JP2004121122A - Plant leaf formation-related protein as2, and gene encoding the same - Google Patents

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To establish a technique for developing symmetric and flat leaves in plant and establishing the veins of leaves, specifically to establish a gene for the technique. <P>SOLUTION: The plant leaf formation-related protein AS2 controlling the transcription of a specific gene in the nucleus of a plant cell, the development of symmetric and flat leaf blades and the establishment of the veins of leaves, more specifically having a cysteine reiterated sequence consisting of cysteine-rich C-motifs and leucine zipper-like motifs is provided. A DNA encoding the protein AS2 and a composition for controlling plant leaf formation using the DNA are also provided respectively. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２、詳細には、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２、より詳細には、システインに富むＣ‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とする植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２に関する。より具体的には、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２が、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質ＡＳ２に関する。
また、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡ、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２を用いた植物の葉の形成を制御するための組成物、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、及びそれを含有してなるベクターに関する。
【０００２】
【従来の技術】
相対的に平坦な組織である被子植物の葉は、その形状及び複雑さという点で広範囲な多様性を持っているが、その基本構造は、一般に、近位−遠位、内側−外側、及び向軸性−背軸性という３つの軸に基づいて説明することができる（非特許文献１〜４参照）。従って、植物は、葉の発生において、３つの軸の確立に関与する一般的なメカニズムを利用していると考えられる。
葉は茎頂のメリステム（ＳＡＭ）から外側器官として発生する。３つの軸のそれぞれに沿った形状の発達、向軸性−背軸性のアイデンティティ及び葉の全体的な形状に関連する葉の形態の変化と共に種々の突然変異体が単離されてきた。
【０００３】
突然変異の表現型に関与する遺伝子の一部はクローニングされ、性状分析されている（非特許文献５〜１２参照）。ｍｙｂ様遺伝子（ＰＨＡＮ）及びホメオボックスを含む転写因子（ＰＨＢとＰＨＶ）をコードしていると思われるキンギョソウのＰＨＡＮＴＡＳＴＩＣＡ（ＰＨＡＮ）、シロイヌナズナのＰＨＡＢＵＬＯＳＡ（ＰＨＢ）、及びシロイヌナズナのＰＨＡＶＯＬＵＴＡ（ＰＨＶ）は、向軸性細胞の運命に関与している。さらに、ＦＩＬＡＭＥＮＴＯＵＳ　ＦＬＯＷＥＲ（ＦＩＬ）、ＹＡＢＢＹ３（ＹＡＢ３）、ＣＲＡＢＳ　ＣＬＡＷ（ＣＲＣ）、及びＫＡＮＡＤＩ（ＫＡＮ）などが挙げられ、これらは葉身における背軸性細胞の運命の仕様に関与している。このような遺伝子における突然変異によって、平坦に広がる葉が、糸状で竿型の構造に変異する。これは、向軸性−背軸性のアイデンティティも歪められているためであり、従って、葉身の側方への発生は、向軸性−背軸性のアイデンティティの遺伝子による決定と一緒になっている可能性があると考えられている。
内側−外側の軸に沿った葉の形状に関しては、多数の植物の葉は一般に、軸としての葉軸に対して明瞭であり、およその左右対称性を示す（非特許文献１３〜１７参照）。しかし、この点についてはいくつかの例外も報告されている（非特許文献１８〜２０参照）。いずれにしても、このような対称性は葉の形状の複雑さ（例えば、単一又は複合）とは無関係である。
【０００４】
対称性の葉の発生に関与するメカニズムを明らかにするために、本発明者らを含む数組のグループがシロイヌナズナのアシンメトリックリーブズ２（ａｓ２）及びアシンメトリックリーブズ１（ａｓ１）を検討している。そのような突然変異体の表現型は、葉身及び奇形の葉脈系の非対称性という点で極めてよく似ているが、異常は絶対的に同一というわけではない（非特許文献２１〜２４参照）。これらの遺伝子の異常は以下のように要約することができる。（１）ａｓ１変異体及びａｓ２変異体の葉は、非対称性の裂片を持ち、両側性に非対称である下向きの巻きを示す。（２）肥厚し、且つ明瞭な主脈を生じることができず、２次葉脈のパターンも非対称性である（非特許文献２３及び２４参照）。（３）試験管内にてフィトクロムを含まない培地で培養した葉の切片は、野生型の葉の切片よりも高い頻度でシュートを再生する（非特許文献２３参照）。（４）例えば、ＫＮＡＴ１、ＫＮＡＴ２、及びＫＮＡＴ６のようなクラスＩｋｎｏｘ遺伝子の転写物が変異体の葉に蓄積する（非特許文献２３参照）。（５）トウモロコシのＲＯＵＧＨ　ＳＨＥＡＴＨ２（ＲＳ２）及びＰＨＡＮの産物に関係するｍｙｂ様転写因子をコードするａｓ１の転写物は、子葉原基及び葉原基における導管組織の周りに蓄積する（非特許文献２１参照）。
【０００５】
以上のように要約された所見は、ａｓ１及びａｓ２が、葉身対称性の発生と同様に、葉の左右対称性の構造的な軸としての顕著な主脈を含む、葉脈システム全体の確立に関与する可能性があることを示唆している（非特許文献２３参照）。それらはまた、おそらくクラスＩｋｎｏｘ遺伝子の発現を抑制することによって、発生上の決定的状況に葉細胞を維持する点で機能している可能性がある。葉脈システムの確立におけるこのような遺伝子の役割は、葉細胞の決定的状況を維持することと高く相関しているが、そのような相関の詳細は明らかにされていない。ａｓ１、ａｓ２及びａｓ１とａｓ２の二重変異植物の異常の類似性によってａｓ１とａｓ２は幾分遺伝的に相互作用しているという提案が導かれている（非特許文献２３参照）。ａｓ１とａｓ２が葉身形成を制御するメカニズムにおいてさらに見識を得るには、ａｓ２遺伝子及びａｓ１遺伝子の両方の性状分析を行うことが極めて重要である。
【０００６】
ａｓ２遺伝子座は、２つのシロイヌナズナのトランスジェニック株＃１４−２２．４．４Ｗ３（Ｔ−１２００）及び＃１４−６８．１．４（Ｔ−１７００）において、ｄＡｃ−Ｉ−ＲＳとして知られる転移因子の２つの誘導体の間に地図上の位置が決定されたことが、本発明者らにより報告されている（非特許文献２５参照）。しかし、その詳細については報告されていなかった。
【０００７】
【非特許文献１】
Ｓｔｅｅｖｅｓ，　Ｔ．Ａ．　ａｎｄ　Ｓｕｓｓｅｘ，　Ｉ．Ｍ　（１９８９）　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、
【非特許文献２】
Ｗａｉｔｅｓ，　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｃｅｌｌ　９３：７７９−７８９、
【非特許文献３】
Ｈｕｄｓｏｎ，　Ａ．　（２０００）　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　７：５８１−５８７、
【非特許文献４】
Ｂｙｒｎｅ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．　Ｏｐｉｎ．　Ｐｌａｎｔ．　Ｂｉｏｌ．　４：３８−４３
【非特許文献５】
Ｈａｋｅ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８９）　ＥＭＢＯ　Ｊ．　８：１５−２２、
【非特許文献６】
Ｃｏｎｗａｙ，　Ｌ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｐｏｅｔｈｉｇ，　Ｒ．Ｓ．（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４：１０２０９−１０２１４）、
【非特許文献７】
Ｈｏｆｅｒ，　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，　（１９９７）　Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．　７：５８１−５８７、
【非特許文献８】
Ｋｉｍ，　Ｇ．Ｔ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１２：２３８１−２３９１、
【非特許文献９】
Ｂｅｒｎａ，　Ｇ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　１５２：７２９−７４２、
【非特許文献１０】
Ｓｅｒｒａｎｏ−Ｃａｒｔａｇｅｎａ，　Ｊ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２６１：７２５−７３９、
【非特許文献１１】
Ｔｉｍｍｅｒｍａｎｓ，　Ｍ．Ｃ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４　：１５１−１５３、
【非特許文献１２】
Ｔｓｉａｎｔｉｓ，　Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２８４　：１５４−１５６
【非特許文献１３】
Ｏｇｕｒａ，　Ｙ．　（１９６２）　Ｐｌａｎｔ　Ａｎａｔｏｍｙ　ａｎｄ　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ．　ｐｐ．１０２−１３４　Ｙｏｕｋｅｎｄｏ，　Ｉｎｃ．，　Ｔｏｋｙｏ．、
【非特許文献１４】
Ｈｉｃｋｅｙ、Ｌ．Ｊ．　（１９７３）Ａｍｅｒ．　Ｊ．　ｂｏｔ．　６０：１７−３３、
【非特許文献１５】
Ｈｉｃｋｅｙ，　Ｌ．Ｊ．　（１９７９）Ｉｎ　Ａｎａｔｏｍｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｄｉｃｏｔｙｌｅｄｏｎｓ．　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｍｅｔｃａｌｆ，　Ｃ．Ｒ．　ａｎｄ　Ｃｈａｌｋ，　Ｌ．　ｐｐ．　２５−３９．　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、
【非特許文献１６】
Ｓｉｎｈａ、Ｎ．Ｒ．　（１９９９）　Ａｎｎｕ．　Ｒｅｖ．　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ；．　ｂｉｏｌ．　５０：４１９−４４６、
【非特許文献１７】
Ｓｅｍｉａｒｔｉ，　Ｅ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２８　：１７７１−１７８３
【非特許文献１８】
Ｗｈａｌｅｙ，　Ｗ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｗｈａｌｅｙ，　Ｃ．Ｙ．　（１９４２）　Ａｍｅｒ．　Ｊ．　ｂｏｔ．　２９：１０５−１９４，
【非特許文献１９】
Ｌｉｅｕ，　Ｓ．Ｍ．　ａｎｄ　Ｓａｔｔｌｅｒ，　Ｒ．　（１９７６）　Ｃａｎ　Ｊ．　Ｂｏｔ．　５４：２１０８−２１２１、
【非特許文献２０】
Ｄｅｎｇｌｅｒ，　Ｎ．Ｇ．　（１９９９）　Ｉｎｔ．　Ｊ．　Ｐｌａｎｔ　Ｓｃｉ．　１６０：Ｓ６７−Ｓ８０
【非特許文献２１】
Ｂｙｒｎｅ，　Ｍ．Ｅ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｎａｔｕｒｅ　４０８：９６４−９７１、
【非特許文献２２】
Ｏｒｉ，　Ｎ．　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１２７　：５５２３−５５３２、
【非特許文献２３】
Ｓｅｍｉａｒｔｉ　ｅｔ　ａｌ．　（２００１ａ）、
【非特許文献２４】
Ｓｕｎ，　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　（２００２）　Ｐｌａｎｔａ　２１４：６９４−７０２
【非特許文献２５】
Ｍａｃｈｉｄａ，　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９７）　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ　９４：８６７５−８６８０
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物における対称性で平坦な葉の発生、及び葉の葉脈を確立させるための手法を、詳細にはそのための遺伝子を確立することを目的としている。より詳細には、本発明は、ａｓ２遺伝子を単離し、その性状分析を行うことにより、対称性で平坦な葉の発生及び葉の葉脈の確立を制御する方法を提供し、そのために有用な新たなタンパク質ＡＳ２、及びそれをコードする遺伝子ａｓ２を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、ａｓ２遺伝子を単離し、性状分析を行った。この遺伝子は、Ｃ‐モチーフと命名されたシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを含む新規タンパク質をコードする。データベースの検索では、ＡＳ２は、本発明者らがＡＳ２ファミリーと命名したタンパク質の大きなファミリーに属することが判った。ａｓ２遺伝子の転写物は主として、胚発生中に子葉原基の向軸性ドメインで検出された。ＡＳ２は明瞭な核への局在シグナルを含んではいないが、緑色蛍光タンパクを結合したＡＳ２は植物の核に局在していた。ａｓ２ｃＤＮＡの過剰発現は、トランスジェニック植物のシュートの形成効率に低下を生じた。ａｓ２ｃＤＮＡを過剰発現したトランスジェニックシロイヌナズナは、上向きに巻いた葉を生じ、時には葉身の適当な広がりを持たない竿型の葉を生じた。従って、ＡＳ２は、核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している可能性があることを見出した。
【００１０】
本発明は、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２に関する。詳細には、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２、より詳細には、システインに富むＣ‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とする植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２に関する。より具体的には、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２が、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質ＡＳ２に関する。
また、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡ、より詳細にはＤＮＡが、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものである植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡに関する。
さらに、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２を用いた植物の葉の形成を制御するための組成物、植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、及びそれを含有してなるベクターに関する。
【００１１】
本発明者らは、２つのシロイヌナズナのトランスジェニック株＃１４−２２．４．４Ｗ３（Ｔ−１２００）及び＃１４−６８．１．４（Ｔ−１７００）において、ａｓ２遺伝子座が、ｄＡｃ−Ｉ−ＲＳとして知られる転移因子の２つの誘導体の間に地図上の位置存在していることを決定していた。これに基づいてａｓ２遺伝子のクローニングを行った。遺伝子地図に基づいたクローニングにおいて、ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４におけるＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカー以外に、遺伝的且つ分子マーカーとしてこのような２つのｄＡｃ−Ｉ−ＲＳ因子に着目した。この因子はハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、ａｓ２遺伝子座は最終的には、ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４における２つのＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカー（マーカー１とマーカー４）の間の３２ｋｂｐの領域であることがわかった。
【００１２】
図１に、シロイヌナズナの第１染色体のゲノムの領域構造、及びゲノム断片による相補性解析の結果を示す（図１Ａ）。図１ＡのＴ−１２００及びＴ−１７００は、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ^ｒ）遺伝子によるｄＡｃ−Ｉ−ＲＳ転移因子の位置を示す。図１Ｂは、第１染色体におけるａｓ２遺伝子付近の各ＢＡＣクローン（Ｆ５Ｉ１４、Ｆ１Ｅ２２、及びＦ１２Ｐ１９）を示す。ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４の上に４種のマーカーの位置を示し、マーカーの上の番号は、それぞれのマーカーとａｓ２遺伝子座との間での組換え体の数を示す（ほとんどの場合で１０，０００を超える染色体を調べた。）。
