JP2002504372A - 高親和性ヒト型化抗−ceaモノクロ−ナル抗体 - Google Patents
高親和性ヒト型化抗−ceaモノクロ−ナル抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
癌胎児性抗原(CEA )を特異的に結合する新規のヒト型化モノクローナル抗体、そのフラグメント又は誘導体が、それらの製造方法と共に提供される。それらのヒト型化抗体は、CEA を発現する癌の処理、及び診断目的、たとえばCEA を発現する腫瘍又は癌細胞のインビボイメージングのために有用である。
Description
【0001】 発明の分野: 本発明は、種々のヒト癌、たとえば乳癌、肺癌及び胃腸癌、たとえば胃及び結
腸癌により発現される抗原である癌胎児性抗原(CEA )に特異的に結合する、ヒ
ト型化モノクローナル抗体及びそのフラグメント又は誘導体に関する。より特定
には、本発明は、ネズミモノクローナル抗体COL −1 、すなわち高親和性抗−CE
A 抗体に由来するヒト型化モノクローナル抗体及びそのヒト型化抗体フラグメン
ト及び誘導体に関する。本発明はさらに、CEA に対して特異的なそのようなヒト
型化モノクローナル抗体を生成するための方法、そのようなヒト型化モノクロー
ナル抗体を含む医薬的および診断組成物、および癌の処理又は診断のためへのそ
の使用方法に関する。
腸癌により発現される抗原である癌胎児性抗原(CEA )に特異的に結合する、ヒ
ト型化モノクローナル抗体及びそのフラグメント又は誘導体に関する。より特定
には、本発明は、ネズミモノクローナル抗体COL −1 、すなわち高親和性抗−CE
A 抗体に由来するヒト型化モノクローナル抗体及びそのヒト型化抗体フラグメン
ト及び誘導体に関する。本発明はさらに、CEA に対して特異的なそのようなヒト
型化モノクローナル抗体を生成するための方法、そのようなヒト型化モノクロー
ナル抗体を含む医薬的および診断組成物、および癌の処理又は診断のためへのそ
の使用方法に関する。
【0002】 発明の背景: 腫瘍細胞により発現される抗原の同定、及びそのような抗体を特異的に結合す
るモノクローナル抗体の調製は、当業界においてよく知られている。抗−腫瘍モ
ノクローナル抗体は治療剤及び診断剤として可能性ある用途を示す。そのような
モノクローナル抗体は、そられが腫瘍抗原を特異的に結合し、そしてそれにより
、分析物における腫瘍細胞又は腫瘍抗原の存在を検出できるので、診断剤として
可能性ある用途を有する。たとえば、モノクローナル抗体のラベルされた形を用
いての腫瘍細胞又は腫瘍のインビトロ又はインビボイメージングのためへの腫瘍
抗原を結合するモノクローナル抗体の使用は、当業界において従来のことである
。
るモノクローナル抗体の調製は、当業界においてよく知られている。抗−腫瘍モ
ノクローナル抗体は治療剤及び診断剤として可能性ある用途を示す。そのような
モノクローナル抗体は、そられが腫瘍抗原を特異的に結合し、そしてそれにより
、分析物における腫瘍細胞又は腫瘍抗原の存在を検出できるので、診断剤として
可能性ある用途を有する。たとえば、モノクローナル抗体のラベルされた形を用
いての腫瘍細胞又は腫瘍のインビトロ又はインビボイメージングのためへの腫瘍
抗原を結合するモノクローナル抗体の使用は、当業界において従来のことである
。
【0003】 さらに、腫瘍抗原を結合するモノクローナル抗体は、治療剤としての良く知ら
れた用途を有する。治療剤として、又はモノクローナル抗体がエフェクター成分
、たとえば薬物、サイトカイン、細胞毒素、等に直接的に又は間接的に結合され
る接合体としてのモノクローナル抗体の使用法はよく知られている。
れた用途を有する。治療剤として、又はモノクローナル抗体がエフェクター成分
、たとえば薬物、サイトカイン、細胞毒素、等に直接的に又は間接的に結合され
る接合体としてのモノクローナル抗体の使用法はよく知られている。
【0004】 実質的に、モノクローナル抗体がエフェクター成分に結合される場合、そのモ
ノクローナル抗体は標的化成分として機能し、すなわちそれは、エフェクター成
分(典型的には、治療活性を有する)を、抗体の標的物、たとえばモノクローナ
ル抗体により結合される抗原を発現する腫瘍に向ける。対照的に、モノクローナ
ル抗体自体が治療剤として作用する場合、その抗体は、標的化成分として(すな
わち、それは抗原を発現する細胞を特異的に結合する)、及び治療活性、典型的
には、腫瘍細胞溶解を仲介するエフェクターとして機能する。モノクローナル抗
体は、たとえば中でも抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)及び補体依存性細胞
毒性(CDC )を包含する、1又は複数のそのようなエフェクター機能を有し;そ
れらの機能は、Fc部分として文献において、一般的に言及される抗体分子の一部
によりもたらされる。
ノクローナル抗体は標的化成分として機能し、すなわちそれは、エフェクター成
分(典型的には、治療活性を有する)を、抗体の標的物、たとえばモノクローナ
ル抗体により結合される抗原を発現する腫瘍に向ける。対照的に、モノクローナ
ル抗体自体が治療剤として作用する場合、その抗体は、標的化成分として(すな
わち、それは抗原を発現する細胞を特異的に結合する)、及び治療活性、典型的
には、腫瘍細胞溶解を仲介するエフェクターとして機能する。モノクローナル抗
体は、たとえば中でも抗体−依存性細胞性細胞毒性(ADCC)及び補体依存性細胞
毒性(CDC )を包含する、1又は複数のそのようなエフェクター機能を有し;そ
れらの機能は、Fc部分として文献において、一般的に言及される抗体分子の一部
によりもたらされる。
【0005】 種々のモノクローナル抗体が生成される1つの特定の腫瘍抗原は、癌胎児性抗
原(CEA )である。CEA は、胃腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌及び肺癌を包含
する種々の癌により発現される、約180,000Dの分子量を有する抗原複合体である
。たとえば、Robbins など., Int'l J. Cancer, 53(6): 892-897 (1993); Greln
erなど., J. Clin. Oncol., 10(5): 735-746 (1992); Obuchi など., Cancer Re
s., 47(13): 3565-3571 (1987); Muraroなど., Cancer Res., 45(11Pt. 2): 576
9-5780 (1985) を参照のこと。
原(CEA )である。CEA は、胃腸癌、結腸直腸癌、乳癌、卵巣癌及び肺癌を包含
する種々の癌により発現される、約180,000Dの分子量を有する抗原複合体である
。たとえば、Robbins など., Int'l J. Cancer, 53(6): 892-897 (1993); Greln
erなど., J. Clin. Oncol., 10(5): 735-746 (1992); Obuchi など., Cancer Re
s., 47(13): 3565-3571 (1987); Muraroなど., Cancer Res., 45(11Pt. 2): 576
9-5780 (1985) を参照のこと。
【0006】 ヒト癌上に特異的に発現される種々の特定のCEA エピトープを検出するためへ
のモノクローナル抗体の使用は、文献に報告されている。たとえば、Obuchiなど
., Cancer Res., 47(13); 3565-3571 (1987); Muraroなど., Cancer Res., 45 (
11Pt.2):(1985)を参照のこと。
のモノクローナル抗体の使用は、文献に報告されている。たとえば、Obuchiなど
., Cancer Res., 47(13); 3565-3571 (1987); Muraroなど., Cancer Res., 45 (
11Pt.2):(1985)を参照のこと。
【0007】 特に、Muraroなど, (前記)は、正常な成人組織に対するヒト結腸癌に対して
強い選択的反応性を示す、COL −1 〜COL −15と命名されたモノクローナル抗体
の生成を報告している。それらの抗体は、CEA 上の明確な制限されたエピトープ
と反応する。それらの抗体のうち、COL −1 抗体は、CEA のその高い親和性(1.
4 ×109M-1)のために、及びまた、それがCEA −関連抗原、たとえば非特異的交
差−反応性抗原(NCA )及び通常の便抗原(NFA )との検出できる反応性を包含
しないために、相当に注目されて来た。Robbins など., Int'l J. Canc., 33(6)
: 892-897 (1993)を参照のこと。
強い選択的反応性を示す、COL −1 〜COL −15と命名されたモノクローナル抗体
の生成を報告している。それらの抗体は、CEA 上の明確な制限されたエピトープ
と反応する。それらの抗体のうち、COL −1 抗体は、CEA のその高い親和性(1.
4 ×109M-1)のために、及びまた、それがCEA −関連抗原、たとえば非特異的交
差−反応性抗原(NCA )及び通常の便抗原(NFA )との検出できる反応性を包含
しないために、相当に注目されて来た。Robbins など., Int'l J. Canc., 33(6)
: 892-897 (1993)を参照のこと。
【0008】 その結合特性のために、COL −1又は現在、治療剤としての使用のために評価
されている。たとえば、Siler など. (Biotech. Ther., 4(3〜4): 163-181 (199
3)) は、LS- M4T ヒト結腸異種グラフト片−含有無胸腺症マウスへの131I−ラベ
ルされたCOL −1 の投与を報告する。それらは、この処理が毒性をほとんど又は
まったく伴わないで、腫瘍増殖の速度の減速をもたらし、そしてそれらの結果が
臨床試験における放射性ラベルされたCOL −1 の可能性ある治療効能を示すこと
を報告する。
されている。たとえば、Siler など. (Biotech. Ther., 4(3〜4): 163-181 (199
3)) は、LS- M4T ヒト結腸異種グラフト片−含有無胸腺症マウスへの131I−ラベ
ルされたCOL −1 の投与を報告する。それらは、この処理が毒性をほとんど又は
まったく伴わないで、腫瘍増殖の速度の減速をもたらし、そしてそれらの結果が
臨床試験における放射性ラベルされたCOL −1 の可能性ある治療効能を示すこと
を報告する。
【0009】 また、Yuなど. (J. Clin. Oncol., 14(6): 1793-1809 (1996))は、121I−ラベ
ルされたCOL −1 が胃腸悪性腫を有する患者において相1の臨床学的試験に存在
することを報告する。それらはさらに、抗体接合が、いくつかの血液学的毒性を
除いて、十分に耐性であることを示している。さらに、COL −1 及びβ−ガラク
トシダーゼの接合体の使用は、種々の腫瘍細胞系からの腫瘍細胞をインビトロで
特異的に殺すことが示されている。Abraham など., Cell Biophys., 24-25: 127
-133 (1994) 。
ルされたCOL −1 が胃腸悪性腫を有する患者において相1の臨床学的試験に存在
することを報告する。それらはさらに、抗体接合が、いくつかの血液学的毒性を
除いて、十分に耐性であることを示している。さらに、COL −1 及びβ−ガラク
トシダーゼの接合体の使用は、種々の腫瘍細胞系からの腫瘍細胞をインビトロで
特異的に殺すことが示されている。Abraham など., Cell Biophys., 24-25: 127
-133 (1994) 。
【0010】 しかしながら、ネズミ抗体、たとえばCOL −1及び他の抗−CEA ネズミ抗体は
ヒトにおいて治療剤としての適用性を有するが、それらは、いくつかの点におい
て不都合である。特に、ネズミ抗体は外来性種起源のものであるので、それらは
ヒトにおいて免疫原性であり得る。これは、抗体が、たとえば慢性又は再発生疾
病状態の治療のために反復して投与されることが所望される場合、特に問題であ
る中和性抗体応答、すなわちヒト抗−ネズミ抗体(HAMA)応答をもたらす。これ
は、いくつかの癌治療は長期間にわたって、たとえば数年又はそれ以上にわたっ
てもたらされるので、実質的に欠点である。また、それらの抗体分子はネズミ不
変ドメインを含むので、それらはヒトエフェクター機能を示すことができない。
ヒトにおいて治療剤としての適用性を有するが、それらは、いくつかの点におい
て不都合である。特に、ネズミ抗体は外来性種起源のものであるので、それらは
ヒトにおいて免疫原性であり得る。これは、抗体が、たとえば慢性又は再発生疾
病状態の治療のために反復して投与されることが所望される場合、特に問題であ
る中和性抗体応答、すなわちヒト抗−ネズミ抗体(HAMA)応答をもたらす。これ
は、いくつかの癌治療は長期間にわたって、たとえば数年又はそれ以上にわたっ
てもたらされるので、実質的に欠点である。また、それらの抗体分子はネズミ不
変ドメインを含むので、それらはヒトエフェクター機能を示すことができない。
【0011】 そのような問題を排除し又は減じることにおいては、キメラ抗体が開示されて
いる。キメラ抗体は、典型的には、2種の異なった種からの2種の異なった抗体
の部分を含む。一般的に、そのような抗体は、他の種からの可変領域、典型的に
はネズミ可変領域に結合されたヒト不変領域を含む。たとえば、親マウス抗体の
結合特性、及びヒト不変領域に関連するエフェクター機能を示すいくつかのマウ
ス/ ヒトキメラ抗体が報告されている。
いる。キメラ抗体は、典型的には、2種の異なった種からの2種の異なった抗体
の部分を含む。一般的に、そのような抗体は、他の種からの可変領域、典型的に
はネズミ可変領域に結合されたヒト不変領域を含む。たとえば、親マウス抗体の
結合特性、及びヒト不変領域に関連するエフェクター機能を示すいくつかのマウ
ス/ ヒトキメラ抗体が報告されている。
【0012】 たとえば、アメリカ特許第4,816,567 号(Cabilly など. );アメリカ特許第
4,978,745 号(Shoemaker など. );アメリカ特許第4,975,369 号(Beavers な
ど. );及びアメリカ特許第4,816,397 号(Bussなど. )を参照のこと。一般的
には、それらのキメラ抗体は、生存するネズミハイブリドーマから抽出されたDN
A からゲノム遺伝子ライブラリーを調製することによって構成される。Nishimur
a など., Cancer Res., 47:999 (1987)。次に、ライブラリーが、正しい抗体フ
ラグメント再配列パターンを示すヘビー(H )鎖及びライト(L )鎖の両者から
可変領域遺伝子についてスクリーニングされる。
4,978,745 号(Shoemaker など. );アメリカ特許第4,975,369 号(Beavers な
ど. );及びアメリカ特許第4,816,397 号(Bussなど. )を参照のこと。一般的
には、それらのキメラ抗体は、生存するネズミハイブリドーマから抽出されたDN
A からゲノム遺伝子ライブラリーを調製することによって構成される。Nishimur
a など., Cancer Res., 47:999 (1987)。次に、ライブラリーが、正しい抗体フ
ラグメント再配列パターンを示すヘビー(H )鎖及びライト(L )鎖の両者から
可変領域遺伝子についてスクリーニングされる。
【0013】 あるいは、ハイブリドーマから抽出されたRNA からcDNAが調製されそしてスク
リーニングされ、あるいは可変領域は、ポリメラーゼ鎖反応により得られる。次
に、クローン化された可変領域遺伝子が、適切なH 又はL 鎖ヒト不変領域遺伝子
のクローン化されたカッセトを含む発現ベクター中に連結される。次に、キメラ
遺伝子は、選択された細胞系、通常ネズミ骨髄腫系において発現される。そのよ
うなキメラ抗体は、ヒト治療に使用されている。
リーニングされ、あるいは可変領域は、ポリメラーゼ鎖反応により得られる。次
に、クローン化された可変領域遺伝子が、適切なH 又はL 鎖ヒト不変領域遺伝子
のクローン化されたカッセトを含む発現ベクター中に連結される。次に、キメラ
遺伝子は、選択された細胞系、通常ネズミ骨髄腫系において発現される。そのよ
うなキメラ抗体は、ヒト治療に使用されている。
【0014】 さらに、CEA を特異的に結合する、COL −1に由来するキメラマウス抗−ヒト
抗体の生成が報告されている。たとえば、アメリカ特許第5,472,693 号(Gourli
e など. (The Dow Chemical Company により所望される) を参照のこと。
抗体の生成が報告されている。たとえば、アメリカ特許第5,472,693 号(Gourli
e など. (The Dow Chemical Company により所望される) を参照のこと。
【0015】 また、Morrisonなどは、Important Advances in Oncology, Recombinanta Chi
meric Monoclonal Antibodies, pp. 3-16 (S.A.- Rosenberg, ed., 1990) (J.B.
Lippincott, Philadelphia, PA)において、いくつかの抗−腫瘍キメラモノクロ
ーナル抗体の調製を報告する。転位性結腸直腸癌を有する患者におけるキメラcM
Ab−17−1Aによる臨床試験の結果は、この抗体が、それが由来するネズミモノク
ローナル抗体に比較して、6倍長い循環時間及び有意に低められた免疫原性を有
することを示す。LoBuglioなど., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4220-4224
(1989);Meredithなど., J. Nucl. Med., 32:1162 (1991) 。
meric Monoclonal Antibodies, pp. 3-16 (S.A.- Rosenberg, ed., 1990) (J.B.
