JP2015192665A - Microorganisms having cellulose and starch resolution - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、新たに同定されたパエニバチルス属の微生物、該微生物により産生される抗菌性抽出物等、および該微生物を用いるエタノールの製造方法などに関する。 The present invention relates to a newly identified microorganism belonging to the genus Paenibacillus, an antibacterial extract produced by the microorganism, and a method for producing ethanol using the microorganism.
バイオマスエタノールは、トウモロコシやサトウキビなどの植物由来バイオマスを原料として製造されたエタノールである。バイオマスに含まれる炭素は大気中のCO2を植物が光合成により固定したものであり、燃焼により排出される量と植物により吸収される量が等しいことから(カーボンニュートラル)、バイオマスエタノールは再生可能なエネルギー資源として期待されている。 Biomass ethanol is ethanol produced using plant-derived biomass such as corn and sugarcane as a raw material. Carbon contained in biomass is CO 2 in the atmosphere fixed by plants through photosynthesis, and the amount emitted by combustion is equal to the amount absorbed by plants (carbon neutral), so biomass ethanol can be regenerated Expected as an energy resource.
しかしながら、バイオマスエタノールの製造原料が食料と競合しうることから、稲藁等のソフトセルロースや廃材木質系バイオマスなどの非食料であるバイオマスを原料とする、バイオマスエタノールの生産技術の開発が強く望まれている。アルコール発酵によるエタノールの生産の前段階である、バイオマス原料の糖化は、現状においては多くの場合強酸による加水分解により行われており、その環境負荷が高いことも問題点として指摘されている。さらに、バイオマスエタノールは、日本国内では製造コストが高く、いまだ試験製造段階にある。よって、食用価値の低い原料等を利用した、低コストおよび低環境負荷型の糖化技術の開発が望まれている。 However, since biomass ethanol production raw materials can compete with food, development of biomass ethanol production technology using biomass that is non-food such as soft cellulose such as rice straw and waste woody biomass is strongly desired. ing. The saccharification of biomass raw material, which is the pre-stage of ethanol production by alcohol fermentation, is currently carried out by hydrolysis with strong acid in many cases, and it is pointed out as a problem that the environmental load is high. Furthermore, biomass ethanol is expensive to produce in Japan and is still in the trial production stage. Therefore, development of a low-cost and low environmental load saccharification technology using raw materials with low edible value is desired.
ところで、種子消毒は、育苗期に発生する多くの病害を防ぐために重要な処理である。種子消毒には農薬が主に使用されているが、消費者の食に対する安全性意識の向上から、最近では農薬や化学肥料を使用しない有機栽培が消費者から歓迎されている。また、生産者にとっても農作物の付加価値が向上するため、その生産量は年々増加している。農薬としてカウントされない有機栽培農法に使用できる種子消毒方法は、温湯消毒と微生物農薬(エコホープ、タフブロック)の2種類に限られている。しかしながら、温湯消毒は温度管理が難しく、正確に熱処理を行うためには特別な装置が必要である。一方、微生物農薬は適用できる作物の範囲が狭く、イネを中心に使用されている。よって、幅広い作物に適用できる微生物農薬の開発が望まれている。 By the way, seed disinfection is an important treatment for preventing many diseases occurring in the seedling raising period. Pesticides are mainly used for seed disinfection, but recently, organic cultivation without the use of pesticides and chemical fertilizers has been welcomed by consumers in order to improve consumer safety awareness of food. In addition, since the added value of crops is improved for producers, the production volume is increasing year by year. Seed disinfection methods that can be used in organic farming methods that are not counted as pesticides are limited to hot water disinfection and microbial pesticides (eco-hope, tough block). However, it is difficult to control the temperature of hot water disinfection, and a special device is required to accurately perform the heat treatment. On the other hand, microbial pesticides have a narrow range of applicable crops and are mainly used in rice. Therefore, development of microbial pesticides that can be applied to a wide range of crops is desired.
本発明者らは、これまでに、強固な結晶構造を有するキチンを効率良く分解することのできる新規なパエニバチルス属の微生物を同定し、開示した(特許文献1)。 The present inventors have identified and disclosed a novel microorganism belonging to the genus Paenibacillus that can efficiently decompose chitin having a strong crystal structure (Patent Document 1).
本発明が解決しようとする課題は、セルロースおよびデンプンの糖化ならびにその後のアルコール発酵を、高効率かつ低環境負荷である方法で行うことのできる技術を開発し、低コストおよび低環境負荷型のバイオマスエタノール製造法を確立することである。 The problem to be solved by the present invention is to develop a technology capable of performing saccharification of cellulose and starch and the subsequent alcohol fermentation by a method with high efficiency and low environmental load, and is a low-cost and low environmental load type biomass. Establish an ethanol production method.
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規のパエニバチルス属の細菌を同定した。また、本発明者らは、当該細菌のスクリーニングの過程で、当該細菌が広い抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生することを見出した。さらに、該抗菌性物質は酵母に対しては抗菌性を示さないことも見出した。当該パエニバチルス属細菌と酵母を共培養するか、あるいは連続的に培養することで、当該パエニバチルス属細菌の産生する抗菌性物質によりコンタミネーションを抑制しつつ、該細菌によるセルロースおよびデンプンの糖化ならびに酵母によるアルコール発酵を効率的に行うことができた。
さらに本発明者らは、当該細菌が、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化(植物へのリンの供給)、植物生長ホルモンの産生、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制(植物もシデロフォアを産生可能)、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害、窒素固定などにより、植物に対する生長促進効果を有することを見出した。
また、広い抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生する当該細菌を、種子消毒剤、農薬、土壌改良剤などとしても使用し得ることを見出した。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have identified a novel bacterium belonging to the genus Paenibacillus having a high cellulose resolution and starch resolution. In addition, the present inventors have found that the bacterium produces an antibacterial substance having a broad antibacterial spectrum in the process of screening the bacterium. Furthermore, it has also been found that the antibacterial substance does not exhibit antibacterial activity against yeast. By co-culturing the yeast of the genus Paenibacillus and yeast, or by continuously cultivating it, while suppressing contamination by the antibacterial substance produced by the bacterium of the genus Paenibacillus, saccharification of cellulose and starch by the bacteria and by yeast Alcohol fermentation could be performed efficiently.
Furthermore, the present inventors have found that the bacterium is a solubilization of a poorly soluble phosphorus compound in the soil (supply of phosphorus to the plant), production of plant growth hormone, and removal of iron in the environment by siderophore. It has been found that it has a growth promoting effect on plants by inhibiting growth (plants can also produce siderophores), sterilizing phytopathogenic microorganisms with hydrogen cyanide and antibiotics, inhibiting biosynthesis of ethylene to suppress plant growth, nitrogen fixation, etc. .
Moreover, it discovered that the said bacteria which produce the antibacterial substance which has a wide antibacterial spectrum can be used also as a seed disinfectant, an agrochemical, a soil improvement agent, etc.
以上の知見に基づき本発明が完成された。即ち、本発明は以下の通りである。
[1] (a)セルロース分解能およびデンプン分解能を有し、
(b)細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
(c)ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体。
[2] 細菌および酵母以外の真菌が、植物病原菌類、ブドウ球菌属、連鎖球菌属、腸球菌、エスケリキア属およびフザリウム属のいずれかに属する菌の1種以上である、[1]に記載の細菌もしくはその変異体。
[3] パエニバチルス属に属する細菌が、パエニバチルス・エスピー(Paenibacillus sp.)FPU−37株(NITE P−01802)である、[1]または[2]に記載の細菌またはその変異体。
[4] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抗菌性抽出物。
[5] アセトニトリルを抽出溶媒として用いて製造された、[4]に記載の抗菌性抽出物。
[6] 低級アルコールを抽出溶媒として用いて製造された、[4]に記載の抗菌性抽出物。
[7] [4]〜[6]のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する、抗菌組成物。
[8] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体を培養することによって得られる、培養物。
[9] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび/またはデンプンを含む、組成物。
[10] さらに酵母を含む、[9]に記載の組成物。
[11] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体、酵母、ならびにセルロースおよび/またはデンプンを含む、エタノール製造用キット。
[12] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養することを含む、セルロースおよび/またはデンプン分解物の製造方法。
[13] セルロースおよび/またはデンプン分解物がグルコースである、[12]に記載の方法。
[14] (a)[1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養することにより、セルロースおよび/またはデンプンをグルコースに変換する工程、
(b)(a)で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法。
[15] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体、および酵母を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養する工程を含む、エタノールの製造方法。
[16] アセトニトリルを用いた抽出によって、[1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
[17] 低級アルコールを用いた抽出によって、[1]〜[3]のいずれかに記載の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法。
[18] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌もしくはその変異体、[8]に記載の培養物または[4]〜[7]のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する農薬。
[19] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌もしくはその変異体、[8]に記載の培養物または[4]〜[7]のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する種子消毒剤。
[20] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌または[8]に記載の培養物を含有する植物生長促進剤。
[21] [1]〜[3]のいずれかに記載の細菌、[8]に記載の培養物または[4]〜[7]のいずれかに記載の抗菌性抽出物を含有する土壌改良剤。
[22] [18]に記載の農薬により植物を処理する工程を含む、細菌または酵母以外の真菌による病害の防除方法。
[23] [19]に記載の種子消毒剤により、種子を処理する工程を含む、種子消毒方法。
[24] [20]に記載の植物生長促進剤により植物を処理する工程を含む、植物生長促進方法。
[25] [21]に記載の土壌改良剤により土壌を処理する工程を含む、土壌改良方法。
The present invention has been completed based on the above findings. That is, the present invention is as follows.
[1] (a) having cellulose resolution and starch resolution;
(B) exhibits antibacterial activity against fungi other than bacteria and yeast,
(C) A bacterium belonging to the genus Paenibacillus or a mutant thereof, which does not have gelatin degradability and nitrate reducing ability.
[2] The fungus other than bacteria and yeast is one or more bacteria belonging to any one of phytopathogenic fungi, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococci, Escherichia and Fusarium, Bacteria or its mutants.
[3] The bacterium according to [1] or [2] or a mutant thereof, wherein the bacterium belonging to the genus Paenibacillus is Paenibacillus sp. FPU-37 strain (NITE P-01802).
[4] An antibacterial extract of the bacterium or variant thereof according to any one of [1] to [3].
[5] The antibacterial extract according to [4], produced using acetonitrile as an extraction solvent.
[6] The antibacterial extract according to [4], produced using a lower alcohol as an extraction solvent.
[7] An antibacterial composition containing the antibacterial extract according to any one of [4] to [6].
[8] A culture obtained by culturing the bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof.
[9] A composition comprising the bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof, and cellulose and / or starch.
[10] The composition according to [9], further comprising yeast.
[11] A kit for producing ethanol comprising the bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof, yeast, and cellulose and / or starch.
[12] A method for producing cellulose and / or starch degradation product, comprising culturing the bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof in a medium containing cellulose and / or starch. .
[13] The method according to [12], wherein the cellulose and / or starch degradation product is glucose.
[14] (a) The bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof is cultured in a medium containing cellulose and / or starch, whereby cellulose and / or starch is converted into glucose. Converting,
(B) converting glucose into ethanol by culturing yeast in a medium containing glucose obtained in (a),
A method for producing ethanol comprising:
[15] A method for producing ethanol, comprising culturing the bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof, and yeast in a medium containing cellulose and / or starch.
[16] A method for producing an antibacterial extract, comprising a step of obtaining an extract of the bacterium or variant thereof according to any one of [1] to [3] by extraction with acetonitrile.
[17] A method for producing an antibacterial extract, comprising a step of obtaining an extract of the bacterium or variant thereof according to any one of [1] to [3] by extraction with a lower alcohol.
[18] The bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof, the culture according to [8], or the antibacterial extract according to any one of [4] to [7] Pesticides.
[19] The bacterium according to any one of [1] to [3] or a mutant thereof, the culture according to [8], or the antibacterial extract according to any one of [4] to [7] Seed disinfectant.
[20] A plant growth promoter containing the bacterium according to any one of [1] to [3] or the culture according to [8].
[21] A soil conditioner containing the bacterium according to any one of [1] to [3], the culture according to [8], or the antibacterial extract according to any one of [4] to [7]. .
[22] A method for controlling diseases caused by fungi other than bacteria or yeast, comprising a step of treating a plant with the agricultural chemical according to [18].
[23] A seed disinfection method including a step of treating seeds with the seed disinfectant according to [19].
[24] A method for promoting plant growth, comprising a step of treating a plant with the plant growth promoter according to [20].
[25] A soil improvement method comprising a step of treating soil with the soil improver according to [21].
本発明により、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有し、広範な抗菌スペクトルを有する抗菌性物質を産生する、新規のパエニバチルス属の細菌が提供される。該細菌を用いることで、食用価値の低いセルロース原料またはデンプン原料を含む、多様な原料からグルコースを産生することができ、さらに該グルコースはエタノール製造のための原料とすることができる。また、該細菌は抗菌性物質を産生するため、エタノール製造工程の効率化を図ることが可能となり、さらに、該抗菌性物質はそれ自体農業資材や医薬品としても有用に活用しうる。 The present invention provides novel Paenibacillus bacteria that produce antibacterial substances with high cellulose and starch degradability and having a broad antibacterial spectrum. By using the bacterium, glucose can be produced from various raw materials including cellulose raw material or starch raw material having low edible value, and the glucose can be used as a raw material for ethanol production. Further, since the bacterium produces an antibacterial substance, it is possible to improve the efficiency of the ethanol production process, and the antibacterial substance itself can be usefully used as an agricultural material or a medicine.
本発明は、
(a)セルロース分解能およびデンプン分解能を有し、
(b)細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
(c)ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、
パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体を提供する。
The present invention
(A) having cellulose resolution and starch resolution;
(B) exhibits antibacterial activity against fungi other than bacteria and yeast,
(C) not having gelatin resolution and nitrate reducing ability,
Provided is a bacterium belonging to the genus Paenibacillus or a mutant thereof.
本明細書中に記載の化合物は、その全ての異性体をも包含する。 The compounds described herein also include all isomers thereof.
本発明のパエニバチルス属に属する細菌(以下、本発明の細菌と略記する場合がある)またはその変異体は、セルロースおよびデンプンを単糖または少糖類へ分解し得る。すなわち、本発明の細菌またはその変異体は、セルロースおよびデンプンを糖化する活性を有する。本発明の細菌またはその変異体によるセルロースの分解は、セルロース分子内部をランダムに切断するエンド型の分解様式、またはセルロース分子の末端から切断してセロビオースを産生するエキソ型の分解様式であり得る。当該分解反応は細胞内で起きてもよいし、細胞外で起きてもよい。当該分解産物の例として、単糖であるグルコース、二糖であるセロビオース、および3糖〜6糖のオリゴ糖を産生し得る。当該分解産物は、好ましくはグルコース、セロビオースまたは3糖であり、より好ましくはグルコースである。
また、デンプンの分解は、その構成分子であるアミロース分子およびアミロペクチン分子をランダムに切断するエンド型の分解様式、ならびに/またはアミロースおよびアミロペクチン分子の末端から切断してマルトースもしくはグルコースを産生するエキソ型の分解様式であり得る。エンド型の分解活性を示すアミラーゼはα−アミラーゼ、エキソ型の分解活性を示しマルトースを産生するアミラーゼはβ−アミラーゼ、エキソ型の分解活性を示しグルコースを産生するアミラーゼはグルコアミラーゼと呼ばれる。後述するように、本発明の細菌が産生するアミラーゼは、α−アミラーゼの触媒ドメインとβ−アミラーゼの触媒ドメインの両方を有することから、好ましい分解様式としては、エンド型の分解様式、およびエキソ型の分解によりマルトースを産生する分解様式が例示される。さらに、本発明の好ましいデンプン分解様式として、本発明のアミラーゼによりデンプンからマルトースが産生された後、該マルトースをα−グルコシダーゼにより分解しグルコースを産生する分解様式が例示される。これらデンプンの分解反応は、細胞内で起きてもよいし、細胞外で起きてもよい。デンプンの分解産物としては、例えば、単糖であるグルコース、二糖であるマルトース、および3〜6糖のオリゴ糖が挙げられる。当該分解産物は、好ましくはグルコース、マルトースまたは3糖であり、より好ましくはグルコースである。
The bacterium belonging to the genus Paenibacillus of the present invention (hereinafter sometimes abbreviated as the bacterium of the present invention) or a variant thereof can degrade cellulose and starch into monosaccharides or oligosaccharides. That is, the bacterium of the present invention or a mutant thereof has an activity of saccharifying cellulose and starch. The degradation of cellulose by the bacterium of the present invention or a mutant thereof can be an endo degradation mode in which the inside of the cellulose molecule is randomly cleaved, or an exo degradation mode in which cellobiose is produced by cleaving from the end of the cellulose molecule. The degradation reaction may take place inside the cell or outside the cell. As examples of the degradation products, glucose that is a monosaccharide, cellobiose that is a disaccharide, and oligosaccharides of 3 to 6 sugars can be produced. The degradation product is preferably glucose, cellobiose or trisaccharide, and more preferably glucose.
In addition, the degradation of starch is an endo-type degradation mode in which its constituent molecules, amylose molecules and amylopectin molecules, are cleaved at random, and / or exo-type that cleaves from the end of amylose and amylopectin molecules to produce maltose or glucose. It can be a decomposition mode. Amylase showing endo-type degradation activity is called α-amylase, amylase showing exo-type degradation activity and producing maltose is called β-amylase, and amylase showing exo-type degradation activity and producing glucose is called glucoamylase. As will be described later, since the amylase produced by the bacterium of the present invention has both the catalytic domain of α-amylase and the catalytic domain of β-amylase, preferred degradation modes include endo-type degradation mode and exo-type degradation mode. The decomposition mode which produces maltose by decomposition | disassembly of is illustrated. Furthermore, as a preferable starch decomposition mode of the present invention, a maltose is produced from starch by the amylase of the present invention, and then the maltose is decomposed by α-glucosidase to produce glucose. These starch degradation reactions may occur inside cells or outside cells. Examples of the degradation products of starch include glucose, which is a monosaccharide, maltose, which is a disaccharide, and oligosaccharides having 3 to 6 sugars. The degradation product is preferably glucose, maltose or trisaccharide, and more preferably glucose.
本発明の細菌またはその変異体が有するセルラーゼの代表例として配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号2で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号2のセルラーゼ遺伝子は、パエニバチルス・ポリミクサ(Paenibacillus polymyxa)のβ−1.4−グルカナーゼと高い相同性を示し、糖質加水分解酵素のファミリー5に分類される触媒ドメイン(GH5)、N末端側に分泌シグナル配列、およびC末端側に糖質結合モジュールであるcarbohydrate−binding module(CBM)のファミリー3(CBM3)ドメインを有する。本発明の細菌またはその変異体が産生するセルラーゼは、セルロースの添加により発現が誘導され、培養上清中に分泌される、基質誘導型の分泌酵素であり得る。 A representative example of the cellulase possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2 as an example of a polynucleotide encoding the same. The polynucleotide containing is mentioned. The cellulase gene of SEQ ID NO: 2 shows a high homology with Paenibacillus polymyxa β-1.4-glucanase, a catalytic domain (GH5) classified as a family 5 of carbohydrate hydrolases, N-terminal It has a secretory signal sequence on the side and a family 3 (CBM3) domain of carbohydrate-binding module (CBM) which is a carbohydrate binding module on the C-terminal side. The cellulase produced by the bacterium of the present invention or a mutant thereof can be a substrate-induced secretory enzyme whose expression is induced by addition of cellulose and secreted into the culture supernatant.
本発明の細菌またはその変異体が有するアミラーゼの代表例として配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号4で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号4のアミラーゼ遺伝子は、パエニバチルス・ポリミクサのβ/α−アミラーゼと高い相同性を示し、N末端側に分泌シグナル配列を有している。さらに、配列番号3で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドは、N末端側にβ−アミラーゼの触媒ドメイン(GH14)および2つのCBM25を有し、C末端側にはα−アミラーゼの触媒ドメイン(GH13)およびCBMの一種であるAamy−Cモジュールを有するため、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性の両方を示すと考えられる。本発明の細菌またはその変異体が有するアミラーゼポリペプチドは、配列番号3で表されるアミノ酸配列に対し、1、2、3または4個のアミノ酸の置換、挿入、または欠失がなされた、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性を有するポリペプチド、ならびにそれをコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明の細菌が産生するアミラーゼは、デンプンの添加により発現が誘導され、培養上清中に分泌される、基質誘導型の分泌酵素であり得る。 A representative example of the amylase possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3, and a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 as an example of a polynucleotide encoding the same. The polynucleotide containing is mentioned. The amylase gene of SEQ ID NO: 4 shows high homology with Paenibacillus polymixa β / α-amylase and has a secretory signal sequence on the N-terminal side. Further, the polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 has a β-amylase catalytic domain (GH14) and two CBM25s on the N-terminal side, and an α-amylase catalytic domain (C-terminal side). GH13) and Aami-C module, which is a kind of CBM, are considered to exhibit both α-amylase activity and β-amylase activity. The amylase polypeptide possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof has an α, 1, 2, 3 or 4 amino acid substitution, insertion, or deletion made in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3. -Also provided are polypeptides having amylase activity and β-amylase activity, and polynucleotides encoding the same. The amylase produced by the bacterium of the present invention can be a substrate-induced secretory enzyme whose expression is induced by addition of starch and secreted into the culture supernatant.
本発明の細菌またはその変異体が有するα−グルコシダーゼの代表例として配列番号5で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドが挙げられ、それをコードするポリヌクレオチドの例として配列番号6で表されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。配列番号6のα−グルコシダーゼ遺伝子は、糖質分解酵素ファミリー31(GH31)に分類される酵素である。本発明の細菌が産生するα−グルコシダーゼは、細胞内に局在する酵素であり得る。 A representative example of the α-glucosidase possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof is a polypeptide comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 5, and an example of a polynucleotide encoding it is represented by SEQ ID NO: 6. A polynucleotide comprising a nucleotide sequence is mentioned. The α-glucosidase gene of SEQ ID NO: 6 is an enzyme classified into the glycolytic enzyme family 31 (GH31). The α-glucosidase produced by the bacterium of the present invention may be an enzyme localized in a cell.
本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、本発明の細菌またはその変異体のマーカーとして有用である。本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリヌクレオチドは、本発明の細菌またはその変異体を検出するための核酸プローブを作製するために用いることができ、また、本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼのポリペプチドは、本発明の細菌またはその変異体を検出するための抗体を作製するために用いることができる。該プローブおよび抗体は、本発明の細菌またはその変異体を同定するために好適に使用し得る。 The cellulase, amylase, and α-glucosidase polynucleotides and polypeptides possessed by the bacterium of the present invention or variants thereof are useful as markers for the bacterium of the present invention or variants thereof. The cellulase, amylase and α-glucosidase polynucleotides possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof can be used for preparing a nucleic acid probe for detecting the bacterium of the present invention or a variant thereof. Cellulase, amylase and α-glucosidase polypeptides possessed by the bacterium of the present invention or a variant thereof can be used for preparing an antibody for detecting the bacterium of the present invention or a variant thereof. The probe and antibody can be suitably used to identify the bacterium of the present invention or a mutant thereof.
