JP2004121122A - Plant leaf formation-related protein as2, and gene encoding the same - Google Patents
Plant leaf formation-related protein as2, and gene encoding the same Download PDFInfo
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Abstract
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】
本発明は、植物の葉形成関連タンパク質AS2、詳細には、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している植物の葉形成関連タンパク質AS2、より詳細には、システインに富むC‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とする植物の葉形成関連タンパク質AS2に関する。より具体的には、植物の葉形成関連タンパク質AS2が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質AS2に関する。
また、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質AS2をコードするDNA、植物の葉形成関連タンパク質AS2を用いた植物の葉の形成を制御するための組成物、植物の葉形成関連タンパク質AS2をコードするDNAからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、及びそれを含有してなるベクターに関する。
【0002】
【従来の技術】
相対的に平坦な組織である被子植物の葉は、その形状及び複雑さという点で広範囲な多様性を持っているが、その基本構造は、一般に、近位−遠位、内側−外側、及び向軸性−背軸性という3つの軸に基づいて説明することができる(非特許文献1〜4参照)。従って、植物は、葉の発生において、3つの軸の確立に関与する一般的なメカニズムを利用していると考えられる。
葉は茎頂のメリステム(SAM)から外側器官として発生する。3つの軸のそれぞれに沿った形状の発達、向軸性−背軸性のアイデンティティ及び葉の全体的な形状に関連する葉の形態の変化と共に種々の突然変異体が単離されてきた。
【0003】
突然変異の表現型に関与する遺伝子の一部はクローニングされ、性状分析されている(非特許文献5〜12参照)。myb様遺伝子(PHAN)及びホメオボックスを含む転写因子(PHBとPHV)をコードしていると思われるキンギョソウのPHANTASTICA(PHAN)、シロイヌナズナのPHABULOSA(PHB)、及びシロイヌナズナのPHAVOLUTA(PHV)は、向軸性細胞の運命に関与している。さらに、FILAMENTOUS FLOWER(FIL)、YABBY3(YAB3)、CRABS CLAW(CRC)、及びKANADI(KAN)などが挙げられ、これらは葉身における背軸性細胞の運命の仕様に関与している。このような遺伝子における突然変異によって、平坦に広がる葉が、糸状で竿型の構造に変異する。これは、向軸性−背軸性のアイデンティティも歪められているためであり、従って、葉身の側方への発生は、向軸性−背軸性のアイデンティティの遺伝子による決定と一緒になっている可能性があると考えられている。
内側−外側の軸に沿った葉の形状に関しては、多数の植物の葉は一般に、軸としての葉軸に対して明瞭であり、およその左右対称性を示す(非特許文献13〜17参照)。しかし、この点についてはいくつかの例外も報告されている(非特許文献18〜20参照)。いずれにしても、このような対称性は葉の形状の複雑さ(例えば、単一又は複合)とは無関係である。
【0004】
対称性の葉の発生に関与するメカニズムを明らかにするために、本発明者らを含む数組のグループがシロイヌナズナのアシンメトリックリーブズ2(as2)及びアシンメトリックリーブズ1(as1)を検討している。そのような突然変異体の表現型は、葉身及び奇形の葉脈系の非対称性という点で極めてよく似ているが、異常は絶対的に同一というわけではない(非特許文献21〜24参照)。これらの遺伝子の異常は以下のように要約することができる。(1)as1変異体及びas2変異体の葉は、非対称性の裂片を持ち、両側性に非対称である下向きの巻きを示す。(2)肥厚し、且つ明瞭な主脈を生じることができず、2次葉脈のパターンも非対称性である(非特許文献23及び24参照)。(3)試験管内にてフィトクロムを含まない培地で培養した葉の切片は、野生型の葉の切片よりも高い頻度でシュートを再生する(非特許文献23参照)。(4)例えば、KNAT1、KNAT2、及びKNAT6のようなクラスIknox遺伝子の転写物が変異体の葉に蓄積する(非特許文献23参照)。(5)トウモロコシのROUGH SHEATH2(RS2)及びPHANの産物に関係するmyb様転写因子をコードするas1の転写物は、子葉原基及び葉原基における導管組織の周りに蓄積する(非特許文献21参照)。
【0005】
以上のように要約された所見は、as1及びas2が、葉身対称性の発生と同様に、葉の左右対称性の構造的な軸としての顕著な主脈を含む、葉脈システム全体の確立に関与する可能性があることを示唆している(非特許文献23参照)。それらはまた、おそらくクラスIknox遺伝子の発現を抑制することによって、発生上の決定的状況に葉細胞を維持する点で機能している可能性がある。葉脈システムの確立におけるこのような遺伝子の役割は、葉細胞の決定的状況を維持することと高く相関しているが、そのような相関の詳細は明らかにされていない。as1、as2及びas1とas2の二重変異植物の異常の類似性によってas1とas2は幾分遺伝的に相互作用しているという提案が導かれている(非特許文献23参照)。as1とas2が葉身形成を制御するメカニズムにおいてさらに見識を得るには、as2遺伝子及びas1遺伝子の両方の性状分析を行うことが極めて重要である。
【0006】
as2遺伝子座は、2つのシロイヌナズナのトランスジェニック株#14−22.4.4W3(T−1200)及び#14−68.1.4(T−1700)において、dAc−I−RSとして知られる転移因子の2つの誘導体の間に地図上の位置が決定されたことが、本発明者らにより報告されている(非特許文献25参照)。しかし、その詳細については報告されていなかった。
【0007】
【非特許文献1】
Steeves, T.A. and Sussex, I.M (1989) Cambridge University Press, Cambridge、
【非特許文献2】
Waites, R. et al. (1998) Cell 93:779−789、
【非特許文献3】
Hudson, A. (2000) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 7:581−587、
【非特許文献4】
Byrne, M., et al.(2001)Curr. Opin. Plant. Biol. 4:38−43
【非特許文献5】
Hake, S., et al. (1989) EMBO J. 8:15−22、
【非特許文献6】
Conway, L.J. and Poethig, R.S.(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10209−10214)、
【非特許文献7】
Hofer, J. et al., (1997) Curr. Biol. 7:581−587、
【非特許文献8】
Kim, G.T. et al. (1998) Genes Dev. 12:2381−2391、
【非特許文献9】
Berna, G., et al. (1999) Genetics, 152:729−742、
【非特許文献10】
Serrano−Cartagena, J., et al. (1999) Mol. Gen. Genet. 261:725−739、
【非特許文献11】
Timmermans, M.C., et al. (1999) Science 284 :151−153、
【非特許文献12】
Tsiantis, M., et al. (1999) Science 284 :154−156
【非特許文献13】
Ogura, Y. (1962) Plant Anatomy and Morphology. pp.102−134 Youkendo, Inc., Tokyo.、
【非特許文献14】
Hickey、L.J. (1973)Amer. J. bot. 60:17−33、
【非特許文献15】
Hickey, L.J. (1979)In Anatomy of the Dicotyledons. Edited by Metcalf, C.R. and Chalk, L. pp. 25−39. Oxford University Press, New York、
【非特許文献16】
Sinha、N.R. (1999) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mo;. biol. 50:419−446、
【非特許文献17】
Semiarti, E., et al. (2001a)Development 128 :1771−1783
【非特許文献18】
Whaley, W.G. and Whaley, C.Y. (1942) Amer. J. bot. 29:105−194,
【非特許文献19】
Lieu, S.M. and Sattler, R. (1976) Can J. Bot. 54:2108−2121、
【非特許文献20】
Dengler, N.G. (1999) Int. J. Plant Sci. 160:S67−S80
【非特許文献21】
Byrne, M.E. et al. (2000) Nature 408:964−971、
【非特許文献22】
Ori, N. et al. (2000) Development 127 :5523−5532、
【非特許文献23】
Semiarti et al. (2001a)、
【非特許文献24】
Sun, Y. et al. (2002) Planta 214:694−702
【非特許文献25】
Machida, C. et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8675−8680
【0008】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、植物における対称性で平坦な葉の発生、及び葉の葉脈を確立させるための手法を、詳細にはそのための遺伝子を確立することを目的としている。より詳細には、本発明は、as2遺伝子を単離し、その性状分析を行うことにより、対称性で平坦な葉の発生及び葉の葉脈の確立を制御する方法を提供し、そのために有用な新たなタンパク質AS2、及びそれをコードする遺伝子as2を提供するものである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、as2遺伝子を単離し、性状分析を行った。この遺伝子は、C‐モチーフと命名されたシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを含む新規タンパク質をコードする。データベースの検索では、AS2は、本発明者らがAS2ファミリーと命名したタンパク質の大きなファミリーに属することが判った。as2遺伝子の転写物は主として、胚発生中に子葉原基の向軸性ドメインで検出された。AS2は明瞭な核への局在シグナルを含んではいないが、緑色蛍光タンパクを結合したAS2は植物の核に局在していた。as2cDNAの過剰発現は、トランスジェニック植物のシュートの形成効率に低下を生じた。as2cDNAを過剰発現したトランスジェニックシロイヌナズナは、上向きに巻いた葉を生じ、時には葉身の適当な広がりを持たない竿型の葉を生じた。従って、AS2は、核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している可能性があることを見出した。
【0010】
本発明は、植物の葉形成関連タンパク質AS2に関する。詳細には、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している植物の葉形成関連タンパク質AS2、より詳細には、システインに富むC‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とする植物の葉形成関連タンパク質AS2に関する。より具体的には、植物の葉形成関連タンパク質AS2が、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列中のアミノ酸が置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質AS2に関する。
また、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質AS2をコードするDNA、より詳細にはDNAが、配列表の配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するものである植物の葉形成関連タンパク質AS2をコードするDNAに関する。
さらに、本発明は、植物の葉形成関連タンパク質AS2を用いた植物の葉の形成を制御するための組成物、植物の葉形成関連タンパク質AS2をコードするDNAからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、及びそれを含有してなるベクターに関する。
【0011】
本発明者らは、2つのシロイヌナズナのトランスジェニック株#14−22.4.4W3(T−1200)及び#14−68.1.4(T−1700)において、as2遺伝子座が、dAc−I−RSとして知られる転移因子の2つの誘導体の間に地図上の位置存在していることを決定していた。これに基づいてas2遺伝子のクローニングを行った。遺伝子地図に基づいたクローニングにおいて、BACクローンF5I14におけるPCR−RFLPマーカー以外に、遺伝的且つ分子マーカーとしてこのような2つのdAc−I−RS因子に着目した。この因子はハイグロマイシン耐性遺伝子を含んでおり、as2遺伝子座は最終的には、BACクローンF5I14における2つのPCR−RFLPマーカー(マーカー1とマーカー4)の間の32kbpの領域であることがわかった。
【0012】
図1に、シロイヌナズナの第1染色体のゲノムの領域構造、及びゲノム断片による相補性解析の結果を示す(図1A)。図1AのT−1200及びT−1700は、ハイグロマイシン耐性(Hygr)遺伝子によるdAc−I−RS転移因子の位置を示す。図1Bは、第1染色体におけるas2遺伝子付近の各BACクローン(F5I14、F1E22、及びF12P19)を示す。BACクローンF5I14の上に4種のマーカーの位置を示し、マーカーの上の番号は、それぞれのマーカーとas2遺伝子座との間での組換え体の数を示す(ほとんどの場合で10,000を超える染色体を調べた。)。
本発明者らは、我々はT−1200及びT−1700のハイグロマイシン耐性(Hygr)遺伝子から染色体ウォーキングを開始し、本発明者らが解析のために作成したRFLPマーカーである、マーカー1、マーカー2、マーカー3及びマーカー4のうちの、as2遺伝子がマーカー1とマーカー4の間の32kbpの領域であることを決定した。
【0013】