本発明者らは、我々はＴ−１２００及びＴ−１７００のハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ^ｒ）遺伝子から染色体ウォーキングを開始し、本発明者らが解析のために作成したＲＦＬＰマーカーである、マーカー１、マーカー２、マーカー３及びマーカー４のうちの、ａｓ２遺伝子がマーカー１とマーカー４の間の３２ｋｂｐの領域であることを決定した。
【００１３】
次に、ａｓ２−１変異体のこの領域のＤＮＡのＰＣＲ−ＲＦＬＰ解析を行い、　配列を決定した。ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１５に相当するＯＲＦにおいて、１３ｂｐの欠失を見い出した。さらに、本発明者らは、ａｓ２−２、ａｓ２−４、及びａｓ２−５のような利用可能なその他の対立遺伝子がすべてこのＯＲＦにおいて突然変異を持っていることを見い出した（詳細は、後述する図２Ａなどを参照のこと。）。ＯＲＦ１５における突然変異がａｓ２の表現型に関与しているかどうかを確定するために、本発明者らは、ＯＲＦ１５すべてを含んでいる野生型ゲノムのＡｐａＩ−ＨｐａＩ断片（断片Ｉ；６．１６ｋｂ）を、ａｓ２−１遺伝子が変異している植物（ａｓ２−１植物）に導入した。また、ＯＲＦ１５の上流領域を欠く断片ＩＩ、及びＯＲＦ１５の上流領域とＯＲＦ１５の真ん中から断片Ｉの３’末端までを欠く断片ＩＩＩで、ａｓ２−１植物を形質転換した。この結果、断片Ｉのみがａｓ２の表現型を示した。
図１Ｂは、ａｓ２周辺の染色体領域の拡大図及び相補性解析の結果を示すものであり、ａｓ２のｃＤＮＡの構造をゲノム構造の下に示す。相補性解析に用いた制限断片の構造を、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと表記された水平の線で示す。右側の記号＋及び−はそれぞれ、相当するＤＮＡ断片との相補性試験の正及び負の結果を示す。
ＯＲＦ１５は、３０００Ｄａを超えるタンパク質をコードすることができる断片Ｉにおける唯一のリーディングフレームである。従って、この結果は、ＯＲＦ１５がａｓ２遺伝子に相当することを示している。断片ＩＩがａｓ２の表現型を補完できなかったことは、断片ＩのＡｐａＩとＢｓｕ３６Ｉとの間の領域がａｓ２の発現に必要であることを示していた。
【００１４】
本発明者らは、ＯＲＦ１５に相当するｃＤＮＡクローンを単離した。この塩基配列を配列表の配列番号１に示す。またそのアミノ酸配列を配列番号２に示す。ａｓ２遺伝子のヌクレオチド配列をｃＤＮＡの配列と比較すると、ｍＲＮＡは、５’非翻訳領域にイントロンを２つ含むが、コーディング領域にはイントロンを含まず（図１Ｂ）、さらに、ＡＳ２は、１９９のアミノ酸残基を持つ新規のタンパク質をコードしていた。図２に、ＡＳ２の予想アミノ酸配列を示す。Ｃモチーフにおけるシステインの位置及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基の位置は、それぞれ星印（＊）及び点（・）で示す。種々のａｓ２対立遺伝子における突然変異したアミノ酸残基を野生型の配列の上にイタリック体で示す。
また、図３にａｓ２のドメインの構成及び特有の特徴を示す。ボックスの下でブラケットで示す領域はａｓ２ドメインである。灰色のボックスはＣモチーフを示し、縞のあるボックスはロイシンジッパー様配列を表す。ａｓ２−１、ａｓ２−２、ａｓ２−４及びａｓ２−５の突然変異の部位を示す。ボックスの下の数はアミノ酸残基の位置を示す。
【００１５】
ａｓ２−１とａｓ２−２の対立遺伝子は両方とも、ロイシンジッパー様配列をコードする配列の上流の同じ部位に１３ｂｐの欠失を有している。この欠失によって、ＡＳ２のカルボキシル末端（Ｃ−末端）側のほとんどを欠くが、追加の１３アミノ酸残基を含む短いポリペプチドを生じるはずである（図２参照）。ａｓ２−４変異体では、ＡＳ２のＣ−末端側に相当するコーディング領域の真ん中に１ｂｐの欠失があり、これによってＡＳ２のＣ−末端４８アミノ酸残基で新しい６３残基による置き換えを生じるフレームシフト突然変異が起きていた（図２参照）。ａｓ２−５変異体では、タンパク質のアミノ末端（Ｎ−末端）側のコーディング領域で単一のグアニンヌクレオチドがアデニンヌクレオチドで置換されており、これによって、４６位においてグルタミン酸残基によるグリシン残基の置換が生じていた（図２参照）。このグリシン残基は、以下に説明するように、ＡＳ２ファミリーのあらゆるメンバーで保存されている。従って、このグリシン残基はＡＳ２の機能にとって必須である。
【００１６】
次に、ＡＳ２及びその関連タンパク質の構造的な特徴を調べた。
予想されるＡＳ２タンパク質は、８１番目の残基から１０９番目の残基までのロイシンジッパー様配列を含んでおり、それには、６残基の間隔と共に、バリン、イソロイシン及びロイシンのような疎水性アミノ酸残基の５回の反復が含まれていた（図２参照）。データベース検索によれば、ＡＳ２のＮ−末端側は、シロイヌナズナ及びその他の植物種（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（イネ）、Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（ダイズ）、Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）など）の仮説遺伝子及びＥＳＴによってコードされる多数の推定上のＮ−末端側に、アミノ酸配列という点で類似していることが判った（図２Ｂ）。シロイヌナズナの配列に関する公的データベースには、ＡＳ２のＮ−末端側に関係するＮ−末端を持つタンパク質をコードしていると予想されるＯＲＦは少なくとも４１あった。このようなタンパク質のうち、数個は、単にかすかにＡＳ２に関係していると思われる（図４参照）。
図４に示すように、推定上のＡＳ２様タンパク質の比較解析によって、Ｃｘ_２Ｃｘ_６Ｃｘ_３Ｃ配列（この場合、ｘは保存的でない残基である；Ｃモチーフと命名した）は、データベース検索及びＡＳ２（ＡＳ２の１０位〜２４位）で同定された４１の予想タンパク質すべてのＮ−末端側において完全に保存されていることが判った。Ｃモチーフ以外にも、ロイシンジッパー様配列も４１のタンパク質のほとんどで強く保存されていた。ＡＳ２を含む半分を超えるタンパク質が以下のような追加の保存的配列を持っていた：Ｃモチーフの中及び周りにおけるＰＣＡＡＣＫＦＬＲＲＫＣｘｘｘＣＶＦＡＰＹＦＰ、Ｃモチーフとロイシンジッパー様配列との間におけるＦＡｘＶＨＫＶＦＧＡＳＮＶｘＫＬＬ、及びロイシンジッパー様配列の周りにおけるＲｘｘＡＶｘＳＬｘＹＥＡｘＡＲｘＲＤＰＶＹＧＣＶＧｘＩＳｘＬＱｘＱＬ（Ｖ又はＩ）ｘｘＬＱｘｘＬｘｘｘｘｘｘＬ（Ｖ又はＩ）（図４参照）。ＡＳ２のＮ−末端におけるアミノ酸配列の強い保存にもかかわらず、ＡＳ２のＣ−末端領域のアミノ酸配列は、その他のＡＳ２様タンパク質及びデータベースにおけるその他のタンパク質の配列とは異なっていた（図３参照）。
【００１７】
ＡＳ２では、Ｎ−末端配列は、Ｃモチーフとロイシンジッパー様配列を特徴としている。本発明者らは、この特徴的な領域をＡＳ２ドメインと呼び、このドメインを含むタンパク質をＡＳ２ファミリーのメンバーと呼ぶことにした。この命名法によれば、シロイヌナズナのゲノムは、ＡＳ２ファミリーに属するタンパク質をコードする可能性のあるＯＲＦを４２含んでいることになる。図４に示すように、この遺伝子及びＡＳ２に似た４１のタンパク質の推定上の遺伝子に対してａｓ２様遺伝子（ＡＳＬ）という命名を付し、このような遺伝子にそれぞれ１〜４１の番号を付けた。このような遺伝子のｃＤＮＡの一部のヌクレオチド配列はジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースに提出され、スアイ（Ｓｈｕａｉ　Ｂ．）及びシュプリンガー（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ、Ｐ．Ｓ）（２００１年、表２参照）によってＬＯＢ及びＬＢＤと命名された。
【００１８】
図４に、ＡＳ２ファミリーメンバーにおけるＡＳ２ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。ＡＳ２ファミリーのメンバー（ＡＳＬと呼ぶ、）の相当する領域の配列と共に、ＡＳ２の８番目から１０９番目の残基を並べる。２０を超えるメンバーで保存されているアミノ酸残基を黒色背景上の白色文字で示す。Ｃモチーフにおけるコンセンサス配列及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基は、それぞれ星印（＊）及び点（・）で示す。ファミリーのメンバーすべてで保存されており、ａｓ２−５対立遺伝子で突然変異していたグリシン残基は星印２つ（＊＊）で示す。シロイヌナズナのＡＳ２ファミリーのメンバーは２つのクラス（クラスＩ及びクラスＩＩ）に分割することができる。クラスＩＩの３を超えるメンバーで保存されていたアミノ酸残基を灰色で示す。多の植物における、Ｏ．ｓ．はＯｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（イネ）を示し、Ｇ．ｍ．はＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（ダイズ）を示し、及びＬ．ｅ．はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）をそれぞれ示す。
【００１９】
これらのＡＳ２ファミリーのメンバーは少なくとも２つのクラス、クラスＩ及びクラスＩＩに分けることができる（図４参照）。クラスＩは、ＡＳ２及び３５のタンパク質（ＡＳＬ１〜ＡＳＬ３５）から成り、Ｃモチーフ、ロイシンジッパー様配列及び上記で述べた主要な保存された残基のほとんどを含む。クラスＩＩは６つのタンパク質（ＡＳＬ３６〜ＡＳＬ４１）から成る。　このようなタンパク質は、Ｃモチーフ及び不完全なロイシンジッパー様配列を含み、その中では、４番目の疎水性残基が欠損しており、ＡＳ２ドメインにはさらに弱くしか保存されていない。その上、このクラスではクラスＩＩのあらゆるメンバーの間でほとんどのアミノ酸配列が保存されており、各タンパク質において僅かな残基が異なっているに過ぎない。
図５に、検索されたシロイヌナズナのＡＳ２ファミリータンパク質の４２メンバーに関する系統樹を示す。分枝上の数は、ＰｒｏｔＭＬプログラムで計算された、そこにおけるブーツストラップ値を表す。各水平の枝の長さは、概算された進化上の距離に比例するように作製されている。右側の区分は、ＡＳ２ファミリーのメンバーの分類を示す。
図５に示すように、クラスＩＩはクラスＩからは離れて関係しているにすぎないことが系統樹により裏付けられ、クラスＩのメンバーは、クラスＩａ及びクラスＩｂと命名されたサブクラスにさらに分割することができ、配列の保存性は弱いが、完全なロイシンジッパー様配列を持っていることが示された。
【００２０】
次に、本発明者らは、野生型植物においてａｓ２転写物の蓄積部位を調べた。１２日令の植物の根、子葉、葉、及び茎頂、２８日令の植物の花芽、３５日令の植物のロゼット葉、茎上の葉、花の茎及び長角果からポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製し、次いで、ＲＮＡ試料でプローブとしてａｓ２のｃＤＮＡを用いたノーザンブロット解析を行った。結果を図６に図面に代わる写真で示す。図６はシロイヌナズナの種々の器官のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す。１２日令植物の根（レーン１）、子葉（レーン２）、葉（レーン３）、及び茎頂（レーン４）、２８日令植物の花芽（レーン５）、及び３５日令植物のロゼット葉（レーン６）、茎上葉（レーン７）、花の茎（レーン８）及び長角果（レーン９）から等量の１．０μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。同じブロットを対照としてΕφ−チューブリン（ＴＵＢＡ）をプローブとして調べた。右側の数はマーカーＲＮＡ分子の大きさを示す。
ａｓ２の転写物は、花の茎を除いて解析した試料のすべてで検出された（図６参照）。ａｓ２転写物のレベルは、小さな発生途上の葉が含まれる茎頂の試料で最も高かった。このようなデータは、ａｓ２突然変異は、子葉、ロゼット葉、茎上の葉、萼片及び花弁のようなあらゆる葉様の器官における変異体の表現型として明白であるが、茎にはないという以前の観察と一致している（非特許文献２３参照）。しかしながら、ａｓ２転写物は根で検出されたが、ａｓ２植物の根は野生型の根と似ていた。
【００２１】
本発明者らは、プローブとしてａｓ２のｃＤＮＡを用いたインスート（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法によって胚発生過程におけるａｓ２の発現部位についても調べた。結果を図７に図面に代わる写真で示す。図７は、インスート（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法によるａｓ２転写物の検出（ａ〜ｄ）結果を示す。アンチセンスプローブで得られたａｓ２転写物の分布パターンである。図７の（ａ）は球状ステージ；（ｂ）は三角ステージ；（ｃ）はハート型ステージ；（ｄ）は魚雷型ステージ；（ｅ）は（ａ）〜（ｄ）のセンス対照パネルを示す。種皮の真下の細胞層の赤味がかった茶色の着色（白色の星印で示す）は、両方のプローブで生じるのでａｓ２のＲＮＡに特異的ではない。図７の縮尺棒は２０μｍを示す。
球状ステージの胚では、ａｓ２の転写物はすべての細胞で検出された（図７参照）。三角の胚の上部にて膨らみが形成されるにつれて、ａｓ２の転写物は、胚の最上層領域に蓄積した（図７（ｂ）参照）。ハート型ステージから魚雷型ステージまで、子葉原基の向軸性側での原表皮細胞でシグナルを検出した（図７（ｃ）、（ｄ）参照）。ウォーキング−スティックステージの後、ａｓ２転写物の蓄積は、特定の領域に明瞭に濃縮されることなく、子葉原基の至るところで検出された（データは示さず）。発芽の後、茎頂のメリステムの周り、葉の原基及び成熟した葉においてインスート（ｉｎ　ｓｉｔｕ）では特異的なハイブリッドの形成のシグナルは検出されなかった。しかしながら、ａｓ２転写物の蓄積は、ノーザンブロットで確認された（図６参照）。
【００２２】
次に、ＡＳ２の核内への局在について調べた。予想されたＡＳ２タンパク質は核内への明瞭な局在シグナル（ＮＬＳ）を含んでいない（図２参照）。
本発明者らは、ＡＳ２が植物細胞の核に局在するかどうかを確定するために、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモータ（３５Ｓ：：ａｓ２：：ＧＦＰ）の制御下での転写とともに、ａｓ２ｃＤＮＡを緑色蛍光タンパク（ＧＦＰ）のＤＮＡに結合した融合コンストラクトを作製した。この融合コンストラクトを粒子衝撃法によってタマネギの上皮細胞に導入し、ＧＦＰによる蛍光をモニターした。結果を図８に図面に代わる写真で示す。図８は、タマネギの上皮細胞におけるａｓ２：：ＧＦＰの細胞小器官の局在をモニターした結果を示す。図８のＡ及びＢは３５Ｓ：：ａｓ２：：ＧＦＰの場合を示し、図８のＣ及びＤは３５Ｓ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰの場合を示し、図８のＥ及びＦは３５Ｓ：：ＧＦＰの場合を示す。それぞれの遺伝子を衝撃によってタマネギの上皮細胞に導入し、導入した組織を２８℃にて１６時間培養した。蛍光顕微鏡下で蛍光をモニターした（左側のパネル（図８のＡ、Ｃ及びＥ）。また、１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで染色した核を右側のパネル（図８のＢ、Ｄ及びＦ）に示す。図８の各縮尺棒は１００μｍを示す。
図８に示すように、ａｓ２−ＧＦＰによる蛍光シグナルは、ＳＶ４０のＮＬＳによって調製されたＮＬＳ−ＧＦＰによる類似のシグナル同様に主として核内にて検出された（図８Ａ、Ｃ）。３５Ｓ：：ＧＦＰのコンストラクトをタマネギ細胞に導入した場合、ＧＦＰによるシグナルは核及び細胞質の双方で検出された（図８Ｅ）。このような結果は、ＡＳ２が核内タンパクであることを示している。
【００２３】
次に、本発明者らは、ＡＳ２を過剰に生産するシロイヌナズナ植物の表現型を調べた。３５Ｓプロモータにａｓ２ｃＤＮＡを結合させ（３５Ｓ：ａｓ２）、ａｓ２を過剰に発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ植物を作出した。結果を図９に図面に代わる写真で示す。図９のＡは、空のベクターｐＳＫ１（ａ）及びｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２（ｂ）により形質転換したＣｏｌ−０由来の根断片をインキュベートし、インキュベートを開始後２１日目に写真撮影した結果を示す。図９Ａの縮尺棒は１０ｍｍを示す。図９のＢは、トランスジェニックしたシロイヌナズナ植物の表現型を示す。図９Ｂの（ａ）は空のベクターｐＳＫ１で形質転換した３５日令の植物の場合を示し、（ｂ）はｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２で形質転換した３５日令の植物の場合を示し、（ｃ）はｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２で形質転換した２５日令の植物の場合を示し、（ｄ）は（ｃ）の植物をさらに１５日間成長させた場合を示す。図９Ｂの縮尺棒は１０ｍｍを示す。図９Ｃは、トランスジェニック植物及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）におけるａｓ２遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。ＲＴ−ＰＣＲのサイクル数をそれぞれのパネルの右側に示す。増幅したＤＮＡ断片をアガロースゲル上の電気泳動で分画し、臭化エチジウムで染色して視覚化した。レーン１は図９Ｂの（ｄ）に示されるトランスジェニック植物の場合を示し、レーン２は野生型（Ｃｏｌ−０）植物の場合を示す。ａｓ２転写物のオープンリーディングフレームの領域に特異的なプライマーで増幅した産物（ａ；ＯＲＦ）、ａｓ２転写物の３’非翻訳領域に特異的なプライマーで増幅した産物（ｂ；ＵＴＲ）、及びα−チューブリンに対する遺伝子の転写産物に特異的なプライマーで増幅した産物（ｃ；α−ｔｕｂｕｌｉｎ）を示す。図９Ｄは、それぞれの葉の表現型を示す。（ａ）は典型的な３５日令の野生型Ｃｏｌ−０植物の場合を示し、（ｂ）はａｓ２−１植物の５番目の葉を示す。軽い表現型の変化（ｃ）及び厳しい表現型の変化（ｄ）を示すトランスジェニック植物の典型的な葉を示す。後者の葉の位置は決定することができなかった。図９Ｄの縮尺棒は５ｍｍを示す。
【００２４】
この予備実験のデータは、形質転換したシュート（ｓｈｏｏｔ）を作出するのは困難であることを明示していた（図９Ａ）。従って、本発明者らは先ず、従来の根形質転換法により形質転換されたシュートのおよその作出効率を確定した。
形質転換について、用いた根の数当りの形質転換された緑色カルス、再生されたシュート（ｓｈｏｏｔ）、及び花の茎を伴うシュート（ｓｈｏｏｔ）の数を数えた。結果を次の表１に示す。
【００２５】