さらに、本発明は、本発明の細菌またはその変異体が有する、セルラーゼ、アミラーゼまたはα−グルコシダーゼのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター、ならびに該ベクターにより形質転換された形質転換体も提供し得る。 Furthermore, the present invention also provides a vector comprising a polynucleotide encoding a cellulase, amylase or α-glucosidase polypeptide possessed by the bacterium of the present invention or a mutant thereof, and a transformant transformed with the vector. obtain.
本発明の細菌またはその変異体は、他の細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示す。当該他の細菌および酵母以外の真菌は、本発明の細菌またはその変異体が示す抗菌活性によって、死滅または増殖が抑制される。具体例としては、植物病原微生物やヒト病原微生物(例えば、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌およびフザリウム属の菌)等が挙げられ、より具体的には、トマト葉かび病菌(Fulvia fulvum(Cooke)Ciferri)、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、イネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)、オオムギ赤かび病菌(Fusarium graminearum)、イチゴ炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum Schechtendal f.sp.Lycopersici)、サトイモ乾腐病菌(Fusarium oxysporum Schechtendal f.sp.Colocasiae)、キュウリつる割病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、イネばか苗病菌(Fusarium moniliforme)、スイカつる枯病菌(Didymella bryoniae)、スイカ炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、ダイズ紫斑病菌(Cercospora kikuchii)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum(旧学名Pseudomonas solanacearum))、および軟腐病(Erwinia carotovora subsp.carotovora)等の植物病原菌類の菌、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、Staphylococcus epidermidis、およびStaphylococcus saprophyticus等のブドウ球菌属の細菌、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus viridans、Streptococcus agalactiae、およびStreptococcus dysgalactiae等の連鎖球菌属の細菌、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus avium、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus gallinarum、およびEnterococcus flavescens等の腸球菌、大腸菌(Escherichia coli)等のエスケリキア属の細菌、Trichophyton rubrum、Trichophyton mentagrophytes、Trichophyton tonsurans、Microsporum canis、Microsporum gypseum、Trichophyton verrucosum等の白癬菌類、Candida albicans等のカンジダ症起因菌、Cryptococcus neoformans等のクリプトコッカス症起因菌、Neisseria gonorrhoeae等の淋菌、Neisseria meningitidis等の髄膜炎菌、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii、Shigella sonnei等の赤痢菌、Salmonella Typhi、Salmonella Paratyphi、Salmonella Typhimurium,Salmonella Enteritidis等のサルモネラ菌、Vibrio cholerae等のコレラ菌、Pseudomonas aeruginosa等の緑膿菌、Bordetella pertussis等の百日咳菌、Haemophilus influenzae等のインフルエンザ菌、Mycobacterium tuberculosis等の結核菌、Clostridium tetani等の破傷風菌、Corynebacterium diphtheriae等のジフテリア菌、ならびにFusarium oxysporum、Fusarium solani、Fusarium graminearum、Fusarium asiaticum、Fusarium culmorum、およびFusarium fujikuroi(完全(有性)世代:Gibberella fujikuroi)等のフザリウム属の菌が挙げられる。本発明の細菌またはその変異体は、少なくともこれらの菌から選択される1種に対して、好ましくは全てに対して抗菌活性を有する。 The bacterium of the present invention or a mutant thereof exhibits antibacterial activity against other bacteria and fungi other than yeast. The other bacteria and fungi other than yeast are inhibited from being killed or grown by the antibacterial activity exhibited by the bacterium of the present invention or a mutant thereof. Specific examples include phytopathogenic microorganisms and human pathogenic microorganisms (eg, Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus, Escherichia, Trichophyton, Candidiasis, Cryptococcosis, and Fusarium. More specifically, tomato leaf mold (Fulvia fulvum (Cooke) Ciferri), rice blast fungus (Magnaporthe grisea), rice blast fungus (Magnaporthe oryzae), omrae ), Strawberry anthracnose fungus (Colletotrichum acutatum), tomato dwarf fungus (Fusarium oxysporum Schechtendal f. Sp. Lycopersici), taro dry rot fungus (Fusarium oxysporum Schechtendal f. Sp. Colocasiae), cucumber vinesporium fungus (i) boiled rice fungus (Fusarium oxysporum f. , Soybean purpura fungus (Cercospora kikuchii), bacterial wilt fungus (Ralstonia solanacearum (formerly known as Pseudomonas solanacearum)), and soft rot (Erwinia carotovora subsp.) Bacteria (Staphylococcus aureus), Staphylococcus epidermidis, and Staphylococcus Staphylococcus bacteria such saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Streptococcus agalactiae, and Streptococcus dysgalactiae like streptococcal bacteria, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus avium, Enterococcus caseiflavus, Enterococcus gall Narum, and Enterococcus flavescens like enterococci, E. (Escherichia coli) Esukerikia genus bacteria such as, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Microsporum canis, Microsporum gypseum, ringworm fungi such as Trichophyton verrucosum, candidiasis, such Candida albicans Causative bacteria, Cryptococcus neoformans and other cryptococcosis-causing bacteria, Neisseria gonorrhoeae and other Neisseria meningitidis such as Neisseria meningitidis, Shige la dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, dysentery bacteria such as Shigella sonnei, Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium, such as Salmonella Enteritidis Salmonella, cholera bacteria such as Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, such as Pseudomonas aeruginosa, such as Bordetella pertussis Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae and other influenza bacteria, Mycobacterium tuberculosis and other tuberculosis bacteria, Clostridium tetani and other tetanus bacteria, Coryneba terium diphtheriae such diphtheriae and Fusarium oxysporum,, Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium asiaticum, Fusarium culmorum, and Fusarium fujikuroi (full (sexual) generation: Gibberella fujikuroi) Fusarium genus fungi, and the like. The bacterium of the present invention or a variant thereof has antibacterial activity, preferably against at least one selected from these bacteria.
本明細書中、「抗菌活性」とは、菌を殺す活性および菌の増殖を抑制する活性を意味する。 In the present specification, the “antibacterial activity” means an activity of killing bacteria and an activity of suppressing the growth of the bacteria.
本発明の細菌またはその変異体は、近縁種である、Paenibacillus polymyxa、Paenibacillus jamilae、Paenibacillus peoriae、およびPaenibacillus kribbensisと異なり、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない。ゼラチン分解能は、ゼラチンを含有する培地に細菌を接種したときに、固化していたゼラチンを室温で溶解する能力を意味する。硝酸塩還元能は、硝酸塩を含有する培地で細菌の培養を行い、還元反応により亜硝酸を生成する能力を意味する。当業者であれば、公知の方法によりゼラチン分解能および硝酸塩還元能の試験を容易に行うことができる。あるいは、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を試験するための市販のキット(例えば、API20Eキット(bioMerieux, Lyon, France))なども好適に使用し得る。本発明の細菌は、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していないことを特徴の一つとする。 Unlike the related species Paenibacillus polymyxa, Paenibacillus jamilae, Paenibacillus peeriae, and Paenibacillus kribbensis, the bacterium of the present invention or a mutant thereof does not have gelatin resolution and nitrate reducing ability. Gelatin resolution means the ability to dissolve solidified gelatin at room temperature when bacteria are inoculated into a medium containing gelatin. The nitrate reducing ability means the ability to cultivate bacteria in a medium containing nitrate and produce nitrite by a reduction reaction. A person skilled in the art can easily test the gelatin resolution and nitrate reducing ability by a known method. Alternatively, a commercially available kit for testing gelatin degradation and nitrate reducing ability (for example, API20E kit (bioMerieux, Lyon, France)) and the like can be suitably used. One feature of the bacterium of the present invention is that it does not have gelatin degradability and nitrate reducing ability.
その他、本発明の細菌またはその変異体の特徴の例として、以下が挙げられる。
・細胞形態が桿状で周鞭毛を持ち、活発な運動性を有する。
・コロニーが白色に近いクリーム色を呈する(培地により多少異なる)。
Other examples of the characteristics of the bacterium of the present invention or mutants thereof include the following.
-Cell shape is rod-shaped, has peripheral flagella, and has active motility.
-The colony has a cream color close to white (slightly different depending on the culture medium).
更なる局面において、本発明の細菌は、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化(植物へのリンの供給)能力、植物生長ホルモンの産生能力、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制能力(植物もシデロフォアを産生可能)、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌能力、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害能力、窒素固定能力を有するという特徴を有する。 In a further aspect, the bacterium of the present invention is capable of solubilizing poorly soluble phosphorus compounds in soil (supplying phosphorus to plants), producing plant growth hormone, and causing plant pathogens by depriving the environment of iron by siderophores. It has the ability to suppress the growth of microorganisms (plants can also produce siderophores), the ability to kill phytopathogenic microorganisms with hydrogen cyanide and antibiotics, the ability to inhibit the biosynthesis of ethylene to suppress plant growth, and the ability to fix nitrogen.
(難溶性リン化合物の可溶化能力)
本発明の細菌は、難溶性リン化合物を可溶化できる。
リンは、植物の必須元素の一つであり、核酸、リン脂質、NADP、ATPなどの構成元素として重要な役割を担っている。土壌に含まれる細菌の一部は、有機酸により、土壌中に含まれるリン酸カルシウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸鉄などの難溶性リン化合物を可溶化することができる。理論に束縛されないが、本発明の細菌も、難溶性リン化合物の可溶化することができ、可溶化されたリンを植物に供給することができるため、植物生長促進作用を有すると考えられる。
(Solubility of poorly soluble phosphorus compounds)
The bacterium of the present invention can solubilize poorly soluble phosphorus compounds.
Phosphorus is one of the essential elements of plants and plays an important role as a constituent element such as nucleic acid, phospholipid, NADP, ATP and the like. Some of the bacteria contained in the soil can solubilize poorly soluble phosphorus compounds such as calcium phosphate, aluminum phosphate, and iron phosphate contained in the soil with an organic acid. Although not bound by theory, it is considered that the bacterium of the present invention can also solubilize poorly soluble phosphorus compounds and supply solubilized phosphorus to plants, and thus has a plant growth promoting action.
(植物生長ホルモンの産生能力)
本発明の細菌は、植物生長ホルモンであるインドール−3−酢酸(IAA)を産生できる。インドール−3−酢酸(IAA)は、植物生長ホルモン(オーキシン)の1つである。理論に束縛されないが、本発明の細菌は、IAAを産生することにより、植物の生長促進効果を有すると考えられる。
(Plant growth hormone production ability)
The bacterium of the present invention can produce indole-3-acetic acid (IAA), which is a plant growth hormone. Indole-3-acetic acid (IAA) is one of the plant growth hormones (auxin). Without being bound by theory, it is considered that the bacterium of the present invention has an effect of promoting plant growth by producing IAA.
(シデロフォアの産生能力)
シデロフォア(Siderophore)とは、細菌や菌類が分泌する鉄キレーターである。シデロフォアは、環境中の微量の鉄と結合して機能する。理論に束縛されないが、本発明の細菌は、シデロフォアを産生し、環境中の鉄を奪うことにより植物病原微生物の増殖を抑制することができると考えられる。
(Siderophore production capacity)
A siderophore is an iron chelator secreted by bacteria and fungi. Siderophores function by binding to trace amounts of iron in the environment. Without being bound by theory, it is believed that the bacterium of the present invention can suppress the growth of phytopathogenic microorganisms by producing siderophores and depriving the environment of iron.
(シアン化水素の産生能力)
本発明の細菌は、シアン化水素(HCN)を産生する。理論に束縛されないが、シアン化水素(HCN)の産生により、植物病原微生物の殺菌が行われるため、植物の生長促進効果を有すると考えられる。
(Production capacity of hydrogen cyanide)
The bacterium of the present invention produces hydrogen cyanide (HCN). Without being bound by theory, it is considered that the production of hydrogen cyanide (HCN) sterilizes phytopathogenic microorganisms and thus has an effect of promoting plant growth.
(エチレンの生合成阻害能力)
メチオニン→S−アデノシルメチオニン(SAM)→1−アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)→エチレンという経路を通じて、エチレンは合成される。本発明の細菌はACCデアミナーゼ遺伝子を有しており、ACCの添加により増殖速度が増加する。
一般的に、エチレンは、生長を阻害し、花芽形成や萌芽を抑制する。理論に束縛されないが、本発明の細菌はACCを分解する作用を有するため、植物の生長を促進することができると考えられる。
(Ethylene biosynthesis inhibiting ability)
Ethylene is synthesized through the route of methionine → S-adenosylmethionine (SAM) → 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) → ethylene. The bacterium of the present invention has an ACC deaminase gene, and the growth rate is increased by the addition of ACC.
In general, ethylene inhibits growth and suppresses flower bud formation and budding. Without being bound by theory, it is considered that the bacterium of the present invention has an action of degrading ACC, and therefore can promote plant growth.
(窒素固定能力)
窒素固定とは、空気中に多量に存在する安定な窒素分子を、アンモニア、硝酸塩、二酸化窒素などの無機窒素化合物に変換するプロセスをいう。本発明の細菌は、ニトロゲナーゼ(フラボドキシン)遺伝子を有しており、窒素非含有培地で増殖することができる。
従って、理論に束縛されないが、本発明の細菌は、窒素固定能力を有し、土壌中に窒素化合物を供給できるため、植物の生長を促進することができると考えられる。
(Nitrogen fixing ability)
Nitrogen fixation refers to a process in which stable nitrogen molecules present in large amounts in air are converted into inorganic nitrogen compounds such as ammonia, nitrate, and nitrogen dioxide. The bacterium of the present invention has a nitrogenase (flavodoxin) gene and can grow on a nitrogen-free medium.
Therefore, without being bound by theory, it is considered that the bacterium of the present invention has a nitrogen fixing ability and can supply a nitrogen compound into the soil, so that it can promote the growth of plants.
本発明の細菌の特徴として、キチン分解活性を有さないことも挙げられる。本発明の細菌は、キチン分解酵素(キチナーゼ)遺伝子を有さず、キチン含有培地上で培養した際にハローを形成しない。 Another characteristic of the bacterium of the present invention is that it does not have a chitinolytic activity. The bacterium of the present invention does not have a chitinase (chitinase) gene and does not form a halo when cultured on a chitin-containing medium.
好ましい態様において、本発明の細菌は、受託番号NITE P−01802で表されるパエニバチルス・エスピー(Paenibacillus sp.)FPU−37株である。当該細菌は、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物寄託センターに寄託されている(受託日:平成26年2月20日)。 In a preferred embodiment, the bacterium of the present invention is Paenibacillus sp. FPU-37 strain represented by accession number NITE P-01802. The bacteria have been deposited with the Patent Microorganism Depositary Center of the National Institute of Technology and Evaluation (trusted date: February 20, 2014).
本発明の細菌またはその変異体は、好ましくは、単離された細菌である。「単離された」とは、天然材料からの細菌の分離がなされることで、天然に存在する場合よりも高い純度であることを意味する。本発明の細菌またはその変異体が単離されたものである場合、その純度は、含有される菌全体の個数に対して、50%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは90%以上、特に好ましくは95%以上、最も好ましくは100%である。 The bacterium of the present invention or a variant thereof is preferably an isolated bacterium. “Isolated” means that the bacteria have been separated from the natural material and thus have a higher purity than if they existed in nature. When the bacterium of the present invention or a mutant thereof is isolated, the purity thereof is 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, with respect to the total number of bacteria contained. Particularly preferred is 95% or more, and most preferred is 100%.
本発明の細菌は、本発明の細菌の変異体であり得る。該変異体は、本発明の細菌に由来する菌株である限り特に限定されないが、例えば、形態学的特徴、染色性、増殖性、栄養要求性、遺伝学的特徴、生理学的特徴、および生化学的特徴等において、本発明の細菌と1以上の同様の性質を示し、かつ本発明の細菌の所望の性質を保持している菌株であり得る。該所望の性質としては、セルラーゼ分解能、デンプン分解能、抗菌活性、植物生長促進作用、難溶性リン化合物の可溶化能、インドール−3−酢酸(IAA)産生能、シデロフォア産生能、シアン化水素(HCN)産生能、エチレン生合成阻害能、窒素固定能が挙げられる。あるいは、該変異体は、該所望の性質を発揮するために必要な本発明の細菌由来の遺伝子(例、本発明の細菌のセルラーゼおよびアミラーゼの遺伝子等)を、他の宿主細胞に導入することによって作製することもできる。 The bacterium of the present invention may be a mutant of the bacterium of the present invention. The mutant is not particularly limited as long as it is a strain derived from the bacterium of the present invention. For example, morphological characteristics, staining, growth, auxotrophy, genetic characteristics, physiological characteristics, and biochemistry It may be a bacterial strain that exhibits one or more similar properties to the bacterium of the present invention in terms of its characteristic characteristics and retains the desired properties of the bacterium of the present invention. The desired properties include cellulase degradation, starch degradation, antibacterial activity, plant growth promoting action, solubilization ability of poorly soluble phosphorus compounds, indole-3-acetic acid (IAA) production ability, siderophore production ability, hydrogen cyanide (HCN) production Ability, ethylene biosynthesis inhibition ability, nitrogen fixation ability. Alternatively, the mutant introduces a gene derived from the bacterium of the present invention (eg, the cellulase and amylase genes of the bacterium of the present invention) necessary for exerting the desired property into another host cell. Can also be produced.
本発明の細菌の変異体は、本発明の細菌に自体公知の変異原処理を行い、親株と同等もしくはそれ以上の所望の効果を有する菌株を選抜することにより得ることができる。セルラーゼ分解能は、例えば後述の実施例に記載される方法を用いて試験することができるが、それらに限定されず、自体公知のいかなる方法を用いてもよい。
本発明の変異体は、例えば、本発明の細菌を改変処理することにより作製できる。このような改変処理としては、例えば、変異原性物質等の存在下での培養、本発明の細菌の有用性を高め得る遺伝子の導入、本発明の細菌の有用性を高め得る遺伝子(例、Indole−3−pyruvic acid (IPA)の生合成系遺伝子群、Siderophore 生合成遺伝子、Fe3+−siderophore ABC transporter permease遺伝子、1−aminocyclopropane−1−carboxylate (ACC) deaminase遺伝子、窒素固定遺伝子(nitrogenase = flavodoxin)、抗生物質産生系遺伝子群、酵素などのタンパク質の生合成能力を高めることを目的としたリボソームの高機能化など遺伝子)の機能改変、および本発明の細菌が保有する遺伝子の破壊、ならびにこれらの操作の組合せなどが挙げられる。本発明はまた、このような作製方法を提供する。
ここで変異原としては、例えば、アルキル化剤(N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)、エチルメタンスルホン酸(EMS)等)、ヌクレオチド塩基類似体(ブロモウラシル等)、ニトロソ化合物、DNAインターカレーター、DNA架橋剤、放射線、紫外線等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、当該変異体は、所望の効果(例えば、セルラーゼ分解能、デンプン分解能、抗菌活性または生長促進作用)が親株と比較して増大しているか、あるいはそれらの効果については同等であるが、例えば広いpHレンジで増殖可能、増殖速度が早い、低温下でも増殖可能などの他の有利な効果を奏する菌株などである。
The mutant of the bacterium of the present invention can be obtained by subjecting the bacterium of the present invention to a known mutagen treatment and selecting a strain having a desired effect equivalent to or higher than that of the parent strain. The cellulase resolution can be tested using, for example, a method described in Examples described later, but is not limited thereto, and any method known per se may be used.
The mutant of the present invention can be produced, for example, by modifying the bacterium of the present invention. Examples of such modification treatment include culture in the presence of a mutagenic substance, introduction of a gene that can enhance the usefulness of the bacterium of the present invention, and a gene that can enhance the usefulness of the bacterium of the present invention (eg, Indole-3-pyruvic acid (IPA) biosynthetic gene group, Siderophore biosynthetic gene, Fe 3+ -siderphore ABC transporter permease gene, 1-aminocyclopropane-1-minboxylate (ACC) gene, (A) ), Antibiotic production system gene group, gene modification such as enhancement of ribosome function for the purpose of enhancing the biosynthesis ability of proteins such as enzymes, etc., and possessed by the bacterium of the present invention Disruption of that gene, as well as a combination of these operations. The present invention also provides such a production method.
Examples of mutagens include alkylating agents (N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG), ethylmethanesulfonic acid (EMS), etc.), nucleotide base analogs (bromouracil, etc.), Examples include, but are not limited to, nitroso compounds, DNA intercalators, DNA cross-linking agents, radiation, and ultraviolet rays. Preferably, the mutant has an increased desired effect (eg cellulase degradation, starch degradation, antibacterial activity or growth promoting action) compared to the parent strain, or is equivalent in terms of their effects, eg Strains that can grow in a wide pH range, have a high growth rate, and can grow even at low temperatures.
得られた変異体が抗菌性物質を産生しているか否かは自体公知の方法により検証することができる。
例えば、AM寒天培地上に変異体の培養液をスポットしたペーパーディスクをおよび何もスポットしていないペーパーディスクを置き、植物病原菌をそれぞれに植菌し、28℃で培養することにより試験できる。何もスポットしていないペーパーディスクと比較して、変異体の培養液をスポットしたペーパーディスク上での該植物病原菌数が少ない場合、該変異体は該植物病原菌に対して抗菌活性を有する。
Whether or not the obtained mutant produces an antibacterial substance can be verified by a method known per se.
For example, it is possible to test by placing a paper disc spotted with a mutant culture medium and an unspotted paper disc on an AM agar medium, inoculating a phytopathogenic fungus into each, and culturing at 28 ° C. When the number of the phytopathogenic fungi on the paper disc spotted with the culture medium of the mutant is small compared to the paper disc on which nothing is spotted, the mutant has antibacterial activity against the phytopathogenic fungus.
得られた変異体が植物生長促進作用を有しているか否かは自体公知の方法により検証することができる。
例えば、変異体が難溶性リン化合物を可溶化することができるか否かは、例えば、リン酸カルシウムを懸濁させたPikovskaya寒天培地上で培養し、コロニーを形成させ、ハロー(halo−zone)形成の有無を調べることにより試験することができる。難溶性リン化合物の可溶化することができる変異体である場合、変異体のコロニー周囲に、リン酸カルシウムの溶解によりハロー(halo−zone)が形成される。
Whether or not the obtained mutant has a plant growth promoting action can be verified by a method known per se.
For example, whether or not a mutant can solubilize a poorly soluble phosphorus compound is determined by, for example, culturing on a Pikovskaya agar medium in which calcium phosphate is suspended, forming colonies, and forming a halo-zone. It can be tested by examining the presence or absence. In the case of a mutant capable of solubilizing a poorly soluble phosphorus compound, a halo (zone) is formed around the mutant colony by dissolution of calcium phosphate.
