JP2006288407A - 造血細胞培養栄養補充成分 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、無血清の真核
生物細胞培養培地補充成分が提供される。
【選択図】なし
Description
(項目1)
1つ以上の抗酸化剤、1つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つ以上の脂質薬剤、1つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、1つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つ以上の微量元素、および1つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される1つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、
ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
1つ以上の抗酸化剤、ならびに、1つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つ以上の脂質薬剤、1つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、1つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つ以上の微量元素、および1つ以上のグルココルチコイドからなる群より選択される1つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、
ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記抗酸化剤が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、あるいはその誘導体または混合物からなる群より選択される、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記脂質薬剤が、HumanEx-Cyte(R)ならびにエタノールアミンまたはその誘導体および混合物からなる群より選択される、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記インスリンが、ヒト亜鉛インスリンである、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記トランスフェリンが、ヒト鉄飽和トランスフェリンである、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記微量元素が、Se4+である、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾンである、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記補充成分が濃縮される、項目1に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記補充成分が、約2倍から約100倍に濃縮される、項目10に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記補充成分が、約40×処方物である、項目11に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
項目1に記載の1つ以上の成分を組み合わせることによって得られる、無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
前記成分が、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールからなる群より選択される、項目13に記載の無血清の真核生物細胞培養培地補充成分。
無血清の真核生物細胞培養培地補充成分を製造する方法であって、水を項目1に記載の1つ以上の成分と混合する工程を包含する、方法。
前記成分が、水、N-アセチル-L-システイン、ヒト血清アルブミン、HumanEx-Cyte(R)、エタノールアミンHCl、ヒト亜鉛インスリン、ヒト鉄飽和トランスフェリン、Se4+塩、ヒドロコルチゾン、D,L-酢酸トコフェロール、および2-メルカプトエタノールを含む、項目15に記載の方法。
キャリア手段を含むキットであって、該キャリア手段が、その中に1つ以上の容器手段を密接した制限で受けるために仕切られれており、ここで、第1の容器手段が項目1に記載の補充成分を含み、そして必要に応じて第2の容器手段は基本培地を含む、キット。
項目1に記載の無血清培養補充成分を補充した基本細胞培養培地を含む無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該補充された培養培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。
前記基本培地が、Iscove'sModified Dulbecco's Medium、RPMI-1640、α-MEMからなる群より選択される、項目18に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