Lippincott, Philadelphia, PA)において、いくつかの抗−腫瘍キメラモノクロ
ーナル抗体の調製を報告する。転位性結腸直腸癌を有する患者におけるキメラcM
Ab−17−1Aによる臨床試験の結果は、この抗体が、それが由来するネズミモノク
ローナル抗体に比較して、6倍長い循環時間及び有意に低められた免疫原性を有
することを示す。LoBuglioなど., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 86:4220-4224
(1989);Meredithなど., J. Nucl. Med., 32:1162 (1991) 。
【0016】 しかしながら、そのようなキメラ化されたモノクローナル抗体は典型的には、
低い免疫原性を示すが、それらは抗体応答を誘発できるネズミ可変配列を含むの
で、それらはヒトにおいて潜在的に免疫原生である。従って、それらのキメラ抗
体は、親に投与される場合、抗−イディオタイプの応答を誘発することができる
可能性がある。Saleh など., Cancer Immunol. Immunother., 32: 185-190 (199
0)。
低い免疫原性を示すが、それらは抗体応答を誘発できるネズミ可変配列を含むの
で、それらはヒトにおいて潜在的に免疫原生である。従って、それらのキメラ抗
体は、親に投与される場合、抗−イディオタイプの応答を誘発することができる
可能性がある。Saleh など., Cancer Immunol. Immunother., 32: 185-190 (199
0)。
【0017】 キメラ抗体の免疫原性のために、“ヒト型化抗体”の生成のための方法が最近
開発されている。理想的には、“ヒト型化”は、もとの分子の抗原−結合特性の
完全な保持を伴って、ほとんど免疫原性でない抗体をもたらす。もとの抗体のす
べての抗原−接合特性を保持するためには、その結合−部位の構造が、“ヒト型
化”バージョンで、忠実に再生されるべきである。
開発されている。理想的には、“ヒト型化”は、もとの分子の抗原−結合特性の
完全な保持を伴って、ほとんど免疫原性でない抗体をもたらす。もとの抗体のす
べての抗原−接合特性を保持するためには、その結合−部位の構造が、“ヒト型
化”バージョンで、忠実に再生されるべきである。
【0018】 これは潜在的には、(a )必須のフレームワーク残基の保持を伴って、又はそ
れを伴わないで、ヒトフレームワーク領域(FR)及び不変領域上に非ヒト相補性
決定領域(CDR )のみをグラフトすることによって(Jones など., Nature, 321
: 522 (1986)及びVerhoeyen など., Science, 239:1539 (1988) を参照のこと)
;又は(b )完全な非ヒト可変ドメインをグラフトし(リガンド結合特性を保存
するために)、そしてまた、それらを、暴露された残基の適切な置換を通してヒ
ト−様表面により“おおい隠す(cloaking)( 抗原性を低めるために) ことによ
って(Padlan, Molesc. Immunol., 28: 489 (1991)を参照のこと)、ヒトフレー
ムワーク上に非ヒト抗体の結合部位をグラフトすることにより達成される。
れを伴わないで、ヒトフレームワーク領域(FR)及び不変領域上に非ヒト相補性
決定領域(CDR )のみをグラフトすることによって(Jones など., Nature, 321
: 522 (1986)及びVerhoeyen など., Science, 239:1539 (1988) を参照のこと)
;又は(b )完全な非ヒト可変ドメインをグラフトし(リガンド結合特性を保存
するために)、そしてまた、それらを、暴露された残基の適切な置換を通してヒ
ト−様表面により“おおい隠す(cloaking)( 抗原性を低めるために) ことによ
って(Padlan, Molesc. Immunol., 28: 489 (1991)を参照のこと)、ヒトフレー
ムワーク上に非ヒト抗体の結合部位をグラフトすることにより達成される。
【0019】 実質的には、CDR −グラフトによるヒト型化は、ヒトフレームワーク及び不変
領域上へのCDR のみのグラフトを包含する。理論的には、これは実質的に、免疫
原性を排除すべきである(アロタイプ又はイディオタイプ差異が存在する場合を
除く)。Jones など., Nature, 321: 522-526 ;Verhoeyen など., Science , 2
39:1534-1536 (1988), Riechmann など., Nature, 332:323-327 (1988)。しか
しながら、CDR −グラフト自体は、所望の結果を生成することができない。
領域上へのCDR のみのグラフトを包含する。理論的には、これは実質的に、免疫
原性を排除すべきである(アロタイプ又はイディオタイプ差異が存在する場合を
除く)。Jones など., Nature, 321: 522-526 ;Verhoeyen など., Science , 2
39:1534-1536 (1988), Riechmann など., Nature, 332:323-327 (1988)。しか
しながら、CDR −グラフト自体は、所望の結果を生成することができない。
【0020】 むしろ、オリジナル抗体のいくつかのフレームワーク残基がまた、抗原結合活
性を保存するために、保存される必要があることが報告されている。Riechmann
など., Nature, 332:323-327 (1988);Queen など., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86: 10028-10029; Tempest など., Biol. Technology, 9;266-271 (1991)
; COなど., Nature, 351:501-502 (1991)。
性を保存するために、保存される必要があることが報告されている。Riechmann
など., Nature, 332:323-327 (1988);Queen など., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 86: 10028-10029; Tempest など., Biol. Technology, 9;266-271 (1991)
; COなど., Nature, 351:501-502 (1991)。
【0021】 上記で論じられたように、もとの抗体の抗原−結合特性を保存するためには、
その結合部位の構造は、ヒト型化分子において忠実に再生されるべきである。X
線結晶学研究は、いくつかの隣接するフレームワーク残基が抗原結合に関与され
ることが見出されているが、抗体結合部位がCDR 残基から主として構築されるこ
とを示している。
その結合部位の構造は、ヒト型化分子において忠実に再生されるべきである。X
線結晶学研究は、いくつかの隣接するフレームワーク残基が抗原結合に関与され
ることが見出されているが、抗体結合部位がCDR 残基から主として構築されるこ
とを示している。
【0022】 Amitなど., Science, 233: 747-753 (1986); Colman など., Nature, 326: 35
8-363 (1987); Sheriff など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 5936-5942 (
1989); Fischmannなど., J. Biol. Chem., 266: 12915-12920 (1991); Tulip な
ど., J. Molec. Biol., 227: 122-148 (1992) 。CDR ループの構築は周囲のフレ
ームワーク構造により有意に影響されることがまた見出されている。Chothia な
ど., J. Molec. Biol., 196: 901-907 (1987); Chothiaなど., Nature, 342: 97
7-883 (1989); Tramomontenoなど., J. Molec. Biol., 215: 175-182 (1990) 。
8-363 (1987); Sheriff など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86. 5936-5942 (
1989); Fischmannなど., J. Biol. Chem., 266: 12915-12920 (1991); Tulip な
ど., J. Molec. Biol., 227: 122-148 (1992) 。CDR ループの構築は周囲のフレ
ームワーク構造により有意に影響されることがまた見出されている。Chothia な
ど., J. Molec. Biol., 196: 901-907 (1987); Chothiaなど., Nature, 342: 97
7-883 (1989); Tramomontenoなど., J. Molec. Biol., 215: 175-182 (1990) 。
【0023】 CDR に対するフレームワーク残基の効果の他に、可変L 鎖(V L )及び可変H
鎖(V H )ドメインの相対的配置からの、小さいが、但し有意な差異が示されて
おり(Colmanなど., Nature, 326: 358-363 (1987), そしてそれらの差異は、表
向きは、ドメイン間接触に関与される残基の変動によるものである(Padlanなど
., Molec. Immunol., 31: 169-217 (1994))。
鎖(V H )ドメインの相対的配置からの、小さいが、但し有意な差異が示されて
おり(Colmanなど., Nature, 326: 358-363 (1987), そしてそれらの差異は、表
向きは、ドメイン間接触に関与される残基の変動によるものである(Padlanなど
., Molec. Immunol., 31: 169-217 (1994))。
【0024】 さらに、側鎖体積の変化が関与する、内部残基の変異の効果に対する構造研究
は、得られる局部変形が分子内部の遠位部分に拡大される、側鎖位置におけるシ
フトにより順応されることを示している。これは、ヒト型化の間、可変ドメイン
、及びそれらのドメイン間の界面における内部残基、又は少なくともその内部体
積がまた、維持されるべきであることを示唆しており;内部残基が異なった性質
、たとえばサイズ、電荷又は疎水性の1つの残基により置換されるヒト型化プロ
トコールは抗原結合部位構造の有意な変性をもたらす。
は、得られる局部変形が分子内部の遠位部分に拡大される、側鎖位置におけるシ
フトにより順応されることを示している。これは、ヒト型化の間、可変ドメイン
、及びそれらのドメイン間の界面における内部残基、又は少なくともその内部体
積がまた、維持されるべきであることを示唆しており;内部残基が異なった性質
、たとえばサイズ、電荷又は疎水性の1つの残基により置換されるヒト型化プロ
トコールは抗原結合部位構造の有意な変性をもたらす。
【0025】 保存される必要があるフレームワーク残基を実質的に同定する1つの方法は、
コンピューターモデリングによるものである。他方では、必須のフレームワーク
残基は、既知の抗体結合部位構造を比較することによって実質的に同定され得る
。Padlan. Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994).
コンピューターモデリングによるものである。他方では、必須のフレームワーク
残基は、既知の抗体結合部位構造を比較することによって実質的に同定され得る
。Padlan. Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994).
【0026】 抗原結合に潜在的に影響を及ぼす残基は、いくつかのグループに分けられる。
第1のグループは、結合部位表面と隣接し、そして従って、抗原と直接的に接触
する残基を含んで成る。それらの残基は、アミノ−末端残基及びCDR に隣接する
それらの残基を包含する。第2のグループは、CDR 又は反対の鎖のいずれかと接
触することによってCDR の構造又は相対的配置を変えることができる残基を包含
する。
第1のグループは、結合部位表面と隣接し、そして従って、抗原と直接的に接触
する残基を含んで成る。それらの残基は、アミノ−末端残基及びCDR に隣接する
それらの残基を包含する。第2のグループは、CDR 又は反対の鎖のいずれかと接
触することによってCDR の構造又は相対的配置を変えることができる残基を包含
する。
【0027】 第3のグループは、可変ドメインの構造的統合性に影響を及ぼす埋もれた側鎖
を有するアミノ酸を含んで成る。それらのグループにおける残基は通常、採用さ
れる番号付けシステムによれば、同じ位置に見出される。Kabat など., Sequenc
es of Proteins of Immunological Interest, NIH Pub. No. 91-3242 (5 th ed.
, 1991) (U.S. Dept. Health & Human Services, Bethessa, DM) and Genbankを
参照のこと。
を有するアミノ酸を含んで成る。それらのグループにおける残基は通常、採用さ
れる番号付けシステムによれば、同じ位置に見出される。Kabat など., Sequenc
es of Proteins of Immunological Interest, NIH Pub. No. 91-3242 (5 th ed.
, 1991) (U.S. Dept. Health & Human Services, Bethessa, DM) and Genbankを
参照のこと。
【0028】 アミノ酸残基における変化のそれらの効果が与えられる場合、ヒト型化抗体は
ヒトにおけるそれらの実質的に低い免疫原性のために所望されるが、それらの生
成は予測できない。たとえば、抗体の配列修飾は、抗原結合親和性の実質的な又
は完全な損失、又は結合特異性の損失をもたらす。他方では、“ヒト型化抗体”
は、配列修飾に関係なく、ヒトにおいて免疫原性をまだ示すことができる。
ヒトにおけるそれらの実質的に低い免疫原性のために所望されるが、それらの生
成は予測できない。たとえば、抗体の配列修飾は、抗原結合親和性の実質的な又
は完全な損失、又は結合特異性の損失をもたらす。他方では、“ヒト型化抗体”
は、配列修飾に関係なく、ヒトにおいて免疫原性をまだ示すことができる。
【0029】 従って、所望する抗原に対する新規のヒト型化抗体についての当業界における
有意な必要性がまだ存在する。さらに特異的には、CEA を発現する癌、たとえば
胃腸及び結腸直腸癌、乳癌、肺癌及び卵巣癌の処理及び診断のための改良された
免疫治療及び免疫診断剤としてのそれらの可能性のために、CEA に対して特異的
なヒト型化抗体についての当業界における必要性がある。
有意な必要性がまだ存在する。さらに特異的には、CEA を発現する癌、たとえば
胃腸及び結腸直腸癌、乳癌、肺癌及び卵巣癌の処理及び診断のための改良された
免疫治療及び免疫診断剤としてのそれらの可能性のために、CEA に対して特異的
なヒト型化抗体についての当業界における必要性がある。
【0030】 本発明の目的: ヒト癌胎児性抗原(CEA )に対して特異的であるヒト型化抗体、すなわち抗−
CEA (“αCEA ”)を提供することが本発明の目的である。より具体的には、ネ
ズミαCEA 抗体、そして特にCOL −1、すなわちCEA に対して高い親和製を有す
るIgG2a イソタイプの特異的ネズミ抗体に由来するヒト型化抗体を提供すること
が本発明の目的である。
CEA (“αCEA ”)を提供することが本発明の目的である。より具体的には、ネ
ズミαCEA 抗体、そして特にCOL −1、すなわちCEA に対して高い親和製を有す
るIgG2a イソタイプの特異的ネズミ抗体に由来するヒト型化抗体を提供すること
が本発明の目的である。
【0031】 ヒト型化αCEA 抗体を含む医薬組成物を提供することがまた、本発明の目的で
ある。高親和性ネズミのα抗体、COL −1に由来するヒト型化抗体を含む医薬組
成物を提供することが本発明のさらなる特定の目的である。 CEA を発現する癌、特に、中でも乳癌、肺癌、卵巣癌、胃腸癌、及び結腸直腸
癌の治療のためにヒト型化αCEA 抗体を用いる方法を提供することが本発明のも
う1 つの特定の目的である。
ある。高親和性ネズミのα抗体、COL −1に由来するヒト型化抗体を含む医薬組
成物を提供することが本発明のさらなる特定の目的である。 CEA を発現する癌、特に、中でも乳癌、肺癌、卵巣癌、胃腸癌、及び結腸直腸
癌の治療のためにヒト型化αCEA 抗体を用いる方法を提供することが本発明のも
う1 つの特定の目的である。
【0032】 癌細胞を検出するための免疫診断組成物、すなわち好ましくはCOL −1に由来
するヒト型化α抗体(ラベルされた形又はラベルされていない形である)を含む
組成物を提供することが本発明のもう1 つの目的である。好ましくはCOL −1に
由来するヒト型化αCEA 抗体(ラベルされた形又はラベルされていない形である
)を含む組成物を用いての癌の免疫診断方法を提供することが本発明のもう1 つ
の目的である。
するヒト型化α抗体(ラベルされた形又はラベルされていない形である)を含む
組成物を提供することが本発明のもう1 つの目的である。好ましくはCOL −1に
由来するヒト型化αCEA 抗体(ラベルされた形又はラベルされていない形である
)を含む組成物を用いての癌の免疫診断方法を提供することが本発明のもう1 つ
の目的である。
【0033】 ヒト型化αCEA 抗体又はそのフラグメントをコードする核酸配列を提供するこ
とが本発明のさらにもう1 つの目的である。高親和性ネズミのαCEA 抗体、すな
わちCOL −1に由来するヒト型化抗体コードする核酸配列を提供することが本発
明のさらなる特定の目的である。ヒト型化αCEA 抗体、高親和性αCEA 抗体、す
なわちCOL −1に由来するヒト型化抗体の発現を提供するベクターを提供するこ
とが本発明のもう1つの目的である。
とが本発明のさらにもう1 つの目的である。高親和性ネズミのαCEA 抗体、すな
わちCOL −1に由来するヒト型化抗体コードする核酸配列を提供することが本発
明のさらなる特定の目的である。ヒト型化αCEA 抗体、高親和性αCEA 抗体、す
なわちCOL −1に由来するヒト型化抗体の発現を提供するベクターを提供するこ
とが本発明のもう1つの目的である。
【0034】 本発明の特定の記載: 本発明を示す前、この開示に使用される一定の用語の定義が下記に示される。 抗体−これはポリクローナル、モノクローナル、キメラ及びヘテロ免疫グロブ
リン(モノクローナル抗体が好ましい)のクラスに属する、一本鎖、二本鎖及び
多鎖のタンパク質及び糖タンパク質を意味し;それはまた、合成、及び遺伝子的
に構築されたそれらの免疫グロブリンの変異体も包含する。“抗体フラグメント
”は、Fab, Fab', F(ab')2及びFvフラグメント、並びに所望の標的エピトープ又
は複数のエピトープに対しこの特異性を有する抗体のいずれかの部分を包含する
。
リン(モノクローナル抗体が好ましい)のクラスに属する、一本鎖、二本鎖及び
多鎖のタンパク質及び糖タンパク質を意味し;それはまた、合成、及び遺伝子的
に構築されたそれらの免疫グロブリンの変異体も包含する。“抗体フラグメント
”は、Fab, Fab', F(ab')2及びFvフラグメント、並びに所望の標的エピトープ又
は複数のエピトープに対しこの特異性を有する抗体のいずれかの部分を包含する
。
【0035】 ヒト型化抗体−これは、親抗体の抗原−結合性質を保持するか又は実質的に保
持するが、しかしヒトにおいてほとんど免疫原性ではない、非ヒト、典型的には
ネズミに由来する抗体を意味するであろう。これは、種々の方法、たとえば(a
)必須のフレームワーク残基の保持を伴って又はそれを伴わないで、ヒトフレー
ムワーク及び不変領域上に非ヒトCDR のみをグラフトすること、又は(b)完全
な非ヒト可変ドメインをグラフトするが、しかしそれらを、表面残基の置換によ
り、非ヒト−様部分により“おおい隠すこと”を包含する種々の方法により達成
され得る。
持するが、しかしヒトにおいてほとんど免疫原性ではない、非ヒト、典型的には
ネズミに由来する抗体を意味するであろう。これは、種々の方法、たとえば(a
)必須のフレームワーク残基の保持を伴って又はそれを伴わないで、ヒトフレー
ムワーク及び不変領域上に非ヒトCDR のみをグラフトすること、又は(b)完全
な非ヒト可変ドメインをグラフトするが、しかしそれらを、表面残基の置換によ
り、非ヒト−様部分により“おおい隠すこと”を包含する種々の方法により達成
され得る。
【0036】 本発明の実施において有用であるそのような方法は、Jones など., Morrison
など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison and Oi
, Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988);Verhoeyen など., Science, 239: 1534-15
36 (1988); Padian, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Imm
un., 31 (3): 169-217 (1994) に開示されるそれらの方法を包含する。
など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984); Morrison and Oi
, Adv. Immunol. 44: 65-92 (1988);Verhoeyen など., Science, 239: 1534-15
36 (1988); Padian, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Imm
un., 31 (3): 169-217 (1994) に開示されるそれらの方法を包含する。
【0037】 相補的決定領域又はCDR −用語CDR とは、本明細書において使用される場合、
Kabat など(1991)により記載されるように、生来の免疫グロブリン結合部位の
天然のFv領域の結合親和性及び特異性を共に定義するアミノ酸配列を意味する。 フレームワーク領域−用語フレームワーク(Framework )領域(FR)とは、本