変異体がインドール−3−酢酸(IAA)を産生できるか否かは、例えば、salkowski’s試験によって評価することができる。
変異体がシデロフォアを産生するか否かは、例えば、Chrome Azurol S−鉄錯体を用いた呈色反応によって試験することができる。
変異体がシアン化水素(HCN)を産生するか否かは、例えば、ピクリン酸−炭酸ナトリウム試験紙によって試験することができる。
変異体がエチレンの生合成を阻害するか否かは、例えば、ACCデアミナーゼ活性を測定することによって評価することができる。
変異体が窒素固定するか否かは、例えば、ニトロゲナーゼ活性を測定することによって評価することができる。
Whether a mutant can produce indole-3-acetic acid (IAA) can be assessed, for example, by the salkowski's test.
Whether or not a mutant produces a siderophore can be tested, for example, by a color reaction using a Chrome Azurol S-iron complex.
Whether a mutant produces hydrogen cyanide (HCN) can be tested, for example, with a picric acid-sodium carbonate test paper.
Whether or not the mutant inhibits biosynthesis of ethylene can be evaluated, for example, by measuring ACC deaminase activity.
Whether or not the mutant is nitrogen-fixed can be evaluated, for example, by measuring nitrogenase activity.
本発明の細菌またはその変異体は、パエニバチルス属細菌全般の培養に用いられる自体公知の方法により培養することができる。当業者であれば培養に使用する培地を適宜選択可能であるが、培地の例としては、M9培地(最少培地)、KL培地、BHI培地、2YT培地、YPD培地、AM3培地、LB培地等が挙げられる。本発明の細菌は窒素固定能力を有するため、窒素を含まない培地で培養することもできる。培養時間や培養スケールなどは、当該培養物の用途等に応じて適宜設定することができる。培養温度は、好ましくは15〜40℃、より好ましくは28〜37℃であり、最も好ましくは37℃である。また、培地は、好ましくは、pH3〜10に調節される。
本発明の細菌またはその変異体の培養は、例えば、試験管、培養フラスコ等の培養器に一定量の培地を入れ、本発明の細菌またはその変異体を接種し、試験管振とう機、シンプロカルシェーカー、ロータリーシェーカー等を用い、好気条件下で30〜42℃にて振とう培養により行うことができる。より大規模な培養は、数L規模のジャーファーメンターや数100L〜数100t規模の工業的タンク等の大規模培養槽を用いての通気攪拌培養にて行うことができる。培養時間は特に制限はない。
The bacterium of the present invention or a mutant thereof can be cultured by a method known per se used for culturing Paenibacillus bacteria in general. A person skilled in the art can appropriately select a medium to be used for culture. Examples of the medium include M9 medium (minimum medium), KL medium, BHI medium, 2YT medium, YPD medium, AM3 medium, and LB medium. Can be mentioned. Since the bacterium of the present invention has a nitrogen fixing ability, it can also be cultured in a medium containing no nitrogen. The culture time, culture scale, etc. can be appropriately set according to the use of the culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, more preferably 28 to 37 ° C, and most preferably 37 ° C. The medium is preferably adjusted to pH 3-10.
The bacterium of the present invention or a mutant thereof can be cultured, for example, by placing a certain amount of medium in a culture vessel such as a test tube or culture flask, inoculating the bacterium of the present invention or a mutant thereof, It can be carried out by shaking culture at 30 to 42 ° C. under aerobic conditions using a calshaker, a rotary shaker or the like. Larger scale culture can be carried out by aeration and agitation culture using a large-scale culture tank such as a jar fermenter of several liter scale or an industrial tank of several hundred liter to several hundred t scale. The culture time is not particularly limited.
本発明は、本発明の細菌またはその変異体の抗菌性抽出物を提供する。該抗菌性抽出物は、本発明の細菌またはその変異体に由来するものであれば、どのような方法により抽出されたものであってもよい。当該方法は、例えば、本発明の細菌またはその変異体を含む培養液を遠心分離に供し、該細菌をペレットにし、アセトニトリルまたは低級アルコール等の有機抽出溶媒に該細菌を再懸濁した液を抗菌性抽出物とすることができ、あるいは、アセトニトリルまたは低級アルコール等の有機抽出溶媒に懸濁した後にさらに遠心分離に供し、その上清を抗菌性抽出物とすることもできる。本明細書中、「低級アルコール」とは、炭素数1〜5のアルコールを意味し、好ましい低級アルコールとしては、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールおよびペンタノールが挙げられ、より好ましくはブタノールである。 The present invention provides an antibacterial extract of the bacterium of the present invention or a variant thereof. The antibacterial extract may be extracted by any method as long as it is derived from the bacterium of the present invention or a mutant thereof. In the method, for example, a culture solution containing the bacterium of the present invention or a mutant thereof is subjected to centrifugation, the bacterium is pelleted, and a solution obtained by resuspending the bacterium in an organic extraction solvent such as acetonitrile or lower alcohol is antibacterial. Extract, or suspended in an organic extraction solvent such as acetonitrile or lower alcohol and then subjected to further centrifugation, and the supernatant can be used as an antibacterial extract. In the present specification, “lower alcohol” means an alcohol having 1 to 5 carbon atoms, and preferred lower alcohols include methanol, ethanol, propanol, butanol and pentanol, and more preferably butanol.
当該抗菌性抽出物は、抗菌性物質を含むことにより、植物病原微生物やヒト病原微生物(例えば、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌およびフザリウム属の菌)等、より具体的には、トマト葉かび病菌(Fulvia fulvum(Cooke)Ciferri)、イネいもち病菌(Magnaporthe grisea)、イネいもち病菌(Magnaporthe oryzae)、オオムギ赤かび病菌(Fusarium graminearum)、イチゴ炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、トマト萎凋病菌(Fusarium oxysporum Schechtendal f.sp.Lycopersici)、サトイモ乾腐病菌(Fusarium oxysporum Schechtendal f.sp.Colocasiae)、キュウリつる割病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)、イネばか苗病菌(Fusarium moniliforme)、スイカつる枯病菌(Didymella bryoniae)、スイカ炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)、ダイズ紫斑病菌(Cercospora kikuchii)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum(旧学名Pseudomonas solanacearum))、および軟腐病(Erwinia carotovora subsp.carotovora)等の植物病原菌類の菌、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、Staphylococcus epidermidis、およびStaphylococcus saprophyticus等のブドウ球菌属の細菌、Streptococcus pyogenes、Streptococcus pneumoniae、Streptococcus viridans、Streptococcus agalactiae、およびStreptococcus dysgalactiae等の連鎖球菌属の細菌、Enterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus avium、Enterococcus casseliflavus、Enterococcus gallinarum、およびEnterococcus flavescens等の腸球菌、大腸菌(Escherichia coli)等のエスケリキア属の細菌、Trichophyton rubrum、Trichophyton mentagrophytes、Trichophyton tonsurans、Microsporum canis、Microsporum gypseum、Trichophyton verrucosum等の白癬菌類、Candida albicans等のカンジダ症起因菌、Cryptococcus neoformans等のクリプトコッカス症起因菌、Neisseria gonorrhoeae等の淋菌、Neisseria meningitidis等の髄膜炎菌、Shigella dysenteriae、Shigella flexneri、Shigella boydii、Shigella sonnei等の赤痢菌、Salmonella Typhi、Salmonella Paratyphi、Salmonella Typhimurium,Salmonella Enteritidis等のサルモネラ菌、Vibrio cholerae等のコレラ菌、Pseudomonas aeruginosa等の緑膿菌、Bordetella pertussis等の百日咳菌、Haemophilus influenzae等のインフルエンザ菌、Mycobacterium tuberculosis等の結核菌、Clostridium tetani等の破傷風菌、Corynebacterium diphtheriae等のジフテリア菌、ならびにFusarium oxysporum、Fusarium solani、Fusarium graminearum、Fusarium asiaticum、Fusarium culmorum、およびFusarium fujikuroi(完全(有性)世代:Gibberella fujikuroi)等のフザリウム属の菌から選択される少なくとも1種の菌に対して抗菌活性を有する。 The antibacterial extract contains an antibacterial substance, so that phytopathogenic microorganisms and human pathogenic microorganisms (for example, Staphylococcus bacteria, Streptococcus bacteria, Enterococci, Escherichia bacteria, ringworm fungi, candidiasis More specifically, tomato leaf mold (Fulvia fulvum (Cooke) Ciferri), rice blast fungus (Magnaporthe grisea), rice blast fungus (Magnegorp), etc. Barley red mold fungus (Fusarium gramminearum), strawberry anthracnose fungus (Colletotrichum acutatum), tomato wilt disease fungus (Fusarium oxysporum Schechtendal f. Sp. Lycopersic) i) Fusarium oxysporum Schechtendal f. sp. Colocasiae, Fusarium oxysporum f. sp. Watermelon anthracnose fungus (Colletotrichum orbiculare), soybean purpura fungus (Cercospora kikuchii), bacterial wilt fungus (Ralstonia solanacearum) (formerly known as Pseudomonas solanacerum), and soft rot aero tora vora cerato v. Bacteria fungi, Staphylococcus aureus (Staphylococcus aureus), Staphylococcus epidermidis, and Staphylococcus Staphylococcus bacteria such saprophyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus viridans, Streptococcus agalactiae, and Streptococcus dysgalactiae like streptococcal bacteria, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus avium, Enterococcus casseriflavus, Entero coccus gallinarum, and Enterococcus Enterococcus such flavescens, E. (Escherichia coli) Esukerikia genus bacteria such as, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Microsporum canis, Microsporum gypseum, ringworm fungi such as Trichophyton verrucosum, Candida, such as Candida albicans Disease-causing bacteria, cryptococcosis-causing bacteria such as Cryptococcus neoformans, Neisseria gonorrhoeae and other Neisseria meningitidis, etc. Neisseria meningitidis, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella, such as Shigella sonnei, Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi, Salmonella Typhimurium, Salmonella, such as Salmonella Enteritidis, cholera bacteria such as Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, such as Pseudomonas aeruginosa Bordetella pertussis, etc. Bordetella pertussis, Haemophilus influenzae and other influenza bacteria, Mycobacterium tuberculosis and other tuberculosis bacteria, Clostridium tetani etc. Fungi, diphtheria such as Corynebacterium diphtheriae, and selected from Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium graminearum, Fusarium asiaticum, Fusarium curum, and Fusarium curum. Has antibacterial activity against one type of bacteria.
また、当該抗菌性抽出物は、抽出に使用した溶媒の種類に応じて、異なる菌に対して抗菌活性を示し得る。例えば、アセトニトリルを使用して抽出した抗菌性抽出物は、植物病原菌類およびフザリウム属の菌に対して抗菌活性を有し得、低級エタノールを使用して抽出した抗菌性抽出物は、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、およびエスケリキア属の菌に対して抗菌活性を有し得る。 In addition, the antibacterial extract can exhibit antibacterial activity against different bacteria depending on the type of solvent used for extraction. For example, an antibacterial extract extracted using acetonitrile may have antibacterial activity against phytopathogenic fungi and fungus belonging to the genus Fusarium, and an antibacterial extract extracted using lower ethanol May have antibacterial activity against bacteria, Streptococcus, Enterococci, and Escherichia.
当該抗菌性抽出物は、広範囲の細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示すため、農薬や医薬品、種子消毒剤、土壌改良剤等に好適に使用し得る。 Since the antibacterial extract exhibits antibacterial activity against a wide range of bacteria and fungi other than yeast, it can be suitably used for agricultural chemicals, pharmaceuticals, seed disinfectants, soil improvers and the like.
当該抗菌性抽出物が農薬として使用される場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。 When the antibacterial extract is used as an agrochemical, the target crops are, for example, rice, barley, tomato, watermelon, cucumber, strawberry, taro, soybean, wheat, corn, potato, kidney bean, pea, peanut, Sugar beet, sugar cane, eggplant, pepper, melon, pumpkin, radish, cabbage, cabbage, komatsuna, onion, leek, leek, garlic, asparagus, burdock, lettuce, garlic, carrot, spinach, okra, apple, pear, ume, grape , Oysters, figs, kiwi and the like.
当該抗菌性抽出物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。 When the antibacterial extract is used as a medicine, it is orally or parenterally administered to humans and other mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) It can be safely administered. The medicament may have a therapeutic effect against bacterial and fungal infections. Specific examples of such infections include infection with staphylococcal bacteria, streptococcal bacteria, enterococci, escherichia bacteria, ringworms, candidiasis bacteria, cryptococcosis bacteria, or fusarium bacteria. Examples include infectious diseases that develop.
一態様において、本発明は、上記抗菌性抽出物を含有する抗菌組成物を提供する。該抗菌組成物は、上記本発明の抗菌性抽出物を有効成分として含むものであれば、該抗菌性抽出物の効果を損なわないその他の多糖、オリゴ糖、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、無機化合物、有機化合物、およびミネラルなどの成分を含有してもよい。また、該抗菌組成物は、所望の効果を損なわないものであれば、希釈剤、賦形剤、安定化剤、保存剤などの生理学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。該抗菌組成物中に含まれる、本発明の抗菌性抽出物の含有量は、抽出方法や用途等に応じて適宜調整できるが、例として、0.1〜100(w/w)%であり得る。 In one aspect, the present invention provides an antibacterial composition containing the antibacterial extract. As long as the antibacterial composition contains the antibacterial extract of the present invention as an active ingredient, other polysaccharides, oligosaccharides, glycoproteins, peptides, proteins, nucleic acids, which do not impair the effect of the antibacterial extract, Components such as lipids, inorganic compounds, organic compounds, and minerals may be contained. In addition, the antibacterial composition may further contain a physiologically acceptable carrier such as a diluent, an excipient, a stabilizer, and a preservative as long as the desired effect is not impaired. The content of the antibacterial extract of the present invention contained in the antibacterial composition can be adjusted as appropriate according to the extraction method, use, etc., but is 0.1 to 100 (w / w)% as an example. obtain.
本発明の抗菌組成物は、広範な抗菌スペクトルを示すことから、殺菌剤等の農薬、抗生物質等の医薬品、種子消毒剤、土壌改良剤等として好適に使用し得る。あるいは、上記抽出操作をせずに本発明の細菌またはその変異体を生物農薬、種子消毒剤、土壌改良剤等として使用することもできる。 Since the antibacterial composition of the present invention exhibits a broad antibacterial spectrum, it can be suitably used as agricultural chemicals such as bactericides, pharmaceuticals such as antibiotics, seed disinfectants, soil improvers and the like. Alternatively, the bacterium of the present invention or a mutant thereof can be used as a biopesticide, a seed disinfectant, a soil conditioner, etc. without performing the above extraction operation.
本発明の抗菌組成物が農薬として使用される場合、および本発明の細菌またはその変異体を生物農薬として使用する場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。 When the antibacterial composition of the present invention is used as a pesticide, and when the bacterium of the present invention or a mutant thereof is used as a biopesticide, target crops include, for example, rice, barley, tomato, watermelon, cucumber, Strawberry, taro, soybean, wheat, corn, potato, kidney bean, pea, peanut, sugar beet, sugar cane, eggplant, pepper, melon, pumpkin, radish, cabbage, cabbage, komatsuna, onion, leek, leek, garlic, asparagus, burdock , Lettuce, garlic, carrot, spinach, okra, apple, pear, ume, grape, oyster, fig, kiwi and the like.
本発明の抗菌組成物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。 When the antimicrobial composition of the present invention is used as a pharmaceutical, it is orally or parenterally administered to humans and other mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) Can be administered safely. The medicament may have a therapeutic effect against bacterial and fungal infections. Specific examples of such infections include infection with staphylococcal bacteria, streptococcal bacteria, enterococci, escherichia bacteria, ringworms, candidiasis bacteria, cryptococcosis bacteria, or fusarium bacteria. Examples include infectious diseases that develop.
別の態様において、本発明は、本発明の細菌またはその変異体を培養することによって得られる培養物を提供する。本明細書中、「培養物」は、培養された菌体および培養上清を意味する。 In another aspect, the present invention provides a culture obtained by culturing the bacterium of the present invention or a mutant thereof. In the present specification, “culture” means cultured cells and culture supernatant.
該培養物は、上記した本発明の抗菌性抽出物および抗菌組成物の製造に有用である。該培養物には、α−グルコシダーゼも含有されると考えられるので、マルトースを分解しグルコースを産生する目的にも好適に使用し得る。また、該培養物は、後述する、本発明のセルロースおよび/またはデンプン分解物の製造方法、本発明のエタノール製造方法、ならびに本発明の抗菌性抽出物の製造方法に用いることができる。本発明の細菌またはその変異体は、長期培養による自己消化(オートリシス)により培養上清中にα−グルコシダーゼを遊離するので、マルトースを分解しグルコースを産生するために、該培養上清を用いることもできる。 The culture is useful for producing the antibacterial extract and antibacterial composition of the present invention described above. Since it is considered that the culture also contains α-glucosidase, it can be suitably used for the purpose of degrading maltose to produce glucose. The culture can be used in the method for producing the cellulose and / or starch degradation product of the present invention, the method for producing ethanol of the present invention, and the method for producing the antibacterial extract of the present invention, which will be described later. Since the bacterium of the present invention or a mutant thereof releases α-glucosidase in the culture supernatant by autolysis by long-term culture, the culture supernatant is used to decompose maltose and produce glucose. You can also.
また、上記、本発明の培養物は、本発明の細菌またはその変異体により産生されたセルラーゼおよびアミラーゼを含有すると考えられるので、セルロースやデンプンの糖化に好適に使用し得る。 Moreover, since it is thought that the culture of this invention contains the cellulase and amylase produced by the bacterium of this invention, or its variant, it can be used suitably for saccharification of a cellulose or starch.
当業者であれば当該培養に使用する培地を適宜選択可能であるが、培地の例としては、M9培地(最少培地)、BHI培地、2YT培地、YPD培地、AM3培地、LB培地等が挙げられる。培養時間や培養スケールなどは、当該培養物の用途等に応じて適宜設定することができる。培養温度は、好ましくは15〜40℃、より好ましくは28〜37℃であり、最も好ましくは37℃である。また、培地は、好ましくは、pH3〜10に調節される。 A person skilled in the art can appropriately select the medium used for the culture. Examples of the medium include M9 medium (minimum medium), BHI medium, 2YT medium, YPD medium, AM3 medium, LB medium, and the like. . The culture time, culture scale, etc. can be appropriately set according to the use of the culture. The culture temperature is preferably 15 to 40 ° C, more preferably 28 to 37 ° C, and most preferably 37 ° C. The medium is preferably adjusted to pH 3-10.
本発明の細菌またはその変異体を培養することによって得られる培養物は、例えば、当該培養物を水もしくは適当な希釈液(例えば、等張緩衝液や培地等)で適切な菌体濃度となるまで希釈することができる。あるいは、培養物をろ過もしくは遠心分離して菌体を回収し、適当な分散媒(例えば、等張緩衝液や新鮮培地等)に再懸濁することもできる。さらに、回収した菌体を常法により凍結乾燥することもできる。あるいはまた、培養物に10〜20%のグリセロールを添加して−80℃で凍結保存し、用時融解して培地等に再懸濁して用いることもできる。また、当該細菌は芽胞(内生胞子)を形成するが、芽胞は熱や乾燥などの環境変化に対して耐性を示し長期間安定に保存できるので、芽胞の形態で製品化し、用時発芽させ菌体を増殖させてもよい。
一方、所望の効果をもたらす有効物質が菌体外(培養上清)に分泌される場合は、培養上清をそのままで、あるいは濃縮もしくは希釈して使用することもできる。
The culture obtained by culturing the bacterium of the present invention or a mutant thereof is, for example, an appropriate bacterial cell concentration in water or an appropriate diluent (eg, isotonic buffer or medium). Can be diluted. Alternatively, the culture can be filtered or centrifuged to recover the cells and resuspended in a suitable dispersion medium (eg, isotonic buffer or fresh medium). Furthermore, the recovered cells can be freeze-dried by a conventional method. Alternatively, 10-20% glycerol can be added to the culture and stored frozen at −80 ° C., thawed at the time of use, and resuspended in a medium or the like. In addition, the bacteria form spores (endospores), which are resistant to environmental changes such as heat and dryness and can be stored stably for a long period of time. Bacteria may be grown.
On the other hand, when an effective substance that provides a desired effect is secreted outside the microbial cells (culture supernatant), the culture supernatant can be used as it is or after being concentrated or diluted.
(農薬)
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物を含有する農薬(本明細書中、本発明の農薬ともいう)を提供する。本発明の農薬は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物または細菌もしくはその変異体が抗菌活性を有する植物病原微生物に起因する病害に対して、防除効果を有する。
本発明の農薬の対象となる農作物の例としては、上記に記載のとおりであるが、所望の効果を有する限り、上記に限定されるものではない。
(Pesticide)
As one embodiment of the present invention, the present invention provides an antibacterial extract of the present invention, an antibacterial composition, a bacterium of the present invention or a mutant thereof, or an agrochemical containing the culture thereof (herein, the present invention). (Also called pesticides). The agrochemical of the present invention has a control effect against diseases caused by phytopathogenic microorganisms in which the antibacterial extract, antibacterial composition or bacterium or variant thereof of the present invention has antibacterial activity.
Examples of crops that are targets of the agricultural chemical of the present invention are as described above, but are not limited to the above as long as they have a desired effect.
所望の効果を有する限り、本発明の農薬により農作物を処理する方法は特に制限されない。例えば、対象とする農作物に、水性溶媒で希釈した本発明の農薬をスプレーヤーにより散布してもよく、対象とする農作物が生育する土壌に本発明の農薬を直接混和するか水等に懸濁した本発明の農薬を用いて潅注処理してもよい。
本発明の農薬を用いて農作物を処理する場合、本発明の農薬で農作物を直接処理してもよく、本発明の農薬で農作物に接触し得る物質(例、農業用水、防根透水シート等)を間接的に処理してもよい。さらには、一実施態様において、農作物に接触し得る物質をあらかじめ本発明の農薬で処理し、続いて本発明の農薬を除去してから、該物質を使用することもできる。
本発明の農薬を散布することにより農作物を処理する場合、農薬の量は、使用土壌約5リットルあたり散布が液体であれば、100〜500ml適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体1mlあたり通常103〜106cfuである。
本発明の農薬により農作物を処理するタイミングは、所望の効果を有する限り特に制限されず、任意のタイミングで使用することができる。
本発明の農薬の施用頻度に対しては特に制限はない。本発明の農薬により植物を処理する前および後において、通常の方法で植物を栽培することができる。
As long as it has a desired effect, the method for treating agricultural products with the agricultural chemical of the present invention is not particularly limited. For example, the agricultural chemical of the present invention diluted with an aqueous solvent may be sprayed on a target crop with a sprayer, and the agricultural chemical of the present invention is directly mixed in a soil where the target agricultural product is grown or suspended in water or the like. Irrigation treatment may be performed using the agrochemical of the present invention.
When a crop is treated with the agrochemical of the present invention, the crop may be directly treated with the agrochemical of the present invention, and a substance that can contact the crop with the agrochemical of the present invention (eg, agricultural water, root permeation sheet, etc.) May be processed indirectly. Furthermore, in one embodiment, a substance that can come into contact with crops can be used after the treatment with the pesticide of the present invention, followed by removal of the pesticide of the present invention.