基本細胞培養培地を項目1に記載の無血清補充成分と組み合わせることによって得られる無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。
前記培地が1×培地である、項目20に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記培地が、濃縮された培地処方物である、項目20に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記培地が、約2×から約100×まで濃縮される、項目22に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記濃縮された培地処方物が、約10×処方物である、項目23に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記濃縮された培地処方物が、10×より高く濃縮される、項目23に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
無血清の真核生物細胞培地を製造する方法であって、基本細胞培養培地を項目1に記載の無血清補充成分と混合する工程を包含し、
ここで、該培地が、CD34+造血細胞の細胞の拡大を支持し得る、
方法。
1つ以上の抗酸化剤、1つ以上のアルブミンまたはアルブミン代替物、1つ以上の脂質薬剤、1つ以上のインスリンまたはインスリン代替物、1つ以上のトランスフェリンまたはトランスフェリン代替物、1つ以上の微量元素、1つ以上のグルココルチコイド、1つ以上の無機塩、1つ以上のエネルギー供給源、1つ以上の緩衝化剤、1つ以上のピルビン酸塩、1つ以上のpH指示薬、1つ以上のアミノ酸、および1つ以上のビタミンからなる群より選択される1つ以上の成分を含む、無血清の真核生物細胞培養培地であって、
ここで、該培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、
無血清の真核生物細胞培養培地。
前記抗酸化剤が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、およびD,L-酢酸トコフェロール、あるいはその誘導体または混合物からなる群より選択される、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記アルブミンが、ヒト血清アルブミンである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記脂質薬剤が、HumanEx-Cyte(R)およびエタノールアミンである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記インスリンが、ヒト亜鉛インスリンである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記トランスフェリンが、ヒト鉄飽和トランスフェリンである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記グルココルチコイドが、ヒドロコルチゾンである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記無機塩成分が、1つ以上のカルシウム塩、1つ以上のカリウム塩、1つ以上のマグネシウム塩、1つ以上のナトリウム塩、1つ以上の炭酸塩、および1つ以上のリン酸塩からなる群より選択される1つ以上の無機塩を含む、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記エネルギー供給源が、D-グルコースである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記緩衝化剤が、HEPESである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記ピルビン酸塩が、ピルビン酸ナトリウムである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記pH指示薬が、フェノールレッドである、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記アミノ酸成分が、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ならびにその塩および誘導体からなる群より選択される1つ以上のアミノ酸を含む、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記ビタミン成分が、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB12、ならびにその誘導体からなる群より選択される1つ以上のビタミンを含む、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記成分が、N-アセチル-L-システイン、2-メルカプトエタノール、ヒト血清アルブミン、D,L-酢酸トコフェロール、HumanEx-Cyte(R)、エタノールアミン、ヒト亜鉛インスリン、鉄飽和トランスフェリン、Se4+、ヒドロコルチゾン、Ca2+、K+、Mg2+、Na+、CO3 