JP2001046079A - Gene cluster relating to polyamine metabolism enzyme originating from plant - Google Patents
Gene cluster relating to polyamine metabolism enzyme originating from plantInfo
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術分野】本発明は植物のポリアミン代
謝において、低温ストレス遭遇時に発現量が変化する植
物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子、該遺伝子のア
ンチセンス遺伝子およびその用途に関する。本発明の植
物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子は、低温時に機
能発現するプロモーターの取得や植物の低温ストレス抵
抗性を増強させるのに有用である。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene whose expression level changes upon encountering low temperature stress in polyamine metabolism of a plant, an antisense gene of the gene, and use thereof. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention is useful for obtaining a promoter that functionally expresses at low temperatures and for enhancing the low-temperature stress resistance of plants.
【０００２】[0002]
【従来の技術】植物はそれぞれの生息地の温度に適応し
て、その地域の温度を最適温度域として生活している。
しかし、植物は生育適温の上限または下限を越えるよう
な環境に遭遇すると高温ストレスや低温ストレスを受
け、徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて
障害を引き起こす。これまで、種々の温度環境に適応し
た野生の植物を食料作物や工芸作物などに利用するため
に、選抜や交雑育種など育種的手段によって作物の温度
適応性の拡大に努めてきた。また、野菜や花卉、果樹等
の園芸作物においては育種的手段に加えて、施設園芸で
栽培可能な期間の拡大を図ってきた。しかし、特に日本
は南北に長く、地域によっては気候が著しく異なるとと
もに、四季の変化が著しいので地域や季節によっては作
物は生育に不適な温度環境にさらされる危険性が大き
い。2. Description of the Related Art Plants adapt to the temperature of their habitats and live in the optimal temperature range of the area.
However, when a plant encounters an environment that exceeds the upper or lower limit of the optimum temperature for growth, it is subjected to high-temperature stress or low-temperature stress, and the physiological function of cells is gradually or rapidly impaired, causing damage. Until now, in order to use wild plants adapted to various temperature environments for food crops and industrial crops, efforts have been made to expand the temperature adaptability of crops by breeding means such as selection and cross breeding. For horticultural crops such as vegetables, flowers, and fruit trees, in addition to breeding means, the cultivation period in facility horticulture has been extended. However, Japan is particularly long in the north and south, and the climate is significantly different in some regions, and the seasons are remarkably changed. Therefore, depending on the region and season, there is a great risk that the crops will be exposed to an unsuitable temperature environment for growth.
【０００３】例えば、熱帯を起源とするイネは、明治以
来の品種改良によって東北地方や北海道などの冷涼地で
も栽培できるようになり、現在ではこれらの地域の基幹
作物として栽培されているが、これらの地域では初夏に
異常低温があると冷害を受け、著しい減収になることが
現在でも問題になっている。近年、地球温暖化やエルニ
ーニョ現象が原因と考えられる異常気象によって作物が
重大な被害を受け、１９９３年のひどい冷害による米不
足は記憶に新しい。また、野菜類についてみると、トマ
ト、キュウリ、メロン、スイカなど果菜類の中には熱帯
起源の作物が多い。これらの作物は需要が大きく農業経
営上も重要性の大きい作物で早くから施設栽培に取り入
れられてきた。しかし、昭和４９年のオイルショック以
来、施設園芸における省資源や暖房コストの低減が問題
となっている。施設園芸における省資源については温室
の構造的なものから栽培技術まで各方面から検討されて
いるが、最も基本的なことは作物の低温ストレス抵抗性
を高めることである。低温ストレス抵抗性を高めるため
に交雑育種、最近の遺伝子工学技術を利用した育種、植
物ホルモンや植物調節剤の作用を利用した方法等が行わ
れている。For example, rice originating in the tropics can be cultivated even in cool regions such as the Tohoku region and Hokkaido due to breeding improvements since the Meiji era, and is now cultivated as a key crop in these regions. It is still a problem that the region suffers from cold damage due to abnormally low temperatures in early summer, resulting in a significant decrease in revenue. In recent years, crops have been severely damaged by extreme weather, which is thought to be caused by global warming and the El Nino phenomenon. As for vegetables, many fruits and vegetables such as tomatoes, cucumbers, melons and watermelons are crops of tropical origin. These crops are in great demand and are important in agricultural management, and have been incorporated into facility cultivation from an early stage. However, since the oil crisis of 1974, there has been a problem of saving resources and reducing heating costs in greenhouse horticulture. Resource conservation in greenhouse horticulture has been studied from various aspects, from the structure of greenhouses to cultivation techniques, but the most fundamental thing is to increase the resistance of crops to low-temperature stress. Cross breeding, breeding using recent genetic engineering techniques, methods utilizing the effects of plant hormones and plant regulators, etc. have been carried out to increase resistance to low temperature stress.
【０００４】遺伝子工学技術を利用し、低温ストレス抵
抗性を増強するためには低温ストレス抵抗性に関与する
遺伝子を単離することが重要な課題である。低温ストレ
ス抵抗性に関与する遺伝子として、これまで幾つかが単
離されている。生体膜脂質の脂肪酸の不飽和化酵素遺伝
子（ω−３デサチュラーゼ遺伝子、グリセロール−３−
リン酸アシルトランスフェラーゼ遺伝子、ステアロイル
−ＡＣＰ−不飽和化酵素遺伝子）や光合成に関与するピ
ルビン酸リン酸ジキナーゼ遺伝子、凍結保護・防止活性
を持つタンパク質をコードする遺伝子（ＣＯＲ１５、Ｃ
ＯＲ８５、ｋｉｎ１）等が単離されている。[0004] In order to enhance low-temperature stress resistance by using genetic engineering technology, it is important to isolate genes involved in low-temperature stress resistance. Some of the genes involved in cold stress resistance have been isolated so far. Fatty acid desaturase gene of biological membrane lipid (ω-3 desaturase gene, glycerol-3-
Phosphate acyltransferase gene, stearoyl-ACP-desaturase gene), pyruvate phosphate dikinase gene involved in photosynthesis, and genes encoding proteins having cryoprotection / prevention activity (COR15, C15)
OR85, kin1) and the like have been isolated.
【０００５】ポリアミンとは第１級アミノ基を２つ以上
もつ脂肪族炭化水素の総称で生体内に普遍的に存在する
天然物であり、２０種類以上のポリアミンが見出されて
いる。代表的なポリアミンとしてはプトレシン、スペル
ミジン、スペルミンがある。ポリアミンの主な生理作用
としては、核酸との相互作用による核酸の安定化と構
造変化、種々の核酸合成系への促進作用、タンパク
質合成系の活性化、細胞膜の安定化や物質の膜透過性
の強化などが知られている。植物におけるポリアミンの
役割としては細胞増殖や***時に核酸、タンパク質生合
成の促進効果や細胞保護が報告されており、環境ストレ
スに対しては塩ストレス、酸ストレス（Plant cell phy
siol., 38(10), 156-1166, 1997）との関わりが主に報
告されている。[0005] Polyamine is a general term for aliphatic hydrocarbons having two or more primary amino groups and is a natural product which is universally present in the living body, and more than 20 kinds of polyamines have been found. Representative polyamines include putrescine, spermidine, and spermine. The main physiological functions of polyamines are stabilization and structural change of nucleic acids due to interaction with nucleic acids, promotion of various nucleic acid synthesis systems, activation of protein synthesis systems, stabilization of cell membranes and membrane permeability of substances. Are known. It has been reported that the role of polyamines in plants is to promote the biosynthesis of nucleic acids and proteins during cell growth and division and to protect cells.
siol., 38 (10), 156-1166, 1997).
【０００６】植物のポリアミン生合成に関わるポリアミ
ン代謝関連酵素としてはアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤ
Ｃ）、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）、Ｓ−アデノシ
ルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）、スペルミジン
合成酵素（ＳＰＤＳ）、スペルミン合成酵素（ＳＰＭ
Ｓ）等が知られている。これらのポリアミン代謝関連酵
素をコードする遺伝子については植物から既に幾つかが
単離されている。ＡＤＣ遺伝子はエンバク（Mol. Gen.
Genet., 224, 431-436, 1990）、トマト（Plant Physio
l., 103, 829-834, 1993）、シロイヌナズナ（plant ph
ysiol., 111, 1077-1083, 1996）、エンドウ（Plant Mo
l. Biol., 28, 997-1009, 1995）、ＯＤＣ遺伝子はチョ
ウセンアサガオ（Datura）（Biocem. J., 314, 241-24
8, 1996）、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ（Plant Mo
l. Biol., 26, 327-338, 1994）、ホウレンソウ（Plant
Physiol., 107, 1461-1462, 1995）、タバコ、ＳＰＤ
Ｓ遺伝子はシロイヌナズナ（Plant cell Physiol., 39
(1), 73-79, 1998）等から単離されている。しかしなが
ら、これらの植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子
と低温ストレス遭遇時の発現量の変化や低温ストレス抵
抗性との関係については全く報告されていない。[0006] Arginine decarboxylase (AD) is a polyamine metabolism-related enzyme involved in polyamine biosynthesis in plants.
C), ornithine decarboxylase (ODC), S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC), spermidine synthase (SPDS), spermine synthase (SPM)
S) and the like are known. Some of the genes encoding these polyamine metabolism-related enzymes have already been isolated from plants. The ADC gene is oat (Mol. Gen.
Genet., 224, 431-436, 1990), tomato (Plant Physio)
l., 103, 829-834, 1993), Arabidopsis (plant ph
ysiol., 111, 1077-1083, 1996), peas (Plant Mo
l. Biol., 28, 997-1009, 1995) and the ODC gene is Datura (Biocem. J., 314, 241-24).
8, 1996), and the SAMDC gene is potato (Plant Mo
l. Biol., 26, 327-338, 1994), spinach (Plant
Physiol., 107, 1461-1462, 1995), tobacco, SPD
The S gene is derived from Arabidopsis thaliana (Plant cell Physiol., 39).
(1), 73-79, 1998). However, there is no report on the relationship between the polyamine metabolism-related enzyme gene derived from these plants and the change in expression level upon encountering low-temperature stress or low-temperature stress resistance.
【０００７】ポリアミンやその生合成に関わるポリアミ
ン代謝関連酵素と低温ストレスに関する報告はイネ植物
でのみ報告がある。例えば、Ｌｅｅら（Plant Science,
122, 111-117, 1997）は分離根培養において低温処理
期間中のポリアミン濃度とポリアミン代謝関連酵素活性
の変化を調べ、５℃の低温処理３日目にプトレシン濃度
が増加し、ＯＤＣやＳＡＭＤＣ活性は低下したがＡＤＣ
活性は増加したと報告している。また、Ｌｅｅら（Plan
t Science, 126, 1-10, 1997）はイネ幼植物の根と地上
部での低温処理期間中のポリアミン濃度とポリアミン代
謝関連酵素の変化を調べ、低温抵抗性品種の地上部では
ＡＤＣとＳＡＭＤＣ活性が増加し、根ではＡＤＣ活性が
増加したと報告している。いずれの報告においても低温
処理期間中でのポリアミン代謝関連酵素の活性レベルを
調べたものであり、ポリアミン代謝関連酵素をコードす
るポリアミン代謝関連酵素遺伝子の単離や低温ストレス
遭遇時の発現量の変化については報告されていない。[0007] There are reports on polyamines, polyamine metabolism-related enzymes involved in biosynthesis thereof, and low temperature stress only in rice plants. For example, Lee et al. (Plant Science,
122, 111-117, 1997) examined the changes in polyamine concentration and polyamine metabolism-related enzyme activity during the low-temperature treatment in isolated root cultures. On the third day of the low-temperature treatment at 5 ° C, putrescine concentration increased, and ODC and SAMDC activities increased. Decreased but ADC
Activity is reported to have increased. Also, Lee et al. (Plan
t Science, 126, 1-10, 1997) examined the changes in polyamine concentrations and polyamine metabolism-related enzymes during the low-temperature treatment of rice seedling roots and aerial parts, and examined ADC and SAMDC in the aerial parts of low-temperature resistant varieties. Activity is reported to be increased and ADC activity is increased in roots. Both reports examined the activity level of polyamine metabolism-related enzymes during the low-temperature treatment period, and isolated the polyamine metabolism-related enzyme genes encoding the polyamine metabolism-related enzymes and the changes in the expression level when encountering low-temperature stress Has not been reported.
【０００８】また、田島ら（Japan Jour. Crop Sci., 5
0(3), 411-412, 1981）はイネの幼植物における低温ス
トレス障害と生存率に及ぼすポリアミン（スペルミジ
ン、スペルミン）の効果を調べているが、ポリアミン生
合成に関わるポリアミン代謝関連酵素遺伝子については
報告していない。Also, Tajima et al. (Japan Jour. Crop Sci., 5
0 (3), 411-412, 1981) investigated the effects of polyamines (spermidine and spermine) on cold stress damage and survival in rice seedlings. Did not report.
【０００９】すなわち、これらの報告によると、低温ス
トレスによって特異的に発現誘導されるポリアミン代謝
関連酵素遺伝子の確認には至っておらず、該遺伝子の低
温ストレス抵抗性との関連や該遺伝子の植物からの単
離、同定は行っていない。That is, according to these reports, a polyamine metabolism-related enzyme gene specifically induced to be induced by low-temperature stress has not yet been identified. Has not been isolated or identified.
【００１０】[0010]
【発明が解決しようとする課題】低温ストレス抵抗性の
高い（低温耐性）品種と低い（低温感受性）品種での生
化学的解析を行い低温ストレス抵抗性に密接に関与する
メカニズムを明らかにする。そして、そのメカニズムに
対して重要な役割をしている遺伝子を取得する。そして
取得した遺伝子を実際に植物に応用し、実用レベルでの
効果を確認することである。これまでポリアミン代謝関
連酵素遺伝子は種々の植物から単離されているが、ポリ
アミン代謝関連酵素遺伝子と低温ストレス抵抗性との関
わりに関する研究は少なく、低温ストレス遭遇時に発現
量が変化するポリアミン代謝関連酵素遺伝子は見つかっ
ていない。したがって、低温ストレス抵抗性に深く関与
するポリアミン代謝関連酵素遺伝子を提供し、該遺伝子
を利用して低温ストレス抵抗性を増強した植物を作出す
ることは重要な課題である。SUMMARY OF THE INVENTION Biochemical analysis is performed on varieties with high (low-temperature tolerance) and low (low-temperature sensitivity) varieties having low temperature stress resistance to clarify the mechanism closely involved in low-temperature stress resistance. Then, genes that play an important role in the mechanism are obtained. Then, the obtained gene is actually applied to plants, and the effect at a practical level is confirmed. Until now, polyamine metabolism-related enzyme genes have been isolated from various plants, but few studies have examined the relationship between polyamine metabolism-related enzyme genes and low-temperature stress resistance. No gene has been found. Therefore, it is an important issue to provide a polyamine metabolism-related enzyme gene that is deeply involved in low-temperature stress resistance, and to produce a plant with enhanced low-temperature stress resistance using the gene.
【００１１】[0011]
【課題を解決するための手段】上記のような状況下にお
いて、本発明者らは植物の低温ストレス抵抗性を向上さ
せるために、植物のポリアミン代謝における低温ストレ
ス遭遇時の分子生物学研究について鋭意検討を行った。
その結果、この問題は低温ストレス遭遇時に特異的に発
現量が変化するポリアミン生合成に関わるポリアミン代
謝関連酵素遺伝子を単離することによって解決されるこ
とを見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本
発明者らは、低温ストレス抵抗性とポリアミンが密接に
関わっていることを見出したものであり、低温ストレス
抵抗性を示す植物組織では、低温ストレス遭遇時にポリ
アミン濃度が特異的に増加し、同時に低温ストレスで特
異的に発現誘導されるポリアミン代謝関連酵素遺伝子を
見出した。Under the circumstances described above, the present inventors have eagerly studied molecular biology at the time of encountering low temperature stress in polyamine metabolism in plants in order to improve the low temperature stress resistance of plants. Study was carried out.
As a result, they have found that this problem can be solved by isolating a polyamine metabolism-related enzyme gene involved in polyamine biosynthesis whose expression level changes specifically when encountering low-temperature stress, and completed the present invention. That is, the present inventors have found that low-temperature stress resistance and polyamine are closely related, and in plant tissues exhibiting low-temperature stress resistance, polyamine concentration specifically increases when low-temperature stress is encountered. At the same time, a polyamine metabolism-related enzyme gene specifically induced by cold stress was found.
【００１２】ポリアミンは分子中にアミン（−ＮＨ−）
を多く含む塩基性物質であり、代表的なポリアミンとし
ては二分子のアミンを含むプトレシン、３分子のアミン
を含むスペルミジン、４分子のアミンを含むスペルミン
等がある。植物において、これらのポリアミン生合成に
関わるポリアミン代謝関連酵素としてはプトレシンにつ
いてはＡＤＣ、ＯＤＣ、スペルミジンについてはＳＡＭ
ＤＣ、ＳＰＤＳ、スペルミンについてはＳＡＭＤＣ、Ｓ
ＰＭＳ等が見つかっている。これらのポリアミン代謝関
連酵素をコードしているポリアミン代謝関連酵素遺伝子
についても既に幾つかの植物で単離されている。しかし
ながら、低温ストレス抵抗性を示す植物組織で低温スト
レス遭遇時に発現誘導を受け、その発現量が増加する植
物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子は見つかってい
ない。Polyamine has an amine (-NH-) in the molecule.
A typical polyamine is putrescine containing two molecules of amine, spermidine containing three molecules of amine, spermine containing four molecules of amine, and the like. In plants, these polyamine metabolism-related enzymes involved in polyamine biosynthesis are ADC, ODC for putrescine, and SAM for spermidine.
SAMDC, S for DC, SPDS, spermine
PMS etc. have been found. Polyamine metabolism-related enzyme genes encoding these polyamine metabolism-related enzymes have already been isolated from some plants. However, no plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene has been found to be induced to be expressed in a plant tissue exhibiting resistance to low-temperature stress when it encounters low-temperature stress, and the expression level thereof increases.
【００１３】このような状況下に、本発明者らは植物の
低温ストレス抵抗性を増強するために鋭意、検討した結
果、低温ストレス抵抗性を示す植物組織では低温ストレ
ス遭遇時に特にポリアミンであるスペルミジンやスペル
ミン含量が増大することを見いだし、実際に低温ストレ
ス抵抗性を示す植物組織からスペルミジンやスペルミン
生合成に関わるポリアミン代謝関連遺伝子（ＳＰＤＳ、
ＳＡＭＤＣ、ＡＤＣ）を単離、同定し、さらにそのうち
３種のポリアミン代謝関連遺伝子が低温ストレス遭遇時
に発現誘導され、その発現量が増加することを見出し、
該遺伝子が低温ストレス抵抗性に深く関与していること
を明らかにし、本発明を完成させるに至った。Under these circumstances, the present inventors have conducted intensive studies to enhance the resistance of plants to low-temperature stress, and as a result, in plant tissues exhibiting low-temperature stress resistance, spermidine, which is a polyamine, especially when a low-temperature stress is encountered. And polyamine metabolism-related genes involved in spermidine and spermine biosynthesis (SPDS,
SAMDC, ADC) were isolated and identified, and among them, three types of polyamine metabolism-related genes were found to be induced when cold stress was encountered, and their expression levels were increased.
