されている。いくつかの態様において、導入遺伝子のＤＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写産物に翻訳される。本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、人工的に産生されることを意味する（例として、人工的に産生された核酸、または人工的に産生されたタンパク質（カプシドタンパク質など））。核酸に関して本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、以下を意味する：（ｉ）in vitroで、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、増幅される；（ｉｉ）クローニングにより組み換え的に生成される；（ｉｉｉ）切断およびゲル分離などにより、精製される；または（ｉｖ）例えば化学合成により、合成される。単離された核酸は、当該分野において周知の組み換えDNA技術により、容易に操作可能であるものである。したがって、５’および３’制限部位が知られているか、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のプライマー配列が開示されているベクター中に含まれるヌクレオチド配列は、単離されていると考えられるが、その天然の宿主中でそのネイティブな状態において存在する核酸配列はそうではない。単離された核酸は、実質的に精製されていてもよいが、必ずしもその必要はない。例えば、クローニングまたは発現ベクター内で単離されている核酸は、それが存在する細胞中の材料のうちのわずかなパーセンテージのみを含んでもよいという点において、純粋ではない。しかし、当該用語が本明細書において用いられる場合、かかる核酸は単離されている。なぜならば、それは当業者に公知の標準的な技術により容易に操作可能であるからである。タンパク質またはペプチドに関して本明細書において用いられる場合、用語「単離される」とは、人工的に（例えば、化学合成により、組み換えDNA技術などにより）産生されたタンパク質またはペプチドを指す。

本明細書に使用されるとき、「導入遺伝子」は、目的のポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例として、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）または他の遺伝子産物をコードするベクター配列に相同的ではない核酸配列である。いくつかの態様において、導入遺伝子は、治療用タンパク質または治療用機能的ＲＮＡをコードする。治療用タンパク質の例は、毒素、酵素（例として、キナーゼ、ホスホリラーゼ、プロテアーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、等々）成長因子、インターロイキン、インターフェロン、抗アポトーシス因子、サイトカイン、抗糖尿病因子、抗アポトーシス剤、凝固因子、抗腫瘍因子、および抗増殖性タンパク質を包含する。核酸コーディング配列は、標的組織の細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で、調節因子に操作可能に連結される。

いくつかの側面において、本開示は、細胞傷害性または宿主細胞のフィットネスに有害な１以上の導入遺伝子をコードするウイルスベクターに関する。「細胞傷害性」導入遺伝子は、生細胞に毒性である遺伝子産物（例として、タンパク質）をコードする導入遺伝子を指す。毒性の導入遺伝子の例は、ジフテリア毒素、ボツリヌス毒素、リボソーム不活性化タンパク質（例として、リシン）、細胞溶解素、ポリン（例として、アクチノポリン）、アポリポタンパク質、あるプロテアーゼ、等々を包含する。いくつかの態様において、タンパク質は、細胞において過剰発現されると、細胞傷害性となる。「宿主細胞の健康に有害な導入遺伝子」は、導入遺伝子を発現しない宿主細胞と比べて減少した、導入遺伝子を発現する宿主細胞のフィットネス（生存能力）を生じる、ある生理化学的特徴（例として、高い熱安定性を有する２次構造、凝集傾向、等々）を有するタンパク質をコードする導入遺伝子を指す。

本明細書に使用されるとき、用語「ベクター」は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、人工染色体、ウイルス、ビリオン、等々などの任意の遺伝子要素を包含し、これは、適切な制御要素と関連して複製することができ、細胞間で遺伝子配列を移送する(transfer)ことができる。よって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを包含する。いくつかの態様において、有用なベクターは、転写される核酸セグメントがプロモーターの転写制御下に位置するベクターであることが企図される。「プロモーター」は、細胞の合成機構によって認識されるかまたは合成機構に導入されて、遺伝子の特定転写を開始することが要求されるＤＮＡ配列を指す。句「操作可能に位置する」、「制御下」、または「転写制御下」は、プロモーターが、核酸に関連して、遺伝子のＲＮＡポリメラーゼの開始および発現を制御するのに正しい場所および配向で存在することを意味する。

用語「発現ベクターまたは構築物」は、核酸コーディング配列の一部または全部が転写されることができる、核酸を含有する任意の型の遺伝子構築物を意味する。いくつかの態様において、発現は、例えば、生物学的に活性なポリペプチド産物（例として、治療用タンパク質または治療用ミニ遺伝子）または転写された遺伝子からの阻害性ＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）を産生するための、核酸の転写を包含する。

用語「干渉核酸」は、本明細書に使用されるとき、導入遺伝子に結合し、その発現を特異的に阻害する、連結されたオリゴヌクレオチドのポリマーを指す。干渉核酸は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または人工のマイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）であり得る。

低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）
低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、堅固なヘアピンターンを有する人工のＲＮＡ分子である。一般に、ｓｈＲＮＡは、ループ配列によってアンチセンス鎖（例として、ガイド鎖）に接続されるセンス鎖（例として、パッセンジャー鎖）含む二重鎖を有するステム部分をコードする単一核酸を包含する、自己相補的な「ステム−ループ」構造に配置される。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、相補性を共有する。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、１００％の相補性を共有する。いくつかの態様において、パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の相補性を共有する。パッセンジャー鎖およびガイド鎖は、塩基対のミスマッチに起因して相補性を欠いていてもよい。いくつかの態様において、ヘアピン形成ＲＮＡのパッセンジャー鎖およびガイド鎖は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０のミスマッチを有する。一般に、ステム（ループと比べて）の最初の２〜８ヌクレオチドは、「シード」残基と称され、標的の認識および結合において重要な役割を果たす。ステム（ループと比べて）の最初の残基は、「アンカー」残基と称される。いくつかの態様において、ヘアピン形成ＲＮＡは、アンカー残基においてミスマッチを有する。

ヘアピン形成ＲＮＡは、ＲＮＡｉ経路を介する翻訳抑制および／または遺伝子サイレンシングに有用である。共通の２次構造を有することに起因して、ヘアピン形成ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）にロードされる前に、タンパク質ＤｒｏｓｈａおよびＤｉｃｅｒによってプロセシングされる特徴を共有する。ヘアピン形成ＲＮＡ間で、二重鎖の長さは変化し得る。いくつかの態様において、二重鎖は、約１９ヌクレオチド長と約２００ヌクレオチド長との間である。いくつかの態様において、二重鎖は、約１４ヌクレオチド長と約３５ヌクレオチド長との間である。いくつかの態様において、二重鎖は、約１９ヌクレオチド長と約１５０ヌクレオチド長との間である。いくつかの態様において、ヘアピン形成ＲＮＡは、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、または３３ヌクレオチド長である二重鎖領域を有する。いくつかの態様において、二重鎖は、約１９ヌクレオチド長と約３３ヌクレオチド長との間である。いくつかの態様において、二重鎖は、約４０ヌクレオチド長と約１００ヌクレオチド長との間である。いくつかの態様において、二重鎖は、約６０ヌクレオチド長と約８０ヌクレオチド長との間である。