2−、PO4 3−、D-グルコース、HEPES、ピルビン酸ナトリウム、フェノールレッド、グリシン、L-アラニン、L-アスパラギン、L-システイン、L-アスパラギン酸、L-グルタミン酸、L-フェニルアラニン、L-ヒスチジン、L-イソロイシン、L-リジン、L-ロイシン、L-グルタミン、L-アルギニンHCL、L-メチオニン、L-プロリン、L-ヒドロキシプロリン、L-セリン、L-トレオニン、L-トリプトファン、L-チロシン、およびL-バリン、ビオチン、D-パントテン酸カルシウム、塩化コリン、葉酸、i-イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキサールHCl、リボフラビン、チアミンHCl、およびビタミンB12を含む、項目27に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
前記培地が、水および項目46に記載の成分を組み合わせることによって得られる、項目41に記載の無血清の真核生物細胞培養培地。
項目41に記載の成分を混合する工程を包含する、無血清の真核生物細胞培養培地を製造する方法。
項目27に記載の無血清培地中にCD34+造血幹細胞を含む組成物。
前記CD34+造血幹細胞が、ヒト、サル、類人猿、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、モルモット、ウシ、ブタ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、およびヒツジからなる群より選択される動物から得られる、項目44に記載の組成物。
CD34+造血細胞を拡大する方法であって、
(a) 該細胞を項目27に記載の培地と接触させる工程;および
(b) 該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
前記培養する工程が、前記培地に造血細胞増殖因子を添加する工程をさらに包含する、項目46に記載の方法。
前記増殖因子が、エリスロポエチン、顆粒球−コロニー刺激因子、幹細胞因子、インターロイキン3、および顆粒球/マクロファージ−コロニー刺激因子からなる群より選択される1つ以上の増殖因子である、項目47に記載の方法。
無血清培養物中のCD34+造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 該CD34+造血細胞を項目27に記載の培地と接触させる工程;
(b) 無血清培養物中で該CD34+造血細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程;および
(c) 該拡大した細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。
前記培養する工程が、造血細胞増殖因子を前記培地に添加する工程をさらに包含する、項目49に記載の方法。
CD34+造血細胞を無血清培養物中で特定の型の細胞に分化させる方法であって、
(a) 該CD34+造血細胞を項目27に記載の培地と接触させる工程;
(b) 無血清培養物中で該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程;および
(c) 1つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程、
を包含する、方法。
無血清培養物中で分化した造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 該CD34+造血細胞を項目27に記載の培地と接触させる工程;
(b) 無血清培養物中で該細胞の拡大を容易にするために適切な条件下で該細胞を培養する工程;
(c) 1つ以上の分化因子を添加する工程あるいは異なる型の造血細胞を形成するように細胞の分化を誘導するために培養条件を変化させる工程;および
(d) 該分化した細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。
組換えCD34+造血細胞を拡大する方法であって、
(a) 目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34+造血細胞を得る工程;および
(b) 組換え細胞の集団を形成するために項目27に記載の培地中で該細胞を培養する工程、
を包含する、方法。
組換えCD34+造血細胞を哺乳動物に提供する方法であって、
(a) 目的のタンパク質をコードする核酸分子を含む組換えCD34+造血細胞を得る工程;
(b) 組換えCD34+造血幹細胞の集団を形成するために項目27に記載の培地中で該細胞を培養する工程;および
(c) 該組換え細胞を哺乳動物に導入する工程、
を包含する、方法。
(実験方法)
以下の実施例において、他に指示がなければ、骨髄細胞を得る方法、CD34+細胞を選択する方法、細胞増殖をアッセイする方法、およびフローサイトメトリーアッセイの方法を、この実施例に記載のように行った。