The inventors have clarified that the gene is deeply involved in cold stress resistance, and have completed the present invention.
【００１４】すなわち、本発明は低温ストレス遭遇時
に、その発現量が変化しう得る植物由来のポリアミン代
謝関連酵素遺伝子である。また、本発明は上記遺伝子か
ら誘導される種々の遺伝子、例えば上記遺伝子とハイブ
リダイズし得る遺伝子、該遺伝子のアンチセンス遺伝
子、上記遺伝子を含む組換えベクター、これらの組換え
ベクターを用いた形質転換により得られた形質転換体で
ある。[0014] That is, the present invention is a plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene whose expression level may change when encountering low-temperature stress. Further, the present invention provides various genes derived from the above genes, for example, a gene capable of hybridizing with the above gene, an antisense gene of the gene, a recombinant vector containing the above gene, and transformation using these recombinant vectors. Is a transformant obtained by the above method.
【００１５】[0015]
【発明の実施の形態】本発明における「ポリアミン代謝
関連酵素遺伝子」とは、植物におけるポリアミン代謝の
生合成に関与するポリアミン代謝関連酵素のアミノ酸を
コードする遺伝子であり、低温ストレス遭遇時に発現量
が変化する遺伝子である。例えばポリアミン代謝の生合
成に関与するスペルミジン合成酵素のアミノ酸をコード
し、低温ストレス遭遇時に発現量が変化する遺伝子を指
す。ここで「低温ストレス」とは植物の生育適温の下限
を越えるような環境に植物が遭遇することによって植物
が受けるストレスであり、低温ストレスを受けた植物は
徐々にあるいは急激に細胞の生理機能が損なわれて障害
が引き起こされる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The term "polyamine metabolism-related enzyme gene" in the present invention is a gene encoding an amino acid of a polyamine metabolism-related enzyme involved in the biosynthesis of polyamine metabolism in plants, and its expression level is reduced when a low-temperature stress is encountered. It is a gene that changes. For example, it refers to a gene that encodes an amino acid of spermidine synthase that is involved in biosynthesis of polyamine metabolism and whose expression level changes when a low-temperature stress is encountered. Here, the term "cold stress" refers to the stress that a plant experiences when the plant encounters an environment that exceeds the lower limit of the optimum temperature for plant growth. Impaired, causing failure.
【００１６】本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵
素遺伝子としては、例えば、配列番号２、４、６または
８記載のアミノ酸をコードする遺伝子などが挙げられ
る。該ポリアミン代謝関連遺伝子としては、例えば配列
番号１、３、５または７記載の塩基配列を含有する。Examples of the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention include a gene encoding the amino acid of SEQ ID NO: 2, 4, 6, or 8. The polyamine metabolism-related gene includes, for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7.
【００１７】本発明における「部分的に置換もしくは削
除するか、または他の遺伝子を挿入もしくは付加した遺
伝子」とは、一般的に生理活性を有するタンパク質のア
ミノ酸配列において１個もしくは複数のアミノ酸が置
換、削除、挿入または付加された場合であっても、その
生理活性が維持される場合があることは当業者において
広く認識されている。本発明にはこのような修飾が加え
られ、かつポリアミン代謝関連酵素をコードする遺伝子
も本発明の範囲に含まれる。このような改変されたＤＮ
Ａは例えば、部位特異的変異法（Nucleic Acid Researc
h, Vol.10, No. 20, 6487-6500, 1982）等によって、特
定の部位のアミノ酸が置換、削除、挿入、付加されるよ
うに本発明のＤＮＡの塩基配列を改変することによって
得られる。In the present invention, "a gene partially substituted or deleted or another gene inserted or added" generally means that one or more amino acids are substituted in the amino acid sequence of a protein having a physiological activity. It is widely recognized by those skilled in the art that the biological activity may be maintained even when the deletion, insertion, or addition is performed. In the present invention, a gene having such a modification and encoding a polyamine metabolism-related enzyme is also included in the scope of the present invention. Such a modified DN
A is, for example, a site-directed mutagenesis method (Nucleic Acid Researc
h, Vol. 10, No. 20, 6487-6500, 1982), etc., by modifying the nucleotide sequence of the DNA of the present invention such that amino acids at specific sites are substituted, deleted, inserted, or added. .
【００１８】本発明において「アンチセンス遺伝子」と
は、低温ストレス遭遇時に発現量が変化する植物由来の
ポリアミン代謝関連遺伝子の塩基配列に相補的な配列を
有する遺伝子を意味する。アンチセンスＤＮＡは、例え
ば、配列番号１、３、５または７の塩基配列に相補的な
ものであり、アンチセンスＲＮＡはそれらから産生され
るものである。In the present invention, the term "antisense gene" means a gene having a sequence complementary to the base sequence of a polyamine metabolism-related gene derived from a plant whose expression level changes upon encountering low-temperature stress. The antisense DNA is, for example, one complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1, 3, 5, or 7, and the antisense RNA is produced therefrom.
【００１９】本発明における「ストリンジェントな条件
下でハイブリダイズし得る遺伝子」は、例えば、配列番
号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェン
トな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択すること
によっても、改変されたＤＮＡを得ることができる。こ
こで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的
なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが
形成されない条件を指す。この条件を明確に数値化する
ことは困難であるが、一例を示すと、本発明の植物由来
のポリアミン代謝関連遺伝子と４２℃で、かつ塩濃度、
６×ＳＳＣ（０．９Ｍ ＮａＣｌ，０．０９Ｍクエン酸
三ナトリウム）または６×ＳＳＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ，
０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4，２０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎ
ａ；ｐＨ７．４）であるハイブリダイゼーション条件下
にハイブリッドを形成し、さらに４２℃で、かつ塩濃
度、０．５×ＳＳＣである洗浄条件下でもハイブリッド
を形成する条件である。The "gene capable of hybridizing under stringent conditions" in the present invention is, for example, by selecting a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1. Can also obtain a modified DNA. Here, “stringent conditions” refer to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. Although it is difficult to quantify these conditions clearly, as an example, the plant-derived polyamine metabolism-related gene of the present invention is used at 42 ° C. and salt concentration,
6 × SSC (0.9 M NaCl, 0.09 M trisodium citrate) or 6 × SSPE (3 M NaCl,
0.2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM EDTA · 2N
a; pH 7.4), under which hybrids are formed under hybridization conditions, and under hybrid conditions at 42 ° C. and a salt concentration of 0.5 × SSC.
【００２０】本発明者らは、低温ストレス抵抗性を示す
クロダネカボチャ植物の根から、低温ストレス遭遇時に
発現量が変化し得るポリアミン代謝関連酵素遺伝子を見
出した。その後、クロダネカボチャ植物の根組織から、
幾つかのポリアミン代謝関連遺伝子を得、上記ポリアミ
ン代謝関連遺伝子のうち、３種の遺伝子が実際に低温ス
トレス抵抗性を示す根組織で低温ストレス遭遇時に発現
量が変化し得るポリアミン代謝関連酵素遺伝子に含有さ
れることを見出した。ここで「低温ストレス遭遇時に発
現量が変化し得るポリアミン代謝関連酵素遺伝子」と
は、該植物が低温ストレス下に遭遇した場合、該植物中
で異なったレベルで発現する遺伝子を意味する。The present inventors have found a polyamine metabolism-related enzyme gene whose expression level can be changed at the time of encountering low-temperature stress, from the root of a black squash pumpkin plant exhibiting low-temperature stress resistance. Then, from the root tissue of the black squash pumpkin plant,
Several polyamine metabolism-related genes were obtained, and among the above-mentioned polyamine metabolism-related genes, three kinds of genes were found to be polyamine metabolism-related enzyme genes whose expression levels can be changed in low-temperature stress-resistant root tissues when they encounter low-temperature stress. Found to be contained. Here, the term "polyamine metabolism-related enzyme gene whose expression level can be changed when encountering low-temperature stress" means a gene that is expressed at a different level in the plant when the plant encounters low-temperature stress.
【００２１】本発明による低温ストレス遭遇時に発現量
が変化する植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子は
種々の植物から単離することができる。具体的には、例
えば、ウリ科、ナス科、イネ科、アブラナ科、マメ科、
アオイ科、キク科、アカザ科、マメ科、小麦、アルファ
ルファ、オオムギ、シロイヌナズナなどが挙げられる。The polyamine metabolism-related enzyme gene derived from a plant whose expression level changes upon encountering low-temperature stress according to the present invention can be isolated from various plants. Specifically, for example, Cucurbitaceae, Solanaceae, Gramineae, Brassicaceae, Legumes,
Malvaceae, Asteraceae, Acalyptaceae, Legumes, wheat, alfalfa, barley, Arabidopsis and the like.
【００２２】本発明の植物由来のポリアミン代謝関連酵
素遺伝子を単離する植物組織としては種子形態、または
生育過程にあるものである。生育過程にある植物は全
体、あるいは部分的な組織から単離することができる。
単離することができる部位としては、特に限定されない
が、好ましくは植物の全樹、蕾、花、子房、果実、葉、
茎、根等である。さらに好ましくは低温ストレス抵抗性
を示す部位である。The plant tissue from which the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention is isolated is in the form of a seed or in a growing process. Developing plants can be isolated from whole or partial tissues.
The site that can be isolated is not particularly limited, but is preferably a whole plant tree, buds, flowers, ovary, fruits, leaves,
Stems, roots, etc. More preferably, it is a site exhibiting low-temperature stress resistance.
【００２３】本発明におけるポリアミンとは、第一級ア
ミノ基を２つ以上もつ脂肪族炭化水素化合物であり、生
物体内に普遍的に存在する極めて一般的な天然物であ
る。例えば、１，３−ジアミノプロパン、プトレシン、
カダベリン、カルジン、スペルミジン、ホモスペルミジ
ン、アミノプロピルカダベリン、テルミン、スペルミ
ン、テルモスペルミン、カナバルミン、アミノペンチル
ノルスペルミジン、Ｎ，Ｎ−ビス（アミノプロピル）カ
ダベリン、ホモスペルミン、カルドペンタミン、ホモカ
ルドペンタミン、カルドヘキサミン、ホモカルドヘキサ
ミンなどが挙げられる。The polyamine in the present invention is an aliphatic hydrocarbon compound having two or more primary amino groups, and is a very common natural product that is universally present in living organisms. For example, 1,3-diaminopropane, putrescine,
Cadaverine, caldin, spermidine, homospermidine, aminopropyl cadaverine, theremin, spermine, thermospermine, canabalmin, aminopentyl norspermidine, N, N-bis (aminopropyl) cadaverine, homospermine, cardopentamine, homocardopentamine, Cardohexamine, homocardohexamine and the like.
【００２４】本発明のポリアミン代謝関連酵素遺伝子は
上記に示したポリアミンの生合成に関与する酵素のアミ
ノ酸をコードする遺伝子である。例えば、代表的なポリ
アミンであるプトレシンについてはアルギニン脱炭酸酵
素（ＡＤＣ）遺伝子とオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）
遺伝子、スペルミジンについてはＳ−アデノシルメチオ
ニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）とスペルミジン合成酵素
（ＳＰＤＳ）遺伝子、スペルミンについてはＳ−アデノ
シルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤＣ）遺伝子とスペ
ルミン合成酵素（ＳＰＭＳ）遺伝子が関与し律速となっ
ているものと考えられている。The polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention is a gene encoding an amino acid of the enzyme involved in the biosynthesis of polyamine as described above. For example, for the representative polyamine putrescine, the arginine decarboxylase (ADC) gene and ornithine decarboxylase (ODC)
For genes and spermidine, S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) and spermidine synthase (SPDS) genes are involved, and for spermine, S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMDC) and spermine synthase (SPMS) genes are involved. It is considered to be rate-limiting.
【００２５】アルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ：arginine
decarboxylase EC4.1.1.19.）はＬ−アルギニンからア
グマチンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素で
ある。オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ：ornithine deca
rboxylase EC4.1.1.17.）はＬ−オルニチンからプトレ
シンと二酸化炭素を生成する反応を触媒する酵素であ
る。Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素（ＳＡＭＤ
Ｃ：S-adenosylmethioninedecarboxylase EC4.1.1.5
0.）はＳ−アデノシルメチオニンからアデノシルメチル
チオプロピルアミンと二酸化炭素を生成する反応を触媒
する酵素である。スペルミジン合成酵素（ＳＰＤＳ：sp
ermidine synthase EC2.5.1.16.）はプトレシンとアデ
ノシルメチルチオプロピルアミンからスペルミジンとメ
チルチオアデノシンを生成する反応を触媒する酵素であ
る。Arginine decarboxylase (ADC)
decarboxylase EC4.1.1.19.) is an enzyme that catalyzes the reaction of producing agmatine and carbon dioxide from L-arginine. Ornithine decarboxylase (ODC: ornithine deca
rboxylase EC4.1.1.17.) is an enzyme that catalyzes a reaction for producing putrescine and carbon dioxide from L-ornithine. S-adenosylmethionine decarboxylase (SAMD
C: S-adenosylmethioninedecarboxylase EC4.1.1.5
0.) is an enzyme that catalyzes a reaction to generate adenosylmethylthiopropylamine and carbon dioxide from S-adenosylmethionine. Spermidine synthase (SPDS: sp
ermidine synthase EC2.5.1.16.) is an enzyme that catalyzes the reaction of producing spermidine and methylthioadenosine from putrescine and adenosylmethylthiopropylamine.
【００２６】本発明のポリアミン代謝関連酵素遺伝子は
以下の方法で単離することができる。 １．ＰＣＲ法によるポリアミン代謝関連酵素遺伝子断片
の取得 （１）低温ストレス誘導ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリー
の作製 昼１８℃／夜１４℃・３日間の低温処理を行ったクロダ
ネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）の根組織か
ら常法に従い、ポリ（Ａ）+ＲＮＡを抽出する。単離し
たポリ（Ａ）+ＲＮＡから市販のMarathon cDNA Amplifi
cation Kit（クローンテック社製）等を用いてＰＣＲ用
に使用するｃＤＮＡライブラリーを作製することができ
る。単離したポリ（Ａ）+ＲＮＡを鋳型として、３’末
端に２つのdegenerate nucleotide positionを持つ修飾
lock-docking オリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素
を用いて１本鎖ｃＤＮＡを合成し、ポリメラーゼ反応に
よって２本鎖化したｃＤＮＡを得る。該２本鎖ｃＤＮＡ
をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより末端を平滑化し、Ma
rathon cDNAアダプターをライゲーション反応により結
合させ、アダプター結合二本鎖ｃＤＮＡライブラリーを
作製する。The polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention can be isolated by the following method. 1. Acquisition of polyamine metabolism-related enzyme gene fragments by PCR (1) Preparation of cDNA library for low-temperature stress-induced PCR Roots of black squash (Cucurbita ficifolia Bouche) subjected to low-temperature treatment at 18 ° C / night and 14 ° C for 3 days Poly (A) + RNA is extracted from the tissue according to a conventional method. Commercially available Marathon cDNA Amplifi from isolated poly (A) + RNA
A cDNA library to be used for PCR can be prepared using a cation Kit (Clontech) or the like. Modification with two degenerate nucleotide positions at the 3 'end using isolated poly (A) + RNA as a template
A single-stranded cDNA is synthesized using a lock-docking oligo (dT) primer and a reverse transcriptase, and a double-stranded cDNA is obtained by a polymerase reaction. The double-stranded cDNA
Was blunt-ended with T4 DNA polymerase,
The rathon cDNA adapter is ligated by a ligation reaction to prepare an adapter-linked double-stranded cDNA library.
【００２７】（２）ＰＣＲプライマーの設計 ポリアミン代謝関連酵素遺伝子としてＳＰＤＳ遺伝子、
ＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子、ＯＤＣ遺伝子を単離
することができる。ＳＰＤＳ遺伝子はシロイヌナズナや
ヒヨス、ＳＡＭＤＣ遺伝子はジャガイモ、ホウレンソ
ウ、タバコ、ＡＤＣ遺伝子はダイズ、エンドウ、トマ
ト、ＯＤＣ遺伝子はチョウセンアサガオ（Datura）等か
ら単離されており、既に塩基配列が決定されている。従
って、決定されている既知の塩基配列を比較し、非常に
保存されている領域を選抜し、ＤＮＡオリゴマーを合成
しＰＣＲ用プライマーを設計することができる。(2) Design of PCR primers SPDS gene as polyamine metabolism-related enzyme gene,
SAMDC gene, ADC gene and ODC gene can be isolated. The SPDS gene has been isolated from Arabidopsis thaliana and Hyos, the SAMDC gene has been isolated from potato, spinach, tobacco, the ADC gene has been isolated from soybean, pea, tomato, the ODC gene has been isolated from Datura, etc., and its nucleotide sequence has already been determined. Therefore, it is possible to compare the determined known base sequence, select a highly conserved region, synthesize a DNA oligomer, and design a primer for PCR.
【００２８】（３）ＰＣＲによるＳＰＤＳ遺伝子、ＳＡ
ＭＤＣ遺伝子、ＡＤＣ遺伝子断片の取得 上記（１）の方法で作製したＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラ
リーをテンプレートとして、上記（２）の方法で設計し
たプライマーを使用して、それぞれＰＣＲを行う。ＰＣ
Ｒ産物をゲル電気泳動で分離し、グラスミルク法などで
精製する。精製したＰＣＲ産物はＴＡベクターなどのク
ローニングベクターに連結させる。クローン化されたｃ
ＤＮＡの塩基配列の決定は、Maxam−Gilbert法あるいは
ダイデオキシ法等により決定できる。いずれの方法も市
販されているキットを用いて行うことができ、配列決定
を自動的に行うオートシーケンサーを使用してもよい。(3) SPDS gene by PCR, SA
Acquisition of MDC gene and ADC gene fragments PCR is performed using the PCR cDNA library prepared by the method (1) as a template and the primers designed by the method (2). PC
The R product is separated by gel electrophoresis and purified by the glass milk method or the like. The purified PCR product is ligated to a cloning vector such as a TA vector. Cloned c
The DNA base sequence can be determined by the Maxam-Gilbert method, the dideoxy method, or the like. Either method can be performed using a commercially available kit, and an automatic sequencer that automatically performs sequencing may be used.
【００２９】（４）完全長遺伝子の単離 完全長の遺伝子を得るためには、常法に従って、プラー
クハイブリダイゼーション法、ＲＡＣＥ（rapid amplif
ication of cDNA ends）法やMarathon ＲＡＣＥ法等に
より完全長の遺伝子を得ることができる。(4) Isolation of full-length gene In order to obtain a full-length gene, plaque hybridization, RACE (rapid amplif
ication of cDNA ends) method or the Marathon RACE method can be used to obtain full-length genes.