【表１】

【００２６】
表１中のカッコ（）内の数値は、根当たりの形質転換体の平均数を示す。
表１は、３５Ｓ：ａｓ２を根組織に導入した場合の緑色カルスの形成効率は、空のベクタープラスミド、ｐＳＫ１を形質転換に用いた場合よりも低いことを示している。トランスジェニックシュート及び花の茎を伴うシュートの再生効率は、５倍〜１０倍低い（表１参照）。
このようなデータは、ａｓ２ｃＤＮＡの過剰発現は、緑色組織における細胞増殖及び／又はシュートの再生に抑制効果を持つことを示した。
ａｓ２ｃＤＮＡを過剰発現する２つのトランスジェニック株を得た。このｃＤＮＡに由来するａｓ２転写物がさらに厳しい表現型を示すトランスジェニック株の１つに蓄積されていることを確認した（図９Ｃ参照）。トランスジェニック植物の１つの株は、軽い矮性の表現型を持ち、上向きに巻いた葉を生じた（図９Ｂの（ｂ）参照）。トランスジェニック植物のもう１つの株は、さらに厳しい異常な表現型を伴っており、植物成長の早期ステージで極めて狭い葉身を持つ葉を生じた（図９Ｂの（ｃ）、及び図９Ｄの（ｃ）参照）。この葉身は広がることができず、竿状の葉を生じた（図９Ｂの（ｄ）、及び図９Ｄの（ｄ）参照）。
【００２７】
以上のことから、ＡＳ２における機能的ドメインを考察した。
ａｓ２遺伝子は、そのＮ−末端側にＣモチーフ（Ｃｘ_２Ｃｘ_６Ｃｘ_３Ｃとして定義される）及びロイシンジッパー様配列を含み、そのＣ−末端側に明らかに独特な配列を含む１９９のアミノ酸残基の新規タンパク質をコードすると思われる（図２、図３参照）。ロイシンジッパー配列がタンパク質−タンパク質の相互作用に関与することは一般的に受け入れられており、ａｓ２のロイシンジッパー様配列は、ＡＳ２といくつかのそのほかのタンパク質との会合に役割を担っている可能性があると考えられる。そのような相互作用がＡＳ２の作用に必須かも知れない。
Ｃモチーフは本発明で初めて同定されたが、それはむしろ、一般にＣｘ_２〜３Ｃｘ_ｎＣｘ_２〜３Ｃ（ｎ＞１２）のコンセンサス配列を持ち、その他の巨大分子との相互作用で機能するジンクフィンガーに似ている（Ｐａｖｌｅｔｉｃｈ，　Ｎ．Ｐ．　ａｎｄ　Ｐａｂｏ，　Ｃ．Ｏ．　（１９９１）　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２５２　：８０９−８１７、　Ｗａｎｇ，　Ｊ．Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　（１９９８）　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　９：５４３−５５３）。Ｃモチーフもまた、例えば、ＤＮＡやタンパク質、特にＡＳ１のようなその他の巨大分子との会合に関与しているのはありそうなことである。ＡＳ２の機能を完全に解明するには、ＡＳ２が相互作用する分子の同定及び性状分析がさらに必要である。
【００２８】
ＡＳ２のＣ−末端側の配列は、既知のモチーフを含む（図３参照）データベースのどのタンパク質の配列とも異なっている。ａｓ２−４対立遺伝子はこの領域にフレームシフト突然変異を持っていたが、この対立遺伝子による表現型は、他のａｓ２対立遺伝子による表現型に似ているので、Ｃ−末端側は、新しく特徴付けられたＡＳ２ドメインを含むＮ−末端側以外のＡＳ２の機能に必須であると考えられる。
【００２９】
ａｓ１及びａｓ２の双方共、クラスＩｋｎｏｘホメオボックス遺伝子の発現を抑制するが、そのような抑制が直接的に又は間接的にａｓ１及びａｓ２に起因するのかどうかは明らかではない。本発明者らは本発明により、他の未だ同定されていない核内タンパク質との相互作用を介して核におけるクラスＩのｋｎｏｘ遺伝子の抑制に関与するタンパク質に対して予想されるように、ａｓ２：ＧＦＰ融合タンパクが植物細胞の核に局在することを明らかにした（図８参照）。ａｓ１：ＧＦＰ融合タンパクも核内に局在していた（未発表データ）。このような所見は、ａｓ１はａｓ２が核において相互作用する分子の１つであるという仮説に矛盾しない。
ａｓ２ｃＤＮＡの過剰発現によって上向きに巻いた葉及び子葉が誘導された（図９参照）。それに対して、ａｓ２の機能欠損突然変異では、下向きに巻いた葉及び子葉を生じた（非特許文献２３参照）。従って、ａｓ２は、葉身における向軸性ドメインの成長の抑制又は背軸性ドメインの成長の刺激に関与している。形質転換（図９Ｂ参照）及び胚の子葉原基における向軸性ドメインでのａｓ２の発現（図７参照）の際に、成長抑制効果が認められたことを考慮すれば、ａｓ２は向軸性ドメインの抑制に機能していると推測することができる。そのような抑制が、細胞の増殖又は伸長の阻害を介して成し遂げられるのかどうかを調べるのは興味深いであろう。
分子レベルでのＡＳ２活性の詳細がどうであれ、過剰発現に関する本発明及びａｓ２突然変異の葉に関する以前の研究は、ＡＳ２が葉の対称性と同様に平坦な葉身の拡張に関与していることを示している。葉のドメインの向軸性−背軸性の運命に関与する遺伝子における突然変異は、葉の運命の決定を妨害し、竿型の葉の形成を誘発することが多い。ａｓ２とこのような遺伝子の間に関係があるのかも知れない。このような背景で、ａｓ１の機能がＰＨＡＮの機能に類似するかどうかを調べることが残されているものの、ａｓ１がＰＨＡＮのシロイヌナズナにおけるホモログであることは注目に値する。
【００３０】
次にＡＳＬタンパクの機能について考察してみる。
ＡＳ２様タンパク質のＮ−末端側におけるアミノ酸配列の保存性によって、結果として、このようなタンパク質が、ＡＳ２ファミリーと呼ばれる植物タンパクの新しいファミリーを形成していることを示した。ａｓ２の発現を伴うこのファミリーのメンバーであるシロイヌナズナのタンパク質をＡＳＬ（ＡＳ２様）タンパクと命名した（図４参照）。アミノ酸配列における類似性及びＡＳＬのＡＳ２ドメインの系統樹は、ＡＳＬタンパクが、サブクラス、クラスＩａとクラスＩｂを持つクラスＩ及びクラスＩＩに分割できることを示した（図２、及び図５参照）。
ａｓ２の発現を伴うＡＳ２ファミリーメンバーの機能を同定することが残されたままであるが、ＡＳ２は、対称で、平坦で丸い葉身の形成及び明瞭な主脈を含む葉脈パターンの確立に必要とされる多であることが判明した。さらに、ａｓ２はａｓ１と共に作用して、クラスＩｋｎｏｘホメオボックス遺伝子の発現を抑制する能力を持つ。ＡＳ２ドメインにおける保存的なグリシン残基のグルタミン酸残基による置換は、変異体の表現型を生じるので（図２〜図４参照）、ＡＳ２ドメインと同様にこの残基がＡＳ２の機能で重要な役割を担っていることは明らかである。クラスＩａのメンバーの一部はＡＳ２ドメインのアミノ酸配列に強い保存を示すが（例えば、ＡＳＬ１とＡＳＬ２）、ＡＳ２の機能には、Ｎ−末端側ＡＳ２ドメイン以外に独特であるＣ−末端領域が必要とされるので、それらは異なった機能を持つ可能性がある。このような密接に関係するＡＳＬの役割に関する明瞭な見識にはさらなる遺伝的及び分子的実験が必要であろう。
【００３１】
最近、ＡＳＬ４に対する遺伝子に相当するＬＯＢ遺伝子（受入番号ＡＦ４４７８９７）が、通常メリステムと器官原基との境界に発現されるが、ａｓ１では存在せず、ａｓ２でも激減することが提言されたているが、ＬＯＢ遺伝子の発生上の役割が未だ確定されていない。
クラスＩＩを構成する６つのＡＳＬは、クラスＩとは異なる特徴的な構造の特性を持っており（図４参照）、そのアミノ酸配列は互いに極めて類似している。　このような遺伝子の発現が報告された（表２参照）ということは、それらが機能的遺伝子であることを示唆している。従って、クラスＩＩのメンバーはシロイヌナズナの発生途上で異なった役割を担っている可能性があると考えられる。
【００３２】
本発明で報告したヌクレオチド及びアミノ酸の配列に関するジーンバンクの受入番号は以下のとおりである。ＡＳ２（ＡＢ０８０８０２）；及びＢＡＣｓＦ５Ｉ１４（ＡＣ００１２２９）、Ｆ１Ｅ２２（ＡＣ００７２３４）、及びＦ１２Ｐ１９（ＡＣ００９５１３）。シロイヌナズナのＡＳ２ファミリータンパク質のメンバーに関する情報を次の表２に要約する。
【００３３】
【表２】

【００３４】
表２中のＢＡＣコード及び遺伝子コードはＴＡＩＲデータベースから得たものであり、ＥＳＴ　ＩＤはＥＭＢＬデータベースから得たものである。表２の中のいくつかのＡＳＬタンパク質は、ＬＯＢドメイン（ＬＢＤ）タンパク質として既にジーンバンクに提出されたものである。
【００３５】
本発明は、新規な植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２を提供するものである。本発明のタンパク質ＡＳ２は配列表の配列番号２に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましいがこれに限定されるものではない。本発明のタンパク質は、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御できる機能を有するものであり、タンパク質のアミノ酸配列としてはシステインに富むＣ‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とするものである。本発明のタンパク質のＣ−モチーフとしては、好ましくはＣｘ_２Ｃｘ_６Ｃｘ_３Ｃ（Ｃはシステインを示し、ｘは任意のアミノ酸を示す。）のアミノ酸配列を有するもの、より具体的なアミノ酸配列としてはＣモチーフの中及び周りにおけるＰＣＡＡＣＫＦＬＲＲＫＣｘｘｘＣＶＦＡＰＹＦＰ（アルファベットはアミノ酸の１文字表記を示し、ｘは任意のアミノ酸を示す。）のアミノ酸配列が挙げられる。また、ロイシンジッパー様モチーフとしては、好ましくはＲｘｘＡＶｘＳＬｘＹＥＡｘＡＲｘＲＤＰＶＹＧＣＶＧｘＩＳｘＬＱｘＱＬ（Ｖ又はＩ）ｘｘＬＱｘｘＬｘｘｘｘｘｘＬ（Ｖ又はＩ）（アルファベットはアミノ酸の１文字表記を示し、ｘは任意のアミノ酸を示す。）のアミノ酸配列を例示することができる。さらに、Ｃモチーフとロイシンジッパー様配列との間における好ましいアミノ酸配列としてはＦＡｘＶＨＫＶＦＧＡＳＮＶｘＫＬＬ（アルファベットはアミノ酸の１文字表記を示し、ｘは任意のアミノ酸を示す。）が挙げられ、この中のＧ（グリシン）は必要な配列である。
したがって、例えば、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質においては、Ｃ−モチーフやロイシンジッパー様モチーフなどやグリシン位置が保存され、植物の葉の形成に関連する機能を有するものである限りにおいては、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の１個又は２個以上、好ましくは１〜５０個のアミノ酸が任意に置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質ＡＳ２を提供するものである。本発明の好ましいタンパク質としては前記で説明してきたようなＡＳ２ファミリーに属するアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられる。
【００３６】
また、本発明は前記した本発明の植物の葉形成関連タンパク質のいずれかをコードするＤＮＡを提供するものである。本発明のＤＮＡは１本鎖であっても２本鎖のものであってもよく、細胞内において前記した本発明の植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２を産生できるものであれよい。また、本発明のＤＮＡは必要によりＲＮＡの形態であってもよい。本発明のＤＮＡの例示として、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するＤＮＡなどが挙げられる。
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ単独であってもよいが、適当なプラスミドなどからなるベクターに組み込まれたものであってもよい。したがって、本発明は、前記した本発明のＤＮＡを含有してなるベクターを提供するものである。
【００３７】
本発明のタンパク質ＡＳ２は植物、好ましくはシロイロナズナの葉の形成に関連するものであり、正常な葉の形成を制御することができる。従って、本発明は前記した本発明のタンパク質ＡＳ２を含有してなる植物の葉の形成を制御するための組成物、又は制御剤を提供するものである。また、本発明のタンパク質の使用に代えて必要に応じて、前記した本発明のＤＮＡを使用することができる。したがって、本発明は、前記した本発明のＤＮＡからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、または制御用の組成物、又は制御剤を提供するものである。
【００３８】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、植物の分析については、種子を土壌に播いて、４℃にて暗所で２日後、２２℃にて１６時間３０００ルクスの白色光照明の条件に植物を移した。植物の日齢は、播種後の日数という観点で提供した。
ａｓ２−５対立遺伝子は、リールシーズ（米国テキサス州、ラウンドロック）から購入したエチルメタンスルホネートで変異誘発したＬｅｒ−０の種子のＭ２集団から単離した。トランスジェニック株、＃１４−２２．４．４Ｗ３（Ｔ−１２００）及び＃１４−６８．１．４（Ｔ−１７００）は、（Ｉ−ＲＳ／ｄＡｃ−Ｉ−ＲＳ）＃１４株から単離した。それらは、ハイグロマイシン　ホスホトランスフェラーゼに対する遺伝子を含む転移ｄＡｃ−Ｉ−ＲＳ因子（受入番号ＡＢ０５５０６４）を持っていた。＃１４−２２．４．４Ｗ３（Ｔ−１２００）及び＃１４−６８．１．４（Ｔ−１７００）の背景は、両者共にＬｅｒエコタイプであった。
【００３９】
実施例１　（ａｓ２遺伝子のクローニング）
減数***組換え休止点を作成し、ａｓ２−１突然変異と隣接するトランスポゾンマーカー＃１４−６８．１．４（Ｔ−１７００）及び＃１４−２２．４．４Ｗ３（Ｔ−１２００）との間の組換えをスクリーニングすることによって、ａｓ２遺伝子の近傍で同定した。ハイグロマイシン耐性を示し、ａｓ２−１の表現型を持つ、このような組換え体を用いて、ａｓ２遺伝子に関するＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーの地図上の位置決めを行った。ＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーとして用いた配列に関する情報は、ペンシルベニア大学、ＴＡＩＲウエブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／）におけるシロイヌナズナゲノムセンターのウエブサイトから入手し、ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４（ジーンバンク受入番号ＡＣ００１２２９）のＰＣＲ−ＲＦＬＰマーカーのヌクレオチド配列は以下のとおりである：
マーカー１については、
５’−ＴＧＴＡＡＣＴＣＴＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＴＴＧ−３’及び
５’−ＧＣＡＡＡＧＴＣＣＡＴＡＧＡＧＧＡＧＣＡＡＧ−３’、
マーカー２については、
５’−ＴＴＧＧＧＴＴＴＧＣＡＣＣＧＡＡＡＣＴＣＡＧ−３’及び
５’−ＡＧＴＧＡＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＡＧ−３’、
マーカー３については、
５’−ＴＧＧＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＣＴＴＴＧＴＧＡＧ−３’及び
５’−ＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＣＡＣＴＣＴＴＣＴＣ−３’、
マーカー４については、
５’−ＡＧＡＡＡＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＴＣＧＧＧＡＣ−３’及び
５’−ＴＣＣＡＡＡＧＣＡＣＴＣＴＣＴＡＧＣＴＴＧＧ−３’
である（図１参照）。
【００４０】
実施例２　（相補性解析）
相補性実験に関する二成分プラスミドを構築するために、６．１６ｋｂｐのＡｐａＩ−ＨｐａＩ断片（図１における断片Ｉ）、４．７５ｋｂｐのＢｓｕ３６Ｉ−ＨｐａＩ断片（図１断片ＩＩ）及び２．２ｋｂｐのＢｓｕ３６Ｉ−ＢｇｌＩＩ断片（図１の断片ＩＩＩ）を、ｐＢＩ１０１（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，　Ｒ．Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９８７）ＥＭＢＯ　Ｊ．　６：３９０１−３９０７）に由来し、１’プロモータ：：バー（Ｙｏｓｈｉｏｋａ，　Ｙ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｇｎｅｓｅ．　Ｇｅｎｅｔ．　Ｓｙｓｔ．　７６：１８９−１９８）を含むｐＢＩ−ＢＡＲプラスミドに別々に挿入した。新しく構築したプラスミドをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）株、ＧＶ３１０１に導入した。次いで、別に記載するように（Ｃｌｏｕｇｈ，　Ｓ．Ｊ．　ａｎｄ　Ｂｅｎｔ，　Ａ．Ｆ．　（１９９８）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　１６：７３５−７４３、　Ｇａｌｂｉａｔｉ，Ｍ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｆｕｎｃｔ．　Ｉｎｔｅｇｒ．　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ１：２５−３４）、吸引浸潤により植物全体を形質転換した。０．０１％のバスタ（Ｂａｓｔａ）（ドイツ、フランクフルト、ＡｇｒｏＥｖｏ）を含む土壌にてトランスジェニック植物を選抜したが、それは、どの遺伝子型のトランスジェニック植物をサザンブロットで解析したかということである。
【００４１】
実施例３　（ｃＤＮＡのクローニング）
１６日令の植物からポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。逆転写ＰＣＲのために、ｃＤＮＡの第１の鎖は、浜田らの方法（Ｈａｍａｄａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２０００）　Ｐｌａｎｔ　Ｊ．　２４：９１−１０１）に準じて作成した。次いで、プライマー、
ＯＲＦ１５ＳＦ（５’−ＧＧＧＴＣＧＡＣＡＴＧＧＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＣ−３’）及び
ＯＲＦ１５ＮＲ（５’−ＧＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＧＣ−３’）