明細書において使用される場合、CDR 間に挿入されたアミノ酸配列を意味する。
抗体のそれらの部位は、抗原結合のために適切な配向でCDR を保存するよう作用
する。
Kabat など(1991)により記載されるように、生来の免疫グロブリン結合部位の
天然のFv領域の結合親和性及び特異性を共に定義するアミノ酸配列を意味する。 フレームワーク領域−用語フレームワーク(Framework )領域(FR)とは、本
明細書において使用される場合、CDR 間に挿入されたアミノ酸配列を意味する。
抗体のそれらの部位は、抗原結合のために適切な配向でCDR を保存するよう作用
する。
【0038】 不変領域−エフェクター機能を付与する抗体分子の一部。本発明においては、
ネズミ不変領域は、ヒト不変領域により置換される。対象のキメラ又はヒト型化
抗体の不変領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。H 鎖不変領域は、次の5種
のイソタイプのいずれかから選択され得る:α, δ, ε, γ又はμ。さらに、種
々のサブクラスのH 鎖(たとえば、H 鎖のIgG サブクラス)は、異なったエフェ
クター機能を担当し、そして従って、所望のH 鎖不変領域を選択することによっ
て、所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体が生成され得る。好ましい不変
領域は、γ1(IgG 1)、γ3(IgG3)及びγ4(IgG4)である。γ1(IgG 1
)イソタイプの不変領域がより好ましい。L 鎖不変領域は、κ又はλ型、好まし
くはκ型のものである。
ネズミ不変領域は、ヒト不変領域により置換される。対象のキメラ又はヒト型化
抗体の不変領域は、ヒト免疫グロブリンに由来する。H 鎖不変領域は、次の5種
のイソタイプのいずれかから選択され得る:α, δ, ε, γ又はμ。さらに、種
々のサブクラスのH 鎖(たとえば、H 鎖のIgG サブクラス)は、異なったエフェ
クター機能を担当し、そして従って、所望のH 鎖不変領域を選択することによっ
て、所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体が生成され得る。好ましい不変
領域は、γ1(IgG 1)、γ3(IgG3)及びγ4(IgG4)である。γ1(IgG 1
)イソタイプの不変領域がより好ましい。L 鎖不変領域は、κ又はλ型、好まし
くはκ型のものである。
【0039】 キメラ抗体−これは、典型的には異なった種のものである2種の異なった抗体
に由来する配列を含む抗体である。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト及びネ
ズミ抗体フラグメント、一般的にはヒト不変及びネズミ可変領域を含んで成る。 哺乳類−乳腺により分泌される乳汁によりそれらの子供を養う動物、好ましく
は温血動物、より好ましくはヒトである。
に由来する配列を含む抗体である。最も典型的には、キメラ抗体は、ヒト及びネ
ズミ抗体フラグメント、一般的にはヒト不変及びネズミ可変領域を含んで成る。 哺乳類−乳腺により分泌される乳汁によりそれらの子供を養う動物、好ましく
は温血動物、より好ましくはヒトである。
【0040】 免疫原性−受容体に投与される場合、免疫応答(体液性又は細胞性)を誘発す
る標的タンパク質又は治療成分の能力の測定。本発明は、対象のヒト型化抗体又
はそのフラグメントの免疫原性に関する。 ヒト型化、低められた免疫原性−これは、親抗体、典型的にはネズミ抗体、た
とえばCOL −1に対して低められた免疫原性を示すヒト型化抗体を言及する。
る標的タンパク質又は治療成分の能力の測定。本発明は、対象のヒト型化抗体又
はそのフラグメントの免疫原性に関する。 ヒト型化、低められた免疫原性−これは、親抗体、典型的にはネズミ抗体、た
とえばCOL −1に対して低められた免疫原性を示すヒト型化抗体を言及する。
【0041】 親抗体の結合性質を実質的に保持するヒト型化抗体−これは、そのようなヒト
型化抗体を生成するために使用される親抗体により認識される抗原と特異的に結
合する能力を保存するヒト型化抗体を意味する。好ましくは、ヒト型化抗体は、
親抗体、たとえばCOL −1 と同じか又は実質的に同じ抗原結合親和性及び結合活
性を示すであろう。理想的には、抗体の親和性は、親抗体親和性の5%以上、よ
り好ましくは約30%以上、そして最も好ましくは50%以上であろう。抗原−結合
親和性をアッセイするための方法は、当業界においてよく知られており、そして
半−最大結合アッセイ、競争アッセイ及びScatchard 分析を包含する。適切な抗
原結合アッセイが本出願に記載される。
型化抗体を生成するために使用される親抗体により認識される抗原と特異的に結
合する能力を保存するヒト型化抗体を意味する。好ましくは、ヒト型化抗体は、
親抗体、たとえばCOL −1 と同じか又は実質的に同じ抗原結合親和性及び結合活
性を示すであろう。理想的には、抗体の親和性は、親抗体親和性の5%以上、よ
り好ましくは約30%以上、そして最も好ましくは50%以上であろう。抗原−結合
親和性をアッセイするための方法は、当業界においてよく知られており、そして
半−最大結合アッセイ、競争アッセイ及びScatchard 分析を包含する。適切な抗
原結合アッセイが本出願に記載される。
【0042】 その広範囲な態様においては、本発明は、CEA 、すなわち種々のヒト癌、特に
胃腸、結腸直腸、乳、肺及び卵巣癌により発現される抗原を特異的に結合するヒ
ト型化抗体に向けられる。好ましくは、そのようなヒト型化抗体は、CEA に対す
る良好な結合親和性を有する抗体、たとえばMuraroなど., Cancer Res., 45 (11
Pt. Z): 5769-5780 (1985)により開示されるCOL −1〜COL −15から誘導される
であろう。
胃腸、結腸直腸、乳、肺及び卵巣癌により発現される抗原を特異的に結合するヒ
ト型化抗体に向けられる。好ましくは、そのようなヒト型化抗体は、CEA に対す
る良好な結合親和性を有する抗体、たとえばMuraroなど., Cancer Res., 45 (11
Pt. Z): 5769-5780 (1985)により開示されるCOL −1〜COL −15から誘導される
であろう。
【0043】 最も好ましくは、そのようなヒト型化抗体は、CEA −関連抗原、たとえば非特
異的交差反応性抗原(NCA )及び通常の便抗原(NFA )との検出できる交差−反
応性を伴わないで、高い親和性(1.4 ×109M-1)でCEA に結合することが報告さ
れているCOL −1、すなわちIgG2a イソタイプのネズミ抗体から誘導されるであ
ろう。
異的交差反応性抗原(NCA )及び通常の便抗原(NFA )との検出できる交差−反
応性を伴わないで、高い親和性(1.4 ×109M-1)でCEA に結合することが報告さ
れているCOL −1、すなわちIgG2a イソタイプのネズミ抗体から誘導されるであ
ろう。
【0044】 上記で論じられたように、ヒト型化抗体は、ネズミに比べて可能性ある利点を
提供し、そしてまた、キメラ抗体、たとえばヒトにおける低められた免疫原性を
提供する。これは、それが、そのようなヒト型化抗体が、たとえば癌の処理のた
めに、又は腫瘍イメージングによるような癌の診断のために、インビボで投与さ
れる場合、HAMA応答の誘発を低め、そして実質的に排除すべきであるので、好都
合である。また、そのような抗体は、改良された血漿クリアランス、薬理動態及
び腫瘍標的化特性を示すことができる。
提供し、そしてまた、キメラ抗体、たとえばヒトにおける低められた免疫原性を
提供する。これは、それが、そのようなヒト型化抗体が、たとえば癌の処理のた
めに、又は腫瘍イメージングによるような癌の診断のために、インビボで投与さ
れる場合、HAMA応答の誘発を低め、そして実質的に排除すべきであるので、好都
合である。また、そのような抗体は、改良された血漿クリアランス、薬理動態及
び腫瘍標的化特性を示すことができる。
【0045】 しかしながら、上記で示されたように、ヒト型化は、多くの場合、抗原結合に
悪影響を及ぼす。好ましくは、本発明のヒト型化αCEA 抗体は、親ネズミ抗体、
好ましくはCOL −1 のCEA 結合抗原親和性の約5%以上、そしてより好ましくは
、役30%以上のCEA に対する結合親和性を有するであろう。最も好ましくは、本
発明のヒト型化抗体は、COL −1 、又はそれに由来するキメラ抗体のCEA 結合親
和性の約5%以上、そしてより好ましくは約30%以上及び最も好ましくは約50%
以上のCEA に対する結合親和性を有するであろう。
悪影響を及ぼす。好ましくは、本発明のヒト型化αCEA 抗体は、親ネズミ抗体、
好ましくはCOL −1 のCEA 結合抗原親和性の約5%以上、そしてより好ましくは
、役30%以上のCEA に対する結合親和性を有するであろう。最も好ましくは、本
発明のヒト型化抗体は、COL −1 、又はそれに由来するキメラ抗体のCEA 結合親
和性の約5%以上、そしてより好ましくは約30%以上及び最も好ましくは約50%
以上のCEA に対する結合親和性を有するであろう。
【0046】 好ましくは、本発明のヒト型化抗体は、COL −1と同じエピトープと結合する
であろう。そのような抗体は、CEA 又はCEA −発現細胞への結合のためにCOL −
1 と競争するそれらの能力に基づいて同定され得る。 一般的に、対象のヒト型化抗体は、CEA を結合する抗体(好ましくは、COL −
1)の可変H (V H )及び可変L 鎖(V L 、たとえばV k )をコードする核酸配
列を得、前記V H 及びV L 配列においてCDR を同定し、そしてそのようなCDR −
コードの核酸配列を、選択されたヒトフレームワーク−コードの核酸配列上にグ
ラフトすることによって生成される。
であろう。そのような抗体は、CEA 又はCEA −発現細胞への結合のためにCOL −
1 と競争するそれらの能力に基づいて同定され得る。 一般的に、対象のヒト型化抗体は、CEA を結合する抗体(好ましくは、COL −
1)の可変H (V H )及び可変L 鎖(V L 、たとえばV k )をコードする核酸配
列を得、前記V H 及びV L 配列においてCDR を同定し、そしてそのようなCDR −
コードの核酸配列を、選択されたヒトフレームワーク−コードの核酸配列上にグ
ラフトすることによって生成される。
【0047】 好ましくは、ヒトフレームワークアミノ酸配列は、得られる抗体がたぶん、ヒ
トにおけるインビボ投与のために適切であるように選択される。これは、たとえ
ばそのようなヒトFRを含む抗体のこれまでの使用法に基づいて決定され得る。好
ましくは、ヒトFRはそれら自体、有意な免疫原ではないであろう。そのようなヒ
トフレームワークの例は、NEWM及びREI を包含する。
トにおけるインビボ投与のために適切であるように選択される。これは、たとえ
ばそのようなヒトFRを含む抗体のこれまでの使用法に基づいて決定され得る。好
ましくは、ヒトFRはそれら自体、有意な免疫原ではないであろう。そのようなヒ
トフレームワークの例は、NEWM及びREI を包含する。
【0048】 あるいは、ヒト型化されるべき抗体(たとえば、COL −1)のFRのアミノ酸配
列は、既知のヒトFRの配列に比較され、そしてCDR −グラフトのために使用され
るヒトFRは、親抗体、たとえばCEA を結合するネズミ抗体の配列に非常に類似す
るそれらの含有配列に基づいて選択されるであろう。多くのヒトFRは単離されて
おり、そしてそれらの配列は文献において報告されている。これは、選択された
ヒトFR上にグラフトされた親(たとえば、ネズミ)抗体のCDR を含む、その得ら
れるCDR −グラフトされた“ヒト型化”抗体が実質的に抗原結合構造を保持し、
そして従って、親抗体の結合親和性を保持する可能性を高める。
列は、既知のヒトFRの配列に比較され、そしてCDR −グラフトのために使用され
るヒトFRは、親抗体、たとえばCEA を結合するネズミ抗体の配列に非常に類似す
るそれらの含有配列に基づいて選択されるであろう。多くのヒトFRは単離されて
おり、そしてそれらの配列は文献において報告されている。これは、選択された
ヒトFR上にグラフトされた親(たとえば、ネズミ)抗体のCDR を含む、その得ら
れるCDR −グラフトされた“ヒト型化”抗体が実質的に抗原結合構造を保持し、
そして従って、親抗体の結合親和性を保持する可能性を高める。
【0049】 そのような研究の結果として、REI 及びNEWM抗体のFRは、COL −1のCDR の有
意な抗原結合親和性の保持を可能にするアミノ酸配列を有するものとして同定さ
れている。示されたように、選択されたヒトフレームワーク領域は好ましくは、
インビボ投与のために適切であることが予測される、すなわち免疫原性ではない
それらの領域であろう。それらのアミノ酸配列に基づけば、REI 及びNEWMヒトフ
レームワーク領域は、実質的に非免疫原性であることが予測される。
意な抗原結合親和性の保持を可能にするアミノ酸配列を有するものとして同定さ
れている。示されたように、選択されたヒトフレームワーク領域は好ましくは、
インビボ投与のために適切であることが予測される、すなわち免疫原性ではない
それらの領域であろう。それらのアミノ酸配列に基づけば、REI 及びNEWMヒトフ
レームワーク領域は、実質的に非免疫原性であることが予測される。
【0050】 いずれの方法においても、好ましくはネズミαCEA 抗体のV H 及びV L 領域を
コードするDNA 配列が得られるべきである。免疫グロブリンをコードする核酸配
列をクローニングするための方法は、当業界においてよく知られている。そのよ
うな方法は、一般的に、ポリメラーゼ鎖反応(PCR )による、適切なプライマー
を用いてのクローンされるべき免疫グロブリンコード配列の増幅を包含するであ
ろう。免疫グロブリン核酸配列を増幅するために適切なプライマー、及び特にネ
ズミ可変H 鎖及び可変L 鎖配列は、文献において報告されている。
コードするDNA 配列が得られるべきである。免疫グロブリンをコードする核酸配
列をクローニングするための方法は、当業界においてよく知られている。そのよ
うな方法は、一般的に、ポリメラーゼ鎖反応(PCR )による、適切なプライマー
を用いてのクローンされるべき免疫グロブリンコード配列の増幅を包含するであ
ろう。免疫グロブリン核酸配列を増幅するために適切なプライマー、及び特にネ
ズミ可変H 鎖及び可変L 鎖配列は、文献において報告されている。
【0051】 そのような免疫グロブリン−コード配列がクローンされた後、それらは当業界
においてよく知られている方法により配列決定され得る。これは、VH及びVL−コ
ード配列、及び特定には、CDR 及びFRをコードするその一部を同定するためにも
たらされるであろう。これは、たとえば、アメリカ特許第4,816,397 号(Bossな
ど. )及びアメリカ特許第5,225,539 号(Winterなど. )に開示される方法を包
含するよく知られた方法によりもたらされ得る。
においてよく知られている方法により配列決定され得る。これは、VH及びVL−コ
ード配列、及び特定には、CDR 及びFRをコードするその一部を同定するためにも
たらされるであろう。これは、たとえば、アメリカ特許第4,816,397 号(Bossな
ど. )及びアメリカ特許第5,225,539 号(Winterなど. )に開示される方法を包
含するよく知られた方法によりもたらされ得る。
【0052】 ヒト型化されるべき抗体のCDR 及びFRをコードするDNA 配列が同定されると、
次に、CDR をコードするアミノ酸配列が同定され(核酸配列及び遺伝子コードに
基づいて、及び前の抗体配列への比較により推定される)、そしてCDR をコード
する核酸配列が、選択されたヒトFR−コードの配列にグラフトされる。これは、
適切なプライマー及びリンカーの使用により達成される。所望の核酸配列の連結
を提供するための適切なプライマー及びリンカーを選択するための方法は、当業
者によく知られている。
次に、CDR をコードするアミノ酸配列が同定され(核酸配列及び遺伝子コードに
基づいて、及び前の抗体配列への比較により推定される)、そしてCDR をコード
する核酸配列が、選択されたヒトFR−コードの配列にグラフトされる。これは、
適切なプライマー及びリンカーの使用により達成される。所望の核酸配列の連結
を提供するための適切なプライマー及びリンカーを選択するための方法は、当業
者によく知られている。
【0053】 上記で論じられたように、ヒト型化のために使用される、選択されたヒトFRは
、好ましくは、インビボ投与のために適切であるそれらのFRであり、すなわちそ
れらは、ヒトにおいて、それら自体免疫原性ではなく(アロタイプ差異のために
);その例はREI 及びNEWMヒトFRである。他方では、ヒトFRは、それらが親抗体
のFR配列のアミノ酸配列と非常に類似するアミノ酸配列を含むように選択される
であろう。これは、ネズミFRのアミノ酸配列を、これまでに報告されているヒト
FR(たとえば、Kabat など.,前記を参照のこと)の配列に比較することによって
もたらされ得る。
、好ましくは、インビボ投与のために適切であるそれらのFRであり、すなわちそ
れらは、ヒトにおいて、それら自体免疫原性ではなく(アロタイプ差異のために
);その例はREI 及びNEWMヒトFRである。他方では、ヒトFRは、それらが親抗体
のFR配列のアミノ酸配列と非常に類似するアミノ酸配列を含むように選択される
であろう。これは、ネズミFRのアミノ酸配列を、これまでに報告されているヒト
FR(たとえば、Kabat など.,前記を参照のこと)の配列に比較することによって
もたらされ得る。
【0054】 CDR −コード配列が選択されたヒトFR−コード配列にグラフトされた後、次に
、“ヒト型化”可変H 及び可変L 鎖配列をコードするその得られるDNA 配列が、
CEA を結合する、ヒト型化Fv又はヒト型化抗体を生成するために発現されるであ
ろう。典型的には、ヒト型化V H 及びV L 配列は完全なαCEA 抗体分子の一部と
して、すなわちそのDNA コード配列が市販のライブラリーから得られているか、
又はDNA 配列を得るために上記方法の1 つを用いて得られたヒト不変ドメイン配
列との融合タンパク質として発現されるであろう。
、“ヒト型化”可変H 及び可変L 鎖配列をコードするその得られるDNA 配列が、
CEA を結合する、ヒト型化Fv又はヒト型化抗体を生成するために発現されるであ
ろう。典型的には、ヒト型化V H 及びV L 配列は完全なαCEA 抗体分子の一部と
して、すなわちそのDNA コード配列が市販のライブラリーから得られているか、
又はDNA 配列を得るために上記方法の1 つを用いて得られたヒト不変ドメイン配
列との融合タンパク質として発現されるであろう。
【0055】 しかしながら、V H 及びV L 配列はまた、ヒト型化αCEA Fvを生成するために
、不変配列の不在下で発現され得る。それにもかかわらず、ヒト不変配列の融合
は、得られるヒト型化αCEA 抗体がヒトエフェクター機能、たとえばCDC 及びAD
CC活性を有するので、実質的に所望される。
、不変配列の不在下で発現され得る。それにもかかわらず、ヒト不変配列の融合
は、得られるヒト型化αCEA 抗体がヒトエフェクター機能、たとえばCDC 及びAD
CC活性を有するので、実質的に所望される。
【0056】 既知配列をコードするDNA を合成するための方法は、当業界においてよく知ら
れている。そのような方法を用いて、対象のヒト型化V L 及びV H 配列をコード
するDNA 配列(不変領域を有するか又はそれを有さない)が合成され、そして次
に、組換え抗体の発現のために適切なベクターシステムにおいて発現される。こ
れは、ヒト不変ドメイン配列を有する融合タンパク質として発現され、そして機
能的(抗原結合)抗体又は抗体フラグメントを生成するために会合する対象のヒ
ト型化V L 及びV H 配列を提供するいずれかのベクターシステムにおいてもたら
され得る。有用な方法は、たとえばアメリカ特許第4,816,397 号(Bossなど. )
及びアメリカ特許第5,225,539 号(Winterなど. )に示される。
れている。そのような方法を用いて、対象のヒト型化V L 及びV H 配列をコード
するDNA 配列(不変領域を有するか又はそれを有さない)が合成され、そして次
に、組換え抗体の発現のために適切なベクターシステムにおいて発現される。こ
れは、ヒト不変ドメイン配列を有する融合タンパク質として発現され、そして機
能的(抗原結合)抗体又は抗体フラグメントを生成するために会合する対象のヒ
ト型化V L 及びV H 配列を提供するいずれかのベクターシステムにおいてもたら
され得る。有用な方法は、たとえばアメリカ特許第4,816,397 号(Bossなど. )
及びアメリカ特許第5,225,539 号(Winterなど. )に示される。
【0057】 組換え抗体及びヒト型化抗体の発現のために適切な発現ベクター及び宿主細胞
は、当業界において良く知られている。次の文献は、本発明を実施することに使
用され得る組換え免疫グロブリンの発現のために適切な方法及びベクターを表す
:Weidleなど., Gene, 51: 21-29 (1987); Doraiなど., J. Immunol., 13(12):
4232-4241 (1987); De Waeleなど., Eur. J. Blochem., 176: 287-295 (1988);
Colcher など., Cancer Res., 49: 1738-1745 (1989); Woodなど., J. Immunol.
, 145(a): 3011-3016 (1990); Bulensなど., Eur. J. Biochem., 195: 235-242
(1991);
は、当業界において良く知られている。次の文献は、本発明を実施することに使
用され得る組換え免疫グロブリンの発現のために適切な方法及びベクターを表す
:Weidleなど., Gene, 51: 21-29 (1987); Doraiなど., J. Immunol., 13(12):
4232-4241 (1987); De Waeleなど., Eur. J. Blochem., 176: 287-295 (1988);
Colcher など., Cancer Res., 49: 1738-1745 (1989); Woodなど., J. Immunol.
