JP2019097478A - Methods of cell collection - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、網目状シートを細胞培養基材として含む細胞培養モジュールにおいて、培養した接着性細胞を網目状シートから剥離、回収するための方法に関する。 The present invention relates to a method for detaching and recovering cultured adhesive cells from a reticulated sheet in a cell culture module containing the reticulated sheet as a cell culture substrate.
再生医療・細胞移植治療に用いる細胞の製造、あるいはバイオ医薬品の製造において、細胞を低コストで効率よく培養することは高度の要求事項となっている。例えば、再生医療において体性幹細胞を用いる場合は、患者の脂肪組織や骨髄から採取した体性幹細胞(間葉系幹細胞)を必要な細胞数まで体外で増幅させて治療に用いるのが一般的であるが、多くの人がこうした治療を受けるようになるためには細胞の製造コストを現状よりも低く抑える必要がある。また、バイオ医薬品の例では、ヒト型モノクローナル抗体の医薬品は製造コストが高いため薬価が高く、そのため治療費は高額となり、患者及び国の医療費負担が大きいのが現状である。 In the production of cells used for regenerative medicine / cell transplantation treatment, or in the production of biopharmaceuticals, efficiently culturing cells at low cost has become a high requirement. For example, when somatic stem cells are used in regenerative medicine, it is common to amplify somatic stem cells (mesenchymal stem cells) collected from the adipose tissue or bone marrow of a patient to the required number of cells outside the body for treatment. However, in order for many people to receive such treatment, it is necessary to keep the cell production cost lower than the present. Furthermore, in the case of biopharmaceuticals, pharmaceutical products of human monoclonal antibodies are expensive because they are expensive to manufacture, and so treatment costs are high, and the medical expenses of patients and the country are large.
こうした課題を解決するため、細胞を効率よく増殖させる様々な手法やデバイスが開発されてきた。例えば、人工透析に用いられるような透過性中空糸膜からなるモジュールを細胞培養に転用した形態のもの、あるいは平面フラスコを多層に重ねた形態のものなどが利用されている。 In order to solve these problems, various methods and devices for efficiently proliferating cells have been developed. For example, a form in which a module made of a permeable hollow fiber membrane used for artificial dialysis is diverted to cell culture, or a form in which flat flasks are stacked in multiple layers is used.
特許文献1には、細胞の増殖及び成長用の中空糸膜型バイオリアクターであって、細胞空間(中空糸膜中空部)および無細胞空間(中空糸膜外側)にそれぞれ異なる培地を循環するための液流回路を有するバイオリアクタシステムが開示されている。しかし、中空糸膜をモジュール化するには煩雑な工程を経る必要があり、簡便・低コスト化することは困難である。 Patent Document 1 discloses a hollow fiber bioreactor for cell growth and growth, in which different media are circulated in a cell space (hollow fiber hollow portion) and a cell-free space (outside the hollow fiber membrane). A bioreactor system is disclosed having a fluid flow circuit. However, modularization of hollow fiber membranes requires complicated steps, which makes it difficult to achieve simplification and cost reduction.
また、多層型フラスコは培養面積に限界があり、多層化することによる重量増やスペース増が問題となっている。更に、細胞をビーズのような小さな粒子担体に接着させ、これを浮遊させて攪拌培養を行うことで接着細胞を浮遊細胞と同様に培養することが可能である。これを利用した高密度培養システムもあるが、攪拌される際に、細胞がダメージを受けたり、細胞回収時にビーズの破片が混入するなどの問題があり、これは特に細胞そのものを治療に使用する再生医療においては問題となる。 In addition, the multi-layered flask has a limited culture area, and the increase in weight and space due to the multi-layering has become a problem. Furthermore, it is possible to culture the adherent cells in the same manner as the floating cells by attaching the cells to a small particle carrier such as beads and suspending it for agitation culture. There are also high-density culture systems using this, but there is a problem such as damage to the cells when mixing, and contamination of bead fragments at the time of cell recovery, which especially use the cells themselves for treatment It is a problem in regenerative medicine.
こうした問題を解決する方法として、網目状(メッシュ)シートを複数枚収納した細胞培養用モジュールを用いる細胞培養方法がある。網目状シートの細胞培養モジュールは、簡便に製造することが出来るうえ、効率よく高密度の細胞培養を行うことが可能である。 As a method for solving such a problem, there is a cell culture method using a cell culture module containing a plurality of mesh-like (mesh) sheets. The reticulated sheet cell culture module can be easily manufactured and can perform high-density cell culture efficiently.
このような細胞培養モジュールを用いて高密度の細胞培養を実施する際の課題の一つは、培養増殖させた多量の細胞を効率よく回収することにある。培養基材(網目状シート)の表面で高密度に達した培養細胞は、自身が分泌した細胞外マトリックスなどにより強固に培養面に接着していることがある。このため培養した細胞を回収する際に用いるタンパク分解酵素液などの細胞剥離剤を使用するだけでは、所望のとおり細胞を回収できない結果となる。すなわち、網目状シートを収納した細胞培養モジュールを用いた細胞培養において、高密度状態で効率よく細胞培養を行うと同時に、増殖させた細胞を効率よく回収することが求められている。 One of the problems in performing high-density cell culture using such a cell culture module is to efficiently recover a large number of cells grown in culture. Cultured cells that reach a high density on the surface of the culture substrate (reticulated sheet) may be firmly adhered to the culture surface by the extracellular matrix or the like that they have secreted. For this reason, it is a result which can not collect | recover a cell as desired only by using cell peeling agents, such as a proteolytic enzyme liquid used when collect | recovering the culture | cultivated cell. That is, in cell culture using a cell culture module containing a reticulated sheet, it is required to efficiently collect cells grown at the same time as efficiently performing cell culture in a high density state.