によりａｓ２のｃＤＮＡを増幅した。次いで増幅した断片をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）（米国カリフォルニア州、ラホヤのストラタジーン）のＳａｌＴ／ＮｏｔＩ部位に連結し、ヌクレオチドの配列決定によって同一性を確認した。ｃＤＮＡの５’末端配列は、プライマー、ＯＲＦ１５ＭＲ（５’−ＴＡＴＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧ−３’）を伴った５’−ＲＡＣＥ及びアダプタプライマーにより決定した。ｃＤＮＡの３’末端配列は、プライマー、ＯＲＦ１５ＭＦ（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＡＴＣＴＧＡＧＣ−３’）を伴った３’−ＲＡＣＥ及びアダプタプライマーにより決定した。突然変異対立遺伝子（ａｓ２−１、ａｓ２−２、ａｓ２−４及びａｓ２−５）のヌクレオチド配列は、各変異体のゲノムＤＮＡからａｓ２遺伝子領域を増幅することによって決定した。各変異植物から単離されていたポリ（Ａ）^＋ＲＮＡから得たａｓ２のｃＤＮＡのヌクレオチド配列も決定した。
【００４２】
実施例４　（系統樹解析）
ＴＡＩＲ　ＢＬＡＳＴの２．０バージョンのプログラムを用いて（ｈｔｔｐ：／／ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ．ｏｒｇ／Ｂｌａｓｔ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）、ＴＡＩＲでのＡＧＩデータセット（ＡＧＩ、全ゲノムからのタンパク質）からａｓ２に類似したシロイヌナズナの遺伝子を入手した。ゲノムネットブラストＴ２プログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌａｓｔ．ｇｅｎｏｍｅ．ａｄ．ｊｐ／）を用いて、ゲノムネットにおけるデータセットからその他の植物種のａｓ２様遺伝子を入手した。ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗのバージョン１．８（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，　Ｊ．Ｄ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９４）　Ｎｕｃｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｒｅｓ．　２２：４６７３−４６８０）を用いてシロイヌナズナのＡＳ２ファミリーの４２メンバーのＡＳ２ドメインの配列を並べた。最尤（ＭＬ）系統樹の構築のために、部分的再構成検索のために出発系統樹として近隣連結（ＮＪ）系統樹を用いた。ＭＯＬＰＨＹのバージョン２．３ｂ３パッケージにおけるＮＪｄｉｓｔ及びｐｒｏｔＭＬプログラムを用いた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｓｍ．ａｃ．ｊｐ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｓｍｌｉｂ／ｓｏｆｔｏｔｈｅｒ．ｈｔｍ＃ｍｏｌｐｈｙ；Ａｄａｃｈｉ，　Ｊ．　ａｎｄ　Ｈａｓｅｇａｗａ，　Ｍ．　（１９９６）　Ｃｏｍｐｕｔ．　Ｓｃｉ．　Ｍｏｎｏｇｒ．　２８：１−１５０）。ＮＪｄｉｓｔからＮＪ系統樹を得て、ＰｒｏｔＭＬからＭＬ系統樹を得た。
それぞれの分枝の部分的なブートストラップ確率は、ＰｒｏｔＭＬプログラムを用いて概算した（Ｈｉｍｉ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｊ．　Ｍｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　５３：３８７−３９３、　Ｓａｋａｋｉｂａｒａ，　Ｋ．，　ｅｔ　ａｌ．，　（２００１）　Ｍｏｌ．　Ｂｉｏｌ．　Ｅｖｏｌ．　１８：４９１−５０２）。
【００４３】
実施例５　（ＲＮＡのゲルブロット解析）
Ｃｏｌ−０野生型植物の解析のために、１２日令の植物から採取した根、子葉、葉、及び茎頂、２８日令植物から採取した花芽、及び３５日令植物から採取したロゼット葉、茎上葉、花の茎及び長角果を用いた。等量の１．０ｍｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを単離し、ノーザンブロットを行った。ａｓ２に対する部分的ｃＤＮＡをプローブとして用いた。
プライマー１（５’−ＧＡＴＣＴＣＡＧＣＴＧＴＧＣＴＡＡＡＴＣ−３’）及び
プライマー２（５’−ＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣ−３’）
を用いてＰＣＲによりそれを増幅し、ＰＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ（−）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。ヌクレオチドの配列決定によりその同一性を確認した。ＯＲＦのコドン１５１からコドン２００を伸長したプラスミドｐａｓ２ｃ３００をＥｃｏＲＩとＣｌａＩで切断することにより作成された、停止コドンを持つ３００ｂｐの断片をハイプライムＤＮＡラベリングキット（ドイツ、マンハイムのベーリンガーマンハイム）を用いて、製造元の指示書に従って、［α−^３２Ｐ］ｄＣＴＰで標識した。この標識した断片をプローブとして用いた。
【００４４】
実施例６　（インスート（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法）
植物の固定、パラフィン包埋及びｉｎ　ｓｉｔｕハイブリッド形成のために用いた方法の詳細は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｗｉｓｃ．ｅｄｕ／ＣＡＴＧ／ｂａｒｔｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌで見い出すことができ、中西らの方法（Ｎａｋａｓｈｉｍａ，　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ（１９９８）Ｐｌａｎｔ　ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．　３９：６９０−７００）に準じて行った。ミクロトーム（日本の東京のエルマ社）を用いて切片（厚さ８μｍ）を作成した。ＣｌａＩでプラスミドｐａｓ２ｃ３００を線状化した後、Ｔ３　ＲＮＡポリメラーゼによりアンチセンスＲＮＡプローブを作成した。センスＲＮＡプローブは、ＥｃｏＲＩでｐａｓ２ｃ３００を線状化した後、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼによって作成した。
【００４５】
実施例７　（プラスミドの構築）
ＣａＭＶ　３５Ｓプロモータの下流の二成分ベクターｐＳＫ１（Ｋｏｊｉｍａ，　Ｓ．，　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）　ＤＮＡ　Ｒｅｓ．　６：４０７−４１０）のＸｂａＩ及びＮｏｔＩ部位にて開始コドンから停止コドンまで伸長したａｓ２ｃＤＮＡ（６００ｂｐ）の断片を挿入することによってプラスミドｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２を構築した。ｐＴＨ−２（Ｃｈｉｕ，　Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．　（１９９６）　Ｃｕｒｒ．　Ｂｉｏｌ．　６：３２５−３３０）のＳａｌＩとＮｃｏＩ部位にて、開始コドンから１９９番目のアミノ酸コドンまで伸長したａｓ２ｃＤＮＡ（５９７ｂｐ）断片及び３つのアラニンリンカー配列（５’ＧＣＡＧＣＴＧＣＣ３’）を挿入することによりプラスミドｐ３５Ｓ：：ａｓ２：：ＧＦＰを構築した。３５Ｓ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰ及び３５Ｓ：：ＧＦＰを含むプラスミドは西浜らの方法（Ｎｉｓｈｉｈａｍａ，　Ｒ．，ｅｔ　ａｌ．　（２００１）　Ｇｅｎｅｓ　Ｄｅｖ．　１５：３５２−３６３）に準じて調製した。
【００４６】
実施例８　（シロイヌナズナの形質転換）
小野内らの方法（Ｏｎｏｕｃｈｉ，　Ｈ．，　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５）　Ｍｏｌ．　Ｇｅｎ．　Ｇｅｎｅｔ．　２４７：６５３−６６０）に準じて、アグロバクテリウムが介在するシロイヌナズナの根外植片の形質転換を行った。ｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２又はｐＳＫ１（Ｋｏｊｉｍａ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９９））を入れたアグロバクテリウムＬＢＡ４４０４／ｐＡＬ４４０４（Ｈｏｅｋｅｍａ，　Ａ．，　ｅｔ　ａｌ．（１９８４）　Ｊ．　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１５８：３８３−３８５）細胞を根外植片と共に培養した。１５ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢ（Ｏｎｏｕｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ．　（１９９５））の存在下、シュート誘導培地で形質転換体を選抜した。プラスミドｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２又はｐＳＫ１を用いてＡ．　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１を形質転換した。次いで、吸引浸潤により植物全体を形質転換した。１５ｍｇ／ＬのハイグロマイシンＢ及び３００ｍｇ／Ｌのカルベニシリンを含むＭＳ培地でトランスジェニック植物を選抜した。
【００４７】
実施例９　（ａｓ２：：ＧＦＰタンパクの細胞小器官局在）
フォンアミムらの方法（ｖｏｎ　Ａｍｉｍ，　Ａ．Ｇ．　ａｎｄ　Ｄｅｎｇ，　Ｘ．Ｗ．　（１９９４）　Ｃｅｌｌ　７９：１０３５−１０４５）に従って、タマネギ球根の上皮層における細胞をｐ３５Ｓ：：ａｓ２：：ＧＦＰ、ｐ３５Ｓ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰ又はｐ３５Ｓ：：ＧＦＰで形質転換した。冷却ＣＣＤカメラシステム（アリゾナ州、トゥーソンのフォトメトリクス）を装備した蛍光顕微鏡（ドイツ製、アキシオプラン２）によって蛍光シグナルを記録した。画像の疑似着色及びＧＦＰからのシグナル量と細胞の幅の測定は、ＩＰラボソフトウエアプログラム（バージニア州フェアファックスのスキャナリティクス）により行った。同一の細胞を１μｇ／ｍＬの４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドールジヒドロクロリド（ＤＡＰＩ）で染色し、同様に蛍光を記録した。
【００４８】
実施例１０　（逆転写−ポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ））
トランスジェニック植物及び野生型の花芽を採取し、直ちに液体窒素中で凍結し、−８０℃に保存した。ポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡの第１鎖を合成した。α−チューブリンｃＤＮＡ特異的なプライマーによるＤＮＡ断片の均等な増幅を行うために試料の体積を正規化した。次いで、セミアルチらの方法（非特許文献２３参照）によりＰＣＲを行った。内因性ａｓ２の転写物に特異的に由来するＤＮＡ断片を増幅するために、ａｓ２転写物の５’及び３’非翻訳領域においてプライマーセットの設計のための部位を選択したが、それらは両方共、トランスジェニック植物を作出するのに用いたｃＤＮＡには存在しない。プライマー対は以下のとおりである：
α−チューブリンについては、
ｐＵ５１（５’−ＧＧＡＣＡＡＧＣＴＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧ−３’）及び
ｐＵ５２（５’−ＣＧＴＣＴＣＣＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣ−３’）、
ａｓ２遺伝子のｃＤＮＡの非翻訳領域については、
ｐＵ７３（５’−ＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＡＡＧＣ−３’）及び
ｐＵ７４（５’−ＣＣＡＡＡＡＣＣＣＴＡＡＡＡＴＣＴＣＡＡＧＡＣＧＧ−３’）、
ａｓ２ｃＤＮＡのオープンリーディングフレームの領域については
ｐＵ３２８（５’−ＧＴＧＴＴＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＡＡＣＧＴ−３’）及び
ｐＵ３１５（５’−ＡＡＡＣＣＴＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＣＡＡＣＡＧＴＡＣＧＧＣＧ−３’）
である。
【００４９】
【発明の効果】
本発明は、核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している新規なタンパク質ＡＳ２、及びそのファミリーを提供するものである。
本発明の植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２は、アミノ酸配列としてシステインに富むＣ‐モチーフからなるシステイン反復配列、特定の位置でのグリシン、及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とするものであり、このような特徴的なアミノ酸配列を有する１群のタンパク質が植物、好ましくはシロイロナズナに存在し、これらのタンパク質が植物の葉形成に関連し、葉の形成を制御していることを本発明は明らかにするものである。したがって、本発明は、これらのタンパク質ＡＳ２からなる植物の葉の形成、成長、保存の制御剤を提供するものである。
【００５０】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、シロイヌナズナの第１染色体のａｓ２遺伝子座を含むゲノムの領域構造及びゲノム断片による相補性解析の結果を示すものである。図１Ａはシロイヌナズナの第１染色体のゲノムの領域構造を示し、Ｔ−１２００及びＴ−１７００は、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇｒ）遺伝子によるｄＡｃ−Ｉ−ＲＳ転移因子の位置を示す。図１Ｂは、ＢＡＣクローンＦ５Ｉ１４、その中のマーカー位置を含むａｓ２周辺の染色体領域の拡大図及び相補性解析の結果を示す。ａｓ２ｃＤＮＡの構造をゲノム構造の下に示す。相補性解析に用いた制限断片は、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩと表記された水平の線で示す。右側の記号＋及び−はそれぞれ、相当するＤＮＡ断片との相補性試験の正及び負の結果を示す。
【図２】図２は、本発明のタンパク質ＡＳ２のアミノ酸配列の例を示す。Ｃモチーフにおけるシステインの位置及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基の位置は、それぞれ星印（＊）及び点（・）で示す。種々のａｓ２対立遺伝子における突然変異したアミノ酸残基は、野生型配列の上にイタリック体で示す。
【図３】図３は、本発明のタンパク質ＡＳ２のドメインの構成及び特有の特徴を示す。ボックスの下でブラケットで示す領域はＡＳ２ドメインである。灰色のボックス及び縞のあるボックスはそれぞれＣモチーフ及びロイシンジッパー様配列を表す。ａｓ２−１、ａｓ２−２、ａｓ２−４及びａｓ２−５の突然変異の部位を示す。ボックスの下の数はアミノ酸残基の位置を示す。
【図４】図４は、ＡＳ２ファミリーメンバーにおけるＡＳ２ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。ＡＳ２ファミリーのメンバーの相当する領域の配列と共に、ＡＳ２の８番目から１０９番目の残基を並べる。２０を超えるメンバーで保存されているアミノ酸残基を黒色背景上の白色文字で示す。Ｃモチーフにおけるコンセンサス配列及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基は、それぞれ星印（＊）及び点（・）で示す。ファミリーのメンバーすべてで保存されており、ａｓ２−５対立遺伝子で突然変異していたグリシン残基は星印２つ（＊＊）で示す。シロイヌナズナのＡＳ２ファミリーのメンバーは２つのクラス（クラスＩ及びクラスＩＩ）に分割することができる。クラスＩＩの３を超えるメンバーで保存されていたアミノ酸残基を灰色で示している。その他の植物における、Ｏ．ｓ．はＯｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ（イネ）を示し、Ｇ．ｍ．はＧｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ（ダイズ）を示し、Ｌ．ｅ．はＬｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ　ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ（トマト）を示す。
【図５】図５は、シロイヌナズナのＡＳ２ファミリータンパク質の４２メンバーに関する系統樹を示す。分枝上の数は、ＰｒｏｔＭＬプログラムで計算された、そこにおけるブーツストラップ値を表す。各水平の枝の長さは、概算された進化上の距離に比例するするように表示されている。右側の区分は、ＡＳ２ファミリーのメンバーの分類を示す。
【図６】図６は、シロイヌナズナの種々の器官におけるａｓ２転写物のポリ（Ａ）^＋ＲＮＡのノーザンブロット解析の結果を示す図面に代わる写真である。１２日令植物の根（レーン１）、子葉（レーン２）、葉（レーン３）、及び茎頂（レーン４）、２８日令植物の花芽（レーン５）、及び３５日令植物のロゼット葉（レーン６）、茎上葉（レーン７）、花の茎（レーン８）及び長角果（レーン９）から等量の１．０μｇのポリ（Ａ）^＋ＲＮＡを調製した。同じブロットを対照としてΕφ−チューブリン（ＴＵＢＡ）をプローブとして調べた。右側の数はマーカーＲＮＡ分子の大きさを示す。
【図７】図７は、インスート（ｉｎ　ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション法によるａｓ２転写物の検出（ａ〜ｄ）結果を示す図面に代わる写真である。アンチセンスプローブで得られたａｓ２転写物の分布パターン。（ａ）球状ステージ；（ｂ）三角ステージ；（ｃ）ハート型ステージ；（ｄ）魚雷型ステージ；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のセンス対照。種皮の真下の細胞層の赤味がかった茶色の着色（白色の星印で示す）は、両方のプローブで生じるのでａｓ２のＲＮＡに特異的ではない。縮尺棒は２０μｍを示す。