次に、as2−1変異体のこの領域のDNAのPCR−RFLP解析を行い、 配列を決定した。BACクローンF5I14のオープンリーディングフレーム(ORF)15に相当するORFにおいて、13bpの欠失を見い出した。さらに、本発明者らは、as2−2、as2−4、及びas2−5のような利用可能なその他の対立遺伝子がすべてこのORFにおいて突然変異を持っていることを見い出した(詳細は、後述する図2Aなどを参照のこと。)。ORF15における突然変異がas2の表現型に関与しているかどうかを確定するために、本発明者らは、ORF15すべてを含んでいる野生型ゲノムのApaI−HpaI断片(断片I;6.16kb)を、as2−1遺伝子が変異している植物(as2−1植物)に導入した。また、ORF15の上流領域を欠く断片II、及びORF15の上流領域とORF15の真ん中から断片Iの3’末端までを欠く断片IIIで、as2−1植物を形質転換した。この結果、断片Iのみがas2の表現型を示した。
図1Bは、as2周辺の染色体領域の拡大図及び相補性解析の結果を示すものであり、as2のcDNAの構造をゲノム構造の下に示す。相補性解析に用いた制限断片の構造を、I、II、IIIと表記された水平の線で示す。右側の記号+及び−はそれぞれ、相当するDNA断片との相補性試験の正及び負の結果を示す。
ORF15は、3000Daを超えるタンパク質をコードすることができる断片Iにおける唯一のリーディングフレームである。従って、この結果は、ORF15がas2遺伝子に相当することを示している。断片IIがas2の表現型を補完できなかったことは、断片IのApaIとBsu36Iとの間の領域がas2の発現に必要であることを示していた。
【0014】
本発明者らは、ORF15に相当するcDNAクローンを単離した。この塩基配列を配列表の配列番号1に示す。またそのアミノ酸配列を配列番号2に示す。as2遺伝子のヌクレオチド配列をcDNAの配列と比較すると、mRNAは、5’非翻訳領域にイントロンを2つ含むが、コーディング領域にはイントロンを含まず(図1B)、さらに、AS2は、199のアミノ酸残基を持つ新規のタンパク質をコードしていた。図2に、AS2の予想アミノ酸配列を示す。Cモチーフにおけるシステインの位置及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基の位置は、それぞれ星印(*)及び点(・)で示す。種々のas2対立遺伝子における突然変異したアミノ酸残基を野生型の配列の上にイタリック体で示す。
また、図3にas2のドメインの構成及び特有の特徴を示す。ボックスの下でブラケットで示す領域はas2ドメインである。灰色のボックスはCモチーフを示し、縞のあるボックスはロイシンジッパー様配列を表す。as2−1、as2−2、as2−4及びas2−5の突然変異の部位を示す。ボックスの下の数はアミノ酸残基の位置を示す。
【0015】
as2−1とas2−2の対立遺伝子は両方とも、ロイシンジッパー様配列をコードする配列の上流の同じ部位に13bpの欠失を有している。この欠失によって、AS2のカルボキシル末端(C−末端)側のほとんどを欠くが、追加の13アミノ酸残基を含む短いポリペプチドを生じるはずである(図2参照)。as2−4変異体では、AS2のC−末端側に相当するコーディング領域の真ん中に1bpの欠失があり、これによってAS2のC−末端48アミノ酸残基で新しい63残基による置き換えを生じるフレームシフト突然変異が起きていた(図2参照)。as2−5変異体では、タンパク質のアミノ末端(N−末端)側のコーディング領域で単一のグアニンヌクレオチドがアデニンヌクレオチドで置換されており、これによって、46位においてグルタミン酸残基によるグリシン残基の置換が生じていた(図2参照)。このグリシン残基は、以下に説明するように、AS2ファミリーのあらゆるメンバーで保存されている。従って、このグリシン残基はAS2の機能にとって必須である。
【0016】
次に、AS2及びその関連タンパク質の構造的な特徴を調べた。
予想されるAS2タンパク質は、81番目の残基から109番目の残基までのロイシンジッパー様配列を含んでおり、それには、6残基の間隔と共に、バリン、イソロイシン及びロイシンのような疎水性アミノ酸残基の5回の反復が含まれていた(図2参照)。データベース検索によれば、AS2のN−末端側は、シロイヌナズナ及びその他の植物種(Oryza sativa(イネ)、Glycine max(ダイズ)、Lycopersicon esculentum(トマト)など)の仮説遺伝子及びESTによってコードされる多数の推定上のN−末端側に、アミノ酸配列という点で類似していることが判った(図2B)。シロイヌナズナの配列に関する公的データベースには、AS2のN−末端側に関係するN−末端を持つタンパク質をコードしていると予想されるORFは少なくとも41あった。このようなタンパク質のうち、数個は、単にかすかにAS2に関係していると思われる(図4参照)。
図4に示すように、推定上のAS2様タンパク質の比較解析によって、Cx2Cx6Cx3C配列(この場合、xは保存的でない残基である;Cモチーフと命名した)は、データベース検索及びAS2(AS2の10位〜24位)で同定された41の予想タンパク質すべてのN−末端側において完全に保存されていることが判った。Cモチーフ以外にも、ロイシンジッパー様配列も41のタンパク質のほとんどで強く保存されていた。AS2を含む半分を超えるタンパク質が以下のような追加の保存的配列を持っていた:Cモチーフの中及び周りにおけるPCAACKFLRRKCxxxCVFAPYFP、Cモチーフとロイシンジッパー様配列との間におけるFAxVHKVFGASNVxKLL、及びロイシンジッパー様配列の周りにおけるRxxAVxSLxYEAxARxRDPVYGCVGxISxLQxQL(V又はI)xxLQxxLxxxxxxL(V又はI)(図4参照)。AS2のN−末端におけるアミノ酸配列の強い保存にもかかわらず、AS2のC−末端領域のアミノ酸配列は、その他のAS2様タンパク質及びデータベースにおけるその他のタンパク質の配列とは異なっていた(図3参照)。
【0017】
AS2では、N−末端配列は、Cモチーフとロイシンジッパー様配列を特徴としている。本発明者らは、この特徴的な領域をAS2ドメインと呼び、このドメインを含むタンパク質をAS2ファミリーのメンバーと呼ぶことにした。この命名法によれば、シロイヌナズナのゲノムは、AS2ファミリーに属するタンパク質をコードする可能性のあるORFを42含んでいることになる。図4に示すように、この遺伝子及びAS2に似た41のタンパク質の推定上の遺伝子に対してas2様遺伝子(ASL)という命名を付し、このような遺伝子にそれぞれ1〜41の番号を付けた。このような遺伝子のcDNAの一部のヌクレオチド配列はジェンバンク(GenBank)データベースに提出され、スアイ(Shuai B.)及びシュプリンガー(Springer、P.S)(2001年、表2参照)によってLOB及びLBDと命名された。
【0018】
図4に、AS2ファミリーメンバーにおけるAS2ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。AS2ファミリーのメンバー(ASLと呼ぶ、)の相当する領域の配列と共に、AS2の8番目から109番目の残基を並べる。20を超えるメンバーで保存されているアミノ酸残基を黒色背景上の白色文字で示す。Cモチーフにおけるコンセンサス配列及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基は、それぞれ星印(*)及び点(・)で示す。ファミリーのメンバーすべてで保存されており、as2−5対立遺伝子で突然変異していたグリシン残基は星印2つ(**)で示す。シロイヌナズナのAS2ファミリーのメンバーは2つのクラス(クラスI及びクラスII)に分割することができる。クラスIIの3を超えるメンバーで保存されていたアミノ酸残基を灰色で示す。多の植物における、O.s.はOryza sativa(イネ)を示し、G.m.はGlycine max(ダイズ)を示し、及びL.e.はLycopersicon esculentum(トマト)をそれぞれ示す。
【0019】
これらのAS2ファミリーのメンバーは少なくとも2つのクラス、クラスI及びクラスIIに分けることができる(図4参照)。クラスIは、AS2及び35のタンパク質(ASL1〜ASL35)から成り、Cモチーフ、ロイシンジッパー様配列及び上記で述べた主要な保存された残基のほとんどを含む。クラスIIは6つのタンパク質(ASL36〜ASL41)から成る。 このようなタンパク質は、Cモチーフ及び不完全なロイシンジッパー様配列を含み、その中では、4番目の疎水性残基が欠損しており、AS2ドメインにはさらに弱くしか保存されていない。その上、このクラスではクラスIIのあらゆるメンバーの間でほとんどのアミノ酸配列が保存されており、各タンパク質において僅かな残基が異なっているに過ぎない。
図5に、検索されたシロイヌナズナのAS2ファミリータンパク質の42メンバーに関する系統樹を示す。分枝上の数は、ProtMLプログラムで計算された、そこにおけるブーツストラップ値を表す。各水平の枝の長さは、概算された進化上の距離に比例するように作製されている。右側の区分は、AS2ファミリーのメンバーの分類を示す。
図5に示すように、クラスIIはクラスIからは離れて関係しているにすぎないことが系統樹により裏付けられ、クラスIのメンバーは、クラスIa及びクラスIbと命名されたサブクラスにさらに分割することができ、配列の保存性は弱いが、完全なロイシンジッパー様配列を持っていることが示された。
【0020】
次に、本発明者らは、野生型植物においてas2転写物の蓄積部位を調べた。12日令の植物の根、子葉、葉、及び茎頂、28日令の植物の花芽、35日令の植物のロゼット葉、茎上の葉、花の茎及び長角果からポリ(A)+RNAを精製し、次いで、RNA試料でプローブとしてas2のcDNAを用いたノーザンブロット解析を行った。結果を図6に図面に代わる写真で示す。図6はシロイヌナズナの種々の器官のポリ(A)+RNAのノーザンブロット解析の結果を示す。12日令植物の根(レーン1)、子葉(レーン2)、葉(レーン3)、及び茎頂(レーン4)、28日令植物の花芽(レーン5)、及び35日令植物のロゼット葉(レーン6)、茎上葉(レーン7)、花の茎(レーン8)及び長角果(レーン9)から等量の1.0μgのポリ(A)+RNAを調製した。同じブロットを対照としてΕφ−チューブリン(TUBA)をプローブとして調べた。右側の数はマーカーRNA分子の大きさを示す。
as2の転写物は、花の茎を除いて解析した試料のすべてで検出された(図6参照)。as2転写物のレベルは、小さな発生途上の葉が含まれる茎頂の試料で最も高かった。このようなデータは、as2突然変異は、子葉、ロゼット葉、茎上の葉、萼片及び花弁のようなあらゆる葉様の器官における変異体の表現型として明白であるが、茎にはないという以前の観察と一致している(非特許文献23参照)。しかしながら、as2転写物は根で検出されたが、as2植物の根は野生型の根と似ていた。
【0021】
本発明者らは、プローブとしてas2のcDNAを用いたインスート(in situ)ハイブリダイゼーション法によって胚発生過程におけるas2の発現部位についても調べた。結果を図7に図面に代わる写真で示す。図7は、インスート(in situ)ハイブリダイゼーション法によるas2転写物の検出(a〜d)結果を示す。アンチセンスプローブで得られたas2転写物の分布パターンである。図7の(a)は球状ステージ;(b)は三角ステージ;(c)はハート型ステージ;(d)は魚雷型ステージ;(e)は(a)〜(d)のセンス対照パネルを示す。種皮の真下の細胞層の赤味がかった茶色の着色(白色の星印で示す)は、両方のプローブで生じるのでas2のRNAに特異的ではない。図7の縮尺棒は20μmを示す。
球状ステージの胚では、as2の転写物はすべての細胞で検出された(図7参照)。三角の胚の上部にて膨らみが形成されるにつれて、as2の転写物は、胚の最上層領域に蓄積した(図7(b)参照)。ハート型ステージから魚雷型ステージまで、子葉原基の向軸性側での原表皮細胞でシグナルを検出した(図7(c)、(d)参照)。ウォーキング−スティックステージの後、as2転写物の蓄積は、特定の領域に明瞭に濃縮されることなく、子葉原基の至るところで検出された(データは示さず)。発芽の後、茎頂のメリステムの周り、葉の原基及び成熟した葉においてインスート(in situ)では特異的なハイブリッドの形成のシグナルは検出されなかった。しかしながら、as2転写物の蓄積は、ノーザンブロットで確認された(図6参照)。
【0022】
次に、AS2の核内への局在について調べた。予想されたAS2タンパク質は核内への明瞭な局在シグナル(NLS)を含んでいない(図2参照)。
本発明者らは、AS2が植物細胞の核に局在するかどうかを確定するために、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の35Sプロモータ(35S::as2::GFP)の制御下での転写とともに、as2cDNAを緑色蛍光タンパク(GFP)のDNAに結合した融合コンストラクトを作製した。この融合コンストラクトを粒子衝撃法によってタマネギの上皮細胞に導入し、GFPによる蛍光をモニターした。結果を図8に図面に代わる写真で示す。図8は、タマネギの上皮細胞におけるas2::GFPの細胞小器官の局在をモニターした結果を示す。図8のA及びBは35S::as2::GFPの場合を示し、図8のC及びDは35S::NLS::GFPの場合を示し、図8のE及びFは35S::GFPの場合を示す。それぞれの遺伝子を衝撃によってタマネギの上皮細胞に導入し、導入した組織を28℃にて16時間培養した。蛍光顕微鏡下で蛍光をモニターした(左側のパネル(図8のA、C及びE)。また、1μg/mLのDAPIで染色した核を右側のパネル(図8のB、D及びF)に示す。図8の各縮尺棒は100μmを示す。
図8に示すように、as2−GFPによる蛍光シグナルは、SV40のNLSによって調製されたNLS−GFPによる類似のシグナル同様に主として核内にて検出された(図8A、C)。35S::GFPのコンストラクトをタマネギ細胞に導入した場合、GFPによるシグナルは核及び細胞質の双方で検出された(図8E)。このような結果は、AS2が核内タンパクであることを示している。
【0023】
次に、本発明者らは、AS2を過剰に生産するシロイヌナズナ植物の表現型を調べた。35Sプロモータにas2cDNAを結合させ(35S:as2)、as2を過剰に発現するトランスジェニックのシロイヌナズナ植物を作出した。結果を図9に図面に代わる写真で示す。図9のAは、空のベクターpSK1(a)及びpSK35S::as2(b)により形質転換したCol−0由来の根断片をインキュベートし、インキュベートを開始後21日目に写真撮影した結果を示す。図9Aの縮尺棒は10mmを示す。図9のBは、トランスジェニックしたシロイヌナズナ植物の表現型を示す。図9Bの(a)は空のベクターpSK1で形質転換した35日令の植物の場合を示し、(b)はpSK35S::as2で形質転換した35日令の植物の場合を示し、(c)はpSK35S::as2で形質転換した25日令の植物の場合を示し、(d)は(c)の植物をさらに15日間成長させた場合を示す。図9Bの縮尺棒は10mmを示す。図9Cは、トランスジェニック植物及び野生型植物(Col−0)におけるas2遺伝子の転写物のRT−PCR解析の結果を示す。RT−PCRのサイクル数をそれぞれのパネルの右側に示す。増幅したDNA断片をアガロースゲル上の電気泳動で分画し、臭化エチジウムで染色して視覚化した。レーン1は図9Bの(d)に示されるトランスジェニック植物の場合を示し、レーン2は野生型(Col−0)植物の場合を示す。as2転写物のオープンリーディングフレームの領域に特異的なプライマーで増幅した産物(a;ORF)、as2転写物の3’非翻訳領域に特異的なプライマーで増幅した産物(b;UTR)、及びα−チューブリンに対する遺伝子の転写産物に特異的なプライマーで増幅した産物(c;α−tubulin)を示す。図9Dは、それぞれの葉の表現型を示す。(a)は典型的な35日令の野生型Col−0植物の場合を示し、(b)はas2−1植物の5番目の葉を示す。軽い表現型の変化(c)及び厳しい表現型の変化(d)を示すトランスジェニック植物の典型的な葉を示す。後者の葉の位置は決定することができなかった。図9Dの縮尺棒は5mmを示す。
【0024】