【００３０】（５）ノザン解析 上記の方法で得られた植物由来のポリアミン代謝関連酵
素遺伝子が低温ストレス抵抗性を示す組織で特異的に低
温ストレス遭遇時にその発現量が変化することを確認す
るために、クロダネカボチャの低温ストレス抵抗性を示
す根と低温ストレス抵抗性を示さない葉や茎に１４℃の
低温処理と２３℃の適温処理した組織からそれぞれＲＮ
Ａを単離し、上記の方法で得られた遺伝子をプローブと
してノザンハイブリダイゼーションを行い、低温ストレ
ス遭遇時に低温ストレス抵抗性を示す根で特異的に発現
量が変化する遺伝子であることを確認する。このように
して取得した遺伝子は、ポリアミン生合成に関与する遺
伝子であり、低温ストレス遭遇時に低温ストレス抵抗性
を示す組織で特異的に発現が高まり、低温ストレス抵抗
性に深く関与する遺伝子である。この遺伝子を利用して
巧妙に、即ち、遺伝子発現を分子生物学的に制御するこ
とにより、低温ストレス抵抗性を増強した植物の作出に
利用することが可能になる。(5) Northern analysis In order to confirm that the expression level of the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene obtained by the above-described method is specifically changed in a tissue exhibiting resistance to low-temperature stress when low-temperature stress is encountered. The roots of black squash squash, which exhibit low-temperature stress resistance, and the leaves and stems that do not exhibit low-temperature stress resistance were subjected to RN treatment at 14 ° C. and at 23 ° C. respectively.
A is isolated, and Northern hybridization is performed using the gene obtained by the above method as a probe, and it is confirmed that the gene whose expression level is specifically changed in roots exhibiting low-temperature stress resistance when low-temperature stress is encountered. The gene thus obtained is a gene involved in polyamine biosynthesis, and is a gene whose expression is specifically increased in tissues exhibiting low-temperature stress resistance when low-temperature stress is encountered, and which is deeply involved in low-temperature stress resistance. By skillfully using this gene, that is, by controlling gene expression by molecular biology, it becomes possible to use it for the production of plants with enhanced low-temperature stress resistance.
【００３１】２．低温ストレス抵抗性に関与するポリア
ミン代謝関連酵素遺伝子の利用 上記した方法により得た遺伝子を適当なプロモーターに
接続して、植物に導入するとポリアミン代謝関連酵素の
含量を増大させることができる。これに対し、前記遺伝
子のアンチセンス鎖（コード配列に相補的な配列）の少
なくとも一部を逆向きに適当なプロモーターに接続した
ものを植物に導入し、いわゆるアンチセンスＲＮＡを発
現させると、ポリアミン代謝関連酵素の含量を低下させ
ることができる。2. Use of polyamine metabolism-related enzyme gene involved in low-temperature stress resistance When the gene obtained by the above method is connected to an appropriate promoter and introduced into a plant, the content of polyamine metabolism-related enzyme can be increased. On the other hand, when the antisense strand (sequence complementary to the coding sequence) of the above-mentioned gene, in which at least a part thereof is connected to an appropriate promoter in the reverse direction, is introduced into a plant, so-called antisense RNA is expressed, The content of metabolic enzymes can be reduced.
【００３２】植物の形質転換方法としては、プロトプラ
ストに電気パルス処理してプラスミドを導入するエレク
トロポレーション法や、小細胞、細胞、リソソーム等と
プロトプラストとの融合法、マイクロインジェクション
法、ポリエチレングリコール法、あるいはパーティクル
ガン法等の方法を挙げることができる。[0032] Plant transformation methods include electroporation in which a protoplast is treated with an electric pulse to introduce a plasmid, fusion of small cells, cells, lysosomes and the like with protoplast, microinjection, polyethylene glycol, and the like. Alternatively, a method such as a particle gun method can be used.
【００３３】また、植物ウイルスをベクターとして利用
することによって、目的遺伝子を植物体に導入すること
ができる。植物ウイルスとしては、例えばカリフラワー
モザイクウイルス(ＣａＭＶ)を用いることができる。す
なわち、まずウイルスゲノムを一旦大腸菌等由来のベク
ターに挿入して組換え体を調製した後、ウイルスゲノム
中にこれらの目的遺伝子を挿入する。このようにして修
飾されたウイルスゲノムを制限酵素により、該組換え体
から切り出し、植物に接種することによって、これらの
目的遺伝子を植物体に挿入することができる [ホーン(H
ohn)ら、モレキュラー・バイオロジー・オブ・プラント
・チューモアーズ(Molecular Biology of Plant Tumor
s) 、アカデミック・プレス、ニューヨーク(Academic P
ress, NewYork)、第549〜560頁(1982)、米国特許第4,40
7,956号] 。In addition, a target gene can be introduced into a plant by using a plant virus as a vector. As the plant virus, for example, cauliflower mosaic virus (CaMV) can be used. That is, first, the virus genome is once inserted into a vector derived from Escherichia coli or the like to prepare a recombinant, and then these target genes are inserted into the virus genome. The thus-modified gene can be inserted into a plant by cutting out the modified viral genome from the recombinant with a restriction enzyme and inoculating the plant [Horn (H
ohn) et al., Molecular Biology of Plant Tumors
s), Academic Press, New York (Academic P
ress, New York), pp. 549-560 (1982); U.S. Pat.
7,956].
【００３４】さらに、アグロバクテリウムのＴｉプラス
ミドを利用する方法がある。アグロバクテリウム属に属
する細菌が植物に感染すると、それが持っているプラス
ミドＤＮＡの一部を植物ゲノム中に移行させるという性
質を利用して、これらの目的遺伝子を植物体に導入する
こともできる。アグロバクテリウム属に属する細菌のう
ち、アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacte
rium tumefaciens) は植物に感染してクラウンゴールと
呼ばれる腫瘍を、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agr
obacterium rhizogenes)は植物に感染して毛状根を引き
起こすが、これらは感染の際にＴｉプラスミド、又はＲ
ｉプラスミドと呼ばれる、それぞれの細菌中に存在する
プラスミド上のＴ−ＤＮＡ領域(Transferred DNA) と呼
ばれる領域が植物中に移行し、植物のゲノム中に組み込
まれることに起因する。さらに、Ｔｉプラスミドまたは
Ｒｉプラスミド上にはＴ−ＤＮＡ領域が植物中に移行
し、植物ゲノム中に組込まれるために必須であるｖｉｒ
領域といわれる領域がある。ｖｉｒ領域自身は植物中に
移行されることはなく、また、このｖｉｒ領域はＴ−Ｄ
ＮＡ領域が存在するのとは異なったプラスミド上にあっ
ても機能しうる [Nature, 303, 179, (1983)]。Further, there is a method using an Agrobacterium Ti plasmid. When a bacterium belonging to the genus Agrobacterium infects a plant, these target genes can also be introduced into the plant by utilizing the property of transferring a part of the plasmid DNA possessed by the bacterium into the plant genome. . Among the bacteria belonging to the genus Agrobacterium, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacte
rium tumefaciens) infects plants and causes a tumor called crown gall to grow into Agrobacterium rhizogenes (Agrobacterium rhizogenes).
(R. bacterium rhizogenes) infect plants and cause hairy roots, which are infected with Ti plasmids or R
This is because a region called a T-DNA region (Transferred DNA) on a plasmid, which is present in each bacterium and is called i-plasmid, is transferred into a plant and integrated into the plant genome. Furthermore, on the Ti plasmid or the Ri plasmid, the vir which is essential for the transfer of the T-DNA region into the plant and integration into the plant genome.
There is an area called an area. The vir region itself is not transferred into the plant, and this vir region has a TD
It may function on a different plasmid than the one in which the NA region is present [Nature, 303, 179, (1983)].
【００３５】ＴｉプラスミドまたはＲｉプラスミド上の
Ｔ−ＤＮＡ領域中に、植物ゲノム中に組込みたいＤＮＡ
を挿入しておけば、アグロバクテリウム属の細菌が植物
体に感染する際に目的とするＤＮＡを植物ゲノム中に組
み込みことができる。ここで、ＴｉプラスミドまたはＲ
ｉプラスミドのＴ−ＤＮＡ中のクラウンゴール、又は毛
状根を引き起こす部分を、目的とする移行機能を損なう
ことなく取り除き、得られたものをベクターとして使用
することもできる。本発明においては、このような種々
のベクターを用いることができる。例えば、バイナリー
ベクターと呼ばれるpBI121（クローンテック社）等のベ
クターに、適当なプロモーターにポリアミン代謝関連酵
素遺伝子を接続したもの、さらに該遺伝子をアンチセン
ス方向に接続したものを挿入して、これらを植物体に導
入することができる。なお、これらのベクターは前出の
ｖｉｒ領域を有しておらず、該ベクターを導入して用い
るアグロバクテリウム属の細菌はｖｉｒ領域を有してい
る他のプラスミドを含有している必要がある。DNA to be integrated into plant genome in T-DNA region on Ti plasmid or Ri plasmid
Can be integrated into the plant genome when Agrobacterium bacteria infect a plant. Here, Ti plasmid or R
The portion that causes crown gall or hairy root in the T-DNA of the i-plasmid can be removed without impairing the intended transfer function, and the resulting product can be used as a vector. In the present invention, such various vectors can be used. For example, a vector obtained by connecting a polyamine metabolism-related enzyme gene to a suitable promoter and a vector obtained by connecting the gene in an antisense direction to a vector such as pBI121 (Clontech) called a binary vector are inserted into a plant. Can be introduced into the body. In addition, these vectors do not have the above-mentioned vir region, and the Agrobacterium bacterium used by introducing the vector needs to contain another plasmid having the vir region. .
【００３６】また、これらのベクターはアグロバクテリ
ウム属の細菌だけではなく、大腸菌中でも増幅すること
ができるシャトルベクターであり、したがって、Ｔｉプ
ラスミドの組換え操作は、大腸菌を用いて行うことがで
きる。さらに、これらのベクターは抗生物質耐性遺伝子
を含んでおり、大腸菌、アグロバクテリウム属の細菌、
および植物体等を形質転換する際に、形質転換体を容易
に選別することができる。また、これらのベクターには
カリフラワーモザイクウイルス(ＣａＭＶ)の３５Ｓプロ
モーターが存在しており、これらのベクターに挿入され
た遺伝子を植物ゲノム中に組み込んだ後、非調節的に発
現させることが可能となる。These vectors are shuttle vectors that can be amplified not only in bacteria of the genus Agrobacterium but also in Escherichia coli. Therefore, recombination of the Ti plasmid can be performed using Escherichia coli. In addition, these vectors contain antibiotic resistance genes, which allow E. coli, Agrobacterium bacteria,
When transforming a plant or the like, the transformant can be easily selected. In addition, these vectors have a 35S promoter of cauliflower mosaic virus (CaMV), and the gene inserted into these vectors can be expressed in a non-regulated manner after integration into the plant genome. .
【００３７】以下、シロイヌナズナにおけるアグロバク
テリウムによる目的遺伝子の導入、および形質転換体細
胞の植物体への再生法を例示する。シロイヌナズナの種
子を常法に従って、ＭＳＯプレート（ムラシゲ・スクー
グ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０ｇ、１０００×ビタミ
ンストック液１ｍｌ／Ｌ、ｐＨ６．２）に播種し、無菌
的に栽培する。発根した根の切片を用いてＣＩＭプレー
ト（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノキシ酢酸
を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．０５μｇ
／ｍｌとなるように加えたもの）上でカルス培養を行
う。プロモーターに目的遺伝子を接続し、カナマイシン
及びハイグロマイシン耐性遺伝子を有するプラスミドに
より形質転換したアグロバクテリウムを培養し、希釈し
たものをチューブに分注し、カルス化した根の切片を浸
し、数日間ＣＩＭプレート上で共存培養する。菌株が肉
眼で観察できるまで十分に増殖したら、除菌操作を行
い、ＳＩＭＣプレート（ＭＳＯプレートに、Ｎ６−[２
−イソペンテニル] アデニンを終濃度５μｇ／ｍｌ、イ
ンドール酢酸（ＩＡＡ）を終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、
クラフォランを終濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加
えたもの）上で数日間培養を行う。これらの切片を最終
的にＳＩＭＣＳプレート（カナマイシンおよびハイグロ
マイシンＢを含有するプレート）上で培養し、１週間ご
とに新しいプレートに移植を繰り返す。形質転換した切
片は増殖を続け、カルスが現れてくる。抗生物質で選択
しているため、非形質転換切片は褐変する。形質転換体
が５ｍｍ程度の大きさになり、ロゼット葉を形成するま
で培養する。A method for introducing a target gene into Arabidopsis thaliana by Agrobacterium and a method for regenerating a transformed cell into a plant are described below. Arabidopsis seeds are seeded on an MSO plate (4.6 g of Murashige and Skoog inorganic salts, 10 g of sucrose, 1 ml / L of 1000 × vitamin stock solution, pH 6.2) and cultivated aseptically according to a conventional method. Using a rooted root section, a CIM plate (2,4-dichlorophenoxyacetic acid was added to an MSO plate at a final concentration of 0.5 μg / ml and kinetin at a concentration of 0.05 μg)
/ Ml). The target gene was connected to the promoter, Agrobacterium transformed with a plasmid having kanamycin and hygromycin resistance genes was cultured, the diluted Agrobacterium was dispensed into a tube, the callus root section was immersed, and CIM was incubated for several days. Co-culture on plate. When the strain grew sufficiently to be visible to the naked eye, a sterilization operation was performed, and the SIMC plate (MSO plate contained N6- [2
-Isopentenyl] adenine at a final concentration of 5 μg / ml, indoleacetic acid (IAA) at a final concentration of 0.15 μg / ml,
Claforan to a final concentration of 500 μg / ml) for several days. These sections are finally cultured on SIMCS plates (plates containing kanamycin and hygromycin B) and the transplantation is repeated every week on a new plate. The transformed sections continue to grow and callus appears. Non-transformed sections turn brown due to selection with antibiotics. The transformant is cultured until it becomes about 5 mm in size and forms rosette leaves.
【００３８】完全なロゼットの形状を示すようになった
ら、形質転換体の根元をカルス部分を含まないようにメ
スで切り取り、ＲＩＭプレート（ＭＳＯプレートにＩＡ
Ａを終濃度０．５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）
に移植する。大きなカルスが付いていると、発根しても
カルスを介して根が出ていて、ロゼットとは維管束がつ
ながっていることが多い。約８〜１０日後、無機塩類培
地〔５ｍＭ ＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4 、２ｍＭＣａ（Ｎ
Ｏ3）2 、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微量
要素（７０ｍＭ Ｈ3ＢＯ3 、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2 、
０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4 、１ｍＭ ＺｎＳＯ4 、０．２
ｍＭ ＮａＭｏＯ4 、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍ
Ｍ ＣｏＣｌ2）１ｍｌ／Ｌ〕に浸したロックウール上
に定植する。開花し、莢を形成した植物体は無機塩類培
地に浸した土に移植し、種子を得ることができる。この
種子を滅菌処理し、ＭＳＨ（ＭＳＯプレートのハイグロ
マイシンＢを終濃度５Ｕ／ｍｌとなるように加えたも
の）に播種して発芽させることにより形質転換体を得る
ことができる。When the shape of the complete rosette was shown, the root of the transformant was cut off with a scalpel so as not to contain the callus portion, and the RIM plate (MSA plate was IA)
A added to a final concentration of 0.5 μg / ml)
To transplant. When a large callus is attached, the root is still protruding through the callus even when rooting, and the vascular bundle is often connected to the rosette. After about 8 to 10 days, an inorganic salt medium [5 mM KNO 3 , 2.5 mM K-phosphate buffer (pH 5.5), 2 mM MgSO 4 , 2 mM Ca (N
O 3 ) 2 , 50 μM Fe-EDTA, 1000 × trace elements (70 mM H 3 BO 3 , 14 mM MnCl 2 ,
0.5 mM CuSO 4 , 1 mM ZnSO 4 , 0.2
mM NaMoO 4 , 10 mM NaCl, 0.01 m
(M CoCl 2 ) at 1 ml / L]. The plant that has flowered and formed a pod can be transplanted into soil immersed in an inorganic salt medium to obtain seeds. A transformant can be obtained by sterilizing this seed, sowing it on MSH (hygromycin B added to an MSO plate to a final concentration of 5 U / ml) and germinating.
【００３９】この形質転換体より、常法に従ってＤＮＡ
を抽出し、このＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、ポリ
アミン代謝関連酵素遺伝子をプローブとして用いてサザ
ンハイブリダイゼーションを行い、形質転換の有無を確
認することができる。また、形質転換体や、非形質転換
体より、常法に従ってＲＮＡを抽出し、ポリアミン代謝
関連遺伝子のセンス配列、もしくはアンチセンス配列を
有するプローブを作成し、これらのプローブを用いてノ
ザンハイブリダイゼーションを行い、目的遺伝子の発現
の状態を調べることができる。From this transformant, a DNA was prepared according to a conventional method.
, And the DNA is cleaved with an appropriate restriction enzyme, and Southern hybridization is performed using a polyamine metabolism-related enzyme gene as a probe to confirm the presence or absence of transformation. In addition, RNA is extracted from a transformant or a non-transformant according to a conventional method, and a probe having a sense sequence or an antisense sequence of a polyamine metabolism-related gene is prepared. Northern hybridization is performed using these probes. Then, the state of expression of the target gene can be examined.
【００４０】本発明のポリアミン代謝関連遺伝子は低温
ストレス遭遇時に発現量が変化し、低温ストレス抵抗性
に関与するため、この塩基配列を低温ストレス時のマー
カーとして利用して、低温ストレス抵抗性のメカニズム
の解明及び低温ストレス時に機能発現する調節遺伝子
（プロモーター配列）の単離を可能にするものである。
従って、もし、この遺伝子の塩基配列を低温ストレス時
のマーカーとして使用すれば、低温ストレス抵抗性や低
温耐性のメカニズムの解明及びそれを調節する遺伝子の
単離が達成されるであろう。Since the expression level of the polyamine metabolism-related gene of the present invention changes upon encountering low-temperature stress and is involved in low-temperature stress resistance, this nucleotide sequence is used as a marker for low-temperature stress to provide a mechanism for low-temperature stress resistance. And the isolation of a regulatory gene (promoter sequence) functionally expressed during cold stress.
Therefore, if the nucleotide sequence of this gene is used as a marker at the time of low-temperature stress, elucidation of the mechanism of low-temperature stress resistance and low-temperature resistance and isolation of a gene that regulates it will be achieved.
【００４１】本発明のポリアミン代謝関連遺伝子は、例
えばカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５
Ｓプロモーターを用いることによって、植物細胞の器官
全体にＡＤＣ、ＳＰＤＳ、ＳＡＭＤＣ等のポリアミン代
謝酵素の含量を増加させることができる、その結果、ポ
リアミン代謝が活性化されプトレシン、スペルミジン、
スペルミン等のポリアミン含量が増加する。The polyamine metabolism-related gene of the present invention is, for example, cauliflower mosaic virus (CaMV) 35
By using the S promoter, the content of polyamine metabolizing enzymes such as ADC, SPDS and SAMDC can be increased throughout the organs of plant cells, so that polyamine metabolism is activated and putrescine, spermidine,
Polyamine content such as spermine increases.
【００４２】ポリアミンの生理作用は低温ストレス抵抗
性だけでなく、高塩、低ｐＨ、低酸素、カドミウム、Ｓ
Ｏ2毒性、紫外線、病原体、除草剤等のストレス抵抗性
にも関わっていると考えられていることから、植物体内
のポリアミン含量を制御することによってこれらのスト
レス抵抗性が付与される可能性がある。The physiological effects of polyamines are not only low temperature stress resistance, but also high salt, low pH, low oxygen, cadmium, S
It is thought that these factors are also involved in the stress resistance of O 2 toxicity, ultraviolet rays, pathogens, herbicides, and the like. Therefore, it is possible that these stress resistances may be imparted by controlling the polyamine content in the plant. is there.