【図８】図８は、タマネギの上皮細胞におけるａｓ２：：ＧＦＰの細胞小器官局在化の結果を示す図面に代わる写真である。３５Ｓ：：ａｓ２：：ＧＦＰ（Ａ、Ｂ）、３５Ｓ：：ＮＬＳ：：ＧＦＰ（Ｃ、Ｄ）及び３５Ｓ：：ＧＦＰ（Ｅ、Ｆ）を衝撃法によりタマネギの上皮細胞に導入し、導入した組織を２８℃にて１６時間培養した。蛍光顕微鏡下で蛍光をモニターした（左側のパネル）。１μｇ／ｍＬのＤＡＰＩで染色した核を右側のパネルに示す。縮尺棒は１００μｍを示す。
【図９】図９は、ａｓ２のｃＤＮＡを過剰発現したトランスジェニックシロイヌナズナのカルス及び植物の表現型、及びａｓ２遺伝子の転写物の蓄積の結果を示す図面に代わる写真である。図９Ａは、空のベクターｐＳＫ１（ａ）及びｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２（ｂ）による、Ｃｏｌ−０由来の根断片の形質転換の結果を示す。縮尺棒は１０ｍｍを示す。図９Ｂは、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の表現型を示す。（ａ）は空のベクターｐＳＫ１で形質転換した３５日令の植物の場合であり、（ｂ）はｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２で形質転換した３５日令の植物であり、（ｃ）はｐＳＫ３５Ｓ：：ａｓ２で形質転換した２５日令の植物であり、（ｄ）はパネルｃの植物をさらに１５日間成長させたものである。縮尺棒は１０ｍｍを示す。図９Ｃは、トランスジェニック植物及び野生型植物（Ｃｏｌ−０）におけるａｓ２遺伝子の転写物のＲＴ−ＰＣＲ解析の結果を示す。サイクル数をそれぞれパネルの右側に示す。レーン１、パネルＢ（ｄ）に示されるトランスジェニック植物；レーン２、野生型（Ｃｏｌ−０）植物であり、ａｓ２転写物のオープンリーディングフレームの領域に特異的なプライマーで増幅した産物（ａ；ＯＲＦ）、ａｓ２転写物の３’非翻訳領域に特異的なプライマーで増幅した産物（ｂ；ＵＴＲ）、及びα−チューブリンに対する遺伝子の転写産物に特異的なプライマーで増幅した産物（ｃ；α−ｔｕｂｕｌｉｎ）を示す。図９Ｄは、葉の表現型を示す。典型的な３５日令の野生型Ｃｏｌ−０植物（ａ）及びａｓ２−１植物（ｂ）の５番目の葉を示す。軽い表現型の変化（ｃ）及び厳しい表現型の変化（ｄ）を示すトランスジェニック植物の典型的な葉を示す。縮尺棒は５ｍｍを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the plant leaf formation-related protein AS2, in particular, the transcription of a specific gene in the nucleus of a plant cell, the development of a symmetrical flat leaf blade, and the establishment of a plant that controls the establishment of leaf veins. The present invention relates to a leaf formation-related protein AS2, more specifically, a plant characterized by having a cysteine repeat sequence composed of a cysteine-rich C-motif and a leucine zipper-like motif. More specifically, the plant leaf formation-related protein AS2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which an amino acid in the amino acid sequence may be substituted, inserted, or deleted. It relates to the protein AS2 which is involved in the formation of plant leaves.
The present invention also provides a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2, a composition for controlling plant leaf formation using the plant leaf formation-related protein AS2, and a plant leaf formation-related protein AS2. The present invention relates to a gene comprising a DNA for controlling the formation of leaves of a plant, and a vector comprising the same.
[0002]
[Prior art]
The leaves of angiosperms, which are relatively flat tissues, have a wide variety in terms of their shape and complexity, but their basic structure is generally proximal-distal, medial-lateral, and The description can be made based on three axes, ie, directional axis and abaxial axis (see Non-Patent Documents 1 to 4). Thus, plants are thought to utilize a general mechanism involved in establishing three axes in leaf development.
The leaves develop from the meristem (SAM) of the shoot apex as an outer organ. A variety of mutants have been isolated with shape development along each of the three axes, axial-abaxial identity and changes in leaf morphology related to the overall shape of the leaf.
[0003]
Some of the genes involved in the phenotype of the mutation have been cloned and characterized (see Non-Patent Documents 5 to 12). Snapdragon PHANTASTICA (PHAN), which is thought to encode the myb-like gene (PHAN) and transcription factors (PHB and PHV) including the homeobox, Arabidopsis PHABULOSA (PHB), and Arabidopsis PHAVOLUTA (PHV) Involved in the fate of axial cells. In addition, FILAMENTOUS FLOWER (FIL), YABBBY3 (YAB3), CLABS CRAW (CRC), and KANADI (KAN), etc., are involved in the specification of the fate of dorsal cells in the leaf blade. Mutations in such genes cause leaves that spread flat to mutate into a thread-like, rod-shaped structure. This is due to the distorted azimuthal-abaxial identity, so that lateral development of the leaf blades is combined with the genetic determination of the axial-abaxial identity. Is believed to be possible.
With respect to the shape of the leaves along the medial-lateral axis, the leaves of many plants are generally clear with respect to the leaf axis as an axis and show an approximate symmetry (see Non-Patent Documents 13 to 17). . However, some exceptions have been reported in this regard (see Non-Patent Documents 18 to 20). In any case, such symmetry is independent of the complexity (eg, single or multiple) of the leaf shape.
[0004]
To elucidate the mechanisms involved in the development of symmetric leaves, several groups, including the present inventors, are studying Arabidopsis asymmetric leaves 2 (as2) and asymmetric leaves 1 (as1). . The phenotypes of such mutants are very similar in terms of asymmetry of the leaf blade and malformed vein system, but the abnormalities are not absolutely identical (see Non-Patent Documents 21 to 24). . Abnormalities in these genes can be summarized as follows. (1) The leaves of the as1 mutant and the as2 mutant have asymmetrical fragments and exhibit bilaterally asymmetric downward winding. (2) Thickened and unable to produce a clear main vein, and the pattern of secondary veins is also asymmetric (see Non-Patent Documents 23 and 24). (3) Leaf sections cultured in a test tube containing a phytochrome-free medium regenerate shoots more frequently than wild-type leaf sections (see Non-Patent Document 23). (4) For example, transcripts of class I Knox genes such as KNAT1, KNAT2, and KNAT6 accumulate in mutant leaves (see Non-Patent Document 23). (5) Transcripts of as1 encoding a myb-like transcription factor related to the products of corn ROUGH SHEATH2 (RS2) and PHAN accumulate around the duct tissue in the cotyledon primordium and leaf primordium (see Non-Patent Document 21). ).
[0005]
The findings summarized above suggest that as1 and as2 are involved in establishing the entire vein system, including the prominent main vein as the structural axis of leaf symmetry, as well as the occurrence of leaf blade symmetry. (See Non-Patent Document 23). They may also function in maintaining leaf cells in a critical developmental context, probably by suppressing the expression of the class I Knox gene. The role of such genes in establishing the vein system is highly correlated with maintaining the critical status of leaf cells, but the details of such correlations have not been revealed. The similarity of abnormalities in as1, as2 and double mutant plants of as1 and as2 has led to the proposal that as1 and as2 interact somewhat genetically (see Non-Patent Document 23). To gain further insight into the mechanism by which as1 and as2 regulate leaf blade formation, it is extremely important to perform a characterization of both the as2 and as1 genes.
[0006]
The as2 locus is a translocation known as dAc-I-RS in two transgenic strains of Arabidopsis thaliana # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700). It has been reported by the present inventors that a map position was determined between two derivatives of the factor (see Non-Patent Document 25). However, no details were reported.
[0007]
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[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to establish a technique for establishing symmetrical and flat leaves in plants and to establish leaf veins, and in particular, to establish genes for them. More specifically, the present invention provides a method for controlling the development of symmetrical and flat leaves and the establishment of leaf veins by isolating and characterizing the as2 gene, thereby providing a useful new The present invention provides a novel protein AS2 and a gene as2 encoding the same.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have isolated and characterized the as2 gene. This gene encodes a novel protein containing a cysteine repeat sequence designated the C-motif and a leucine zipper-like motif. A search of the database revealed that AS2 belongs to a large family of proteins, which we have named the AS2 family. Transcripts of the as2 gene were mainly detected in the axial domain of cotyledon primordium during embryonic development. AS2 did not contain a distinct nuclear localization signal, but AS2 bound to green fluorescent protein was localized in plant nuclei. Overexpression of as2 cDNA resulted in a decrease in shoot formation efficiency of transgenic plants. Transgenic Arabidopsis overexpressing the as2 cDNA resulted in leaves that rolled up and sometimes produced rod-shaped leaves that did not have the proper extent of the leaf blades. Thus, we found that AS2 may regulate the transcription of certain genes in the nucleus, the development of symmetrical and flat leaf blades, and the establishment of leaf veins.