本発明は、細胞培養基材である網目状シートの表面で培養された細胞を、網目状シートを収納した細胞培養モジュール(容器)内から効率よく回収する方法を提供することを目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for efficiently recovering cells cultured on the surface of a reticulated sheet, which is a cell culture substrate, from a cell culture module (container) containing the reticulated sheet.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出し、本発明に到達した。 MEANS TO SOLVE THE PROBLEM As a result of earnestly examining in order to solve the said subject, this inventor discovered that the said subject could be solved by the means shown below, and arrived at this invention.
すなわち、本発明は、以下の構成からなる。
1.網目状シートを細胞培養基材として収納した細胞培養モジュール内から培養した細胞を回収する方法であって、
i)前記モジュール内の細胞に細胞剥離剤を接触させる工程、および
ii)前記モジュールの外側から直接あるいは間接的に接触させた振動発生装置により振動を与える工程、
を含む細胞回収方法。
2.前記細胞剥離剤が、その一部にタンパク分解酵素を含む、1に記載の細胞回収方法。
3.前記振動発生装置による振動の大きさが2〜80m/s2である、1または2に記載の細胞回収方法。
4.前記振動発生装置により振動を与える時間が10秒〜30分である、1〜3のいずれかに記載の細胞回収方法。
5.前記振動発生装置が振動モーターである、1〜4のいずれかに記載の細胞回収方法。
That is, the present invention is configured as follows.
1. A method of recovering cultured cells from within a cell culture module containing a reticulated sheet as a cell culture substrate,
i) contacting the cells in the module with a cell release agent, and ii) applying vibration by means of a vibration generator brought into contact directly or indirectly from the outside of the module,
Cell recovery method including:
2. The cell recovery method according to 1, wherein the cell release agent partially contains a proteolytic enzyme.
3. The cell recovery method according to 1 or 2, wherein the magnitude of vibration by the vibration generator is 2 to 80 m / s 2 .
4. The cell recovery method according to any one of 1 to 3, wherein the time for applying vibration by the vibration generator is 10 seconds to 30 minutes.
5. The cell recovery method according to any one of 1 to 4, wherein the vibration generator is a vibration motor.
本発明により、細胞培養モジュール内の網目状シート上で培養された細胞を高効率に剥離、回収する方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a method for exfoliating and recovering cells cultured on a reticulated sheet in a cell culture module with high efficiency.
(網目状シート)
本発明において、網目状シートの素材は、細胞を網目状シート表面に保持できる構造をとることができるものであれば、特に限定されない。例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、ポリアクリロニトリル、フッ素系樹脂、ポリアミド、ポリエステル等の水不溶性の合成樹脂が好適に利用できる。また、綿、麻、竹、紙などの植物性線維、羊毛、絹などの動物性線維など、天然線維を用いることもできる。また、合成樹脂製線維と天然線維とを混紡してもよい。さらに、ガラス線維やカーボンでもよく、アルミナ(Al2O3)などのセラミックス系、さらにステンレス、鋼、アルミニウム、金、プラチナなどの金属も使用できる。また、これらの誘導体が主成分であっても良い。また、網目状シートはこれらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されていてもよい。親水化処理することにより、培養細胞の網目状シート表面への接着が容易になる。また、使用する細胞に応じて、網目状シートへの接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコーティングしたものでも良い。
(Reticulated sheet)
In the present invention, the material of the reticulated sheet is not particularly limited as long as it can have a structure capable of holding cells on the reticulated sheet surface. For example, water-insoluble synthetic resins such as polyethylene, polypropylene, polystyrene, polyvinyl alcohol, polymethyl methacrylate, polyacrylonitrile, fluorine-based resin, polyamide, and polyester can be suitably used. In addition, natural fibers such as vegetable fibers such as cotton, hemp, bamboo and paper, and animal fibers such as wool and silk can also be used. Also, synthetic resin fibers and natural fibers may be blended. Furthermore, glass fibers or carbon may be used, and ceramics such as alumina (Al 2 O 3 ) and metals such as stainless steel, steel, aluminum, gold, platinum and the like can also be used. In addition, these derivatives may be main components. Further, the reticulated sheet may be one obtained by chemically modifying these materials, and may be, for example, hydrophilized. By hydrophilizing treatment, adhesion of cultured cells to the reticulated sheet surface is facilitated. Moreover, according to the cell to be used, what coated collagen, fibronectin, etc. may be used in order to improve the adhesiveness to a reticulated sheet.