この予備実験のデータは、形質転換したシュート(shoot)を作出するのは困難であることを明示していた(図9A)。従って、本発明者らは先ず、従来の根形質転換法により形質転換されたシュートのおよその作出効率を確定した。
形質転換について、用いた根の数当りの形質転換された緑色カルス、再生されたシュート(shoot)、及び花の茎を伴うシュート(shoot)の数を数えた。結果を次の表1に示す。
【0025】
【表1】
【0026】
表1中のカッコ()内の数値は、根当たりの形質転換体の平均数を示す。
表1は、35S:as2を根組織に導入した場合の緑色カルスの形成効率は、空のベクタープラスミド、pSK1を形質転換に用いた場合よりも低いことを示している。トランスジェニックシュート及び花の茎を伴うシュートの再生効率は、5倍〜10倍低い(表1参照)。
このようなデータは、as2cDNAの過剰発現は、緑色組織における細胞増殖及び/又はシュートの再生に抑制効果を持つことを示した。
as2cDNAを過剰発現する2つのトランスジェニック株を得た。このcDNAに由来するas2転写物がさらに厳しい表現型を示すトランスジェニック株の1つに蓄積されていることを確認した(図9C参照)。トランスジェニック植物の1つの株は、軽い矮性の表現型を持ち、上向きに巻いた葉を生じた(図9Bの(b)参照)。トランスジェニック植物のもう1つの株は、さらに厳しい異常な表現型を伴っており、植物成長の早期ステージで極めて狭い葉身を持つ葉を生じた(図9Bの(c)、及び図9Dの(c)参照)。この葉身は広がることができず、竿状の葉を生じた(図9Bの(d)、及び図9Dの(d)参照)。
【0027】
以上のことから、AS2における機能的ドメインを考察した。
as2遺伝子は、そのN−末端側にCモチーフ(Cx2Cx6Cx3Cとして定義される)及びロイシンジッパー様配列を含み、そのC−末端側に明らかに独特な配列を含む199のアミノ酸残基の新規タンパク質をコードすると思われる(図2、図3参照)。ロイシンジッパー配列がタンパク質−タンパク質の相互作用に関与することは一般的に受け入れられており、as2のロイシンジッパー様配列は、AS2といくつかのそのほかのタンパク質との会合に役割を担っている可能性があると考えられる。そのような相互作用がAS2の作用に必須かも知れない。
Cモチーフは本発明で初めて同定されたが、それはむしろ、一般にCx2〜3CxnCx2〜3C(n>12)のコンセンサス配列を持ち、その他の巨大分子との相互作用で機能するジンクフィンガーに似ている(Pavletich, N.P. and Pabo, C.O. (1991) Science 252 :809−817、 Wang, J.H. et al. (1998) Immunity 9:543−553)。Cモチーフもまた、例えば、DNAやタンパク質、特にAS1のようなその他の巨大分子との会合に関与しているのはありそうなことである。AS2の機能を完全に解明するには、AS2が相互作用する分子の同定及び性状分析がさらに必要である。
【0028】
AS2のC−末端側の配列は、既知のモチーフを含む(図3参照)データベースのどのタンパク質の配列とも異なっている。as2−4対立遺伝子はこの領域にフレームシフト突然変異を持っていたが、この対立遺伝子による表現型は、他のas2対立遺伝子による表現型に似ているので、C−末端側は、新しく特徴付けられたAS2ドメインを含むN−末端側以外のAS2の機能に必須であると考えられる。
【0029】
as1及びas2の双方共、クラスIknoxホメオボックス遺伝子の発現を抑制するが、そのような抑制が直接的に又は間接的にas1及びas2に起因するのかどうかは明らかではない。本発明者らは本発明により、他の未だ同定されていない核内タンパク質との相互作用を介して核におけるクラスIのknox遺伝子の抑制に関与するタンパク質に対して予想されるように、as2:GFP融合タンパクが植物細胞の核に局在することを明らかにした(図8参照)。as1:GFP融合タンパクも核内に局在していた(未発表データ)。このような所見は、as1はas2が核において相互作用する分子の1つであるという仮説に矛盾しない。
as2cDNAの過剰発現によって上向きに巻いた葉及び子葉が誘導された(図9参照)。それに対して、as2の機能欠損突然変異では、下向きに巻いた葉及び子葉を生じた(非特許文献23参照)。従って、as2は、葉身における向軸性ドメインの成長の抑制又は背軸性ドメインの成長の刺激に関与している。形質転換(図9B参照)及び胚の子葉原基における向軸性ドメインでのas2の発現(図7参照)の際に、成長抑制効果が認められたことを考慮すれば、as2は向軸性ドメインの抑制に機能していると推測することができる。そのような抑制が、細胞の増殖又は伸長の阻害を介して成し遂げられるのかどうかを調べるのは興味深いであろう。
分子レベルでのAS2活性の詳細がどうであれ、過剰発現に関する本発明及びas2突然変異の葉に関する以前の研究は、AS2が葉の対称性と同様に平坦な葉身の拡張に関与していることを示している。葉のドメインの向軸性−背軸性の運命に関与する遺伝子における突然変異は、葉の運命の決定を妨害し、竿型の葉の形成を誘発することが多い。as2とこのような遺伝子の間に関係があるのかも知れない。このような背景で、as1の機能がPHANの機能に類似するかどうかを調べることが残されているものの、as1がPHANのシロイヌナズナにおけるホモログであることは注目に値する。
【0030】
次にASLタンパクの機能について考察してみる。
AS2様タンパク質のN−末端側におけるアミノ酸配列の保存性によって、結果として、このようなタンパク質が、AS2ファミリーと呼ばれる植物タンパクの新しいファミリーを形成していることを示した。as2の発現を伴うこのファミリーのメンバーであるシロイヌナズナのタンパク質をASL(AS2様)タンパクと命名した(図4参照)。アミノ酸配列における類似性及びASLのAS2ドメインの系統樹は、ASLタンパクが、サブクラス、クラスIaとクラスIbを持つクラスI及びクラスIIに分割できることを示した(図2、及び図5参照)。
as2の発現を伴うAS2ファミリーメンバーの機能を同定することが残されたままであるが、AS2は、対称で、平坦で丸い葉身の形成及び明瞭な主脈を含む葉脈パターンの確立に必要とされる多であることが判明した。さらに、as2はas1と共に作用して、クラスIknoxホメオボックス遺伝子の発現を抑制する能力を持つ。AS2ドメインにおける保存的なグリシン残基のグルタミン酸残基による置換は、変異体の表現型を生じるので(図2〜図4参照)、AS2ドメインと同様にこの残基がAS2の機能で重要な役割を担っていることは明らかである。クラスIaのメンバーの一部はAS2ドメインのアミノ酸配列に強い保存を示すが(例えば、ASL1とASL2)、AS2の機能には、N−末端側AS2ドメイン以外に独特であるC−末端領域が必要とされるので、それらは異なった機能を持つ可能性がある。このような密接に関係するASLの役割に関する明瞭な見識にはさらなる遺伝的及び分子的実験が必要であろう。
【0031】
最近、ASL4に対する遺伝子に相当するLOB遺伝子(受入番号AF447897)が、通常メリステムと器官原基との境界に発現されるが、as1では存在せず、as2でも激減することが提言されたているが、LOB遺伝子の発生上の役割が未だ確定されていない。
クラスIIを構成する6つのASLは、クラスIとは異なる特徴的な構造の特性を持っており(図4参照)、そのアミノ酸配列は互いに極めて類似している。 このような遺伝子の発現が報告された(表2参照)ということは、それらが機能的遺伝子であることを示唆している。従って、クラスIIのメンバーはシロイヌナズナの発生途上で異なった役割を担っている可能性があると考えられる。
【0032】
本発明で報告したヌクレオチド及びアミノ酸の配列に関するジーンバンクの受入番号は以下のとおりである。AS2(AB080802);及びBACsF5I14(AC001229)、F1E22(AC007234)、及びF12P19(AC009513)。シロイヌナズナのAS2ファミリータンパク質のメンバーに関する情報を次の表2に要約する。
【0033】
【表2】
【0034】
表2中のBACコード及び遺伝子コードはTAIRデータベースから得たものであり、EST IDはEMBLデータベースから得たものである。表2の中のいくつかのASLタンパク質は、LOBドメイン(LBD)タンパク質として既にジーンバンクに提出されたものである。
【0035】
本発明は、新規な植物の葉形成関連タンパク質AS2を提供するものである。本発明のタンパク質AS2は配列表の配列番号2に記載されたアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましいがこれに限定されるものではない。本発明のタンパク質は、植物細胞の核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御できる機能を有するものであり、タンパク質のアミノ酸配列としてはシステインに富むC‐モチーフからなるシステイン反復配列及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とするものである。本発明のタンパク質のC−モチーフとしては、好ましくはCx2Cx6Cx3C(Cはシステインを示し、xは任意のアミノ酸を示す。)のアミノ酸配列を有するもの、より具体的なアミノ酸配列としてはCモチーフの中及び周りにおけるPCAACKFLRRKCxxxCVFAPYFP(アルファベットはアミノ酸の1文字表記を示し、xは任意のアミノ酸を示す。)のアミノ酸配列が挙げられる。また、ロイシンジッパー様モチーフとしては、好ましくはRxxAVxSLxYEAxARxRDPVYGCVGxISxLQxQL(V又はI)xxLQxxLxxxxxxL(V又はI)(アルファベットはアミノ酸の1文字表記を示し、xは任意のアミノ酸を示す。)のアミノ酸配列を例示することができる。さらに、Cモチーフとロイシンジッパー様配列との間における好ましいアミノ酸配列としてはFAxVHKVFGASNVxKLL(アルファベットはアミノ酸の1文字表記を示し、xは任意のアミノ酸を示す。)が挙げられ、この中のG(グリシン)は必要な配列である。
したがって、例えば、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質においては、C−モチーフやロイシンジッパー様モチーフなどやグリシン位置が保存され、植物の葉の形成に関連する機能を有するものである限りにおいては、当該アミノ酸配列中のアミノ酸の1個又は2個以上、好ましくは1〜50個のアミノ酸が任意に置換、挿入、若しくは欠失してもよいアミノ酸配列からなる植物の葉の形成に関連するタンパク質AS2を提供するものである。本発明の好ましいタンパク質としては前記で説明してきたようなAS2ファミリーに属するアミノ酸配列を有するタンパク質などが挙げられる。
【0036】
また、本発明は前記した本発明の植物の葉形成関連タンパク質のいずれかをコードするDNAを提供するものである。本発明のDNAは1本鎖であっても2本鎖のものであってもよく、細胞内において前記した本発明の植物の葉形成関連タンパク質AS2を産生できるものであれよい。また、本発明のDNAは必要によりRNAの形態であってもよい。本発明のDNAの例示として、配列表の配列番号1に記載の塩基配列、又は当該塩基配列にストリージェントな条件下でハイブリダイズし得る塩基配列を有するDNAなどが挙げられる。
本発明のDNAは、DNA単独であってもよいが、適当なプラスミドなどからなるベクターに組み込まれたものであってもよい。したがって、本発明は、前記した本発明のDNAを含有してなるベクターを提供するものである。
【0037】
本発明のタンパク質AS2は植物、好ましくはシロイロナズナの葉の形成に関連するものであり、正常な葉の形成を制御することができる。従って、本発明は前記した本発明のタンパク質AS2を含有してなる植物の葉の形成を制御するための組成物、又は制御剤を提供するものである。また、本発明のタンパク質の使用に代えて必要に応じて、前記した本発明のDNAを使用することができる。したがって、本発明は、前記した本発明のDNAからなる植物の葉の形成を制御するための遺伝子、または制御用の組成物、又は制御剤を提供するものである。
【0038】
【実施例】
次に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
なお、以下の実施例において、植物の分析については、種子を土壌に播いて、4℃にて暗所で2日後、22℃にて16時間3000ルクスの白色光照明の条件に植物を移した。植物の日齢は、播種後の日数という観点で提供した。
as2−5対立遺伝子は、リールシーズ(米国テキサス州、ラウンドロック)から購入したエチルメタンスルホネートで変異誘発したLer−0の種子のM2集団から単離した。トランスジェニック株、#14−22.4.4W3(T−1200)及び#14−68.1.4(T−1700)は、(I−RS/dAc−I−RS)#14株から単離した。それらは、ハイグロマイシン ホスホトランスフェラーゼに対する遺伝子を含む転移dAc−I−RS因子(受入番号AB055064)を持っていた。#14−22.4.4W3(T−1200)及び#14−68.1.4(T−1700)の背景は、両者共にLerエコタイプであった。
【0039】
実施例1 (as2遺伝子のクローニング)
減数***組換え休止点を作成し、as2−1突然変異と隣接するトランスポゾンマーカー#14−68.1.4(T−1700)及び#14−22.4.4W3(T−1200)との間の組換えをスクリーニングすることによって、as2遺伝子の近傍で同定した。ハイグロマイシン耐性を示し、as2−1の表現型を持つ、このような組換え体を用いて、as2遺伝子に関するPCR−RFLPマーカーの地図上の位置決めを行った。PCR−RFLPマーカーとして用いた配列に関する情報は、ペンシルベニア大学、TAIRウエブサイト(http://www.arabidopsis.org/)におけるシロイヌナズナゲノムセンターのウエブサイトから入手し、BACクローンF5I14(ジーンバンク受入番号AC001229)のPCR−RFLPマーカーのヌクレオチド配列は以下のとおりである:
マーカー1については、
5’−TGTAACTCTTCCGTCCGGTTTG−3’及び
5’−GCAAAGTCCATAGAGGAGCAAG−3’、
マーカー2については、
5’−TTGGGTTTGCACCGAAACTCAG−3’及び
5’−AGTGACAGACAGTGACCACAAG−3’、
マーカー3については、
5’−TGGTGGGATGAAACTTTGTGAG−3’及び
5’−CTCTCTCTTTCTCACTCTTCTC−3’、
マーカー4については、
5’−AGAAAACTGCTGTCTTCGGGAC−3’及び
5’−TCCAAAGCACTCTCTAGCTTGG−3’
である(図1参照)。
【0040】
実施例2 (相補性解析)
相補性実験に関する二成分プラスミドを構築するために、6.16kbpのApaI−HpaI断片(図1における断片I)、4.75kbpのBsu36I−HpaI断片(図1断片II)及び2.2kbpのBsu36I−BglII断片(図1の断片III)を、pBI101(Jefferson, R.A., et al. (1987)EMBO J. 6:3901−3907)に由来し、1’プロモータ::バー(Yoshioka, Y., et al. (2001) Gnese. Genet. Syst. 76:189−198)を含むpBI−BARプラスミドに別々に挿入した。新しく構築したプラスミドをアグロバクテリウム(Agrobacterium tumefaciens)株、GV3101に導入した。次いで、別に記載するように(Clough, S.J. and Bent, A.F. (1998) Plant J. 16:735−743、 Galbiati,M., et al. (2000) Funct. Integr. Genomics1:25−34)、吸引浸潤により植物全体を形質転換した。0.01%のバスタ(Basta)(ドイツ、フランクフルト、AgroEvo)を含む土壌にてトランスジェニック植物を選抜したが、それは、どの遺伝子型のトランスジェニック植物をサザンブロットで解析したかということである。