[0010]
The present invention relates to a plant leaf formation-related protein, AS2. In particular, the plant leaf formation-related protein AS2, which regulates the transcription of specific genes in the nucleus of plant cells, the development of symmetrical and flat leaf blades, and the establishment of leaf veins, more particularly cysteine The present invention relates to a plant leaf formation-related protein AS2, which has a cysteine repeat sequence composed of a C-rich motif and a leucine zipper-like motif. More specifically, the plant leaf formation-related protein AS2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which an amino acid in the amino acid sequence may be substituted, inserted, or deleted. It relates to the protein AS2 which is involved in the formation of plant leaves.
In addition, the present invention relates to a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2, more specifically, a DNA that hybridizes to a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or to a condition that is stringent with the nucleotide sequence. The present invention relates to a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2 having a base sequence that can be used.
Further, the present invention provides a composition for controlling plant leaf formation using a plant leaf formation-related protein AS2, and the control of plant leaf formation comprising DNA encoding the plant leaf formation-related protein AS2. And a vector comprising the same.
[0011]
We found that in two transgenic Arabidopsis strains # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700), the as2 locus was associated with dAc-I. It has been determined that a map position exists between two derivatives of the transposable element known as -RS. Based on this, the as2 gene was cloned. In cloning based on the genetic map, attention was paid to two such dAc-I-RS factors as genetic and molecular markers in addition to the PCR-RFLP marker in the BAC clone F5114. This factor contained the hygromycin resistance gene and the as2 locus was eventually found to be a 32 kbp region between the two PCR-RFLP markers (marker 1 and marker 4) in BAC clone F5114. .
[0012]
FIG. 1 shows the region structure of the genome of chromosome 1 of Arabidopsis thaliana and the results of complementation analysis using genomic fragments (FIG. 1A). In FIG. 1A, T-1200 and T-1700 indicate hygromycin resistance (Hyg ^r ) Shows the position of the dAc-I-RS transposable element by the gene. FIG. 1B shows each BAC clone (F5I14, F1E22, and F12P19) near the as2 gene on chromosome 1. The positions of the four markers are indicated on the BAC clone F5I14, and the numbers above the markers indicate the number of recombinants between each marker and the as2 locus (in most cases 10,000 Chromosomes beyond that were examined.).
We believe that we have the hygromycin resistance of T-1200 and T-1700 (Hyg ^r ) The chromosome walking is started from the gene, and among the RFLP markers created by the present inventors for analysis, marker1, marker2, marker3 and marker4, the as2 gene is between marker1 and marker4. Was determined to be a 32 kbp region.
[0013]
Next, the DNA of this region of the as2-1 mutant was subjected to PCR-RFLP analysis to determine the sequence. A 13 bp deletion was found in the ORF corresponding to open reading frame (ORF) 15 of BAC clone F5I14. In addition, we have found that all other available alleles, such as as2-2, as2-4, and as2-5, have mutations in this ORF (see below for details). 2A etc.). To determine if the mutation in ORF15 is responsible for the as2 phenotype, we used the ApaI-HpaI fragment of the wild-type genome (fragment I; 6.16 kb) containing the entire ORF15. , As2-1 gene was mutated (as2-1 plant). In addition, as2-1 plants were transformed with fragment II lacking the upstream region of ORF15 and fragment III lacking the upstream region of ORF15 and the middle of ORF15 to the 3 'end of fragment I. As a result, only the fragment I showed the phenotype of as2.
FIG. 1B shows an enlarged view of the chromosome region around as2 and the results of complementation analysis. The structure of as2 cDNA is shown below the genomic structure. The structures of the restriction fragments used for complementation analysis are indicated by horizontal lines labeled I, II, and III. The symbols + and-on the right indicate the positive and negative results of the complementation test with the corresponding DNA fragment, respectively.
ORF15 is the only reading frame in fragment I that can encode a protein greater than 3000 Da. Therefore, this result indicates that ORF15 corresponds to the as2 gene. The failure of fragment II to complement the as2 phenotype indicated that the region between ApaI and Bsu36I of fragment I was required for expression of as2.
[0014]
The present inventors have isolated a cDNA clone corresponding to ORF15. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Comparing the nucleotide sequence of the as2 gene with the sequence of the cDNA, the mRNA contains two introns in the 5 ′ untranslated region but no intron in the coding region (FIG. 1B), and AS2 contains 199 amino acids. It encoded a novel protein with residues. FIG. 2 shows the predicted amino acid sequence of AS2. The position of the cysteine in the C motif and the position of the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Mutated amino acid residues in various as2 alleles are shown in italics above the wild-type sequence.
FIG. 3 shows the configuration of the domain of as2 and its unique features. The area shown in brackets below the box is the as2 domain. Gray boxes indicate the C motif, and striped boxes represent leucine zipper-like sequences. The mutation sites of as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5 are shown. The numbers below the boxes indicate the positions of the amino acid residues.
[0015]
Both the as2-1 and as2-2 alleles have a 13 bp deletion at the same site upstream of the sequence encoding the leucine zipper-like sequence. This deletion should result in a short polypeptide that lacks most of the carboxyl-terminal (C-terminal) side of AS2 but contains an additional 13 amino acid residues (see FIG. 2). In the as2-4 mutant, there is a 1 bp deletion in the middle of the coding region corresponding to the C-terminus of AS2, which results in a frameshift that results in the replacement of the C-terminal 48 amino acid residues of AS2 by 63 new residues. Mutation had occurred (see FIG. 2). In the as2-5 variant, a single guanine nucleotide was replaced with an adenine nucleotide in the coding region on the amino-terminal (N-terminal) side of the protein, thereby replacing the glycine residue with a glutamic acid residue at position 46. (See FIG. 2). This glycine residue is conserved among all members of the AS2 family, as described below. Therefore, this glycine residue is essential for the function of AS2.
[0016]
Next, the structural characteristics of AS2 and its related proteins were examined.
The predicted AS2 protein contains a leucine zipper-like sequence from residue 81 to residue 109, with a spacing of 6 residues and hydrophobic amino acids such as valine, isoleucine and leucine. Five repeats of the residue were included (see FIG. 2). According to database searches, the N-terminal side of AS2 indicates that a large number of hypothetical genes and ESTs encoded by Arabidopsis thaliana and other plant species (Oryza sativa (rice), Glycine max (soybean), Lycopersicon esculentum (tomato), etc.) Was similar in amino acid sequence to the putative N-terminal side (FIG. 2B). In the official database of Arabidopsis sequences, there were at least 41 ORFs predicted to encode proteins with an N-terminus related to the N-terminus of AS2. Some of these proteins appear to be only slightly related to AS2 (see FIG. 4).
As shown in FIG. 4, by comparative analysis of putative AS2-like proteins, Cx ₂ Cx ₆ Cx ₃ The C sequence (where x is a non-conserved residue; designated the C motif) was the N-terminus of all 41 predicted proteins identified by database search and AS2 (positions 10 to 24 of AS2). It was found to be completely preserved on the side. In addition to the C motif, the leucine zipper-like sequence was strongly conserved in most of the 41 proteins. More than half of the proteins, including AS2, had additional conserved sequences as follows: P in and around the C motif C AA C KFLRRK C xxx C VFAPYFP, FAxVHKVFGASNVxKLL between the C motif and the leucine zipper-like sequence, and RxxAVxSLxYAEAxARxRDPVYGCVGxISxLQxQL (V or I) xxLQxxLxxxxxL (V or I) around the leucine zipper-like sequence. Despite the strong conservation of the amino acid sequence at the N-terminus of AS2, the amino acid sequence of the C-terminal region of AS2 was different from the sequences of other AS2-like proteins and other proteins in the database (see FIG. 3). .
[0017]
In AS2, the N-terminal sequence is characterized by a C motif and a leucine zipper-like sequence. We have designated this characteristic region as the AS2 domain, and the proteins containing this domain as members of the AS2 family. According to this nomenclature, the Arabidopsis genome will contain 42 ORFs that may encode proteins belonging to the AS2 family. As shown in FIG. 4, this gene and the putative gene of 41 proteins similar to AS2 are named as2-like gene (ASL), and such genes are numbered 1-41 respectively. Was. The nucleotide sequence of some of the cDNAs of such genes has been submitted to the GenBank database and has been submitted by Shuai B. and Springer, PS (2001, see Table 2) to LOB and LBD. Was named.
[0018]
FIG. 4 shows a comparison of the amino acid sequence of the AS2 domain among AS2 family members. Align residues 8 through 109 of AS2 with the sequence of the corresponding region of the AS2 family member (referred to as ASL). Amino acid residues conserved in more than 20 members are shown in white letters on a black background. The consensus sequence in the C motif and the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Glycine residues that are conserved across all family members and have been mutated at the as2-5 allele are indicated by two asterisks (**). Members of the AS2 family of Arabidopsis can be divided into two classes (Class I and Class II). Amino acid residues conserved in more than three members of class II are shown in gray. O. in many plants s. Indicates Oryza sativa (rice); m. Indicates Glycine max (soybean); e. Indicates Lycopersicon esculentum (tomato), respectively.
[0019]
These AS2 family members can be divided into at least two classes, class I and class II (see FIG. 4). Class I consists of AS2 and 35 proteins (ASL1-ASL35) and contains the C motif, leucine zipper-like sequence and most of the major conserved residues mentioned above. Class II consists of six proteins (ASL36-ASL41). Such proteins contain a C motif and an incomplete leucine zipper-like sequence, in which the fourth hydrophobic residue is missing, and are less conserved in the AS2 domain. Moreover, in this class most amino acid sequences are conserved between all members of class II, and only a few residues differ in each protein.
FIG. 5 shows a phylogenetic tree for 42 members of the searched Arabidopsis thaliana AS2 family proteins. The numbers on the branches represent the bootstrap values therein, as calculated by the ProtML program. The length of each horizontal branch is made to be proportional to the estimated evolutionary distance. The right section shows the classification of AS2 family members.
As shown in FIG. 5, the phylogenetic tree confirms that class II is only associated with class I, and the members of class I are further divided into subclasses named class Ia and class Ib. And showed that the sequence was weakly conserved but had a complete leucine zipper-like sequence.
[0020]
Next, the present inventors examined the accumulation site of as2 transcript in wild-type plants. Poly (A) from roots, cotyledons, leaves, and shoot tips of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants, rosette leaves of 35-day-old plants, leaves on stems, flower stems and siliques ⁺ The RNA was purified and then subjected to Northern blot analysis on the RNA sample using as2 cDNA as a probe. The result is shown in FIG. 6 by a photograph replacing a drawing. FIG. 6 shows poly (A) of various organs of Arabidopsis thaliana. ⁺ 3 shows the results of Northern blot analysis of RNA. Roots (lane 1), cotyledons (lane 2), leaves (lane 3) and shoot tips (lane 4) of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants (lane 5), and rosette leaves of 35-day-old plants (Lane 6), upper leaves (lane 7), flower stems (lane 8) and siliques (lane 9) in equal amounts of 1.0 μg of poly (A) ⁺ RNA was prepared. Using the same blot as a control, Εφ-tubulin (TUBA) was used as a probe. The numbers on the right indicate the size of the marker RNA molecule.
Transcripts of as2 were detected in all of the samples analyzed except for the flower stems (see FIG. 6). As2 transcript levels were highest in shoot apex samples containing small developing leaves. Such data indicate that the as2 mutation was apparent as a mutant phenotype in any leaf-like organ such as cotyledons, rosette leaves, stalk leaves, sepals and petals, but not in stems. (See Non-Patent Document 23). However, as2 transcripts were detected in roots, but the roots of as2 plants were similar to wild-type roots.
[0021]
The present inventors also examined the expression site of as2 during the embryonic development process by an in situ hybridization method using as2 cDNA as a probe. The result is shown in FIG. 7 by a photograph replacing a drawing. FIG. 7 shows the results of detection (ad) of the as2 transcript by the in situ hybridization method. It is a distribution pattern of the as2 transcript obtained with the antisense probe. 7A shows a spherical stage; FIG. 7B shows a triangular stage; FIG. 7C shows a heart-shaped stage; FIG. 7D shows a torpedo-shaped stage; . The reddish brown coloration of the cell layer just below the seed coat (indicated by white stars) is not specific for as2 RNA as it occurs with both probes. The scale bar in FIG. 7 indicates 20 μm.
In embryos at the globular stage, transcripts of as2 were detected in all cells (see FIG. 7). As the bulge formed at the top of the triangular embryo, the transcript of as2 accumulated in the uppermost region of the embryo (see FIG. 7 (b)). From the heart-shaped stage to the torpedo-shaped stage, signals were detected in the epidermal cells on the axial side of the cotyledon primordium (see FIGS. 7 (c) and (d)). After the walking-stick stage, accumulation of as2 transcript was detected throughout the cotyledon primordium without being clearly concentrated in specific areas (data not shown). After germination no specific hybrid formation signal was detected in situ around the meristem at the shoot apex, in the leaf primordium and in the mature leaves. However, accumulation of as2 transcript was confirmed by Northern blot (see FIG. 6).
[0022]
Next, the localization of AS2 into the nucleus was examined. The predicted AS2 protein does not contain a distinct nuclear localization signal (NLS) (see FIG. 2).
We determined whether AS2 is localized in the nucleus of plant cells, together with transcription under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (35S :: as2 :: GFP), A fusion construct was prepared in which the as2 cDNA was linked to DNA of green fluorescent protein (GFP). This fusion construct was introduced into onion epithelial cells by the particle bombardment method, and the fluorescence by GFP was monitored. The result is shown in FIG. 8 by a photograph replacing a drawing. FIG. 8 shows the results of monitoring the localization of as2 :: GFP organelles in onion epithelial cells. 8A and 8B show the case of 35S :: as2 :: GFP, FIGS. 8C and D show the case of 35S :: NLS :: GFP, and FIGS. 8E and F show the case of 35S :: GFP. Show the case. Each gene was introduced into onion epithelial cells by impact, and the introduced tissue was cultured at 28 ° C. for 16 hours. Fluorescence was monitored under a fluorescence microscope (left panels (A, C and E in FIG. 8). Nuclei stained with 1 μg / mL DAPI are shown in right panels (B, D and F in FIG. 8). 8, each scale bar indicates 100 μm.
As shown in FIG. 8, the fluorescent signal by as2-GFP was detected mainly in the nucleus, as was a similar signal by NLS-GFP prepared by SV40 NLS (FIGS. 8A, C). When the 35S :: GFP construct was introduced into onion cells, GFP signals were detected in both nucleus and cytoplasm (FIG. 8E). These results indicate that AS2 is a nuclear protein.