本開示の方法は、干渉核酸を発現する核酸を記載し、ここで、干渉核酸は、導入遺伝子の発現を特異的に阻害する。いくつかの態様において、核酸は、導入遺伝子に結合しその転写をブロックするｓｈＲＮＡを発現する。

マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）および人工のマイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、転写後のサイレンシングによって細胞内遺伝子発現を調節する、低分子の非コーディングＲＮＡである。ｍｉＲＮＡが標的ｍＲＮＡ配列に部分的に相補的であるとき、これらは、典型的には、標的ｍＲＮＡの安定性を低減し、翻訳を阻害する。対照的に、ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡ標的にほぼ完全に相補的であるとき、ｍＲＮＡは切断され、その大規模な破壊を引き起こす。ｍｉＲＮＡは、転写後レベルで、全身送達され、普遍的に発現される導入遺伝子の組織特異的調節を達成できる。ｍｉＲＮＡは、異なる組織および細胞型において、別個の発現プロファイルを有し、細胞内遺伝子および細胞内機能の転写後プロファイルを差示的に調節する。したがって、本明細書に提供される方法は、細胞における導入遺伝子発現をサイレンシングするためにｍｉＲＮＡを使用する。

ｍｉＲＮＡは、それが標的とするｍＲＮＡの機能を阻害し、結果として、ｍＲＮＡによってコードされるポリペプチドの発現を阻害する。よって、ｍｉＲＮＡの活性を（部分的にまたは全体的に）ブロッキングすること（例としては、ｍｉＲＮＡをサイレンシングすること）は、その発現が阻害される（ポリペプチドを抑制する）ポリペプチドの発現を有効に誘導または回復させることができる。一態様において、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ標的によってコードされるポリペプチドの抑制は、様々な方法のいずれか１つを通して、細胞中のｍｉＲＮＡ活性を阻害することによって達成される。例えば、ｍｉＲＮＡの活性のブロッキングは、ｍｉＲＮＡに相補的であるかまたは実質的に相補的である低分子干渉核酸（例として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡスポンジ、ＴｕＤ ＲＮＡ）とのハイブリダイゼーションによって達成され得、これにより、ｍｉＲＮＡのその標的ｍＲＮＡとの相互作用をブロックする。本明細書に使用されるとき、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的である低分子干渉核酸は、ｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができ、ｍｉＲＮＡの活性をブロックするものである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的である低分子干渉核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８塩基を除きｍｉＲＮＡと完全に相補的である低分子干渉核酸である。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡに実質的に相補的である低分子干渉核酸配列は、ｍｉＲＮＡと少なくとも１塩基相補的である低分子干渉核酸である。

人工のマイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、ｍｉＲＮＡ遺伝子骨格を利用して人工的に設計された低分子ＲＮＡを産生するために、上に記載されたｍｉＲＮＡ生合成経路を利用する。ａｍｉＲＮＡの細胞内プロセシングは、同じ選択的核酸配列（これは、一般に、２１塩基対の長さである）を全て保有する、単一型の低分子ＲＮＡ集団を産生する。それにより、ａｍｉＲＮＡは、個々の導入遺伝子をサイレンシングするため、または、密接に関連する遺伝子アイソフォームを同時にサイレンシングするための実行可能な方法を提供する。ａｍｉＲＮＡは時折、より高い遺伝子サイレンシング特異性およびより低いオフターゲットサイレンシング効果のために、伝統的なｍｉＲＮＡを超える利点を有する。

いくつかの態様において、人工のマイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、ｐｒｅ−ｍＲＮＡの自然の標的化領域を目的の標的化領域と置き換えるために、天然のｍｉＲＮＡを改変することによって誘導される。例えば、天然に存在する発現されたｍｉＲＮＡは、足場または骨格（例として、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場）として使用され得、ステム配列は、目的の遺伝子（例として、宿主細胞に対して直交性のｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−３３３またはｍｉＲ−８５６）を標的とするｍｉＲＮＡのものと置き換えられている。人工の前駆体マイクロＲＮＡ（ｐｒｅ−ａｍｉＲＮＡ）は、通常、単一の安定な低分子ＲＮＡが優先的に産生されるようにプロセシングされる。いくつかの態様において、本明細書に開示のウイルスベクターおよび粒子（例として、本明細書に記載のｓｃＡＡＶベクターおよびｓｃＡＡＶ）は、ａｍｉＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ＡｍｉＲＮＡのｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場は、ｐｒｉ−ＭＩＲ−２１、ｐｒｉ−ＭＩＲ−２２、ｐｒｉ−ＭＩＲ−２６ａ、ｐｒｉ−ＭＩＲ−３０ａ、ｐｒｉ−ＭＩＲ−３３、ｐｒｉ−ＭＩＲ−１２２、ｐｒｉ−ＭＩＲ−３７５、ｐｒｉ−ＭＩＲ−１９９、ｐｒｉ−ＭＩＲ−９９、ｐｒｉ−ＭＩＲ−１９４、ｐｒｉ−ＭＩＲ−１５５、およびｐｒｉ−ＭＩＲ−４５１からなる群から選択されるｐｒｉ−ｍｉＲＮＡから誘導される。

いくつかの態様において、導入遺伝子は、目的のタンパク質、例として、治療用タンパク質、および阻害性核酸（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）についての１以上の結合部位を発現するように操作されてもよい。いくつかの態様において、導入遺伝子はまた、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含む。かかるタンパク質を発現する転写産物は、１以上の阻害性ｍｉＲＮＡ（例として、宿主細胞中で発現されないｍｉＲＮＡ）を含有するように操作されてもよい。このように、宿主細胞中で発現される場合、転写産物は、宿主細胞中での転写によって発現される阻害性核酸（例として、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）を介して分解されてもよい。