, 145(a): 3011-3016 (1990); Bulensなど., Eur. J. Biochem., 195: 235-242
(1991);
【0058】 Beggingtonなど., Biol. Technology, 10: 169 (1992); King など., Biochem
. J., 281: 317-323 (1992); Page など., Biol. Technology, 9: 64(1991); ki
ngなど., Biochem. J., 290: 723-729 (1993); Chaudary など., Nature, 339:
394-397 (1989); Jones など., Nature, 321: 522-525 (1986); Morrison and O
l, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Benharなど., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91: 12051-12055 (1994); Singer など., J. Immunol., 150: 2844-2857 (
1993); Cootcなど., Hybridoms, 13(3): 215-219 (1994); Queenなど., Proc. N
atl. Acad. USA, 86: 10029-10033 (1989); Caron など., Cancer Res., 32: 67
61-6767 (1992); Cotomaなど., J. Immunol. Meth., 152: 89-109 (1992)。
. J., 281: 317-323 (1992); Page など., Biol. Technology, 9: 64(1991); ki
ngなど., Biochem. J., 290: 723-729 (1993); Chaudary など., Nature, 339:
394-397 (1989); Jones など., Nature, 321: 522-525 (1986); Morrison and O
l, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Benharなど., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 91: 12051-12055 (1994); Singer など., J. Immunol., 150: 2844-2857 (
1993); Cootcなど., Hybridoms, 13(3): 215-219 (1994); Queenなど., Proc. N
atl. Acad. USA, 86: 10029-10033 (1989); Caron など., Cancer Res., 32: 67
61-6767 (1992); Cotomaなど., J. Immunol. Meth., 152: 89-109 (1992)。
【0059】 さらに、組換え抗体の発現のために適切なベクターは市販されている。ベクタ
ーは、たとえば裸核酸セグメント、キャリヤー会合された核酸セグメント、核タ
ンパク質、プラスミド、ウィルス、ウィロイド又は転移因子であり得る。 機能的免疫グロブリンを発現できることが知られている宿主細胞は、たとえば
哺乳類細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣(CHO )細胞;COS 細胞;骨
髄腫細胞、たとえばNSO 及びSP2/O 細胞;細菌、たとえばE.コリ;酵母細胞、た
とえばサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae); 及び他の
宿主細胞を包含する。それらのうち、CHO 細胞が、免疫グロブリンを効果的に発
現し、そして分泌するそれらの能力を付与する多くの研究により使用される。NS
O 細胞は、本発明において有用な宿主細胞の好ましい型の1つである。
ーは、たとえば裸核酸セグメント、キャリヤー会合された核酸セグメント、核タ
ンパク質、プラスミド、ウィルス、ウィロイド又は転移因子であり得る。 機能的免疫グロブリンを発現できることが知られている宿主細胞は、たとえば
哺乳類細胞、たとえばチャイニーズハムスター卵巣(CHO )細胞;COS 細胞;骨
髄腫細胞、たとえばNSO 及びSP2/O 細胞;細菌、たとえばE.コリ;酵母細胞、た
とえばサッカロミセス・セレビシアエ(Saccharomyces cerevisiae); 及び他の
宿主細胞を包含する。それらのうち、CHO 細胞が、免疫グロブリンを効果的に発
現し、そして分泌するそれらの能力を付与する多くの研究により使用される。NS
O 細胞は、本発明において有用な宿主細胞の好ましい型の1つである。
【0060】 実質的に、ヒト型化抗体の組換え発現は、2種の一般的な方法の1 つにより得
られる。第1の方法においては、宿主細胞は、選択された不変領域に任意に融合
されたV H 及びV L 可変配列の両方の発現を提供する単一のベクターによりトラ
ンスフェクトされる。第2の方法においては、宿主細胞は、2種のベクターによ
りトランスフェクトされ、それらのベクターの各々は、選択された不変領域にそ
れぞれ任意に融合されるV H 又はV L 配列のいずれかの発現を提供する。
られる。第1の方法においては、宿主細胞は、選択された不変領域に任意に融合
されたV H 及びV L 可変配列の両方の発現を提供する単一のベクターによりトラ
ンスフェクトされる。第2の方法においては、宿主細胞は、2種のベクターによ
りトランスフェクトされ、それらのベクターの各々は、選択された不変領域にそ
れぞれ任意に融合されるV H 又はV L 配列のいずれかの発現を提供する。
【0061】 ヒト不変ドメイン配列は当業界においてよく知られており、そして文献に報告
されている。好ましいヒト不変L 鎖配列(C L )は、κ及びλ不変L 鎖配列を包
含する。好ましいヒト不変H 鎖配列は、ヒトγ1, 2, 3, 4及び変更された効果又
は機能、たとえば増強されたインビボ半減期、低められたFc受容体結合及び同様
のものを提供するそれらの突然変異誘発されたバージョンを包含する。
されている。好ましいヒト不変L 鎖配列(C L )は、κ及びλ不変L 鎖配列を包
含する。好ましいヒト不変H 鎖配列は、ヒトγ1, 2, 3, 4及び変更された効果又
は機能、たとえば増強されたインビボ半減期、低められたFc受容体結合及び同様
のものを提供するそれらの突然変異誘発されたバージョンを包含する。
【0062】 発現の後、得られるヒト型化抗体の抗原結合親和性は、既知の方法、たとえば
Scatchard 分析によりアッセイされるであろう。理想的には、ヒト型化抗体の抗
原−結合親和性は、親抗体、たとえばCOL −1 の親和性に接近するであろう。上
記で論じられたように、理想的には、ヒト型化抗体の親和性は、親抗体、たとえ
ばCOL −1の5%以上、より好ましくは30%以上、及び最も好ましくは50%以上
であろう。
Scatchard 分析によりアッセイされるであろう。理想的には、ヒト型化抗体の抗
原−結合親和性は、親抗体、たとえばCOL −1 の親和性に接近するであろう。上
記で論じられたように、理想的には、ヒト型化抗体の親和性は、親抗体、たとえ
ばCOL −1の5%以上、より好ましくは30%以上、及び最も好ましくは50%以上
であろう。
【0063】 多くの場合、選択されたヒトFR上にCDR (CEA を結合する抗体からの)をグラ
フトすることによって生成されるヒト型化抗体は、CEA に対する所望の親和性を
有する、ヒト型化抗体を提供することができる。しかしながら、抗原結合を増強
するために、選択されたヒトFRの特定の残基をさらに修飾することが必要であり
、又は所望される。これは、いくつかのフレームワーク残基が抗原結合をもたら
すために又は少なくとももたらすために必須であると思われるので、存在するこ
とができる。好ましくは、結合一部位構造を維持し、又はもたらす親(たとえば
、ネズミ)抗体のそれらのフレームワーク残基が保持されるであろう。それらの
残基は、Fab フラグメントの親抗体のX −線結晶学により同定され得、それによ
り、抗原−結合部位の三次元構造が同定される。
フトすることによって生成されるヒト型化抗体は、CEA に対する所望の親和性を
有する、ヒト型化抗体を提供することができる。しかしながら、抗原結合を増強
するために、選択されたヒトFRの特定の残基をさらに修飾することが必要であり
、又は所望される。これは、いくつかのフレームワーク残基が抗原結合をもたら
すために又は少なくとももたらすために必須であると思われるので、存在するこ
とができる。好ましくは、結合一部位構造を維持し、又はもたらす親(たとえば
、ネズミ)抗体のそれらのフレームワーク残基が保持されるであろう。それらの
残基は、Fab フラグメントの親抗体のX −線結晶学により同定され得、それによ
り、抗原−結合部位の三次元構造が同定される。
【0064】 それらの残基は、親Fab のX −線結晶学により実質的に同定され、それにより
、抗原−結合部位の三次元構造が同定される。また、抗原結合に包含され得るフ
レームワーク残基は、これまでに報告されているヒト型化ネズミ抗体配列に基づ
いて、推定的に選択され得る。従って、CEA 結合を最適化するために親ネズミ抗
体からのそれらの及び他のネズミフレームワーク残基を保持することは、有益で
ある。しかしながら、タンパク質及び抗体のアミノ酸修飾に関連する固有の非予
測性のために、抗原結合に対するその変化の効果は予測できない。それにもかか
わらず、そのような方法論は、理想的には、得られるヒト型化抗体に“ヒト−様
”特徴を付与し、従って、抗原−結合に影響を及ぼす内部及び接触残基を保持し
ながら、それを低い免疫原性にするであろう。
、抗原−結合部位の三次元構造が同定される。また、抗原結合に包含され得るフ
レームワーク残基は、これまでに報告されているヒト型化ネズミ抗体配列に基づ
いて、推定的に選択され得る。従って、CEA 結合を最適化するために親ネズミ抗
体からのそれらの及び他のネズミフレームワーク残基を保持することは、有益で
ある。しかしながら、タンパク質及び抗体のアミノ酸修飾に関連する固有の非予
測性のために、抗原結合に対するその変化の効果は予測できない。それにもかか
わらず、そのような方法論は、理想的には、得られるヒト型化抗体に“ヒト−様
”特徴を付与し、従って、抗原−結合に影響を及ぼす内部及び接触残基を保持し
ながら、それを低い免疫原性にするであろう。
【0065】 本発明はさらに、本明細書に示されるヒト型化抗体及び抗体フラグメントに対
して実質的に相同である変異体及び同等物を包含する。それらは、たとえば保存
性置換突然変異、すなわち類似するアミノ酸による1 又は複数のアミノ酸の置換
を含むことができる。たとえば、保存性置換は、同じ一般的なクラス内のもう1
つのアミノ酸による1 つのアミノ酸の置換、たとえばもう1つの酸性アミノ酸に
よる1 つの酸性アミノ酸の置換、もう1つの塩基性アミノ酸による1つの塩基性
アミノ酸置換、又はもう1 つの中性アミノ酸による1つの中性アミノ酸の置換を
意味する。保存性アミノ酸置換により意図されることは、当業界において良く知
られている。
して実質的に相同である変異体及び同等物を包含する。それらは、たとえば保存
性置換突然変異、すなわち類似するアミノ酸による1 又は複数のアミノ酸の置換
を含むことができる。たとえば、保存性置換は、同じ一般的なクラス内のもう1
つのアミノ酸による1 つのアミノ酸の置換、たとえばもう1つの酸性アミノ酸に
よる1 つの酸性アミノ酸の置換、もう1つの塩基性アミノ酸による1つの塩基性
アミノ酸置換、又はもう1 つの中性アミノ酸による1つの中性アミノ酸の置換を
意味する。保存性アミノ酸置換により意図されることは、当業界において良く知
られている。
【0066】 “実質的に相同である”とは、関連する対照アミノ酸配列に対する対象のアミ
ノ酸配列(オリゴ−又はポリ−ペプチド又はタンパク質の)の類似性に関して使
用される。この用語は、対象及び対照配列間で、それらの配列が“一列整列”し
て存在する場合、すなわち最少数の“ヌル”塩基がそれらの配列間で対応して存
在する塩基の数を最大にするためにそれらの対象及び/ 又は対照配列に挿入され
る場合、少なくとも約75%の“対応”(すなわち、同一のアミノ酸残基の状態が
同時に位置決定される)として定義される。“ヌル”塩基は対象及び対照配列の
一部ではなく;また、対象配列に挿入される“ヌル”塩基の最少数は、対象配列
に挿入される最少数とは異なることができる。
ノ酸配列(オリゴ−又はポリ−ペプチド又はタンパク質の)の類似性に関して使
用される。この用語は、対象及び対照配列間で、それらの配列が“一列整列”し
て存在する場合、すなわち最少数の“ヌル”塩基がそれらの配列間で対応して存
在する塩基の数を最大にするためにそれらの対象及び/ 又は対照配列に挿入され
る場合、少なくとも約75%の“対応”(すなわち、同一のアミノ酸残基の状態が
同時に位置決定される)として定義される。“ヌル”塩基は対象及び対照配列の
一部ではなく;また、対象配列に挿入される“ヌル”塩基の最少数は、対象配列
に挿入される最少数とは異なることができる。
【0067】 この定義においては、対象配列は、両アミノ酸配列がαCEA 抗体又はαCEA 結
合親和性を有する抗体フラグメントのいずれかであるタンパク質又はタンパク質
の一部を製造する対象配列に“関連している”と思われる。それらのαCEA 抗体
又は抗体フラグメントを含んで成る個々のタンパク質は、独立して、抗体又は抗
体フラグメント、又はニ又は多官能タンパク質、たとえば融合タンパク質、二及
び多−特異的抗体、一本鎖抗体及び同様のものであり得る。
合親和性を有する抗体フラグメントのいずれかであるタンパク質又はタンパク質
の一部を製造する対象配列に“関連している”と思われる。それらのαCEA 抗体
又は抗体フラグメントを含んで成る個々のタンパク質は、独立して、抗体又は抗
体フラグメント、又はニ又は多官能タンパク質、たとえば融合タンパク質、二及
び多−特異的抗体、一本鎖抗体及び同様のものであり得る。
【0068】 本発明はさらに、そのようなヒト型化抗体及び抗体フラグメントが発現され得
る核酸配列、及びそれらのヒト型化抗体及び抗体フラグメントがトランスフェク
トされた宿主細胞において発現され得る発明のベクターに向けられる。
る核酸配列、及びそれらのヒト型化抗体及び抗体フラグメントがトランスフェク
トされた宿主細胞において発現され得る発明のベクターに向けられる。
【0069】 好ましい態様においては、そのようなヒト型化抗体及び対応する核酸配列は、
COL −1に由来するであろう。最も好ましくは、ヒト型化V H 配列及びヒト型化
V L 配列は、それぞれ、図1 又は13、又は図2又は14に示されるような、及び下
記に示される例において論じられるような配列を実質的に有するであろう。しか
しながら、論じられるように、本発明はさらに、それらのヒト型化V H 及びV L 配列、たとえば1又は複数の保存性アミノ酸置換をさらに含んで成るか、又は抗
原結合に影響を及ぼし、又はそれを有意に低めない1又は複数の追加のネズミフ
レームワーク残基を保持する配列の他の修飾に向けられる。
COL −1に由来するであろう。最も好ましくは、ヒト型化V H 配列及びヒト型化
V L 配列は、それぞれ、図1 又は13、又は図2又は14に示されるような、及び下
記に示される例において論じられるような配列を実質的に有するであろう。しか
しながら、論じられるように、本発明はさらに、それらのヒト型化V H 及びV L 配列、たとえば1又は複数の保存性アミノ酸置換をさらに含んで成るか、又は抗
原結合に影響を及ぼし、又はそれを有意に低めない1又は複数の追加のネズミフ
レームワーク残基を保持する配列の他の修飾に向けられる。
【0070】 対象のヒト型化抗体は、それらがCEA (多くの異なった癌細胞型、たとえば肺
癌、乳癌、胃腸癌、たとえば胃癌、結腸直腸癌、たとえば結腸癌、卵巣癌、等上
で発現される抗原)に特異的に結合し、そしてさらに、それらがヒトにおいて、
有意に免疫性ではないので、次のような使用のために適切であるべきである:CE
A 発現により特徴づけられる癌の処理又は予防のための治療薬;CEA 発現により
特徴づけられる癌の進行の診断及び評価のための診断剤(CEA 発現のレベルに基
づく);腫瘍イメージング剤;又はRadioimmunoguided SurgeryR System (RIGSR
) における放射性ラベルされた抗体。Hinkleなど., Antibody, Immunoconjugate
s and Radiopharmaceuticals, 4(3): 339-358 (1991)を参照のこと。
癌、乳癌、胃腸癌、たとえば胃癌、結腸直腸癌、たとえば結腸癌、卵巣癌、等上
で発現される抗原)に特異的に結合し、そしてさらに、それらがヒトにおいて、
有意に免疫性ではないので、次のような使用のために適切であるべきである:CE
A 発現により特徴づけられる癌の処理又は予防のための治療薬;CEA 発現により
特徴づけられる癌の進行の診断及び評価のための診断剤(CEA 発現のレベルに基
づく);腫瘍イメージング剤;又はRadioimmunoguided SurgeryR System (RIGSR
) における放射性ラベルされた抗体。Hinkleなど., Antibody, Immunoconjugate
s and Radiopharmaceuticals, 4(3): 339-358 (1991)を参照のこと。
【0071】 当業者は、どれくらいの量の抗体が癌を処理するために効果的であるか又は非
毒性であるかを決定することができる(通常の実験により)。しかしながら、一
般的に、有効用量は、1日当たり、体重1kg 当たり約0.05〜100mg の範囲であろ
う。
毒性であるかを決定することができる(通常の実験により)。しかしながら、一
般的に、有効用量は、1日当たり、体重1kg 当たり約0.05〜100mg の範囲であろ
う。
【0072】 本発明のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントは、治療又は予防効果を
生成するために十分な量で、前記処理方法に従ってヒト又は他の動物に投与され
得る。本発明の抗体は、従来の医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤、及び/
又は賦形剤と共に既知の技法に従って、本発明の抗体を組合すことによって調製
される従来の用量形で、そのようなヒト又は他の動物に投与され得る。医薬的に
許容できるキャリヤー、希釈剤及び/ 又は賦形剤の形及び特徴は、それが組み合
わされるべき活性成分の量、投与経路、及び他の良く知られている変数により指
図されることが、当業者により認識されるであろう。
生成するために十分な量で、前記処理方法に従ってヒト又は他の動物に投与され
得る。本発明の抗体は、従来の医薬的に許容できるキャリヤー、希釈剤、及び/
又は賦形剤と共に既知の技法に従って、本発明の抗体を組合すことによって調製
される従来の用量形で、そのようなヒト又は他の動物に投与され得る。医薬的に
許容できるキャリヤー、希釈剤及び/ 又は賦形剤の形及び特徴は、それが組み合
わされるべき活性成分の量、投与経路、及び他の良く知られている変数により指
図されることが、当業者により認識されるであろう。
【0073】 医薬的に許容できる製剤は、たとえば適切な溶媒、保存剤、たとえば所望によ
り、ベンジルアルコール、及び緩衝材を含むことができる。有用な溶媒は、たと
えば水、水性アルコール、グリコール、及びホスホネート及びカーボネートエス
テルを包含する。そのような水溶液は、50体積%以下の有機溶媒を含む。懸濁液
型製剤は、キャリヤーとして液体懸濁媒体、たとえばポリビニルピロリドン、不
活性油、たとえば植物油又は高く精製された鉱油、又は水性セルロースエーテル
、たとえば水性カルボキシメチルセルロースを含むことができる。
り、ベンジルアルコール、及び緩衝材を含むことができる。有用な溶媒は、たと
えば水、水性アルコール、グリコール、及びホスホネート及びカーボネートエス
テルを包含する。そのような水溶液は、50体積%以下の有機溶媒を含む。懸濁液
型製剤は、キャリヤーとして液体懸濁媒体、たとえばポリビニルピロリドン、不
活性油、たとえば植物油又は高く精製された鉱油、又は水性セルロースエーテル
、たとえば水性カルボキシメチルセルロースを含むことができる。
【0074】 増粘剤、たとえばゼラチン又はアルギネートがまた存在し、1又は複数の天然
又は合成の界面活性剤又は脱泡剤が使用され得、そして1又は複数の懸濁剤、た
とえばソルビトール又は他の糖が使用され得る。そのような形成体は、1又は複
数のアジュバントを含むことができる。
又は合成の界面活性剤又は脱泡剤が使用され得、そして1又は複数の懸濁剤、た
とえばソルビトール又は他の糖が使用され得る。そのような形成体は、1又は複
数のアジュバントを含むことができる。
【0075】 本発明の抗体(又はそのフラグメント)の投与経路は、経口、非経口、吸入又
は局所であり得る。用語、非経口とは、本明細書において使用される場合、静脈
内、筋肉内、皮下、直腸、膣内又は腹腔内投与を包含する。非経口投与の皮下、
静脈内及び筋肉内形が一般的に好ましい。 予防的に又は治療的に使用する本発明のヒト型化抗体のための毎日の非経口及
び経口用量レジメは、一般的に、1 日当たり・体重1kg 当たり約0.005 〜100mg
、好ましくは約0.5 〜10mgの範囲であろう。
は局所であり得る。用語、非経口とは、本明細書において使用される場合、静脈
内、筋肉内、皮下、直腸、膣内又は腹腔内投与を包含する。非経口投与の皮下、
静脈内及び筋肉内形が一般的に好ましい。 予防的に又は治療的に使用する本発明のヒト型化抗体のための毎日の非経口及
び経口用量レジメは、一般的に、1 日当たり・体重1kg 当たり約0.005 〜100mg
、好ましくは約0.5 〜10mgの範囲であろう。
【0076】 本発明の抗体はまた、吸入により投与され得る。“吸入”とは、鼻腔内又は経
口吸入投与を意味する。そのような投与のための適切な投与形、たとえばエアゾ
ール製剤又は計量された用量吸入器が、従来の技法により調製され得る。使用さ
れる本発明の化合物の好ましい投与量は一般的に、kg体重当たり約0.1 〜約100m
g 、より好ましくは約10〜100mg の範囲であろう。
口吸入投与を意味する。そのような投与のための適切な投与形、たとえばエアゾ
ール製剤又は計量された用量吸入器が、従来の技法により調製され得る。使用さ
れる本発明の化合物の好ましい投与量は一般的に、kg体重当たり約0.1 〜約100m
g 、より好ましくは約10〜100mg の範囲であろう。
【0077】 本発明の抗体はまた、局所投与され得る。局所投与とは、非全身性投与を意味
する。これは、皮膚又は頬腔への本発明のヒト型化抗体(又はヒト型化抗体フラ
グメント)の外部的投与、及び耳、眼又は鼻中への抗体の注入、並びに抗体が血
流中に実質的に侵入しない場合を包含する。全身性投与とは、経口、静脈内、腹
腔内、皮下及び筋肉内投与を意味する。治療、予防又は診断効果のために必要と
される抗体の量はもちろん、選択される抗体、処理される病状の性質及び重症度
、及び処理を受ける動物により変化し、そして究極的には、医者の考えしだいで
ある。本発明の抗体の適切な局所用量は一般的に、毎日、kg体重当たり約1〜10
0mg の範囲内であろう。
する。これは、皮膚又は頬腔への本発明のヒト型化抗体(又はヒト型化抗体フラ
グメント)の外部的投与、及び耳、眼又は鼻中への抗体の注入、並びに抗体が血
流中に実質的に侵入しない場合を包含する。全身性投与とは、経口、静脈内、腹
腔内、皮下及び筋肉内投与を意味する。治療、予防又は診断効果のために必要と
される抗体の量はもちろん、選択される抗体、処理される病状の性質及び重症度
、及び処理を受ける動物により変化し、そして究極的には、医者の考えしだいで
ある。本発明の抗体の適切な局所用量は一般的に、毎日、kg体重当たり約1〜10
0mg の範囲内であろう。
【0078】製剤: 抗体又はそのフラグメントは単独で投与されることが可能であるが、医薬製剤
として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与に関しては、製剤の0.00
1 〜10重量%(w/w )、たとえば1〜2重量%であるが、但し、それは10%(w/
w )ほどであるが、しかし好ましくは、5%(w/w )を越えず、そしてより好ま
しくは、製剤の0.1 〜1%(w/w )である。
として提供することが好ましい。活性成分は、局所投与に関しては、製剤の0.00
1 〜10重量%(w/w )、たとえば1〜2重量%であるが、但し、それは10%(w/
w )ほどであるが、しかし好ましくは、5%(w/w )を越えず、そしてより好ま
しくは、製剤の0.1 〜1%(w/w )である。
【0079】 本発明の局所製剤は、活性成分、及び1 又は複数の許容できるキャリヤー、並
びに任意には、いずれか他の治療成分を含んで成る。キャリヤーは、製剤中の他
の成分と適合でき、そしてその受容体に有害ではないような態様で、“許容でき
る”べきである。 局所投与のために適切な製剤は、処理が必要とされる部位への皮膚を通しての
侵入のために適切な液体又は半液体調製物、たとえばリニメント、ローション、
軟膏又はペースト、及び眼、耳又は鼻への投与のために適切な点滴剤を包含する
。
びに任意には、いずれか他の治療成分を含んで成る。キャリヤーは、製剤中の他
の成分と適合でき、そしてその受容体に有害ではないような態様で、“許容でき
る”べきである。 局所投与のために適切な製剤は、処理が必要とされる部位への皮膚を通しての
侵入のために適切な液体又は半液体調製物、たとえばリニメント、ローション、
軟膏又はペースト、及び眼、耳又は鼻への投与のために適切な点滴剤を包含する
。
【0080】 本発明の点眼剤は、無菌水性又は油性溶液又は懸濁液を含んで成り、そして殺
菌剤及び/ 又は殺カビ剤、及び/ 又はいずれか他の適切な保存剤の適切な水溶液
に活性成分を溶解することによって調製され得、そして好ましくは、前記溶液は
界面活性剤を含むこともできる。次にその得られる溶液は、透明にされ、そして
濾過により殺菌され、そして無菌技法により容器に移され得る。点眼剤への包含
のために適切な殺菌剤及び殺カビ剤の例は、硝酸又は酢酸フェニル第二水銀(0.
002 %)、塩化ベンズアルコニウム(0.01%)及び酢酸クロルヘキシジン(0.01
%)である。油性溶液の調製のための適切な溶媒は、グリセロール、希釈アルコ
ール及びプロピレングリコールを包含する。
菌剤及び/ 又は殺カビ剤、及び/ 又はいずれか他の適切な保存剤の適切な水溶液
に活性成分を溶解することによって調製され得、そして好ましくは、前記溶液は
界面活性剤を含むこともできる。次にその得られる溶液は、透明にされ、そして
濾過により殺菌され、そして無菌技法により容器に移され得る。点眼剤への包含
のために適切な殺菌剤及び殺カビ剤の例は、硝酸又は酢酸フェニル第二水銀(0.