【0041】
実施例3 (cDNAのクローニング)
16日令の植物からポリ(A)+RNAを調製した。逆転写PCRのために、cDNAの第1の鎖は、浜田らの方法(Hamada, S., et al. (2000) Plant J. 24:91−101)に準じて作成した。次いで、プライマー、
ORF15SF(5’−GGGTCGACATGGCATCTTCTTCAACAAACTCAC−3’)及び
ORF15NR(5’−GGGCGGCCGCTCAAGACGGATCAACAGTACGGC−3’)
によりas2のcDNAを増幅した。次いで増幅した断片をpBluescriptSK(−)(米国カリフォルニア州、ラホヤのストラタジーン)のSalT/NotI部位に連結し、ヌクレオチドの配列決定によって同一性を確認した。cDNAの5’末端配列は、プライマー、ORF15MR(5’−TATCTGAAGCTGACGAAGCTGATG−3’)を伴った5’−RACE及びアダプタプライマーにより決定した。cDNAの3’末端配列は、プライマー、ORF15MF(5’−GATCTCAGCTGTGCTAAATCTGAGC−3’)を伴った3’−RACE及びアダプタプライマーにより決定した。突然変異対立遺伝子(as2−1、as2−2、as2−4及びas2−5)のヌクレオチド配列は、各変異体のゲノムDNAからas2遺伝子領域を増幅することによって決定した。各変異植物から単離されていたポリ(A)+RNAから得たas2のcDNAのヌクレオチド配列も決定した。
【0042】
実施例4 (系統樹解析)
TAIR BLASTの2.0バージョンのプログラムを用いて(http://arabidopsis.org/Blast/index.html)、TAIRでのAGIデータセット(AGI、全ゲノムからのタンパク質)からas2に類似したシロイヌナズナの遺伝子を入手した。ゲノムネットブラストT2プログラム(http://www.blast.genome.ad.jp/)を用いて、ゲノムネットにおけるデータセットからその他の植物種のas2様遺伝子を入手した。CLUSTAL Wのバージョン1.8(Thompson, J.D., et al. (1994) Nucl. Acid. Res. 22:4673−4680)を用いてシロイヌナズナのAS2ファミリーの42メンバーのAS2ドメインの配列を並べた。最尤(ML)系統樹の構築のために、部分的再構成検索のために出発系統樹として近隣連結(NJ)系統樹を用いた。MOLPHYのバージョン2.3b3パッケージにおけるNJdist及びprotMLプログラムを用いた(http://www.ism.ac.jp/software/ismlib/softother.htm#molphy;Adachi, J. and Hasegawa, M. (1996) Comput. Sci. Monogr. 28:1−150)。NJdistからNJ系統樹を得て、ProtMLからML系統樹を得た。
それぞれの分枝の部分的なブートストラップ確率は、ProtMLプログラムを用いて概算した(Himi, S., et al. (2001) J. Mol. Evol. 53:387−393、 Sakakibara, K., et al., (2001) Mol. Biol. Evol. 18:491−502)。
【0043】
実施例5 (RNAのゲルブロット解析)
Col−0野生型植物の解析のために、12日令の植物から採取した根、子葉、葉、及び茎頂、28日令植物から採取した花芽、及び35日令植物から採取したロゼット葉、茎上葉、花の茎及び長角果を用いた。等量の1.0mgのポリ(A)+RNAを単離し、ノーザンブロットを行った。as2に対する部分的cDNAをプローブとして用いた。
プライマー1(5’−GATCTCAGCTGTGCTAAATC−3’)及び
プライマー2(5’−TCAAGACGGATCAACAGTAC−3’)
を用いてPCRによりそれを増幅し、PBluescriptSK(−)のEcoRV部位にクローニングした。ヌクレオチドの配列決定によりその同一性を確認した。ORFのコドン151からコドン200を伸長したプラスミドpas2c300をEcoRIとClaIで切断することにより作成された、停止コドンを持つ300bpの断片をハイプライムDNAラベリングキット(ドイツ、マンハイムのベーリンガーマンハイム)を用いて、製造元の指示書に従って、[α−32P]dCTPで標識した。この標識した断片をプローブとして用いた。
【0044】
実施例6 (インスート(in situ)ハイブリダイゼーション法)
植物の固定、パラフィン包埋及びin situハイブリッド形成のために用いた方法の詳細は、http://www.genetics.wisc.edu/CATG/barton/index.htmlで見い出すことができ、中西らの方法(Nakashima, M.,et al(1998)Plant cell Physiol. 39:690−700)に準じて行った。ミクロトーム(日本の東京のエルマ社)を用いて切片(厚さ8μm)を作成した。ClaIでプラスミドpas2c300を線状化した後、T3 RNAポリメラーゼによりアンチセンスRNAプローブを作成した。センスRNAプローブは、EcoRIでpas2c300を線状化した後、T7 RNAポリメラーゼによって作成した。
【0045】
実施例7 (プラスミドの構築)
CaMV 35Sプロモータの下流の二成分ベクターpSK1(Kojima, S., et al.(1999) DNA Res. 6:407−410)のXbaI及びNotI部位にて開始コドンから停止コドンまで伸長したas2cDNA(600bp)の断片を挿入することによってプラスミドpSK35S::as2を構築した。pTH−2(Chiu, W.,et al. (1996) Curr. Biol. 6:325−330)のSalIとNcoI部位にて、開始コドンから199番目のアミノ酸コドンまで伸長したas2cDNA(597bp)断片及び3つのアラニンリンカー配列(5’GCAGCTGCC3’)を挿入することによりプラスミドp35S::as2::GFPを構築した。35S::NLS::GFP及び35S::GFPを含むプラスミドは西浜らの方法(Nishihama, R.,et al. (2001) Genes Dev. 15:352−363)に準じて調製した。
【0046】
実施例8 (シロイヌナズナの形質転換)
小野内らの方法(Onouchi, H., et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247:653−660)に準じて、アグロバクテリウムが介在するシロイヌナズナの根外植片の形質転換を行った。pSK35S::as2又はpSK1(Kojima et al. (1999))を入れたアグロバクテリウムLBA4404/pAL4404(Hoekema, A., et al.(1984) J. Bacteriol 158:383−385)細胞を根外植片と共に培養した。15mg/LのハイグロマイシンB(Onouchi et al. (1995))の存在下、シュート誘導培地で形質転換体を選抜した。プラスミドpSK35S::as2又はpSK1を用いてA. tumefaciens株GV3101を形質転換した。次いで、吸引浸潤により植物全体を形質転換した。15mg/LのハイグロマイシンB及び300mg/Lのカルベニシリンを含むMS培地でトランスジェニック植物を選抜した。
【0047】
実施例9 (as2::GFPタンパクの細胞小器官局在)
フォンアミムらの方法(von Amim, A.G. and Deng, X.W. (1994) Cell 79:1035−1045)に従って、タマネギ球根の上皮層における細胞をp35S::as2::GFP、p35S::NLS::GFP又はp35S::GFPで形質転換した。冷却CCDカメラシステム(アリゾナ州、トゥーソンのフォトメトリクス)を装備した蛍光顕微鏡(ドイツ製、アキシオプラン2)によって蛍光シグナルを記録した。画像の疑似着色及びGFPからのシグナル量と細胞の幅の測定は、IPラボソフトウエアプログラム(バージニア州フェアファックスのスキャナリティクス)により行った。同一の細胞を1μg/mLの4’6−ジアミジノ−2−フェニルインドールジヒドロクロリド(DAPI)で染色し、同様に蛍光を記録した。
【0048】
実施例10 (逆転写−ポリメラーゼ鎖反応(RT−PCR))
トランスジェニック植物及び野生型の花芽を採取し、直ちに液体窒素中で凍結し、−80℃に保存した。ポリ(A)+RNAを精製し、cDNAの第1鎖を合成した。α−チューブリンcDNA特異的なプライマーによるDNA断片の均等な増幅を行うために試料の体積を正規化した。次いで、セミアルチらの方法(非特許文献23参照)によりPCRを行った。内因性as2の転写物に特異的に由来するDNA断片を増幅するために、as2転写物の5’及び3’非翻訳領域においてプライマーセットの設計のための部位を選択したが、それらは両方共、トランスジェニック植物を作出するのに用いたcDNAには存在しない。プライマー対は以下のとおりである:
α−チューブリンについては、
pU51(5’−GGACAAGCTGGGATCCAGG−3’)及び
pU52(5’−CGTCTCCACCTTCAGCACC−3’)、
as2遺伝子のcDNAの非翻訳領域については、
pU73(5’−CCCCTCTGAGCAACAGAAAGC−3’)及び
pU74(5’−CCAAAACCCTAAAATCTCAAGACGG−3’)、
as2cDNAのオープンリーディングフレームの領域については
pU328(5’−GTGTTTGGAGCAAGTAACGT−3’)及び
pU315(5’−AAACCTAGGAGACGGATCAACAGTACGGCG−3’)
である。
【0049】
【発明の効果】
本発明は、核における特定の遺伝子の転写、対称性で平坦な葉身の発生、及び葉の葉脈の確立を制御している新規なタンパク質AS2、及びそのファミリーを提供するものである。
本発明の植物の葉形成関連タンパク質AS2は、アミノ酸配列としてシステインに富むC‐モチーフからなるシステイン反復配列、特定の位置でのグリシン、及びロイシンジッパー様モチーフを有することを特徴とするものであり、このような特徴的なアミノ酸配列を有する1群のタンパク質が植物、好ましくはシロイロナズナに存在し、これらのタンパク質が植物の葉形成に関連し、葉の形成を制御していることを本発明は明らかにするものである。したがって、本発明は、これらのタンパク質AS2からなる植物の葉の形成、成長、保存の制御剤を提供するものである。
【0050】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図1】図1は、シロイヌナズナの第1染色体のas2遺伝子座を含むゲノムの領域構造及びゲノム断片による相補性解析の結果を示すものである。図1Aはシロイヌナズナの第1染色体のゲノムの領域構造を示し、T−1200及びT−1700は、ハイグロマイシン耐性(Hygr)遺伝子によるdAc−I−RS転移因子の位置を示す。図1Bは、BACクローンF5I14、その中のマーカー位置を含むas2周辺の染色体領域の拡大図及び相補性解析の結果を示す。as2cDNAの構造をゲノム構造の下に示す。相補性解析に用いた制限断片は、I、II、IIIと表記された水平の線で示す。右側の記号+及び−はそれぞれ、相当するDNA断片との相補性試験の正及び負の結果を示す。
【図2】図2は、本発明のタンパク質AS2のアミノ酸配列の例を示す。Cモチーフにおけるシステインの位置及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基の位置は、それぞれ星印(*)及び点(・)で示す。種々のas2対立遺伝子における突然変異したアミノ酸残基は、野生型配列の上にイタリック体で示す。
【図3】図3は、本発明のタンパク質AS2のドメインの構成及び特有の特徴を示す。ボックスの下でブラケットで示す領域はAS2ドメインである。灰色のボックス及び縞のあるボックスはそれぞれCモチーフ及びロイシンジッパー様配列を表す。as2−1、as2−2、as2−4及びas2−5の突然変異の部位を示す。ボックスの下の数はアミノ酸残基の位置を示す。
【図4】図4は、AS2ファミリーメンバーにおけるAS2ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。AS2ファミリーのメンバーの相当する領域の配列と共に、AS2の8番目から109番目の残基を並べる。20を超えるメンバーで保存されているアミノ酸残基を黒色背景上の白色文字で示す。Cモチーフにおけるコンセンサス配列及びロイシンジッパー様配列における疎水性残基は、それぞれ星印(*)及び点(・)で示す。ファミリーのメンバーすべてで保存されており、as2−5対立遺伝子で突然変異していたグリシン残基は星印2つ(**)で示す。シロイヌナズナのAS2ファミリーのメンバーは2つのクラス(クラスI及びクラスII)に分割することができる。クラスIIの3を超えるメンバーで保存されていたアミノ酸残基を灰色で示している。その他の植物における、O.s.はOryza sativa(イネ)を示し、G.m.はGlycine max(ダイズ)を示し、L.e.はLycopersicon esculentum(トマト)を示す。
【図5】図5は、シロイヌナズナのAS2ファミリータンパク質の42メンバーに関する系統樹を示す。分枝上の数は、ProtMLプログラムで計算された、そこにおけるブーツストラップ値を表す。各水平の枝の長さは、概算された進化上の距離に比例するするように表示されている。右側の区分は、AS2ファミリーのメンバーの分類を示す。
【図6】図6は、シロイヌナズナの種々の器官におけるas2転写物のポリ(A)+RNAのノーザンブロット解析の結果を示す図面に代わる写真である。12日令植物の根(レーン1)、子葉(レーン2)、葉(レーン3)、及び茎頂(レーン4)、28日令植物の花芽(レーン5)、及び35日令植物のロゼット葉(レーン6)、茎上葉(レーン7)、花の茎(レーン8)及び長角果(レーン9)から等量の1.0μgのポリ(A)+RNAを調製した。同じブロットを対照としてΕφ−チューブリン(TUBA)をプローブとして調べた。右側の数はマーカーRNA分子の大きさを示す。
【図7】図7は、インスート(in situ)ハイブリダイゼーション法によるas2転写物の検出(a〜d)結果を示す図面に代わる写真である。アンチセンスプローブで得られたas2転写物の分布パターン。(a)球状ステージ;(b)三角ステージ;(c)ハート型ステージ;(d)魚雷型ステージ;(e)(a)〜(d)のセンス対照。種皮の真下の細胞層の赤味がかった茶色の着色(白色の星印で示す)は、両方のプローブで生じるのでas2のRNAに特異的ではない。縮尺棒は20μmを示す。
【図8】図8は、タマネギの上皮細胞におけるas2::GFPの細胞小器官局在化の結果を示す図面に代わる写真である。35S::as2::GFP(A、B)、35S::NLS::GFP(C、D)及び35S::GFP(E、F)を衝撃法によりタマネギの上皮細胞に導入し、導入した組織を28℃にて16時間培養した。蛍光顕微鏡下で蛍光をモニターした(左側のパネル)。1μg/mLのDAPIで染色した核を右側のパネルに示す。縮尺棒は100μmを示す。