本開示は、宿主細胞において内在的に発現されないｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ（例として、直交性のｍｉＲＮＡ）にハイブリダイズするように構成されたｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ結合部位を有する転写産物を発現するように操作された導入遺伝子に部分的に基づく。例えば、いくつかの態様において、ヒト細胞などの哺乳動物細胞中に導入遺伝子を発現するように操作された構築物は、植物細胞または昆虫細胞中に内在的にのみ発現される阻害性核酸（例として、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）について１以上の結合部位を有する導入遺伝子を含む。いくつかの態様において、Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞中で導入遺伝子を発現するように操作された構築物は、哺乳動物細胞または植物細胞中に内在的にのみ発現される阻害性核酸（例として、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）についての１以上の結合部位を有する導入遺伝子を含む。

いくつかの態様において、転写産物は、ｍｉＲ−３３３（配列番号１）またはｍｉＲ−８５６（配列番号２）から選択されるｍｉＲＮＡについての１以上の結合部位を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲ−３３３についての結合部位は、配列番号３に示される配列によって表される。いくつかの態様において、ｍｉＲ−８５６についての結合部位は、配列番号４に示される配列によって表される。

転写産物中の阻害性核酸（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）結合部位の位置は、変化し得る。いくつかの態様において、阻害性核酸についての１以上の結合部位は、転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に位置する。いくつかの態様において、阻害性核酸についての１以上の結合部位は、イントロン中に位置する。いくつかの態様において、阻害性核酸についての１以上の結合部位は、転写産物の最終コドンの最後のコドンとポリＡテールとの間に位置する。いくつかの態様において、阻害性核酸についての１以上の結合部位は、５’ＵＴＲに位置し、かつ、阻害性核酸についての１以上の結合部位は、転写産物の最終コドンの最後のコドンとポリＡテールとの間に位置する。

ウイルスベクター
ウイルスベクターは、プラスミドおよび遺伝子材料の細胞への送達のための強力なツールを提供する。ウイルス媒介送達を用いる用途のためにプラスミドＤＮＡを適応させることは、神経細胞などの伝統的にトランスフェクトが困難な細胞中の遺伝子情報の送達を包含する、研究のための多数の利点を提供している。ウイルスは、自然に、宿主細胞に感染し、これらにウイルスゲノムを複製するように指示する。科学者は、代替的なゲノム（例として、核酸または導入遺伝子をコードするプラスミド）（これらは、一旦ウイルスが宿主細胞に感染すると、複製され得る）をウイルスに提供することによって、このプロセスを利用してきた。要するに、研究者は、組み換えウイルスを産生するために、宿主細胞にプラスミドを導入することができる。

安全性の理由から、研究で使用されるウイルスのゲノムは、ウイルス複製に必要な、ある遺伝子の除去を通して改変されている。これらの遺伝子は通常、ウイルス粒子が産生されるために存在しなければならない、多数の「アクセサリープラスミド」に分けられる。宿主細胞による、ウイルスゲノムと一緒の、目的の核酸を含むウイルス粒子の産生は、本明細書において「パッケージング」と称される。核酸のウイルスゲノムへの送達およびパッケージングは、核酸がコードされるウイルスゲノムによって変化し、以下の各ウイルスベクターについて、詳細に考察されるだろう。

宿主細胞中でのパッケージングのためのウイルスゲノムから発現される導入遺伝子は、毒性（例として、細胞傷害性または宿主細胞のフィットネスに有害）であり得、従って、宿主細胞中でのウイルスパッケージングと干渉し得る。いくつかの態様において、第１核酸から発現される導入遺伝子は、宿主細胞に対して細胞傷害性である。いくつかの態様において、発現された導入遺伝子は、高い熱安定性を有する２次構造を形成する。

本明細書に使用されるとき、用語「組み換えウイルス」または「組み換えウイルス粒子」は、宿主細胞ゲノムに挿入された外来性ＤＮＡから産生され、導入された核酸を被包する宿主細胞中で産生される粒子を指す。

いくつかの側面において、本開示は、トランスフェクトされた宿主細胞を提供する。用語「トランスフェクション」は、細胞による外来ＤＮＡの取り込みを指すために使用され、細胞は、外来性ＤＮＡが細胞膜の内側に導入されているときに「トランスフェクトされ」ている。数多のトランスフェクション技法は、一般に当該技術分野において知られている。例として、Graham et al. (1973) Virology, 52:456、Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York、Davis et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology、Elsevier and Chu et al. (1981) Gene 13:197を参照。かかる技法は、１以上の外来性核酸（ヌクレオチド組み込みベクターおよび他の核酸分子など）を適切な宿主細胞へ導入するために使用され得る。当業者は、本開示によって記載される方法において、宿主細胞が、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の単離された核酸でトランスフェクトされてもよいことを理解するだろう。

レンチウイルスベクター
レンチウイルスベクターは、ヒト免疫不全ウイルス−１（ＨＩＶ−１）に由来する。レンチウイルスゲノムは、ＤＮＡに逆転写され、次いで、宿主細胞ゲノムに組み込まれる一本鎖ＲＮＡからなる。レンチウイルスは、***細胞および非***細胞の両方に感染することができ、これらを遺伝子治療のための魅力的なツールとしている。

レンチウイルスゲノムは、ほぼ９ｋｂの長さであり、３つの主要な構造遺伝子：ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子は、３つのウイルスコアタンパク質に翻訳される：マトリックス（ＭＡ）タンパク質、これは、ビリオンのアセンブリおよび非***細胞の感染に必要である；カプシド（ＣＡ）タンパク質、これは、ビリオンの疎水性コアを形成する；およびヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、これは、コーティングによってウイルスゲノムを保護し、ＲＮＡと密接に会合する。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス複製に不可欠なウイルスプロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ酵素をコードする。ｅｎｖ遺伝子は、ウイルス表面の糖タンパク質をコードし、これは、細胞受容体への結合および細胞膜との融合を可能にすることによる、宿主細胞へのウイルス侵入に不可欠である。いくつかの態様において、ウイルス糖タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）由来である。ウイルスゲノムはまた、ｔａｔおよびｒｅｖを包含する調節遺伝子を含有する。ｔａｔは、ウイルス転写を活性化するのに重大なトランスアクチベーターをコードするが、ｒｅｖは、ウイルス転写産物のスプライシングおよび搬出を調節するタンパク質をコードする。ｔａｔおよびｒｅｖは、ウイルス組み込み後に合成される最初のタンパク質であり、ウイルスｍＲＮＡの産生を加速するのに必要とされる。