002 %)、塩化ベンズアルコニウム(0.01%)及び酢酸クロルヘキシジン(0.01
%)である。油性溶液の調製のための適切な溶媒は、グリセロール、希釈アルコ
ール及びプロピレングリコールを包含する。
【0081】 本発明のローションは、皮膚又は眼への適用のために適切なそれらの成分を含
む。眼用ローションは、殺菌剤を任意には含む無菌水溶液を含んで成り、そして
点眼剤の調製のための方法に類似する方法により調製され得る。皮膚への適用の
ためのローション又はリニメントはまた、乾燥を促進し、そして皮膚を冷却する
ための剤、たとえばアルコール又はアセトン、及び/ 又は湿潤剤、たとえばグリ
セロール又はオイル、たとえばひまし油又はアラキス油を含むことができる。
む。眼用ローションは、殺菌剤を任意には含む無菌水溶液を含んで成り、そして
点眼剤の調製のための方法に類似する方法により調製され得る。皮膚への適用の
ためのローション又はリニメントはまた、乾燥を促進し、そして皮膚を冷却する
ための剤、たとえばアルコール又はアセトン、及び/ 又は湿潤剤、たとえばグリ
セロール又はオイル、たとえばひまし油又はアラキス油を含むことができる。
【0082】 本発明のクリーム、軟膏又はペーストは、外部適用のための活性成分の半固体
製剤である。それらは、細かく分割された又は粉末化された形で、活性成分を、
単独で、又は水性又は非水性流体における溶液又は懸濁液において、適切な機械
の助けにより、グリース又は非グリース基材と共に混合することによって製造さ
れ得る。
製剤である。それらは、細かく分割された又は粉末化された形で、活性成分を、
単独で、又は水性又は非水性流体における溶液又は懸濁液において、適切な機械
の助けにより、グリース又は非グリース基材と共に混合することによって製造さ
れ得る。
【0083】 前記基材は、炭化水素、たとえば硬質、軟質又は液体パラフィン、グリセロー
ル、蜜蝋、金属石鹸;粘質;天然起源の油、たとえばアーモンド、コーン、アラ
キス、ヒマシ又はオリーブ油;羊毛脂又はその誘導体、又は脂肪酸、たとえばス
テアリン酸又はオレイン酸、並びにアルコール、たとえばプロピレングリコール
又はマクロゲルを含んで成る。製剤は、いずれかの適切な界面活性剤、たとえば
アニオン、カチオン又は非イオン性界面活性剤、たとえばソルビタンエステル又
はポリオキシエチレン誘導体を組み込むことができる。沈殿防止剤、たとえば天
然ゴム、セルロース誘導体又は無機材料、たとえばシリカ状シリカ、及び他の成
分、たとえばラノリンがまた、包含され得る。
ル、蜜蝋、金属石鹸;粘質;天然起源の油、たとえばアーモンド、コーン、アラ
キス、ヒマシ又はオリーブ油;羊毛脂又はその誘導体、又は脂肪酸、たとえばス
テアリン酸又はオレイン酸、並びにアルコール、たとえばプロピレングリコール
又はマクロゲルを含んで成る。製剤は、いずれかの適切な界面活性剤、たとえば
アニオン、カチオン又は非イオン性界面活性剤、たとえばソルビタンエステル又
はポリオキシエチレン誘導体を組み込むことができる。沈殿防止剤、たとえば天
然ゴム、セルロース誘導体又は無機材料、たとえばシリカ状シリカ、及び他の成
分、たとえばラノリンがまた、包含され得る。
【0084】 本発明のキットは、融解(任意には、続いて希釈を伴う)又は(好ましくは、
緩衝された)液体ビークルにおける懸濁により再構成されるべき、それぞれ、凍
結された又は凍結乾燥されたヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントを包含
する。キットはまた、投与のために適切な製剤を生成するために、ヒト型化抗体
又はヒト型化抗体フラグメントと共に混合するために、緩衝剤及び/ 又は賦形剤
溶液(液体又は凍結形での)(又は、水と共に再構成されるべき緩衝剤及び/ 又
は賦形剤粉末製剤)も含むことができる。
緩衝された)液体ビークルにおける懸濁により再構成されるべき、それぞれ、凍
結された又は凍結乾燥されたヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントを包含
する。キットはまた、投与のために適切な製剤を生成するために、ヒト型化抗体
又はヒト型化抗体フラグメントと共に混合するために、緩衝剤及び/ 又は賦形剤
溶液(液体又は凍結形での)(又は、水と共に再構成されるべき緩衝剤及び/ 又
は賦形剤粉末製剤)も含むことができる。
【0085】 従って、好ましくは、ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントを含むキッ
トは、キットに提供される予定された量の加熱、水、又は溶液の添加が、癌の処
理又は診断へのインビボ又はインビトロ使用のために効果的であるよう十分な濃
度及びpHの製剤をもたらすような濃度で、凍結され、凍結乾燥され、予備希釈さ
れ、又は予備混合される。好ましくは、そのようなキットはまた、癌を処理し、
又は検出するための、ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント組成物を再構
成し又は使用するための説明書の含むことができる。
トは、キットに提供される予定された量の加熱、水、又は溶液の添加が、癌の処
理又は診断へのインビボ又はインビトロ使用のために効果的であるよう十分な濃
度及びpHの製剤をもたらすような濃度で、凍結され、凍結乾燥され、予備希釈さ
れ、又は予備混合される。好ましくは、そのようなキットはまた、癌を処理し、
又は検出するための、ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント組成物を再構
成し又は使用するための説明書の含むことができる。
【0086】 キットはまた、再構成される活性組成物のための複数の成分部分を含むことが
できる。たとえば、第2成分部分(ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント
の他に)は、ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントと共に混合される場合
、それと共に接合されたシステムを形成する、二官能価キレート又は治療剤、た
とえば放射性核種であり得る。上記に示される緩衝剤、賦形剤、及び他の成分部
分は、別々に、又はキットと一緒に販売され得る。
できる。たとえば、第2成分部分(ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント
の他に)は、ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントと共に混合される場合
、それと共に接合されたシステムを形成する、二官能価キレート又は治療剤、た
とえば放射性核種であり得る。上記に示される緩衝剤、賦形剤、及び他の成分部
分は、別々に、又はキットと一緒に販売され得る。
【0087】 本発明のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントの個々の投与量の最適な
量及び間隔は、処理される状態の性質及び程度、投与の形、経路及び部位、及び
処理される特定の動物により決定され、そしてそのような最適性は従来の技法に
より決定され得ることは、当業者により認識されるであろう。処理の最適な経過
、すなわち定義された日数の間、1日当たり本発明の抗体又はそのフラグメント
の用量の回数は、処理決定試験の従来の経過を用いて、当業者により確かめられ
得ることはまた、当業者に理解されるであろう。
量及び間隔は、処理される状態の性質及び程度、投与の形、経路及び部位、及び
処理される特定の動物により決定され、そしてそのような最適性は従来の技法に
より決定され得ることは、当業者により認識されるであろう。処理の最適な経過
、すなわち定義された日数の間、1日当たり本発明の抗体又はそのフラグメント
の用量の回数は、処理決定試験の従来の経過を用いて、当業者により確かめられ
得ることはまた、当業者に理解されるであろう。
【0088】 対象のヒト型化抗体はまた、他の抗癌剤、たとえば他の抗体又は薬物と共に投
与され得る。また、対象のヒト型化抗体又はフラグメントは、治療活性を有する
エフェクター成分に、直接的に又は間接的に結合され得る。適切なエフェクター
成分は、サイトカイン(IL−1, TNF, インターフェロン、コロニー刺激因子、IL
−1、等)、細胞毒素(プソイドモナス内毒素、リシン、アブリン、等)、放射
性核種、たとえば中でも40Y, 131I, 99mTc, 111In, 125I,薬物(メトトレキセー
ト、ダウノルビシン、ドキソルビシン、等)、イムノモジュレータ−、治療用酵
素(たとえば、β−ガラクトシダーゼ)、抗−増殖剤、等を包含する。
与され得る。また、対象のヒト型化抗体又はフラグメントは、治療活性を有する
エフェクター成分に、直接的に又は間接的に結合され得る。適切なエフェクター
成分は、サイトカイン(IL−1, TNF, インターフェロン、コロニー刺激因子、IL
−1、等)、細胞毒素(プソイドモナス内毒素、リシン、アブリン、等)、放射
性核種、たとえば中でも40Y, 131I, 99mTc, 111In, 125I,薬物(メトトレキセー
ト、ダウノルビシン、ドキソルビシン、等)、イムノモジュレータ−、治療用酵
素(たとえば、β−ガラクトシダーゼ)、抗−増殖剤、等を包含する。
【0089】 所望するエフェクターへの抗体の結合はよく知られている。たとえば、アメリ
カ特許第5,435,990 号(Chang など. )を参照のこと。さらに、そのような結合
を促進するための二官能価リンカーは、良く知られており、そして広く入手でき
る。また、放射性核種の結合を提供するキレート化剤(キラント及びキレ−ト化
合物)は、良く知られており、そして広く入手できる。
カ特許第5,435,990 号(Chang など. )を参照のこと。さらに、そのような結合
を促進するための二官能価リンカーは、良く知られており、そして広く入手でき
る。また、放射性核種の結合を提供するキレート化剤(キラント及びキレ−ト化
合物)は、良く知られており、そして広く入手できる。
【0090】 あるいは、対象のヒト型化αCEA 抗体又はフラグメントは、インビボ及びイン
ビトロで、免疫診断剤として使用され得る。特に好ましい使用法は、CEA を発現
する癌細胞病変のインビボイメージングのためである。対象の抗体は、それらが
有意なHAMA又はアレルギー反応を誘発しないので、好ましい。従って、それらは
、患者の疾病状態をモニターするために、反復して使用さえ得る。
ビトロで、免疫診断剤として使用され得る。特に好ましい使用法は、CEA を発現
する癌細胞病変のインビボイメージングのためである。対象の抗体は、それらが
有意なHAMA又はアレルギー反応を誘発しないので、好ましい。従って、それらは
、患者の疾病状態をモニターするために、反復して使用さえ得る。
【0091】 上記で示されたように、対象のヒト型化抗体又はそのフラグメントのもう1つ
の好ましい適用は、Radioimmunoguided SystemR (RiGSR) においてである。この
技法は、手術の前、放射性ラベルされたモノクローナル抗体又はそのフラグメン
トの静脈内投与を包含する。放射能の腫瘍摂取及び血液クリアランスを可能にし
た後、患者は手術室に通され、ここで手術調査が、手で支えられたガンマ活性プ
ローブ、たとえばNeoprobeR 1000の助けによりもたらされる。これは、外科医が
腫瘍転移を同定し、そして切開の複雑化を少なくすることを助ける。
の好ましい適用は、Radioimmunoguided SystemR (RiGSR) においてである。この
技法は、手術の前、放射性ラベルされたモノクローナル抗体又はそのフラグメン
トの静脈内投与を包含する。放射能の腫瘍摂取及び血液クリアランスを可能にし
た後、患者は手術室に通され、ここで手術調査が、手で支えられたガンマ活性プ
ローブ、たとえばNeoprobeR 1000の助けによりもたらされる。これは、外科医が
腫瘍転移を同定し、そして切開の複雑化を少なくすることを助ける。
【0092】 RIGSR は、それが眼での観察及び/ 又は触診により検出できない腫瘍の検出を
可能にするので、好都合である。O'Dwyer など., Arch. Surg., 121: 1331-1394
(1986)を参照のこと。この技法は、Hinkleなど., Antibody, Immunoconjugates
and Radio Pharmaceuticals, 4(3) 339-358 (1991)に詳細に記載されている。こ
の文献は、COL −1モノクローナル抗体を包含するαCEA 抗体と共にこの技法の
使用を開示する。
可能にするので、好都合である。O'Dwyer など., Arch. Surg., 121: 1331-1394
(1986)を参照のこと。この技法は、Hinkleなど., Antibody, Immunoconjugates
and Radio Pharmaceuticals, 4(3) 339-358 (1991)に詳細に記載されている。こ
の文献は、COL −1モノクローナル抗体を包含するαCEA 抗体と共にこの技法の
使用を開示する。
【0093】 この技法は、結腸、乳、膵臓及び卵巣のために特に有用である。従って、この
技法は、結腸、乳及び卵巣癌により発現されるCEA と反応する対象のヒト型化抗
体に適用できるはずである。また、Hinkleなど. ( 前記) は、この技法を記載す
る多くの引例を引用する。対象のヒト型化抗体又はそのフラグメントは、インビ
ボ投与のために適切である放射性核種、たとえばヨウ素放射性核種、たとえば13 1 I及び125Iにより放射性ラベルされ得る。さらに、111In 及び99m Tcがまた適切
である。
技法は、結腸、乳及び卵巣癌により発現されるCEA と反応する対象のヒト型化抗
体に適用できるはずである。また、Hinkleなど. ( 前記) は、この技法を記載す
る多くの引例を引用する。対象のヒト型化抗体又はそのフラグメントは、インビ
ボ投与のために適切である放射性核種、たとえばヨウ素放射性核種、たとえば13 1 I及び125Iにより放射性ラベルされ得る。さらに、111In 及び99m Tcがまた適切
である。
【0094】 対象のヒト型化抗体は、単独で、又は他の抗体と組合して使用され得る。また
、対象のヒト型化抗体は、診断的に効果的な組成物の形で調製され得る。一般的
に、これは、診断的に許容できるキャリヤー及び賦形剤、及び検出を提供するラ
ベルの組み込みを包含する。適切なラベルは、診断用放射性核種、酵素、等を包
含する。腫瘍イメージングのために抗体を使用するための方法は、当業界におい
て良く知られている。
、対象のヒト型化抗体は、診断的に効果的な組成物の形で調製され得る。一般的
に、これは、診断的に許容できるキャリヤー及び賦形剤、及び検出を提供するラ
ベルの組み込みを包含する。適切なラベルは、診断用放射性核種、酵素、等を包
含する。腫瘍イメージングのために抗体を使用するための方法は、当業界におい
て良く知られている。
【0095】 さらなる労力なしに、当業者は、前述の記載を用いて、本発明をその完全な程
度まで使用できると思われる。本発明はさらに、次の例の考慮により明確にされ
、ここでそれらの例は、本発明の純粋な例示であり、そして従って、単なる例で
あり、本発明を限定するものではない。
度まで使用できると思われる。本発明はさらに、次の例の考慮により明確にされ
、ここでそれらの例は、本発明の純粋な例示であり、そして従って、単なる例で
あり、本発明を限定するものではない。
【0096】 実施例材料及び方法 :DNA 鋳型の調製 : すべての組換え作業は、プラスミドM13 ベクターにおけるDNA 配列に基づいて
行われた。初期のヒト型化COL −1 VH を生成するためのNEWMフレームワーク領
域の源は、図13に示されるヌクレオチド配列を有するDNA セグメントを、M13 Ba
mHI 部位とHind III部位との間に担持するM13 構造体であった。初期のヒト型化
COL −1 VLを生成するためのREI フレームワーク領域の源は、図2のREI アミノ
酸配列をコードするDNA セグメントを、M13 BamHIK Hind III 部位との間に担持
するM13 構造体であった。
行われた。初期のヒト型化COL −1 VH を生成するためのNEWMフレームワーク領
域の源は、図13に示されるヌクレオチド配列を有するDNA セグメントを、M13 Ba
mHI 部位とHind III部位との間に担持するM13 構造体であった。初期のヒト型化
COL −1 VLを生成するためのREI フレームワーク領域の源は、図2のREI アミノ
酸配列をコードするDNA セグメントを、M13 BamHIK Hind III 部位との間に担持
するM13 構造体であった。
【0097】 オーバーラップ−延長方法が所定のDNA 配列中に突然変異を導入するために使
用される場合、二本鎖M13 DNA が使用される。対照的に、延長−連結方法が代わ
りに使用される場合、オリゴヌクレオチドが2本のDNA 鎖の1つとのみアニール
するよう企画された。この後者の方法においては、M13 DNA はまず、DNA におけ
るあらゆるチミジン塩基をウリジン塩基により置換するために処理され、ウリジ
ニル化されたDNA が生成された。
用される場合、二本鎖M13 DNA が使用される。対照的に、延長−連結方法が代わ
りに使用される場合、オリゴヌクレオチドが2本のDNA 鎖の1つとのみアニール
するよう企画された。この後者の方法においては、M13 DNA はまず、DNA におけ
るあらゆるチミジン塩基をウリジン塩基により置換するために処理され、ウリジ
ニル化されたDNA が生成された。
【0098】 これは、dUTPアーゼ及びウテシルグリコシラーゼを欠いているコンピテント細
胞、通常RZ1032細胞(但し、Bio −Rad, Hercules, CA から入手できるCJ236 細
胞も適切である)中にM13 プラスミドDNA を、次の成分を組合すことによってト
ランスフェクトすることにより達成された: 1μl のM13 プラスミドDNA ; 4mlのLBブイヨン; 40μl のコンピテントRZ1032細胞。
胞、通常RZ1032細胞(但し、Bio −Rad, Hercules, CA から入手できるCJ236 細
胞も適切である)中にM13 プラスミドDNA を、次の成分を組合すことによってト
ランスフェクトすることにより達成された: 1μl のM13 プラスミドDNA ; 4mlのLBブイヨン; 40μl のコンピテントRZ1032細胞。
【0099】 培養物を37℃で5時間、振盪し、そして得られる一本鎖プラスミドDNA (ssDN
A )を単離し、そして50μl のトリス−EDTA緩衝液に溶解した。次に、DNA を、
下記成分を一緒に混合することによって、ウラシルグリコシラーゼにより処理し
た: 1μl のウリジニル化されたssDNA; 1μl の10×グリコシラーゼ緩衝液; 1U のウラシルグリコシラーゼ(Gibco BRL, Gathersburg, MD); 40μl の25mMのMgCl2 。
A )を単離し、そして50μl のトリス−EDTA緩衝液に溶解した。次に、DNA を、
下記成分を一緒に混合することによって、ウラシルグリコシラーゼにより処理し
た: 1μl のウリジニル化されたssDNA; 1μl の10×グリコシラーゼ緩衝液; 1U のウラシルグリコシラーゼ(Gibco BRL, Gathersburg, MD); 40μl の25mMのMgCl2 。
【0100】 次に、この混合物を、37℃で1時間インキュベートし、そして次に、6.6 μl
の25mMのMgCl2 及び9.9 μl の1M のNaOHを添加した。次に、この混合物を37℃
で5分間インキュベートし、0.6MのHCl 16.5μl を添加し、混合物を中和した。
次にDNA をエタノール沈殿せしめ、そして水に溶解した。
の25mMのMgCl2 及び9.9 μl の1M のNaOHを添加した。次に、この混合物を37℃
で5分間インキュベートし、0.6MのHCl 16.5μl を添加し、混合物を中和した。
次にDNA をエタノール沈殿せしめ、そして水に溶解した。
【0101】M13 オリゴヌクレオチドプライマー : 次のオリゴヌクレオチドプライマーを、下記に例示されるヒト型化COL −1 V
H 及びVLを調製するための方法を通して使用した: 10. 5'-CTAAAACGACGGCCAGT-3',及び 11. 5'-AACAGCTATGACCTAG-3' (両者とも、VHの生成に使用するためのものであ
る) ;及び 385. 5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3',及び 391. 5'-CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGA-3' ( 両者とも、VKの生成に使用するための
ものである) 。 それらのプライマーは、(NEWM又はREI )標的フレームワーク配列、及びM13
のBam HI部位〜Hind III部位セクションの両者の外側にあるプラスミドM13 の領
域に対して相補的である。
H 及びVLを調製するための方法を通して使用した: 10. 5'-CTAAAACGACGGCCAGT-3',及び 11. 5'-AACAGCTATGACCTAG-3' (両者とも、VHの生成に使用するためのものであ
る) ;及び 385. 5'-GCGGGCCTCTTCGCTATTACGC-3',及び 391. 5'-CTCTCTCAGGGCCAGGCGGTGA-3' ( 両者とも、VKの生成に使用するための
ものである) 。 それらのプライマーは、(NEWM又はREI )標的フレームワーク配列、及びM13
のBam HI部位〜Hind III部位セクションの両者の外側にあるプラスミドM13 の領
域に対して相補的である。
【0102】ネズミ可変領域 : 下記に示される例に従って生成された抗体の抗体結合特性を比較するために、
キメラH 鎖(すなわち、ネズミCOL −1 VH領域及びヒトIgG1不変領域を有するH
鎖)、及び/ 又はキメラL 鎖(すなわち、ネズミCOL −1 VL及びヒトκ不変領域
を有するL 鎖)を有する抗体を発現した。それらのキメラ鎖の源は、両鎖を有す
るキメラCOL −1 抗体を発現する、ATCCに寄託された細胞系CRL11217(Budapest
)であった。この抗体のH 鎖を、“MuVH”と命名し、そしてそのL 鎖を“MuVL”
と称した。
キメラH 鎖(すなわち、ネズミCOL −1 VH領域及びヒトIgG1不変領域を有するH
鎖)、及び/ 又はキメラL 鎖(すなわち、ネズミCOL −1 VL及びヒトκ不変領域
を有するL 鎖)を有する抗体を発現した。それらのキメラ鎖の源は、両鎖を有す
るキメラCOL −1 抗体を発現する、ATCCに寄託された細胞系CRL11217(Budapest
)であった。この抗体のH 鎖を、“MuVH”と命名し、そしてそのL 鎖を“MuVL”
と称した。
【0103】オリゴヌクレオチドリン酸化プロトコール : 非オーバーラップ延長に使用される突然変異誘発オリゴヌクレオチドを、下記
方法に従って、リン酸化した。25μl の最終体積において、次の成分を組合した
: 10pモルの個々のオリゴヌクレオチド; 5μl の5×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液;及び 5U のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Gibco BRL )。 リン酸化反応を、酵素の添加により開始し、そして37℃で1時間、進行せしめ
た。
方法に従って、リン酸化した。25μl の最終体積において、次の成分を組合した
: 10pモルの個々のオリゴヌクレオチド; 5μl の5×ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液;及び 5U のT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Gibco BRL )。 リン酸化反応を、酵素の添加により開始し、そして37℃で1時間、進行せしめ
た。
【0104】非オーバーラップ延長−連結のためのアニーリングプロトコール : 非オーバーラップ延長−連結のためのアニーリング段階は、すべての突然変異
−担持のオリゴヌクレオチド及び1つのプライマーオリゴヌクレオチドが、すべ
てのチミジン塩基がウリジン塩基により置換されている一本鎖DNA 鋳型にアニー
リングされる1回のアニーリングの実施を包含した。突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドをまず、上記でオリゴヌクレオチドリン酸化プロトコールに従って、リン
酸化した。
−担持のオリゴヌクレオチド及び1つのプライマーオリゴヌクレオチドが、すべ
てのチミジン塩基がウリジン塩基により置換されている一本鎖DNA 鋳型にアニー
リングされる1回のアニーリングの実施を包含した。突然変異誘発オリゴヌクレ
オチドをまず、上記でオリゴヌクレオチドリン酸化プロトコールに従って、リン
酸化した。
【0105】 20μl の最終体積において、次の成分を組合した: 1p モルの個々の突然変異−担持のリン酸化されたオリゴヌクレオチド; 1pモルのプライマーオリゴヌクレオチド; 4μl の5×アニーリング緩衝液; 0.2pモルのssU −DNA 鋳型。 次に、その混合物を30秒間、90℃に加熱し、次にすばやく、70℃に冷却し、そ
して最終的に、ゆっくりと37℃に冷却した。
して最終的に、ゆっくりと37℃に冷却した。
【0106】非オーバーラップ延長−連結のための延長−連結プロトコール : プライマー及びリン酸化された突然変異オリゴヌクレオチドがssU −DNA 鋳型
にアニーリングされたアニーリング段階の完結の後、延長−連結を次の通りに行
った。30μl の最終体積において、次の成分を組合した: 20μl のアニーリングされたssU −DNA (すなわち、上記アニーリング方法の
内容物); 2μl の5×アニーリング緩衝液; 2μl の0.1Mのジチオトレイトール; 0.3 μl の0.1MのATP ; 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの1μl の6.25mMのdNTP混合物; 2.5UのT7 DNAポリメラーゼ(USB 、現在のAmersham Life Sciences, Clevelan