When treating agricultural products by spraying the agricultural chemical of the present invention, the amount of the agricultural chemical is preferably 100 to 500 ml if spraying is liquid per about 5 liters of soil used, and the bacterial cell concentration is 1 ml spray liquid. Usually 10 3 to 10 6 cfu.
The timing for treating the crop with the agricultural chemical of the present invention is not particularly limited as long as it has a desired effect, and can be used at any timing.
There is no restriction | limiting in particular with respect to the application frequency of the agrochemical of this invention. Before and after the plant is treated with the agricultural chemical of the present invention, the plant can be cultivated by a usual method.
本発明の農薬に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、抗菌性物質を生成する細菌であることが好ましい。 When the mutant of the bacterium of the present invention is used for the agricultural chemical of the present invention, the mutant is preferably a bacterium that produces an antibacterial substance.
(種子消毒剤)
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含有する種子消毒剤(本明細書中、本発明の種子消毒剤ともいう)を提供する。本発明の種子消毒剤は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物または細菌が抗菌活性を有する植物病原微生物に対して、防除効果を有する。
(Seed disinfectant)
As one embodiment of the present invention, the present invention provides a seed disinfectant containing the antibacterial extract, antibacterial composition of the present invention, the bacterium of the present invention or a variant thereof, or a culture thereof (herein, the present invention The seed disinfectant of the invention is also provided. The seed disinfectant of the present invention has a control effect on the phytopathogenic microorganisms of which the antibacterial extract, antibacterial composition or bacterium of the present invention has antibacterial activity.
本発明の種子消毒剤は、種子、種もみ、種芋、球根などの消毒に使用することができる。 The seed disinfectant of the present invention can be used for disinfecting seeds, seed meal, seed pods, bulbs and the like.
本発明の種子消毒剤は、所望の効果を損なわない限り、従来公知の種子消毒方法により使用され得る。
種子を消毒する方法としては湿粉衣、浸漬、吹付け、塗沫などの方法があるが、これらに限定されない。一実施態様として、本発明の種子消毒剤は、液状である本発明の種子消毒剤に種子を浸す浸漬法に用いられる。別の実施態様としては、粉末状の本発明の種子消毒剤を種子にまぶす粉衣法に用いられる。浸漬法は種子の浸種前処理、種子の催芽処理時のいずれにおいても、用いることができる。また粉衣法は、乾燥種子に用いることができる。また別の実施形態として、本発明の種子消毒剤は、表面を湿らせた種子に本発明の種子消毒剤を付着させて用いることができる。
The seed disinfectant of the present invention can be used by a conventionally known seed disinfecting method as long as the desired effect is not impaired.
Methods for disinfecting seeds include, but are not limited to, wet dressing, dipping, spraying, and smearing. In one embodiment, the seed disinfectant of the present invention is used in a dipping method in which seeds are immersed in a liquid liquid of the seed disinfectant of the present invention. As another embodiment, the seed disinfectant of the present invention in powder form is used for a powder coating method in which seeds are applied. The dipping method can be used both in the seed soaking pretreatment and in the seed germination treatment. The powder coating method can be used for dried seeds. In another embodiment, the seed disinfectant of the present invention can be used by attaching the seed disinfectant of the present invention to a seed whose surface has been moistened.
種子消毒を行う場合には、種子質量に対して製剤を2〜50質量%適用することが好ましく、その菌体濃度は種子質量1gあたり通常103〜109cfuである。
浸漬法により種子消毒を行う場合、例えば、種子を本発明の種子消毒剤0.5時間から48時間、好ましくは1時間から24時間、浸潤させることにより種子消毒を行うことができる。
When seed disinfection is performed, it is preferable to apply 2 to 50% by mass of the preparation with respect to the seed mass, and the bacterial cell concentration is usually 10 3 to 10 9 cfu per 1 g of seed mass.
When seed sterilization is performed by the dipping method, for example, seed sterilization can be performed by infiltrating seeds of the present invention for 0.5 to 48 hours, preferably 1 to 24 hours.
本発明の種子消毒剤に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、抗菌性物質を生成する細菌であることが好ましい。 When the mutant of the bacterium of the present invention is used for the seed disinfectant of the present invention, the mutant is preferably a bacterium that produces an antibacterial substance.
(植物生長促進剤)
本発明の一実施形態として、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含む植物生長促進剤(本明細書中、本発明の植物生長促進剤ともいう)を提供する。
本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物は、土壌中の難溶性リン化合物の可溶化(植物へのリンの供給)、植物生長ホルモンの産生、シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制(植物もシデロフォアを産生可能)、シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌、植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害、窒素固定などにより、植物に対する生長促進効果を有する。
(Plant growth promoter)
As one embodiment of the present invention, a plant growth promoter (also referred to as a plant growth promoter of the present invention in the present specification) comprising the bacterium of the present invention or a mutant thereof or a culture thereof is provided.
The bacterium of the present invention or a mutant thereof or a culture thereof is obtained by solubilizing poorly soluble phosphorus compounds in soil (supplying phosphorus to plants), producing plant growth hormones, and depriving the environment of iron by siderophores. Has the effect of promoting the growth of plants by suppressing the growth of plant pathogenic microorganisms (plants can also produce siderophores), sterilizing plant pathogenic microorganisms with hydrogen cyanide and antibiotics, inhibiting the biosynthesis of ethylene to suppress plant growth, and fixing nitrogen .
本発明の植物生長促進剤の対象となる植物としては、ナス科植物(トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ、ピーマン、トウガラシ等)、マメ科植物(インゲン、ダイズ、ラッカセイ、ササゲ、アズキ等)、アブラナ科植物(ハクサイ、カブ、キャベツ、ダイコン、アブラナ等)、イネ科植物(イネ、コムギ、トウモロコシ、オオムギ、ライムギ、サトウキビ等)、ウリ科植物(キュウリ、メロン、スイカ、カボチャ、トウガン等)、ユリ科植物(チューリップ、ユリ、タマネギ、アスパラガス、ネギ、ニラ、ニンニク等)、ミカン科植物(特に柑橘類:ウンシュウミカン、ユズ、レモン、ブンタン、イヨカン、ハッサク、グレープフルーツ等)を挙げることができ、中でも好ましい例としてナス科植物、およびイネ科植物を挙げることができるが、これらに限定されない。 Examples of plants that can be targeted by the plant growth promoter of the present invention include solanaceous plants (tomatoes, eggplants, potatoes, tobacco, peppers, peppers, etc.), legumes (green beans, soybeans, groundnuts, cowpeas, azuki beans, etc.), rapes. Family plants such as Chinese cabbage, turnip, cabbage, radish, rape, etc., Gramineae plants (rice, wheat, corn, barley, rye, sugarcane, etc.), Cucurbitaceae plants (cucumber, melon, watermelon, pumpkin, eugan, etc.), lily Citrus plants (tulips, lilies, onions, asparagus, leeks, leek, garlic, etc.), citrus plants (especially citrus fruits: citrus: yuzu, lemon, buntan, iyokan, hassaku, grapefruit, etc.) Preferred examples include solanaceous plants and gramineous plants. , But it is not limited to these.
所望の効果を有する限り、本発明の植物生長促進剤により植物を処理する方法は特に制限されない。例えば、対象とする植物に、水性溶媒で希釈した本発明の植物生長促進剤をスプレーヤーにより散布してもよく、対象とする植物が生育する土壌に本発明の植物生長促進剤を直接混和するか水等に懸濁した本発明の植物生長促進剤を用いて潅注処理してもよい。
植物生長促進剤を直接土壌に混和することにより植物生長促進処理を行う場合には、使用土壌約5リットルあたり散布が液体であれば、100〜500ml適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体1mlあたり通常103〜109cfu、好ましくは104〜108cfuである。
As long as it has a desired effect, the method for treating plants with the plant growth promoter of the present invention is not particularly limited. For example, the plant growth promoter of the present invention diluted with an aqueous solvent may be sprayed on the target plant with a sprayer, and the plant growth promoter of the present invention is directly mixed in the soil where the target plant grows. Irrigation treatment may be performed using the plant growth promoter of the present invention suspended in water or the like.
When the plant growth promoting treatment is carried out by directly mixing the plant growth promoter into the soil, it is preferable to apply 100 to 500 ml if the spraying is liquid per about 5 liters of the soil used. Usually 10 3 to 10 9 cfu, preferably 10 4 to 10 8 cfu per ml of liquid.
本発明の植物生長促進剤の施用頻度に対しては特に制限はない。本発明の植物生長促進剤を使用する前および後において、通常の方法で植物を栽培することができる。 There is no restriction | limiting in particular with respect to the application frequency of the plant growth promoter of this invention. Before and after using the plant growth promoter of the present invention, the plant can be cultivated by a usual method.
本発明の植物生長促進剤に本発明の細菌の変異体を用いる場合、該変異体は、難溶性リン化合物の可溶化能力、植物生長ホルモンの産生能力、シデロフォアの産生能力、シアン化水素の産生能力、エチレンの生合成阻害能力、窒素固定能力および抗菌性物質の産生能力から成る群より選ばれる少なくとも1つ以上の能力を有する細菌であることが好ましく、より好ましくは2つ以上、さらに好ましくは3つ以上、最も好ましくは7つの能力を有する細菌である。 When the mutant of the bacterium of the present invention is used for the plant growth promoter of the present invention, the mutant is a solubilizing ability of a poorly soluble phosphorus compound, an ability to produce a plant growth hormone, an ability to produce a siderophore, an ability to produce hydrogen cyanide, Preferably, the bacterium has at least one ability selected from the group consisting of the ability to inhibit ethylene biosynthesis, the ability to fix nitrogen, and the ability to produce an antibacterial substance, more preferably two or more, and even more preferably three. As described above, a bacterium having 7 abilities is most preferable.
(土壌改良剤)
本発明の一実施形態として、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物を含む、土壌改良剤(本明細書中、本発明の土壌改良剤ともいう)を提供する。
本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物は、植物に対する生長促進効果を有し、抗菌作用を有するため、土壌改良剤として使用することができる。本発明の抗菌性抽出物および抗菌組成物もまた抗菌作用を有するため、土壌改良剤として使用することができる。
本明細書において、土壌は、土耕栽培に用いる土等の固形培地、養液栽培等に用いる液体培地、または半流動培地を含む。本明細書中、土壌改良剤とは、土壌の、物理性または化学性を改良する作用を有する剤を指す。本発明の土壌改良剤は、土耕栽培用土壌、養液土耕栽培用土壌、および養液栽培(水耕栽培、噴霧耕、固形培地耕)用土壌のいずれにも使用され得る。
土壌改良の例としては、病原性の低い土壌への改良、生長促進作用を有する土壌への改良、防腐作用を有する土壌への改良などが挙げられるがこれらに限定されない。
(Soil conditioner)
As one embodiment of the present invention, a soil conditioner (in the present specification, the soil conditioner of the present invention) comprising the antibacterial extract, the antibacterial composition of the present invention, the bacterium of the present invention or a mutant thereof or a culture thereof Also referred to as an agent).
Since the bacterium of the present invention or a mutant thereof or a culture thereof has a growth promoting effect on plants and an antibacterial action, it can be used as a soil conditioner. Since the antibacterial extract and antibacterial composition of the present invention also have an antibacterial action, they can be used as a soil conditioner.
In the present specification, the soil includes a solid medium such as soil used for soil cultivation, a liquid medium used for hydroponics or the like, or a semi-fluid medium. In the present specification, the soil improver refers to an agent having an action of improving physical or chemical properties of soil. The soil improver of the present invention can be used for any of soil for soil cultivation, soil for hydroponics, and soil for hydroponics (hydroponics, spray cultivation, solid culture).
Examples of soil improvement include, but are not limited to, improvement to soil with low pathogenicity, improvement to soil having growth promoting action, and improvement to soil having antiseptic action.
所望の効果を有する限り、本発明の土壌改良剤により土壌を処理する方法は特に制限されない。例えば、本発明の土壌改良剤を土壌に直接混和してもよく、本発明の土壌改良剤を水等に懸濁した後に潅注処理してもよい。養液栽培または水耕栽培の場合、本発明の土壌改良剤を培養液または水耕液へ直接添加してもよい。本発明の一実施形態において、あらかじめ本発明の土壌改良剤により土壌を処理し、その後本発明の土壌改良剤を除去した土壌を、植物の栽培に使用することもできる。土壌改良剤の除去は、例えばろ過膜によるろ過等によって行われ得るが、所望の効果を有する限りこれに限定されない。
本発明の一実施態様において、本発明の土壌改良剤により、養液栽培用の液体培地を処理することにより、細菌および酵母以外の真菌に対する防腐効果を液体培地に与えることができる。
As long as it has a desired effect, the method for treating soil with the soil improver of the present invention is not particularly limited. For example, the soil conditioner of the present invention may be directly mixed with soil, or the soil conditioner of the present invention may be irrigated after being suspended in water or the like. In the case of hydroponics or hydroponics, the soil conditioner of the present invention may be added directly to the culture solution or hydroponic solution. In one Embodiment of this invention, the soil which processed soil with the soil improvement agent of this invention previously, and removed the soil improvement agent of this invention after that can also be used for cultivation of a plant. The removal of the soil conditioner can be performed, for example, by filtration with a filtration membrane, but is not limited thereto as long as the desired effect is obtained.
In one embodiment of the present invention, an antiseptic effect against bacteria and fungi other than yeast can be imparted to the liquid medium by treating the liquid medium for hydroponics with the soil improver of the present invention.
本発明の土壌改良剤を用いて土壌改良を行う場合には使用土壌約5リットルあたり散布が液体であれば、100〜500ml適用することが好ましく、その菌体濃度は散布液体1mlあたり通常103〜109cfu、好ましくは104〜108cfuである。 In the case of soil improvement using the soil improver of the present invention, it is preferable to apply 100 to 500 ml if the spraying is liquid per about 5 liters of soil used, and the cell concentration is usually 10 3 per 1 ml of sprayed liquid. -10 9 cfu, preferably 10 4 -10 8 cfu.
本発明の土壌改良剤を散布するタイミングは、所望の効果を有する限り特に制限されず、植物の播種前、植物の育種中などの任意のタイミングで使用することができる。
本発明の土壌改良剤の施用頻度に対しては特に制限はない。
The timing at which the soil conditioner of the present invention is sprayed is not particularly limited as long as it has a desired effect, and can be used at any timing such as before planting or during plant breeding.
There is no restriction | limiting in particular with respect to the application frequency of the soil improvement agent of this invention.
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、粉剤、粒剤、水和剤、顆粒水和剤(ドライフロアブル)、フロアブル剤(懸濁剤)、乳剤、エマルション、マイクロカプセル剤などの様々な剤形で提供され得る。 If the seed disinfectant of the present invention, the soil improver of the present invention, the agricultural chemical of the present invention or the plant growth promoter of the present invention does not impair the desired effect, it is a powder, granule, wettable powder, granule water. It can be provided in various dosage forms, such as a summing agent (dry flowable), a flowable agent (suspension), an emulsion, an emulsion, and a microcapsule.
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、有効成分に加え、担体を含んでも良い。使用できる担体としては、農薬または種子消毒剤に常用されるものであれば、固体または液体のいずれでも使用でき特定のものに限定されるものではない。
固体担体としては、鉱物系担体(クレー、タルク、炭酸カルシウム、けいそう土、ゼオライト、ベントナイト、酸性白土、活性白土、アタパルガスクレー、バーミキュライト、パーライト、軽石、珪砂、シリカ、ホワイトカーボン、二酸化チタンなど)、植物系担体(木質粉、トウモロコシ茎(穂軸)、クルミ殻(堅果外皮)、果実核、モミガラ、オガクズ、ふすま、大豆粉、粉末セルロース、デンプン、デキストリン、糖類(グルコース、マルトース、ラクトース、シュークロースなど)などの不活性な粉体または粒状物、寒天などの水溶性高分子ゲルなどや塩素化ポリエチレン、塩素化ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、エチレン−酢酸ビニル共重合体、尿素−アルデビド樹脂などの種々のポリマー粉末)などが挙げられる。
また、液体担体としては、水、アルコール類、多価アルコール類、多価アルコール誘導体類、ケトン類、エステル類、含窒素担体類、油脂類などが挙げられ、具体的には、エタノール、イソプロパノール、シクロヘキサノール、エチレングリコール、ジエチレングリコール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、プロピレン系グリコールエーテル、シクロヘキサノン、γ―ブチロラクトン、脂肪酸メチルエステル(ヤシ油脂肪酸メチルエステル)、二塩基酸メチルエステル(コハク酸ジメチルエステル,グルタミン酸ジメチルエステル、アジピン酸ジメチルエステル)、N―アルキルピロリドン、ヤシ油、大豆油、菜種油などが挙げられる。
The seed disinfectant of the present invention, the soil improver of the present invention, the agricultural chemical of the present invention or the plant growth promoter of the present invention may contain a carrier in addition to the active ingredient as long as the desired effect is not impaired. As a carrier that can be used, any solid or liquid can be used as long as it is commonly used for agricultural chemicals or seed disinfectants, and is not limited to a specific one.
As the solid carrier, mineral carriers (clay, talc, calcium carbonate, diatomaceous earth, zeolite, bentonite, acid clay, activated clay, attapulgus clay, vermiculite, perlite, pumice, silica sand, silica, white carbon, titanium dioxide Etc.), plant-based carriers (wood flour, corn stalk (cob), walnut shell (nut husk), fruit core, rice bran, sawdust, bran, soybean flour, powdered cellulose, starch, dextrin, sugars (glucose, maltose, lactose Inert powders or granules such as sucrose), water-soluble polymer gels such as agar, chlorinated polyethylene, chlorinated polypropylene, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, ethylene-vinyl acetate copolymer, Various polymer powders such as urea-aldevid resin) That.
Examples of the liquid carrier include water, alcohols, polyhydric alcohols, polyhydric alcohol derivatives, ketones, esters, nitrogen-containing carriers, fats and oils, specifically, ethanol, isopropanol, Cyclohexanol, ethylene glycol, diethylene glycol, propylene glycol, hexylene glycol, polyethylene glycol, polypropylene glycol, propylene glycol ether, cyclohexanone, γ-butyrolactone, fatty acid methyl ester (coconut oil fatty acid methyl ester), dibasic acid methyl ester (succinic acid) Acid dimethyl ester, glutamic acid dimethyl ester, adipic acid dimethyl ester), N-alkylpyrrolidone, coconut oil, soybean oil, rapeseed oil and the like.
本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤は、所望の効果を損なわないものであれば、界面活性剤、乳化剤、粉砕助剤、結合助剤、滑助剤、溶解助剤、懸濁分散助剤、粉末化助剤、液性調整剤、増粘剤、崩壊分散剤、酸化防止剤、拡展剤、展着剤、湿潤剤、安定化剤、乾燥剤、紫外線吸収剤、ドリフト防止剤、アジュバント、物理性改良剤、有効成分安定化剤または凍結防止剤などを含んでも良い。
また、本発明の種子消毒剤、本発明の土壌改良剤、本発明の農薬または本発明の植物生長促進剤には、有効成分に加え、他の殺菌成分、殺虫成分、植物生育調節成分が含まれていてもよい。
If the seed disinfectant of the present invention, the soil improver of the present invention, the agricultural chemical of the present invention or the plant growth promoter of the present invention does not impair the desired effect, a surfactant, emulsifier, grinding aid, binding Auxiliary agent, slip aid, dissolution aid, suspension dispersion aid, powdering aid, liquidity modifier, thickener, disintegrating dispersant, antioxidant, spreading agent, spreading agent, wetting agent, A stabilizer, a desiccant, an ultraviolet absorber, an anti-drift agent, an adjuvant, a physical property improver, an active ingredient stabilizer or an antifreeze agent may be included.
Further, the seed disinfectant of the present invention, the soil improver of the present invention, the agricultural chemical of the present invention or the plant growth promoter of the present invention includes other fungicidal components, insecticidal components, plant growth regulating components in addition to the active ingredients. It may be.
さらに、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび/またはデンプンを含む、組成物を提供する。 Furthermore, the present invention provides a composition comprising the bacterium of the present invention or a variant thereof, and cellulose and / or starch.
本発明の組成物に含まれるセルロースおよび/またはデンプンとしては、セルロースおよび/またはデンプンを含有するものであればいかなるものも使用可能である。食用農作物の価格の高騰を防ぐ観点から、食料供給と競合しないセルロースおよび/またはデンプン原料を使用するのが好ましい。食料供給と競合しない原料としては、農作物の非可食部分(例えば、サトウキビ搾汁後のバガス、稲藁等のソフトセルロース、トウモロコシの茎)や木質廃材が好適な例として挙げられる。また、食用価値の低い農作物(例えば、規格外農産物、資源作物、大麦、および食品廃棄物等)も、原料として好適に用い得る。入手しやすさの観点から、大麦粉末、コーンスターチ等の市販のデンプン原料や、結晶性セルロース等の精製品も好適に使用し得る。本発明の組成物中のセルロースおよび/またはデンプンの含有量は、セルロース原料の種類、デンプン原料の種類、該組成物の使用目的等に応じて適宜設定することができる。 As the cellulose and / or starch contained in the composition of the present invention, any one containing cellulose and / or starch can be used. From the viewpoint of preventing an increase in the price of edible crops, it is preferable to use a cellulose and / or starch raw material that does not compete with the food supply. Suitable examples of raw materials that do not compete with food supply include non-edible parts of crops (eg, bagasse after sugarcane juice, soft cellulose such as rice straw, corn stalks) and wood waste. In addition, agricultural crops with low edible value (for example, non-standard agricultural products, resource crops, barley, food waste, etc.) can be suitably used as raw materials. From the viewpoint of availability, commercially available starch raw materials such as barley powder and corn starch, and purified products such as crystalline cellulose can also be suitably used. The content of cellulose and / or starch in the composition of the present invention can be appropriately set according to the type of cellulose raw material, the type of starch raw material, the purpose of use of the composition, and the like.
本発明の組成物に含まれる微生物の含有量は、その使用目的等に応じて適宜設定することができる。 The content of the microorganism contained in the composition of the present invention can be appropriately set according to the purpose of use.
本発明の組成物は、本発明の細菌またはその変異体、ならびにセルロースおよび/またはデンプンを有効成分として含むものであれば、さらに、所望の効果を損なわないその他の多糖、オリゴ糖、糖タンパク質、ペプチド、タンパク質、核酸、脂質、無機化合物、有機化合物、およびミネラルなどの成分を含有してもよい。また、該組成物は、所望の効果を損なわないものであれば、希釈剤、賦形剤、安定化剤、保存剤などの生理学的に許容される担体を更に含んでいてもよい。 As long as the composition of the present invention contains the bacterium of the present invention or a mutant thereof, and cellulose and / or starch as active ingredients, other polysaccharides, oligosaccharides, glycoproteins that do not impair the desired effects, Components such as peptides, proteins, nucleic acids, lipids, inorganic compounds, organic compounds, and minerals may be contained. In addition, the composition may further contain a physiologically acceptable carrier such as a diluent, an excipient, a stabilizer, and a preservative as long as the desired effect is not impaired.