本発明において、網目状シートの線径は、好ましくは100μm〜2000μm程度のものが利用され得る。線径は、網目状シートが適度な強度を保ち、かつ網目間の培養液等の物質の通過に大きな支障がない範囲であればよい。網目状シート上に細胞を播種し、細胞培養を行う場合は、網目状シートの線径は、細胞の増殖する面積、細胞密度や培地との接触度合い、培地の流れなどに影響することから、本発明のメリットを活かす要件となる。線径の測定は、例えば、網目状シートを網目が判別できる程度の倍率で撮影した画像をImageJ(NIH製)、WINROOF(三谷商事製)およびNIS Element D3.00 SP6(ニコン製)等の画像解析ソフトを用いて行うことができる。 In the present invention, the wire diameter of the reticulated sheet may preferably be about 100 μm to 2000 μm. The wire diameter may be in such a range that the reticulated sheet maintains an appropriate strength and there is no significant hindrance to the passage of a substance such as a culture solution between the meshes. When cells are seeded on a reticulated sheet and cell culture is performed, the wire diameter of the reticulated sheet affects the area in which the cells grow, the cell density, the degree of contact with the medium, the flow of the medium, etc. It is a requirement that makes use of the merits of the present invention. For measurement of the wire diameter, for example, an image obtained by photographing a mesh sheet at a magnification that allows the mesh to be discriminated is an image such as ImageJ (manufactured by NIH), WINROOF (manufactured by Mitani Corp.), NIS Element D3.00 SP6 (manufactured by Nikon), etc. It can be performed using analysis software.
本発明において、網目状シートの目開きは、多少のばらつきがあっても構わないが出来るだけ一定であることが望ましい。目開きは、特に限定されるものではないが、細胞の増殖や培養液の流れを妨げない方が望ましく、10μm〜1000μm程度であることが好ましい。さらに、目開きは、培養に伴う各種生体成分の目詰まり等の影響も受ける可能性もあり、最適な設計は、これらの物質との相互作用を鑑みて実施されるべきものである。目開きの測定は、以下に示すような方法で行うことができる。例えば、網目状シートを網目が判別できる程度の倍率で撮影した画像を前記ImageJ、WINROOF、NIS Element D3.00 SP6等の画像解析ソフトにより2値化処理を行う。画像解析ソフトにより算出される「Average Size[pixel2]」と、解析に用いた画像の縮尺情報[pixel/μm]から、網目(空隙)部の平均面積[μm2]を求め、網目を正方形と仮定して、一辺の長さ[μm]を算出する。得られた一辺の長さを網目状シートの目開きとする。 In the present invention, the openings of the mesh sheet may have some variations, but it is desirable that they be as constant as possible. Although the mesh size is not particularly limited, it is desirable that the mesh size and the flow of the culture solution are not impeded, and it is preferably about 10 μm to 1000 μm. Furthermore, the openings may also be affected by clogging of various biological components involved in culture, etc., and an optimum design should be performed in view of the interaction with these substances. The measurement of the opening can be performed by the following method. For example, an image obtained by photographing a mesh-like sheet at a magnification that makes it possible to discriminate a mesh is binarized using image analysis software such as ImageJ, WINROOF, or NIS Element D3.00 SP6. The average area [μm 2 ] of the mesh (void) part is determined from “Average Size [pixel 2 ]” calculated by the image analysis software and the scale information [pixel / μm] of the image used for analysis, and the mesh is a square Assuming that, the length [μm] of one side is calculated. The length of one side obtained is taken as the opening of the mesh sheet.
(細胞培養モジュール)
本発明において、細胞培養モジュールは、モジュールケースに1枚または複数枚の網目状シートを螺旋および/または円筒形に巻回積層したものを収納することにより簡単に作製することができる。このような細胞培養モジュールは、容積あたりの培養面積を大きくすることができるため好ましい。また、培養操作も簡便化することが出来、効率よく細胞培養を実施することが出来る。例として、螺旋に巻いた網目状シートを筒状容器(モジュールケース)に入れた細胞培養モジュールの模式図を図1に示す。
(Cell culture module)
In the present invention, the cell culture module can be easily prepared by housing one or a plurality of reticulated sheets in a spiral and / or cylindrical form in a module case. Such a cell culture module is preferable because the culture area per volume can be increased. In addition, culture procedures can be simplified, and cell culture can be performed efficiently. As an example, a schematic view of a cell culture module in which a mesh sheet wound in a spiral is placed in a cylindrical container (module case) is shown in FIG.
図1は、2つの出入口を有するモジュールケース4に網目状シート2が螺旋に巻かれた状態で収納され、網目状シート2の両端部が樹脂3によりモジュールケース4に接着固定された形態となっている細胞培養モジュールを示している。この際、モジュール内に収納された網目状シートが互いに近すぎると、培養した細胞が内側または外側のシートにも接着してしまい回収し難くなることがある。そのため、互いに接触しない程度に間隙を設けた状態で固定されているのが好ましい。また、モジュール内部はポート5aおよび5bを介して外部と連通する構造となっている。 In FIG. 1, the mesh sheet 2 is housed in a spirally wound state in a module case 4 having two inlets and outlets, and both ends of the mesh sheet 2 are adhesively fixed to the module case 4 by a resin 3. Shows a cell culture module. At this time, if the reticulated sheets stored in the module are too close to each other, the cultured cells may adhere to the inner or outer sheet and it may be difficult to recover. Therefore, it is preferable to fix in the state which provided the gap to such an extent that it does not contact mutually. Also, the inside of the module is in communication with the outside through the ports 5a and 5b.