【図9】図9は、as2のcDNAを過剰発現したトランスジェニックシロイヌナズナのカルス及び植物の表現型、及びas2遺伝子の転写物の蓄積の結果を示す図面に代わる写真である。図9Aは、空のベクターpSK1(a)及びpSK35S::as2(b)による、Col−0由来の根断片の形質転換の結果を示す。縮尺棒は10mmを示す。図9Bは、トランスジェニックシロイヌナズナ植物の表現型を示す。(a)は空のベクターpSK1で形質転換した35日令の植物の場合であり、(b)はpSK35S::as2で形質転換した35日令の植物であり、(c)はpSK35S::as2で形質転換した25日令の植物であり、(d)はパネルcの植物をさらに15日間成長させたものである。縮尺棒は10mmを示す。図9Cは、トランスジェニック植物及び野生型植物(Col−0)におけるas2遺伝子の転写物のRT−PCR解析の結果を示す。サイクル数をそれぞれパネルの右側に示す。レーン1、パネルB(d)に示されるトランスジェニック植物;レーン2、野生型(Col−0)植物であり、as2転写物のオープンリーディングフレームの領域に特異的なプライマーで増幅した産物(a;ORF)、as2転写物の3’非翻訳領域に特異的なプライマーで増幅した産物(b;UTR)、及びα−チューブリンに対する遺伝子の転写産物に特異的なプライマーで増幅した産物(c;α−tubulin)を示す。図9Dは、葉の表現型を示す。典型的な35日令の野生型Col−0植物(a)及びas2−1植物(b)の5番目の葉を示す。軽い表現型の変化(c)及び厳しい表現型の変化(d)を示すトランスジェニック植物の典型的な葉を示す。縮尺棒は5mmを示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to the plant leaf formation-related protein AS2, in particular, the transcription of a specific gene in the nucleus of a plant cell, the development of a symmetrical flat leaf blade, and the establishment of a plant that controls the establishment of leaf veins. The present invention relates to a leaf formation-related protein AS2, more specifically, a plant characterized by having a cysteine repeat sequence composed of a cysteine-rich C-motif and a leucine zipper-like motif. More specifically, the plant leaf formation-related protein AS2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which an amino acid in the amino acid sequence may be substituted, inserted, or deleted. It relates to the protein AS2 which is involved in the formation of plant leaves.
The present invention also provides a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2, a composition for controlling plant leaf formation using the plant leaf formation-related protein AS2, and a plant leaf formation-related protein AS2. The present invention relates to a gene comprising a DNA for controlling the formation of leaves of a plant, and a vector comprising the same.
[0002]
[Prior art]
The leaves of angiosperms, which are relatively flat tissues, have a wide variety in terms of their shape and complexity, but their basic structure is generally proximal-distal, medial-lateral, and The description can be made based on three axes, ie, directional axis and abaxial axis (see Non-Patent
The leaves develop from the meristem (SAM) of the shoot apex as an outer organ. A variety of mutants have been isolated with shape development along each of the three axes, axial-abaxial identity and changes in leaf morphology related to the overall shape of the leaf.
[0003]
Some of the genes involved in the phenotype of the mutation have been cloned and characterized (see Non-Patent
With respect to the shape of the leaves along the medial-lateral axis, the leaves of many plants are generally clear with respect to the leaf axis as an axis and show an approximate symmetry (see Non-Patent Documents 13 to 17). . However, some exceptions have been reported in this regard (see Non-Patent Documents 18 to 20). In any case, such symmetry is independent of the complexity (eg, single or multiple) of the leaf shape.
[0004]
To elucidate the mechanisms involved in the development of symmetric leaves, several groups, including the present inventors, are studying Arabidopsis asymmetric leaves 2 (as2) and asymmetric leaves 1 (as1). . The phenotypes of such mutants are very similar in terms of asymmetry of the leaf blade and malformed vein system, but the abnormalities are not absolutely identical (see Non-Patent Documents 21 to 24). . Abnormalities in these genes can be summarized as follows. (1) The leaves of the as1 mutant and the as2 mutant have asymmetrical fragments and exhibit bilaterally asymmetric downward winding. (2) Thickened and unable to produce a clear main vein, and the pattern of secondary veins is also asymmetric (see Non-Patent Documents 23 and 24). (3) Leaf sections cultured in a test tube containing a phytochrome-free medium regenerate shoots more frequently than wild-type leaf sections (see Non-Patent Document 23). (4) For example, transcripts of class I Knox genes such as KNAT1, KNAT2, and KNAT6 accumulate in mutant leaves (see Non-Patent Document 23). (5) Transcripts of as1 encoding a myb-like transcription factor related to the products of corn ROUGH SHEATH2 (RS2) and PHAN accumulate around the duct tissue in the cotyledon primordium and leaf primordium (see Non-Patent Document 21). ).
[0005]
The findings summarized above suggest that as1 and as2 are involved in establishing the entire vein system, including the prominent main vein as the structural axis of leaf symmetry, as well as the occurrence of leaf blade symmetry. (See Non-Patent Document 23). They may also function in maintaining leaf cells in a critical developmental context, probably by suppressing the expression of the class I Knox gene. The role of such genes in establishing the vein system is highly correlated with maintaining the critical status of leaf cells, but the details of such correlations have not been revealed. The similarity of abnormalities in as1, as2 and double mutant plants of as1 and as2 has led to the proposal that as1 and as2 interact somewhat genetically (see Non-Patent Document 23). To gain further insight into the mechanism by which as1 and as2 regulate leaf blade formation, it is extremely important to perform a characterization of both the as2 and as1 genes.
[0006]
The as2 locus is a translocation known as dAc-I-RS in two transgenic strains of Arabidopsis thaliana # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700). It has been reported by the present inventors that a map position was determined between two derivatives of the factor (see Non-Patent Document 25). However, no details were reported.
[0007]
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[0008]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to establish a technique for establishing symmetrical and flat leaves in plants and to establish leaf veins, and in particular, to establish genes for them. More specifically, the present invention provides a method for controlling the development of symmetrical and flat leaves and the establishment of leaf veins by isolating and characterizing the as2 gene, thereby providing a useful new The present invention provides a novel protein AS2 and a gene as2 encoding the same.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have isolated and characterized the as2 gene. This gene encodes a novel protein containing a cysteine repeat sequence designated the C-motif and a leucine zipper-like motif. A search of the database revealed that AS2 belongs to a large family of proteins, which we have named the AS2 family. Transcripts of the as2 gene were mainly detected in the axial domain of cotyledon primordium during embryonic development. AS2 did not contain a distinct nuclear localization signal, but AS2 bound to green fluorescent protein was localized in plant nuclei. Overexpression of as2 cDNA resulted in a decrease in shoot formation efficiency of transgenic plants. Transgenic Arabidopsis overexpressing the as2 cDNA resulted in leaves that rolled up and sometimes produced rod-shaped leaves that did not have the proper extent of the leaf blades. Thus, we found that AS2 may regulate the transcription of certain genes in the nucleus, the development of symmetrical and flat leaf blades, and the establishment of leaf veins.