本発明の組成物は、後述する、本発明のセルロースおよび/またはデンプン分解物の製造方法、ならびに本発明のエタノール製造方法に好適に用いることができる。 The composition of this invention can be used suitably for the manufacturing method of the cellulose and / or starch degradation product of this invention mentioned later, and the ethanol manufacturing method of this invention.
本発明の組成物は、さらに酵母を含有し得る。本明細書中、「酵母」は、アルコール発酵を行うことのできる酵母を意味し、好ましい例としては、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces pastrianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces uvarum、およびSaccharomyces bayanusが挙げられる。当該酵母を含む本発明の組成物は、後述する、本発明のエタノールの製造方法に好適に用いることができる。 The composition of the present invention may further contain yeast. In the present specification, “yeast” means a yeast capable of performing alcoholic fermentation, and preferable examples include Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Saccharomyces pastricus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces cerevisiae, The composition of this invention containing the said yeast can be used suitably for the manufacturing method of the ethanol of this invention mentioned later.
本発明の組成物を、細菌が生育可能な適切な条件下でインキュベートすることによって、セルロースおよび/またはデンプンの分解が進み、結果としてグルコース、セロビオース、マルトース、および3糖〜6糖のオリゴ糖等を得ることができ、さらに酵母によるアルコール発酵に供することで、エタノールを製造することができる。本発明の細菌またはその変異体は、広範な微生物に対して抗菌活性を示すため、コンタミネーションを抑制しつつセルロースおよび/またはデンプンの分解を行うことが可能で、かつ、酵母に対しては抗菌活性を示さないので、該分解工程後の糖溶液をそのままアルコール発酵に使用可能である。従って、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、酵母、ならびにセルロースおよび/またはデンプンを含む、エタノール製造用キットも提供し、該キットを用いれば、効率的にエタノールを製造することができる。 By incubating the composition of the present invention under appropriate conditions under which bacteria can grow, cellulose and / or starch can be decomposed, resulting in glucose, cellobiose, maltose, trisaccharide to hexasaccharide oligosaccharide, etc. Further, ethanol can be produced by subjecting it to alcohol fermentation with yeast. Since the bacterium of the present invention or a mutant thereof exhibits antibacterial activity against a wide range of microorganisms, it is possible to decompose cellulose and / or starch while suppressing contamination, and antibacterial against yeast. Since it does not show activity, the sugar solution after the decomposition step can be used as it is for alcohol fermentation. Therefore, the present invention also provides a kit for producing ethanol comprising the bacterium of the present invention or a mutant thereof, yeast, and cellulose and / or starch, and ethanol can be produced efficiently by using the kit. .
一態様において、本発明は、本発明の細菌またはその変異体を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養することを含む、セルロースおよび/またはデンプンの分解物の製造方法を提供する。この培養を行うことで、本発明の細菌またはその変異体によってセルロースおよび/またはデンプンが糖化され、培地中にグルコース、セロビオース、マルトース、および3糖〜6糖のオリゴ糖などの分解物が生じる。 In one aspect, the present invention provides a method for producing a degradation product of cellulose and / or starch, comprising culturing the bacterium of the present invention or a variant thereof in a medium containing cellulose and / or starch. By performing this culture, cellulose and / or starch is saccharified by the bacterium of the present invention or a mutant thereof, and degradation products such as glucose, cellobiose, maltose, and oligosaccharides of 3 to 6 sugars are generated in the medium.
当該製造方法における、本発明の細菌またはその変異体の定義、好ましいセルロースおよび/またはデンプン原料については上記に準じる。 In the production method, the definition of the bacterium of the present invention or a variant thereof, and preferable cellulose and / or starch raw materials are the same as described above.
当該製造方法における培養の方法は、本発明の細菌またはその変異体によるセルロースおよび/またはデンプンの糖化が可能であれば特に制限されない。使用し得る培地としては、例えば、M9培地(最少培地)、BHI培地、2YT培地、YPD培地、AM3培地、LB培地等が挙げられる。培養温度は、好ましくは10〜40℃、より好ましくは28〜37℃であり、最も好ましくは37℃であり、培地は、好ましくは、pH3〜10に調節される。培養時間や培養スケールなどは、当該培養によって得られる分解物の使用目的等に応じて適宜設定することができる。 The culture method in the production method is not particularly limited as long as saccharification of cellulose and / or starch by the bacterium of the present invention or a mutant thereof is possible. Examples of the medium that can be used include M9 medium (minimum medium), BHI medium, 2YT medium, YPD medium, AM3 medium, and LB medium. The culture temperature is preferably 10 to 40 ° C, more preferably 28 to 37 ° C, most preferably 37 ° C, and the medium is preferably adjusted to pH 3 to 10. The culture time, culture scale, and the like can be appropriately set according to the purpose of use of the degradation product obtained by the culture.
「セルロースおよび/またはデンプンの分解物」は、セルロースの分解物、デンプンの分解物、またはこれら分解物の混合物を意味する。当該製造方法によって得られる分解物の糖鎖の大きさは特に限定されないが、例えば、単糖であるグルコース、二糖であるセロビオースおよびマルトース、3〜6糖のオリゴ糖等が挙げられる。該分解物は、好ましくはグルコースである。 “Cellulose and / or starch degradation product” means a degradation product of cellulose, a degradation product of starch, or a mixture of these degradation products. The size of the sugar chain of the degradation product obtained by the production method is not particularly limited, and examples thereof include glucose that is a monosaccharide, cellobiose and maltose that are disaccharides, oligosaccharides of 3 to 6 sugars, and the like. The degradation product is preferably glucose.
さらに、本発明は、
(a)本発明の細菌またはその変異体を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養することにより、セルロースおよび/またはデンプンをグルコースに変換する工程、
(b)(a)で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法を提供する。
Furthermore, the present invention provides
(A) converting cellulose and / or starch into glucose by culturing the bacterium of the present invention or a variant thereof in a medium containing cellulose and / or starch;
(B) converting glucose into ethanol by culturing yeast in a medium containing glucose obtained in (a),
A method for producing ethanol comprising
上記(a)の工程における、本発明の細菌またはその変異体の定義、好ましいセルロース原料およびデンプン原料、好ましい培地および培養方法は上記に準じる。培養時間については、少なくとも、セルロース原料およびデンプン原料をグルコースにまで分解し、必要量のグルコースを得るのに要する時間であることが好ましい。当該培養時間は、使用するセルロース原料およびデンプン原料の種類や量、培養スケール等に応じて適宜設定可能である。 In the step (a), the definition of the bacterium of the present invention or a mutant thereof, preferred cellulose raw material and starch raw material, preferred medium and culture method are the same as described above. The culture time is preferably the time required to decompose at least the cellulose raw material and starch raw material into glucose and obtain the required amount of glucose. The culture time can be appropriately set according to the type and amount of the cellulose raw material and starch raw material used, the culture scale, and the like.
上記(b)の工程において用いられる酵母は、アルコール発酵を行うことのできる酵母であれば特に制限されないが、好ましくは、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Saccharomyces pastrianus、Saccharomyces carlsbergensis、Saccharomyces uvarum、およびSaccharomyces bayanusである。 The yeast used in the step (b) is not particularly limited as long as it is a yeast capable of performing alcoholic fermentation. is there.
該酵母の培養は、アルコール発酵に適した条件で行われるのであれば、特に制限されないが、例えば、酵母を増殖させる必要がある場合の培養温度は10〜40℃、好ましくは28℃であり、発酵を行う際の温度は10〜30℃、好ましくは15〜25℃、より好ましくは15℃であり得る。また、培地のpHは、好ましくはpH3〜10、より好ましくはpH4.9に調節し得る。使用し得る培地の種類は上記に準じる。 The culture of the yeast is not particularly limited as long as it is performed under conditions suitable for alcohol fermentation. For example, the culture temperature when yeast needs to be grown is 10 to 40 ° C, preferably 28 ° C. The temperature at the time of fermentation may be 10-30 degreeC, Preferably it is 15-25 degreeC, More preferably, it may be 15 degreeC. In addition, the pH of the medium can be adjusted to preferably pH 3 to 10, more preferably pH 4.9. The types of media that can be used are as described above.
上記(a)および(b)の工程は、同時に行うことも可能である。即ち、本発明は、本発明の細菌またはその変異体、および酵母を、セルロースおよび/またはデンプンを含有する培地中で培養する工程を含む、エタノールの製造方法も提供する。 The steps (a) and (b) can be performed simultaneously. That is, this invention also provides the manufacturing method of ethanol including the process of culture | cultivating the bacterium of this invention, its variant, and yeast in the culture medium containing a cellulose and / or starch.
本発明のエタノールの製造方法においては、デンプン原料のα化をしなくてもデンプン原料の糖化を効率的に行うことができるため、原料の前処理を簡略化することができる。また、本発明の細菌は広範な微生物に対し抗菌活性を示すことから、原料の滅菌処理を省いたとしてもコンタミネーションを抑制しつつ原料の糖化を行うことが可能で、滅菌処理に要する大きなエネルギーを節約することができる。従って、本発明のエタノールの製造方法は、原料の前処理や滅菌処理の工程を省略し、低コストかつ低環境負荷型のエタノール製造方法を提供することができる。一方で、本発明の細菌またはその変異体は、酵母に対しては抗菌活性を示さないので、糖化処理後の培養液をそのまま酵母によるアルコール発酵に使用するか、あるいは本発明の細菌またはその変異体と酵母とを共培養し、原料の糖化処理とアルコール発酵を同時進行で行うことも可能である。 In the method for producing ethanol of the present invention, since the starch raw material can be efficiently saccharified without the starch raw material being pregelatinized, the pretreatment of the raw material can be simplified. In addition, since the bacterium of the present invention exhibits antibacterial activity against a wide range of microorganisms, it is possible to saccharify the raw material while suppressing contamination even if the sterilization treatment of the raw material is omitted. Can be saved. Therefore, the ethanol production method of the present invention can provide a low-cost and low environmental load ethanol production method by omitting the raw material pretreatment and sterilization treatment steps. On the other hand, since the bacterium of the present invention or a mutant thereof does not exhibit antibacterial activity against yeast, the culture solution after saccharification treatment is used as it is for alcoholic fermentation by yeast, or the bacterium of the present invention or a mutant thereof. It is also possible to co-culture the body and yeast and simultaneously carry out saccharification treatment of the raw material and alcohol fermentation.
上記方法により製造されたエタノールは、当業者に公知の方法により精製し、燃料等の所望の用途に使用することができる。 Ethanol produced by the above method can be purified by a method known to those skilled in the art and used for a desired application such as fuel.
他の態様において、本発明は、アセトニトリルを用いた抽出または低級アルコールを用いた抽出によって、本発明の細菌またはその変異体の抽出物を得る工程を含む、抗菌性抽出物の製造方法を提供する。 In another aspect, the present invention provides a method for producing an antibacterial extract comprising the step of obtaining an extract of a bacterium of the present invention or a variant thereof by extraction with acetonitrile or extraction with a lower alcohol. .
当該方法は、例えば、本発明の細菌またはその変異体を含む培養液を遠心分離に供し、該細菌をペレットにし、アセトニトリルまたは低級アルコールに該細菌を再懸濁した液を抗菌性抽出物とすることができ、あるいは、アセトニトリルまたは低級アルコールに懸濁した後にさらに遠心分離に供し、その上清を抗菌性抽出物とすることもできる。アセトニトリルを用いた抽出および低級アルコールを用いた抽出は単独で行ってもよいし、あるいは連続して行ってもよい。連続して行う場合は、アセトニトリル抽出および低級アルコール抽出のいずれを先に行ってもよい。 In this method, for example, a culture solution containing the bacterium of the present invention or a mutant thereof is subjected to centrifugation, the bacterium is pelleted, and a solution obtained by resuspending the bacterium in acetonitrile or lower alcohol is used as an antibacterial extract. Alternatively, after suspending in acetonitrile or lower alcohol, it can be further centrifuged, and the supernatant can be used as an antibacterial extract. The extraction using acetonitrile and the extraction using lower alcohol may be performed alone or continuously. When performing continuously, either acetonitrile extraction or lower alcohol extraction may be performed first.
当該方法により得られた抗菌性抽出物は、広範囲の細菌および酵母以外の真菌に対し抗菌活性を示す。該細菌および酵母以外の真菌については上記に準じる。よって、該抗菌性抽出物は、農薬や医薬品等に好適に使用し得る。 The antibacterial extract obtained by the method exhibits antibacterial activity against a wide range of bacteria and fungi other than yeast. The fungi other than the bacteria and yeast are as described above. Therefore, the antibacterial extract can be suitably used for agricultural chemicals, pharmaceuticals and the like.
当該抗菌性抽出物が農薬として使用される場合、対象となる農作物としては、例えば、イネ、大麦、トマト、スイカ、キュウリ、イチゴ、サトイモ、大豆、小麦、トウモロコシ、ジャガイモ、インゲンマメ、エンドウ、ラッカセイ、テンサイ、サトウキビ、ナス、ピーマン、メロン、カボチャ、ダイコン、ハクサイ、キャベツ、コマツナ、タマネギ、ネギ、ニラ、ニンニク、アスパラガス、ゴボウ、レタス、シュンギク、ニンジン、ホウレンソウ、オクラ、リンゴ、ナシ、ウメ、ブドウ、カキ、イチジク、キウイなどが挙げられる。 When the antibacterial extract is used as an agrochemical, the target crops are, for example, rice, barley, tomato, watermelon, cucumber, strawberry, taro, soybean, wheat, corn, potato, kidney bean, pea, peanut, Sugar beet, sugar cane, eggplant, pepper, melon, pumpkin, radish, cabbage, cabbage, komatsuna, onion, leek, leek, garlic, asparagus, burdock, lettuce, garlic, carrot, spinach, okra, apple, pear, ume, grape , Oysters, figs, kiwi and the like.
当該抗菌性抽出物が医薬品として使用される場合、ヒトおよび他の哺乳動物(例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど)に対して、経口的または非経口的に安全に投与することができる。該医薬品は、細菌感染症および真菌感染症に対して治療効果を有し得る。当該感染症の具体例として、ブドウ球菌属の菌、連鎖球菌属の菌、腸球菌、エスケリキア属の菌、白癬菌、カンジダ症起因菌、クリプトコッカス症起因菌またはフザリウム属の菌に感染したことにより発症する感染症などが挙げられる。 When the antibacterial extract is used as a medicine, it is orally or parenterally administered to humans and other mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cows, cats, dogs, monkeys, etc.) It can be safely administered. The medicament may have a therapeutic effect against bacterial and fungal infections. Specific examples of such infections include infection with staphylococcal bacteria, streptococcal bacteria, enterococci, escherichia bacteria, ringworms, candidiasis bacteria, cryptococcosis bacteria, or fusarium bacteria. Examples include infectious diseases that develop.
(防除方法)
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物を含有する農薬(本明細書中、本発明の農薬ともいう)により植物を処理する工程を含む、細菌および酵母以外の真菌による病害の防除方法を提供する。使用する本発明の農薬の濃度、対象となる農作物、散布方法、使用頻度などは、本発明の農薬について記載したものに準ずる。
(Control method)
As one embodiment of the present invention, the present invention provides an antibacterial extract of the present invention, an antibacterial composition, a bacterium of the present invention or a mutant thereof, or an agrochemical containing the culture thereof (herein, the present invention). A method for controlling diseases caused by fungi other than bacteria and yeast, which comprises a step of treating a plant with a pesticide. The concentration of the agricultural chemical of the present invention to be used, the target crop, the application method, the frequency of use, and the like are the same as those described for the agricultural chemical of the present invention.
(種子消毒方法)
本発明の一実施態様として、本発明は、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物により、種子を処理する工程を含む、種子消毒方法を提供する。種子消毒の方法については、種子消毒剤について記載したものに準ずる。
(Seed disinfection method)
In one embodiment of the present invention, the present invention comprises a seed disinfection step comprising treating a seed with the antibacterial extract, antibacterial composition of the present invention, the bacterium of the present invention or a mutant thereof, or a culture thereof. Provide a method. Seed disinfection methods are the same as those described for seed disinfectants.
(植物生長促進方法)
本発明の一実施形態として、本発明の細菌もしくはその変異体またはそれらの培養物により植物を処理する工程を含む、植物生長促進方法を提供する。
方法については、植物生長促進剤について記載したものに準ずる。
(Plant growth promotion method)
As one embodiment of the present invention, there is provided a method for promoting plant growth, comprising the step of treating a plant with the bacterium of the present invention or a mutant thereof or a culture thereof.
About a method, it applies to what was described about the plant growth promoter.
(土壌改良方法)
本発明の一実施形態として、本発明の抗菌性抽出物、抗菌組成物、本発明の細菌もしくはその変異体、またはそれらの培養物により土壌を処理する工程を含む、土壌改良方法を提供する。
土壌改良方法については、土壌改良剤について記載したものに準ずる。
(Soil improvement method)
As one embodiment of the present invention, there is provided a soil improvement method comprising a step of treating soil with the antibacterial extract, the antibacterial composition of the present invention, the bacterium of the present invention or a mutant thereof, or a culture thereof.
About a soil improvement method, it applies to what was described about the soil improvement agent.
以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples, but it goes without saying that the present invention is not limited thereto.
(実施例1)セルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規微生物のスクリーニング
1.セルロース分解能を有する微生物の選別(図1)
まず、稲藁の粉末を唯一の炭素源として含む最少培地を作製した。稲藁粉末は、稲藁をハサミで約3〜5cmの長さに切り、70℃の乾燥機で一週間程乾燥させた後、ミキサーで粉末状になるまで粉砕することで得た。7%稲藁培地は、100mLのM9培地(Na2HPO4;6g、KH2PO4;3g、NaCl;0.5g、NH4Cl;1gを蒸留水に溶解し1Lとすることで作製した)、および7gの稲藁粉末をボトルに入れて、オートクレーブ(121℃、20分)し、冷却後に滅菌済みの100mM CaCl2を1mLおよび1M MgSO4を1mL添加することで作製した。
稲藁培地に、福井県内外の40箇所よりサンプリングされた土壌を加え、セルロース分解能を有する微生物を同定すべく集積培養を繰り返した。該土壌に含まれる酵母は、セルロースの分解により生成したグルコースを利用して発酵し、二酸化炭素を発生するため、二酸化炭素の発泡を指標に目的とする微生物を濃縮した(図1A)。
さらに、コンゴレッドとカルボキシメチルセルロース(CMC)を添加した寒天培地上に微生物を播種し、溶解斑の大きさを指標に微生物の選抜を行った(図1B)。
こうして、高いセルロース分解能を有する微生物を選別した。
(Example 1) Screening of novel microorganisms having cellulose and starch degrading ability Selection of microorganisms capable of degrading cellulose (Figure 1)
First, a minimal medium containing rice straw powder as the only carbon source was prepared. The rice straw powder was obtained by cutting the rice straw to a length of about 3 to 5 cm with scissors, drying it with a dryer at 70 ° C. for about one week, and then pulverizing it into a powder form with a mixer. The 7% rice straw medium was prepared by dissolving 100 mL of M9 medium (Na 2 HPO 4 ; 6 g, KH 2 PO 4 ; 3 g, NaCl; 0.5 g, NH 4 Cl; 1 g in distilled water to 1 L). ) And 7 g of rice straw powder were put into a bottle, autoclaved (121 ° C., 20 minutes), and after cooling, 1 mL of sterilized 100 mM CaCl 2 and 1 mL of 1M MgSO 4 were added.
To the rice straw medium, soil sampled from 40 locations inside and outside Fukui Prefecture was added, and enrichment culture was repeated to identify microorganisms having cellulose-degrading ability. The yeast contained in the soil fermented using glucose produced by the decomposition of cellulose to generate carbon dioxide, and therefore the target microorganisms were concentrated using carbon dioxide foaming as an index (FIG. 1A).
Furthermore, microorganisms were seeded on an agar medium supplemented with Congo red and carboxymethylcellulose (CMC), and microorganisms were selected using the size of dissolution spots as an index (FIG. 1B).
Thus, microorganisms having high cellulose resolution were selected.
2.デンプン分解能を有する微生物の選別(図2)
蒸留水1Lと六条大麦粉末(福井大麦倶楽部、石挽、βg)50gを混合した溶液にサンプリング土壌約300gを添加して混ぜ、室温(約23℃)で4日間静置培養した。六条大麦粉末10gと蒸留水200mLを混合し、乳酸を使用してpHを2.5〜3.0に調整した培地を新たに作製し、前記培養液を5mL添加し、50℃で3日間静置培養した。培地のpHを低くすることによって雑菌の繁殖を抑え、培地の腐敗を防ぐことができる。その後、100μLの培養液を、6.25%(w/v)六条大麦液体培地(0.5gの六条大麦と蒸留水8mLを混合し、121℃で20分間オートクレーブすることで作製した)(約pH5.6)の入った試験管に添加した(図2、1次スクリーニング)。
デンプン分解酵素(アミラーゼ)を産生する微生物は、デンプンの分解産物である二糖(マルトース)の資化性(代謝能力)が高いと考え、マルトースを唯一の炭素源とする最少寒天培地上での増殖速度を指標にし、大きなコロニーを形成する微生物を選抜した(図2、2次スクリーニング)。マルトース含有寒天培地は、6gのNa2HPO4、3gのKH2PO4、0.5gのNaCl、1gのNH4Cl、15gのAgarを蒸留水500mLに溶解後、121℃で20分間オートクレーブし、冷却後に別個に滅菌した、20gマルトース水和物を溶解した500mLの水溶液、100mM CaCl2を1mL、および1M MgSO4を1mL混合し、シャーレに流入することで作製した。
さらに、デンプン質を豊富に含んでいる六条大麦粉を添加した最少寒天培地上で、溶解斑の大きさを指標にし、デンプン糖化能の高い微生物を選抜した(図2、3次スクリーニング)。六条大麦寒天培地への植菌の際は、なるべく形状の異なるコロニーを選択して植菌した。六条大麦寒天培地は、6gのNa2HPO4、3gのKH2PO4、0.5gのNaCl、1gのNH4Cl、20gの六条大麦粉末、15gのAgarを蒸留水1Lに溶解後、121℃で20分間オートクレーブし、冷却後に別個に滅菌した、100mM CaCl2を1mL、および1M MgSO4を1mL混合し、シャーレに流入することで作製した。
3次スクリーニングで溶解斑を形成したシングルコロニーをそれぞれ2YT液体培地(Polypepton 16g、Yeast Extract 10g、およびNaCl 5gを蒸留水に溶解し、NaOHでpH7.5に調整後、蒸留水を加え1Lとし、121℃で20分間オートクレーブすることで作製した)5mLに植菌し、一晩前培養を行った。1%(w/v)コーンスターチを含有するM9液体培地10mLに、前培養液20μLを混合し、28℃、150rpmで4日間振とう培養した。その後、培養液を15000rpmで5分間遠心し、培養上清20μLをグルコース迅速比色定量法(Anal.Sci.,29(11),1021−5)に供し、デンプンをグルコースに効率的に分解することができる微生物を同定した(図2、4次スクリーニング)。
2. Selection of microorganisms with starch degradability (Fig. 2)
About 300 g of sampling soil was added to a solution obtained by mixing 1 L of distilled water and 50 g of Rokujo barley powder (Fukui barley club, stone grinding, βg), and the mixture was incubated at room temperature (about 23 ° C.) for 4 days. Mix 10 g of Rokujo barley powder and 200 mL of distilled water, make a new medium adjusted to pH 2.5-3.0 using lactic acid, add 5 mL of the culture solution, and leave it at 50 ° C. for 3 days. Incubated. By lowering the pH of the medium, it is possible to suppress the growth of various bacteria and prevent the medium from being spoiled. Thereafter, 100 μL of the culture broth was prepared by mixing 6.25% (w / v) Rojo barley liquid medium (0.5 g of Rojo barley and 8 mL of distilled water mixed and autoclaved at 121 ° C. for 20 minutes) (about It was added to a test tube containing pH 5.6) (FIG. 2, primary screening).