細胞培養容器として前記細胞培養モジュールを用いることにより、細胞へ常に新鮮な培地(培養液)や必要なガス等を連続的または断続的に供給することができるため、シャーレや多段フラスコ等を用いた培養において必要な培地の交換作業等が不要となり、作業者の手間やコンタミのリスクを減らすことができる。 By using the above-mentioned cell culture module as a cell culture vessel, fresh medium (culture fluid) and necessary gas can always be supplied continuously or intermittently to cells, so petri dishes, multi-stage flasks, etc. were used. It becomes unnecessary to replace the necessary culture medium, etc., and it is possible to reduce the time and labor of workers and the risk of contamination.
(培養の対象となる細胞)
本発明において、培養の対象となる細胞としては、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来は特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞のいずれも対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、線維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子が導入された細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工された細胞であっても良い。
(Cells to be cultured)
In the present invention, adherent animal cells are suitable as cells to be cultured. The origin of the cells is not particularly limited, and those derived from any animal such as human, pig, dog and mouse can be used. In addition, adherent animal cells can be targeted to both primary culture cells and established cell lines. In addition, primary cells such as epidermal keratinocytes, vascular endothelial cells, fibroblasts, and hepatocytes, and additionally stem cells such as embryonic stem cells, artificial pluripotent stem cells, mesenchymal stem cells, adipose precursor cells, and hepatic stem cells, precursors It may be a cell. In addition, these cells may be cells into which foreign genes have been introduced before culture, or may be cells which have been previously stimulated and processed with stimulators such as antibodies and ligands.
(細胞培養モジュールにおける細胞の培養)
前述の網目状シートを培養基材として収納した細胞培養モジュールを用いて細胞を培養する場合には、出入口の一方から細胞を懸濁した液をモジュール内に流入させることにより、細胞を播種することが出来る。一定時間静置し、細胞を網目状シート表面に接着させた後に、インキュベーター内に設置した細胞培養モジュールに、連続的あるいは断続的に培養液を送液することにより細胞を培養、増殖させることが出来る。培養液は、細胞に必要な養分や酸素・二酸化炭素などのガスを供給する役割を有する。培養に用いられる培養液は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培養液として通常用いられるものであればよい。
(Culture of cells in a cell culture module)
When culturing cells using a cell culture module containing the above-mentioned reticulated sheet as a culture substrate, seed the cells by flowing a solution in which the cells are suspended from one of the port into the module. Can do. After allowing the cells to adhere to the surface of the reticulated sheet for a certain period of time, the culture solution is continuously or intermittently fed to the cell culture module placed in the incubator to culture and grow the cells. It can. The culture solution plays a role of supplying nutrients necessary for cells and gases such as oxygen and carbon dioxide. The culture solution to be used for the culture may be determined according to the type of the cultured cells, and may be any one that is usually used as a culture solution for the cells.
細胞培養における培養液、特に細胞培養モジュール内を流れる培養液の流速については、厳密に制御することが好ましい。培養液は連続的に流しても良いし断続的に流しても良いが、流速が遅すぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流速が速すぎても細胞周囲の環境変化が激しくなるため、細胞が周りの環境に馴染めず増殖しにくくなる。したがって、細胞培養モジュール内を流れる培養液の流速は、細胞増殖度合いや環境に応じて調整することが好ましい。細胞増殖度合いを調べる方法は特に限定されないが、培養液中のグルコースや乳酸塩の濃度等の測定結果をもとに行うことが出来る。 It is preferable to strictly control the flow rate of the culture solution in the cell culture, particularly the culture solution flowing in the cell culture module. The culture solution may be flowed continuously or intermittently. However, if the flow rate is too low, the nutrient supply to the cells is not sufficient and the cells are less likely to grow. On the other hand, even if the flow rate is too high, the environmental change around the cells becomes severe, and the cells become unadapted to the surrounding environment and are difficult to proliferate. Therefore, it is preferable to adjust the flow rate of the culture fluid flowing in the cell culture module according to the degree of cell growth and the environment. The method for examining the degree of cell growth is not particularly limited, but can be performed based on the measurement results of the concentration of glucose and lactate in the culture solution.
(細胞の回収 −プロテアーゼ処理−)
網目状シートを用いて培養した細胞を回収するための手段を例を挙げて説明する。例えば、網目状シート表面において細胞を培養した場合には、培養液の灌流を停止した後、モジュール内の培養液を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液を充分PBSに置換する。次に、PBSを除去し、トリプシン等のプロテアーゼをモジュール内へ充填し、一定時間インキュベートして培養細胞を網目状シート表面から剥離させた後、培養液などをモジュール内へ流入させることにより、細胞を回収することが出来る。プロテアーゼの濃度は、細胞数にもよるが、0.1〜0.5重量%が好ましい。また、プロテアーゼ処理の温度は34〜39℃が好ましく、処理時間は30秒〜30分が好ましい。
(Cell recovery-Protease treatment-)
The means for recovering cells cultured using the reticulated sheet will be described by way of example. For example, when cells are cultured on a reticulated sheet surface, after stopping perfusion of the culture solution, divalent cation free phosphate buffered saline (PBS) is removed to remove the culture solution in the module. Perfusion is performed for a fixed time, and the culture solution is sufficiently replaced with PBS. Next, PBS is removed, a protease such as trypsin is loaded into the module, and incubation is carried out for a certain period of time to exfoliate the cultured cells from the reticulated sheet surface, and then a culture solution etc. is allowed to flow into the module. Can be recovered. The concentration of the protease depends on the number of cells but is preferably 0.1 to 0.5% by weight. Further, the temperature of the protease treatment is preferably 34 to 39 ° C., and the treatment time is preferably 30 seconds to 30 minutes.