[0023]
Next, the present inventors examined the phenotype of Arabidopsis thaliana plants that overproduce AS2. As2 cDNA was ligated to the 35S promoter (35S: as2) to create a transgenic Arabidopsis thaliana plant that overexpresses as2. The result is shown in FIG. 9 by a photograph replacing a drawing. FIG. 9A shows the results of incubation of Col-0-derived root fragments transformed with the empty vectors pSK1 (a) and pSK35S :: as2 (b) and photographing 21 days after starting the incubation. . The scale bar in FIG. 9A indicates 10 mm. FIG. 9B shows the phenotype of the transgenic Arabidopsis thaliana plant. FIG. 9B (a) shows the case of a 35 day old plant transformed with the empty vector pSK1, (b) shows the case of a 35 day old plant transformed with pSK35S :: as2, and (c) Shows the case of a 25-day-old plant transformed with pSK35S :: as2, and (d) shows the case of growing the plant of (c) for further 15 days. The scale bar in FIG. 9B indicates 10 mm. FIG. 9C shows the results of RT-PCR analysis of transcripts of the as2 gene in transgenic plants and wild-type plants (Col-0). The number of RT-PCR cycles is shown on the right side of each panel. The amplified DNA fragment was fractionated by electrophoresis on an agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide. Lane 1 shows the case of the transgenic plant shown in (d) of FIG. 9B, and lane 2 shows the case of the wild-type (Col-0) plant. product amplified with a primer specific to the region of the open reading frame of the as2 transcript (a; ORF), product amplified with a primer specific to the 3 ′ untranslated region of the as2 transcript (b; UTR), and α -Shows products (c; α-tubulin) amplified with primers specific to the transcript of the gene for tubulin. FIG. 9D shows the phenotype of each leaf. (A) shows the case of a typical 35-day-old wild-type Col-0 plant, and (b) shows the fifth leaf of an as2-1 plant. Shown are typical leaves of transgenic plants showing a light phenotypic change (c) and a severe phenotypic change (d). The position of the latter leaf could not be determined. The scale bar in FIG. 9D indicates 5 mm.
[0024]
The data from this preliminary experiment demonstrated that it was difficult to create transformed shoots (FIG. 9A). Therefore, the present inventors first determined the approximate production efficiency of shoots transformed by the conventional root transformation method.
For transformation, the number of transformed green calli, regenerated shoots, and shoots with flower stems per number of roots used were counted. The results are shown in Table 1 below.
[0025]
[Table 1]

[0026]
The values in parentheses in Table 1 indicate the average number of transformants per root.
Table 1 shows that the efficiency of green callus formation when 35S: as2 was introduced into root tissue was lower than when the empty vector plasmid, pSK1, was used for transformation. The regeneration efficiency of transgenic shoots and shoots with flower stems is 5 to 10 times lower (see Table 1).
Such data indicated that overexpression of as2 cDNA had a suppressive effect on cell proliferation and / or shoot regeneration in green tissue.
Two transgenic strains overexpressing the as2 cDNA were obtained. It was confirmed that the as2 transcript derived from this cDNA was accumulated in one of the transgenic strains showing a more severe phenotype (see FIG. 9C). One strain of the transgenic plant had a light dwarf phenotype and produced upwardly curled leaves (see FIG. 9B (b)). Another strain of transgenic plants was associated with a more severe abnormal phenotype and produced leaves with extremely narrow leaf blades at early stages of plant growth ((c) in FIG. 9B, and (( c)). This leaf blade was unable to spread, resulting in rod-shaped leaves (see (d) of FIG. 9B and (d) of FIG. 9D).
[0027]
From the above, the functional domain in AS2 was considered.
The as2 gene has a C motif (Cx ₂ Cx ₆ Cx ₃ (Defined as C) and a leucine zipper-like sequence, and appears to encode a novel protein of 199 amino acid residues with a distinctly unique sequence on the C-terminal side (see FIGS. 2 and 3). It is generally accepted that leucine zipper sequences are involved in protein-protein interactions, and the leucine zipper-like sequence of as2 may play a role in the association of AS2 with some other proteins. It is thought that there is. Such an interaction may be essential for the action of AS2.
Although the C motif was first identified in the present invention, it is rather generally _2-3 Cx _n Cx _2-3 It has a C (n> 12) consensus sequence and resembles a zinc finger that functions in interaction with other macromolecules (Pavletich, NP and Pabo, CO (1991) Science 252: 809) -817, Wang, JH et al. (1998) Immunity 9: 543-553). The C motif is also likely to be involved in association with other macromolecules such as, for example, DNA and proteins, especially AS1. Complete elucidation of the function of AS2 requires further identification and characterization of the molecules with which AS2 interacts.
[0028]
The sequence on the C-terminal side of AS2 is different from the sequence of any protein in the database containing a known motif (see FIG. 3). Although the as2-4 allele had a frameshift mutation in this region, the phenotype by this allele was similar to that by other as2 alleles, so the C-terminal side was newly characterized. It is considered to be essential for the function of AS2 other than the N-terminal side containing the designated AS2 domain.
[0029]
Both as1 and as2 suppress the expression of the class I Knox homeobox gene, but it is not clear whether such suppression is directly or indirectly due to as1 and as2. The present inventors have proposed that, as expected for proteins involved in the repression of class I knox genes in the nucleus through interactions with other yet unidentified nuclear proteins, as2: It was revealed that the GFP fusion protein was localized in the nucleus of plant cells (see FIG. 8). as1: GFP fusion protein was also localized in the nucleus (unpublished data). These findings are consistent with the hypothesis that as1 is one of the molecules with which as2 interacts in the nucleus.
Up-winding leaves and cotyledons were induced by overexpression of as2 cDNA (see FIG. 9). In contrast, the as2 function-deficient mutation resulted in downward-wound leaves and cotyledons (see Non-Patent Document 23). Thus, as2 has been implicated in suppressing the growth of the axial domain or in stimulating the growth of the dorsal domain in the leaf blade. Considering that a growth inhibitory effect was observed during transformation (see FIG. 9B) and expression of as2 in the axial domain in embryo cotyledon primordia (see FIG. 7), as2 is It can be guessed that it functions to suppress the domain. It will be interesting to determine if such suppression is achieved through inhibition of cell growth or elongation.
Whatever the details of AS2 activity at the molecular level, the present invention on overexpression and previous studies on leaves of as2 mutants show that AS2 is involved in leaf symmetry as well as flat leaf blade expansion It is shown that. Mutations in the genes involved in the axial-abaxial fate of the leaf domain interfere with leaf fate decisions and often induce rod-shaped leaf formation. There may be a relationship between as2 and such a gene. Against this background, it is worth noting that as1 is a homologue of PHAN in Arabidopsis, although it remains to examine whether the function of as1 is similar to that of PHAN.
[0030]
Next, the function of the ASL protein will be considered.
The conserved amino acid sequence on the N-terminal side of the AS2-like protein has consequently indicated that such proteins form a new family of plant proteins called the AS2 family. The Arabidopsis protein, a member of this family with expression of as2, was named ASL (AS2-like) protein (see FIG. 4). Amino acid sequence similarity and the phylogenetic tree of the AS2 domain of ASL indicated that the ASL protein could be divided into class I and class II with subclasses, class Ia and class Ib (see FIGS. 2 and 5).
While it remains to identify the function of AS2 family members with the expression of as2, AS2 is required for the formation of symmetric, flat and round leaf blades and the establishment of vein patterns including distinct main veins Turned out to be many. In addition, as2 has the ability to act together with as1 to suppress the expression of the class I Knox homeobox gene. Substitution of a conserved glycine residue in the AS2 domain with a glutamic acid residue results in a mutant phenotype (see FIGS. 2-4), so this residue plays an important role in the function of AS2, as in the AS2 domain. It is clear that Although some members of class Ia show strong conservation in the amino acid sequence of the AS2 domain (eg, ASL1 and ASL2), AS2 function requires a unique C-terminal region in addition to the N-terminal AS2 domain So they may have different functions. Clear insights into the role of such closely related ASLs will require further genetic and molecular experiments.
[0031]
Recently, it has been suggested that the LOB gene (accession number AF447897) corresponding to the gene for ASL4 is usually expressed at the border between meristem and organ primordium, but is not present in as1 and is drastically reduced in as2. , The developmental role of the LOB gene has not yet been determined.
The six ASLs that make up Class II have characteristic structural characteristics different from Class I (see FIG. 4), and their amino acid sequences are very similar to each other. The reported expression of such genes (see Table 2) suggests that they are functional genes. Thus, class II members may play different roles during the development of Arabidopsis.
[0032]
The accession numbers of Genebank for the nucleotide and amino acid sequences reported in the present invention are as follows. AS2 (AB080802); and BACs F5I14 (AC001229), F1E22 (AC007234), and F12P19 (AC009513). Information about members of the Arabidopsis AS2 family of proteins is summarized in Table 2 below.
[0033]
[Table 2]

[0034]
The BAC code and the gene code in Table 2 were obtained from the TAIR database, and the EST ID was obtained from the EMBL database. Some ASL proteins in Table 2 have already been submitted to Genebank as LOB domain (LBD) proteins.
[0035]
The present invention provides a novel plant leaf formation-related protein, AS2. The protein AS2 of the present invention is preferably a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, but is not limited thereto. The protein of the present invention has a function of controlling the transcription of a specific gene in the nucleus of a plant cell, the development of a symmetric flat leaf blade, and the establishment of leaf veins, and the amino acid sequence of the protein is cysteine. And a cysteine repeat sequence consisting of a C-motif rich in C and a leucine zipper-like motif. The C-motif of the protein of the present invention is preferably Cx motif. ₂ Cx ₆ Cx ₃ C (C represents cysteine and x represents an arbitrary amino acid); more specific amino acid sequences include P in and around the C motif. C AA C KFLRRK C xxx C An amino acid sequence of VFAPYFP (the alphabet indicates a one-letter code of an amino acid, and x indicates an arbitrary amino acid). Further, as the leucine zipper-like motif, preferably, the amino acid sequence of RxxAVxSLxYEAxARxRDPVYGCVGxISxLQxQL (V or I) xxLQxxLxxxxxxL (V indicates the one-letter code of an amino acid and x indicates an arbitrary amino acid) is exemplified. Can be. Further, as a preferable amino acid sequence between the C motif and the leucine zipper-like sequence, FAxVHKVFGASNVxKLL (the alphabet indicates a one-letter code of an amino acid, and x indicates an arbitrary amino acid), and G (glycine) among them. Is the required array.
Therefore, for example, in the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, the C-motif, the leucine zipper-like motif, and the glycine position are conserved and have a function related to the formation of plant leaves. In some cases, the formation of leaves of a plant comprising an amino acid sequence in which one or more, preferably 1 to 50, amino acids in the amino acid sequence may be optionally substituted, inserted or deleted Which provides a protein AS2 related to Preferred proteins of the present invention include proteins having an amino acid sequence belonging to the AS2 family as described above.
[0036]
The present invention also provides a DNA encoding any one of the above-described leaf formation proteins of the present invention. The DNA of the present invention may be single-stranded or double-stranded, and may be one that can produce the above-described leaf-forming protein AS2 of the plant of the present invention in a cell. Further, the DNA of the present invention may be in the form of RNA if necessary. Examples of the DNA of the present invention include a DNA having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a DNA having a base sequence capable of hybridizing to the base sequence under stringent conditions.
The DNA of the present invention may be a DNA alone, or may be a DNA incorporated into a vector comprising an appropriate plasmid or the like. Therefore, the present invention provides a vector containing the above-described DNA of the present invention.
[0037]
The protein AS2 of the present invention is related to leaf formation of plants, preferably Arabidopsis thaliana, and can control normal leaf formation. Accordingly, the present invention provides a composition or a control agent for controlling the formation of leaves of a plant comprising the above-described protein AS2 of the present invention. In addition, the above-described DNA of the present invention can be used as necessary instead of using the protein of the present invention. Accordingly, the present invention provides a gene for controlling the formation of leaves of a plant comprising the above-described DNA of the present invention, a control composition, or a control agent.
[0038]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In the following examples, regarding the analysis of plants, seeds were sown on soil, and after 2 days in a dark place at 4 ° C., the plants were transferred to a condition of white light illumination of 3000 lux at 22 ° C. for 16 hours. . Plant age was provided in terms of days after sowing.
The as2-5 allele was isolated from the M2 population of Ler-0 seeds mutagenized with ethyl methanesulfonate purchased from Reel Seeds (Round Rock, Tex., USA). Transgenic strains, # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700), were isolated from the (I-RS / dAc-I-RS) strain # 14. did. They had a transposed dAc-I-RS element (accession number AB055064) containing the gene for hygromycin phosphotransferase. The background of # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700) were both Ler ecotypes.
[0039]
Example 1 (Cloning of as2 gene)
A meiotic recombination breakpoint is created between the as2-1 mutation and the adjacent transposon markers # 14-68.1.4 (T-1700) and # 14-22.4.4W3 (T-1200). Was identified in the vicinity of the as2 gene by screening for recombination. Such a recombinant showing hygromycin resistance and having the as2-1 phenotype was used to map the PCR-RFLP marker for the as2 gene on the map. Information on the sequence used as the PCR-RFLP marker was obtained from the Arabidopsis Genome Center website on the TAIR website (http://www.arabidopsis.org/), University of Pennsylvania, and was obtained from BAC clone F5114 (Genebank accession number AC001229). ) The nucleotide sequence of the PCR-RFLP marker is as follows:
For marker 1,
5'-TGTAACTCTTCCCGTCCGGTTTG-3 'and
5'-GCAAAGTCCATAGAGGAGCAAG-3 ',
For marker 2,
5'-TTGGGTTTGCACCGAAACTCAG-3 'and
5′-AGTGACAGACAGTGACCACAAG-3 ′,
For marker 3,
5′-TGGTGGGATGAAACTTTGTTGAG-3 ′ and
5′-CTCTCTCTTTCTCACTCTTCTC-3 ′,
For marker 4,
5'-AGAAAACTGCTGTCTTTCGGGAC-3 'and
5'-TCCAAAAGCACTCTCTAGCTTGG-3 '
(See FIG. 1).
[0040]
Example 2 (Complementation analysis)
To construct a binary plasmid for complementation experiments, a 6.16 kbp ApaI-HpaI fragment (fragment I in FIG. 1), a 4.75 kbp Bsu36I-HpaI fragment (FIG. 1 fragment II) and a 2.2 kbp Bsu36I- fragment. The BglII fragment (fragment III in FIG. 1) was derived from pBI101 (Jefferson, RA, et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907) and the 1 ′ promoter :: bar (Yoshioka, Y .; , Et al., (2001) Gnise. Genet. Syst. 76: 189-198). The newly constructed plasmid was introduced into Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) strain, GV3101. Then, as described separately (Clough, SJ and Bent, AF (1998) Plant J. 16: 735-743, Galbiati, M., et al. (2000) Funct. Integra. Genomics 1: 25-34), the whole plant was transformed by suction infiltration. Transgenic plants were selected in soil containing 0.01% Basta (AgroEvo, Frankfurt, Germany), which genotype transgenic plants were analyzed by Southern blot.
[0041]
Example 3 (Cloning of cDNA)
Poly (A) from 16 days old plants ⁺ RNA was prepared. For reverse transcription PCR, the first strand of the cDNA was prepared according to the method of Hamada et al. (Hamada, S., et al. (2000) Plant J. 24: 91-101). Then the primer,
ORF15SF (5′-GGGTCGACATGGCATCTTCTTCAACAAACTCAC-3 ′) and
ORF15NR (5′-GGGCGGCCGCTCAAGACGGATCAACAGTACGGC-3 ′)
As a result, as2 cDNA was amplified. The amplified fragment was then ligated to the SalT / NotI site of pBluescriptSK (-) (Stratagene, La Jolla, Calif., USA) and the identity was confirmed by nucleotide sequencing. The 5 'end sequence of the cDNA was determined by primers, 5'-RACE with ORF15MR (5'-TATCTGAAGCTGACGAAGCTGATG-3') and adapter primers. The 3 'end sequence of the cDNA was determined by primers, 3'-RACE with ORF15MF (5'-GATCTCAGCTGTGCTAAATCTGGAC-3') and adapter primers. The nucleotide sequence of the mutant alleles (as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5) was determined by amplifying the as2 gene region from the genomic DNA of each mutant. Poly (A) isolated from each mutant plant ⁺ The nucleotide sequence of the as2 cDNA obtained from the RNA was also determined.