【００４３】また、発現調節用のプロモーターとして
は、例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、ノパリン
合成酵素遺伝子（ＮＯＳ）プロモーター、オクトピン合
成酵素遺伝子（ＯＣＳ）プロモーター、フェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）遺伝子プロモーター、
カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子プロモーター等を
挙げることができる。さらにこれらに限定されない公知
の植物プロモーターも挙げられる。Examples of the promoter for controlling the expression include a CaMV 35S promoter, a nopaline synthase gene (NOS) promoter, an octopine synthase gene (OCS) promoter, a phenylalanine ammonia lyase (PAL) gene promoter, and the like.
Chalcone synthase (CHS) gene promoter and the like can be mentioned. Furthermore, known plant promoters are not limited to these.
【００４４】上記３５Ｓプロモーターのような器官全体
に恒常的に発現させるプロモーターだけでなく、低温、
高温、光、熱、ホルモンあるいは傷害等の調節性のプロ
モーターを用いれば、生活環境に応じて目的遺伝子を発
現させることができる。例えば、本発明のポリアミン代
謝関連酵素遺伝子と植物が低温に遭遇した時だけ転写を
起こさせ得るプロモーターを用いることによって、低温
時のみ植物体のポリアミン代謝を制御し低温ストレス抵
抗性を高めることができる。また、器官又は組織特異的
なプロモーターを用いれば、特定の器官又は組織だけに
目的遺伝子を発現させることができる。Not only a promoter such as the 35S promoter, which is constantly expressed in the whole organ,
The use of a regulatory promoter such as high temperature, light, heat, hormone, or injury enables the expression of the target gene in accordance with the living environment. For example, by using the polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention and a promoter capable of causing transcription only when a plant encounters a low temperature, the polyamine metabolism of a plant can be controlled only at a low temperature and the resistance to low-temperature stress can be increased. . When an organ or tissue-specific promoter is used, the target gene can be expressed only in a specific organ or tissue.
【００４５】本発明のポリアミン代謝関連酵素遺伝子に
より形質転換される植物は、特に限定されるものではな
いが、低温ストレス抵抗性の低い（低温感受性）植物が
挙げられる。The plant transformed with the polyamine metabolism-related enzyme gene of the present invention is not particularly limited, and includes plants having low resistance to low temperature stress (low temperature sensitivity).
【００４６】[0046]
【実施例】以下、実施例により、本発明を詳細に説明す
る。なお、これらは本発明を特に限定するものではな
い。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to examples. These do not particularly limit the present invention.
【００４７】実施例１：キュウリとクロダネカボチャの
根のポリアミン含量の測定 （１）供試材料の調製 根において低温ストレス抵抗性の高いクロダネカボチャ
（Cucurbita ficifolia Bouche）と低温ストレス抵抗性
の低いキュウリ‘四葉’をガラス室で播種し、子葉展開
時に市販の床土（サンサン床土；タキイ種苗社製）を詰
めた鉢に移植した。第１本葉展開時に人工気象室（気温
昼２６℃／夜２０℃、相対湿度 昼７０％／夜８５
％、光強度４８０μＭ／ｍ2ｓ、１５時間日長）内に置
いた。２台の栽培槽（１／２倍ホーグランド液 １２０
Ｌ、液温２３℃）に９株ずつ定植した。 （２）低温処理 定植４日後に、株ごとに生体重を測定して植え戻したの
ち、１台の栽培槽の液温を１４℃に下げた。 （３）サンプリング サンプリングは低温処理後、３日ごとに３株ずつ採取
し、茎葉と根の生体重を測定した。同時にポリアミン定
量のために根５ｇを調製し、分析まで−８０℃に凍結保
存した。Example 1 Measurement of Polyamine Content in Roots of Cucumber and Black Squash (1) Preparation of Test Material Black squash (Cucurbita ficifolia Bouche) having high low-temperature stress resistance and low low-temperature stress resistance in roots Cucumber 'four-leaf' was sowed in a glass room, and transplanted into a pot filled with commercially available floor soil (Sansan floor soil; manufactured by Takii Seed Company) at the time of cotyledon development. At the time of the first true leaf deployment, the artificial weather chamber (temperature 26 ° C / 20 ° C at night, relative humidity 70% day / 85 at night)
%, Light intensity: 480 μM / m 2 s, 15 hours photoperiod). Two cultivation tanks (1/2 times Hoagland liquid 120
L, a liquid temperature of 23 ° C.). (2) Low-temperature treatment Four days after planting, the plant was re-measured by measuring the live weight of each plant, and then the liquid temperature of one cultivation tank was lowered to 14 ° C. (3) Sampling Sampling was performed by sampling three plants every three days after the low-temperature treatment, and measuring the live weight of foliage and roots. At the same time, 5 g of roots were prepared for polyamine quantification, and stored frozen at -80 ° C until analysis.
【００４８】（４）ポリアミン含量の測定 ポリアミンを５％過塩素酸水溶液（試料生体重１．０ｇ
当たり４ｍｌ）で葉から抽出した。プトレシン、スペル
ミジン、スペルミンの希釈内部標準液を添加後、２℃、
40,000×ｇで２０分間遠心分離した。上清液をカチオン
交換樹脂（５０Ｗ−４Ｘ、２００−４００メッシュ、Ｈ
+型：バイオラッド製）カラムに通した。０．７Ｎ Ｎ
ａＣｌ／０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）、水、１Ｎ塩酸を順次流してカラムを洗浄し、ポリ
アミン以外のアミノ酸や有機物を除去した。６Ｎ塩酸を
カラムに加え、液が出なくなるまで流出し、ポリアミン
を回収した。溶出液を４０℃で減圧乾固し、これに５％
過塩素酸を加えポリアミンを溶解した。プトレシン、ス
ペルミジン、スペルミンのポリアミン量の定量はベンゾ
イル化した後、ＵＶ検出器を接続した高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて内部標準法で分析し
た。ＨＰＬＣカラムはInertsil ODS-2（４．６×２５０
ｍｍ：ＧＬサイエンス社製）を使用し、５８％メタノー
ルに１％酢酸を含んだ溶離液を用いた。(4) Measurement of polyamine content Polyamine was added to a 5% aqueous solution of perchloric acid (sample live weight 1.0 g).
Per 4 ml). After adding diluted internal standard solution of putrescine, spermidine and spermine,
Centrifuged at 40,000 × g for 20 minutes. The supernatant solution was washed with a cation exchange resin (50W-4X, 200-400 mesh, H
+ Type: manufactured by Bio-Rad) column. 0.7N N
aCl / 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.
0), water and 1N hydrochloric acid were successively flown to wash the column to remove amino acids and organic substances other than polyamine. 6N Hydrochloric acid was added to the column, and the mixture was allowed to flow until no more liquid came out, and the polyamine was recovered. The eluate was dried under reduced pressure at 40 ° C., and 5%
Perchloric acid was added to dissolve the polyamine. The amounts of polyamines of putrescine, spermidine, and spermine were determined by benzoylation and analyzed by an internal standard method using high performance liquid chromatography (HPLC) connected to a UV detector. The HPLC column was Inertsil ODS-2 (4.6 × 250).
mm: GL Science) and an eluent containing 1% acetic acid in 58% methanol was used.
【００４９】上記の方法に従ってクロダネカボチャとキ
ュウリの低温ストレス遭遇中の根の生長とポリアミン含
量を測定した。その結果を図１〜図４に示した。図１の
結果から、低温ストレス抵抗性が低いキュウリの根の生
長は１４℃の低温処理で顕著に阻害されたが、低温スト
レス抵抗性の高いクロダネカボチャの根の生長は２３℃
区よりやや劣る程度であった。図２の結果から、プトレ
シン濃度は２作物とも低温１４℃区で２３℃区より高い
値を示した。図３の結果から、スペルミジン濃度は２作
物とも低温１４℃区で２３℃区より高い値を示したが、
２３℃区との違いは低温ストレス抵抗性の高いクロダネ
カボチャの方が大きかった。図４の結果から、スペルミ
ン濃度はキュウリでは２３℃区の方が高い値を示したの
に対して、低温ストレス抵抗性の高いクロダネカボチャ
では低温処理６日目、９日目には１４℃区で２３℃区よ
り高い値を示した。Root growth and polyamine content of black squash and cucumber were measured according to the method described above during low temperature stress. The results are shown in FIGS. From the results of FIG. 1, the growth of cucumber roots with low low-temperature stress resistance was significantly inhibited by the low-temperature treatment at 14 ° C., whereas the growth of black squash pumpkin with high low-temperature stress resistance was 23 ° C.
It was slightly inferior to the ward. From the results in FIG. 2, the putrescine concentration of both crops was higher in the low-temperature 14 ° C. section than in the 23 ° C. section. From the results of FIG. 3, the spermidine concentration of both crops was higher in the low-temperature 14 ° C. section than in the 23 ° C. section,
The difference from the 23 ° C. section was greater for the black squash with higher resistance to low-temperature stress. From the results in FIG. 4, the spermine concentration showed a higher value in the 23 ° C. section in the cucumber, whereas the black squash with high resistance to the low temperature stress showed 14 ° C. on the 6th and 9th days of the low temperature treatment. In the plot, the value was higher than that in the 23 ° C plot.
【００５０】本実験の結果からポリアミン特にスペルミ
ジン、スペルミンが低温ストレス抵抗性の高いクロダネ
カボチャの根で低温１４℃区で２３℃区より高い値を示
すことが確認された。このことはクロダネカボチャの根
の低温ストレス抵抗性にポリアミンが密接に関係し、ポ
リアミンの量的変化が重要であることを示唆している。
低温ストレス抵抗性の高いクロダネカボチャの根におい
て低温１４℃区でポリアミン量が増加したのは、低温ス
トレス遭遇後、根のポリアミン生合成に関与するポリア
ミン代謝関連遺伝子の発現が誘導され、その結果として
ポリアミン代謝が活性化しポリアミン量が増加したもの
と推察される。From the results of this experiment, it was confirmed that polyamines, particularly spermidine and spermine, showed higher values in the low temperature 14 ° C section than in the 23 ° C section in black squash roots having high low temperature stress resistance. This suggests that polyamines are closely related to the low-temperature stress resistance of black squash roots, and that the quantitative changes of polyamines are important.
The increase in polyamine levels at 14 ° C in low temperature stress resistant black squash roots was caused by the expression of polyamine metabolism-related genes involved in root polyamine biosynthesis after low temperature stress. It is inferred that polyamine metabolism was activated and the amount of polyamine increased.
【００５１】実施例２：植物由来のポリアミン代謝関連
遺伝子のクローニング （１）ポリ（Ａ）+ＲＮＡの調製 クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche）をバ
ーミキュライトに播種し、子葉展開時に市販の床土（サ
ンサン床土；タキイ種苗社製）を詰めた鉢に移植した。
鉢上げしたクロダネカボチャを植物栽培用のインキュベ
ーター（気温昼２６℃／夜２２℃、１３時間日長）内に
置いた。第２本葉展開時にインキュベータ内の温度を昼
１８℃／夜１４℃まで下げ低温処理を開始した。低温処
理３日後に、根、茎、葉に分けてサンプリングした。Ｒ
ＮＡ抽出を行うまで−８０℃のフリーザーに保存した。Example 2 Cloning of Polyamine Metabolism-Related Gene Derived from Plant (1) Preparation of Poly (A) + RNA A black squash (Cucurbita ficifolia Bouche) was sown on vermiculite, and a commercial soil (Sansan) was used when cotyledons were developed. (Soil; Takii Seed Co., Ltd.).
The potted black squash was put in an incubator for plant cultivation (air temperature 26 ° C./night 22 ° C., 13 hours day length). During the development of the second true leaf, the temperature in the incubator was reduced to 18 ° C./14° C. at night to start the low-temperature treatment. Three days after the low-temperature treatment, sampling was performed separately for roots, stems, and leaves. R
It was stored in a -80 ° C freezer until NA extraction was performed.
【００５２】約４ｇのクロダネカボチャの根組織を直ち
に液体窒素中で凍結し、液体窒素存在下乳鉢で細かく粉
砕した。その後、１０ｍｌの抽出用０．２Ｍトリス−酢
酸緩衝液〔５Ｍ guanidine thiocyanate、０．７％ β
−mercaptoethanol、１％polyvinylpyrrolidone（分子
量360,000）、０．６２％ N−Lauroylsarcosine Sodi
um Salt；ｐＨ８．５）を加え、ポリトロンホモジナイ
ザー（KINEMATICA社製）を用いて氷冷下２分間粉砕し
た。ただし、β−メルカプトエタノールとポリビニルピ
ロリドンは使用する直前に添加した。その後、粉砕液を
17,000×ｇで２０分間遠心分離し、上清を回収した。Approximately 4 g of the root tissue of black squash was immediately frozen in liquid nitrogen and finely ground in a mortar in the presence of liquid nitrogen. Then, 10 ml of 0.2 M Tris-acetate buffer for extraction [5 M guanidine thiocyanate, 0.7% β
-Mercaptoethanol, 1% polyvinylpyrrolidone (360,000 molecular weight), 0.62% N-Lauroylsarcosine Sodi
um Salt; pH 8.5) and crushed for 2 minutes under ice-cooling using a Polytron homogenizer (manufactured by KINEMATICA). However, β-mercaptoethanol and polyvinylpyrrolidone were added immediately before use. After that, pulverized liquid
After centrifugation at 17,000 × g for 20 minutes, the supernatant was recovered.
【００５３】この上清をミラクロスに濾渦し、その濾液
を超遠心分離管に入れた５．７Ｍ塩化セシウム溶液１．
５ｍｌに静かに重層し、155,000×ｇ、２０℃で２０時間
遠心した後、上清を捨てＲＮＡの沈殿を回収した。この
沈殿を３ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ；ｐＨ８．０）に溶解し、
さらに等量のフェノール：クロロホルム：イソアミルア
ルコール（容積比、２５:２４:１）を加え良く混合した
後、遠心分離を行って上層の水層を回収した。得られた
水層に、１／１０倍量の３Ｍ酢酸ナトリウム（氷酢酸で
ｐＨ６．２に調製）と、２．５倍量のエタノールを添加
して良く混合し、−２０℃で一晩静置した。その後、1
7,000×ｇで２０分間遠心分離し、得られた沈殿を７０
％エタノールで洗浄して減圧乾燥した。The supernatant was filtered through a Miracloth, and the filtrate was placed in an ultracentrifuge tube of a 5.7 M cesium chloride solution.
After gently overlaying 5 ml, the mixture was centrifuged at 155,000 × g and 20 ° C. for 20 hours, and the supernatant was discarded to collect the RNA precipitate. The precipitate was washed with 3 ml of TE buffer (10 mM Tris-HC).
1, 1 mM EDTA · 2Na; pH 8.0)
Further, an equal amount of phenol: chloroform: isoamyl alcohol (volume ratio, 25: 24: 1) was added and mixed well, and then centrifuged to collect an upper aqueous layer. To the obtained aqueous layer, 1/10 volume of 3M sodium acetate (adjusted to pH 6.2 with glacial acetic acid) and 2.5 volume of ethanol are added, mixed well, and allowed to stand at -20 ° C overnight. Was placed. Then 1
After centrifugation at 7,000 × g for 20 minutes, the obtained precipitate was
% Ethanol and dried under reduced pressure.
【００５４】この乾燥標品を５００μｌの前述のＴＥ緩
衝液に溶解し、全ＲＮＡ溶液を得た。このＲＮＡ溶液を
６５℃で５分間インキュベートした後、氷上で急冷し
た。これに２×結合緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、１Ｍ ＮａＣｌ、０．５％
ＳＤＳ；ｐＨ７．５）を等量になるようにＲＮＡ溶液に
加え、平衡化緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ・２Ｎａ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．５％ Ｓ
ＤＳ；ｐＨ７．５）で予め平衡化したオリゴ（ｄＴ）セ
ルロースカラム（クローンテック社製）に重層した。次
いで、カラムを約１０倍量の上記平衡化緩衝液で洗浄し
た後、溶出緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ；ｐＨ７．５）でポリ(Ａ)+ＲＮＡを
溶出した。This dried sample was dissolved in 500 μl of the above-mentioned TE buffer to obtain a total RNA solution. After incubating the RNA solution at 65 ° C. for 5 minutes, it was quenched on ice. This was added to 2x binding buffer (10 mM Tris-HC).
1, 5 mM EDTA · 2Na, 1 M NaCl, 0.5%
SDS; pH 7.5) was added to the RNA solution to make an equal volume, and equilibration buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM
M EDTA · 2Na, 0.5M NaCl, 0.5% S
DS; pH 7.5) and overlaid on an oligo (dT) cellulose column (Clontech) previously equilibrated. Next, the column was washed with about 10 volumes of the above equilibration buffer, and then the elution buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM
Poly (A) + RNA was eluted with EDTA · 2Na; pH 7.5).
【００５５】得られた溶出液に１／１０倍量の前述の３
Ｍ酢酸ナトリウム水溶液と、２．５倍量のエタノールを
加え混合し、−７０℃で静置した。その後、10,000×ｇ
で遠心分離を行ない、得られた沈殿を７０％エタノール
で洗浄して減圧乾燥した。この乾燥標品を再度５００μ
lのＴＥ緩衝液に溶解し、オリゴ（ｄＴ）セルロースカ
ラム精製を繰り返し行った。得られた低温処理したクロ
ダネカボチャの根由来のポリ(Ａ)+ＲＮＡはＰＣＲ用の
ｃＤＮＡライブラリーと完全長遺伝子単離用のｃＤＮＡ
ライブラリーの作製に用いた。The obtained eluate was added to a 1 / 10-fold amount of the aforementioned 3
M sodium acetate aqueous solution and 2.5 times the amount of ethanol were added and mixed, and the mixture was allowed to stand at -70 ° C. Then 10,000 xg
The precipitate was washed with 70% ethanol and dried under reduced pressure. This dried sample is again
After dissolving in 1 l of TE buffer, oligo (dT) cellulose column purification was repeated. The resulting poly (A) + RNA derived from the cold-treated black squash root was a cDNA library for PCR and a cDNA for full-length gene isolation.
Used for library construction.
【００５６】（２）低温処理ＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラ
リーの作製 ｃＤＮＡライブラリーの作製はMarathon cDNA Amplific
ation Kit(クローンテック製）を使用した。（１）で得
られたクロダネカボチャの根由来のポリ(Ａ)+RNAを鋳型
として３’末端に２つのdegenerate nucleotide positi
on を持つ修飾lock-docking オリゴ（ｄＴ）プライマー
と逆転写酵素を用い、GublerとHoffmanらの方法（Gene,
25, 263-269 (1983)）に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成し
た。得られたｃＤＮＡの両末端にMarathon cDNAアダプ
ター（Ｔ４ ＤＮＡリガーゼにより２本鎖ｃＤＮＡの両
末端へ結合しやすくなるように５’末端をリン酸化した
もの）を連結した。得られたアダプター結合のｃＤＮＡ
をクロダネカボチャ根由来のＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラ
リーとした。(2) Preparation of cDNA Library for Low Temperature Treatment PCR The cDNA library was prepared by Marathon cDNA Amplific
ation Kit (Clontech) was used. Using the poly (A) + RNA derived from the root of black squash obtained in (1) as a template, two degenerate nucleotide positi
Using a modified lock-docking oligo (dT) primer with on and reverse transcriptase, the method of Gubler and Hoffman et al. (Gene,
25, 263-269 (1983)). To both ends of the obtained cDNA, a Marathon cDNA adapter (5'-end phosphorylated so as to be easily bound to both ends of a double-stranded cDNA by T4 DNA ligase) was ligated. The resulting adapter-bound cDNA
Was used as a cDNA library for PCR derived from black squash pumpkin root.