(細胞の回収 −振動発生装置−)
前記処理と同時または前記処理の後、細胞培養モジュールに接触させた振動発生装置を駆動させてモジュールに振動を与えることにより、培養細胞を網目状シート表面から剥離させる。その後、培養液などをモジュール内へ流入、排出させ、網目状シート表面から剥離した細胞を培養液とともに回収することが出来る。
(Cell recovery-Vibration generator-)
Simultaneously with the treatment or after the treatment, the cultured cells are detached from the surface of the reticulated sheet by driving the vibration generator brought into contact with the cell culture module to give vibration to the module. Thereafter, a culture solution or the like can be flowed into and discharged from the module, and cells detached from the surface of the reticulated sheet can be recovered together with the culture solution.
本発明において、振動発生装置は、自ら振動を発生する装置であれば、特に限定されない。例えば、モーター軸に偏芯したおもりを付けて回転させることにより振動を発生させるタイプ、磁界中でコイルに電流を流すことにより起こる力を利用して振動を発生させるタイプ(スピーカータイプ)、ピストンを油圧や空気圧によって駆動して振動を発生させるタイプ等の振動発生装置を使用することが出来る。中でも、モーター軸に偏芯したおもりを付けて回転させることにより振動を発生させるタイプ(以降、振動モーターともいう)が、小型化や費用面を考慮すると好ましい。振動モーターは、携帯電話機、ゲーム機などに幅広く用いられている。内部の回転方式の違いから、円筒型(シリンダー型)、円盤型のものなどがあるが、本発明に使用するものは、何れの形態をとるものでも構わない。使用する振動モーターの振動の大きさ(振動量)は、細胞培養モジュールに対し、細胞剥離に適した振動を伝えることが出来れば特に限定されないが、振動量が2〜80m/s2のものが適している。また、振動モーターは、所望の振動量のものを一つだけ使用しても良いし、複数個を同時に使用することで振動量を確保しても良い。但し、複数個の振動モーターを同時に使用する場合は、互いに振動を打ち消し合わないよう、空間的配置やモーターの振動数などを考慮する必要がある。細胞培養モジュールに振動を与える時間は、10秒〜30分程度が好ましい。振動時間が短すぎると、膜表面から細胞が十分剥離せず、振動時間が長すぎると、細胞がダメージを受ける可能性がある。図2に、振動モーターの例となる模式図を示す。 In the present invention, the vibration generating device is not particularly limited as long as it generates a vibration by itself. For example, a type that generates vibration by rotating an eccentric weight attached to a motor shaft, a type that generates vibration using a force generated by applying a current to a coil in a magnetic field (speaker type), a piston It is possible to use a vibration generator such as a type that is driven by hydraulic pressure or air pressure to generate vibration. Among them, a type (hereinafter, also referred to as a vibration motor) that generates vibration by rotating an eccentric weight attached to a motor shaft is preferable in consideration of downsizing and cost. Vibration motors are widely used in mobile phones, game machines and the like. There are cylindrical (cylindrical) and disc-like types due to the difference in internal rotation method, but any form may be used as the one used in the present invention. The magnitude (vibration amount) of the vibration of the vibration motor to be used is not particularly limited as long as the vibration suitable for cell detachment can be transmitted to the cell culture module, but the vibration amount is 2 to 80 m / s 2 Is suitable. In addition, only one vibration motor having a desired vibration amount may be used, or a plurality of vibration motors may be used simultaneously to secure the vibration amount. However, when using a plurality of vibration motors at the same time, it is necessary to consider the spatial arrangement, the frequency of the motor, and the like so as not to cancel each other's vibration. The time for giving vibration to the cell culture module is preferably about 10 seconds to 30 minutes. If the vibration time is too short, cells may not be sufficiently detached from the membrane surface, and if the vibration time is too long, the cells may be damaged. FIG. 2 shows a schematic view of an example of a vibration motor.
図3、4に、細胞培養モジュールに振動モーターを取り付ける際の一例を示す。振動モーター13はハウジング14に収納された状態で支持部材に取り付けられている。支持部材15a、15bは、それらの間にモジュールを把持できるように接続バネ16が接続固定されている。ハウジングおよび支持部材は、振動を吸収、防振するものでなければ、硬質のものであっても、エラストマーのような軟質のものであってもよい。支持部材15aおよび15bの間に細胞培養モジュールを図に示されるように挟み込み、所定時間、所定の振動量を与えればよい。 FIGS. 3 and 4 show an example of attaching a vibration motor to a cell culture module. The vibration motor 13 is attached to the support member in a state of being accommodated in the housing 14. Connection springs 16 are connected and fixed to the support members 15a and 15b so that the module can be gripped between them. The housing and the support member may be rigid or flexible such as elastomer, as long as they do not absorb and damp vibrations. The cell culture module may be sandwiched between the support members 15a and 15b as shown in the figure, and a predetermined amount of vibration may be given for a predetermined time.