Microorganisms that produce starch-degrading enzymes (amylases) are considered to be highly assimilating (metabolic ability) to the disaccharide (maltose), which is a degradation product of starch, and are used on a minimal agar medium with maltose as the sole carbon source. Using the growth rate as an index, microorganisms that form large colonies were selected (FIG. 2, secondary screening). Maltose-containing agar medium was prepared by dissolving 6 g of Na 2 HPO 4 , 3 g of KH 2 PO 4 , 0.5 g of NaCl, 1 g of NH 4 Cl and 15 g of Agar in 500 mL of distilled water and autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. This was prepared by mixing 500 mL of an aqueous solution in which 20 g maltose hydrate was dissolved, 1 mL of 100 mM CaCl 2 , and 1 mL of 1M MgSO 4, which were sterilized separately after cooling, and flowing into a petri dish.
Furthermore, microorganisms with high starch saccharification ability were selected on the minimal agar medium supplemented with 6-joo barley flour containing abundant starch, using the size of dissolved spots as an index (FIG. 2, tertiary screening). When inoculating the Rojo Barley Agar medium, colonies with different shapes were selected and inoculated as much as possible. Six-joule barley agar was prepared by dissolving 6 g Na 2 HPO 4 , 3 g KH 2 PO 4 , 0.5 g NaCl, 1 g NH 4 Cl, 20 g six-joo barley powder, 15 g Agar in 1 L distilled water, 121 It was prepared by mixing 1 mL of 100 mM CaCl 2 and 1 mL of 1M MgSO 4 , autoclaved at 20 ° C. for 20 minutes, sterilized separately after cooling, and flowing into a petri dish.
Single colonies that formed dissolution spots in the third screening were each dissolved in 2YT liquid medium (Polypepton 16 g, Yeast Extract 10 g, and NaCl 5 g in distilled water, adjusted to pH 7.5 with NaOH, and made 1 L with distilled water. Inoculated into 5 mL) (prepared by autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes) and pre-cultured overnight. 20 μL of the preculture was mixed with 10 mL of M9 liquid medium containing 1% (w / v) corn starch, and cultured with shaking at 28 ° C. and 150 rpm for 4 days. Thereafter, the culture solution is centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and 20 μL of the culture supernatant is subjected to a glucose rapid colorimetric method (Anal. Sci., 29 (11), 1021-5) to efficiently decompose starch into glucose. Microorganisms that can be identified were identified (Figure 2, 4th screening).
(実施例2)セルロース分解能およびデンプン分解能を有する新規微生物の同定試験
興味深いことに、上記のようにして選別された、高いセルロース分解能を有する微生物、および高いデンプン分解能を有する微生物は同じエリアからサンプリングされたものであった。そこで、両微生物の属(genus)を決定するために、16S rRNA遺伝子(約1.5kb)の塩基配列を利用して分子系統解析を行ったところ、これら微生物の16S rRNA遺伝子の塩基配列は100%一致した。さらに、両微生物の結晶性セルロース分解能、デンプン分解能、生理学的性質、生化学的性質、および形態学的特徴を比較した結果、これら微生物が同一の微生物であることが判明した。以下に、該微生物の特徴を列記する。
・細胞形態は桿状で周鞭毛を持ち、活発な運動性を有する。
・コロニーは白色に近いクリーム色を呈する(培地により多少異なる)。
・アミラーゼを産生する。
・グルカナーゼを産生する。
・細菌および真菌類に対する抗生物質を産生する。
・ゼラチンを加水分解しない。
・硝酸塩を還元しない。
また、16S rRNA遺伝子の塩基配列を利用した分子系統解析の結果を図3に示す。分子系統解析の結果、当該微生物はPaenibacillus属の微生物であり、Paenibacillus属の基準株(type strain)であるAJ320493やAJ271157、AB680894、AF391123と遺伝子クラスターを形成していることが明らかになった(図3)。当該微生物は、ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない点で前記近縁種とは異なることから、当該微生物をPaenibacillus属の新種細菌と同定し、FPU−37株と命名した。
(Example 2) Identification test of novel microorganisms having cellulose resolution and starch resolution Interestingly, microorganisms having high cellulose resolution and microorganisms having high starch resolution selected as described above were sampled from the same area. It was. Thus, in order to determine the genus of both microorganisms, a molecular phylogenetic analysis was performed using the base sequence of the 16S rRNA gene (about 1.5 kb). As a result, the base sequence of the 16S rRNA gene of these microorganisms was 100. % Matched. Furthermore, as a result of comparing the crystalline cellulose resolution, starch resolution, physiological properties, biochemical properties, and morphological characteristics of both microorganisms, they were found to be the same microorganism. The characteristics of the microorganism are listed below.
-Cell shape is rod-shaped, has peripheral flagella, and has active motility.
-The colony has a cream color close to white (some differences depending on the culture medium).
Produces amylase.
-Produces glucanase.
• Produce antibiotics against bacteria and fungi.
・ Do not hydrolyze gelatin.
・ Nitrate is not reduced.
Moreover, the result of the molecular phylogenetic analysis using the base sequence of 16S rRNA gene is shown in FIG. As a result of molecular phylogenetic analysis, it was clarified that the microorganism was a microorganism belonging to the genus Paenibacillus and formed a gene cluster with AJ320493, AJ271157, AB680894, and AF391123 which are Painebacillus genus strains (type strain) (FIG. 3). Since the microorganism is different from the related species in that it does not have gelatin degradability and nitrate reducing ability, the microorganism was identified as a new species of Paenibacillus genus and named FPU-37 strain.
(実施例3)FPU−37株の糖質分解酵素の同定
次世代シーケンサー(Illumina Hiseq)によるゲノムドラフト解析を行った結果、FPU−37株のゲノムサイズは約5.9Mbpであり、細菌としては比較的大きなゲノムサイズを有することが明らかとなった。すでにPaenibacillus属で報告されている既知のセルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼの遺伝子配列に基づいて、FPU−37株のゲノム上に存在しているこれら遺伝子配列の相同性検索を行ったところ、それぞれ1種類の遺伝子がヒットした。
FPU−37株のセルラーゼ遺伝子(配列番号1)は、Paenibacillus polymyxaのβ−1.4−グルカナーゼと高い相同性を示し、糖質加水分解酵素(Glycoside Hydrolases;GH)のファミリー5に分類される触媒ドメイン(GH5)、N末端側に分泌シグナル配列、およびC末端側に糖質結合モジュールであるcarbohydrate−binding module(CBM)のファミリー3(CBM3)ドメインを有することが明らかとなった。
FPU−37株のアミラーゼ遺伝子(配列番号3)は、パエニバチルス・ポリミクサのβ/α−アミラーゼと高い相同性を示し、N末端側に分泌シグナル配列を有していた。さらに、該アミラーゼ遺伝子は、N末端側にβ−アミラーゼの触媒ドメイン(GH14)および2つのCBM25を有し、C末端側にはα−アミラーゼの触媒ドメイン(GH13)およびCBMの一種であるAamy−Cモジュールを有することが明らかとなった。よって、FPU−37株のアミラーゼ遺伝子は、α−アミラーゼ活性およびβ−アミラーゼ活性の両方を有すると考えられる。
また、FPU−37株のα−グルコシダーゼ遺伝子(配列番号5)は、糖質分解酵素ファミリー31(GH31)に分類される酵素であることが明らかとなった。
(Example 3) Identification of saccharide-degrading enzyme of FPU-37 strain As a result of genome draft analysis by a next-generation sequencer (Illumina Hiseq), the genome size of FPU-37 strain is about 5.9 Mbp, It was found to have a relatively large genome size. Based on the gene sequences of known cellulase, amylase and α-glucosidase already reported in the genus Paenibacillus, homology search of these gene sequences existing on the genome of FPU-37 strain was performed. A variety of genes were hit.
The cellulase gene (SEQ ID NO: 1) of FPU-37 strain shows high homology with Paenibacillus polymyxa β-1.4-glucanase, and is classified as a family 5 of Glycoside Hydrolases (GH). It was revealed that it has a domain (GH5), a secretory signal sequence on the N-terminal side, and a carbohydrate-binding module (CBM) family 3 (CBM3) domain on the C-terminal side, which is a carbohydrate binding module.
The amylase gene (SEQ ID NO: 3) of the FPU-37 strain showed high homology with Paenibacillus polymixa β / α-amylase and had a secretory signal sequence on the N-terminal side. Furthermore, the amylase gene has a β-amylase catalytic domain (GH14) and two CBM25s on the N-terminal side, and an α-amylase catalytic domain (GH13) and a kind of CBM Aamy- It became clear to have a C module. Therefore, the amylase gene of FPU-37 strain is considered to have both α-amylase activity and β-amylase activity.
In addition, it was revealed that the α-glucosidase gene (SEQ ID NO: 5) of the FPU-37 strain is an enzyme classified into the carbohydrate degrading enzyme family 31 (GH31).
(実施例4)FPU−37株のセルラーゼ、アミラーゼおよびα−グルコシダーゼの局在と発現誘導
1.FPU−37株のセルラーゼの局在と発現誘導
(1)BHI培地(3.7gのBHIを蒸留水で溶解し100mLとした後、オートクレーブ滅菌(121℃、20分)することで作製した)のみ、および(2)1%(w/v)スターチ、(3)1%(w/v)結晶性セルロース、または(4)1%(w/v)Fusarium粉末を添加したBHI培地100mLをそれぞれ作製した。
BHI液体培地20mL中、37℃で1日振とう培養したFPU−37の前培養から、上記(1)〜(4)の培地にそれぞれ5mLずつ培養液を添加し、37℃で3日間旋回培養した。その後、これら培養液から1.5mLずつをチューブに移し、遠心分離(15000回転、5分間)を行い、上清を新しいチューブに移した。該上清を以下の酵素反応に使用した。
氷上にて、1.5mLチューブに基質溶液(p−Nitrophenyl−β−D−Glucoside(PNP−Glu)またはp−Nitrophenyl−β−D−Cellobioside(PNP−(Glu)2))40μL、緩衝液(クエン酸緩衝液(pH5.6))30μL、および酵素液(上記で得られた上清)30μLを加え、反応液を作製した。ネガティブコントロールとして、反応液を反応させず直ちに反応停止液(0.2M水酸化ナトリウム溶液)200μL添加したものを作製した。反応液は37℃で3時間反応させ、反応後直ちに氷上に移し、反応停止液を200μL添加し反応を停止させた。
その後、96ウェルプレートに反応液を200μL/wellとなるように移し、吸光プレートリーダーで405nmでの吸光度を測定した。
結果を図4に示す。結晶性セルロースを添加して培養した培養上清でのみセルラーゼ活性が認められたことから、FPU−37株のセルラーゼはセルロースにより発現誘導されることが明らかとなった。また、セルラーゼ活性の局在を調べたところ、該活性は、培養上清のみに認められた(図4B)。これらの結果より、FPU−37株のセルラーゼは、セルロースにより発現誘導され、細胞外へ分泌されることが明らかとなった。
(Example 4) Localization and expression induction of cellulase, amylase and α-glucosidase of FPU-37 strain Localization and expression induction of cellulase of FPU-37 strain (1) BHI medium (prepared by dissolving 3.7 g of BHI in distilled water to 100 mL and then autoclaving (121 ° C., 20 minutes)) And (2) 1% (w / v) starch, (3) 1% (w / v) crystalline cellulose, or (4) 1% (w / v) Fusarium powder added to 100 mL of BHI medium. did.
From the pre-culture of FPU-37 cultured in 20 ml of BHI liquid medium at 37 ° C. for 1 day, add 5 ml of the culture solution to each of the above media (1) to (4) and swirl culture at 37 ° C. for 3 days. did. Thereafter, 1.5 mL of each culture was transferred to a tube, centrifuged (15000 rpm, 5 minutes), and the supernatant was transferred to a new tube. The supernatant was used for the following enzyme reaction.
On ice, a substrate solution (p-Nitrophenyl-β-D-Glucoside (PNP-Glu) or p-Nitrophenyl-β-D-Cellobioside (PNP- (Glu) 2 )) 40 μL, buffer ( 30 μL of citrate buffer (pH 5.6)) and 30 μL of enzyme solution (supernatant obtained above) were added to prepare a reaction solution. As a negative control, a reaction stop solution (0.2 M sodium hydroxide solution) 200 μL was immediately added without reacting the reaction solution. The reaction solution was allowed to react at 37 ° C. for 3 hours, immediately after the reaction, transferred to ice, and 200 μL of a reaction stop solution was added to stop the reaction.
Thereafter, the reaction solution was transferred to a 96-well plate at 200 μL / well, and the absorbance at 405 nm was measured with an absorbance plate reader.
The results are shown in FIG. Since cellulase activity was observed only in the culture supernatant cultured with the addition of crystalline cellulose, it became clear that the cellulase of the FPU-37 strain was induced by cellulose. Further, when the localization of the cellulase activity was examined, the activity was found only in the culture supernatant (FIG. 4B). From these results, it was revealed that the cellulase of the FPU-37 strain was induced to be expressed by cellulose and secreted outside the cell.
2.FPU−37株のアミラーゼの局在と発現誘導
2YT、2YT+3%(w/v)可溶スターチ液体培地それぞれ20mL中において、30℃、120rpmでFPU−37株を3日間振とう培養した。その後、それぞれの培養液から2mLずつ分注し、15000rpm、5分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。沈殿している菌体に対して、懸濁用緩衝液(MES緩衝液(48mL,1M,pH6.2)、EDTA2Na(20mM)、ウシ血清アルブミン(10mg/mL,0.2%(w/v)アジ化ナトリウムを含む)を蒸留水で500mLとすることで作製した)をそれぞれ2mLずつ加え、ボルテックスして沈殿を懸濁し、15000rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄した後、さらに15000rpmで1分間遠心分離し、上清を廃棄し、懸濁用緩衝液をそれぞれ2mLずつ加えボルテックスで沈殿を懸濁することで、菌体懸濁液を得た。
α−アミラーゼ測定キット(キッコーマンバイオケミファ株式会社)を使用して、2YT培地または2YT+3%(w/v)可溶スターチ培地から得られた、上記培養上清と菌体懸濁液のα−アミラーゼ活性を測定した(図5A)。α−アミラーゼ活性は、FPU−37株の培養上清(図5A、培養上清)において認められ、菌体懸濁液(図5A、菌体画分)では活性が低かった。さらに、可溶スターチを添加した培養上清(図5A、培養上清、デンプン+)において、添加しないもの(図5A、培養上清、デンプン−)と比べ、α−アミラーゼの活性が顕著に高いことから、デンプンの添加によりα−アミラーゼの発現が誘導されたことを確認した。
BETA−AMYLASE BETAMYL−3 ASSAY KIT(MEGAZYME)を使用して、2YT培地または2YT+3%(w/v)可溶スターチ培地から得られた、上記培養上清と菌体懸濁液のβ−アミラーゼ活性を測定した(図5B)。β−アミラーゼ活性は、培地に可溶スターチを添加したFPU−37株の培養上清(図5B、培養上清、デンプン+)において強く認められ、培地に可溶スターチを添加していないFPU−37株の培養上清(図5B、培養上清、デンプン−)において弱いながらも認められ、菌体懸濁液(図5B、菌体画分)では活性が低かった。さらに、可溶スターチを添加した培養上清(図5B、培養上清、デンプン+)において、添加しないもの(図5B、培養上清、デンプン−)と比べ、β−アミラーゼの活性が顕著に高いことから、デンプンの添加によりβ−アミラーゼの発現が誘導されたことを確認した。
2. FPU-37 Strain Amylase Localization and Expression Induction In 20 mL each of 2YT, 2YT + 3% (w / v) soluble starch liquid medium, the FPU-37 strain was cultured with shaking at 30 ° C. and 120 rpm for 3 days. Thereafter, 2 mL of each culture was dispensed, centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. Suspension buffer (MES buffer (48 mL, 1 M, pH 6.2), EDTA2Na (20 mM), bovine serum albumin (10 mg / mL, 0.2% (w / v)) 2) each of which was made up to 500 mL with distilled water), vortexed to suspend the precipitate, centrifuged at 15000 rpm for 5 minutes, discarded the supernatant, and then further 15000 rpm The suspension was centrifuged for 1 minute, the supernatant was discarded, 2 mL each of the suspension buffer was added, and the precipitate was suspended by vortex to obtain a cell suspension.
α-amylase of the above-mentioned culture supernatant and cell suspension obtained from 2YT medium or 2YT + 3% (w / v) soluble starch medium using an α-amylase measurement kit (Kikkoman Biochemifa Co., Ltd.) Activity was measured (FIG. 5A). The α-amylase activity was observed in the culture supernatant (FIG. 5A, culture supernatant) of the FPU-37 strain, and the activity was low in the bacterial cell suspension (FIG. 5A, bacterial cell fraction). Furthermore, in the culture supernatant to which soluble starch was added (FIG. 5A, culture supernatant, starch +), the activity of α-amylase was remarkably higher than that to which it was not added (FIG. 5A, culture supernatant, starch−). From this, it was confirmed that the addition of starch induced the expression of α-amylase.
Β-amylase activity of the above culture supernatant and cell suspension obtained from 2YT medium or 2YT + 3% (w / v) soluble starch medium using BETA-AMYLASE BETAMYL-3 ASSAY KIT (MEGAZYME) Was measured (FIG. 5B). β-amylase activity is strongly observed in the culture supernatant (FIG. 5B, culture supernatant, starch +) of the FPU-37 strain in which soluble starch is added to the medium, and FPU− in which soluble starch is not added to the medium. Although it was weak in 37 culture supernatants (FIG. 5B, culture supernatant, starch), the activity was low in the cell suspension (FIG. 5B, cell fraction). Furthermore, the activity of β-amylase is significantly higher in the culture supernatant to which soluble starch was added (FIG. 5B, culture supernatant, starch +) compared to the culture supernatant not added (FIG. 5B, culture supernatant, starch-). From this, it was confirmed that the addition of starch induced the expression of β-amylase.
3.FPU−37株のα−グルコシダーゼの局在
2YT+3%(w/v)可溶スターチ液体培地10mL中において、30℃でFPU−37株を3日間振とう培養した。その後、培養液を15mL容量のチューブに移し、8000rpm、10分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移した。沈殿している菌体に、PBS緩衝液(NaCl 8g/L, KCl 0.2g/L, Na2HPO4×12H2O 2.9g/L, KH2PO40.24g/L)を10mL加え、ボルテックスして菌体を洗浄した。この菌体懸濁液を8000rpmで10分間遠心分離し、上清を廃棄した後、さらに8000rpmで1分間遠心分離し、上清を完全に廃棄した後、PBS緩衝液を10mL加え、ボルテックスで沈殿を懸濁することで、菌体懸濁液を得た。菌体液の1mLを別のチューブに移し、残りの菌体液に1mg/mLとなるように溶菌酵素リゾチームを添加し、30℃で30分間反応後、超音波破砕を行い、15000rpmで10分間遠心分離し、その上清を細胞溶解液として用いた。
培養前の培地(コントロール)、培養上清(細胞外画分=分泌酵素)、菌体懸濁液(菌体表層酵素)および細胞溶解液(菌体内酵素)のα−グルコシダーゼ活性は、サンプル0.5mLに対して等量の3%マルトース水溶液を加えて37℃で1時間反応後、グルコース迅速比色定量法(Anal.Sci.,29(11),1021−5)によりグルコースの生成を指標に測定した。その結果、α−グルコシダーゼ活性は、細胞溶解液においてのみ検出された。
以上の結果より、FPU−37株のα−アミラーゼおよびβ−アミラーゼは、ともにデンプンの添加により発現誘導される菌体外酵素であり、α−グルコシダーゼは、細胞内に局在していることを確認した。
3. Localization of α-glucosidase of FPU-37 strain In 10 mL of 2YT + 3% (w / v) soluble starch liquid medium, the FPU-37 strain was cultured with shaking at 30 ° C for 3 days. Thereafter, the culture solution was transferred to a 15 mL tube, centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a new tube. 10 mL of PBS buffer solution (NaCl 8 g / L, KCl 0.2 g / L, Na 2 HPO 4 × 12H 2 O 2.9 g / L, KH 2 PO 4 0.24 g / L) is added to the precipitated cells. In addition, the cells were washed by vortexing. This bacterial cell suspension is centrifuged at 8000 rpm for 10 minutes, the supernatant is discarded, and further centrifuged at 8000 rpm for 1 minute. After the supernatant is completely discarded, 10 mL of PBS buffer is added and vortexed. Was suspended to obtain a cell suspension. Transfer 1 mL of the microbial solution to another tube, add lysozyme lysozyme to 1 mg / mL to the remaining microbial solution, react at 30 ° C. for 30 minutes, perform ultrasonic disruption, and centrifuge at 15000 rpm for 10 minutes. The supernatant was used as a cell lysate.
The α-glucosidase activity of the culture medium (control), the culture supernatant (extracellular fraction = secretory enzyme), the cell suspension (cell surface enzyme), and the cell lysate (cell enzyme) was measured as sample 0. After adding 1% 3% maltose aqueous solution to 5 mL and reacting at 37 ° C. for 1 hour, glucose rapid colorimetry (Anal. Sci., 29 (11), 1021-5) is used as an indicator of glucose production. Measured. As a result, α-glucosidase activity was detected only in the cell lysate.
From the above results, it can be seen that α-amylase and β-amylase of the FPU-37 strain are extracellular enzymes that are induced by addition of starch, and α-glucosidase is localized in the cell. confirmed.