d, OH ); 0.5UのT4 DNAリガーゼ(Gibco BRL ); 30μl までの水。 次に、この混合物を、室温で1時間インキュベートした。
にアニーリングされたアニーリング段階の完結の後、延長−連結を次の通りに行
った。30μl の最終体積において、次の成分を組合した: 20μl のアニーリングされたssU −DNA (すなわち、上記アニーリング方法の
内容物); 2μl の5×アニーリング緩衝液; 2μl の0.1Mのジチオトレイトール; 0.3 μl の0.1MのATP ; 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの1μl の6.25mMのdNTP混合物; 2.5UのT7 DNAポリメラーゼ(USB 、現在のAmersham Life Sciences, Clevelan
d, OH ); 0.5UのT4 DNAリガーゼ(Gibco BRL ); 30μl までの水。 次に、この混合物を、室温で1時間インキュベートした。
【0107】標準のPCR プロトコール : 次の方法を用いて、交互に、非オーバーラップ延長−連結DNA 配列を増幅し、
そして個々のオーバーラップDNA 配列の延長を行った。50μl の最終体積におい
て、次の成分を組合わせた: 2μl の鋳型DNA (アニーリングされたssU −DNA 又はアニーリングされてい
ないssDNA ); 5μl の10×Vent緩衝液(NEB 、すなわちNew England Biolabs, Beverly, MA
)又は10×Thermalase緩衝液(New Haven, CT のIBI ); 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの2μl の6.25mMのdNTP混合物; 25p モルの1 つのオリゴヌクレオチドプライマー; 25p モルのいずれかの突然変異−担持のオリゴヌクレオチド(オーバーラップ
−延長のための)又は第2オリゴヌクレオチドプライマー; 1U のVent DNAポリメラーゼ(NEB )又はThermalase DNAポリメラーゼ(IBI
)。
そして個々のオーバーラップDNA 配列の延長を行った。50μl の最終体積におい
て、次の成分を組合わせた: 2μl の鋳型DNA (アニーリングされたssU −DNA 又はアニーリングされてい
ないssDNA ); 5μl の10×Vent緩衝液(NEB 、すなわちNew England Biolabs, Beverly, MA
)又は10×Thermalase緩衝液(New Haven, CT のIBI ); 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの2μl の6.25mMのdNTP混合物; 25p モルの1 つのオリゴヌクレオチドプライマー; 25p モルのいずれかの突然変異−担持のオリゴヌクレオチド(オーバーラップ
−延長のための)又は第2オリゴヌクレオチドプライマー; 1U のVent DNAポリメラーゼ(NEB )又はThermalase DNAポリメラーゼ(IBI
)。
【0108】 反応を、DNA ポリメラーゼの添加により開始し、そして次に、次のような条件
での約15回のサイクルにより処理した;(1)94℃で30秒間;(2)50℃で30秒
間;及び(3)75℃(Vent DNAポリメタ−ゼのための)又は72℃(Thermalaseの
いずれかで30〜60秒間。反応を、75℃(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72
℃Ghermalaseのための)いずれかの一定温度で5分で完結せしめた。
での約15回のサイクルにより処理した;(1)94℃で30秒間;(2)50℃で30秒
間;及び(3)75℃(Vent DNAポリメタ−ゼのための)又は72℃(Thermalaseの
いずれかで30〜60秒間。反応を、75℃(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72
℃Ghermalaseのための)いずれかの一定温度で5分で完結せしめた。
【0109】PCR オーバーラップ−延長増幅プロトコール : 1 対のPCR 反応(1つは、2種の(部分的相補性)オーバーラップするDNA セ
グメントの個々のためである)を行った後、2種の得られるセグメントを、次の
PCR 方法に従って連結した。50μl の最終体積において、次の成分を混合した: 1μl の個々のオーバーラップDNA (上記オーバーラップPCR 延長反応からの
); 5μlの10×Vent緩衝液(NEB )又はThermalaseを緩衝液(IBI ); 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの6.25mMのdNTP混合物2μl ; オーバーラップPCR 延長に使用される個々のオリゴヌクレオチドプライマー25
p モル; 1U のVent DNAポリメラーゼ(NEB )又はThermalase DNAポリメラーゼ(IBI
)。
グメントの個々のためである)を行った後、2種の得られるセグメントを、次の
PCR 方法に従って連結した。50μl の最終体積において、次の成分を混合した: 1μl の個々のオーバーラップDNA (上記オーバーラップPCR 延長反応からの
); 5μlの10×Vent緩衝液(NEB )又はThermalaseを緩衝液(IBI ); 等モル量のdATP, dTTP, dGTP, dCTPの6.25mMのdNTP混合物2μl ; オーバーラップPCR 延長に使用される個々のオリゴヌクレオチドプライマー25
p モル; 1U のVent DNAポリメラーゼ(NEB )又はThermalase DNAポリメラーゼ(IBI
)。
【0110】 反応を、DNA ポリメラーゼの添加により開始し、そして次に、次の条件下で約
15サイクルにより処理した:(1)94℃で30秒間;(2)50℃で30秒間;及び(
3)75℃で(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72℃(Thermalaseのための)
での30〜60秒間。反応を、75℃(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72℃(Th
ermalaseのための)のいずれかの一定温度で5分間で完結せしめた。
15サイクルにより処理した:(1)94℃で30秒間;(2)50℃で30秒間;及び(
3)75℃で(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72℃(Thermalaseのための)
での30〜60秒間。反応を、75℃(Vent DNAポリメラーゼのための)又は72℃(Th
ermalaseのための)のいずれかの一定温度で5分間で完結せしめた。
【0111】M13 からのヒト型化COL −1 可変領域DNA 配列のpSV ベクター中への移行、及び 続く抗体発現 : ヒト型化抗体を、次のようにして、NSO 細胞において増殖されたpSV ベクター
において発現した。プラスミドM13 において生成されたヒト型化可変領域構造体
を、M13 プラスミドをエタノール沈殿し(細胞質ゾルDNA として)、そられを水
溶液に再溶解し、そしてそれらを、10U のHind III及びBam HI (両者ともBRL,す
なわちGibco BRL からである) により、37℃で1時間、消化することによって、
トリス−EDTA緩衝液を含む100 μl の最終体積において得た。
において発現した。プラスミドM13 において生成されたヒト型化可変領域構造体
を、M13 プラスミドをエタノール沈殿し(細胞質ゾルDNA として)、そられを水
溶液に再溶解し、そしてそれらを、10U のHind III及びBam HI (両者ともBRL,す
なわちGibco BRL からである) により、37℃で1時間、消化することによって、
トリス−EDTA緩衝液を含む100 μl の最終体積において得た。
【0112】 次に、得られるDNA フラグメントを、低溶融点アガロースゲル上で試験し、ヒ
ト型化構造体DNA を含むバンドを切除し、そしてDNA を、20μl のトリス−EDTA
緩衝液を充填するELUTP “d ”カラムを用いて精製した。10μl の精製されたDN
A 調製物を、1μl のHind III及びBam HI−消化されたpSV 調製物、3μl の5
×リガーゼ緩衝液、及び1U のT4 DNAリガーゼ(BRL )と共に組合し、前記構造
体をpSV プラスミド中に挿入した。
ト型化構造体DNA を含むバンドを切除し、そしてDNA を、20μl のトリス−EDTA
緩衝液を充填するELUTP “d ”カラムを用いて精製した。10μl の精製されたDN
A 調製物を、1μl のHind III及びBam HI−消化されたpSV 調製物、3μl の5
×リガーゼ緩衝液、及び1U のT4 DNAリガーゼ(BRL )と共に組合し、前記構造
体をpSV プラスミド中に挿入した。
【0113】 ヒト型化COL −1 VH構造体を、ヒトIgG1 H鎖不変領域を担持するpSVgptベクタ
ー中に挿入し;使用されるpSVgptベクターは図5に示される“aLYS−30”である
。個々のヒト型化可変領域構造体を、図5に示されるHuVHLYS 又はHuVLLys セグ
メントのいずれかを置換するために、それぞれの不変領域に隣接して挿入した。
ー中に挿入し;使用されるpSVgptベクターは図5に示される“aLYS−30”である
。個々のヒト型化可変領域構造体を、図5に示されるHuVHLYS 又はHuVLLys セグ
メントのいずれかを置換するために、それぞれの不変領域に隣接して挿入した。
【0114】 得られるベクターを次の通りにして、NSO 細胞中にトランスフェクトした。pS
V −挿入方法により生成された、約3μg のVHベクター又は約6μg のVLベクタ
ーを、10U のPvuI(Gibco BRL )による消化により線状化した。次に、消化され
たDNA をエタノール沈殿せしめ、そして50μl の水に再溶解した。NSO 細胞を遠
心分離により集め、そして0.5ml のダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)に再懸
濁し、そして次に、Gene Pulser キュベット(Bio −Rad )に移した。1 つのVH
及び1つのVL構造体からのDNA を細胞と共に、ピペットで取ることによって軽く
混合し、そしてキュベットを氷上に5分間、放置した。
V −挿入方法により生成された、約3μg のVHベクター又は約6μg のVLベクタ
ーを、10U のPvuI(Gibco BRL )による消化により線状化した。次に、消化され
たDNA をエタノール沈殿せしめ、そして50μl の水に再溶解した。NSO 細胞を遠
心分離により集め、そして0.5ml のダルベッコ変性イーグル培地(DMEM)に再懸
濁し、そして次に、Gene Pulser キュベット(Bio −Rad )に移した。1 つのVH
及び1つのVL構造体からのDNA を細胞と共に、ピペットで取ることによって軽く
混合し、そしてキュベットを氷上に5分間、放置した。
【0115】 次に、キュベットを、Bio −Rad Gene Pulser の電極間に挿入し、そして960
μF で170Vの単一のパルスを適用した。次に、キュベットの内容物を、20mlのDM
EMを含むフラスコに移し、そして細胞を37℃で1〜2日間、静置した。細胞を再
び、遠心分離により収穫し、そして36mlの選択DMEMに再懸濁した。この再懸濁液
の1.5ml アリコートを、24−ウェルプレートの個々のウェルに配置し、そして37
℃で4 日間インキュベートし、この時点で、個々のウェル中の培地を、1.5ml の
新鮮な選択DMEMにより交換した。
μF で170Vの単一のパルスを適用した。次に、キュベットの内容物を、20mlのDM
EMを含むフラスコに移し、そして細胞を37℃で1〜2日間、静置した。細胞を再
び、遠心分離により収穫し、そして36mlの選択DMEMに再懸濁した。この再懸濁液
の1.5ml アリコートを、24−ウェルプレートの個々のウェルに配置し、そして37
℃で4 日間インキュベートし、この時点で、個々のウェル中の培地を、1.5ml の
新鮮な選択DMEMにより交換した。
【0116】 37℃でのさらなる6 日間のインキュベーションの後、生存する細胞コロニーが
裸眼で見出され、そして個々のウェルの上清液を抗体生成についてのアッセイし
た。全体の抗体の生成(すなわち、精製なしでの)、及び精製された抗体の生成
を、アッセイした。精製された抗体を得るために、上清液を、プロテインA カラ
ムに通した。
裸眼で見出され、そして個々のウェルの上清液を抗体生成についてのアッセイし
た。全体の抗体の生成(すなわち、精製なしでの)、及び精製された抗体の生成
を、アッセイした。精製された抗体を得るために、上清液を、プロテインA カラ
ムに通した。
【0117】ELISA アッセイプロトコール : 抗体の濃度及び抗体結合特徴を、次の通りに示される酵素−結合免疫吸着アッ
セイ(ELISA )方法を用いて試験した。
セイ(ELISA )方法を用いて試験した。
【0118】IgG 濃度の測定 : トランスフェクトされた細胞から選択されたIgG の濃度を、次の通りに示され
る酵素−結合免疫吸着アッセイ(ELISA )方法を用いて測定した。 ポリ塩化ビニル(PVC )マイクロタイタ−プレート(Dynatech Laboratories,
Chantilly, VA,カタログ#001-010-2101 )を、Milli −QR水により希釈され、そ
して50ml/ ウェルを用いてプレート上に配置されるヤギ抗−ヒトIgG (10mg/ml,
GAHIG, Southern Biotechnology Associates, Ins., Birringham, AL,カタログ
#2010-01)により被覆した。プレートを、周囲濃度で一晩、又は37℃で3時間、
空気乾燥せしめた。
る酵素−結合免疫吸着アッセイ(ELISA )方法を用いて測定した。 ポリ塩化ビニル(PVC )マイクロタイタ−プレート(Dynatech Laboratories,
Chantilly, VA,カタログ#001-010-2101 )を、Milli −QR水により希釈され、そ
して50ml/ ウェルを用いてプレート上に配置されるヤギ抗−ヒトIgG (10mg/ml,
GAHIG, Southern Biotechnology Associates, Ins., Birringham, AL,カタログ
#2010-01)により被覆した。プレートを、周囲濃度で一晩、又は37℃で3時間、
空気乾燥せしめた。
【0119】 使用の前、非特異的結合を、リン酸緩衝溶液(Sigma,カタログ#1000-3 )(PB
S/BSA )における、1%(w/v )のウシ血清アルビミン(Sigma, St. Louis, MO
, カタログ#A7888)0.2ml をウェル当たりに添加することによってブロックした
。すべてのインキュベーションは、保湿された容器において行われた。プレート
を37℃で1〜2時間インキュベートし、そしてブロッキング溶液を、サンプル添
加の前に除去した。500ng/ml(50μl/ウェル)で設定されたサンプル又は標準Ig
G 溶液の一連の2倍希釈溶液を、PBS/BSA 溶液に3等分した。プレートを37℃で
3時間又は4℃で一晩インキュベートした。
S/BSA )における、1%(w/v )のウシ血清アルビミン(Sigma, St. Louis, MO
, カタログ#A7888)0.2ml をウェル当たりに添加することによってブロックした
。すべてのインキュベーションは、保湿された容器において行われた。プレート
を37℃で1〜2時間インキュベートし、そしてブロッキング溶液を、サンプル添
加の前に除去した。500ng/ml(50μl/ウェル)で設定されたサンプル又は標準Ig
G 溶液の一連の2倍希釈溶液を、PBS/BSA 溶液に3等分した。プレートを37℃で
3時間又は4℃で一晩インキュベートした。
【0120】 プレートを、自動プレート洗浄機を用いて、0.025 % Tween-20 (v/v, Sigma)
により3度洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ(Southern Biotechno
logy Associates Inc.)に接合されたヤギ抗−ヒトIgG の1:1000希釈溶液50μl
をウェル当たり添加し、そして37℃で1.5 時間インキュベートした。ウェルを、
自動プレート洗浄機を用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度
洗浄し、そして50μl のOPD 基質緩衝液をウェル当たり添加した。色彩を4分間
、進行せしめ、12.5μl の12.5%H2SO4 により停止し、そして492nm での吸光度
を読み取った。試験サンプルにおけるIgG の濃度を、標準のIgG から構成された
標準曲線と光学密度の平均との比較により推定した。
により3度洗浄した。ホースラディシュペルオキシダーゼ(Southern Biotechno
logy Associates Inc.)に接合されたヤギ抗−ヒトIgG の1:1000希釈溶液50μl
をウェル当たり添加し、そして37℃で1.5 時間インキュベートした。ウェルを、
自動プレート洗浄機を用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度
洗浄し、そして50μl のOPD 基質緩衝液をウェル当たり添加した。色彩を4分間
、進行せしめ、12.5μl の12.5%H2SO4 により停止し、そして492nm での吸光度
を読み取った。試験サンプルにおけるIgG の濃度を、標準のIgG から構成された
標準曲線と光学密度の平均との比較により推定した。
【0121】ヒト型化抗体の相対的親和性の決定 : 抗体結合性質を、ポリ塩化ビニル(PVC )マイクロタイタープレート(Dynate
ch Laboratories, Chantilly, VA, カタログ#001-010-2101 )上に固定された、
部分的に精製されたCEA 抗原を用いて、ELISA により試験した。
ch Laboratories, Chantilly, VA, カタログ#001-010-2101 )上に固定された、
部分的に精製されたCEA 抗原を用いて、ELISA により試験した。
【0122】 PVC プレートを、Milli −Q 水により1:300 に希釈された50μl のCEA (Dow
Chemical, ロット#040191 )によりウェル当たり被覆した。プレートを周囲温度
で一晩、又は37℃で3時間、空気乾燥せしめた。使用の前、非特異的結合を、リ
ン酸緩衝液(Sigma,カタログ#100-3)(PBS/BSA )中、1%(w/v )のウシ血清
アルブミン(Sigma, St. Louis, MO, カタログ#A7888)0.2ml をウェル当たり添
加することによってブロックした。
Chemical, ロット#040191 )によりウェル当たり被覆した。プレートを周囲温度
で一晩、又は37℃で3時間、空気乾燥せしめた。使用の前、非特異的結合を、リ
ン酸緩衝液(Sigma,カタログ#100-3)(PBS/BSA )中、1%(w/v )のウシ血清
アルブミン(Sigma, St. Louis, MO, カタログ#A7888)0.2ml をウェル当たり添
加することによってブロックした。
【0123】 プレートを37℃で1〜2時間インキュベートし、そしてブロック溶液をサンプ
ル添加の前に除去した。すべてのインキュベーションは、保湿された容器におい
て行われた。PBS/BSA 溶液における試験されるサンプルの一連の二倍希釈溶液(
1.0 μg/ml〜10μg/mlの濃度範囲から出発する)を、TAG −被覆されたプレート
3つの部分から成るウェルに添加した(50μl/ウェル)。プレートを4℃で一晩
、又は37℃で1〜2時間インキュベートした。プレートを、自動プレート洗浄機
を用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度、洗浄した。
ル添加の前に除去した。すべてのインキュベーションは、保湿された容器におい
て行われた。PBS/BSA 溶液における試験されるサンプルの一連の二倍希釈溶液(
1.0 μg/ml〜10μg/mlの濃度範囲から出発する)を、TAG −被覆されたプレート
3つの部分から成るウェルに添加した(50μl/ウェル)。プレートを4℃で一晩
、又は37℃で1〜2時間インキュベートした。プレートを、自動プレート洗浄機
を用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度、洗浄した。
【0124】 ホースラディシュペルオキシダーゼ(Southern Biotechnology Associates In
c.)に接合されたヤギ抗−ヒトIgG の1:1000希釈溶液50μl をウェル当たり添加
し、そして37℃で1.5 時間インキュベートした。ウェルを自動プレート洗浄機を
用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度、洗浄し、50μl のOP
D 基質緩衝液ウェル当たり添加した。色彩を4分間、進行せしめ、12.5μl の12
.5%H2SO4 により停止し、そして492nm での吸光度を読み取った。
c.)に接合されたヤギ抗−ヒトIgG の1:1000希釈溶液50μl をウェル当たり添加
し、そして37℃で1.5 時間インキュベートした。ウェルを自動プレート洗浄機を
用いて、0.025 %のTween −20(v/v, Sigma)により3度、洗浄し、50μl のOP
D 基質緩衝液ウェル当たり添加した。色彩を4分間、進行せしめ、12.5μl の12
.5%H2SO4 により停止し、そして492nm での吸光度を読み取った。
【0125】CEA に結合するための親和性定数の決定 : 精製されたHu−COL −1 の2倍希釈溶液を、1.0 μg/ml〜0.003 μg/mlの範囲
にわたって、PBS/BSA により調製し、そしてサンプル(20μl/ウェル)を、上記
のようにして調製され、そしてブロックされたTAG 被覆されたPVC に三重反復し
て適用した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに
続いて、サンプルを、GAHIG −被覆されたトラッププレート上のその対応するウ
ェルに、プレートから移した。
にわたって、PBS/BSA により調製し、そしてサンプル(20μl/ウェル)を、上記
のようにして調製され、そしてブロックされたTAG 被覆されたPVC に三重反復し
て適用した。プレートを4℃で一晩インキュベートした。インキュベーションに
続いて、サンプルを、GAHIG −被覆されたトラッププレート上のその対応するウ
ェルに、プレートから移した。
【0126】 オリジナルTAG プレートを、自動プレート洗浄機を用いて、0.025 %Tween −
20(v/v, Sigma, カタログ#P1379)により3度洗浄した。125I−ラベルされたヤ
ギ抗−ヒトIgG プローブ(ICN Biomedicals, Inc.,カタログ#68088)をPBS/BSA7
5,000cpm/25 μl に希釈し、そしてすべてのウェルに添加した(25μl/ウェル)
。このTAG プレートを37℃で1時間インキュベートした。
20(v/v, Sigma, カタログ#P1379)により3度洗浄した。125I−ラベルされたヤ
ギ抗−ヒトIgG プローブ(ICN Biomedicals, Inc.,カタログ#68088)をPBS/BSA7
5,000cpm/25 μl に希釈し、そしてすべてのウェルに添加した(25μl/ウェル)
。このTAG プレートを37℃で1時間インキュベートした。
【0127】 37℃で1時間のインキュベーションの後、トラッププレートを上記のようにし
て洗浄し、そして125I−ラベルされたGAHIG プローブを添加した。このプレート
を37℃で1時間インキュベートした。次に、プローブを含む両プレート(TAG 及
びGAHIG −トラップ)を、マイクロプレート洗浄機により洗浄し、結合されてい
ないプローブを除去した。プレートカッター(D. Lee, Sunnyvale, CA, Model H
WC-4)を用いて、プレートフレームからウェルを分離した。個々のウェルにおけ
る放射能を、Scatchard (Ann. NY Acad., 51: 600-672 (1946)) の方法に従って
分析した。
て洗浄し、そして125I−ラベルされたGAHIG プローブを添加した。このプレート
を37℃で1時間インキュベートした。次に、プローブを含む両プレート(TAG 及
びGAHIG −トラップ)を、マイクロプレート洗浄機により洗浄し、結合されてい
ないプローブを除去した。プレートカッター(D. Lee, Sunnyvale, CA, Model H
WC-4)を用いて、プレートフレームからウェルを分離した。個々のウェルにおけ
る放射能を、Scatchard (Ann. NY Acad., 51: 600-672 (1946)) の方法に従って
分析した。
【0128】 例1 ネズミCOL −1 からの初期CDR −グラフトされた(ヒト型化)抗体の合成: 本発明者は、この例において、それぞれヒトモノクローナル抗体(“Mab ”)
REI 及びNEWMのV L 及びV H フレームワークを用いてのヒト型化COL −1 モノク
ローナル抗体(COL −1 HuVH/HuVK )の構成を記載する。ネズミCOL −1 のため
のCDR を、前記で論じられたような既知の方法に従って、ヒトフレームワーク上
にグラフトした。特に、ヒトフレームワークは、これまでの研究に基づいて、適
切であることが予測される、すなわち抗原結合に悪影響を与えず、そしてヒトに
おいて有意な免疫原性を示すべきでない抗体から選択された。それぞれ可変H 鎖
及び可変L 鎖のために選択されたヒトフレームワークは、NEWM及びREI であった
。
REI 及びNEWMのV L 及びV H フレームワークを用いてのヒト型化COL −1 モノク
ローナル抗体(COL −1 HuVH/HuVK )の構成を記載する。ネズミCOL −1 のため