以下、本発明の有効性を実施例を挙げて説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Hereinafter, the effectiveness of the present invention will be described by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
(回収細胞数の測定)
細胞培養モジュールから回収した細胞懸濁液は、遠心分離操作により最終的に1mlの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を1:1で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
1.血球計算盤およびカバーガラスの表面を70%イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
2.注射用蒸留水でカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
3.細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
4.1〜3の操作を別の血球計算盤を使用して行う(2回測定し平均をとる)。
5.顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる(10×対物レンズ)。
6.カウンターを用いて1mm2エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも100〜500細胞を計測する。
計算法:
C=N×104
C:1ml当たりの細胞数
N:計測した細胞数の平均
104:1mm2に対する容量の変換値
全体の数=C×V
V=細胞を懸濁した液体の容量
(Measurement of the number of collected cells)
The cell suspension collected from the cell culture module was finally suspended in 1 ml of culture solution by centrifugation. A mixture of this suspension and trypan blue staining solution at 1: 1 was added to a hemocytometer, and the number of cells was counted under a microscope.
1. The surfaces of the hemocytometer and coverslips are washed with 70% isopropanol and the excess isopropanol is blotted dry.
2. Wet the side of the cover glass with distilled water for injection and stick on a hemocytometer.
3. The cell suspension is well stirred with a Pasteur pipette or the like, immediately poured into a hemocytometer and filled up to the top of the groove.
4. Perform the procedure of 1 to 3 using another hemocytometer (two measurements and averaging).
5. Place a hemocytometer on the microscope and focus on the grid line (10 × objective).
6. Use a counter to quickly count the number of cells in a 1 mm 2 area.
※ Because errors are likely to occur, measure at least 100 to 500 cells for accurate counting.
Calculation method:
C = N × 10 4
C: Number of cells per 1 ml N: Average of the number of cells measured 10 4 : conversion value of volume to 1 mm 2 Total number of cells = C × V
V = volume of liquid in which cells are suspended
(細胞生存率の測定)
トリパンブルーで染色されない細胞を生細胞、染色される細胞を死細胞と判定し、細胞の生存率を測定した。
(Measurement of cell viability)
Cells not stained with trypan blue were determined to be live cells, and cells to be stained were determined to be dead cells, and cell viability was measured.
[実施例1]
(メッシュシートの準備)
ポリプロピレン製の網目状シート(ハギテック社製、型番:PP376、線径153μm、開口率50%、目開き376μm、厚み285μm)を、幅145mm、長さ80mmに切ったものを用意した。これを超純水で洗浄した後、0.05%ウシコラーゲン溶液に20分間浸し、その後、再び超純水ですすぎ、クリーンベンチ内で自然乾燥させた。
Example 1
(Preparation of mesh sheet)
What cut | disconnected the mesh-like sheet (The Hagi Tech make, model number: PP376, wire diameter 153 micrometers, aperture ratio 50%, opening ratio 376 micrometers, thickness 285 micrometers) made from polypropylene into 145 mm in width and 80 mm in length was prepared. After washing this with ultrapure water, it was immersed in a 0.05% bovine collagen solution for 20 minutes, then rinsed again with ultrapure water and naturally dried in a clean bench.
(細胞培養容器の作製)
細胞培養モジュールを以下のように作製した。
前述の網目状シートを螺旋状に巻き、直径1cm、長さ10cmの円筒状のポリカーボネート製モジュールケース内に収納し、網目状シートの両端を樹脂でモジュールケースに接着固定した。このようにして、図2に示すような形状の細胞培養用モジュールを作製した後、ガンマ線照射により滅菌処理を行った。
(Preparation of cell culture vessel)
Cell culture modules were made as follows.
The above-mentioned mesh sheet was spirally wound and housed in a cylindrical polycarbonate module case having a diameter of 1 cm and a length of 10 cm, and both ends of the mesh sheet were adhered and fixed to the module case with resin. Thus, a module for cell culture having a shape as shown in FIG. 2 was produced, and then sterilization treatment was performed by gamma irradiation.