レンチウイルスの安全性を改善するために、ウイルスの産生に必要な構成要素は、複数のベクターにわたって分かれている。本開示の方法は、末端反復配列（ＬＴＲ）が隣接する１以上の目的の導入遺伝子をコードする組み換えレンチウイルス導入ベクターを記載する。これらのＬＴＲは、数百回または数千回反復されて、宿主細胞ゲノムへの導入プラスミド配列の組み込みを容易にする、同一のヌクレオチド配列である。本開示の方法はまた、１以上のアクセサリープラスミドを記載する。これらのアクセサリープラスミドは、１以上のレンチウイルスパッケージングプラスミドを包含してもよく、これは、複製、スプライシング、およびウイルス粒子の搬送に必要なｐｏｌおよびｒｅｖ遺伝子をコードする。アクセサリープラスミドはまた、レンチウイルスのエンベローププラスミドを包含してもよく、これは、ウイルス粒子が宿主細胞と融合するのを許可するウイルス糖タンパク質を産生するのに必要な遺伝子をコードする。

アデノ随伴ウイルス
本開示の単離された核酸は、組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（ｒＡＡＶベクター）であってもよい。いくつかの態様において、本開示によって記載されるような単離された核酸は、第１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）またはそのバリアントを含む領域（例として、第１領域）を含む。単離された核酸（例として、組み換えＡＡＶベクター）は、カプシドタンパク質へパッケージングされて、対象へ投与され、および／または選択された標的細胞へ送達されてもよい。「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小限には、導入遺伝子およびその調節配列、および５’および３’ＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）から構成される。導入遺伝子は、本明細書の他に開示されるように、阻害性核酸（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、等々）についての１以上のタンパク質および／または１以上の結合部位をコードする１以上の領域を含んでもよい。導入遺伝子はまた、本開示において他に記載されるように、例えば、タンパク質および／または発現制御配列（例として、ポリＡテール）をコードする領域を含む。

一般に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲをコードする配列全体が、分子中に使用されるが、これらの配列のある程度のマイナーな改変が許容される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は、当業者の技術の範囲内である(within the skill of the art)(例として、Sambrook et al., "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989);およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照のこと）。本発明において使用される、かかる分子の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用」プラスミドであり、ここで、選択された導入遺伝子配列および関連する調節エレメントは、５’および３’ＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接している。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含有する任意の公知のＡＡＶから得てもよい。いくつかの態様において、単離された核酸（例として、ｒＡＡＶベクター）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２／２−６６、ＡＡＶ２／２−８４、ＡＡＶ２／２−１２５、およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する少なくとも１のＩＴＲを含む。いくつかの態様において、単離された核酸は、ＡＡＶ２ ＩＴＲをコードする領域（例として、第１領域）を含む。

いくつかの態様において、単離された核酸はさらに、１以上のＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２／２−６６、ＡＡＶ２／２−８４、ＡＡＶ２／２−１２５、およびそれらのバリアントから選択される血清型を有する。いくつかの態様において、ＡＡＶ ＩＴＲは、機能的な末端溶液部位(functional terminal resolution site)（ＴＲＳ）を欠く突然変異体ＩＴＲ（ｍＴＲ）である。用語「末端溶液部位を欠く」は、ＩＴＲの末端溶解部位（ＴＲＳ）の機能を抑止する(abrogate)突然変異（例として、非同義突然変異などのセンス変異またはミスセンス）を含むＡＡＶ ＩＴＲ、または、機能的ＴＲＳ（例として、ΔＴＲＳ ＩＴＲ）をコードする核酸配列を欠く切断型ＡＡＶ ＩＴＲを指す。いずれの具体的な理論によっても拘束されることは望まないが、機能的ＴＲＳを欠くＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターは、例えばMcCarthy (2008) Molecular Therapy 16(10):1648-1656に記載されるような自己相補的なｒＡＡＶベクターを産生する。

本明細書に使用されるとき、用語「自己相補的なＡＡＶベクター」（ｓｃＡＡＶ）は、ＡＡＶのＩＴＲの１つからの末端溶解部位（ＴＲ）の非存在によって産生される二本鎖ベクターゲノムを含有するベクターを指す。ＴＲの非存在は、ＴＲが存在していないベクター末端における複製の開始を妨げる。一般に、ｓｃＡＡＶベクターは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ ＴＲが各末端に存在し、変異ＴＲ（ｍＴＲ）が中央に存在する、一本鎖の逆方向反復ゲノムを産生する。いくつかの態様において、単離された核酸は、ウイルスゲノム複製の間に突然変異体逆方向反復配列（ｍＴＲ）と同様の機能を果たし得るＲＮＡヘアピン構造（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、およびａｍｉＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列を含み、自己相補的なＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを産生する。例えば、いくつかの態様において、本開示は、２つの末端の各々において逆方向反復配列（ＩＴＲ）を有する一本鎖自己相補的な核酸、および、ヘアピン形成ＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡ、等々）をコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターを含むある部分、を含むｒＡＡＶ（例として、自己相補的なＡＡＶ；ｓｃＡＡＶ）ベクターを提供する。いくつかの態様において、ヘアピン形成ＲＮＡ（例として、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉ−ＲＮＡ、等々）をコードする配列は、突然変異体ＩＴＲによって通常占有される自己相補的核酸の位置で置換される。

「組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター」は、典型的には、最小限では、導入遺伝子およびその調節配列、および５’および３’ＡＡＶ逆位反復配列（ＩＴＲ）から構成される。カプシドタンパク質にパッケージングされ、選択された標的細胞に送達されるのは、この組み換えＡＡＶベクターである。いくつかの態様において、導入遺伝子は、ポリペプチド、タンパク質、機能的ＲＮＡ分子（例として、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡインヒビター）または目的の他の遺伝子産物をコードする、ベクター配列に異種性の核酸配列である。核酸コーディング配列は、標的組織の細胞中での導入遺伝子の転写、翻訳、および／または発現を可能にする様式で、調節因子に操作可能に連結されている。

本開示は、単一のシス作用性野生型ＩＴＲを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ＩＴＲは、５’ＩＴＲである。いくつかの態様において、ＩＴＲは、３’ＩＴＲである。一般に、ＩＴＲ配列は、約１４５ｂｐの長さである。好ましくは、実質的にＩＴＲ（単数または複数）をコードする配列全体は、分子中で使用されるが、これらの配列のいくらかの程度のマイナーな改変が許可される。ＩＴＲ配列を改変する能力は、当業者の能力の範囲内(within the skill of the art)である（例として、Sambrook et al, "Molecular Cloning. A Laboratory Manual", 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989);およびK. Fisher et al., J Virol., 70:520 532 (1996)などのテキストを参照のこと）。例えば、ＩＴＲは、その末端溶液部位（ＴＲ）において変異されてもよく、これは、ＴＲが変異されており、かつ、自己相補的なＡＡＶの形成を生じるベクター末端での複製を阻害する。本開示において使用されるかかる分子の別の例は、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドであり、ここで、選択された導入遺伝子配列および関連する調節因子は、５’ＡＡＶ ＩＴＲ配列および３’ヘアピン形成ＲＮＡ配列に隣接する。ＡＡＶ ＩＴＲ配列は、現在同定されている哺乳動物ＡＡＶ型を含有する、任意の公知のＡＡＶから得てもよい。

いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶは、シュードタイプ化したｒＡＡＶである。例えば、Ｙのタンパク質でカプシド形成された血清型ＸのＩＴＲを含むシュードタイプ化したＡＡＶベクターは、ＡＡＶＸ／Ｙとして命名されるであろう（例えば、ＡＡＶ２／１は、ＡＡＶ２のＩＴＲおよびＡＡＶ１のカプシドを有する）。いくつかの態様において、シュードタイプ化したｒＡＡＶは、１つのＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質の組織特異的ターゲティング能力を、別のＡＡＶ血清型からのウイルスＤＮＡと組み合わせて、それにより、標的組織への導入遺伝子のターゲティングされた送達を可能にするために有用であり得る。

所望されるカプシドタンパク質を有する組み換えＡＡＶを得るための方法は、当該分野において周知である（例えば、ＵＳ２００３／０１３８７７２を参照；その内容は、本明細書においてその全体において参考として援用される）。典型的には、方法は、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする核酸配列；機能的ｒｅｐ遺伝子；ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）および導入遺伝子から構成される組み換えＡＡＶベクター；ならびにＡＡＶカプシドタンパク質中への組み換えＡＡＶベクターパッケージングを可能にするために十分なヘルパー機能を含む宿主細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、カプシドタンパク質は、ＡＡＶのｃａｐ遺伝子によってコードされる構造タンパク質である。ＡＡＶは、３つのカプシドタンパク質であるビリオンタンパク質１〜３（ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と命名される）を含み、その全ては、選択的スプライシングを介して、単一のｃａｐ遺伝子から転写される。いくつかの態様において、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の分子量は、夫々約８７ｋＤａ、約７２ｋＤａおよび約６２ｋＤａである。いくつかの態様において、翻訳の際、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムのまわりの球状の６０マーのタンパク質シェルを形成する。いくつかの態様において、カプシドタンパク質の機能は、ウイルスゲノムを保護し、ゲノムを送達し、宿主と相互作用することである。いくつかの側面において、カプシドタンパク質は、ウイルスゲノムを組織特異的様式で宿主に送達する。

いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３９、ＡＡＶｒｈ４３、ＡＡＶ２／２−６６、ＡＡＶ２／２−８４、ＡＡＶ２／２−１２５からなる群から選択されるＡＡＶ血清型である。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、非ヒト霊長目の動物由来の血清型、例えばｓｃＡＡＶ．ｒｈ８、ＡＡＶ．ｒｈ３９、またはＡＡＶ．ｒｈ４３血清型である。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９血清型である。

rAAVベクターをAAVカプシド中にパッケージングするために宿主細胞において培養されるべき成分は、宿主細胞にトランスで提供してもよい。あるいは、必要とされる成分（例えば、組み換えAAVベクター、rep配列、cap配列、および／またはヘルパー機能）のうちの任意の１以上を、当業者に公知の方法を用いて必要とされる成分のうちの１以上を含むように操作された、安定な宿主細胞により提供させることができる。最も好適には、かかる安定な宿主細胞は、必要とされる成分を誘導性プロモーターの制御下に含むであろう。しかし、必要とされる成分は、構成的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性および構成的プロモーターの例は、本明細書において、導入遺伝子と共に用いるために好適な調節エレメントの議論において提供される。なお別の選択肢において、選択される安定な宿主細胞は、選択される成分を構成的プロモーターの制御下に、他の選択される成分を１以上の誘導性プロモーターの制御下に含んでもよい。例えば、293細胞（これは、E1ヘルパー機能を構成的プロモーターの制御下に含む）に由来するが、repおよび／またはcapタンパク質を誘導性プロモーターの制御下に含む、安定な宿主細胞を作製することができる。当業者は、なお他の安定な宿主細胞を作製することができる。

本開示のrAAVを生成するために必要とされる組み換えAAVベクター、rep配列、cap配列、およびヘルパー機能は、任意の適切な遺伝子エレメント（ベクター）を用いて、パッケージング宿主細胞に送達することができる。選択される遺伝子エレメントは、本明細書において記載されるものを含む任意の好適な方法により送達することができる。本開示の任意の態様を構築するために用いられる方法は、核酸操作における技術を有する当業者に公知であり、遺伝子工学、組み換え工学および合成技術を含む。例えば、Sambrook et al, Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）を参照。同様に、rAAVビリオンを作製する方法は、周知であり、好適な方法の選択は、本開示に対する限定ではない。例えば、K. Fisher et al, J. Virol., 70:520-532 (1993)および米国特許第5,478,745号を参照。

アデノウイルスベクター
アデノウイルスゲノムは、複数の重度にスプライシングされた転写産物を含む、非エンベロープの大きな（３６−ｋｂ）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）分子である。アデノウイルスは、高いパッケージング能力（〜８キロベース）を有し、***および非***細胞の広範な範囲を標的とすることができる。アデノウイルスは、宿主ゲノムには組み込まれず、よって宿主細胞中で一過的な導入遺伝子発現を生成するのみである。アデノウイルスゲノムのいずれかの末端において、末端反復配列（ＩＴＲ）が存在する。アデノウイルスゲノムによってコードされる遺伝子は、初期（Ｅ１−Ｅ４）および後期（Ｌ１−Ｌ５）転写産物に分けられる。ほとんどのヒトアデノウイルスベクターは、細胞に侵入するのにコクサッキーアデノウイルス受容体を使用する、Ａｄ５ウイルス型に基づいている。

組み換えアデノウイルスは、そのゲノムからＥ１およびＥ３遺伝子が欠失している。Ｅ１の欠失は、ウイルス複製を不完全とする；Ｅ１は、ＨＥＫ２９３細胞などのアデノウイルスパッケージング細胞株によって提供される。Ｅ３は、宿主細胞免疫の回避に関与しており、ウイルス産生に必須ではない。これら２つの構成要素の欠失は、＞８キロベースの導入遺伝子パッケージング能力を生じる。