(実施例5)FPU−37株が有する抗菌活性の解析
1.植物病原菌類に対する抗菌活性
本発明者らは、FPU−37株のスクリーニングの過程において、FPU−37株が周囲の微生物を排除する強力な抗菌活性を示すことを見出した。そこで、本発明者らは、農業上重要な植物病原菌類に対するFPU−37株の抗菌活性を対峙培養により確認した(図6)。
AM3寒天培地上に、FPU−37株の培養液を40μLスポットしたペーパーディスクおよび何もスポットしていないペーパーディスクを置き、図6に示す植物病原菌をそれぞれ植菌し、28℃で培養した。
FPU−37株は、いずれの植物病原菌に対しても強い抗菌活性を有することが示された。
2.抗菌性物質の局在と誘導
1%(w/v)結晶性セルロースを含有するBHI培地中で、FPU−37株を3日間培養した500mLの培養液を遠心分離(8000rpm、10分間)し、その上清を1mL取ってフィルター滅菌し、培養上清サンプルとした。残りの上清は廃棄し、菌体にPBSを20mL加えて再懸濁した。該菌体懸濁液を遠心分離(6000rpm、15分間)し、菌体量の5倍量のアセトニトリル(例:菌体1mgに対してアセトニトリル5μL)を加え再懸濁した。その後、懸濁液を撹拌し(145rpm、30分間)、遠心分離(6000rpm、15分間)し、上清を採取し、さらに該上清を遠心分離(8000rpm、5分間)し、その上清を採取した。当該上清をアセトニトリル抽出画分とした。
キュウリ病原菌(Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum)に対する抗菌活性を確認したところ、培養上清、培地のみ、およびコントロール(アセトニトリルのみ)においては、抗菌活性が確認されず、アセトニトリル抽出画分のみが抗菌活性を示した(図7A)。この結果は、FPU−37株が産生する抗菌性物質が培養上清には分泌されず、菌体に付着していることを示している。
また、上記抗菌活性は、結晶性セルロースまたは真菌細胞壁(1%(w/v)Fusarium粉末)を含有する培地でFPU−37株を培養したときに誘導されることが明らかとなった(図7B)。
3.アセトニトリル抽出画分およびブタノール抽出画分の抗菌活性の解析
上記と同様の方法によりアセトニトリル抽出画分を得た。また、アセトニトリルの代わりにブタノールを使用すること以外は同様の方法によって、ブタノール抽出画分を得た。これら抽出画分の微生物に対する抗菌活性を解析した。
黄色ブドウ球菌、フザリウム属の菌、および酵母(公益財団法人 日本醸造協会、協会901号酵母を使用)に対する抗菌活性を確認したところ、アセトニトリル抽出画分はフザリウム属の菌のみに対して、ブタノール抽出画分は黄色ブドウ球菌のみに対して抗菌活性を示した(図8A)。従って、FPU−37株は、少なくとも2種類の抗菌性物質を産生することが示唆された。また、該抗菌性物質は、酵母に対しては抗菌活性を示さないことが明らかとなった。この性質は、FPU−37株と酵母を共培養することを可能とし、セルロース原料および/またはデンプン原料から簡便かつ効率的にエタノールを製造することを可能にする。
さらに、ブタノール抽出画分の抗菌スペクトルを確認したところ、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方に広く抗菌活性を示すことが明らかとなった(図8B)。
(Example 5) Analysis of antibacterial activity of FPU-37 strain Antibacterial activity against phytopathogenic fungi In the process of screening the FPU-37 strain, the inventors have found that the FPU-37 strain exhibits a strong antibacterial activity that eliminates surrounding microorganisms. Therefore, the present inventors confirmed the antibacterial activity of the FPU-37 strain against agriculturally important plant pathogenic fungi by counterculture (FIG. 6).
On the AM3 agar medium, a paper disk spotted with 40 μL of the culture solution of FPU-37 strain and a paper disk spotted with nothing were placed, and the phytopathogenic bacteria shown in FIG. 6 were inoculated and cultured at 28 ° C.
FPU-37 strain was shown to have strong antibacterial activity against any phytopathogenic fungus.
2. Localization and induction of antibacterial substances 500 mL of culture medium in which FPU-37 strain was cultured for 3 days in BHI medium containing 1% (w / v) crystalline cellulose was centrifuged (8000 rpm, 10 minutes), 1 mL of the supernatant was taken and sterilized with a filter to obtain a culture supernatant sample. The remaining supernatant was discarded, and 20 mL of PBS was added to the cells and resuspended. The bacterial cell suspension was centrifuged (6000 rpm, 15 minutes), and 5 times the amount of bacterial cell acetonitrile (eg, 5 μL of acetonitrile per 1 mg of bacterial cell) was added and resuspended. Thereafter, the suspension is stirred (145 rpm, 30 minutes), centrifuged (6000 rpm, 15 minutes), the supernatant is collected, and the supernatant is further centrifuged (8000 rpm, 5 minutes). Collected. The supernatant was used as an acetonitrile extraction fraction.
When antibacterial activity against cucumber pathogen (Fusarium oxysporum f. Sp. Cucumerinum) was confirmed, antibacterial activity was not confirmed in the culture supernatant, medium alone, and control (acetonitrile only), and only the acetonitrile extract fraction was antibacterial activity. (FIG. 7A). This result shows that the antibacterial substance produced by the FPU-37 strain is not secreted into the culture supernatant and is attached to the cells.
Further, it was revealed that the antibacterial activity was induced when the FPU-37 strain was cultured in a medium containing crystalline cellulose or fungal cell wall (1% (w / v) Fusarium powder) (FIG. 7B). ).
3. Analysis of antibacterial activity of acetonitrile extracted fraction and butanol extracted fraction Acetonitrile extracted fraction was obtained by the same method as above. A butanol extract fraction was obtained in the same manner except that butanol was used instead of acetonitrile. The antibacterial activity of these extracted fractions against microorganisms was analyzed.
Antibacterial activity against Staphylococcus aureus, Fusarium spp., And yeasts (using the Japan Brewing Association, Association No. 901 yeast) was confirmed, but the acetonitrile extract fraction was extracted with butanol only against Fusarium spp. The fraction showed antibacterial activity only against S. aureus (FIG. 8A). Therefore, it was suggested that FPU-37 strain produces at least two types of antibacterial substances. Further, it was revealed that the antibacterial substance does not exhibit antibacterial activity against yeast. This property makes it possible to co-cultivate the FPU-37 strain and yeast, and to easily and efficiently produce ethanol from cellulose raw materials and / or starch raw materials.
Furthermore, when the antibacterial spectrum of the butanol extract fraction was confirmed, it was revealed that both the gram positive bacteria and the gram negative bacteria showed wide antibacterial activity (FIG. 8B).
(実施例6)FPU−37および酵母を用いたエタノール製造
FPU−37株はデンプンを効率よく糖化可能であり、酵母以外の広範な微生物に対し抗菌活性を示す強力な抗菌性物質を産生するので、この特徴を利用して、アミラーゼによるデンプン糖化に必要な原料のα化処理と滅菌処理を行わずに、デンプンを豊富に含む六条大麦粉をそのまま唯一の炭素源として用い、FPU−37株および酵母(協会酵母901号)による並行複発酵行った(図9)。
六条大麦粉70gとM9培地100mLを混合し、乳酸でpHを4.9に調整しオートクレーブによる滅菌をせずに発酵培地として用いた。FPU−37株を2YT培地400mL中で2日間(28℃)培養し、5000rpmで15分間遠心分離し、上清を廃棄し、乳酸でpHを4.9に調整したM9培地10mLを加え、菌体を懸濁し、該懸濁液10mLを上記発酵培地へ加えた。その後、25℃の恒温槽中で2日間糖化処理を行った。YPD培地400mL中で2日間振とう培養(28℃)した協会酵母901号を、5000rpmで12分間遠心分離し、上清を廃棄し、乳酸でpHを4.9に調整したM9培地5mLを加え、菌体を懸濁し、該懸濁液5mLを上記糖化処理後の発酵培地へ加えた。15℃の恒温槽中で、静置培養発酵を40日間行った。発酵液を数日おきに採取し、MilliQ水で100倍希釈し、ガスクロマトグラフィーを使用してエタノール濃度を測定した。
図9に示すように、発酵培地中のエタノール濃度は、発酵開始から19日間大きく上昇し、19日目以降は上昇が緩やかとなった。FPU−37株を加えていない発酵培地においてもエタノール濃度の上昇が見られるが、これは六条大麦粉を加熱せずにそのまま使用したため、大麦由来のアミラーゼが失活せずに機能したためと考えられる。尚、オートクレーブ処理でα化した六条大麦粉を使用し、FPU−37株を発酵培地に加えなかった場合は、発酵培地に酵母を加えてもエタノールが検出されないことを確認している。また、FPU−37株が産生するα−グルコシダーゼは細胞内に局在するが、FPU−37株は溶菌しやすい細菌であるため、溶菌により培養液中にα−グルコシダーゼが放出され、FPU−37のアミラーゼにより産生されたマルトースをさらにグルコースに分解し、該グルコースから酵母がエタノールを産生したものと考えられる。
発酵開始40日目で、FPU−37株を使用した場合の産生されたエタノールの濃度は4.8%で、FPU−37株を使用しなかった場合は、3.8%であった(図9)。よって、FPU−37株を用いることで、原料のα化処理および滅菌処理を行わずとも、効率的にエタノールを製造できることが示された。
(Example 6) Ethanol production using FPU-37 and yeast Since FPU-37 strain can efficiently saccharify starch, it produces a strong antibacterial substance exhibiting antibacterial activity against a wide range of microorganisms other than yeast. By utilizing this feature, the raw material required for starch saccharification with amylase is not subjected to the alpha conversion and sterilization, and the starch-rich six-joo barley flour is used as the sole carbon source as it is, and the FPU-37 strain and Parallel double fermentation with yeast (Association Yeast 901) was performed (FIG. 9).
Sixty barley flour (70 g) and M9 medium (100 mL) were mixed, adjusted to pH 4.9 with lactic acid, and used as a fermentation medium without sterilization by autoclave. The FPU-37 strain is cultured in 400 mL of 2YT medium for 2 days (28 ° C.), centrifuged at 5000 rpm for 15 minutes, the supernatant is discarded, 10 mL of M9 medium adjusted to pH 4.9 with lactic acid is added, The body was suspended and 10 mL of the suspension was added to the fermentation medium. Then, the saccharification process was performed for 2 days in a 25 degreeC thermostat. Association yeast 901, cultured for 2 days in 400 mL of YPD medium (28 ° C), was centrifuged at 5000 rpm for 12 minutes, the supernatant was discarded, and 5 mL of M9 medium adjusted to pH 4.9 with lactic acid was added. The cells were suspended, and 5 mL of the suspension was added to the fermentation medium after the saccharification treatment. Static culture fermentation was performed for 40 days in a constant temperature bath at 15 ° C. The fermentation broth was collected every few days, diluted 100 times with MilliQ water, and the ethanol concentration was measured using gas chromatography.
As shown in FIG. 9, the ethanol concentration in the fermentation medium increased greatly for 19 days from the start of fermentation, and the increase became gradual after the 19th day. An increase in ethanol concentration is also observed in the fermentation medium without the addition of FPU-37 strain, but this is considered to be because the amylase derived from barley functioned without being deactivated because Rojo barley flour was used as it was without heating. . In addition, when the 6-joo barley flour gelatinized by the autoclave process was used and the FPU-37 strain was not added to the fermentation medium, it was confirmed that ethanol was not detected even if yeast was added to the fermentation medium. Moreover, although the α-glucosidase produced by the FPU-37 strain is localized in the cell, since the FPU-37 strain is a bacterium that is easily lysed, α-glucosidase is released into the culture solution by lysis, and the FPU-37. It is considered that maltose produced by this amylase was further decomposed into glucose, and yeast produced ethanol from the glucose.
On the 40th day after the start of fermentation, the concentration of ethanol produced when the FPU-37 strain was used was 4.8%, and when the FPU-37 strain was not used, it was 3.8% (Fig. 9). Therefore, it was shown that by using the FPU-37 strain, ethanol can be efficiently produced without subjecting the raw material to a gelatinization treatment and a sterilization treatment.
(実施例7)FPU−37株の種子消毒(雑菌抑制)効果
種子消毒は、育苗期に発生する多くの病害を防ぐために重要な処理である。種子消毒には農薬が主に使用されているが、消費者の食に対する安全性意識の向上から、最近では農薬や化学肥料を使用しない有機栽培が消費者から歓迎されている。また、生産者にとっても農作物の付加価値が向上するため、その生産量は年々増加している。農薬としてカウントされない有機栽培農法に使用できる種子消毒方法は、温湯消毒と微生物農薬(エコホープ、タフブロック)の2種類に限られている。しかしながら、温湯消毒は温度管理が難しく、正確に熱処理を行うためには特別な装置が必要である。一方、微生物農薬は適用できる作物の範囲が狭く、イネを中心に使用されている。そこで、広い抗菌スペクトルを持つFPU−37株は、イネ以外(トマト、レタス、コマツナ、キャベツ、ホウレンソウ、球根、種芋など)にも使用できる種子消毒剤として使用できるのではないかと考え、トマトの種子を用いて種子消毒試験を行った。
試験は、実際に種子に付着している微生物に対するFPU−37株の効果を明確に判定できるように、無菌の寒天培地上で行った。培地はMurashige and Skoog Plant Salt Mixture(4.6 g/L、和光純薬 392−00591)を用い、植物と微生物の両方が増殖できるように酵母エキス(5g/L)およびグルコース(5g/L)、寒天(15g/L)をさらに添加した(MSYG培地)。寒天培地は、オートクレーブ滅菌後にシャーレに分注した。雑菌の増殖を抑制するために使用した抗生物質(ストレプトマイシン)は、オートクレーブ滅菌後に50℃程度にまで温度が下がってから100μg/ml濃度となるように添加した。トマトの種子は、そのままMSYG培地または抗生物質含有MSYG培地の上に各60個ずつを置いて発芽させた。FPU−37株の種子消毒(雑菌抑制)効果では、FPU−37株の一晩培養液1mL(2x108CFU/mL)に種子を含浸させてからMSYG培地の上に置いて発芽させた。
(Example 7) Seed disinfection (miscellaneous bacteria suppression) effect of FPU-37 strain Seed disinfection is an important treatment for preventing many diseases occurring in the seedling raising period. Pesticides are mainly used for seed disinfection, but recently, organic cultivation without the use of pesticides and chemical fertilizers has been welcomed by consumers in order to improve consumer safety awareness of food. In addition, since the added value of crops is improved for producers, the production volume is increasing year by year. Seed disinfection methods that can be used in organic farming methods that are not counted as pesticides are limited to hot water disinfection and microbial pesticides (eco-hope, tough block). However, it is difficult to control the temperature of hot water disinfection, and a special device is required to accurately perform the heat treatment. On the other hand, microbial pesticides have a narrow range of applicable crops and are mainly used in rice. Therefore, the FPU-37 strain with a broad antibacterial spectrum is considered to be a seed disinfectant that can be used for other than rice (tomato, lettuce, komatsuna, cabbage, spinach, bulbs, seeds, etc.). A seed disinfection test was conducted using
The test was performed on a sterile agar medium so that the effect of the FPU-37 strain on the microorganisms actually attached to the seeds could be clearly determined. The medium is Murashige and Skog Plant Salt Mixture (4.6 g / L, Wako Pure Chemicals 392-00591). Yeast extract (5 g / L) and glucose (5 g / L) so that both plants and microorganisms can grow. Agar (15 g / L) was further added (MSYG medium). The agar medium was dispensed into a petri dish after autoclaving. Antibiotic (streptomycin) used to suppress the growth of miscellaneous bacteria was added so as to reach a concentration of 100 μg / ml after the temperature dropped to about 50 ° C. after autoclaving. Tomato seeds were germinated by directly placing 60 seeds on MSYG medium or antibiotic-containing MSYG medium. In the seed disinfection (bacteria control) effect of the FPU-37 strain, seeds were impregnated with 1 mL (2 × 10 8 CFU / mL) of an overnight culture solution of the FPU-37 strain, and then placed on the MSYG medium for germination.
種子消毒せずにMSYG培地上に置いて発芽させたトマトの種は、その多くが種子の周囲に雑菌が大量に繁殖して出芽しなかった(発芽率18%)。一方、抗生物質含有MSYG培地では、雑菌の繁殖が抑えられることにより高い発芽率(92%)となり、種子消毒の重要性が実感できる結果となった。FPU−37株を含浸させた種子においても、雑菌の繁殖が良く抑えられており、83%という高い発芽率であった。以上の結果から、FPU−37株は雑菌の繁殖を抑えて発芽率を高める効果があると考えられる。また、土壌改良剤(土壌殺菌)としても期待される。 Many of the tomato seeds germinated by placing them on the MSYG medium without seed disinfection did not germinate because germs proliferated in large quantities around the seeds (germination rate 18%). On the other hand, in the antibiotic-containing MSYG medium, the germination rate was high (92%) by suppressing the propagation of various bacteria, and the result that the importance of seed disinfection was realized. Also in the seed impregnated with the FPU-37 strain, the propagation of miscellaneous bacteria was well suppressed, and the germination rate was as high as 83%. From the above results, it is considered that the FPU-37 strain has the effect of suppressing germ propagation and increasing the germination rate. It is also expected as a soil conditioner (soil sterilization).
(実施例8)FPU−37株の生長促進効果
FPU−37株が植物の生長に与える効果を試験した。
FPU−37株がイネの生長に与える効果を試験するため、イネ(コシヒカリ)を2群に分けた。ハウス内において、半分にはFPU−37株の一晩培養液(2x108CFU/mL)を、残りの半分には培地のみを、潅水により育苗箱あたり50mLを一週間間隔で2回与えた。圃場に移して20日後の結果を図10に示す。
FPU−37株を添加したイネは、培地のみを与えられたイネと比較して、生長が促進された。従って、FPU−37株の一晩培養液は、イネに対して生長促進作用を有することが示された。
次にFPU−37株がトマトの生長に与える効果を試験した。
トマト苗を4群に分け、それぞれに、FPU−37株の一晩培養液(2x108CFU/mL)、10−1株の一晩培養液(2x108CFU/mL)、1K−5株の一晩培養液(2x108CFU/mL)または培地のみを、潅水により根部に10mLづつ与えた。添加20日後の結果を図11に示す。
FPU−37株を添加したトマトは、培地のみを与えられたトマトと比較して、生長が促進された。従って、FPU−37株の一晩培養液は、トマトに対して生長促進作用を有することが示された。その効果は、すでに生長促進作用が確認されている1K−5株や10−1株に匹敵するものであった。
FPU−37株は植物病原菌類等に対して強い抗菌活性を有しているが、大変興味深いことにイネやトマトなどの作物に対して生長促進効果を示すことを発見した(図10および図11)。そこで、FPU−37株の植物生長促進効果に関する分子機構の解明を目的として、生長促進に係わる各因子を解析した。
植物の生長促進効果に関与することが推定される表2に記載の因子について解析した。
(Example 8) Growth promotion effect of FPU-37 strain The effect of the FPU-37 strain on plant growth was tested.
In order to test the effect of FPU-37 strain on rice growth, rice (Koshihikari) was divided into two groups. In the house, an FPU-37 strain overnight culture solution (2 × 10 8 CFU / mL) was given to half, the medium only to the other half, and 50 mL per seedling box by irrigation twice a week. FIG. 10 shows the result 20 days after the transfer to the field.
Growth of rice to which the FPU-37 strain was added was promoted compared to rice to which only the medium was given. Therefore, it was shown that the overnight culture solution of FPU-37 strain has a growth promoting effect on rice.
Next, the effect of the FPU-37 strain on tomato growth was tested.
The tomato seedlings are divided into 4 groups, each of which has an overnight culture of FPU-37 strain (2 × 10 8 CFU / mL), an overnight culture of 10-1 strain (2 × 10 8 CFU / mL), and 1K-5 strain. An overnight culture (2 × 10 8 CFU / mL) or medium alone was given to the root by 10 ml each by irrigation. The result 20 days after the addition is shown in FIG.
The growth of the tomato added with the FPU-37 strain was promoted as compared to the tomato fed with the medium alone. Therefore, it was shown that the overnight culture solution of FPU-37 strain has a growth promoting effect on tomato. The effect was comparable to the 1K-5 and 10-1 strains whose growth promoting action was already confirmed.
The FPU-37 strain has strong antibacterial activity against phytopathogenic fungi and the like, but interestingly, it has been found that it has a growth promoting effect on crops such as rice and tomato (FIGS. 10 and 11). ). Then, in order to elucidate the molecular mechanism regarding the plant growth promotion effect of FPU-37 strain, each factor related to growth promotion was analyzed.
The factors listed in Table 2 estimated to be involved in the plant growth promoting effect were analyzed.
実施例8−1. 有機酸による難溶性リン酸塩の可溶化能力試験
31.3gのPikovskaya’Agar(HIMEDIA M520−500G)を1Lの水に溶解し、121℃で20分オートクレーブ後にシャーレに分注した。この寒天培地上でFPU−37株を28℃で1週間培養し、不溶性リンで白濁した培地に形成される透明な溶解斑を指標に難溶性リン化合物の可溶化能力を検定した。
Example 8-1. Test for Solubilization of Slightly Soluble Phosphate with Organic Acid 31.3 g of Pikovskaya'Agar (HIMEDIA M520-500G) was dissolved in 1 L of water and dispensed into a petri dish after autoclaving at 121 ° C. for 20 minutes. The FPU-37 strain was cultured at 28 ° C. for 1 week on this agar medium, and the solubilizing ability of the poorly soluble phosphorus compound was tested using transparent dissolution spots formed on the medium clouded with insoluble phosphorus as an index.
FPU−37株の菌体周辺に明確な溶解斑が形成され、難溶性リン化合物の可溶化能力が確認された(図12)。 Clear dissolution spots were formed around the cells of the FPU-37 strain, and the solubilizing ability of the poorly soluble phosphorus compound was confirmed (FIG. 12).
実施例8−2. シデロフォアの産生試験
(1) Fe−CAS Indicator(10mM HClに溶解した1mM FeCl3・6H2O溶液10mLに対して、50mLのChrome Azurol S(TCI TG2VM−TS)水溶液(1.21mg/mL)と40mlのHDTMA(TCI 33H7B−RI)水溶液(1.82mg/ml)を混合して調製)60mL、(2)2YT−PIPES寒天培地(酵母エキス10g/L、ポリペプトン16g/L、NaCl 5g/L、PIPES(DOJINDO GB157)30.24g/L、寒天15g/L)1L、および(3)10%(w/v)カザミノ酸溶液 50mL、をそれぞれオートクレーブ滅菌後に混合し、シャーレに分注してシデロフォア検定培地を作成した。Chrome Azurol S−鉄錯体は青色に呈色するが、シデロフォアにより鉄が奪われると呈色は消失する。寒天培地上でFPU−37株を28℃で12日間培養して、Chrome Azurol S−鉄錯体に由来する青色の消失を指標にシデロフォアの産生を評価した。
シデロフォア検定培地上で明確な青色の消失が確認されたことから、FPU−37株のシデロフォア産生能力が確認された(図13)。
Example 8-2. Against 1mM FeCl 3 · 6H 2 O solution 10mL dissolved in production test (1) Fe-CAS Indicator ( 10mM HCl siderophores, and 50mL of Chrome Azurol S (TCI TG2VM-TS ) solution (1.21 mg / mL) 60 mL of 40 ml HDTMA (TCI 33H7B-RI) aqueous solution (1.82 mg / ml), (2) 2YT-PIPES agar medium (yeast extract 10 g / L, polypeptone 16 g / L, NaCl 5 g / L, PIPES (DOJINDO GB157) 30.24 g / L, agar 15 g / L) 1 L, and (3) 10% (w / v) casamino acid solution 50 mL were mixed after autoclave sterilization, dispensed into a petri dish, and siderophore assay A medium was prepared. The Chrome Azurol S-iron complex is colored blue, but the color disappears when iron is taken away by the siderophore. The FPU-37 strain was cultured on an agar medium at 28 ° C. for 12 days, and the production of siderophore was evaluated using the disappearance of blue color derived from the Chrome Azurol S-iron complex as an index.