骨髄を、スクリーニングした正常ドナーの群から得た(Roswell Park Cancer Instituteの好意)。髄質を、後部腸骨稜から吸引し、そして滅菌ヘパリン化チューブに入れた。研究室では、約25mLのヘパリン化骨髄を、等量のハンクス平衡塩溶液(カルシウムまたはマグネシウムを含まない)(LifeTechnologies, Gaithersburg, MD)で希釈し、そして50mLチューブ中のNycoprepTM 1.077(LifeTechnologies)上に注意深く積層した。次いで、サンプルを室温で30分間、800×gにて遠心分離した。遠心分離後、界面での骨髄単球細胞(BMMC)のバンドをピペッティングによって取り出した。細胞を、ハンクス平衡塩溶液(カルシウムまたはマグネシウムを含まない)で1回洗浄し、そしてヘモサイトメーター(細胞生存性を測定するためにトリパンブルー染料排除を使用する)を使用して計数した。
いくつかの実験については、CD34+細胞を、製造者の指示に従ってMicroCELLector(R) Systemを使用して分離した。簡単にいえば、BMMCの非接着画分を、SoybeanAgglutinin MicroCELLector(R)フラスコでのインキュベーション後に集めた。細胞を、Iscove改変Dulbecco培地(IMDM)で洗浄した。
所定の実験については、使用されるCD34+細胞は、上記の方法の1つのみによって単離されている細胞であった。他に指示がなければ、CD34+細胞を、5%CO2/95%空気雰囲気中37℃にてインキュベートした。細胞を、ヘモサイトメーターを使用して計数した。細胞生存性を、細胞がトリパンブルー染料を排除する能力によって評価した。
CD34+細胞を、組換え増殖因子を補充したStemPro-34TMSFM(Life Technologies)または20%ウシ胎児血清および組換え増殖因子を補充したIMDMのいずれか中で6〜8日間培養した。他に指示がなければ、組換え増殖因子を、細胞培養実験のセットアップの最初に添加した。
ノクローナル抗体で染色した。細胞のアリコートを、マウスIgGとともに15分間氷上でインキュベートして、非特異的結合部位をブロックした。次いで、細胞を、FITC-またはPE-のいずれかを結合したモノクローナル抗体を含む12×75mmポリスチレンチューブに添加した。これらのチューブを混合し、そして30〜45分間氷上でインキュベートした。次いで、染色した細胞を、Dulbeccoリン酸緩衝生理的食塩水(DPBS)で1回洗浄し、そして2%ホルマリン/DPBSで固定した。分析を、FACSort装置(Becton Dickinson (BD))を使用して行った。蛍光色素結合した抗体の標準パネルは、抗CD34/HPCA-2(BD)、抗CD14/Mφp9(BD)、抗CD38/T16(Immunotech,Inc.)、抗CD13/366(Coulter Corp.)、および抗CD33/906(Coulter)である。
(無血清培養条件下でのCD34+選択した細胞の増殖)
CD34+細胞が種々の培養条件下で拡大および分化する能力を研究するために、CD34+細胞を、正常ドナー骨髄から選択した。最初に、1.3%の総骨髄細胞が、報告された値(Cinin,C.I.ら, J. Immunol. 133:157 (1984))と一致してCD34+であった(表4)。選択プロセスは、新たに吸引した正常骨髄細胞で1%から64%までCD34+細胞を富化した。
1 拡大指標は、等式:7日目の細胞÷2×104によって決定される細胞集団の増幅のレベルを示す。
2 %FBS=7日目の実験群細胞÷7日目のFBSコントロール群の細胞×100%(FBSコントロールはIMDM+20%FBS+SCF+IL-3+GM-CSF中で培養された細胞である)
(実施例3)
(CD34+細胞拡大の動態)
StemPro-34TMSFM中での細胞拡大の動態を、血清含有培地中での細胞拡大の動態と比較した。CD34+骨髄細胞を、24ウェルプレートに2×104細胞/ウェルの初期濃度で播種した。ヒト組換え因子SCF(100ng/mL)、IL-3(50ng/mL)、およびGM-CSF(25ng/mL)の最終濃度を、セットアップ時にStemProTM-34SFMまたはIMDM/20%FBSのいずれかに添加した。示した日に、ウェルを採取し、そして細胞を、ヘモサイトメーターおよびトリパンブルー染料排除を使用して計数した。結果を図1に示す。
(CD34+細胞の拡大)
細胞拡大中のCD34+細胞集団の変化を検査した。CD34+骨髄細胞を、24ウェル平底プレートに1mL当たり2×104細胞で播種し、そしてStemProTM-34SFMまたはIMDM+20%FBSのいずれか中で6〜8日間培養した。すべての培養物に、セットアップ時にヒト組換え増殖因子SCF(100ng/mL)、IL-3(50ng/mL)、およびGM-CSF(25ng/mL)の最終濃度を補充した。総細胞計数を、ヘモサイトメーターおよびトリパンブルー染料排除によって決定した。CD34+細胞をFACSによって計数した。
(拡大における増殖因子添加の効果)
本発明の補充成分および培地の有利な効果を、図3にさらに示す。正常骨髄からのCD34+選択した細胞を、StemProTM-34中に1mL当たり2×104細胞の密度でプレーティングした。ヒト組換え増殖因子を、示した日(d)の100ng/mLSCF、50ng/mL IL-3、および25ng/mL GM-CSFの最終濃度まで添加し、そして細胞を7日間インキュベートした。拡大指標を、(7日目の細胞密度÷初期播種密度)として算出した。拡大指標は、20%FBSを補充したIMDMと比較して、StemPro-34TMSFMで約4倍であった。