本開示の方法は、目的の核酸（単数または複数）をコードする組み換えアデノウイルスベクターを記載する。組換えアデノウイルスベクターの産生は、導入ベクターおよびアデノウイルスベクターの両方を包含する。アデノウイルスにおいてパッケージングされる導入遺伝子は、最初に、導入ベクターに配置される。アデノウイルスゲノム中の挿入部位における配列に相補的である左側および右側の隣接配列を含有する組み換え導入ベクターは、相同組み合わせ（ＨＲ）によるアデノウイルスプラスミドへの導入遺伝子の挿入を容易にする。左側および右側の配列は、ＨＲにおけるＤＮＡ ＤＳＢを修復するために鋳型として使用され、それにより、アデノウイルスプラスミドへの導入遺伝子の誤りのない挿入を容易にする。本開示の方法は、宿主細胞中の１以上のアクセサリープラスミドの使用を記載する。レトロウイルス系において、アクセサリープラスミドは、Ｅ１およびＥ３遺伝子以外のウイルスパッケージングに必要な全ての構成要素をコードするパッケージングプラスミドである。さらなるアクセサリープラスミドは、パッケージング細胞にＥ１遺伝子を提供することが必要とされる。

レトロウイルスベクター
レトロウイルス（ほとんど一般にγ−レトロウイルス）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの構造タンパク質および酵素タンパク質（逆転写酵素およびインテグラーゼを包含する）から構成されるＲＮＡウイルスである。一旦宿主細胞の内側へ入ると、レトロウイルスは、ウイルスゲノムからＤＮＡプロウイルスを産生するために逆転写酵素を使用する。次いで、インテグラーゼタンパク質は、目的の核酸（単数または複数）をコードするウイルスゲノムの産生のために、このプロウイルスを宿主ゲノムに組み込む。レトロウイルスは、相対的に高い量のＤＮＡ（８キロベースまで）をパッケージングすることができるが、非***細胞に感染することはできず、宿主細胞ゲノムに無作為に挿入する。

レトロウイルスの導入およびパッケージングベクターは、上に記載のレンチウイルス系と同様である。レトロウイルス導入ベクターは、典型的には、ＬＴＲに隣接して目的の核酸をコードし、これは、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）配列に由来する。本開示の方法は、１以上のアクセサリープラスミドの使用を記載する。レトロウイルスについては、アクセサリープラスミドは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子をコードするパッケージングプラスミドおよびｅｎｖ遺伝子をコードするエンベローププラスミドである。レンチウイルス系におけるように、ｇａｇ遺伝子は、３つのウイルスコアタンパク質に翻訳される：マトリックス（ＭＡ）タンパク質、これは、ビリオンアセンブリおよび非***細胞の感染に必要である；カプシド（ＣＡ）タンパク質、これは、ビリオンの疎水性コアを形成する；およびヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質、これは、コーティングによってウイルスゲノムを保護し、ＲＮＡと密接に会合する。ｐｏｌ遺伝子は、ウイルス複製に不可欠な、ウイルスプロテアーゼ、逆転写酵素、およびインテグラーゼ酵素をコードする。

細胞
「宿主細胞」とは、目的の物質を内部に持つか、またはこれを内部に持つことができる、または、目的の核酸をウイルス粒子にパッケージングすることができる、任意の細胞を指す。しばしば、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。宿主細胞の例は、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、ハムスター細胞、サル細胞、昆虫細胞、植物細胞、または細菌細胞を包含する。昆虫細胞の例は、これらに限定されないが、Spodoptera frugiperda（例として、Ｓｆ９、Ｓｆ２１）、Spodoptera exigua、Heliothis virescens、Helicoverpa zea、Heliothis subflexa、Anticarsia gemmatalis、Trichopulsia ni （例として、High-Five細胞）、Drosophila melanogaster (例として、Ｓ２、Ｓ３)、Antheraea eucalypti、Bombyx mori、Aedes alpopictus、Aedes aegyptii、およびその他を包含する。細菌細胞の例は、これらに限定されないが、Escherichia coli、Corynebacterium glutamicum、およびPseudomonas fluorescensを包含する。酵母細胞の例は、これらに限定されないが、Saccharomyces cerevisiae、Saccharomyces pombe、Pichia pastoris、Bacillus sp.、Aspergillus sp.、Trichoderma sp.、およびMyceliophthora thermophila C1を包含する。植物細胞の例は、これらに限定されないが、Nicotiana sp.、Arabidopsis thaliana、Mays zea、Solanum sp.、またはLemna spを包含する。

いくつかの態様において、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞の例は、ヘンリエッタラックス腫瘍（ＨｅＬａ）細胞およびベイビーハムスター腎臓（ＢＨＫ−２１）細胞を包含する。いくつかの態様において、宿主細胞は、ヒト細胞、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。宿主細胞は、１以上のウイルス導入ベクターおよび１以上のアクセサリープラスミドのレシピエントとして使用され得る。この用語は、それがトランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書において用いられる場合、外因性DNA配列でトランスフェクトされた細胞を指し得る。単一の親細胞の子孫は、天然の、偶発的な、または計画的な変異に起因して、形態学において、またはゲノムもしくは全DNAの補完物（complement）において、元の親と必ずしも完全に同一でなくともよい。

本明細書において用いられる場合、用語「細胞株」は、in vitroでの持続的または長期の増殖および***が可能な細胞の集団を指す。しばしば、細胞株は、単一の前駆細胞に由来するクローンの集団である。さらに、当該分野において、かかるクローン集団の貯蔵またはトランスファーの間に、核型において自発的なまたは誘導される変化が起こり得ることが知られている。したがって、言及される細胞株に由来する細胞は、祖先の細胞または培養物と正確に同一でない場合があり、言及される細胞株は、かかるバリアントを含む。
本明細書において用いられる場合、用語「組み換え細胞」とは、生物学的に活性なポリペプチドの転写またはRNAなどの生物学的に活性な核酸の産生をもたらすDNAセグメントなどの外因性DNAセグメントが導入されている細胞を指す。

本開示の側面は、ベクター収率、ウイルス力価、および／または組み換えウイルス粒子（例として、ｒＡＡＶ粒子）の産生を宿主細胞において改善するための組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本開示によって記載される方法は、ベクター収率、ウイルス力価、および／または組み換えウイルス粒子（例として、ｒＡＡＶ粒子）を、直交性（宿主細胞に関して）阻害性核酸および同族結合部位のペアを使用しないウイルス粒子産生の方法と比較して、約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、またはそれ以上（例として、２０倍、１００倍、２００倍、１０００倍、またはそれ以上）改善する。

例１
本開示は、一般に、遺伝子発現ベクターの力価を改善するための、および、産生（例として、パッケージング）効率を増加させるための方法に関する。図１は、遺伝子発現ベクターのいくつかの非限定例を提供する。