得られた細胞培養モジュールを用い、図5に示すような細胞培養装置を構成した。まず、培養液貯留容器6を注射用蒸留水容器に交換した後、ポンプ7を起動して細胞培養モジュールのプライミング処理を行った。プライミング処理を終了した後、注射用蒸留水容器をウシ胎児血清を10%(v/v)添加したダルベッコ改変イーグル培地を入れた培養液貯留容器に交換し、細胞培養モジュール内の水を培養液に置換した。 A cell culture apparatus as shown in FIG. 5 was configured using the obtained cell culture module. First, after replacing the culture solution storage container 6 with a distilled water container for injection, the pump 7 was activated to perform a priming treatment of the cell culture module. After the priming process is completed, the injection distilled water container is replaced with a culture fluid storage container containing Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum, and the water in the cell culture module is treated as a culture fluid. Replaced by
(細胞培養実験)
前記培養液貯留容器6内の培養液に、プライマリーのヒト間葉系幹細胞(Cell Applications,Inc.製)を懸濁し、ポンプ7を起動して細胞培養モジュール内に播種して2時間静置し、網目状シート表面に細胞を接着させた。細胞播種密度は2000cells/cm2となるように調整した。培養液貯留容器6を培養液のみの容器に交換した後、培養液の流量を150μl/minとして灌流を開始した。本細胞培養実験は、CO2インキュベーター内で37℃、7日間行った。
(Cell culture experiment)
The primary human mesenchymal stem cells (manufactured by Cell Applications, Inc.) are suspended in the culture solution in the culture solution storage container 6, the pump 7 is activated, and the cells are seeded in a cell culture module and allowed to stand for 2 hours. The cells were attached to the surface of the reticulated sheet. The cell seeding density was adjusted to be 2000 cells / cm 2 . After replacing the culture solution storage container 6 with a culture solution only container, perfusion was started with the flow rate of the culture solution set to 150 μl / min. This cell culture experiment was performed at 37 ° C. for 7 days in a CO 2 incubator.
(細胞培養用モジュールからの細胞回収)
7日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養用モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、モジュール内部に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液を充分PBSに置換した。次に、PBSを除去し、0.25%トリプシン溶液(ライフテクノロジーズ社製)を細胞培養用モジュール内へ静かに充填し、室温で15分間インキュベートした。
この後、細胞培養モジュールに接触させた円盤型振動モーター(東京パーツ工業製、FM34F)を振動量(加速度)17m/s2で15秒間駆動させ、細胞培養モジュールに振動を与えた。即ち、図3および図4に示すように、振動モーターを含む支持部材でモジュールを挟んで固定した後、振動モーターを駆動させモジュールに振動を与えた。その後、培養液を細胞培養モジュール内へ流し入れ、反対方向から培養液とともに流し出した細胞を回収した。回収した細胞について、総細胞数および生存率を計測した。
(Cell collection from module for cell culture)
After 7 days of culture, culture medium perfusion was stopped and cells grown in the cell culture module were collected. That is, after stopping the perfusion of the culture solution, in order to remove the culture solution present inside the module, phosphate buffered saline (PBS) was perfused for a fixed time, and the culture solution was sufficiently replaced with PBS. Next, PBS was removed, and a 0.25% trypsin solution (Life Technologies) was gently filled into a cell culture module and incubated at room temperature for 15 minutes.
Thereafter, a disk type vibration motor (FM34F, manufactured by Tokyo Parts Industry Co., Ltd.) in contact with the cell culture module was driven at a vibration amount (acceleration) of 17 m / s 2 for 15 seconds to give vibration to the cell culture module. That is, as shown in FIG. 3 and FIG. 4, after the module was sandwiched and fixed by the support member including the vibration motor, the vibration motor was driven to give vibration to the module. Thereafter, the culture solution was poured into the cell culture module, and the cells flushed with the culture solution from the opposite direction were collected. Total cell number and viability were measured for the recovered cells.
[実施例2]
振動モーターとして、円筒型の振動モーター(シーアイ化成製、A4A−05−WTB−3)を用いて振動量(加速度)7m/s2、5分間駆動させた以外は、実施例1と同様にして細胞の回収を行った。
Example 2
As in Example 1, except that the vibration amount (acceleration) 7 m / s 2 was driven for 5 minutes using a cylindrical vibration motor (A4A-05-WTB-3, manufactured by CI Kasei Co., Ltd.) as a vibration motor. Cell recovery was performed.
[実施例3]
実施例2と同様の振動モーターを用いて振動量3m/s2、25分間駆動させた以外は、実施例1と同様にして細胞の回収を行った。
[Example 3]
The cells were recovered in the same manner as in Example 1 except that the vibration amount was 3 m / s 2 and driven for 25 minutes using the same vibration motor as in Example 2.
[実施例4]
実施例1と同様の振動モーターを用いて振動量17m/s2、25分間駆動させた以外は、実施例1と同様にして細胞の回収を行った。
Example 4
The cells were recovered in the same manner as in Example 1 except that the vibration amount was 17 m / s 2 and driven for 25 minutes using the same vibration motor as in Example 1.
[実施例5]
実施例1と同様の振動モーターを2台用いて、1台あたりの振動量17m/s2、15秒間駆動させた以外は、実施例1と同様にして細胞の回収を行った。
[Example 5]
Cells were recovered in the same manner as in Example 1 except that two vibration motors similar to those in Example 1 were used, and the vibration amount per unit was 17 m / s 2 and driven for 15 seconds.
[比較例1]
実施例1と同様の網目状シートを収納した細胞培養モジュールを用い、実施例1と同様にして細胞培養実験を行った。7日間培養後、培養液灌流を停止し、モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、モジュール内に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液をPBSに置換した。次に、PBSを除去し、0.25%トリプシン溶液(ライフテクノロジーズ社製)を細胞培養モジュール内へ静かに充填し、室温で15分間インキュベートした。この後、振動を与える処理を行わずに、培養液を細胞培養モジュール内へ流し入れ、反対方向から培養液と共に流し出した細胞を回収した。
Comparative Example 1
A cell culture experiment was conducted in the same manner as in Example 1 using a cell culture module containing the same reticulated sheet as in Example 1. After 7 days of culture, culture medium perfusion was stopped and cells grown in the module were collected. That is, after stopping the perfusion of the culture solution, in order to remove the culture solution present in the module, phosphate buffered saline (PBS) was perfused for a fixed time, and the culture solution was replaced with PBS. The PBS was then removed and a 0.25% trypsin solution (Life Technologies) was gently loaded into the cell culture module and incubated for 15 minutes at room temperature. Thereafter, the culture solution was poured into the cell culture module without treatment to give vibration, and the cells which were flushed with the culture solution from the opposite direction were collected.