[0010]
The present invention relates to a plant leaf formation-related protein, AS2. In particular, the plant leaf formation-related protein AS2, which regulates the transcription of specific genes in the nucleus of plant cells, the development of symmetrical and flat leaf blades, and the establishment of leaf veins, more particularly cysteine The present invention relates to a plant leaf formation-related protein AS2, which has a cysteine repeat sequence composed of a C-rich motif and a leucine zipper-like motif. More specifically, the plant leaf formation-related protein AS2 consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, or an amino acid sequence in which an amino acid in the amino acid sequence may be substituted, inserted, or deleted. It relates to the protein AS2 which is involved in the formation of plant leaves.
In addition, the present invention relates to a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2, more specifically, a DNA that hybridizes to a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or to a condition that is stringent with the nucleotide sequence. The present invention relates to a DNA encoding a plant leaf formation-related protein AS2 having a base sequence that can be used.
Further, the present invention provides a composition for controlling plant leaf formation using a plant leaf formation-related protein AS2, and the control of plant leaf formation comprising DNA encoding the plant leaf formation-related protein AS2. And a vector comprising the same.
[0011]
We found that in two transgenic Arabidopsis strains # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700), the as2 locus was associated with dAc-I. It has been determined that a map position exists between two derivatives of the transposable element known as -RS. Based on this, the as2 gene was cloned. In cloning based on the genetic map, attention was paid to two such dAc-I-RS factors as genetic and molecular markers in addition to the PCR-RFLP marker in the BAC clone F5114. This factor contained the hygromycin resistance gene and the as2 locus was eventually found to be a 32 kbp region between the two PCR-RFLP markers (
[0012]
FIG. 1 shows the region structure of the genome of
We believe that we have the hygromycin resistance of T-1200 and T-1700 (Hyg r ) The chromosome walking is started from the gene, and among the RFLP markers created by the present inventors for analysis, marker1, marker2, marker3 and marker4, the as2 gene is between marker1 and marker4. Was determined to be a 32 kbp region.
[0013]
Next, the DNA of this region of the as2-1 mutant was subjected to PCR-RFLP analysis to determine the sequence. A 13 bp deletion was found in the ORF corresponding to open reading frame (ORF) 15 of BAC clone F5I14. In addition, we have found that all other available alleles, such as as2-2, as2-4, and as2-5, have mutations in this ORF (see below for details). 2A etc.). To determine if the mutation in ORF15 is responsible for the as2 phenotype, we used the ApaI-HpaI fragment of the wild-type genome (fragment I; 6.16 kb) containing the entire ORF15. , As2-1 gene was mutated (as2-1 plant). In addition, as2-1 plants were transformed with fragment II lacking the upstream region of ORF15 and fragment III lacking the upstream region of ORF15 and the middle of ORF15 to the 3 'end of fragment I. As a result, only the fragment I showed the phenotype of as2.
FIG. 1B shows an enlarged view of the chromosome region around as2 and the results of complementation analysis. The structure of as2 cDNA is shown below the genomic structure. The structures of the restriction fragments used for complementation analysis are indicated by horizontal lines labeled I, II, and III. The symbols + and-on the right indicate the positive and negative results of the complementation test with the corresponding DNA fragment, respectively.
ORF15 is the only reading frame in fragment I that can encode a protein greater than 3000 Da. Therefore, this result indicates that ORF15 corresponds to the as2 gene. The failure of fragment II to complement the as2 phenotype indicated that the region between ApaI and Bsu36I of fragment I was required for expression of as2.
[0014]
The present inventors have isolated a cDNA clone corresponding to ORF15. This base sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 2. Comparing the nucleotide sequence of the as2 gene with the sequence of the cDNA, the mRNA contains two introns in the 5 ′ untranslated region but no intron in the coding region (FIG. 1B), and AS2 contains 199 amino acids. It encoded a novel protein with residues. FIG. 2 shows the predicted amino acid sequence of AS2. The position of the cysteine in the C motif and the position of the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Mutated amino acid residues in various as2 alleles are shown in italics above the wild-type sequence.
FIG. 3 shows the configuration of the domain of as2 and its unique features. The area shown in brackets below the box is the as2 domain. Gray boxes indicate the C motif, and striped boxes represent leucine zipper-like sequences. The mutation sites of as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5 are shown. The numbers below the boxes indicate the positions of the amino acid residues.
[0015]
Both the as2-1 and as2-2 alleles have a 13 bp deletion at the same site upstream of the sequence encoding the leucine zipper-like sequence. This deletion should result in a short polypeptide that lacks most of the carboxyl-terminal (C-terminal) side of AS2 but contains an additional 13 amino acid residues (see FIG. 2). In the as2-4 mutant, there is a 1 bp deletion in the middle of the coding region corresponding to the C-terminus of AS2, which results in a frameshift that results in the replacement of the C-terminal 48 amino acid residues of AS2 by 63 new residues. Mutation had occurred (see FIG. 2). In the as2-5 variant, a single guanine nucleotide was replaced with an adenine nucleotide in the coding region on the amino-terminal (N-terminal) side of the protein, thereby replacing the glycine residue with a glutamic acid residue at position 46. (See FIG. 2). This glycine residue is conserved among all members of the AS2 family, as described below. Therefore, this glycine residue is essential for the function of AS2.
[0016]
Next, the structural characteristics of AS2 and its related proteins were examined.
The predicted AS2 protein contains a leucine zipper-like sequence from residue 81 to residue 109, with a spacing of 6 residues and hydrophobic amino acids such as valine, isoleucine and leucine. Five repeats of the residue were included (see FIG. 2). According to database searches, the N-terminal side of AS2 indicates that a large number of hypothetical genes and ESTs encoded by Arabidopsis thaliana and other plant species (Oryza sativa (rice), Glycine max (soybean), Lycopersicon esculentum (tomato), etc.) Was similar in amino acid sequence to the putative N-terminal side (FIG. 2B). In the official database of Arabidopsis sequences, there were at least 41 ORFs predicted to encode proteins with an N-terminus related to the N-terminus of AS2. Some of these proteins appear to be only slightly related to AS2 (see FIG. 4).
As shown in FIG. 4, by comparative analysis of putative AS2-like proteins, Cx 2 Cx 6 Cx 3 The C sequence (where x is a non-conserved residue; designated the C motif) was the N-terminus of all 41 predicted proteins identified by database search and AS2 (
[0017]
In AS2, the N-terminal sequence is characterized by a C motif and a leucine zipper-like sequence. We have designated this characteristic region as the AS2 domain, and the proteins containing this domain as members of the AS2 family. According to this nomenclature, the Arabidopsis genome will contain 42 ORFs that may encode proteins belonging to the AS2 family. As shown in FIG. 4, this gene and the putative gene of 41 proteins similar to AS2 are named as2-like gene (ASL), and such genes are numbered 1-41 respectively. Was. The nucleotide sequence of some of the cDNAs of such genes has been submitted to the GenBank database and has been submitted by Shuai B. and Springer, PS (2001, see Table 2) to LOB and LBD. Was named.
[0018]
FIG. 4 shows a comparison of the amino acid sequence of the AS2 domain among AS2 family members.
[0019]
These AS2 family members can be divided into at least two classes, class I and class II (see FIG. 4). Class I consists of AS2 and 35 proteins (ASL1-ASL35) and contains the C motif, leucine zipper-like sequence and most of the major conserved residues mentioned above. Class II consists of six proteins (ASL36-ASL41). Such proteins contain a C motif and an incomplete leucine zipper-like sequence, in which the fourth hydrophobic residue is missing, and are less conserved in the AS2 domain. Moreover, in this class most amino acid sequences are conserved between all members of class II, and only a few residues differ in each protein.
FIG. 5 shows a phylogenetic tree for 42 members of the searched Arabidopsis thaliana AS2 family proteins. The numbers on the branches represent the bootstrap values therein, as calculated by the ProtML program. The length of each horizontal branch is made to be proportional to the estimated evolutionary distance. The right section shows the classification of AS2 family members.
As shown in FIG. 5, the phylogenetic tree confirms that class II is only associated with class I, and the members of class I are further divided into subclasses named class Ia and class Ib. And showed that the sequence was weakly conserved but had a complete leucine zipper-like sequence.
[0020]
Next, the present inventors examined the accumulation site of as2 transcript in wild-type plants. Poly (A) from roots, cotyledons, leaves, and shoot tips of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants, rosette leaves of 35-day-old plants, leaves on stems, flower stems and siliques + The RNA was purified and then subjected to Northern blot analysis on the RNA sample using as2 cDNA as a probe. The result is shown in FIG. 6 by a photograph replacing a drawing. FIG. 6 shows poly (A) of various organs of Arabidopsis thaliana. + 3 shows the results of Northern blot analysis of RNA. Roots (lane 1), cotyledons (lane 2), leaves (lane 3) and shoot tips (lane 4) of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants (lane 5), and rosette leaves of 35-day-old plants (Lane 6), upper leaves (lane 7), flower stems (lane 8) and siliques (lane 9) in equal amounts of 1.0 μg of poly (A) + RNA was prepared. Using the same blot as a control, Εφ-tubulin (TUBA) was used as a probe. The numbers on the right indicate the size of the marker RNA molecule.
Transcripts of as2 were detected in all of the samples analyzed except for the flower stems (see FIG. 6). As2 transcript levels were highest in shoot apex samples containing small developing leaves. Such data indicate that the as2 mutation was apparent as a mutant phenotype in any leaf-like organ such as cotyledons, rosette leaves, stalk leaves, sepals and petals, but not in stems. (See Non-Patent Document 23). However, as2 transcripts were detected in roots, but the roots of as2 plants were similar to wild-type roots.
[0021]
The present inventors also examined the expression site of as2 during the embryonic development process by an in situ hybridization method using as2 cDNA as a probe. The result is shown in FIG. 7 by a photograph replacing a drawing. FIG. 7 shows the results of detection (ad) of the as2 transcript by the in situ hybridization method. It is a distribution pattern of the as2 transcript obtained with the antisense probe. 7A shows a spherical stage; FIG. 7B shows a triangular stage; FIG. 7C shows a heart-shaped stage; FIG. 7D shows a torpedo-shaped stage; . The reddish brown coloration of the cell layer just below the seed coat (indicated by white stars) is not specific for as2 RNA as it occurs with both probes. The scale bar in FIG. 7 indicates 20 μm.
In embryos at the globular stage, transcripts of as2 were detected in all cells (see FIG. 7). As the bulge formed at the top of the triangular embryo, the transcript of as2 accumulated in the uppermost region of the embryo (see FIG. 7 (b)). From the heart-shaped stage to the torpedo-shaped stage, signals were detected in the epidermal cells on the axial side of the cotyledon primordium (see FIGS. 7 (c) and (d)). After the walking-stick stage, accumulation of as2 transcript was detected throughout the cotyledon primordium without being clearly concentrated in specific areas (data not shown). After germination no specific hybrid formation signal was detected in situ around the meristem at the shoot apex, in the leaf primordium and in the mature leaves. However, accumulation of as2 transcript was confirmed by Northern blot (see FIG. 6).
[0022]
Next, the localization of AS2 into the nucleus was examined. The predicted AS2 protein does not contain a distinct nuclear localization signal (NLS) (see FIG. 2).
We determined whether AS2 is localized in the nucleus of plant cells, together with transcription under the control of the cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter (35S :: as2 :: GFP), A fusion construct was prepared in which the as2 cDNA was linked to DNA of green fluorescent protein (GFP). This fusion construct was introduced into onion epithelial cells by the particle bombardment method, and the fluorescence by GFP was monitored. The result is shown in FIG. 8 by a photograph replacing a drawing. FIG. 8 shows the results of monitoring the localization of as2 :: GFP organelles in onion epithelial cells. 8A and 8B show the case of 35S :: as2 :: GFP, FIGS. 8C and D show the case of 35S :: NLS :: GFP, and FIGS. 8E and F show the case of 35S :: GFP. Show the case. Each gene was introduced into onion epithelial cells by impact, and the introduced tissue was cultured at 28 ° C. for 16 hours. Fluorescence was monitored under a fluorescence microscope (left panels (A, C and E in FIG. 8). Nuclei stained with 1 μg / mL DAPI are shown in right panels (B, D and F in FIG. 8). 8, each scale bar indicates 100 μm.
As shown in FIG. 8, the fluorescent signal by as2-GFP was detected mainly in the nucleus, as was a similar signal by NLS-GFP prepared by SV40 NLS (FIGS. 8A, C). When the 35S :: GFP construct was introduced into onion cells, GFP signals were detected in both nucleus and cytoplasm (FIG. 8E). These results indicate that AS2 is a nuclear protein.