(拡大における増殖因子添加の効果)
図3の結果は、StemPro-34TMが細胞拡大に関して非常に大きな制御を可能にすることを示す。同様の結果を図4に示す。新たに採取された正常骨髄からのCD34+選択した細胞を、StemProTM-34またはIMDM+20%FBS中で1mL当たり2×104細胞の播種密度で培養した。示すように、ヒト組換え増殖因子を、培養セットアップ時またはセットアップの3日後のいずれかに、100ng/mLSCF、50ng/mL IL-3、25ng/mL GM-CSF、および12ユニット/mL EPOの最終濃度まで添加した。培養の7日後、細胞を採取し、計数し、そして細胞のアリコートをFACS分析のために染色した。図4では、CD34−細胞は、本発明の補充成分および培地によって支持される分化された細胞である。このような細胞は、赤血球前駆体(例えば、BFU-E細胞)および骨髄前駆体(例えば、CFU-GMおよびCFU-G細胞)である。
(BFU-E細胞発生における増殖因子の効果)
エリスロポエチン(EPO)およびインターロイキン6(IL-6)は、CD34+造血細胞のBFU-E細胞への分化を刺激する。CD34+細胞の分化を、StemPro-34TMSFMを使用して評価した。正常骨髄からのCD34+選択した細胞を、ヒト組換えサイトカイン(SCF(100ng/mL)、IL-3(50ng/mL)、GM-CSF(25ng/mL)、IL-6(20ng/mL)(最終濃度))および図5の挿入図に示すEPOの濃度の組み合わせを使用して、指示された培地中で2×104細胞/mLの密度で(3連で)プレーティングした。
(種々の補充成分の成分の最適化)
処方物の補充成分および培地のいくつかの成分は、種々の濃度の範囲にわたって機能的活性を有することを示した。これらの成分には、トランスフェリン、ヒト血清アルブミン、Human Ex-Cyte(R)、2-メルカプトエタノール、およびN-アセチル-L-システインが含まれた。
正常ヒト骨髄細胞を、StemPro-34TM SMF培地中で培養し、これにトランスフェリンを図6に示す最終濃度まで添加した。培養の6日後に、細胞を採取しそして計数した。100μg/mLヒトトランスフェリンの濃度が最適となった。しかし、示したように、他の濃度のヒトトランスフェリンは細胞増殖を支持する。
CD34+細胞を、Stem-Pro-34TMSFM中で培養し、これに種々の脂質/脂肪酸混合物を図7に示す最終濃度まで添加した。培養の6〜7日後に、細胞を採取しそして計数した。
CD34+細胞を、0.05mM2-メルカプトエタノール(最終濃度)を含むまたは含まないStemPro-34TM SFM中で培養した。培養の6〜7日後、細胞を採取および計数した。結果を図8に示す。4.34mg/Lの最終濃度で使用した抗酸化剤の2-メルカプトエタノールは、性能を約2倍増大した。
CD34+細胞を、StemPro-34TMSFM中で培養し、これに図9に示すヒト血清アルブミンおよびHuman Ex-Cyteの最終濃度を添加した。培養の6〜7日後、細胞を採取および計数した。本発明の好ましい実施態様では、HumanEx-Cyte(R)が5mg/Lの濃度で使用される場合、ヒト血清アルブミンは5mg/Lの最終濃度で用いられる。
(長期性能についてのN-アセチル-L-システインの必要性の同定)
アンモニアは、造血細胞に毒性である成分である。培養物中で、アンモニアは、アンモニウムイオン(NH4 +)の形態をとる。図10に示すように、アンモニウムイオンは、液体処方物中で自発的に破壊される。細胞拡大におけるアンモニウムイオン濃度の効果を評価した。CD34+細胞を、24ウェル平底プレートに、2×104細胞/ウェルの初期濃度で2連で播種した。これらの実験に使用した培地を新たに作成し、そしてアンモニウムを示した濃度で培地中に滴定した。次いで、すべてのウェルに、ヒト組換えSCF100ng/mL、IL-3 50ng/mL、およびGM-CSF 25ng/mL(最終濃度)を補充した。培養の6日後、細胞を採取し、そしてアンモニウム濃度を、較正アンモニウムプローブを使用して決定した。
本発明の補充成分は、造血細胞を培養するための多くの異なる基本培地のいずれかと使用され得る。正常骨髄からのCD34+選択した細胞を、RPMI 1640、MEM-α、IMDM、Medium 199、NCTC 109、またはHam'sF10培地中に2×104細胞/mLの密度でプレーティングした。これらの培地のそれぞれは、Life Technologies, Inc.から購入され得る。すべての培養物に、組換えヒト増殖因子SCF(100ng/mL)、IL-3(50ng/mL)、およびGM-CSF(25ng/mL)(最終濃度)を補充した。図14に示すように、多くの培地処方物は、CD34−細胞の増殖および拡大を支持するために本発明の補充成分とともに使用され得る。
Claims (1)
- 無血清の真核生物細胞培養培地補充成分であって、ここで、該補充成分を補充した基本細胞培養培地が、CD34+造血細胞の拡大を支持し得る、無血清の真核
生物細胞培養培地補充成分。
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