[比較例2]
実施例1と同様の網目状シートを収納した細胞培養モジュールを用い、実施例1と同様にして細胞培養実験を行った。7日間培養後、培養液灌流を停止し、モジュール内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、モジュール内に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液をPBSに置換した。次に、細胞剥離剤を接触させる処理を行わずに実施例1と同様の振動を与える処理を行った後、培養液を細胞培養モジュール内へ流し入れ、反対方向から培養液と共に流し出した細胞を回収した。
Comparative Example 2
A cell culture experiment was conducted in the same manner as in Example 1 using a cell culture module containing the same reticulated sheet as in Example 1. After 7 days of culture, culture medium perfusion was stopped and cells grown in the module were collected. That is, after stopping the perfusion of the culture solution, in order to remove the culture solution present in the module, phosphate buffered saline (PBS) was perfused for a fixed time, and the culture solution was replaced with PBS. Next, the same treatment as in Example 1 is carried out without contacting with a cell release agent, and then the culture fluid is poured into the cell culture module, and the cells flushed with the culture fluid from the opposite direction are treated. It was collected.
実施例1〜5、比較例1〜2の細胞培養実験をそれぞれ繰り返し8回行った。その細胞回収数および細胞生存率の測定結果を表1、表2および図6に示した。これらの結果より、実施例1〜5は、回収細胞数および細胞生存率において比較例よりも高値を示した。一方、比較例1は、細胞生存率は実施例と遜色ないが、回収細胞数は実施例のものより少ない結果となった。比較例2は、回収細胞数および細胞生存率のいずれも実施例に比べて低い結果となった。これらの結果から、細胞剥離剤と振動発生装置を併用することにより、培養細胞を高生存率かつ高効率に回収できることが示された。 The cell culture experiments of Examples 1 to 5 and Comparative Examples 1 to 2 were repeated eight times respectively. The measurement results of the number of recovered cells and the cell viability are shown in Table 1, Table 2 and FIG. From these results, Examples 1 to 5 showed higher values of the number of recovered cells and cell viability than the comparative example. On the other hand, in Comparative Example 1, the cell survival rate was comparable to that of the example, but the number of recovered cells was smaller than that of the example. In Comparative Example 2, both the number of recovered cells and the cell viability were lower than in the Examples. From these results, it was shown that cultured cells can be recovered with high viability and high efficiency by using a cell detachment agent and a vibration generator in combination.
本発明により、網目状シートを培養基材として用いた細胞培養モジュールにおいて培養された細胞を、モジュール内から高生存率かつ高回収率で回収する方法を提供することが可能となる。 According to the present invention, it is possible to provide a method of recovering cells cultured in a cell culture module using a reticulated sheet as a culture substrate with high viability and high recovery rate from within the module.
1 細胞培養モジュール
2 網目状シート
3 接着樹脂
4 モジュールケース
5a、5b ポート
6 培養液貯留容器
7 ポンプ
8 廃液回収容器
11 振動モーターのおもり
12 振動モーター軸
13 振動モーター本体
14 振動モーターハウジング
15a、15b 支持部材
16 接続バネ
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 cell culture module 2 reticulated sheet 3 adhesive resin 4 module case 5a, 5b port 6 culture solution storage container 7 pump 8 waste liquid collection container 11 weight of vibration motor 12 vibration motor shaft 13 vibration motor main body 14 vibration motor housing 15a, 15b Member 16 Connection spring
Claims (5)
i)前記モジュール内の細胞に細胞剥離剤を接触させる工程、および
ii)前記モジュールの外側から直接あるいは間接的に接触させた振動発生装置により振動を与える工程、
を含む細胞回収方法。 A method for recovering cultured cells from a cell culture module containing a reticulated sheet as a cell culture substrate,
i) contacting the cells in the module with a cell release agent, and ii) applying vibration by means of a vibration generator brought into contact directly or indirectly from the outside of the module,
Cell recovery method including:
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017231623A JP2019097478A (en) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Methods of cell collection |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2017231623A JP2019097478A (en) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Methods of cell collection |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019097478A true JP2019097478A (en) | 2019-06-24 |
Family
ID=66973278
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017231623A Pending JP2019097478A (en) | 2017-12-01 | 2017-12-01 | Methods of cell collection |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2019097478A (en) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2024095911A1 (en) * | 2022-11-01 | 2024-05-10 | キヤノン株式会社 | Cell detachment device and cell detachment method |
-
2017
- 2017-12-01 JP JP2017231623A patent/JP2019097478A/en active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2024095911A1 (en) * | 2022-11-01 | 2024-05-10 | キヤノン株式会社 | Cell detachment device and cell detachment method |
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