ある導入遺伝子（例として、パッケージング細胞に毒性であるかまたはウイルスベクターパッケージング系と非親和性である導入遺伝子産物）を含むウイルスベクターの産生は、いくつかの課題（例えば、極めて低い力価またはウイルスベクターの非産生）に直面している。低い力価またはウイルスベクターの非産生の可能性のある原因は、例えば、ベクター構築物の悪い品質、ベクター構築物におけるパッケージングシグナル／複製起源の変異または欠失、ベクターゲノム複製を妨げる高い熱安定性を有する２次構造、または他の因子（例として、細胞傷害性導入遺伝子またはベクターゲノム複製またはパッケージングと干渉する導入遺伝子）を包含する。

例えば、回文配列がｒＡＡＶゲノム均一性および収率を損なうことが観察されている（図２Ａ−２Ｃ）。図２Ａは、Ｈ１プロモーターによって駆動されてＡｐｏｂを標的とするか、または、Ｕ６プロモーターによって駆動されてホタルルシフェラーゼ遺伝子（Ｆｌｕｃ）を標的とする、ｓｈＲＮＡカセットを含む自己相補的なＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）プラスミドの概略図を示す。手短に言うと、細胞は、発現構築物で形質転換されて、アガロース分析が実施された。切断型ウイルスゲノムは、全てのｓｈＲＮＡカセットについてのレーンで観察されたが、対照カセットでは観察されなかった（ｓｈＲＮＡなし）（図２Ｂ）。ベクターは、ＡＡＶ９カプシドにパッケージングされ、ＥＧＦＰプライマー／プローブセットを使用するｑＰＣＲによって収率について査定された。データは、ｓｈＲＮＡコーディング配列が構築物の野生型ＩＴＲ（ｗｔＴＲ）に非常に近接しているときに、低いＡＡＶ収率を示すことを指示する（図２Ｃ）。よって、いくつかの態様において、導入遺伝子の２次構造は、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターのパッケージングまたは収率を損なう。

第３世代のレンチウイルスベクターの産生の概略図が、図３に提供される。手短に言うと、パッケージング細胞（例として、ＨＥＫ２９３Ｔ）は、４つのプラスミドで形質転換される：ｇａｇ遺伝子を含むパッケージングプラスミド、Ｅｎｖコーディングプラスミド、Ｒｅｖコーディングプラスミド、および導入遺伝子を含むベクタープラスミド。

導入遺伝子の細胞傷害性は、例えば、レンチウイルスベクターの文脈において、減少したウイルス複製および／またはパッケージング効率を生じ得る。したがって、細胞傷害性導入遺伝子（例として、ＥＧＦＰ−（ＧＲ）_８０（ＡＬＳ／ＦＴＤ関連ジペプチド反復タンパク質）またはＡｐｏｌ１（アポリポタンパク質Ｌ１）を保有する２つのレンチウイルスベクターの産生が調査された。細胞は、ＧＦＰ（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ、上図）または８０マーのグリシン−アルギニン（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０）ジアミノ酸反復ペプチドに融合されたＧＦＰのいずれかを発現するレンチウイルスベクターで感染された。蛍光イメージングは、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰと比べて低い、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０による細胞の形質導入を示し、ＧＦＰを含むベクターと比べて低い、細胞傷害性タンパク質（ＧＲ_８０）を含むベクターの複製またはパッケージング効率を指示する（図４）。

パッケージング不可能な(unpackagable)（例として、細胞傷害性）導入遺伝子を含むウイルスベクターの複製および／またはパッケージングを増加させるための手法が開発された（図５）。手短に言うと、パッケージング細胞は、ウイルスベクター産生プラスミド（単数または複数）およびパッケージング不可能な（例として、細胞傷害性）導入遺伝子に特異的な干渉ＲＮＡ分子（例として、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、等々）を発現することが可能なプラスミドでコトランスフェクトされる。パッケージングの間の導入遺伝子発現の一過的なサイレンシング（例として、Ａｇｏ２などのＲＮＡｉ機構によって媒介される）は、ウイルスベクター複製およびパッケージングを増加させて、増加した収率を導く。

細胞は、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０特異的ｓｈＲＮＡを発現するプラスミドによる一過的な遺伝子発現サイレンシングの間にパッケージングされた、ＧＦＰ（Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ、図６ 上図）、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０（図６、中央図）、またはＬｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０のいずれかを発現するレンチウイルスベクターで感染させた（図６、下図）。蛍光イメージングは、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰと比較して低い、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０による細胞の形質導入を示し、ＧＦＰを含むベクターと比べて低い、細胞傷害性タンパク質（ＧＲ_８０）を含むベクターの複製またはパッケージング効率を指示する。しかしながら、ＧＦＰ−ＧＲ_８０の有意に増加した形質導入および発現が、Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＧＲ_８０＋ｓｈＲＮＡ−ＧＦＰで形質導入された細胞で観察され、ベクターパッケージング間の導入遺伝子発現の一過的なサイレンシングは、高い力価および機能的なウイルスベクターを生じる。

漸増数のｍｉＲＮＡ結合部位が導入遺伝子構築物に組み込まれるとき、ＲＮＡｉ効力が増加することが観察されている。例えば、０、１、または３つのｍｉＲ−１２２結合部位が、ｎＬａｃＺ発現構築物に組み込まれた。Ｈｕｈ７細胞は、各構築物でトランスフェクトされて、ｎＬａｃＺ発現が測定された。データは、１または３つのｍｉＲ−１２２結合部位を有する構築物でトランスフェクトされた細胞中での減少した導入遺伝子（ｎＬａｃＺ）発現を指示する（図８）。導入遺伝子発現における同様の減少がまた、マウス肝臓において観察された（図８）。

図９は、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）とそれらの標的部位との間の相互作用による特定および効率的な遺伝子サイレンシングを示す。細胞は、３３３Ｔまたは８５６Ｔのいずれかに特異的な複数のｍｉＲＮＡ結合部位（これらは、公知の哺乳動物ｍｉＲＮＡによって結合されない配列である）を含むＥＧＦＰ構築物およびｍｉＲ−３３３またはｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡのいずれかを発現するプラスミドでコトランスフェクトされた。ｍｉＲ−３３３およびｍｉＲ−８５６ならびにそれらの各結合部位の配列は、以下の表１に示される。

データは、ｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ対照プラスミドではなく、ｍｉＲ−３３３ ａｍｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ−３３３Ｔ発現のサイレンシングを指示する。データは、ｍｉＲ−３３３ ａｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ対照プラスミドではなく、ｍｉＲ−８５６ ａｍｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞におけるＥＧＦＰ−８５６Ｔ発現のサイレンシングを指示する。