[0023]
Next, the present inventors examined the phenotype of Arabidopsis thaliana plants that overproduce AS2. As2 cDNA was ligated to the 35S promoter (35S: as2) to create a transgenic Arabidopsis thaliana plant that overexpresses as2. The result is shown in FIG. 9 by a photograph replacing a drawing. FIG. 9A shows the results of incubation of Col-0-derived root fragments transformed with the empty vectors pSK1 (a) and pSK35S :: as2 (b) and photographing 21 days after starting the incubation. . The scale bar in FIG. 9A indicates 10 mm. FIG. 9B shows the phenotype of the transgenic Arabidopsis thaliana plant. FIG. 9B (a) shows the case of a 35 day old plant transformed with the empty vector pSK1, (b) shows the case of a 35 day old plant transformed with pSK35S :: as2, and (c) Shows the case of a 25-day-old plant transformed with pSK35S :: as2, and (d) shows the case of growing the plant of (c) for further 15 days. The scale bar in FIG. 9B indicates 10 mm. FIG. 9C shows the results of RT-PCR analysis of transcripts of the as2 gene in transgenic plants and wild-type plants (Col-0). The number of RT-PCR cycles is shown on the right side of each panel. The amplified DNA fragment was fractionated by electrophoresis on an agarose gel and visualized by staining with ethidium bromide.
[0024]
The data from this preliminary experiment demonstrated that it was difficult to create transformed shoots (FIG. 9A). Therefore, the present inventors first determined the approximate production efficiency of shoots transformed by the conventional root transformation method.
For transformation, the number of transformed green calli, regenerated shoots, and shoots with flower stems per number of roots used were counted. The results are shown in Table 1 below.
[0025]
[Table 1]
[0026]
The values in parentheses in Table 1 indicate the average number of transformants per root.
Table 1 shows that the efficiency of green callus formation when 35S: as2 was introduced into root tissue was lower than when the empty vector plasmid, pSK1, was used for transformation. The regeneration efficiency of transgenic shoots and shoots with flower stems is 5 to 10 times lower (see Table 1).
Such data indicated that overexpression of as2 cDNA had a suppressive effect on cell proliferation and / or shoot regeneration in green tissue.
Two transgenic strains overexpressing the as2 cDNA were obtained. It was confirmed that the as2 transcript derived from this cDNA was accumulated in one of the transgenic strains showing a more severe phenotype (see FIG. 9C). One strain of the transgenic plant had a light dwarf phenotype and produced upwardly curled leaves (see FIG. 9B (b)). Another strain of transgenic plants was associated with a more severe abnormal phenotype and produced leaves with extremely narrow leaf blades at early stages of plant growth ((c) in FIG. 9B, and (( c)). This leaf blade was unable to spread, resulting in rod-shaped leaves (see (d) of FIG. 9B and (d) of FIG. 9D).
[0027]
From the above, the functional domain in AS2 was considered.
The as2 gene has a C motif (Cx 2 Cx 6 Cx 3 (Defined as C) and a leucine zipper-like sequence, and appears to encode a novel protein of 199 amino acid residues with a distinctly unique sequence on the C-terminal side (see FIGS. 2 and 3). It is generally accepted that leucine zipper sequences are involved in protein-protein interactions, and the leucine zipper-like sequence of as2 may play a role in the association of AS2 with some other proteins. It is thought that there is. Such an interaction may be essential for the action of AS2.
Although the C motif was first identified in the present invention, it is rather generally 2-3 Cx n Cx 2-3 It has a C (n> 12) consensus sequence and resembles a zinc finger that functions in interaction with other macromolecules (Pavletich, NP and Pabo, CO (1991) Science 252: 809) -817, Wang, JH et al. (1998) Immunity 9: 543-553). The C motif is also likely to be involved in association with other macromolecules such as, for example, DNA and proteins, especially AS1. Complete elucidation of the function of AS2 requires further identification and characterization of the molecules with which AS2 interacts.
[0028]
The sequence on the C-terminal side of AS2 is different from the sequence of any protein in the database containing a known motif (see FIG. 3). Although the as2-4 allele had a frameshift mutation in this region, the phenotype by this allele was similar to that by other as2 alleles, so the C-terminal side was newly characterized. It is considered to be essential for the function of AS2 other than the N-terminal side containing the designated AS2 domain.
[0029]
Both as1 and as2 suppress the expression of the class I Knox homeobox gene, but it is not clear whether such suppression is directly or indirectly due to as1 and as2. The present inventors have proposed that, as expected for proteins involved in the repression of class I knox genes in the nucleus through interactions with other yet unidentified nuclear proteins, as2: It was revealed that the GFP fusion protein was localized in the nucleus of plant cells (see FIG. 8). as1: GFP fusion protein was also localized in the nucleus (unpublished data). These findings are consistent with the hypothesis that as1 is one of the molecules with which as2 interacts in the nucleus.
Up-winding leaves and cotyledons were induced by overexpression of as2 cDNA (see FIG. 9). In contrast, the as2 function-deficient mutation resulted in downward-wound leaves and cotyledons (see Non-Patent Document 23). Thus, as2 has been implicated in suppressing the growth of the axial domain or in stimulating the growth of the dorsal domain in the leaf blade. Considering that a growth inhibitory effect was observed during transformation (see FIG. 9B) and expression of as2 in the axial domain in embryo cotyledon primordia (see FIG. 7), as2 is It can be guessed that it functions to suppress the domain. It will be interesting to determine if such suppression is achieved through inhibition of cell growth or elongation.
Whatever the details of AS2 activity at the molecular level, the present invention on overexpression and previous studies on leaves of as2 mutants show that AS2 is involved in leaf symmetry as well as flat leaf blade expansion It is shown that. Mutations in the genes involved in the axial-abaxial fate of the leaf domain interfere with leaf fate decisions and often induce rod-shaped leaf formation. There may be a relationship between as2 and such a gene. Against this background, it is worth noting that as1 is a homologue of PHAN in Arabidopsis, although it remains to examine whether the function of as1 is similar to that of PHAN.
[0030]
Next, the function of the ASL protein will be considered.
The conserved amino acid sequence on the N-terminal side of the AS2-like protein has consequently indicated that such proteins form a new family of plant proteins called the AS2 family. The Arabidopsis protein, a member of this family with expression of as2, was named ASL (AS2-like) protein (see FIG. 4). Amino acid sequence similarity and the phylogenetic tree of the AS2 domain of ASL indicated that the ASL protein could be divided into class I and class II with subclasses, class Ia and class Ib (see FIGS. 2 and 5).
While it remains to identify the function of AS2 family members with the expression of as2, AS2 is required for the formation of symmetric, flat and round leaf blades and the establishment of vein patterns including distinct main veins Turned out to be many. In addition, as2 has the ability to act together with as1 to suppress the expression of the class I Knox homeobox gene. Substitution of a conserved glycine residue in the AS2 domain with a glutamic acid residue results in a mutant phenotype (see FIGS. 2-4), so this residue plays an important role in the function of AS2, as in the AS2 domain. It is clear that Although some members of class Ia show strong conservation in the amino acid sequence of the AS2 domain (eg, ASL1 and ASL2), AS2 function requires a unique C-terminal region in addition to the N-terminal AS2 domain So they may have different functions. Clear insights into the role of such closely related ASLs will require further genetic and molecular experiments.
[0031]
Recently, it has been suggested that the LOB gene (accession number AF447897) corresponding to the gene for ASL4 is usually expressed at the border between meristem and organ primordium, but is not present in as1 and is drastically reduced in as2. , The developmental role of the LOB gene has not yet been determined.
The six ASLs that make up Class II have characteristic structural characteristics different from Class I (see FIG. 4), and their amino acid sequences are very similar to each other. The reported expression of such genes (see Table 2) suggests that they are functional genes. Thus, class II members may play different roles during the development of Arabidopsis.
[0032]
The accession numbers of Genebank for the nucleotide and amino acid sequences reported in the present invention are as follows. AS2 (AB080802); and BACs F5I14 (AC001229), F1E22 (AC007234), and F12P19 (AC009513). Information about members of the Arabidopsis AS2 family of proteins is summarized in Table 2 below.
[0033]
[Table 2]
[0034]
The BAC code and the gene code in Table 2 were obtained from the TAIR database, and the EST ID was obtained from the EMBL database. Some ASL proteins in Table 2 have already been submitted to Genebank as LOB domain (LBD) proteins.
[0035]
The present invention provides a novel plant leaf formation-related protein, AS2. The protein AS2 of the present invention is preferably a protein having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, but is not limited thereto. The protein of the present invention has a function of controlling the transcription of a specific gene in the nucleus of a plant cell, the development of a symmetric flat leaf blade, and the establishment of leaf veins, and the amino acid sequence of the protein is cysteine. And a cysteine repeat sequence consisting of a C-motif rich in C and a leucine zipper-like motif. The C-motif of the protein of the present invention is preferably Cx motif. 2 Cx 6 Cx 3 C (C represents cysteine and x represents an arbitrary amino acid); more specific amino acid sequences include P in and around the C motif. C AA C KFLRRK C xxx C An amino acid sequence of VFAPYFP (the alphabet indicates a one-letter code of an amino acid, and x indicates an arbitrary amino acid). Further, as the leucine zipper-like motif, preferably, the amino acid sequence of RxxAVxSLxYEAxARxRDPVYGCVGxISxLQxQL (V or I) xxLQxxLxxxxxxL (V indicates the one-letter code of an amino acid and x indicates an arbitrary amino acid) is exemplified. Can be. Further, as a preferable amino acid sequence between the C motif and the leucine zipper-like sequence, FAxVHKVFGASNVxKLL (the alphabet indicates a one-letter code of an amino acid, and x indicates an arbitrary amino acid), and G (glycine) among them. Is the required array.
Therefore, for example, in the protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, the C-motif, the leucine zipper-like motif, and the glycine position are conserved and have a function related to the formation of plant leaves. In some cases, the formation of leaves of a plant comprising an amino acid sequence in which one or more, preferably 1 to 50, amino acids in the amino acid sequence may be optionally substituted, inserted or deleted Which provides a protein AS2 related to Preferred proteins of the present invention include proteins having an amino acid sequence belonging to the AS2 family as described above.
[0036]
The present invention also provides a DNA encoding any one of the above-described leaf formation proteins of the present invention. The DNA of the present invention may be single-stranded or double-stranded, and may be one that can produce the above-described leaf-forming protein AS2 of the plant of the present invention in a cell. Further, the DNA of the present invention may be in the form of RNA if necessary. Examples of the DNA of the present invention include a DNA having a base sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or a DNA having a base sequence capable of hybridizing to the base sequence under stringent conditions.
The DNA of the present invention may be a DNA alone, or may be a DNA incorporated into a vector comprising an appropriate plasmid or the like. Therefore, the present invention provides a vector containing the above-described DNA of the present invention.
[0037]
The protein AS2 of the present invention is related to leaf formation of plants, preferably Arabidopsis thaliana, and can control normal leaf formation. Accordingly, the present invention provides a composition or a control agent for controlling the formation of leaves of a plant comprising the above-described protein AS2 of the present invention. In addition, the above-described DNA of the present invention can be used as necessary instead of using the protein of the present invention. Accordingly, the present invention provides a gene for controlling the formation of leaves of a plant comprising the above-described DNA of the present invention, a control composition, or a control agent.
[0038]
【Example】
Next, the present invention will be described in more detail with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In the following examples, regarding the analysis of plants, seeds were sown on soil, and after 2 days in a dark place at 4 ° C., the plants were transferred to a condition of white light illumination of 3000 lux at 22 ° C. for 16 hours. . Plant age was provided in terms of days after sowing.
The as2-5 allele was isolated from the M2 population of Ler-0 seeds mutagenized with ethyl methanesulfonate purchased from Reel Seeds (Round Rock, Tex., USA). Transgenic strains, # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700), were isolated from the (I-RS / dAc-I-RS) strain # 14. did. They had a transposed dAc-I-RS element (accession number AB055064) containing the gene for hygromycin phosphotransferase. The background of # 14-22.4.4W3 (T-1200) and # 14-68.1.4 (T-1700) were both Ler ecotypes.
[0039]
Example 1 (Cloning of as2 gene)
A meiotic recombination breakpoint is created between the as2-1 mutation and the adjacent transposon markers # 14-68.1.4 (T-1700) and # 14-22.4.4W3 (T-1200). Was identified in the vicinity of the as2 gene by screening for recombination. Such a recombinant showing hygromycin resistance and having the as2-1 phenotype was used to map the PCR-RFLP marker for the as2 gene on the map. Information on the sequence used as the PCR-RFLP marker was obtained from the Arabidopsis Genome Center website on the TAIR website (http://www.arabidopsis.org/), University of Pennsylvania, and was obtained from BAC clone F5114 (Genebank accession number AC001229). ) The nucleotide sequence of the PCR-RFLP marker is as follows:
For
5'-TGTAACTCTTCCCGTCCGGTTTG-3 'and
5'-GCAAAGTCCATAGAGGAGCAAG-3 ',
For
5'-TTGGGTTTGCACCGAAACTCAG-3 'and
5′-AGTGACAGACAGTGACCACAAG-3 ′,
For
5′-TGGTGGGATGAAACTTTGTTGAG-3 ′ and
5′-CTCTCTCTTTCTCACTCTTCTC-3 ′,
For
5'-AGAAAACTGCTGTCTTTCGGGAC-3 'and
5'-TCCAAAAGCACTCTCTAGCTTGG-3 '
(See FIG. 1).