【００５７】（３）ＰＣＲ用プライマーの設計 既に植物や哺乳類から単離されているアルギンニン脱炭
酸酵素遺伝子、Ｓ−アデノシルメチオニン脱炭酸酵素遺
伝子、スペルミジン合成酵素遺伝子の決定されている塩
基配列を比較した。そして、非常に相同性が高く保存さ
れている領域を選び出し、ＤＮＡオリゴマーを合成した
（配列プライマーＩ〜VI）。 ＳＰＤＳプライマーＩ（配列番号９） 5'-GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3' ＳＰＤＳプライマーII（配列番号１０） 5'-GTGAATCTCAGCGTTGTA-3' ＳＡＭＤＣプライマーIII（配列番号１１） 5'−TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3' ＳＡＭＤＣプライマーIV（配列番号１２） 5'-GCTAAACCCATCTTCAGGGGT-3' ＡＤＣプライマーＶ（配列番号１３） 5'-GGGCT(T/G)GGA(G/A)T(G/C）GACTA(C/T）-3'（ミック
スプライマー） ＡＤＣプライマーVI（配列番号１４） 5'-(T/C)CC(A/G)TC(A/G)CTGTC(G/A)CA(G/C)GT-3'（ミッ
クスプライマー）(3) Design of primers for PCR Comparison of the nucleotide sequences of arginine decarboxylase gene, S-adenosylmethionine decarboxylase gene and spermidine synthase gene which have already been isolated from plants and mammals. did. Then, a region having extremely high homology and being conserved was selected, and a DNA oligomer was synthesized (sequence primers I to VI). SPDS primer I (SEQ ID NO: 9) 5'-GTTTTGGATGGAGTGATTCA-3 'SPDS primer II (SEQ ID NO: 10) 5'-GTGAATCTCAGCGTTGTA-3' SAMDC primer III (SEQ ID NO: 11) 5'-TATGTGCTGTCTGAGTCGAGC-3 'SAMDC primer IV (sequence No. 12) 5′-GCTAAACCCATCTTCAGGGGT-3 ′ ADC primer V (SEQ ID NO: 13) 5′-GGGCT (T / G) GGA (G / A) T (G / C) GACTA (C / T) -3 ′ (mix Primer) ADC primer VI (SEQ ID NO: 14) 5 '-(T / C) CC (A / G) TC (A / G) CTGTC (G / A) CA (G / C) GT-3' (mix primer)
【００５８】（４）ＰＣＲによる増幅 （２）で得られたＰＣＲ用ｃＤＮＡライブラリーをテン
プレートとして、（３）で設計した配列プライマーを用
いてＰＣＲを行った。ＰＣＲのステップは最初、９４
℃、３０秒、４５℃、１分間、７２℃、２分間で５サイ
クル行い、続いて９４℃、３０秒、５５℃、１分間、７
２℃、２分間で３０サイクル行った。 （５）アガロースゲル電気泳動 ＰＣＲ増幅産物を１．５％アガロース電気泳動を行い、
泳動後のゲルをエチジウムブロマイド染色し、ＵＶトラ
ンスイルミネーター上で増幅バンドを検出した。 （６）ＰＣＲ産物の確認と回収 検出された増幅バンドを確認し、カミソリの刃を用いて
アガロースゲルから切り出した。切り出したゲルを１．
５ｍｌのマイクロチューブに移し、QIAEXII Gel Extrac
tion Kit（QIAGEN社製）を用いてゲルからＤＮＡ断片を
単離精製を行った。回収したＤＮＡ断片をpGEMTクロー
ニングベクター（Promega社製）にサブクローニング
し、大腸菌に形質転換後、常法に従ってプラスミドＤＮ
Ａを調製した。 （７）塩基配列決定 得られたプラスミドの挿入配列の塩基配列決定をダイデ
オキシ法（Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-7
8, 1983）により行った。ＳＰＤＳ遺伝子については３
種類の遺伝子、ＳＡＭＤＣ遺伝子については１種類の遺
伝子、ＡＤＣ遺伝子については２種類の遺伝子が単離さ
れた。 （８）ホモロジー検索 これらの遺伝子の塩基配列を既知遺伝子塩基配列のデー
タベースとホモロジーサーチを行うと３種類のＳＰＤＳ
遺伝子は既知の植物由来のＳＰＤＳ遺伝子と７０％の相
同性を示した。１種類のＳＡＭＤＣ遺伝子については既
知の植物由来のＳＡＭＤＣ遺伝子と７０％以上の相同性
を示した。２種類のＡＤＣ遺伝子については既知の植物
由来のＡＤＣ遺伝子と６７％以上の相同性を示した。(4) Amplification by PCR Using the cDNA library for PCR obtained in (2) as a template, PCR was performed using the sequence primers designed in (3). The PCR step is initially 94
5 cycles of 30 ° C., 30 seconds, 45 ° C., 1 minute, 72 ° C., 2 minutes, followed by 94 ° C., 30 seconds, 55 ° C., 1 minute, 7
30 cycles were performed at 2 ° C. for 2 minutes. (5) Agarose gel electrophoresis The PCR amplification product was subjected to 1.5% agarose electrophoresis,
The gel after electrophoresis was stained with ethidium bromide, and an amplified band was detected on a UV transilluminator. (6) Confirmation and recovery of PCR product The amplified band detected was confirmed and cut out from the agarose gel using a razor blade. 1. Cut the cut gel.
Transfer to a 5 ml microtube and use QIAEXII Gel Extrac
The DNA fragment was isolated and purified from the gel using the tion Kit (manufactured by QIAGEN). The recovered DNA fragment was subcloned into a pGEMT cloning vector (manufactured by Promega) and transformed into E. coli, followed by plasmid DN
A was prepared. (7) Determination of nucleotide sequence The nucleotide sequence of the inserted sequence of the obtained plasmid was determined by the dideoxy method (Messing, Methods in Enzymol., 101, 20-7).
8, 1983). 3 for SPDS gene
One kind of gene, one kind of SAMDC gene, and two kinds of ADC gene were isolated. (8) Homology search By performing a homology search on the base sequences of these genes with a database of known gene base sequences, three types of SPDS
The gene showed 70% homology with the known plant-derived SPDS gene. One type of SAMDC gene showed 70% or more homology with a known plant-derived SAMDC gene. The two types of ADC genes showed 67% or more homology with known plant-derived ADC genes.
【００５９】（９）ノザンブロット解析 これらの遺伝子が低温ストレス抵抗性を示す根組織で低
温ストレス遭遇時に発現量が変化していることを確かめ
るために、ノザンブロッティングを下記に示す様にして
行った。１４℃で６日間の低温ストレス処理を行ったク
ロダネカボチャの根、茎、葉と２３℃で６日間の適温処
理を行ったクロダネカボチャの根、茎、葉からＲＮＡを
抽出した。ＲＮＡ抽出方法は実験例２のようにして行っ
た。得られたtotal ＲＮＡ１０μｇを１．５％ホルムア
ルデヒドアガロースゲルで電気泳動した後、ハイボンド
Ｎ+ナイロンメンブランに一晩ブロッティングした。Ｕ
ＶクロスリンカーでＲＮＡを固定した後、プレハイブリ
ダイゼーション用緩衝液(５０％ Formamide、５×ＳＳ
ＰＥ、５×Denhardt's液、 ０．１％ＳＤＳ、８０μｇ／
ｍｌ サケ***ＤＮＡ；ｐＨ７．０)で、４２℃、２時
間プレハイブリダイゼーションを行った。ＰＣＲで得ら
れた６種類のｃＤＮＡを32Ｐ-ｄＣＴＰとランダムラベ
ルキット（アマシャム社製）を用いて、プローブを作製
した。このプローブをプレハイブリダイゼーションに加
え、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハ
イブリダイゼーション後、メンブランを２×ＳＳＣ,
０．１％ＳＤＳを含む洗浄液からスタートし、最終的に
は０．１×ＳＳＣ,０．１％ＳＤＳを含む洗浄液で５０
℃、３０分、２回まで洗浄した。メンブランをＸ線フィ
ルム(コダック社製)を用いて、オートラジオグラフィー
をとった。(9) Northern Blot Analysis Northern blotting was performed as shown below to confirm that the expression levels of these genes changed in low-temperature stress-resistant root tissues upon encountering low-temperature stress. RNA was extracted from the roots, stems, and leaves of black squash subjected to low-temperature stress treatment at 14 ° C. for 6 days and from the roots, stems, and leaves of black squash squash treated at 23 ° C. for 6 days. The RNA extraction method was performed as in Experimental Example 2. 10 μg of the obtained total RNA was electrophoresed on a 1.5% formaldehyde agarose gel, and then blotted on a Hybond N + nylon membrane overnight. U
After immobilizing RNA with V crosslinker, buffer for prehybridization (50% Formamide, 5 × SS
PE, 5 × Denhardt's solution, 0.1% SDS, 80 μg /
ml salmon sperm DNA; pH 7.0) at 42 ° C for 2 hours. Probes were prepared from the six types of cDNAs obtained by PCR using 32 P-dCTP and a random label kit (manufactured by Amersham). This probe was added to the prehybridization, and hybridization was performed at 42 ° C. overnight. After hybridization, the membrane was washed with 2 × SSC,
Starting with a washing solution containing 0.1% SDS, finally, a washing solution containing 0.1 × SSC and 0.1% SDS is used.
Washed twice at 30 ° C. for 30 minutes. The membrane was autoradiographed using an X-ray film (Kodak).
【００６０】ノザンブロッティングの結果を図５、図
６、図７に示した。図５の結果から、取得した３種類の
ＳＰＤＳ遺伝子のうちの一つが低温ストレス抵抗性の高
い根組織において１４℃の低温ストレス処理によってそ
の発現量が増加し、低温ストレス抵抗性が低い茎、葉組
織では１４℃の低温ストレス処理によってＳＰＤＳ遺伝
子の発現量は有意に増加しなかった。図６の結果から、
取得した１種類のＳＡＭＤＣ遺伝子が低温ストレス抵抗
性の高い根組織において１４℃の低温ストレス処理によ
ってその発現量が増加し、低温ストレス抵抗性が低い
茎、葉組織では１４℃の低温ストレス処理によってＳＡ
ＭＤＣ遺伝子の発現量は有意に増加しなかった。図７の
結果から、取得した２種類のＡＤＣ遺伝子のうちの一つ
が低温ストレス抵抗性の高い根組織において１４℃の低
温ストレス処理によってその発現量が増加し、低温スト
レス抵抗性が低い茎、葉組織では１４℃の低温ストレス
処理によってＡＤＣ遺伝子の発現量は有意に増加しなか
った。The results of Northern blotting are shown in FIGS. 5, 6, and 7. From the results of FIG. 5, it is found that the expression of one of the three types of SPDS genes obtained by the low-temperature stress treatment at 14 ° C. in the root tissue having high low-temperature stress resistance was increased by the low-temperature stress treatment at 14 ° C. In the tissues, the expression level of the SPDS gene did not significantly increase by the low-temperature stress treatment at 14 ° C. From the results in FIG.
The expression level of one type of the obtained SAMDC gene is increased by low-temperature stress treatment at 14 ° C. in root tissues having high low-temperature stress resistance, and is increased by low-temperature stress treatment at 14 ° C. in stem and leaf tissues having low low-temperature stress resistance.
The expression level of the MDC gene did not increase significantly. From the results of FIG. 7, it is found that the expression level of one of the obtained two types of ADC genes is increased by the low-temperature stress treatment at 14 ° C. in the root tissue having high low-temperature stress resistance, and stems and leaves having low low-temperature stress resistance are obtained. In the tissue, the expression level of the ADC gene was not significantly increased by the low-temperature stress treatment at 14 ° C.
【００６１】以上の結果から、上記３つのポリアミン代
謝関連酵素遺伝子は低温ストレス抵抗性が高いクロダネ
カボチャの根組織で低温ストレス時に特異的に発現量が
高まる遺伝子であり、低温ストレス抵抗性に密接に関与
する遺伝子であると考えられる。本結果と実施例１の結
果からクロダネカボチャの根では低温ストレス遭遇によ
って特異的なＳＰＤＳ遺伝子やＳＡＭＤＣ遺伝子、ＡＤ
Ｃ遺伝子などのポリアミン代謝関連遺伝子の発現量が高
まりポリアミン代謝が活性化し、スペルミジンやスペル
ミン等のポリアミンの含量が増加した。低温ストレス遭
遇時にポリアミン量が増加したことによって根の低温ス
トレスに対する抵抗性が増強したと考えることができ
る。上記の３種類のポリアミン代謝関連遺伝子は低温ス
トレス抵抗性に関与する遺伝子であり、ＳＰＤＳ遺伝子
はＣｆＳＰＤ１、ＳＡＭＤＣ遺伝子はＣｆＳＡＭ１（配
列番号３，４）、ＡＤＣ遺伝子はＣｆＡＤＣ１（配列番
号５，６）と命名した。From the above results, the above-mentioned three polyamine metabolism-related enzyme genes are genes whose expression levels are specifically increased at the time of low-temperature stress in the root tissue of black squash pumpkin having high low-temperature stress resistance, and are closely related to low-temperature stress resistance. Is thought to be a gene involved in From this result and the result of Example 1, in the root of the squash pumpkin, specific SPDS gene, SAMDC gene, AD
The expression level of polyamine metabolism-related genes such as the C gene was increased, polyamine metabolism was activated, and the content of polyamines such as spermidine and spermine was increased. It can be considered that the resistance of the roots to low-temperature stress was enhanced by the increase in the amount of polyamine when the low-temperature stress was encountered. The above three types of polyamine metabolism-related genes are genes involved in low-temperature stress resistance. The SPDS gene is CfSPD1, the SAMDC gene is CfSAM1 (SEQ ID NOS: 3 and 4), and the ADC gene is CfADC1 (SEQ ID NOs: 5 and 6). Named.
【００６２】（１０）完全長遺伝子の取得 完全長遺伝子はプラークハイブリダイゼーション法で取
得した。ｃＤＮＡライブラリーの作製はZAP-cDNA Synth
esis Kit(stratagene社製）を使用した。（１）で得ら
れたクロダネカボチャ根由来のポリ(Ａ)+ＲＮＡを鋳型
としてオリゴ（ｄＴ）プライマーと逆転写酵素を用い、
GublerとHoffmanらの方法（Gene, 25, 263-269 (198
3)）に従い２本鎖ｃＤＮＡを合成した。(10) Acquisition of full-length gene The full-length gene was obtained by the plaque hybridization method. Preparation of cDNA library by ZAP-cDNA Synth
esis Kit (manufactured by Stratagene) was used. Using oligo (dT) primer and reverse transcriptase with poly (A) + RNA derived from black squash root obtained in (1) as a template,
Gubler and Hoffman et al. (Gene, 25, 263-269 (198
According to 3)), double-stranded cDNA was synthesized.
【００６３】得られたｃＤＮＡの両末端にEcoRIアダプ
ター（内部にXhoIとSpeIサイトを持つ）を連結し、XhoI
で消化した後、それをλファージベクター、λZAPIIア
ームのEcoRIとXhoI部位に連結後、インビトロパッケー
ジングキット（Stratagene社製、GIGAPACK Gold）を用
い、パッケージングを行い、大腸菌SURE株（ＯＤ660＝
０．５）に感染させることにより多数の組換えλファー
ジを得た。これをクロダネカボチャ根由来のｃＤＮＡラ
イブラリーとした。このライブラリーのサイズは８．０
×１０6であった。An EcoRI adapter (with internal XhoI and SpeI sites) was ligated to both ends of the obtained cDNA.
Ligated to the λ phage vector, the EcoRI and XhoI sites of the λZAPII arm, and packaged using an in vitro packaging kit (Stratagene, GIGAPACK Gold) to obtain the E. coli SURE strain (OD660 =
0.5), a large number of recombinant λ phages were obtained. This was used as a cDNA library derived from black squash root. The size of this library is 8.0
× 10 6 .
【００６４】プローブの作製は（６）で調製したＳＰＤ
Ｓ遺伝子とＳＡＭＤＣ遺伝子のプラスミドＤＮＡからイ
ンサートｃＤＮＡを単離・調製し、得られたｃＤＮＡを
鋳型として、Random Primed DNA Labeling Kit（ＵＳＢ
社製）を用いて、32Ｐ標識プローブを作製した。得られ
た32Ｐ標識ｃＤＮＡをプローブに用いた。前記、クロダ
ネカボチャ根由来のｃＤＮＡライブラリーを構成するフ
ァージを大腸菌に感染させてＬＢ寒天培地上で増殖さ
せ、約50,000個のファージＤＮＡをナイロンメンブレン
（ハイボンド−Ｎ+、アマシャム社製）に写し取った。
ファージＤＮＡを写し取ったナイロンメンブレンをアル
カリ変性液（０．５ＭＮａＯＨ、１．５Ｍ ＮａＣｌ）を
含んだ濾紙上に移し、４分間放置し、次に中和液（０．
５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５Ｍ ＮａＣｌ；ｐＨ８．
０）を含んだ濾紙上に移し５分間放置した。２×ＳＳＣ
（０．３Ｍ ＮａＣｌ、０．０３Ｍクエン酸三ナトリウ
ム）で洗浄した後、メンブレンをストラタリンカー（st
ratagene社製）を用いＤＮＡの固定を行った。固定処理
を行ったナイロンメンブレンをハイブリダイゼーション
溶液（５０％ホルムアミド、０．５％ＳＤＳ、６×ＳＳ
ＰＥ（３Ｍ ＮａＣｌ、０．２Ｍ ＮａＨ2ＰＯ4、２０ｍＭ
ＥＤＴＡ・２Ｎａ；ｐＨ７．４）、５×Denhard's溶液
（０．１％ Ficoll、０．１％ Polyvinylpyrrolidon
e、０．１％ bovine serum albumin）、５０μｇ／ｍｌ
変性サケ***ＤＮＡを含有）中において、４２℃で３時
間プレハイブリさせ、作製したｃＤＮＡプローブを加え
４２℃で１８時間ハイブリダイズさせた。その後、メン
ブレンを取り出し、２×ＳＳＣ、１×ＳＳＣ、０．５×Ｓ
ＳＣおよび０．１×ＳＳＣを含有する溶液を用いて、４
２℃で１〜2時間洗浄した。このメンブレンを乾燥した
後、Ｘ線フィルムを密着させて一晩感光させた。その結
果、ＳＰＤＳ遺伝子及びＳＡＭＤＣ遺伝子の断片から得
たプローブでハイブリダイズした陽性クローンを選抜す
ることができた。The preparation of the probe was performed using the SPD prepared in (6).
Insert cDNA is isolated and prepared from plasmid DNA of S gene and SAMDC gene, and Random Primed DNA Labeling Kit (USB
Using company Ltd.) to prepare a 32 P-labeled probe. The obtained 32 P-labeled cDNA was used as a probe. Wherein, Cucurbita ficifolia root-derived phage which constitute the cDNA library were infected into E. coli were grown on LB agar medium, Utsushito' about 50,000 phage DNA to a nylon membrane (Hybond -N +, Amersham) Was.