のCDR を、前記で論じられたような既知の方法に従って、ヒトフレームワーク上
にグラフトした。特に、ヒトフレームワークは、これまでの研究に基づいて、適
切であることが予測される、すなわち抗原結合に悪影響を与えず、そしてヒトに
おいて有意な免疫原性を示すべきでない抗体から選択された。それぞれ可変H 鎖
及び可変L 鎖のために選択されたヒトフレームワークは、NEWM及びREI であった
。
【0129】 ヒト型化VHの初期バージョンの生成においては、これまでの研究に基づいて、
抗原結合性質の保持を可能にする一定のネズミフレームワーク残基をまた保持し
た。特に、ネズミH 鎖の残基F27, N28, 129, K30, N97 及びT98 が最初に保持さ
れた。 このNEWM−グラフトされた、ヒト型化COL −1 V H の生成を、次の2回の二重
PCR 方法を用いて達成した:標準のPCR プロトコール(オーバーラップ−延長の
ための)、続いてオリゴヌクレオチドプライマー10および11によるPCR 増幅。こ
の方法を、図13に示されるヌクレオチド配列を有するDNA セグメントを、Hind I
IIとBamHI 部位との間に担持する一本鎖M13 DNA 鋳型を用いて、上記のようにし
て行った。
抗原結合性質の保持を可能にする一定のネズミフレームワーク残基をまた保持し
た。特に、ネズミH 鎖の残基F27, N28, 129, K30, N97 及びT98 が最初に保持さ
れた。 このNEWM−グラフトされた、ヒト型化COL −1 V H の生成を、次の2回の二重
PCR 方法を用いて達成した:標準のPCR プロトコール(オーバーラップ−延長の
ための)、続いてオリゴヌクレオチドプライマー10および11によるPCR 増幅。こ
の方法を、図13に示されるヌクレオチド配列を有するDNA セグメントを、Hind I
IIとBamHI 部位との間に担持する一本鎖M13 DNA 鋳型を用いて、上記のようにし
て行った。
【0130】 第1回目(Vent DNAポリメラーゼによる)に使用される突然変異誘発オリゴヌ
クレオチドを企画し、そして次の配列を用いて合成した: 836. 5'-TGAGAATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGT; 及び 837. 5'-TCGGGGCATATTCAGTATCACCATTCTCAGGATC-3' 。 第2回目(Thermalaseによる)のためのそれらの配列は、下記の通りであった
: 838. 5'-ACTATGATTACGACGCGTTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGTCCTTGGTCACCGTC-3
' ;及び 839. 5'-ACGCGTCGTAATCATAGTAGATAGACCCCGTGTATTACAGTAATAGACCGCGGTG-3'。 得られるヒト型化VHを、COL 1NMVH又は“HuVH”と命名した。
クレオチドを企画し、そして次の配列を用いて合成した: 836. 5'-TGAGAATGGTGATACTGAATATGCCCCGAAGT; 及び 837. 5'-TCGGGGCATATTCAGTATCACCATTCTCAGGATC-3' 。 第2回目(Thermalaseによる)のためのそれらの配列は、下記の通りであった
: 838. 5'-ACTATGATTACGACGCGTTGGTTCTTCGATGTCTGGGGCCAAGGGTCCTTGGTCACCGTC-3
' ;及び 839. 5'-ACGCGTCGTAATCATAGTAGATAGACCCCGTGTATTACAGTAATAGACCGCGGTG-3'。 得られるヒト型化VHを、COL 1NMVH又は“HuVH”と命名した。
【0131】 ヒト型化VLの初期バージョンの生成においては、独特のネズミフレームワーク
残基は保持されなかった。REI −グラフトされた、ヒト型化COL −1 V L の生成
を、図17に示されるREIVK 配列を用いて上記方法により生成されたssU −DNA セ
グメントをHind IIIとBam HI部位との間に担持するssMB鋳型(又は第2回目にお
いては、第1 回目に起因する突然変異誘発されたM13 鋳型)を用いて、上記アニ
ーリング及び延長−連結プロトコール、続いて標準のPCR プロトコールによる増
幅を行うことを包含する2回の方法を用いることによって達成した。
残基は保持されなかった。REI −グラフトされた、ヒト型化COL −1 V L の生成
を、図17に示されるREIVK 配列を用いて上記方法により生成されたssU −DNA セ
グメントをHind IIIとBam HI部位との間に担持するssMB鋳型(又は第2回目にお
いては、第1 回目に起因する突然変異誘発されたM13 鋳型)を用いて、上記アニ
ーリング及び延長−連結プロトコール、続いて標準のPCR プロトコールによる増
幅を行うことを包含する2回の方法を用いることによって達成した。
【0132】 第1回目で使用される突然変異誘発オリゴヌクレオチドを企画し、そして次の
配列を用いて合成した: 842. 5'-TATAGCCAGATGCACTGACACTTTTGCTGGCCCTACAGGTGATG-3'; 844. 5'-GCTCTGGGTCATCTGGATGTCGG-3'; 849. 5'-TTCTACTCACGTGTGATTTGCAGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTAGGAAGCTCCCTACTGTG CTGGCAGTAG-3'; 850. 5'-ATGGTGAAGGTGTAGTCGGTACCGC-3'; 及び 851, 5'-GCCTTACCTGGCGTCTGCTGGTACC-3'。
配列を用いて合成した: 842. 5'-TATAGCCAGATGCACTGACACTTTTGCTGGCCCTACAGGTGATG-3'; 844. 5'-GCTCTGGGTCATCTGGATGTCGG-3'; 849. 5'-TTCTACTCACGTGTGATTTGCAGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTAGGAAGCTCCCTACTGTG CTGGCAGTAG-3'; 850. 5'-ATGGTGAAGGTGTAGTCGGTACCGC-3'; 及び 851, 5'-GCCTTACCTGGCGTCTGCTGGTACC-3'。
【0133】 第2回目に使用される突然変異誘発オリゴヌクレオチドは下記配列であった: 841. 5'-GCACACCAGATTGTAGGTTGGATGCAAGG-3'。 得られるヒト型化VLを、“COL 1REVK”又は“HuVK”と命名した。 同時に、第2のヒト型化COL −1 VLを、次の突然変異誘発オリゴヌクレオチド
を用いて、同じ方法により製造した。
を用いて、同じ方法により製造した。
【0134】 第1回目のためには: 842. 5'-TATAGCCAGATGCACTGACACTTTTGCTGGCCCTACAGGTGATG-3'; 844. 5'-GCTCTGGGTCATCTGGATGTCGG-3'; 849. 5'-TTCTACTCACGTGTGATTTGCAGCTTGGTCCCTTGGCCGAACGTAGGAAGCTCCCTACTGTG CTGGCAGTAG-3'; 及び 851, 5'-GCCTTACCTGGCGTCTGCTGGTACC-3'。 第2回目のためには: 841. 5'-GCACACCAGATTGTAGGTTGGATGCAAGG-3'。 得られるVLを、“HuVKF ”と命名した。
【0135】 HuVH及びHuVKの多くのアミノ酸置換されたバージョンをまた、オリゴヌクレオ
チドプライマー10及び11、又はプライマー385 及び391 を用いての上記オーバー
ラップ延長技法、続いてVent DNAポリメラーゼによるRCR 増幅を用いて構成した
。突然変異誘発オリゴヌクレオチド及びDNA 鋳型は、それらの得られるヒト型化
可変領域の名称下で下記に記載される:
チドプライマー10及び11、又はプライマー385 及び391 を用いての上記オーバー
ラップ延長技法、続いてVent DNAポリメラーゼによるRCR 増幅を用いて構成した
。突然変異誘発オリゴヌクレオチド及びDNA 鋳型は、それらの得られるヒト型化
可変領域の名称下で下記に記載される:
【0136】 HuVHT (鋳型として図16に示されるHuVH DNAを用いる) 954. 5'-GACAATGCTGACAGACACCAGCAA-3';及び 955. 5'-TGCTGGTGTCTGTCAGCATTGTCA-3'; HuVHS (鋳型としてHuVH DNAを用いる) 684. 5'-CACCAGCAGCAACCAGTTCAG-3'; 及び 683. 5'-ACTGGTTGCTCGTGGTGTCTA-3'; HuVHSTAY(鋳型としてHuVHs DNA を用いる) 1026. 5'-ACCAGCAGCAACACAGCCTACCTGAGACTCAGCAG-3';及び 1028. 5'-TGCTGAGTCTCAGGTAGGCTGTGTTGCTGCTGGTGT-3';
【0137】 HuVHA (鋳型としてHuVH DNAを用いる) 745. 5'-TGACCTGCACCGCGTCTGGCTTCAAC-3';及び 746. 5'-TTGAAGCCAGACGCGGTGCAGGTCAG-3'; HuVHAA(鋳型としてHuVHA DNA を用いる) 1071. 5'-GAGACTCAGCAGCGTGACAG-3'; 及び 1072. 5'-CGCTGCTGAGTCTCAGGCTGAATGTGTTCTTGCTGGTGTC-3';
【0138】 HuVHAT(鋳型としてHuVHA DNA を用いる) 1071. 5'-CCTGAGACTCAGCAGCGTGACAG-3';及び 1074. 5'-CGCTGCTGAGTCTCAGGCTGGCCTGGTTCTTGCTGGTG; HuVHAY(鋳型としてHuVHA DNA を用いる) 1071. 5'-CCTGAGACTCAGCAGCGTGACAG-3';及び 1073. 5'-CGCTGCTGAGTCTCAGGTAGAACTGGTTCTTGC-3'; HuVHATAY(鋳型としてHuVHA DNA を用いる) 1071. 5'-CCTGAGACTCAGCAGCGTGACAG-3';及び 1075. 5'-CGCTGCTGAGTCTCAGGTAGGCTGTGTTCTTGCTGGTGTC-3';
【0139】 HuVHASTAY (鋳型としてHuVHS DNA を用いる) 745. 5'-TGACCTGCACCGCGTCTGGCTTCAAC-3';及び 746. 5'-TTGAAGCCAGACGCGGTGCAGGTCAG-3';及び HuVKVL(鋳型として図18に示されるHuVK DNAを用いる) 1010. 5'-ACTCCGACATCGTGCTGACCCAGAG-3';及び 1011. 5'-CTCTGGGTCAGCACGATGTCGGAG-3'。
【0140】 上記生成されたM13 DNA 構造体を、pSV ベクターに移行し、次にそれを、上記
方法に従って、NSO 宿主細胞中にトランスフェクトした。VH構造体−及びVL構造
体−含有pSV ベクターを、次の組み合わせでNSO 細胞中にトランスフェクトした
(VH及びVL領域の示される組み合わせを有する抗体を生成するために): MuVH/MuVK; HuVH/HuVK; HuVH/MuVK; MuVH/HuVK; HuVHA/HuVK; HuVHT/HuVK; HuVHT/HuVKF; HuVH/HuVKVL; HuVHS/HuVKVL; HuVHSTAY/HuVK; HuVH/HuVKF; MuVH/HuVKF; 及び HuVHSTAY/HuVKVL 。
方法に従って、NSO 宿主細胞中にトランスフェクトした。VH構造体−及びVL構造
体−含有pSV ベクターを、次の組み合わせでNSO 細胞中にトランスフェクトした
(VH及びVL領域の示される組み合わせを有する抗体を生成するために): MuVH/MuVK; HuVH/HuVK; HuVH/MuVK; MuVH/HuVK; HuVHA/HuVK; HuVHT/HuVK; HuVHT/HuVKF; HuVH/HuVKVL; HuVHS/HuVKVL; HuVHSTAY/HuVK; HuVH/HuVKF; MuVH/HuVKF; 及び HuVHSTAY/HuVKVL 。
【0141】 他のVHと種々のVKとの組み合わせは、結合の程度において予測できない変動を
有するが、類似する態様で挙動することが予測される。最適な組み合わせの最終
選択は、最少のネズミアミノ酸置換を伴って、最良の選択性抗原結合性質を有す
る抗体を獲得する機能であろう。
有するが、類似する態様で挙動することが予測される。最適な組み合わせの最終
選択は、最少のネズミアミノ酸置換を伴って、最良の選択性抗原結合性質を有す
る抗体を獲得する機能であろう。
【0142】 初期のヒト型化(CDR −グラフトされた)COL −1 可変H 鎖(V H )及び可変
L 鎖(V k )領域、HuVH及びHuVKのアミノ酸配列は、それぞれ、図1及び2に示
されている。NSO トランスフェクタントを、完全な抗体発現についてスクリーン
し、そしてそれにより生成される抗体の抗原結合性質を、CEA に対するELISA 試
験により測定した。結果は図4〜9に示される。このデータは、グラフト片−ヒ
ト型化クローン及び混合−及び−適合クローンの中で、MuVH/HuVK はHuVH/MuVK
及びHuVH/HuVK の両者よりも性能的にすぐれているが、しかしキメラMuVH/MuVK
抗体ほどではなかったことを示す。
L 鎖(V k )領域、HuVH及びHuVKのアミノ酸配列は、それぞれ、図1及び2に示
されている。NSO トランスフェクタントを、完全な抗体発現についてスクリーン
し、そしてそれにより生成される抗体の抗原結合性質を、CEA に対するELISA 試
験により測定した。結果は図4〜9に示される。このデータは、グラフト片−ヒ
ト型化クローン及び混合−及び−適合クローンの中で、MuVH/HuVK はHuVH/MuVK
及びHuVH/HuVK の両者よりも性能的にすぐれているが、しかしキメラMuVH/MuVK
抗体ほどではなかったことを示す。
【0143】 それらの結果は、初期の十分にヒト型化抗体(HuVH/HuVK )がCEA 抗原結合親
和性において20倍の低下を示すことを示唆する。従って、それは、ネズミCOL −
1 の約5%の結合親和性を示す。混合−及び−適合抗体(HuVH/HuVK )及び(Mu
VH/HuVK )のCEA 結合の分析に基づけば、CEA 抗原結合の低下がヒト型化H 鎖の
アミノ酸配列に明らかに寄与することが決定された。しかしながら、抗原結合に
おける約2倍の低下がまた、ヒト型化κ鎖のアミノ酸配列に関して明らかに存在
した。これは、図4におけるELISA データから評価され得る。
和性において20倍の低下を示すことを示唆する。従って、それは、ネズミCOL −
1 の約5%の結合親和性を示す。混合−及び−適合抗体(HuVH/HuVK )及び(Mu
VH/HuVK )のCEA 結合の分析に基づけば、CEA 抗原結合の低下がヒト型化H 鎖の
アミノ酸配列に明らかに寄与することが決定された。しかしながら、抗原結合に
おける約2倍の低下がまた、ヒト型化κ鎖のアミノ酸配列に関して明らかに存在
した。これは、図4におけるELISA データから評価され得る。
【0144】 この調査の結果として、VHSTAY−及びVKVL−含有H 及びL 鎖を含んで成る抗原
は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, M
aryland 20852 に1996年10月16日に寄託され、そして受託番号ATCC CRL−12208
(これは、ネズミプラスマ細胞腫細胞系である)が得られた。この寄託は、ブダ
ペスト条約に従って行われた。寄託された細胞系は、本出願の特許証の発行に基
づいて、又は35 U.S. C.§120 下で本出願の優先権のいずれかの特許主張に基づ
いて、制限なしに、変更しないで入手できるであろう。
は、American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, M
aryland 20852 に1996年10月16日に寄託され、そして受託番号ATCC CRL−12208
(これは、ネズミプラスマ細胞腫細胞系である)が得られた。この寄託は、ブダ
ペスト条約に従って行われた。寄託された細胞系は、本出願の特許証の発行に基
づいて、又は35 U.S. C.§120 下で本出願の優先権のいずれかの特許主張に基づ
いて、制限なしに、変更しないで入手できるであろう。
【0145】 前記の記載に基づけば、本明細書に開示されるヒト型化抗体が抗原−結合性質
、すなわち親モノクローナル抗体、nCOL−1 (ネズミ抗体)に比較でき、そして
nCOL−1 に由来するキメラ抗体、たとえばChCOL −1 γ1 (ATCC No. CRL 1121
7 )に比較できるCEA 親和性を示すことが、理解されるであろう。さらに、前記
の結果に基づければ、それらの抗体は、それらを、インビボ診断又は治療として
の使用のために、たとえば改良された血清クリアランス、代謝性質、及びヒトに
おけるほとんど存在しないか又はまったく存在しない免疫原生のために適切にす
るであろう性質を有する。
、すなわち親モノクローナル抗体、nCOL−1 (ネズミ抗体)に比較でき、そして
nCOL−1 に由来するキメラ抗体、たとえばChCOL −1 γ1 (ATCC No. CRL 1121
7 )に比較できるCEA 親和性を示すことが、理解されるであろう。さらに、前記
の結果に基づければ、それらの抗体は、それらを、インビボ診断又は治療として
の使用のために、たとえば改良された血清クリアランス、代謝性質、及びヒトに
おけるほとんど存在しないか又はまったく存在しない免疫原生のために適切にす
るであろう性質を有する。
【0146】 それらの性質は、それらが、有意な悪影響、たとえばHAMA応答又は非特異的細
胞毒性を伴わないで、多量に及び長期間にわたって、対象のヒト型化抗体を反復
して投与することを可能にするであろうから、非常に有意である。これは、それ
らの抗体の長期間にわたっての使用を可能にするので、癌処理及び癌診断のため
に重要である。さらに、対象のヒト抗体のクリアランス性質は、それらの抗体が
所望する標的部位、たとえばCEA を発現する癌を効果的に標的化することを可能
にするであろう(標的化効能に対する血清クリアランスの効果のために)。
胞毒性を伴わないで、多量に及び長期間にわたって、対象のヒト型化抗体を反復
して投与することを可能にするであろうから、非常に有意である。これは、それ
らの抗体の長期間にわたっての使用を可能にするので、癌処理及び癌診断のため
に重要である。さらに、対象のヒト抗体のクリアランス性質は、それらの抗体が
所望する標的部位、たとえばCEA を発現する癌を効果的に標的化することを可能
にするであろう(標的化効能に対する血清クリアランスの効果のために)。
【0147】 従って、本発明のヒト型化抗体は、CEA に対して特異的な、これまでに開示さ
れている抗体よりも実質的な改良点を有する。 本発明の1つの態様は、本明細書の考慮又は本明細書に開示される本発明の実
施から当業者に明らかであろう。本明細書における例は単なる例示として見なさ
れ、本発明の真の範囲及び精神は請求項の範囲により示される。
れている抗体よりも実質的な改良点を有する。 本発明の1つの態様は、本明細書の考慮又は本明細書に開示される本発明の実
施から当業者に明らかであろう。本明細書における例は単なる例示として見なさ
れ、本発明の真の範囲及び精神は請求項の範囲により示される。
【0148】
一般情報: 出願人: 名称:The Dow Chemical Company 発明の名称:高親和性ヒト型化抗−CEAモノクローナル抗体 配列の数:53 コンピューター読取り形: 媒体型:3−1/2″ディスケット コンピューター:IBM PC Compatible 操作システム:MS-DOS ソフトウェア:PacentIn
【0149】 配列番号1についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ネズミCOL-1 VH 位置:1..124 配列:配列番号1:
【0150】
【化1】
【0151】 配列番号2についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:NEWM VH FR鋳型 位置:1..124 配列:配列番号2:
【0152】
【化2】
【0153】 配列番号3についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVH 位置:1..124 配列:配列番号3:
【0154】
【化3】
【0155】 配列番号4についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHA 位置:1..124 配列:配列番号4:
【0156】
【化4】
【0157】 配列番号5についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHAT 位置:1..124 配列:配列番号5:
【0158】
【化5】
【0159】 配列番号6についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHAA 位置:1..124 配列:配列番号6:
【0160】
【化6】
【0161】 配列番号7についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHAY 位置:1..124 配列:配列番号7:
【0162】
【化7】
【0163】 配列番号8についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHATAY 位置:1..124 配列:配列番号8:
【0164】
【化8】
【0165】 配列番号9についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHASTAY 位置:1..124 配列:配列番号9:
【0166】
【化9】
【0167】 配列番号10についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHT 位置:1..124 配列:配列番号10:
【0168】
【化10】
【0169】 配列番号11についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHS 位置:1..124 配列:配列番号11:
【0170】
【化11】
【0171】 配列番号12についての情報: 配列の特徴: 長さ:124 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, HuVHSTAY 位置:1..124 配列:配列番号12:
【0172】
【化12】
【0173】 配列番号13についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ネズミCOL-1 VK 位置:1..110 配列:配列番号13:
【0174】
【化13】
【0175】 配列番号14についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:REI VK FR 鋳型 位置:1..110 配列:配列番号14:
【0176】
【化14】
【0177】 配列番号15についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VK, HuVK 位置:1..110 配列:配列番号15:
【0178】
【化15】
【0179】 配列番号16についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VK, HuVKVL 位置:1..110 配列:配列番号16:
【0180】
【化16】
【0181】 配列番号17についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VK, HuVKH 位置:1..110 配列:配列番号17:
【0182】
【化17】
【0183】 配列番号18についての情報: 配列の特徴: 長さ:125 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, ATCC CRL-12208 VH 位置:1..125 配列:配列番号18:
【0184】
【化18】
【0185】 配列番号19についての情報: 配列の特徴: 長さ:110 型:アミノ酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:ヒト型化COL-1 VH, ATCC CRL-12208 VK 位置:1..110 配列:配列番号19:
【0186】
【化19】
【0187】 配列番号20についての情報: 配列の特徴: 長さ:348 型:DNA 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:HuVHを生成するために使用される鋳型 位置:1..348 配列:配列番号20:
【0188】
【化20】
【0189】 配列番号21についての情報: 配列の特徴: 長さ:372 型:DNA 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:HuVH変異体を生成するために使用される鋳型 位置:1..372 配列:配列番号21:
【0190】
【化21】
【0191】 配列番号22についての情報: 配列の特徴: 長さ:318 型:DNA 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:HuVKを生成するために使用される鋳型 位置:1..318 配列:配列番号22:
【0192】
【化22】
【0193】 配列番号23についての情報: 配列の特徴: 長さ:330 型:DNA 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:HuVK変異体を生成するために使用される鋳型 位置:1..330 配列:配列番号23:
【0194】
【化23】
【0195】 配列番号24についての情報: 配列の特徴: 長さ:17 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド10 位置:1..17 配列:配列番号24: CTAAAACGAC GGCCAGT 17
【0196】 配列番号25についての情報: 配列の特徴: 長さ:16 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド11 位置:1..16 配列:配列番号25: AACAGCTATG ACCATG 16
【0197】 配列番号26についての情報: 配列の特徴: 長さ:22 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド385 位置:1..22 配列:配列番号26: GCGGGCCTCT TCGCTATTAC GC 22
【0198】 配列番号27についての情報: 配列の特徴: 長さ:22 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド391 位置:1..22 配列:配列番号27: CTCTCTCAGG GCCAGGCGGT GA 22
【0199】 配列番号28についての情報: 配列の特徴: 長さ:32 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド836 位置:1..32 配列:配列番号28: TGAGAATGGT GATACTGAAT ATGCCCCGAA GT 32
【0200】 配列番号29についての情報: 配列の特徴: 長さ:34 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド837 位置:1..34 配列:配列番号29: TCGGGGCATA TTCAGTATCA CCATTCTCAG GATC 34
【0201】 配列番号30についての情報: 配列の特徴: 長さ:59 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド838 位置:1..59 配列:配列番号30: ACTATGATTA CGACGCGTTG GTTCTTCGAT GTCTGGGGCC AAGGGTCCTT GGTCACGTC 59
【0202】 配列番号31についての情報: 配列の特徴: 長さ:55 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド839 位置:1..55 配列:配列番号31: ACGCGTCGTA ATCATAGTAG ATAGACCCCG TGTATTACAG TAATAGACCG CGGTG 55
【0203】 配列番号32についての情報: 配列の特徴: 長さ:44 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド842 位置:1..44 配列:配列番号32: TATAGCCAGA TGCACTGACA CTTTTGCTGG CCCTACAGGT GATG 44
【0204】 配列番号33についての情報: 配列の特徴: 長さ:23 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド844 位置:1..23 配列:配列番号33: GCTCTGGGTC ATCTGGATGT CGG 23
【0205】 配列番号34についての情報: 配列の特徴: 長さ:72 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド849 位置:1..72 配列:配列番号34: TTCTACTCAC GTGTGATTTG CAGCTTGGTC CCTTGGCCGA ACGTAGGAAG CTCCCTACTG 60 TGCTGGCAGT AG 72
【0206】 配列番号35についての情報: 配列の特徴: 長さ:25 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド850 位置:1..25 配列:配列番号35: ATGGTGAAGG TGTAGTCGGT ACCGC 25
【0207】 配列番号36についての情報: 配列の特徴: 長さ:25 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド851 位置:1..25 配列:配列番号36: GCCTTACCTG GCGTCTGCTG GTACC 25
【0208】 配列番号37についての情報: 配列の特徴: 長さ:29 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド841 位置:1..29 配列:配列番号37: GCACACCAGA TTGTAGGTTG GATGCAAGG 29
【0209】 配列番号38についての情報: 配列の特徴: 長さ:44 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド842 位置:1..44 配列:配列番号38: TATAGCCAGA TGCACTGACA CTTTTGCTGG CCCTACAGGT GATG 44
【0210】 配列番号39についての情報: 配列の特徴: 長さ:24 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド954 位置:1..24 配列:配列番号39: GACAATGCTG ACAGACACCA GCAA 24
【0211】 配列番号40についての情報: 配列の特徴: 長さ:24 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド955 位置:1..24 配列:配列番号40: TGCTGGTGTC TGTCAGCATT GTCA 24
【0212】 配列番号41についての情報: 配列の特徴: 長さ:21 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド684 位置:1..21 配列:配列番号41: CACCAGCAGC AACCAGTTCA G 21
【0213】 配列番号42についての情報: 配列の特徴: 長さ:21 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド683 位置:1..21 配列:配列番号42: ACTGGTTGCT CGTGGTCTCT A 21
【0214】 配列番号43についての情報: 配列の特徴: 長さ:35 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1026 位置:1..35 配列:配列番号43: ACCAGCAGCA ACACAGCCTA CCTGAGACTC AGCAG 35
【0215】 配列番号44についての情報: 配列の特徴: 長さ:36 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1028 位置:1..36 配列:配列番号44: TGCTGAGTCT CAGGTAGGCT GTGTTGCTGC TGGTGT 36
【0216】 配列番号45についての情報: 配列の特徴: 長さ:26 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド745 位置:1..26 配列:配列番号45: TGACCTGCAC CGCGTCTGGC TTCAAC 26
【0217】 配列番号46についての情報: 配列の特徴: 長さ:26 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド746 位置:1..26 配列:配列番号46: TTGAAGCCAG ACGCGGTGCA GGTCAG 26
【0218】 配列番号47についての情報: 配列の特徴: 長さ:20 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1071 位置:1..20 配列:配列番号47: GAGACTCAGC AGCGTGACAG 20
【0219】 配列番号48についての情報: 配列の特徴: 長さ:40 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1072 位置:1..40 配列:配列番号48: CGCTGCTGAG TCTCAGGCTG AATGTGTTCT TGCTGGTGTC 40
【0220】 配列番号49についての情報: 配列の特徴: 長さ:38 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1074 位置:1..38 配列:配列番号49: CGCTGCTGAG TCTCAGGCTG GCCTGGTTCT TGCTGGTG 38
【0221】 配列番号50についての情報: 配列の特徴: 長さ:33 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1073 位置:1..33 配列:配列番号50: CGCTGCTGAG TCTCAGGTAG AACTGGTTCT TGC 33
【0222】 配列番号51についての情報: 配列の特徴: 長さ:40 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1075 位置:1..40 配列:配列番号51: CGCTGCTGAG TCTCAGGTAG GCTGTGTTCT TGCTGGTGTC 40
【0223】 配列番号52についての情報: 配列の特徴: 長さ:25 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1010 位置:1..25 配列:配列番号52: ACTCCGACAT CGTGCTGACC CAGAG 25
【0224】 配列番号53についての情報: 配列の特徴: 長さ:24 型:DNA 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 特徴: 名称/キー:オリゴヌクレオチド1011 位置:1..24 配列:配列番号53: CTCTGGGTCA GCACGATGTC GGAG 24
【図1】 図1は、ネズミCOL −1 V H (COL1MuVH) 、NEWM FR 鋳型、及びヒト型化NEWM
に基づくV H (COL 1NMVH又は“HuVH”)のアミノ酸配列の−列配列を含む。本
明細書に例示される種々のヒト型化VHにに保持されるネズミFR残基が、下記表に
従って、記号( ↑), (A), (T), (S), (T), (A)及び(Y )により示される。
に基づくV H (COL 1NMVH又は“HuVH”)のアミノ酸配列の−列配列を含む。本
明細書に例示される種々のヒト型化VHにに保持されるネズミFR残基が、下記表に
従って、記号( ↑), (A), (T), (S), (T), (A)及び(Y )により示される。
【表1】 (★:記号(↑)により示される、保持されたネズミ残基は、F-27, N-28, I-29
, K-30, N-97及びT-98である。)HuVHSTAYは、寄託された細胞系ATCC CRL-12208
から発現されたCOL1NMVHのバージョンである。
, K-30, N-97及びT-98である。)HuVHSTAYは、寄託された細胞系ATCC CRL-12208
から発現されたCOL1NMVHのバージョンである。
【図2】 図2は、ネズミCOL −1 V弗(COL 1MuVK又は“HuVK”)、REI FR鋳型、及び ヒト型化REI に基づくV弗(COL 1REVK)のアミノ酸配列の一列配列を含む。CDR
はボックスにより囲まれる。ヒト型化配列に保持されるネズミFR残基は、次の ように記号により示される:HuVKF に関しては(F )及びHuVKVLに関しては (
V )及び(L )。HuVKVLは、寄託された細胞系ATCC CRL−12208 から発現された
COL 1REVKのバージョンである。
はボックスにより囲まれる。ヒト型化配列に保持されるネズミFR残基は、次の ように記号により示される:HuVKF に関しては(F )及びHuVKVLに関しては (
V )及び(L )。HuVKVLは、寄託された細胞系ATCC CRL−12208 から発現された
COL 1REVKのバージョンである。
【図3】 図3は、NSO 骨髄腫細胞において対象のヒト型化抗体を発現するために使用さ
れるIgG 1発現ベクターを示す。
れるIgG 1発現ベクターを示す。
【図4】 図4は、ELISA アッセイにより測定される場合、CEA に対する異なったCOL −
1 抗体の結合を示す。
1 抗体の結合を示す。
【図5】 図5は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体によ
るELISA アッセイの結果を含む。
るELISA アッセイの結果を含む。
【図6】 図6は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体によ
るELISA アッセイの結果を含む。
るELISA アッセイの結果を含む。
【図7】 図7は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体によ
るELISA アッセイの結果を含む。
るELISA アッセイの結果を含む。
【図8】 図8は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体によ
るELISA アッセイの結果を含む。
るELISA アッセイの結果を含む。
【図9】 図9は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体によ
るELISA アッセイの結果を含む。
るELISA アッセイの結果を含む。
【図10】 図10は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体に
よるELISA アッセイの結果を含む。
よるELISA アッセイの結果を含む。
【図11】 図11は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体に
よるELISA アッセイの結果を含む。
よるELISA アッセイの結果を含む。
【図12】 図12は、本発明に従って生成されたそれらの抗体を包含するCOL −1 抗体に
よるELISA アッセイの結果を含む。
よるELISA アッセイの結果を含む。
【図13】 図13は、寄託された細胞系ATCC CRL−12208 により発現された、ヒト型化V 弗のアミノ酸配列を含む。
【図14】 図14は、寄託された細胞系ATCC CRL−12208 により発現された、ヒト型化V 弗のアミノ酸配列を含む。
【図15】 図15は、初期のヒト型化COL −1 H 鎖可変領域HuVHを生成するために使用さ
れるDNA 鋳型のヌクレオチド配列を表す。
れるDNA 鋳型のヌクレオチド配列を表す。
【図16】 図16は、種々のHuVH誘導体を生成するために使用されるDNA 鋳型のヌクレオ
チド配列を表す。
チド配列を表す。
【図17】 図17は、初期のヒト型化COL −1 L 鎖可変領域HuVKを生成するために使用さ
れるDNA 鋳型のヌクレオチド配列を表す。
れるDNA 鋳型のヌクレオチド配列を表す。
【図18】 図18は、HuVKのHuVKVL誘導体を生成するために使用されるDNA 鋳型のヌクレ
オチド配列を表す。
オチド配列を表す。
【手続補正書】
【提出日】平成12年9月22日(2000.9.22)
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 35/00 G01N 33/574 E C07K 16/30 33/577 B 16/46 C12N 15/00 ZNAA G01N 33/574 A61K 37/02 33/577 43/00 49/02 C (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF ,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE, SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY ,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM ,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY, CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID ,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ, LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT ,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL, TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V N,YU,ZW (72)発明者 テンペスト,フィリップ アール. イギリス国,ケンブリッジ シービー1 5エルユー,ウエスト ラッティング,ハ イ ストリート 43 (72)発明者 カー,フランク ジェイ. イギリス国,バルメディー エービー23 8エックスアール,ザ ホールディング ス,バーチリー (72)発明者 ハリス,ウィリアム ジェイ. イギリス国,アンガス ディーディー7 7エービー,カーノウスティー,クイーン ストリート 18 (72)発明者 アームーア,キャスリン イギリス国,ケンブリッジ シービー1 5エルユー,ウエスト ラッティング,ハ イ ストリート 43 Fターム(参考) 4B024 AA01 AA12 BA41 CA07 DA02 EA02 EA04 EA10 GA11 HA13 HA15 4C076 AA95 BB11 CC27 CC41 EE59 4C084 AA02 AA03 AA12 BA01 BA02 BA21 CA53 NA14 ZB262 4C085 AA14 CC05 DD62 HH03 KA04 KB18 KB82 LL18 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA28 EA51 FA72 FA73 FA74
Claims (26)
- 【請求項1】 癌胎児性抗原(CEA )を結合するネズミ抗体に由来すること
を特徴とする、CEA に特異的に結合するヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメ
ント。 - 【請求項2】 前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントの相補的決
定領域(CDR )が前記ネズミ抗体から得られ、前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗
体フラグメントのH 鎖可変領域のフレームワーク領域がNEWMフレームワーク領域
、又は図1又は13のヒト型化COL −1 フレームワーク領域のアミノ酸配列を有し
、そして前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントのライト鎖可変領域の
フレームワーク領域がREI フレームワーク領域、又は図2又は14のヒト型化COL
−1フレームワーク領域のアミノ酸配列を有する請求項1記載のヒト型化抗体又
はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項3】 前記ヒト型化抗体がCOL −1 の抗原結合親和性の少なくとも
10%である、CEA に対する抗原結合親和製を有し、そして前記ヒト型化抗体フラ
グメントが前記ヒト型化抗体の構成部分のアミノ酸配列に同一であるアミノ酸配
列を有する請求項2記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項4】 前記ヒト型化抗体が、COL −1の抗原結合親和性の少なくと
も30%である、CEA に対する抗原結合親和性を有する請求項2記載のヒト結合さ
れた抗体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項5】 前記ネズミ抗体がCOL −1 〜COL −15の1 つである請求項2
〜4のいずれか1項記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項6】 前記ネズミ抗体がCOL −1 である請求項5記載のヒト型化抗
体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項7】 前記ヒト型化抗体がATCC CRL−12208 により発現され、そし
て前記ヒト型化抗体フラグメントがATCC CRL−12208 により発現される抗体の構
造部分のアミノ酸配列に同じであるアミノ酸配列を有する請求項6記載のヒト型
化抗体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項8】 前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントが、図1又
は13のヒト型化可変H 鎖配列又は図2又は14のヒト型化可変L 鎖配列を有し、又
は前記ヒト型化可変H 鎖配列及び前記ヒト型化可変L 鎖配列の両者を有する請求
項1記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメント。 - 【請求項9】 請求項1及び6〜8のいずれか1項記載のヒト型化抗体又は
ヒト型化抗体フラグメントを発現させることができることを特徴とする核酸配列
。 - 【請求項10】 請求項1及び6〜8のいずれか1項記載のヒト型化抗体又
はヒト型化抗体フラグメントを発現させることができることを特徴とするベクタ
ー。 - 【請求項11】 前記ベクターが、裸の核酸セグメント、キャリヤーに会合
した核酸セグメント、核タンパク質、プラスミド、ウィルス、ウイロイド、又は
転移因子である請求項10記載のベクター。 - 【請求項12】 癌の治療、又はインビボもしくはインビトロ検出のために
適切な組成物であって、それぞれ、治療的に有効な又は診断的に有効な量の請求
項1〜8のいずれか1項記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントを含
んでなる組成物。 - 【請求項13】 前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントが、治療
活性を有するエフェクター成分に、直接的に又は間接的に会合又は結合され、そ
して癌の治療のために適切である請求項12記載の組成物。 - 【請求項14】 前記エフェクター成分が放射性核種、治療用酵素、抗癌剤
、サイトカイン、細胞毒素又は抗−増殖剤である請求項13記載の組成物。 - 【請求項15】 前記ヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントが検出で
きるラベルに、直接的に又は間接的に会合され又は結合され、そして癌の検出の
ために適切である請求項12記載の組成物。 - 【請求項16】 前記検出できるラベルが放射性核種又は酵素である請求項
15記載の組成物。 - 【請求項17】 CEA −発現癌を有する哺乳類のインビボ処理のための方法
であって、治療的有効量の請求項12〜14のいずれか1項記載の組成物を、前記哺
乳類に投与することを特徴とする方法。 - 【請求項18】 CEA −発現癌細胞のインビトロ免疫検出の方法であって、
前記癌細胞と、請求項12, 15, 又は16のいずれか1項記載の組成物を接触せしめ
ることを特徴とする方法。 - 【請求項19】 前記組成物中のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメン
トが固体支持体に結合されている請求項18記載の方法。 - 【請求項20】 哺乳類におけるCEA −発現癌細胞の免疫検出の方法であっ
て、診断的に有効な量の請求項12, 15又は16のいずれか1項記載の組成物を、前
記哺乳類に投与することを含んで成る方法。 - 【請求項21】 前記免疫検出がインビボ腫瘍イメージングである請求項20
記載の方法。 - 【請求項22】 (i) 放射性核種−ラベル抗体を静脈内投与することにより
、 (ii) その後、放射性核種活性プローブを用いて腫瘍細胞を検出することによ
り、そして(ii)その後、手術的切除により前記検出された腫瘍細胞を除去する
ことにより癌をインビボ処理するための方法であって、前記抗体が請求項1〜8
のいずれか1項記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントであることを
特徴とする方法。 - 【請求項23】 前記放射性核種が125I又は131Iである請求項22記載の方法
。 - 【請求項24】 活性成分として、請求項12〜16のいずれか1 項記載の組成
物、及び癌を処理し、又は検出するためのその使用のための説明書(ここで、前
記組成物は前記使用の前に再構成される)を含むことによって特徴づけられる商
業用パッケージ。 - 【請求項25】 癌を処理し、又は検出するためへの請求項12〜16のいずれ
か1 項記載の組成物の使用。 - 【請求項26】 癌の処理又は検出のためへの請求項1及び1 〜8のいずれ
か1項記載のヒト型化抗体又はヒト型化抗体フラグメントの使用。
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---|---|---|---|
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JP2014509200A (ja) * | 2011-03-02 | 2014-04-17 | ロシュ グリクアート アーゲー | Cea抗体 |
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