上に記載のデータに基づいて、パッケージング不可能である（例として、細胞傷害性）導入遺伝子を含むウイルスベクターの複製および／またはパッケージングを増加させるための第２の手法もまた開発された（図７）。手短に言うと、１以上（例として、３）の人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）結合部位は、パッケージング不可能である（例として、細胞傷害性）導入遺伝子を含むプラスミド中に操作される。パッケージング細胞は、ウイルスベクター産生プラスミド（単数または複数）および産生プラスミド中に操作される結合部位に特異的なａｍｉＲＮＡを発現することができるプラスミドでコトランスフェクトされる。パッケージング期の間、ａｍｉＲＮＡは、導入遺伝子上に位置する標的部位に結合し、導入遺伝子発現を一過的にサイレンシングし、改善されたウイルス力価およびパッケージング効率を生じる。

アポリポタンパク質Ｌ１（Ａｐｏｌ１）を発現できるレンチウイルスベクター（これは、典型的には、従来のウイルスベクター産生手順を使用してパッケージングすることができない）は、図７に概略される手法を用いて産生された。手短に言うと、３つのｍｉＲ−８５６結合部位（３ｘ８５６Ｔ）は、Ａｐｏｌ１レンチウイルス発現構築物に組み込まれた。パッケージング細胞は、Ａｐｏｌ１発現構築物およびａｍｉＲ−８５６を発現するプラスミドでコトランスフェクトされた（図１０、左側）。データは、ベクター力価が漸増ａｍｉＲ−８５６濃度とともに増加することを示し、パッケージングの間の導入遺伝子（例として、Ａｐｏｌ１）発現の増加したサイレンシングが、Ｌｅｎｔｉ−Ａｐｏｌ１ベクター産生の効率を増加させることを指示する（図１０、右側）。加えて、データは、導入遺伝子発現のサイレンシングの間にパッケージングされているベクター（例として、Ｌｅｎｔｉ−Ａｐｏｌ１）によって発現されるアポリポタンパク質Ｌ１が、対照Ｌｅｎｔｉ−ＧＦＰベクターではなくＬｅｎｔｉ−Ａｐｏｌ１ベクターで感染された細胞の死滅によって証明されるように、機能的であることを指示する（図１１）。

要するに、例に記載されるデータは、ウイルスベクター産生のパッケージング期の間の、コトランスフェクションの導入遺伝子発現の一過的な抑制が、（かかるベクターが細胞傷害性または他にパッケージング不可能な導入遺伝子を含んでいたとしても）首尾よく、高い力価および機能的なウイルス（例として、レンチウイルス）ベクターを産生したことを実証している。

Claims (32)

1. 組み換えウイルス産生収率を制御するための方法であって、以下：
   （ｉ）宿主細胞に導入遺伝子を含む第１核酸を導入すること；
   （ｉｉ）宿主細胞に干渉核酸を発現することができる第２核酸を導入すること、ここで、干渉核酸は導入遺伝子の発現を特異的に阻害する；
   （ｉｉｉ）宿主細胞内で導入遺伝子を含む核酸を複製すること；および
   （ｉｖ）任意に、宿主細胞から第１核酸を含むウイルス粒子を単離すること
   を含む、前記方法。
2. 宿主細胞は、ウイルスベクターパッケージング細胞である、請求項１に記載の方法。
3. 宿主細胞は、哺乳動物細胞である、請求項１または２に記載の方法。
4. 宿主細胞は、ヒト細胞、任意にＨＥＫ２９３Ｔ細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 宿主細胞は、昆虫細胞、任意にSpodoptera frugiperda (Sf9)細胞である、請求項１または２に記載の方法。
6. 第１核酸は、レンチウイルス導入プラスミド、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、またはレトロウイルスベクターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 第１核酸は、レンチウイルス導入ベクターであり、少なくとも１つの末端反復配列（ＬＴＲ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 第１核酸は、ＡＡＶベクターであり、少なくとも１つの逆位反復配列（ＩＴＲ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９ ＩＴＲである、請求項８に記載の方法。
10. ＡＡＶベクターは、少なくとも１つのΔＩＴＲまたはｍＴＲを含む自己相補的なＡＡＶベクターである、請求項８または９に記載の方法。
11. 第１核酸は、レトロウイルス導入プラスミドであり、少なくとも１つの末端反復配列（ＬＴＲ）を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
12. 導入遺伝子の発現は、宿主細胞中のウイルスベクターパッケージングと干渉する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 導入遺伝子は、細胞傷害性であるか、または、宿主細胞のフィットネスに有害な生理化学的特徴（例として、導入遺伝子は、高い熱安定性を有する２次構造を形成するタンパク質をコードする）を１以上含む、請求項１２に記載の方法。
14. 第１核酸によってコードされる転写産物は、阻害性核酸のための１以上の結合部位を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 阻害性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または人工のｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）であり、任意に１以上の結合部位は、配列番号３および４から選択される配列を含む、請求項１４に記載の方法。
16. １以上の結合部位の各々の配列は、宿主細胞の内在性のｍｉＲＮＡによって認識されない、請求項１４または１５に記載の方法。
17. １以上の結合部位は、転写産物の最終コドンとポリＡテールとの間に位置する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. １以上の結合部位は、転写産物の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に位置する、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
19. 第２核酸は、低分子ヘアピンＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはａｍｉＲＮＡを発現する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 第２核酸は、導入遺伝子をコードする核酸に結合するｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡを発現する、請求項１９に記載の方法。
21. ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、非ヒト細胞中で発現されるｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
22. ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、昆虫細胞または植物細胞中で発現されるｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
23. ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、植物細胞中で発現されるｍｉＲＮＡ配列を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
24. ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３３３配列（配列番号１）またはｍｉＲ−８５６配列（配列番号２）を含み、任意にａｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０足場を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 宿主細胞は、１以上のアクセサリープラスミドをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. １以上のアクセサリープラスミドの各々は、パッケージングプラスミド、Ｅｎｖコーディングプラスミド、Ｒｅｖコーディングプラスミド、Ｒｅｐコーディングプラスミド、またはＣａｐコーディングプラスミドから選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 第１核酸および第２核酸は、宿主細胞に同時に導入される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 第１核酸および第２核酸は、宿主細胞に個別に導入される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
29. 第１核酸および第２核酸は、同じプラスミド上に位置する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
30. 導入遺伝子発現の阻害は、一過的である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 導入遺伝子発現の阻害は、持続性である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
32. 宿主細胞から単離されたウイルス粒子から発現された導入遺伝子が、機能的である、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。