The nylon membrane on which the phage DNA was copied was transferred onto a filter paper containing an alkali denaturing solution (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl), allowed to stand for 4 minutes, and then neutralized (0.
5M Tris-HCl, 1.5M NaCl; pH8.
It was transferred onto a filter paper containing 0) and left for 5 minutes. 2 x SSC
(0.3 M NaCl, 0.03 M trisodium citrate), and then washed the membrane with a stratalinker (st
(made by ratagene). The immobilized nylon membrane was mixed with a hybridization solution (50% formamide, 0.5% SDS, 6 × SS).
PE (3 M NaCl, 0.2 M NaH 2 PO 4 , 20 mM
EDTA · 2Na; pH 7.4), 5 × Denhard's solution (0.1% Ficoll, 0.1% Polyvinylpyrrolidon)
e, 0.1% bovine serum albumin), 50 μg / ml
(Containing denatured salmon sperm DNA) at 42 ° C for 3 hours, and the prepared cDNA probe was added thereto, followed by hybridization at 42 ° C for 18 hours. After that, the membrane is taken out, 2 × SSC, 1 × SSC, 0.5 × S
Using a solution containing SC and 0.1 × SSC, 4
Washed at 2 ° C. for 1-2 hours. After drying this membrane, an X-ray film was brought into close contact and exposed overnight. As a result, a positive clone hybridized with a probe obtained from a fragment of the SPDS gene and the SAMDC gene could be selected.
【００６５】陽性クローンのファージＤＮＡそれぞれか
ら、インビボ・エクシジョン法によりｃＤＮＡインサー
トを持つプラスミドクローンを調製した。インビボ・エ
クシジョン法は、ZAP-cDNA Synthesis Kit(stratagene
社製）の方法に従った。ＳＰＤＳ遺伝子およびＳＡＭＤ
Ｃ遺伝子断片を含むファージ液２００μｌ、大腸菌XL1-
Blue懸濁液２００μｌ、ヘルパーファージＲ４０８懸濁
液１μｌを混ぜ３７℃で１５分間インキュベートした
後、３ｍｌの２×ＹＴ培地を加え３７℃で２時間振蘯培
養し、７０℃で２０分間処理し、遠心分離（4,000×ｇ、
１０分間）して上清を回収した。得られた上清３０μｌ
と大腸菌SURE懸濁液３０μｌを混ぜ、３７℃で１５分間
インキュベートした後、アンピシリンを５０ppm含むＬ
Ｂ寒天培地に数μｌ植菌し、３７℃で一晩培養した。コ
ロニーを形成した大腸菌は、ｃＤＮＡインサートを持つ
プラスミドクローンを含んでいた。これらのプラスミド
の挿入配列の塩基配列決定を、ダイデオキシ法（Messin
g, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983）により
行った。その結果、開始コドンを含むプラスミドである
ことが明らかとなった。From each of the phage DNAs of the positive clones, a plasmid clone having a cDNA insert was prepared by the in vivo excision method. The in vivo excision method uses the ZAP-cDNA Synthesis Kit (stratagene
Company's method). SPDS gene and SAMD
200 μl of phage solution containing C gene fragment, E. coli XL1-
After mixing 200 μl of the Blue suspension and 1 μl of the helper phage R408 suspension and incubating at 37 ° C. for 15 minutes, 3 ml of 2 × YT medium was added, and the cells were cultured with shaking at 37 ° C. for 2 hours and treated at 70 ° C. for 20 minutes. Centrifugation (4,000 × g,
10 minutes) and the supernatant was collected. 30 μl of the obtained supernatant
And 30 μl of Escherichia coli SURE suspension, incubated at 37 ° C. for 15 minutes, and then added L containing 50 ppm of ampicillin.
Several μl of the cells were inoculated on a B agar medium and cultured at 37 ° C. overnight. E. coli that formed a colony contained a plasmid clone with a cDNA insert. The nucleotide sequence of the inserted sequence of these plasmids was determined by the dideoxy method (Messin method).
g, Methods in Enzymol., 101, 20-78, 1983). As a result, it was revealed that the plasmid contained an initiation codon.
【００６６】得られた完全長のクロダネカボチャ由来の
スペルミジン合成酵素遺伝子をＦＳＰＤ１（配列番号
１，２）、Ｓ−アデンシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子
をＦＳＡＭ２４（配列番号７，８）と命名した。得られ
たＦＳＰＤ１と既知の植物由来のスペルミジン合成酵素
遺伝子とアミノ酸比較を行った（表１）。表１の結果か
らクロダネカボチャ根由来のＦＳＰＤ１は他の植物由来
のＳＰＤＳ遺伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示し
た。The resulting full-length sperm pumpkin-derived spermidine synthase gene was designated as FSPD1 (SEQ ID NOS: 1 and 2), and the S-addensylmethionine decarboxylase gene was designated as FSAM24 (SEQ ID NOs: 7 and 8). An amino acid comparison was performed between the obtained FSPD1 and a known plant-derived spermidine synthase gene (Table 1). From the results in Table 1, FSPD1 derived from black squash root showed high homology at the amino acid level with SPDS genes derived from other plants.
【００６７】[0067]
【表１】 [Table 1]
【００６８】得られたＦＳＡＭ２４と既知の植物由来の
Ｓ−アデンシルメチオニン脱炭酸酵素遺伝子とアミノ酸
比較を行った（表２）。表２の結果からクロダネカボチ
ャ根由来のＦＳＡＭ２４は他の植物由来のＳＡＭＤＣ遺
伝子とアミノ酸レベルで高い相同性を示した。The obtained FSAM24 was compared with an amino acid of a known plant-derived S-adensylmethionine decarboxylase gene (Table 2). From the results in Table 2, FSAM24 derived from black squash root showed high homology at the amino acid level with the SAMDC gene derived from other plants.
【００６９】[0069]
【表２】 [Table 2]
【００７０】実施例３：トランスジェニックシロイヌナ
ズナの作製 （１）プラスミドの構築 配列番号１に示したポリアミン代謝関連酵素遺伝子ＦＳ
ＰＤ１の塩基配列よりオープンリーディングフレームを
すべて含むようにNotIで切断、配列番号７に示したポリ
アミン代謝関連酵素遺伝子ＦＳＡＭ２４の塩基配列より
オープンリーディングフレームをすべて含むようにXhoI
で切断し、それぞれ平滑末端化した。この断片を平滑末
端化した３５Ｓプロモーターが連結しているバイナリー
ベクターpBI101−Hm2にサブクローニングした。このプ
ラスミドをpBI35S−FSPD1、pBI35S−FSAM24と命名し
た。なお、形質転換された大腸菌エシェリヒア・コリ
（Escherichia coli）JM109を、エシェリヒア・コリJM1
09／pBI35S−FSPD1、エシェリヒア・コリJM109／pBI35S
− FSAM24と命名した。Example 3: Preparation of transgenic Arabidopsis thaliana (1) Construction of plasmid Polyamine metabolism-related enzyme gene FS shown in SEQ ID NO: 1
Cleavage with NotI to include the entire open reading frame from the nucleotide sequence of PD1, XhoI to include all of the open reading frame from the nucleotide sequence of the polyamine metabolism-related enzyme gene FSAM24 shown in SEQ ID NO: 7
And blunt-ended. This fragment was subcloned into a binary vector pBI101-Hm2 to which a blunt-ended 35S promoter was ligated. This plasmid was named pBI35S-FSPD1, pBI35S-FSAM24. The transformed Escherichia coli JM109 was replaced with Escherichia coli JM1.
09 / pBI35S-FSPD1, Escherichia coli JM109 / pBI35S
-Named FSAM24.
【００７１】（２）プラスミドのアグロバクテリウムへ
の導入 （１）で得られた大腸菌pBI35S−FSPD1、pBI35S− FSAM
24とヘルパープラスミドpRK2013を持つ大腸菌HB101株
を、それぞれ５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培
地で３７℃で１晩、アグロバクテリウムEHA101株を５０
ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むＬＢ培地で３７℃で２晩
培養した。各培養液１．５ｍｌをエッペンドルフチュー
ブに取り集菌した後、ＬＢ培地で洗浄した。これらの菌
体を１ｍｌのＬＢ培地に懸濁後、３種の菌を１００μｌ
ずつ混合し、ＬＢ培地寒天培地にまき、２８℃で培養し
てプラスミドをアグロバクテリウムに接合伝達させた。
１〜２日後に一部を白金耳でかきとり、５０ｍｇ／Ｌカ
ナマイシン、２０ｍｇ／Ｌハイグロマイシン、２５ｍｇ
／Ｌクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天培地上に塗布
した。２８#Cで２日間培養した後、単一コロニーを選択
した。得られた形質転換体をEHA101／pBI35S−FSPD1、E
HA101／pBI35S− FSAM24と命名した。(2) Introduction of plasmid into Agrobacterium Escherichia coli pBI35S-FSPD1, pBI35S-FSAM obtained in (1)
E. coli HB101 harboring 24 and the helper plasmid pRK2013 were incubated overnight at 37 ° C. in an LB medium containing 50 mg / L kanamycin at 50 ° C. overnight.
The cells were cultured at 37 ° C. for 2 nights in an LB medium containing mg / L kanamycin. After 1.5 ml of each culture solution was collected in an Eppendorf tube and collected, the cells were washed with an LB medium. After suspending these cells in 1 ml of LB medium, 100 μl of the three kinds of cells were added.
Each was mixed, spread on an LB medium agar medium, and cultured at 28 ° C. to conjugatively transfer the plasmid to Agrobacterium.
After 1-2 days, a portion was scraped with a platinum loop, and 50 mg / L kanamycin, 20 mg / L hygromycin, 25 mg
Was spread on LB agar medium containing / L chloramphenicol. After 2 days of culture at 28 # C, a single colony was selected. The obtained transformant was transformed into EHA101 / pBI35S-FSPD1, E
HA101 / pBI35S-named FSAM24.
【００７２】（３）無菌シロイヌナズナの栽培 シロイヌナズナWassilewskija株（以下、ＷＳ株と称
す）の種子（大阪大学：新名惇彦博士より提供）数１０
粒を１．５ｍｌチューブに入れ、７０％エタノール１ml
を加え３分間放置した。続いて滅菌液（５％次亜塩素酸
ナトリウム、０．０２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）に３
分間浸し、滅菌水で５回洗浄した後に、ＭＳＯプレート
（ムラシゲ−スクーグ無機塩類４．６ｇ、ショ糖１０
ｇ、１０００×ビタミンストック液１ｍｌ／Ｌ；ｐＨ
６．２）に置床した。このプレートを４℃に２日間放置
して低温処理を行い、続いて植物インキュベーター（サ
ンヨー製、ＭＬＲ−３５０ＨＴ）中に２２℃、光強度６
０００ルクス、長日条件下（明期１６時間、暗期８時
間）にて、２１日間培養した。感染効率を上げるために
再度植物を無菌的に引き抜いて、新たなＭＳＯプレート
の表面に根を広げ、さらに２日間培養を続けた。(3) Cultivation of sterile Arabidopsis thaliana Seeds of Arabidopsis thaliana Wassilewskija strain (hereinafter referred to as WS strain) (provided by Dr. Atsushi Ninamea, Osaka University) Number 10
Put the granules in a 1.5 ml tube and add 1 ml of 70% ethanol
Was added and left for 3 minutes. Then, add 3% to sterile solution (5% sodium hypochlorite, 0.02% Triton X-100).
After immersion for 5 minutes and washing 5 times with sterile water, the MSO plate (Murashige-Skoog inorganic salts 4.6 g, sucrose 10
g, 1000 × vitamin stock solution 1 ml / L; pH
6.2). The plate was left at 4 ° C. for 2 days to perform a low-temperature treatment, and then placed in a plant incubator (manufactured by Sanyo, MLR-350HT) at 22 ° C. and a light intensity of 6 ° C.
The cells were cultured for 21 days under the conditions of 000 lux and a long day (light 16 hours, dark 8 hours). The plant was again aseptically extracted to increase the infection efficiency, the roots were spread on the surface of a new MSO plate, and the culture was continued for another 2 days.
【００７３】（４）アグロバクテリウムの感染 前記で２１日間培養したＷＳ株の根を数株ずつそろえ
て、メスで１．５〜２．０ｃｍ程度に切りそろえ、ＣＩ
Ｍプレート（ＭＳＯプレートに２，４−ジクロロフェノ
キシ酢酸を終濃度０．５μｇ／ｍｌ、カイネチンを０．
０５μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に置き並べ
た。光強度３０００ルクス、１６時間明期、８時間暗期
で２日間培養し、ＭＳ希釈液（ムラシゲ−スクーグ無機
塩類６．４ｇ／Ｌ、ｐＨ６．３）で３倍に希釈したもの
をそれぞれ１ｍｌずつチューブに分注し、この中にカル
ス化した根の切片を１０分間浸した。２枚重ねた滅菌ろ
紙上に並べ、余分な水分を除き、新しいＣＩＭプレート
に各々置き並べた。同条件にて２日間共存培養した。(4) Infection of Agrobacterium The roots of the WS strain cultured for 21 days as described above were prepared by several strains, cut to about 1.5 to 2.0 cm with a scalpel, and
M plate (MSO plate: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid: 0.5 μg / ml final concentration;
05 μg / ml). The cells were cultured for 2 days at a light intensity of 3,000 lux, 16 hours of light, and 8 hours of dark, and 3 times diluted with MS diluent (Murashige-Skoog inorganic salts 6.4 g / L, pH 6.3), 1 ml each. The tube was dispensed, and the callus root section was immersed in the tube for 10 minutes. They were placed on two stacked sterile filter papers to remove excess water, and placed on a new CIM plate. Co-culture was performed under the same conditions for 2 days.
【００７４】（５）除菌 各々の菌株が肉眼で観察できるまで十分に増殖した切片
を除菌液（ＭＳ希釈液にクラフォランを終濃度２００μ
ｇ／ｍｌになるように加えたもの）に移し、ゆっくりと
振蘯させて６０分間洗浄した。この操作を５回繰り返し
た後、滅菌ろ紙上で水分を取り除き、ＳＩＭＣプレート
（ＭＳＯプレートに、２−ｉｐを終濃度５μｇ／ｍｌ、
ＩＡＡを終濃度０．１５μｇ／ｍｌ、クラフォランを終
濃度５００μｇ／ｍｌとなるように加えたもの）に置き
並べ、光強度６０００ルクス、１６時間明期、８時間暗
期で２日間培養した。(5) Eradication A section in which each strain was sufficiently grown until it could be observed with the naked eye was subjected to an eradication solution (claforan in MS diluent at a final concentration of 200 μl).
g / ml) and shaken slowly to wash for 60 minutes. After repeating this operation 5 times, the moisture was removed on sterile filter paper, and the SIMC plate (2-ip was added to an MSO plate at a final concentration of 5 μg / ml,
IAA was added to a final concentration of 0.15 μg / ml and claforan was added to a final concentration of 500 μg / ml), and the cells were cultured at a light intensity of 6000 lux, 16 hours of light, and 8 hours of dark for 2 days.
【００７５】（６）形質転換植物の選択 前記で２日間培養した切片をＳＩＭＣＳプレート（ＳＩ
ＭＣプレートにハイグロマイシンＢを終濃度４．６Ｕ／
ｍｌとなるように加えたもの）に移植し、光強度６００
０ルクス、１６時間明期、８時間暗期で培養した。以
後、１週間毎に新しいＳＩＭＣＳプレートに移植した。
形質転換した切片は増殖を続け、ドーム状に盛り上がっ
たカルスとなるが、非形質転換体は褐変した。形質転換
体は約２週間後カルスが緑色を呈し、約１カ月後葉が形
成され、その後ロゼット葉となった。(6) Selection of Transformed Plant The section cultured for 2 days as described above was placed on a SIMCS plate (SI
Hygromycin B was added to the MC plate at a final concentration of 4.6 U /
ml) and transplanted to a light intensity of 600
The cells were cultured at 0 lux, 16 hours light, and 8 hours dark. Thereafter, the cells were transplanted to new SIMCS plates every week.
The transformed sections continued to grow and became callus raised in a dome shape, while non-transformants turned brown. In the transformant, the callus became green after about two weeks, leaves formed about one month later, and then rosette leaves.
【００７６】（７）形質転換植物の再生 ロゼット葉となった植物体の根本を、カルス部分を含ま
ないように剃刃もしくはメスで切り取り、ＲＩＭプレー
トに軽く乗せるように挿した。８〜１０日後、１〜２ｃ
ｍ程度の根が数本形成したものをピンセットで無機塩類
培地〔５ｍＭＫＮＯ3、２．５ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）、２ｍＭ ＭｇＳＯ4、２ｍＭ Ｃａ
（ＮＯ3）2、５０μＭ Ｆｅ−ＥＤＴＡ、１０００×微
量要素（７０ｍＭ Ｈ３ＢＯ3、１４ｍＭ ＭｎＣｌ2、
０．５ｍＭ ＣｕＳＯ4、１ｍＭＺｎＳＯ4、０．２ｍＭ
ＮａＭｏＯ4、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０１ｍＭ
ＣｏＣｌ2）１ｍｌ／Ｌ〕に浸したロックウールミニポ
ット（日東紡績社製）に定植し、培養した。開花し、さ
や形成後は、バーライトとバーミキュライト（ＴＥＳ社
製）を１：１に混合し、無機塩類混合培地に浸した土に
植え換えた。約１カ月後、１株につき数百粒の種子が得
られた。これを以後Ｔ２種子と称す。(7) Regeneration of Transformed Plants The roots of the plants that had become rosette leaves were cut off with a razor or scalpel so as not to contain callus parts, and inserted so as to be lightly placed on an RIM plate. 8-10 days later, 1-2c
m roots were formed with an inorganic salt medium [5 mM KNO 3 , 2.5 mM K-phosphate buffer (pH 5.5), 2 mM MgSO 4 , 2 mM Ca]
(NO 3 ) 2 , 50 μM Fe-EDTA, 1000 × trace elements (70 mM H3BO 3 , 14 mM MnCl 2 ,
0.5mM CuSO 4, 1mMZnSO 4, 0.2mM
NaMoO 4 , 10 mM NaCl, 0.01 mM
(CoCl 2 ) 1 ml / L] and planted and cultured in a rock wool minipot (manufactured by Nitto Boseki Co., Ltd.). After flowering and pod formation, barlite and vermiculite (manufactured by TES) were mixed at a ratio of 1: 1 and replanted in soil soaked in a mixed medium of inorganic salts. After about one month, several hundred seeds per strain were obtained. This is hereinafter referred to as T2 seed.
【００７７】（８）抗生物質耐性株の取得 Ｔ２種子約１００粒を（３）と同様の方法で滅菌し、Ｍ
ＳＨプレートに播種した。ほぼ３：１の割合でハイグロ
マイシンＢ耐性株が発芽した。(8) Acquisition of antibiotic-resistant strain About 100 T2 seeds were sterilized in the same manner as in (3), and M
Seeded on SH plate. Hygromycin B resistant strains germinated at a ratio of approximately 3: 1.