Since clear blue disappearance was confirmed on the siderophore assay medium, the siderophore production ability of the FPU-37 strain was confirmed (FIG. 13).
実施例8−3. シアン化水素(HCN)の産生分析
M9最少培地(表4)に寒天15g/Lおよび酵母エキス5g/L、グリシン5g/Lを添加して寒天培地を作成し、この寒天培地上に形成したコロニーを用いてシアン化水素の酸性能力を検定した。シアン化水素を検定するために検定紙は、0.5%(w/v)Picric Acid(2,4,6−Trinitrophenol)(Wako 207−08671)水溶液に、2%(w/v)になるようにSodium Carbonateを加えてフィルター滅菌し、Whatman Filter Paper(no.1)に含浸・風乾することで作成した(この状態で黄色)。
この検定紙(黄色)を寒天培地上に形成したコロニーの上に置き、黄色から褐色への変化を指標にHCN産生を評価した。この方法では、検定紙の色が黄色からオレンジ、赤、茶色に変化し、それぞれ低、中、高レベルのHCN産生を評価可能である。
結果を図14に示す。検定紙が褐色に変色したことから、高いHCN産生能力を有していることが確認された。
Example 8-3. Production analysis of hydrogen cyanide (HCN) Agar medium was prepared by adding agar 15 g / L, yeast extract 5 g / L, and glycine 5 g / L to M9 minimal medium (Table 4), and colonies formed on this agar medium were used. The acidity of hydrogen cyanide was tested. In order to test hydrogen cyanide, the test paper should be 2% (w / v) in 0.5% (w / v) Picric Acid (2,4,6-Trinitrophenol) (Wako 207-08671) aqueous solution. The filter was sterilized by adding sodium carbonate, impregnated in Whatman Filter Paper (no. 1) and air-dried (yellow in this state).
This test paper (yellow) was placed on a colony formed on an agar medium, and HCN production was evaluated using the change from yellow to brown as an index. In this method, the color of the test paper changes from yellow to orange, red, and brown, and low, medium, and high levels of HCN production can be evaluated, respectively.
The results are shown in FIG. Since the test paper turned brown, it was confirmed that it has a high HCN production ability.
実施例8−4. キチン分解活性
キチンの分解活性は、キチン含有培地(0.5%(w/v)コロイダルキチンと0.5%酵母エキスを含むM9寒天培地)上での溶解斑形成を指標に評価した。また、ゲノム解析によりキチン分解酵素(キチナーゼ)遺伝子の存在についても確認した(図15)。
キチン含有培地上においてハローが形成されなかったことから、FPU−37株はキチン分解能力のないと判定した。この結果は、ゲノム解析によりゲノム上にキチナーゼ遺伝子が存在しないことと一致する。
Example 8-4. Chitin degradation activity The degradation activity of chitin was evaluated using dissolution spot formation on a chitin-containing medium (M9 agar medium containing 0.5% (w / v) colloidal chitin and 0.5% yeast extract) as an index. In addition, the presence of a chitinolytic enzyme (chitinase) gene was also confirmed by genome analysis (FIG. 15).
Since no halo was formed on the chitin-containing medium, it was determined that the FPU-37 strain was not capable of degrading chitin. This result is consistent with the absence of a chitinase gene on the genome by genomic analysis.
実施例8 −5. インドール−3−酢酸(IAA)の産生試験Example 8-5. Production test of indole-3-acetic acid (IAA)
KL培地に最終濃度0.1%となるようにトリプトファンを添加し、FPU−37株を植菌して28℃で3日間振盪培養した。菌体を遠心分離で除去した培養上清2mLに対して、2滴のオルトリン酸を滴下し、さらに4mLのSalkowski試薬(35%過塩素酸50mLに対して0.5M FeCl3を1mL混合して調製)を加えて室温で30分間IAAを赤色に発色させ、530nmの吸光度を測定した。培養液の測定と同時にIAA標品で検量線を作成し、培養液中のIAA産生量を定量した。
測定の結果、FPU−37株が培養上清中に「8.41μg/mL」という高濃度のインドール−3−酢酸(IAA)を植物成長ホルモンとして産生していることを確認した。
Tryptophan was added to the KL medium to a final concentration of 0.1%, the FPU-37 strain was inoculated, and cultured with shaking at 28 ° C. for 3 days. Add 2 drops of orthophosphoric acid to 2 mL of the culture supernatant from which the cells have been removed by centrifugation, and add 4 mL of Salkowski reagent (1 mL of 0.5 M FeCl 3 to 50 mL of 35% perchloric acid). Preparation) was added and IAA was colored red for 30 minutes at room temperature, and the absorbance at 530 nm was measured. Simultaneously with the measurement of the culture solution, a calibration curve was prepared with the IAA standard, and the amount of IAA produced in the culture solution was quantified.
As a result of the measurement, it was confirmed that the FPU-37 strain produced indole-3-acetic acid (IAA) at a high concentration of “8.41 μg / mL” as a plant growth hormone in the culture supernatant.
実施例8−6. ニトロゲナーゼ(フラボドキシン)の測定
ニトロゲナーゼ(フラボドキシン)は、窒素固定を行う細菌が持っている酵素であり、大気中の窒素をアンモニアに変換する反応を触媒する。ニトロゲナーゼ活性は、窒素源を含まない最少培地(KL培地から硫酸アンモニウムを除いた培地)での増殖能力を指標に評価した。また、ゲノム解析によりニトロゲナーゼ(フラボドキシン)遺伝子の存在についても確認した。
培養試験の結果、窒素源非含有培地での培養において、培養三日後にOD660における吸光度が0.65にまで達したため、FPU−37株には窒素固定能力があると判断した。さらに、ゲノム上に存在するニトロゲナーゼ(フラボドキシン)遺伝子(配列番号7)も確認した。
Example 8-6. Measurement of nitrogenase (flavodoxin) Nitrogenase (flavodoxin) is an enzyme possessed by bacteria that fix nitrogen, and catalyzes the reaction of converting nitrogen in the atmosphere into ammonia. Nitrogenase activity was evaluated using the growth ability in a minimal medium (a medium obtained by removing ammonium sulfate from a KL medium) as an index. Genome analysis also confirmed the presence of the nitrogenase (flavodoxin) gene.
As a result of the culture test, since the absorbance at OD660 reached 0.65 after 3 days of culture in the culture in a nitrogen source-free medium, it was judged that the FPU-37 strain had a nitrogen fixing ability. Furthermore, the nitrogenase (flavodoxin) gene (SEQ ID NO: 7) present on the genome was also confirmed.
[FPU−37株由来ニトロゲナーゼ(フラボドキシン)の塩基配列(配列番号7)]
ATGAACTTGGGTAAAATCATGATTGCTTATGCTAGCATGACCGGTAATACAGAGGAAATCGCGGAATTGATCGCCGAGGGTGTTCGTCAGGCAGGGCATGAGGCAGAGTTGAAGGCTTCGTATGATTGCAACGCGCAAGAATTGCTCGCATATGACGGATTCCTGTTGGGTGTATATACATGGGGAGATGGTGAGCTTCCTGATGAATTTTTAGATTTTTACGAGGAACTAGACGAGCTTGATCTGTCTGGTAAAAAGACTGCTGTATTTGGCAGTGGAGATACATCTTATACACAATTCTGTGGCGCAGTGGACTTGGTAGAGGGAAAAGTCAAAGAACGCGGCGCATCAGTCATTCAGGAGAGTTTGAAGATTGAATTCAATCCACTCGATGATGAGAAGGAGAATTGCCGAGCTTACGGAAGACAATTTGCGCAGGCTGGCATTGGAGTGTCCTGA
[FPU−37株由来ニトロゲナーゼ(フラボドキシン)のアミノ酸配列(配列番号8)]
MNLGKIMIAYASMTGNTEEIAELIAEGVRQAGHEAELKASYDCNAQELLAYDGFLLGVYTWGDGELPDEFLDFYEELDELDLSGKKTAVFGSGDTSYTQFCGAVDLVEGKVKERGASVIQESLKIEFNPLDDEKENCRAYGRQFAQAGIGVS
[Base sequence of nitrogenase (flavodoxin) derived from FPU-37 strain (SEQ ID NO: 7)]
ATGAACTTGGGTAAAATCATGATTGCTTATGCTAGCATGACCGGTAATACAGAGGAAATCGCGGAATTGATCGCCGAGGGTGTTCGTCAGGCAGGGCATGAGGCAGAGTTGAAGGCTTCGTATGATTGCAACGCGCAAGAATTGCTCGCATATGACGGATTCCTGTTGGGTGTATATACATGGGGAGATGGTGAGCTTCCTGATGAATTTTTAGATTTTTACGAGGAACTAGACGAGCTTGATCTGTCTGGTAAAAAGACTGCTGTATTTGGCAGTGGAGATACATCTTATACACAATTCTGTGGCGCAGTGGACTTGGTAGAGGGAAAAGTC AAGAACGCGGCGCATCAGTCATTCAGGAGAGTTTGAAGATTGAATTCAATCCACTCGATGATGAGAAGGAGAATTGCCGAGCTTACGGAAGACAATTTGCGCAGGCTGGCATTGGAGTGTCCTGA
[Amino acid sequence of nitrogenase (flavodoxin) derived from FPU-37 strain (SEQ ID NO: 8)]
MNLGKIMIYASMTGGNTEEIIAELIAEGVRQAGHEAELKASYDCNAQELLLAYDGFLLLGVYTWDGGDELPFLFDFYEELDELDLSGKTAVFGSGDTSYTQFCGAVDLVEGKVDGRFGASCRQ
実施例8−7. 1−アミノシクロプロパン−1−カルボン酸(ACC)デアミナーゼ活性の測定
エチレン生合成における前駆体であるACCの代謝による資化能力(ACCデアミナーゼは代謝酵素)を測定することにより、エチレンの合成阻害能力を評価した。具体的には、ACCを唯一の窒素源として含む最少培地(KL培地から硫酸アンモニウムを除いた培地)を作成し、その増殖能力を濁度として数値化することにより評価した。上述の試験により、FPU−37株は窒素固定能力を有することが明らかとなったため、実際にはACCの添加により増殖能力が高くなることでACC代謝能力を評価した。また、ゲノム解析により1−aminocyclopropane−1−carboxylate deaminase(ACC代謝酵素)遺伝子の存在についても確認した。
試験の結果、FPU−37株はACCの添加により増殖速度が増加したことから、ACC代謝能力があり、ACC代謝酵素を産生していると判断した。さらに、ゲノム上に存在する1−aminocyclopropane−1−carboxylate deaminase(ACC代謝酵素)遺伝子(配列番号9)も確認した。
Example 8-7. Measurement of 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) deaminase activity The ability to inhibit the synthesis of ethylene by measuring the ability to assimilate ACC as a precursor in ethylene biosynthesis (ACC deaminase is a metabolic enzyme) Evaluated. Specifically, a minimal medium (a medium obtained by removing ammonium sulfate from a KL medium) containing ACC as the only nitrogen source was prepared, and the growth ability was evaluated by quantifying it as turbidity. The above test revealed that the FPU-37 strain has a nitrogen-fixing ability. Therefore, the ACC metabolic ability was actually evaluated by increasing the growth ability by adding ACC. In addition, the presence of the 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (ACC metabolizing enzyme) gene was also confirmed by genome analysis.
As a result of the test, the growth rate of the FPU-37 strain was increased by the addition of ACC. Therefore, it was judged that the FPU-37 strain had ACC metabolic ability and produced ACC metabolic enzyme. Furthermore, the 1-aminocyclopropan-1-carboxylate deaminase (ACC metabolizing enzyme) gene (SEQ ID NO: 9) present on the genome was also confirmed.
[FPU−37株由来1−aminocyclopropane−1−carboxylate deaminaseの塩基配列(配列番号9)]
ATGAACAGAATTTATCTGGATCATGCCGCATCGACTCCTATGCATCCTGAGGTTGCGCAGACTATGATGGATATCATGACCGGCCAATTCGGCAACGCTTCGAGCGTTCATGCCTTTGGCCGCGATGCCAAGCGCACCGTCAGCGCAGCGCGGGATGCCGTTGCGGCCTCTTTGGGCTGCAAGCCTGAAGAAATTATATTTACGAGCGGAGGGACAGAGAGTGATAATCTGGCCCTGTTTGGGACGGCTACGGCAGATGGTCGTACTTCCGGCCATATTATTACAACCGCGATTGAACATCACGCCGTGCTTCATGCTTGCGATGAGCTGGAAAAAGCAGGATACCAGGTGACCTATGTCCCAGTCAATGGTTTTGGGCGTGTGAATCCTGCGGACATTGAGGCAGCTATTCGCCCGGATACTTTTTTGATCAGCATGATGTATGCCAACAATGAGGTGGGCGTCATTCAGCCGGTCCAAGAAGTAGGACAGATTGCGAGAGAGCATGGAATTATATTTCATGTAGATGCAGTCCAAGCCTTCGGGCATATATCCATCGACTGCGGGAACCTCCCGATTGACTTACTTAGTGTGTCTGGCCATAAGATTAATGGACCGCAAGGAGTGGGTGCATTGTATATCCGTCAGGGTACACGCATTCAGCCGCTAATGCATGGGGGACTTCAGGAGAAGAAACGCCGTGCAGGAACAGAAAATATCGCCGGCATTGCTGGGCTGGCTAAAGCCGCAACTCTTGCCAATGCTTCCATTGAAGAGCGAGGAGCACACGATATGGCTCTTCGCCAAACGCTGCTAAAAGCGTTGGAAAACTCTCTGGGCAGTCATGAGTTTATAATCAATGGCGATCCTGAACATTTTGTGCCTAATGTGCTAAATATTAGCTTTCCAGCCATTGGTACAGAGACCATGCTGATGAATCTCGACATGGAAGGAATCGCAGCGGCCAGCGGATCAGCCTGCACTTCGGGGTCTCTAGAGCTATCGCATGTGTTGCAGGCGATGGATCTTCCTGAAGATGTTTTGAATTCAGCGATTCGATTTAGCTTCGGTTTGGGTAATACTACGGAAGAAATGGAATACACGGCCAAGAAAATTGAAACTATATGGAAGCGGCTGCGTACTAGGTACTAG
[FPU−37株由来1−aminocyclopropane−1−carboxylate deaminaseのアミノ酸配列(配列番号10)]
MNRIYLDHAASTPMHPEVAQTMMDIMTGQFGNASSVHAFGRDAKRTVSAARDAVAASLGCKPEEIIFTSGGTESDNLALFGTATADGRTSGHIITTAIEHHAVLHACDELEKAGYQVTYVPVNGFGRVNPADIEAAIRPDTFLISMMYANNEVGVIQPVQEVGQIAREHGIIFHVDAVQAFGHISIDCGNLPIDLLSVSGHKINGPQGVGALYIRQGTRIQPLMHGGLQEKKRRAGTENIAGIAGLAKAATLANASIEERGAHDMALRQTLLKALENSLGSHEFIINGDPEHFVPNVLNISFPAIGTETMLMNLDMEGIAAASGSACTSGSLELSHVLQAMDLPEDVLNSAIRFSFGLGNTTEEMEYTAKKIETIWKRLRTRY
[FPU-37 strain-derived 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase nucleotide sequence (SEQ ID NO: 9)]
ATGAACAGAATTTATCTGGATCATGCCGCATCGACTCCTATGCATCCTGAGGTTGCGCAGACTATGATGGATATCATGACCGGCCAATTCGGCAACGCTTCGAGCGTTCATGCCTTTGGCCGCGATGCCAAGCGCACCGTCAGCGCAGCGCGGGATGCCGTTGCGGCCTCTTTGGGCTGCAAGCCTGAAGAAATTATATTTACGAGCGGAGGGACAGAGAGTGATAATCTGGCCCTGTTTGGGACGGCTACGGCAGATGGTCGTACTTCCGGCCATATTATTACAACCGCGATTGAACATCACGCCGTGCTTCATGCTTGCGATGAGCTGGAA AAGCAGGATACCAGGTGACCTATGTCCCAGTCAATGGTTTTGGGCGTGTGAATCCTGCGGACATTGAGGCAGCTATTCGCCCGGATACTTTTTTGATCAGCATGATGTATGCCAACAATGAGGTGGGCGTCATTCAGCCGGTCCAAGAAGTAGGACAGATTGCGAGAGAGCATGGAATTATATTTCATGTAGATGCAGTCCAAGCCTTCGGGCATATATCCATCGACTGCGGGAACCTCCCGATTGACTTACTTAGTGTGTCTGGCCATAAGATTAATGGACCGCAAGGAGTGGGTGCATTGTATATCCGTCAGGGTACACGCATTCAGCCG TAATGCATGGGGGACTTCAGGAGAAGAAACGCCGTGCAGGAACAGAAAATATCGCCGGCATTGCTGGGCTGGCTAAAGCCGCAACTCTTGCCAATGCTTCCATTGAAGAGCGAGGAGCACACGATATGGCTCTTCGCCAAACGCTGCTAAAAGCGTTGGAAAACTCTCTGGGCAGTCATGAGTTTATAATCAATGGCGATCCTGAACATTTTGTGCCTAATGTGCTAAATATTAGCTTTCCAGCCATTGGTACAGAGACCATGCTGATGAATCTCGACATGGAAGGAATCGCAGCGGCCAGCGGATCAGCCTGCACTTCGGGGTCTCTAGAGC TATCGCATGTGTTGCAGGCGGATGGATCTTCCTGGAAGATGTTTGAATTTCAGCGATTCGATTTAGCTTCGGTTTGGGTAATATACTACGAGAAAAATGGAATAACGGGCCATGAATAGATTGAGATC
[Amino acid sequence of FPU-37 strain-derived 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase (SEQ ID NO: 10)]
MNRIYLDHAASTPMHPEVAQTMMDIMTGQFGNASSVHAFGRDAKRTVSAARDAVAASLGCKPEEIIFTSGGTESDNLALFGTATADGRTSGHIITTAIEHHAVLHACDELEKAGYQVTYVPVNGFGRVNPADIEAAIRPDTFLISMMYANNEVGVIQPVQEVGQIAREHGIIFHVDAVQAFGHISIDCGNLPIDLLSVSGHKINGPQGVGALYIRQGTRIQPLMHGGLQEKKRRAGTENIAGIAGLAKAATLANASIEERGAHDMALRQTLLKALENSLGSHEFIINGDPEHFVPNVLNISFPAIGTETMLMNLDMEGIAAASGSACTSGSLE SHVLQAMDLPEDVLNSAIRFSFGLGNTTEEMEYTAKKIETIWKRLRTRY
実施例8−8. 抗生物質
実施例5に記載のとおり、FPU−37株は抗生物質を産生する。
Example 8-8. Antibiotics As described in Example 5, strain FPU-37 produces antibiotics.
FPU−37株の生長促進効果に関するまとめ
以上の結果から、FPU−37株が有する植物に対する生長促進効果の分子機構は、「土壌中の難溶性リン化合物の可溶化(植物へのリンの供給)」や「植物生長ホルモンの産生」、「シデロフォアにより環境中の鉄を奪うことによる植物病原微生物の増殖抑制(植物もシデロフォアを産生可能)」、「シアン化水素や抗生物質による植物病原微生物の殺菌」、「植物の生長を抑制するエチレンの生合成阻害」、「窒素固定」などによる複数の因子による複合効果であることが示唆された。結果を表7に示す。
FPU−37株の優れた抗菌活性は、種子消毒剤だけでなく、土壌改良剤やバイオ農薬への応用が期待できる。
Summary of Growth Promotion Effect of FPU-37 Strain From the above results, the molecular mechanism of the growth promotion effect on plants possessed by FPU-37 strain is “solubilization of poorly soluble phosphorus compounds in soil (supply of phosphorus to plants)” ”And“ production of plant growth hormones ”,“ suppression of the growth of phytopathogenic microorganisms by depriving the environment of iron with siderophores (plants can also produce siderophores) ”,“ sterilization of phytopathogenic microorganisms with hydrogen cyanide and antibiotics ”, It was suggested that this is a combined effect of multiple factors such as “inhibition of biosynthesis of ethylene that suppresses plant growth” and “nitrogen fixation”. The results are shown in Table 7.
The excellent antibacterial activity of the FPU-37 strain is expected to be applied not only to seed disinfectants but also to soil conditioners and biopesticides.
本発明によれば、高いセルロース分解能およびデンプン分解能を有し、強力な抗菌性物質を産生する新規のパエニバチルス属の細菌が提供される。該細菌を用いることで、多様なセルロース原料およびデンプン原料からグルコースを製造することが可能となり、さらに、該グルコースはエタノールの製造に有用である。また、該細菌が産生する抗菌性物質の効果により、エタノール製造工程の効率化を図ることが可能となる。該抗菌性物質はそれ自体農業資材や医薬品としても有用に活用しうる。 ADVANTAGE OF THE INVENTION According to this invention, the novel Paenibacillus bacterium which has a high cellulose resolution and starch resolution | decomposability and produces a strong antimicrobial substance is provided. By using the bacterium, glucose can be produced from various cellulose raw materials and starch raw materials, and the glucose is useful for producing ethanol. Moreover, the efficiency of the ethanol production process can be improved by the effect of the antibacterial substance produced by the bacteria. The antibacterial substance itself can be usefully used as an agricultural material or a medicine.
Claims (25)
(b)細菌および酵母以外の真菌に対して抗菌活性を示し、
(c)ゼラチン分解能および硝酸塩還元能を有していない、
パエニバチルス属に属する細菌またはその変異体。 (A) having cellulose resolution and starch resolution;
(B) exhibits antibacterial activity against fungi other than bacteria and yeast,
(C) not having gelatin resolution and nitrate reducing ability,
A bacterium belonging to the genus Paenibacillus or a mutant thereof.
(b)(a)で得たグルコースを含む培地中で、酵母を培養することにより、グルコースをエタノールに変換する工程、
を含むエタノールの製造方法。 (A) A step of converting cellulose and / or starch into glucose by culturing the bacterium according to any one of claims 1 to 3 or a variant thereof in a medium containing cellulose and / or starch. ,
(B) converting glucose into ethanol by culturing yeast in a medium containing glucose obtained in (a),
A method for producing ethanol comprising:
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