[0040]
Example 2 (Complementation analysis)
To construct a binary plasmid for complementation experiments, a 6.16 kbp ApaI-HpaI fragment (fragment I in FIG. 1), a 4.75 kbp Bsu36I-HpaI fragment (FIG. 1 fragment II) and a 2.2 kbp Bsu36I- fragment. The BglII fragment (fragment III in FIG. 1) was derived from pBI101 (Jefferson, RA, et al. (1987) EMBO J. 6: 3901-3907) and the 1 ′ promoter :: bar (Yoshioka, Y .; , Et al., (2001) Gnise. Genet. Syst. 76: 189-198). The newly constructed plasmid was introduced into Agrobacterium (Agrobacterium tumefaciens) strain, GV3101. Then, as described separately (Clough, SJ and Bent, AF (1998) Plant J. 16: 735-743, Galbiati, M., et al. (2000) Funct. Integra. Genomics 1: 25-34), the whole plant was transformed by suction infiltration. Transgenic plants were selected in soil containing 0.01% Basta (AgroEvo, Frankfurt, Germany), which genotype transgenic plants were analyzed by Southern blot.
[0041]
Example 3 (Cloning of cDNA)
Poly (A) from 16 days old plants + RNA was prepared. For reverse transcription PCR, the first strand of the cDNA was prepared according to the method of Hamada et al. (Hamada, S., et al. (2000) Plant J. 24: 91-101). Then the primer,
ORF15SF (5′-GGGTCGACATGGCATCTTCTTCAACAAACTCAC-3 ′) and
ORF15NR (5′-GGGCGGCCGCTCAAGACGGATCAACAGTACGGC-3 ′)
As a result, as2 cDNA was amplified. The amplified fragment was then ligated to the SalT / NotI site of pBluescriptSK (-) (Stratagene, La Jolla, Calif., USA) and the identity was confirmed by nucleotide sequencing. The 5 'end sequence of the cDNA was determined by primers, 5'-RACE with ORF15MR (5'-TATCTGAAGCTGACGAAGCTGATG-3') and adapter primers. The 3 'end sequence of the cDNA was determined by primers, 3'-RACE with ORF15MF (5'-GATCTCAGCTGTGCTAAATCTGGAC-3') and adapter primers. The nucleotide sequence of the mutant alleles (as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5) was determined by amplifying the as2 gene region from the genomic DNA of each mutant. Poly (A) isolated from each mutant plant + The nucleotide sequence of the as2 cDNA obtained from the RNA was also determined.
[0042]
Example 4 (Phylogenetic tree analysis)
Using the 2.0 version of the TAIR BLAST program (http://arabidopsis.org/Blast/index.html), the Arabidopsis thaliana similar to as2 from the AGI dataset (AGI, protein from the whole genome) at TAIR The gene was obtained. Using the Genome Net Blast T2 program (http://www.blast.genome.ad.jp/), as2-like genes of other plant species were obtained from the dataset in Genome Net. Using CLUSTAL W version 1.8 (Thompson, JD, et al. (1994) Nucl. Acid. Res. 22: 4673-4680), the sequence of the AS2 domain of 42 members of the AS2 family of Arabidopsis is aligned. Was. For the construction of the maximum likelihood (ML) phylogenetic tree, a neighboring connected (NJ) phylogenetic tree was used as a starting phylogenetic tree for a partial reconstruction search. Using the NJdist and protML programs in the MOLPHY version 2.3b3 package (http://www.ism.ac.jp/software/ismib/softother.htm#morphhy; Adachi, J. and Hasegawa 96, Mawagawa, M., 1996) Comput. Sci. Monogr. 28: 1-150). An NJ phylogenetic tree was obtained from NJdist, and an ML phylogenetic tree was obtained from ProtML.
The partial bootstrap probabilities for each branch were estimated using the ProtML program (Himi, S., et al. (2001) J. Mol. Evol. 53: 387-393, Sakakibara, K., et. al., (2001) Mol. Biol. Evol. 18: 491-502).
[0043]
Example 5 (RNA gel blot analysis)
For analysis of Col-0 wild-type plants, roots, cotyledons, leaves, and shoot tips collected from 12-day-old plants, flower buds collected from 28-day-old plants, and rosette leaves collected from 35-day-old plants, Upper stem, flower stem and siliques were used. Equivalent amount of 1.0 mg of poly (A) + RNA was isolated and Northern blot was performed. The partial cDNA for as2 was used as a probe.
Primer 1 (5'-GATCTCAGCTGTGCTAAATC-3 ') and
Primer 2 (5'-TCAAGACGGATCAACAGTAC-3 ')
It was amplified by PCR using and cloned into the EcoRV site of PBluescript SK (-). Its identity was confirmed by nucleotide sequencing. Using a high-prime DNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany), a 300 bp fragment having a stop codon, which was created by cutting plasmid pas2c300 obtained by extending codon 200 from
[0044]
Example 6 (In situ hybridization method)
Details of the methods used for plant fixation, paraffin embedding and in situ hybridization can be found at http: // www. genetics. wisc. edu / CATG / barton / index. html, and was performed according to the method of Nakanishi et al. (Nakashima, M., et al (1998) Plant cell Physiol. 39: 690-700). Sections (8 μm thick) were prepared using a microtome (Elma, Tokyo, Japan). After linearizing the plasmid pas2c300 with ClaI, an antisense RNA probe was prepared with T3 RNA polymerase. A sense RNA probe was prepared with T7 RNA polymerase after linearizing pas2c300 with EcoRI.
[0045]
Example 7 (Construction of plasmid)
As2 cDNA (600 bp) extended from the start codon to the stop codon at the XbaI and NotI sites of the binary vector pSK1 (Kojima, S., et al. (1999) DNA Res. 6: 407-410) downstream of the
[0046]
Example 8 (Transformation of Arabidopsis thaliana)
According to the method of Onouchi et al. (Onouchi, H., et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247: 653-660), Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis root explants was performed. Was. Agrobacterium LBA4404 / pAL4404 (Hookema, A., et al. (1984) J. Bacteriol 158: 383-385) cells containing pSK35S :: as2 or pSK1 (Kojima et al. (1999)). Cultured with the pieces. Transformants were selected on a shoot induction medium in the presence of 15 mg / L hygromycin B (Onouchi et al. (1995)). Using plasmids pSK35S :: as2 or pSK1 Tumefaciens strain GV3101 was transformed. The whole plant was then transformed by suction infiltration. Transgenic plants were selected on MS media containing 15 mg / L hygromycin B and 300 mg / L carbenicillin.
[0047]
Example 9 (as2 :: localization of organelles of GFP protein)
The cells in the epithelial layer of the onion bulb were p35S :: as2 :: GFP, p35S :: according to the method of von Amim, von Amim, AG and Deng, XW (1994) Cell 79: 1035-1045. Transformation was performed with NLS :: GFP or p35S :: GFP. Fluorescent signals were recorded by a fluorescent microscope (
[0048]
Example 10 (Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR))
Transgenic plants and wild-type flower buds were harvested, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C. Poly (A) + RNA was purified and the first strand of cDNA was synthesized. The sample volume was normalized in order to perform equal amplification of DNA fragments with primers specific for α-tubulin cDNA. Next, PCR was performed by the method of Semiarti et al. (See Non-Patent Document 23). In order to amplify a DNA fragment specifically derived from the endogenous as2 transcript, sites for the design of the primer set were selected in the 5 'and 3' untranslated regions of the as2 transcript, both of which were Are not present in the cDNA used to create the transgenic plants. The primer pairs are as follows:
For α-tubulin,
pU51 (5′-GGACAAGCTGGGATCCAGG-3 ′) and
pU52 (5′-CGTCTCCACCTTCAGCACC-3 ′),
As for the untranslated region of the cDNA of the as2 gene,
pU73 (5'-CCCCTCTGAGCAACAGAAAGC-3 ') and
pU74 (5'-CCAAAAACCTAAAATCTCAAGACGG-3 '),
About the region of the open reading frame of as2 cDNA
pU328 (5'-GTGTTTGGAGCAAGTAACGT-3 ') and
pU315 (5′-AAACCTAGGAGACGGATCAACAGTACGGCG-3 ′)
It is.
[0049]
【The invention's effect】
The present invention provides a novel protein, AS2, which regulates the transcription of specific genes in the nucleus, the development of symmetric flat leaf blades, and the establishment of leaf veins, and a family thereof.
The plant leaf formation-related protein AS2 of the present invention is characterized by having a cysteine repeat sequence consisting of a cysteine-rich C-motif as an amino acid sequence, glycine at a specific position, and a leucine zipper-like motif, The present invention clearly shows that a group of proteins having such a characteristic amino acid sequence is present in plants, preferably Arabidopsis thaliana, and these proteins are related to leaf formation of plants and regulate leaf formation. It is to be. Therefore, the present invention provides an agent for controlling the formation, growth, and preservation of leaves of a plant comprising the protein AS2.
[0050]
[Sequence list]
[Brief description of the drawings]
BRIEF DESCRIPTION OF DRAWINGS FIG. 1 shows the region structure of a genome containing the as2 locus on
FIG. 2 shows an example of the amino acid sequence of the protein AS2 of the present invention. The position of the cysteine in the C motif and the position of the hydrophobic residue in the leucine zipper-like sequence are indicated by an asterisk (*) and a dot (•), respectively. Mutated amino acid residues in the various as2 alleles are shown in italics above the wild-type sequence.
FIG. 3 shows the organization and unique characteristics of the domain of the protein AS2 of the present invention. The area shown in brackets below the box is the AS2 domain. Gray boxes and striped boxes represent the C motif and leucine zipper-like sequence, respectively. The mutation sites of as2-1, as2-2, as2-4 and as2-5 are shown. The numbers below the boxes indicate the positions of the amino acid residues.
FIG. 4 shows a comparison of amino acid sequences of AS2 domains among AS2 family members.
FIG. 5 shows a phylogenetic tree for 42 members of the Arabidopsis AS2 family proteins. The numbers on the branches represent the bootstrap values therein, as calculated by the ProtML program. The length of each horizontal branch is shown to be proportional to the estimated evolutionary distance. The right section shows the classification of AS2 family members.
FIG. 6 shows poly (A) of the as2 transcript in various organs of Arabidopsis thaliana. + 4 is a photograph replacing a drawing, showing the results of Northern blot analysis of RNA. Roots (lane 1), cotyledons (lane 2), leaves (lane 3) and shoot tips (lane 4) of 12-day-old plants, flower buds of 28-day-old plants (lane 5), and rosette leaves of 35-day-old plants (Lane 6), upper leaves (lane 7), flower stems (lane 8) and siliques (lane 9) in equal amounts of 1.0 μg of poly (A) + RNA was prepared. Using the same blot as a control, Εφ-tubulin (TUBA) was used as a probe. The numbers on the right indicate the size of the marker RNA molecule.
FIG. 7 is a photograph instead of a drawing, showing the results (ad) of detecting as2 transcripts by the in situ hybridization method. Distribution pattern of as2 transcript obtained with antisense probe. (A) spherical stage; (b) triangular stage; (c) heart-shaped stage; (d) torpedo-shaped stage; (e) sense controls of (a)-(d). The reddish brown coloration of the cell layer just below the seed coat (indicated by white stars) is not specific for as2 RNA as it occurs with both probes. The scale bar indicates 20 μm.
FIG. 8 is a photograph instead of a drawing, showing the results of organelle localization of as2 :: GFP in onion epithelial cells. Tissue in which 35S :: as2 :: GFP (A, B), 35S :: NLS :: GFP (C, D) and 35S :: GFP (E, F) were introduced into onion epithelial cells by the impact method and introduced. Was cultured at 28 ° C. for 16 hours. Fluorescence was monitored under a fluorescence microscope (left panel). Nuclei stained with 1 μg / mL DAPI are shown in the right panel. The scale bar indicates 100 μm.
FIG. 9 is a photograph instead of a drawing showing the callus and plant phenotypes of transgenic Arabidopsis thaliana overexpressing as2 cDNA and the results of accumulation of transcripts of as2 gene. FIG. 9A shows the results of transformation of Col-0-derived root fragments with empty vectors pSK1 (a) and pSK35S :: as2 (b). The scale bar indicates 10 mm. FIG. 9B shows the phenotype of the transgenic Arabidopsis thaliana plant. (A) is the case of a 35-day-old plant transformed with the empty vector pSK1, (b) is a 35-day-old plant transformed with pSK35S :: as2, and (c) is pSK35S :: as2. (D) is a plant obtained by growing the plant of panel c for another 15 days. The scale bar indicates 10 mm. FIG. 9C shows the results of RT-PCR analysis of transcripts of the as2 gene in transgenic plants and wild-type plants (Col-0). The number of cycles is shown on the right side of each panel.
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2002
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