【００７８】（９）ＤＮＡ抽出とサザンハイブリダイゼ
ーション 前記で発芽したＴ２種子を無機塩類培地に浸したロック
ウールミニポットにピンセットで移植し、光強度６００
０ルクス、１６時間明期、８時間暗期、２２℃の条件下
で培養した。２週間後、ロックウールの表面をナイフで
撫でるようにメスで地上部を切り取り、直ちに液体窒素
で凍結した。これを液体窒素存在下乳鉢で細かく粉砕
し、１ｇ当たり３ｍｌのＤＮＡ抽出用緩衝液〔２００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ Ｅ
ＤＴＡ−２Ｎａ、１％ Ｎ−ラウロイルサルコシンナト
リウム、１００μｇ／ｍｌ proteinase K〕を加え十分
撹拌した。６０℃、１時間インキュベート後、遠心分離
（10,000×ｇ、１０分間）し上清をミラクロスで濾渦し
新しいチューブに移した。フェノール：クロロフォル
ム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）抽出を３
回行なった後、エタノール沈殿を行った。沈殿をＴＥ緩
衝液に溶解した。それぞれ植物体約２．０ｇから、２０
μｇずつのゲノムＤＮＡが得られた。このうち１μｇの
ＤＮＡを用いて、それぞれを制限酵素EcoRI、HindIIIで
切断し、１％アガロース電気泳動及びサザンハイブリダ
イゼーションに供した。また、形質転換を行っていない
ＷＳ株の種子を発芽、生育させ、植物体より、同様にＤ
ＮＡを抽出し、制限酵素EcoRI、HindIIIによる消化を行
ない、１％アガロースゲル電気泳動及びサザンハイブリ
ダイゼーションに供した。ハイブリダイゼーション用プ
ローブはpCfSPD1、pCfSAM1を用いた。サザンハイブリダ
イゼーションは、モレキュラー・クローニング，ア・ラ
ボラトリー・マニュアル（Molecular Cloning，a Labor
atory Manual）、第９章、第３１〜５８頁〔コールド・
スプリング・ハーバー（Cold Spring Harber）社、１９
８９年刊〕に記載の方法に従って行った。すなわち、そ
れぞれのＤＮＡ試料について１％アガロースゲル電気泳
動を行い、泳動後、アルカリ変性を行いナイロンメンブ
レン（ハイボンド−Ｎ+、アマシャム社製）に一晩サザ
ンブロットした。紫外線トランスイルミネーター（２５
４ｎｍ）に３分間照射させ、ＤＮＡを固定した。このメ
ンブレンをプレハイブリダイゼーション緩衝液（５×De
nhardt's液、６×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、１０μｇ／
ｍｌサケ***ＤＮＡ）５ｍｌ中で５０℃、２時間プレハ
イブリダイゼーションを行った。プローブを加え、５０
℃で一晩ハイブリダイゼーションを行なった。ハイブリ
ダイゼーションの後、メンブレンを２×ＳＳＣ、０．１
％ＳＤＳを含む洗浄液で室温、１０分間、２回洗浄し、
続いて同じ洗浄液で５０℃、３０分間で２回洗浄した。
メンブレンは乾燥させた後、Ｘ線フィルム（コダック社
製）を入れたカセット内で−８０℃、一晩感光させ、オ
ートラジオグラフィーをとった。形質転換を行っていな
い株（１）、pFSPD1を導入した形質転換体（２）、pFSA
M24を導入した形質転換体（３）、ベクターのみを導入
した形質転換体（４）について、サザンハイブリダイゼ
ーションにより検出されたシグナルのパターンを比較し
た。(9) DNA extraction and Southern hybridization The T2 seeds germinated as described above were transplanted with tweezers into a rock wool minipot immersed in an inorganic salt medium, and the light intensity was adjusted to 600.
The cells were cultured at 0 lux, 16 hours light, 8 hours dark, and 22 ° C. Two weeks later, the top of the rock wool was cut off with a scalpel like a stroke with a knife, and immediately frozen with liquid nitrogen. This was finely ground in a mortar in the presence of liquid nitrogen, and 3 ml of a DNA extraction buffer [200 g
M Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM E
DTA-2Na, 1% N-lauroyl sarcosine sodium, 100 μg / ml proteinase K] and stirred well. After incubating at 60 ° C. for 1 hour, the mixture was centrifuged (10,000 × g, 10 minutes), and the supernatant was filtered and vortexed with Miracloth and transferred to a new tube. Phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25: 24: 1) extraction 3
After performing the reaction twice, ethanol precipitation was performed. The precipitate was dissolved in TE buffer. From about 2.0 g of each plant, 20
Genomic DNA of each μg was obtained. Using 1 μg of the DNA, each was cut with restriction enzymes EcoRI and HindIII and subjected to 1% agarose electrophoresis and Southern hybridization. In addition, seeds of the WS strain that have not been transformed are germinated and grown, and D
NA was extracted, digested with restriction enzymes EcoRI and HindIII, and subjected to 1% agarose gel electrophoresis and Southern hybridization. As hybridization probes, pCfSPD1 and pCfSAM1 were used. Southern hybridization is performed using Molecular Cloning, a Laboratories.
atory Manual), Chapter 9, pages 31-58 [Cold
Cold Spring Harber, 19
1989]. That is, each DNA sample was subjected to 1% agarose gel electrophoresis, and after electrophoresis, denatured with alkali and subjected to overnight Southern blot on a nylon membrane (Hybond-N + , manufactured by Amersham). UV transilluminator (25
4 nm) for 3 minutes to fix the DNA. This membrane is mixed with a prehybridization buffer (5 × De
nhardt's solution, 6 × SSC, 0.1% SDS, 10 μg /
Prehybridization was performed at 5 ° C. for 2 hours in 5 ml of the DNA (ml salmon sperm DNA). Add probe, 50
Hybridization was carried out at ℃ overnight. After hybridization, the membrane was washed with 2 x SSC, 0.1
Wash twice with a washing solution containing% SDS at room temperature for 10 minutes.
Subsequently, washing was performed twice at 50 ° C. for 30 minutes with the same washing solution.
After drying the membrane, the membrane was exposed overnight at -80 ° C in a cassette containing an X-ray film (manufactured by Kodak), and autoradiography was performed. Untransformed strain (1), transformant into which pFSPD1 has been introduced (2), pFSA
The signal patterns detected by Southern hybridization were compared between the transformant (3) into which M24 was introduced and the transformant (4) into which only the vector was introduced.
【００７９】（２）には、（１）、（２）、（３）、
（４）共通の内在性のシグナルのほかに、EcoRIで切断
したサンプルでは約１．９kbpと約０．７kbp、HindIII
で切断したサンプルでは約６kbpの位置に特異的なシグ
ナルが観察され、目的遺伝子が（２）に組み込まれてい
ることが観察された。（３）には、（１）、（２）、
（３）、（４）共通の内在性のシグナルのほかに、EcoR
Iで切断したサンプルでは約３kbp、HindIIIで切断した
サンプルでは約９kbp、１．３kbpおよび０．４kbpの位
置に特異的なシグナルが観察され、目的遺伝子が（３）
に組み込まれていることが観察された。(2) includes (1), (2), (3),
(4) In addition to the common endogenous signal, about 1.9 kbp and about 0.7 kbp in the sample cut with EcoRI, HindIII
In the sample cleaved with, a specific signal was observed at about 6 kbp, and it was observed that the target gene was incorporated into (2). (3) includes (1), (2),
(3), (4) In addition to common endogenous signals, EcoR
Specific signals were observed at about 3 kbp in the sample cut with I, about 9 kbp, 1.3 kbp and 0.4 kbp in the sample cut with HindIII, and the target gene was expressed as (3)
Was observed.
【００８０】[0080]
【発明の効果】上述したように、本発明により、植物の
低温ストレス抵抗性を増強することができ、また植物の
生育過程において遭遇する低温ストレスによる障害の回
避や生長抑制を軽減することができ、栽培の安定化と生
産性の向上が期待できる。As described above, according to the present invention, it is possible to enhance the resistance of plants to low-temperature stress, and it is possible to avoid the obstacles caused by low-temperature stress and reduce the suppression of growth during the growth process of plants. It is expected that cultivation is stabilized and productivity is improved.
【００８１】[0081]
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：1328 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＦＳＰＤ１ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：77..1060 特徴を決定した方法：Ｐ 配列： CCAACGGGTC ATACAGAAGC ACTCCCCACT GTATTGGGAT TTGGGATTTT AGCGAGTCGA 60 TAGTAGAGGG ATTATTATGT CTGCGGAACA TATCGTTGGG TCGGCGGCCG ATGCGGCGGC 120 GAAGAAACCT GAGATTGAGA ATGGGGTATC CGCCTCACAG CCCGATTCTA TTTCCTCTGT 180 AATTCCTGGA TGGTTTTCTG AAATTAGCCC AATGTGGCCT GGAGAGGCCC ATTCCTTGAA 240 GGTGGAGAAG GTTTTGTTTC AAGGGAAGTC TGATTACCAG AACGTTTTGG TATTTCAGTC 300 ATCAACTTAT GGGAAGGTTC TGGTTTTGGA TGGCGTGATT CAGCTTACAG AGAGAGATGA 360 ATGTGCTTAC CAAGAGATGA TCACCCACCT TCCACTTTGC TCAATTCCAA ACCCCAAAAA 420 GGTTCTCGTT ATCGGTGGAG GAGACGGCGG TGTTTTGCGA GAGGTGGCTC GCCATTCATC 480 TGTTGAGCAG ATAGATATCT GTGAAATCGA CAAGATGGTA GTTGATGTTT CCAAAGAATT 540 TTTCCCTCGC GTAGCTGTCG GGTTTGAGGA TCCTCGTGTC ACTCTTCATA TTGGTGATGG 600 CGTCGCATTT CTGAAGGCTG TTCCTGAAGG CACTTATGAT GCAGTGATAG TGGATTCTTC 660 TGATCCTATT GGTCCTGCAC AAGAGCTCTT TGAGAAGCCT TTTTTTGCTT CAGTTGCCAA 720 AGCTCTTCGA CCAGGAGGCG TTGTGTGTAC TCAAGCAGAG AGCATTTGGC TTCACATGCA 780 TATCATTGAA GACATTGTAA CAAACTGCCG CCAAATATTC AAAGGCTCTG TCAACTATGC 840 ATGGACTACA GTTCCTACAT ATCCAAGCGG AGTGATTGGG TTTATGCTCT GCTCAACTGA 900 GGGGCCTCCT CTTGATTTCA AGCATCCAGT CAACCCAGTA GAGGTGAACG GTATCGACAC 960 CGTGAAGAGT CCGCTCAAGT TTTACAACTC GGAGATTCAT ACAGCAGCTT TCTGTTTGCC 1020 TTCTTTTGCG AAGAAGATCA TCGATTCAAA AGCAAAATGA AAAGGTTTCC CCCACAGCGT 1080 TGAAGAAGCA GAAATTGGCG GTCTTGGAGT GTGCCAATGT AATAAGTGGA GGCTTAAATT 1140 AGAGTCGAAA TGGTCGCTTT ATATTGTGAT CAGCGTCATA AAGTTTCTTG AGATGTTATG 1200 AGTAGTAGAA ATAGCTTTTG TTTTCCTCCC CAAAATTTTC CCCGTCCTTT TTCATTGAAA 1260 AGTGACATCT GGTGTTCTAG CTTCTATAAA TAAATATGCT AAATAAATAT ATTTAGCCAA 1320 AAAAAAAA 1328[Sequence List] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1328 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type: root Direct origin Library name: cDNA library derived from roots induced at low temperature Clone name: FSPD1 Sequence characteristics Characteristic symbol: CDS Location: 77..1060 Method for determining characteristics: P sequence: CCAACGGGTC ATACAGAAGC ACTCCCCACT GTATTGGGAT TTGGGATTTT AGCGAGTCGA 60 TAGTAGAGGG ATTATTATGT CTGCGGAACA TATCGTTGGG TCGGCGGCCG ATGCGGCGGC 120 GAAGAAACCT GAGATTGAGA ATGGGGTATC CGCCTCACAG CCCGATTCTA TTTCCTCTGT 180 AATTCCTGGA TGGTTTTCTG AAATTAGCCC AATGTGGCCT GGAGAGGCCC ATTCCTTGAA 240 GGTGGAGAAG GTTTTGTTTC AAGGGAAGTC TGATTACCAG AACGTTTTGG TATTTCAGTC 300 ATCAACTTAT GGGAAGGTTC TGGTTTTGGA TGGCGTGATT CAGCTTACAG AGAGAGATGA 360 ATGTGCTTAC CAAGAGATGA TCACCCACCT TCCACTTTGC TCAATTCCAA ACCCCAAAAA 420 GG TTCTCGTT ATCGGTGGAG GAGACGGCGG TGTTTTGCGA GAGGTGGCTC GCCATTCATC 480 TGTTGAGCAG ATAGATATCT GTGAAATCGA CAAGATGGTA GTTGATGTTT CCAAAGAATT 540 TTTCCCTCGC GTAGCTGTCG GGTTTGAGGA TCCTCGTGTC ACTCTTCATA TTGGTGATGG 600 CGTCGCATTT CTGAAGGCTG TTCCTGAAGG CACTTATGAT GCAGTGATAG TGGATTCTTC 660 TGATCCTATT GGTCCTGCAC AAGAGCTCTT TGAGAAGCCT TTTTTTGCTT CAGTTGCCAA 720 AGCTCTTCGA CCAGGAGGCG TTGTGTGTAC TCAAGCAGAG AGCATTTGGC TTCACATGCA 780 TATCATTGAA GACATTGTAA CAAACTGCCG CCAAATATTC AAAGGCTCTG TCAACTATGC 840 ATGGACTACA GTTCCTACAT ATCCAAGCGG AGTGATTGGG TTTATGCTCT GCTCAACTGA 900 GGGGCCTCCT CTTGATTTCA AGCATCCAGT CAACCCAGTA GAGGTGAACG GTATCGACAC 960 CGTGAAGAGT CCGCTCAAGT TTTACAACTC GGAGATTCAT ACAGCAGCTT TCTGTTTGCC 1020 TTCTTTTGCG AAGAAGATCA TCGATTCAAA AGCAAAATGA AAAGGTTTCC CCCACAGCGT 1080 TGAAGAAGCA GAAATTGGCG GTCTTGGAGT GTGCCAATGT AATAAGTGGA GGCTTAAATT 1140 AGAGTCGAAA TGGTCGCTTT ATATTGTGAT CAGCGTCATA AAGTTTCTTG AGATGTTATG 1200 AGTAGTAGAA ATAGCTTTTG TTTTCCTCCC CAAAATTTTC CCCGTCCTTT TTCATTGAAA 1260 AGTGACATCT GGTGTT CTAG CTTCTATAAA TAAATATGCT AAATAAATAT ATTTAGCCAA 1320 AAAAAAAA 1328
【００８２】 配列番号：２ 配列の長さ：327 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＦＳＰＤ１ 配列： Met Ser Ala Glu His Ile Val Gly Ser Ala Ala Asp Ala Ala Ala Lys 5 10 15 Lys Pro Glu Ile Glu Asn Gly Val Ser Ala Ser Gln Pro Asp Ser Ile 20 25 30 Ser Ser Val Ile Pro Gly Trp Phe Ser Glu Ile Ser Pro Met Trp Pro 35 40 45 Gly Glu Ala His Ser Leu Lys Val Glu Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys 50 55 60 Ser Asp Tyr Gln Asn Val Leu Val Phe Gln Ser Ser Thr Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Val Leu Val Leu Asp Gly Val Ile Gln Leu Thr Glu Arg Asp Glu Cys 85 90 95 Ala Tyr Gln Glu Met Ile Thr His Leu Pro Leu Cys Ser Ile Pro Asn 100 105 110 Pro Lys Lys Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Arg 115 120 125 Glu Val Ala Arg His Ser Ser Val Glu Gln Ile Asp Ile Cys Glu Ile 130 135 140 Asp Lys Met Val Val Asp Val Ser Lys Glu Phe Phe Pro Arg Val Ala 145 150 155 160 Val Gly Phe Glu Asp Pro Arg Val Thr Leu His Ile Gly Asp Gly Val 165 170 175 Ala Phe Leu Lys Ala Val Pro Glu Gly Thr Tyr Asp Ala Val Ile Val 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Pro Ile Gly Pro Ala Gln Glu Leu Phe Glu Lys Pro 195 200 205 Phe Phe Ala Ser Val Ala Lys Ala Leu Arg Pro Gly Gly Val Val Cys 210 215 220 Thr Gln Ala Glu Ser Ile Trp Leu His Met His Ile Ile Glu Asp Ile 225 230 235 240 Val Thr Asn Cys Arg Gln Ile Phe Lys Gly Ser Val Asn Tyr Ala Trp 245 250 255 Thr Thr Val Pro Thr Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Phe Met Leu Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Gly Pro Pro Leu Asp Phe Lys His Pro Val Asn Pro Val 275 280 285 Glu Val Asn Gly Ile Asp Thr Val Lys Ser Pro Leu Lys Phe Tyr Asn 290 295 300 Ser Glu Ile His Thr Ala Ala Phe Cys Leu Pro Ser Phe Ala Lys Lys 305 310 315 320 Ile Ile Asp Ser Lys Ala Lys 325SEQ ID NO: 2 Sequence length: 327 Sequence type: amino acid Number of chains: single-chain Topology: linear Sequence type: protein Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type : Root Direct origin Library name: Root-derived cDNA library derived at low temperature Clone name: FSPD1 Sequence: Met Ser Ala Glu His Ile Val Gly Ser Ala Ala Asp Ala Ala Ala Lys 5 10 15 Lys Pro Glu Ile Glu Asn Gly Val Ser Ala Ser Gln Pro Asp Ser Ile 20 25 30 Ser Ser Val Ile Pro Gly Trp Phe Ser Glu Ile Ser Pro Met Trp Pro 35 40 45 Gly Glu Ala His Ser Leu Lys Val Glu Lys Val Leu Phe Gln Gly Lys 50 55 60 Ser Asp Tyr Gln Asn Val Leu Val Phe Gln Ser Ser Thr Tyr Gly Lys 65 70 75 80 Val Leu Val Leu Asp Gly Val Ile Gln Leu Thr Glu Arg Asp Glu Cys 85 90 95 Ala Tyr Gln Glu Met Ile Thr His Leu Pro Leu Cys Ser Ile Pro Asn 100 105 110 Pro Lys Lys Val Leu Val Ile Gly Gly Gly Asp Gly Gly Val Leu Arg 115 120 125 Glu Val Ala Arg His Ser Ser Val Glu Gln Ile Asp Ile Cys Glu Ile 130 135 140 Asp Lys Met Val Val Asp Val Ser Lys Glu Phe Phe Pro Arg Val Ala 145 150 155 160 Val Gly Phe Glu Asp Pro Arg Val Thr Leu His Ile Gly Asp Gly Val 165 170 175 Ala Phe Leu Lys Ala Val Pro Glu Gly Thr Tyr Asp Ala Val Ile Val 180 185 190 Asp Ser Ser Asp Pro Ile Gly Pro Ala Gln Glu Leu Phe Glu Lys Pro 195 200 205 Phe Phe Ala Ser Val Ala Lys Ala Leu Arg Pro Gly Gly Val Val Cys 210 215 220 Thr Gln Ala Glu Ser Ile Trp Leu His Met His Ile Ile Glu Asp Ile 225 230 235 240 Val Thr Asn Cys Arg Gln Ile Phe Lys Gly Ser Val Asn Tyr Ala Trp 245 250 255 Thr Thr Val Pro Thr Tyr Pro Ser Gly Val Ile Gly Phe Met Leu Cys 260 265 270 Ser Thr Glu Gly Pro Pro Leu Asp Phe Lys His Pro Val Asn Pro Val 275 280 285 Glu Val Asn Gly Ile Asp Thr Val Lys Ser Pro Leu Lys Phe Tyr Asn 290 295 300 Ser Glu Ile His Thr Ala Ala Phe Cys Leu Pro Ser Phe Ala Lys Lys 305 310 315 320 Ile Ile Asp Ser Lys Ala Lys 325