[0042]
Example 4 (Phylogenetic tree analysis)
Using the 2.0 version of the TAIR BLAST program (http://arabidopsis.org/Blast/index.html), the Arabidopsis thaliana similar to as2 from the AGI dataset (AGI, protein from the whole genome) at TAIR The gene was obtained. Using the Genome Net Blast T2 program (http://www.blast.genome.ad.jp/), as2-like genes of other plant species were obtained from the dataset in Genome Net. Using CLUSTAL W version 1.8 (Thompson, JD, et al. (1994) Nucl. Acid. Res. 22: 4673-4680), the sequence of the AS2 domain of 42 members of the AS2 family of Arabidopsis is aligned. Was. For the construction of the maximum likelihood (ML) phylogenetic tree, a neighboring connected (NJ) phylogenetic tree was used as a starting phylogenetic tree for a partial reconstruction search. Using the NJdist and protML programs in the MOLPHY version 2.3b3 package (http://www.ism.ac.jp/software/ismib/softother.htm#morphhy; Adachi, J. and Hasegawa 96, Mawagawa, M., 1996) Comput. Sci. Monogr. 28: 1-150). An NJ phylogenetic tree was obtained from NJdist, and an ML phylogenetic tree was obtained from ProtML.
The partial bootstrap probabilities for each branch were estimated using the ProtML program (Himi, S., et al. (2001) J. Mol. Evol. 53: 387-393, Sakakibara, K., et. al., (2001) Mol. Biol. Evol. 18: 491-502).
[0043]
Example 5 (RNA gel blot analysis)
For analysis of Col-0 wild-type plants, roots, cotyledons, leaves, and shoot tips collected from 12-day-old plants, flower buds collected from 28-day-old plants, and rosette leaves collected from 35-day-old plants, Upper stem, flower stem and siliques were used. Equivalent amount of 1.0 mg of poly (A) ⁺ RNA was isolated and Northern blot was performed. The partial cDNA for as2 was used as a probe.
Primer 1 (5'-GATCTCAGCTGTGCTAAATC-3 ') and
Primer 2 (5'-TCAAGACGGATCAACAGTAC-3 ')
It was amplified by PCR using and cloned into the EcoRV site of PBluescript SK (-). Its identity was confirmed by nucleotide sequencing. Using a high-prime DNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), a 300 bp fragment having a stop codon, which was created by cutting plasmid pas2c300 obtained by extending codon 200 from codon 151 of the ORF with EcoRI and ClaI, According to the manufacturer's instructions, [α- ³² [P] dCTP. This labeled fragment was used as a probe.
[0044]
Example 6 (In situ hybridization method)
Details of the methods used for plant fixation, paraffin embedding and in situ hybridization can be found at http: // www. genetics. wisc. edu / CATG / barton / index. html, and was performed according to the method of Nakanishi et al. (Nakashima, M., et al (1998) Plant cell Physiol. 39: 690-700). Sections (8 μm thick) were prepared using a microtome (Elma, Tokyo, Japan). After linearizing the plasmid pas2c300 with ClaI, an antisense RNA probe was prepared with T3 RNA polymerase. A sense RNA probe was prepared with T7 RNA polymerase after linearizing pas2c300 with EcoRI.
[0045]
Example 7 (Construction of plasmid)
As2 cDNA (600 bp) extended from the start codon to the stop codon at the XbaI and NotI sites of the binary vector pSK1 (Kojima, S., et al. (1999) DNA Res. 6: 407-410) downstream of the CaMV 35S promoter. The plasmid pSK35S :: as2 was constructed by inserting the fragment of an as2 cDNA (597 bp) fragment extending from the start codon to the 199th amino acid codon at the SalI and NcoI sites of pTH-2 (Chiu, W., et al. (1996) Curr. Biol. 6: 325-330); Plasmid p35S :: as2 :: GFP was constructed by inserting three alanine linker sequences (5′GCAGCTGCC3 ′). Plasmids containing 35S :: NLS :: GFP and 35S :: GFP were prepared according to the method of Nishihama et al. (Nishihama, R., et al. (2001) Genes Dev. 15: 352-363).
[0046]
Example 8 (Transformation of Arabidopsis thaliana)
According to the method of Onouchi et al. (Onouchi, H., et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 653-660), Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis root explants was performed. Was. Agrobacterium LBA4404 / pAL4404 (Hookema, A., et al. (1984) J. Bacteriol 158: 383-385) cells containing pSK35S :: as2 or pSK1 (Kojima et al. (1999)). Cultured with the pieces. Transformants were selected on a shoot induction medium in the presence of 15 mg / L hygromycin B (Onouchi et al. (1995)). Using plasmids pSK35S :: as2 or pSK1 Tumefaciens strain GV3101 was transformed. The whole plant was then transformed by suction infiltration. Transgenic plants were selected on MS media containing 15 mg / L hygromycin B and 300 mg / L carbenicillin.
[0047]
Example 9 (as2 :: localization of organelles of GFP protein)
The cells in the epithelial layer of the onion bulb were p35S :: as2 :: GFP, p35S :: according to the method of von Amim, von Amim, AG and Deng, XW (1994) Cell 79: 1035-1045. Transformation was performed with NLS :: GFP or p35S :: GFP. Fluorescent signals were recorded by a fluorescent microscope (Axioplan 2, Germany) equipped with a cooled CCD camera system (Photometrics, Tucson, AZ). Pseudo-coloring of the image and measurement of the signal amount and cell width from GFP were performed with the IP Lab software program (Scanalytics, Fairfax, VA). The same cells were stained with 1 μg / mL of 4′6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) and the fluorescence was recorded as well.
[0048]
Example 10 (Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR))
Transgenic plants and wild-type flower buds were harvested, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. Poly (A) ⁺ RNA was purified and the first strand of cDNA was synthesized. The sample volume was normalized in order to perform equal amplification of DNA fragments with primers specific for α-tubulin cDNA. Next, PCR was performed by the method of Semiarti et al. (See Non-Patent Document 23). In order to amplify a DNA fragment specifically derived from the endogenous as2 transcript, sites for the design of the primer set were selected in the 5 'and 3' untranslated regions of the as2 transcript, both of which were Are not present in the cDNA used to create the transgenic plants. The primer pairs are as follows:
For α-tubulin,
pU51 (5′-GGACAAGCTGGGATCCAGG-3 ′) and
pU52 (5′-CGTCTCCACCTTCAGCACC-3 ′),
As for the untranslated region of the cDNA of the as2 gene,
pU73 (5'-CCCCTCTGAGCAACAGAAAGC-3 ') and
pU74 (5'-CCAAAAACCTAAAATCTCAAGACGG-3 '),
About the region of the open reading frame of as2 cDNA
pU328 (5'-GTGTTTGGAGCAAGTAACGT-3 ') and
pU315 (5′-AAACCTAGGAGACGGATCAACAGTACGGCG-3 ′)
It is.
[0049]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel protein, AS2, which regulates the transcription of specific genes in the nucleus, the development of symmetric flat leaf blades, and the establishment of leaf veins, and a family thereof.
The plant leaf formation-related protein AS2 of the present invention is characterized by having a cysteine repeat sequence consisting of a cysteine-rich C-motif as an amino acid sequence, glycine at a specific position, and a leucine zipper-like motif, The present invention clearly shows that a group of proteins having such a characteristic amino acid sequence is present in plants, preferably Arabidopsis thaliana, and these proteins are related to leaf formation of plants and regulate leaf formation. It is to be. Therefore, the present invention provides an agent for controlling the formation, growth, and preservation of leaves of a plant comprising the protein AS2.
[0050]
[Sequence list]

[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the region structure of a genome containing the as2 locus on chromosome 1 of Arabidopsis thaliana and the results of complementation analysis using genomic fragments. FIG. 1A shows the region structure of the genome of chromosome 1 of Arabidopsis thaliana, and T-1200 and T-1700 show the location of the dAc-I-RS transposable element by the hygromycin resistance (Hygr) gene. FIG. 1B shows an enlarged view of the chromosome region around as2 including the BAC clone F5I14 and a marker position therein, and the results of complementation analysis. The structure of the as2 cDNA is shown below the genomic structure. Restriction fragments used for complementation analysis are indicated by horizontal lines labeled I, II, and III. The symbols + and-on the right indicate the positive and negative results of the complementation test with the corresponding DNA fragment, respectively.
FIG. 2 shows an example of the amino acid sequence of the protein AS2 of the present invention. The position of the cysteine in the C motif and the position of the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Mutated amino acid residues in the various as2 alleles are shown in italics above the wild-type sequence.
FIG. 3 shows the organization and unique characteristics of the domain of the protein AS2 of the present invention. The area shown in brackets below the box is the AS2 domain. Gray boxes and striped boxes represent the C motif and leucine zipper-like sequence, respectively. The mutation sites of as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5 are shown. The numbers below the boxes indicate the positions of the amino acid residues.
FIG. 4 shows a comparison of amino acid sequences of AS2 domains among AS2 family members. Align residues 8 through 109 of AS2 with the sequence of the corresponding region of the AS2 family member. Amino acid residues conserved in more than 20 members are shown in white letters on a black background. The consensus sequence in the C motif and the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Glycine residues that are conserved across all family members and have been mutated at the as2-5 allele are indicated by two asterisks (**). Members of the AS2 family of Arabidopsis can be divided into two classes (Class I and Class II). Amino acid residues conserved in more than three members of class II are shown in gray. O. in other plants. s. Indicates Oryza sativa (rice); m. Indicates Glycine max (soybean); e. Indicates Lycopersicon esculentum (tomato).
FIG. 5 shows a phylogenetic tree for 42 members of the Arabidopsis AS2 family proteins. The numbers on the branches represent the bootstrap values therein, as calculated by the ProtML program. The length of each horizontal branch is shown to be proportional to the estimated evolutionary distance. The right section shows the classification of AS2 family members.
FIG. 6 shows poly (A) of the as2 transcript in various organs of Arabidopsis thaliana. ⁺ 4 is a photograph replacing a drawing, showing the results of Northern blot analysis of RNA. Roots (lane 1), cotyledons (lane 2), leaves (lane 3) and shoot tips (lane 4) of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants (lane 5), and rosette leaves of 35-day-old plants (Lane 6), upper leaves (lane 7), flower stems (lane 8) and siliques (lane 9) in equal amounts of 1.0 μg of poly (A) ⁺ RNA was prepared. Using the same blot as a control, Εφ-tubulin (TUBA) was used as a probe. The numbers on the right indicate the size of the marker RNA molecule.
FIG. 7 is a photograph instead of a drawing, showing the results (ad) of detecting as2 transcripts by the in situ hybridization method. Distribution pattern of as2 transcript obtained with antisense probe. (A) spherical stage; (b) triangular stage; (c) heart-shaped stage; (d) torpedo-shaped stage; (e) sense controls of (a)-(d). The reddish brown coloration of the cell layer just below the seed coat (indicated by white stars) is not specific for as2 RNA as it occurs with both probes. The scale bar indicates 20 μm.
FIG. 8 is a photograph instead of a drawing, showing the results of organelle localization of as2 :: GFP in onion epithelial cells. Tissue in which 35S :: as2 :: GFP (A, B), 35S :: NLS :: GFP (C, D) and 35S :: GFP (E, F) were introduced into onion epithelial cells by the impact method and introduced. Was cultured at 28 ° C. for 16 hours. Fluorescence was monitored under a fluorescence microscope (left panel). Nuclei stained with 1 μg / mL DAPI are shown in the right panel. The scale bar indicates 100 μm.
FIG. 9 is a photograph instead of a drawing showing the callus and plant phenotypes of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing as2 cDNA and the results of accumulation of transcripts of as2 gene. FIG. 9A shows the results of transformation of Col-0-derived root fragments with empty vectors pSK1 (a) and pSK35S :: as2 (b). The scale bar indicates 10 mm. FIG. 9B shows the phenotype of the transgenic Arabidopsis thaliana plant. (A) is the case of a 35-day-old plant transformed with the empty vector pSK1, (b) is a 35-day-old plant transformed with pSK35S :: as2, and (c) is pSK35S :: as2. (D) is a plant obtained by growing the plant of panel c for another 15 days. The scale bar indicates 10 mm. FIG. 9C shows the results of RT-PCR analysis of transcripts of the as2 gene in transgenic plants and wild-type plants (Col-0). The number of cycles is shown on the right side of each panel. Lane 1, transgenic plants shown in panel B (d); Lane 2, wild-type (Col-0) plants, products amplified with primers specific for the open reading frame region of the as2 transcript (a; ORF), a product amplified with a primer specific to the 3 ′ untranslated region of the as2 transcript (b; UTR), and a product amplified with a primer specific to the transcript of the gene for α-tubulin (c; α) -Tubulin). FIG. 9D shows the leaf phenotype. Shown is the fifth leaf of a typical 35 day old wild type Col-0 plant (a) and as2-1 plant (b). Shown are typical leaves of transgenic plants showing a light phenotypic change (c) and a severe phenotypic change (d). The scale bar indicates 5 mm.

Claims (9)

植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２。Plant leaf formation-related protein AS2. 植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している請求項１に記載の植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２。The plant leaf formation-related protein AS2 according to claim 1, which controls transcription of a specific gene in the nucleus of the plant cell, development of a symmetric flat leaf blade, and establishment of leaf veins. システインに富むＣ‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とする請求項１又は２に記載の植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２。The plant leaf formation-related protein AS2 according to claim 1 or 2, having a cysteine repeat sequence composed of a cysteine-rich C-motif and a leucine zipper-like motif. 植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２が、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連する請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク質ＡＳ２。The plant leaf formation-related protein AS2 is used to form a plant leaf comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which amino acids in the amino acid sequence may be substituted, inserted, or deleted. A protein AS2 according to any of the preceding claims. 請求項１〜４のいずれかに記載の植物の葉形成関連タンパク質ＡＳ２をコードするＤＮＡ。A DNA encoding the plant leaf formation-related protein AS2 according to any one of claims 1 to 4. ＤＮＡが、配列表の配列番号１に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものである請求項５に記載のＤＮＡ。6. The DNA according to claim 5, wherein the DNA has a base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a base sequence capable of hybridizing to the base sequence under stringent conditions. 請求項１〜４に記載のタンパク質ＡＳ２を含有してなる植物の葉の形成を制御するための組成物。A composition for controlling leaf formation of a plant comprising the protein AS2 according to claim 1. 請求項５又は６に記載のＤＮＡからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子。A gene comprising the DNA according to claim 5 or 6 for controlling leaf formation of a plant. 請求項５又は６に記載ＤＮＡを含有してなるベクター。A vector comprising the DNA according to claim 5.

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