【００８３】 配列番号：３ 配列の長さ：573 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＣｆＳＡＭ１ 配列： TATGTGCTGT CTGAGTCGAG CCTCTTTGTC TACCCATACA AGTTCATCAT CAAAACTTGC 60 GGCACTACTA AGCTGCTTCT GTCTATTCCA GCTCTGATAA AGTTGGCTGA TTCTCTATCC 120 CTTAATGTGA AATCTGTGAG GTACACTCGT GGAAGCTTTA TCTTTCCTGG TGCCCAGTCT 180 TTTCCCCATC GCAGCTTCTC TGAGGAAGTT GCTGTTCTTG ATGGCTACTT GGCCAAGCTT 240 GGCCTCCATG GCTCTGCTTA TGTGATGGGA AGTCCTGATG AGACAAGGAA ATGGCACGTT 300 TACTCTGCCT GTGCCAAAAT GGGTAGCCGA AGCTACAATC CCGTCTATAC TCTGGAGATG 360 TGCATGACTG GCTTAGACAA GGAGAAGGCG TCTGTCTTCT TCAAAACAGA CACAAGTTCT 420 GCTGCTGCAA TGACTGAAAA CTCCGGTATC AGGAAGATCC TTCCGAAATC TGATATATGC 480 GACTTTGAGT TTGACCCATG TGGGTATTCC ATGAATGCTA TTGAAGGAGA TGCGGAGTCT 540 ACCATCCATG TCACCCCTGA AGATGGGTTT AGC 573SEQ ID NO: 3 Sequence length: 573 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type: root direct origin library name: cold-induced roots derived cDNA library clones name: CfSAM1 sequence: TATGTGCTGT CTGAGTCGAG CCTCTTTGTC TACCCATACA AGTTCATCAT CAAAACTTGC 60 GGCACTACTA AGCTGCTTCT GTCTATTCCA GCTCTGATAA AGTTGGCTGA TTCTCTATCC 120 CTTAATGTGA AATCTGTGAG GTACACTCGT GGAAGCTTTA TCTTTCCTGG TGCCCAGTCT 180 TTTCCCCATC GCAGCTTCTC TGAGGAAGTT GCTGTTCTTG ATGGCTACTT GGCCAAGCTT 240 GGCCTCCATG GCTCTGCTTA TGTGATGGGA AGTCCTGATG AGACAAGGAA ATGGCACGTT 300 TACTCTGCCT GTGCCAAAAT GGGTAGCCGA AGCTACAATC CCGTCTATAC TCTGGAGATG 360 TGCATGACTG GCTTAGACAA GGAGAAGGCG TCTGTCTTCT TCAAAACAGA CACAAGTTCT 420 GCTGCTGCAA TGACTGAAAA CTCCGGTATC AGGAAGATCC TTCCGAAATC TGATATATGC 480 GACTTTGAGT TTGACCCATG TGGGTATTCC AT GAATGCTA TTGAAGGAGA TGCGGAGTCT 540 ACCATCCATG TCACCCCTGA AGATGGGTTT AGC 573
【００８４】 配列番号：４ 配列の長さ：191 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＣｆＳＡＭ１ 配列： Tyr Val Leu Ser Glu Ser Ser Leu Phe Val Tyr Pro Tyr Lys Phe Ile 5 10 15 Ile Lys Thr Cys Gly Thr Thr Lys Leu Leu Leu Ser Ile Pro Ala Leu 20 25 30 Ile Lys Leu Ala Asp Ser Leu Ser Leu Asn Val Lys Ser Val Arg Tyr 35 40 45 Thr Arg Gly Ser Phe Ile Phe Pro Gly Ala Gln Ser Phe Pro His Arg 50 55 60 Ser Phe Ser Glu Glu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Lys Leu 65 70 75 80 Gly Leu His Gly Ser Ala Tyr Val Met Gly Ser Pro Asp Glu Thr Arg 85 90 95 Lys Trp His Val Tyr Ser Ala Cys Ala Lys Met Gly Ser Arg Ser Tyr 100 105 110 Asn Pro Val Tyr Thr Leu Glu Met Cys Met Thr Gly Leu Asp Lys Glu 115 120 125 Lys Ala Ser Val Phe Phe Lys Thr Asp Thr Ser Ser Ala Ala Ala Met 130 135 140 Thr Glu Asn Ser Gly Ile Arg Lys Ile Leu Pro Lys Ser Asp Ile Cys 145 150 155 160 Asp Phe Glu Phe Asp Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Ala Ile Glu Gly 165 170 175 Asp Ala Glu Ser Thr Ile His Val Thr Pro Glu Asp Gly Phe Ser 180 185 190SEQ ID NO: 4 Sequence length: 191 Sequence type: amino acid Number of chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: protein Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type : Root Direct origin Library name: Root-derived cDNA library derived from low temperature Clone name: CfSAM1 Sequence: Tyr Val Leu Ser Glu Ser Ser Leu Phe Val Tyr Pro Tyr Lys Phe Ile 5 10 15 Ile Lys Thr Cys Gly Thr Thr Lys Leu Leu Leu Ser Ile Pro Ala Leu 20 25 30 Ile Lys Leu Ala Asp Ser Leu Ser Leu Asn Val Lys Ser Val Arg Tyr 35 40 45 Thr Arg Gly Ser Phe Ile Phe Pro Gly Ala Gln Ser Phe Pro His Arg 50 55 60 Ser Phe Ser Glu Glu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Lys Leu 65 70 75 80 Gly Leu His Gly Ser Ala Tyr Val Met Gly Ser Pro Asp Glu Thr Arg 85 90 95 Lys Trp His Val Tyr Ser Ala Cys Ala Lys Met Gly Ser Arg Ser Tyr 100 105 110 Asn Pro Val Tyr Thr Leu Glu Met Cys Met Thr Gly Leu Asp Lys Glu 115 1 20 125 Lys Ala Ser Val Phe Phe Lys Thr Asp Thr Ser Ser Ala Ala Ala Met 130 135 140 Thr Glu Asn Ser Gly Ile Arg Lys Ile Leu Pro Lys Ser Asp Ile Cys 145 150 155 160 Asp Phe Glu Phe Asp Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Ala Ile Glu Gly 165 170 175 Asp Ala Glu Ser Thr Ile His Val Thr Pro Glu Asp Gly Phe Ser 180 185 190
【００８５】 配列番号：５ 配列の長さ：621 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＣｆＡＤＣ１ 配列： GGGCTTGGAG TCGACTATGA CGGGTCGAAG TCAGGGGATT CTGAGTTATC TGTTGCTTAT 60 GAACTCGGAG AGTATGCCTC TACGGTTGTT GATGCAGTCC GCTGTGTATG CGACCGTAGG 120 GCCGTTAAGC ACCCGATAAT TTGCAGTGAA AGTGGCCGAG CAATCGTCTC TCATCACTCT 180 GTTCTGATAT TTGAGGCTGT TTCTGCTAGT TCTTATGAGG TCCCATCCAT GAGCTCGATT 240 GAACGTCAGT ATCTTGTCGA TGGACTAACC GACGATGCTC GTATTGATTA TCAGAACCTT 300 TTGACTGCAG CTTATATGGG TGAGTACAAG GCGTGCTTGC TATATGCAGA TCAATTGAAG 360 CAATGCTGTG TTGAGAAATT CAAGGATGGG TGTTTGGGAA TGGAAGAACT AGCTGCGGTA 420 GATGGGCTTT GTGCCCTTGT TTCAAAGGCA ATTGGAGAGT TGGATGCTGT AAGAACTTAC 480 CATGTGAACC TCTCCATTTT CACCTCTATC CCAGATTTCT GGGGTATTGA CCAGCTGTTT 540 CCAATTGTCC CTATTCATCG TCTCGATCAA AGACCGTCAG TGAGGGGCAT TCTATCCGAT 600 CTAACCTGTG ACAGCGACGG A 621SEQ ID NO: 5 Sequence length: 621 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type: root direct origin library name: cold-induced roots derived cDNA library clones name: CfADC1 sequence: GGGCTTGGAG TCGACTATGA CGGGTCGAAG TCAGGGGATT CTGAGTTATC TGTTGCTTAT 60 GAACTCGGAG AGTATGCCTC TACGGTTGTT GATGCAGTCC GCTGTGTATG CGACCGTAGG 120 GCCGTTAAGC ACCCGATAAT TTGCAGTGAA AGTGGCCGAG CAATCGTCTC TCATCACTCT 180 GTTCTGATAT TTGAGGCTGT TTCTGCTAGT TCTTATGAGG TCCCATCCAT GAGCTCGATT 240 GAACGTCAGT ATCTTGTCGA TGGACTAACC GACGATGCTC GTATTGATTA TCAGAACCTT 300 TTGACTGCAG CTTATATGGG TGAGTACAAG GCGTGCTTGC TATATGCAGA TCAATTGAAG 360 CAATGCTGTG TTGAGAAATT CAAGGATGGG TGTTTGGGAA TGGAAGAACT AGCTGCGGTA 420 GATGGGCTTT GTGCCCTTGT TTCAAAGGCA ATTGGAGAGT TGGATGCTGT AAGAACTTAC 480 CATGTGAACC TCTCCATTTT CACCTCTATC CC AGATTTCT GGGGTATTGA CCAGCTGTTT 540 CCAATTGTCC CTATTCATCG TCTCGATCAA AGACCGTCAG TGAGGGGCAT TCTATCCGAT 600 CTAACCTGTG ACAGCGACGG A 621
【００８６】 配列番号：６ 配列の長さ：207 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＣｆＡＤＣ１ 配列： Gly Leu Gly Val Asp Tyr Asp Gly Ser Lys Ser Gly Asp Ser Glu Leu 5 10 15 Ser Val Ala Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Ala Ser Thr Val Val Asp Ala 20 25 30 Val Arg Cys Val Cys Asp Arg Arg Ala Val Lys His Pro Ile Ile Cys 35 40 45 Ser Glu Ser Gly Arg Ala Ile Val Ser His His Ser Val Leu Ile Phe 50 55 60 Glu Ala Val Ser Ala Ser Ser Tyr Glu Val Pro Ser Met Ser Ser Ile 65 70 75 80 Glu Arg Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Thr Asp Asp Ala Arg Ile Asp 85 90 95 Tyr Gln Asn Leu Leu Thr Ala Ala Tyr Met Gly Glu Tyr Lys Ala Cys 100 105 110 Leu Leu Tyr Ala Asp Gln Leu Lys Gln Cys Cys Val Glu Lys Phe Lys 115 120 125 Asp Gly Cys Leu Gly Met Glu Glu Leu Ala Ala Val Asp Gly Leu Cys 130 135 140 Ala Leu Val Ser Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Ala Val Arg Thr Tyr 145 150 155 160 His Val Asn Leu Ser Ile Phe Thr Ser Ile Pro Asp Phe Trp Gly Ile 165 170 175 Asp Gln Leu Phe Pro Ile Val Pro Ile His Arg Leu Asp Gln Arg Pro 180 185 190 Ser Val Arg Gly Ile Leu Ser Asp Leu Thr Cys Asp Ser Asp Gly 195 200 205SEQ ID NO: 6 Sequence length: 207 Sequence type: amino acids Number of chains: single-stranded Topology: linear Sequence type: protein Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type : Root Direct origin Library name: Root-derived cDNA library derived at low temperature Clone name: CfADC1 Sequence: Gly Leu Gly Val Asp Tyr Asp Gly Ser Lys Ser Gly Asp Ser Glu Leu 5 10 15 Ser Val Ala Tyr Glu Leu Gly Glu Tyr Ala Ser Thr Val Val Asp Ala 20 25 30 Val Arg Cys Val Cys Asp Arg Arg Ala Val Lys His Pro Ile Ile Cys 35 40 45 Ser Glu Ser Gly Arg Ala Ile Val Ser His His Ser Val Leu Ile Phe 50 55 60 Glu Ala Val Ser Ala Ser Ser Tyr Glu Val Pro Ser Met Ser Ser Ile 65 70 75 80 Glu Arg Gln Tyr Leu Val Asp Gly Leu Thr Asp Asp Ala Arg Ile Asp 85 90 95 Tyr Gln Asn Leu Leu Thr Ala Ala Tyr Met Gly Glu Tyr Lys Ala Cys 100 105 110 Leu Leu Tyr Ala Asp Gln Leu Lys Gln Cys Cys Val Glu Lys Phe Lys 115 1 20 125 Asp Gly Cys Leu Gly Met Glu Glu Leu Ala Ala Val Asp Gly Leu Cys 130 135 140 Ala Leu Val Ser Lys Ala Ile Gly Glu Leu Asp Ala Val Arg Thr Tyr 145 150 155 160 160 His Val Asn Leu Ser Ile Phe Thr Ser Ile Pro Asp Phe Trp Gly Ile 165 170 175 Asp Gln Leu Phe Pro Ile Val Pro Ile His Arg Leu Asp Gln Arg Pro 180 185 190 Ser Val Arg Gly Ile Leu Ser Asp Leu Thr Cys Asp Ser Asp Gly 195 200 205
【００８７】 配列番号：７ 配列の長さ：１８１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＦＳＡＭ２４ 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：４５６．．１５４７ 特徴を決定した方法：Ｐ 配列： TCCGTCTGCG GCCTCTTGAA TTCTCATCGT TTCTCTCTCT TTCGAATTTT GTTTTCTTTC 60 GCTCTCAGCC CTTTCTTGCA AGTTTTATTT TAGGCATTCT CCGGGTTTCC TTCTCCTCCG 1 20 CTAATTCTTT TCATCGCGAA TGATTTAATG GAGTCAAAAG GTGGTAAGAA GTCTAGTAGT 1 80 AGTAGTAGTA GAAGCAGTAA ATCCCTTTTC TACGAAGCTC CCCTCGGATA CAGCATTGAA 2 40 GACGTTAGAC CACACGGTGG AATCAAGAAG TTCAGATCTG CTGCCTACTC CAACTGCGTT 3 00 CGTAAACCAT CCTGAGTTCT GCTGAATTCC GTTTTTCCTG CGCACCGAGA TCCTTAGTTT 3 60 TCTATAATTT TTACTGTGTC TTTTTTCTTT AGTACTCTAC TTTCCTCGTT CTCTCGTTCA 4 20 ATCTCTCAAC ATTAGTAACT TCCTTTTAAG AAAAGATGAC GTTTCCTACC TCTGCAATCG 4 80 GATTTGAAGG CTATGAAAAG AGGCTTGAAG TATCATTCTT TGAGCCCGGC ATTTTTGCTG 5 40 ACCCAAGGGG CATGGGCCTT CGTGCTTTGT CCAAGGCACA ACTAGATGAA ATTCTGACAT 6 00 TAGCCGAGTG CACCATTGTT GATTCTTTGT CCAATGACTA TCTTGATTCA TATGTCCTTT 6 60 CGGAGTCGAG CCTCTTTGTC TACCCATACA AGTTCATCAT CAAAACTTGC GGCACTACTA 7 20 AGCTGCTTCT GTCTATTCCA GCTCTGATAA AGTTGGCTGA TTCTCTATCC CTTAATGTGA 7 80 AATCTGTGAG GTACACTCGT GGAAGCTTTA TCTTTCCTGG TGCCCAGTCT TTTCCCCATC 8 40 GCAGCTTCTC TGAGGAAGTT GCTGTTCTTG ATGGCTACTT GGCCAAGCTT GGCCTCCATG 9 00 GCTCTGCTTA TGTGATGGGA AGTCCTGATG AGACAAGGAA ATGGCACGTT TACTCTGCCT 9 60 GTGCCAAAAT GGGTAGCCGA AGCTACAATC CCGTCTATAC TCTGGAGATG TGCATGACTG 10 20 GCTTAGACAA GGAGAAGGCG TCTGTCTTCT TCAAAACAGA CACAAGTTCT GCTGCTGCAA 10 80 TGACTGAAAA CTCCGGTATC AGGAAGATCC TTCCGAAATC TGATATATGC GACTTTGAGT 11 40 TTGACCCATG TGGGTATTCC ATGAATGCTA TTGAAGGAGA TGCGGAGTCT ACCATCCATG 12 00 TCACTCCAGA AGAAGGGTTT AGCTATGCAA GCTTTGAAGC AGCTGGTTAT GAATTGGACG 12 60 ACCTGGACCT GTGTAAGGTG ATTGGGAGGG TGCTGGCATG CTTCCAGCCA TCTGATTTCT 13 20 CTGTTGCCCT CCACTCAGAT GTGGTCGGTG AGGATCTGAA AGATTTACTG TGCCTGGACC 13 80 TGAAGGGGTA CGAGGGTGGA GAGAAGAGCT GTGAAATGCT TGGGGAAAAT GGATCCGTCA 14 40 TCTATCAGAG CTTTAAGAAT AGAGGAGATT ATGCGTCATC TCCAAGGTCA ATCCTCATGA 15 00 AATGCTGTTG GAGAGAGGAC GAGGCGGACG AGGAAGTTGA GAAGTAGTAG TAGTTACTTA 15 60 CTTTCAACTT TTGCTGCGTT TTATCTTTTA ATACTATAGT ATCTTCGGGG TCGTTCTGTT 16 20 CTGTGCTGTT CTGTTCTTTC ATTATGTCCT TTTGTGTTGT TTCCTTTGCG AATAATAATT 16 80 CCCAGGTGGG GATGGTAGGC TGTCGTGTCC TGTCCTGGAG AGTCTATCGT CTGATGTTAT 17 40 TATGATCATC AAACTATATA ATGATAATAT CGTATTTCCT TATTTAAAAA AAAAAAAAAA 18 00 AAAAAAAAAA AAAA 1814SEQ ID NO: 7 Sequence length: 1814 Sequence type: nucleic acid Number of strands: double-stranded Topology: linear Sequence type: cDNA to mRNA Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue Type: root Direct origin Library name: cDNA library derived from cold-derived root Clone name: FSAM24 Sequence characteristics Characteristic symbol: CDS Location: 456. . 1547 method to determine the characteristics: P sequence: TCCGTCTGCG GCCTCTTGAA TTCTCATCGT TTCTCTCTCT TTCGAATTTT GTTTTCTTTC 60 GCTCTCAGCC CTTTCTTGCA AGTTTTATTT TAGGCATTCT CCGGGTTTCC TTCTCCTCCG 1 20 CTAATTCTTT TCATCGCGAA TGATTTAATG GAGTCAAAAG GTGGTAAGAA GTCTAGTAGT 1 80 AGTAGTAGTA GAAGCAGTAA ATCCCTTTTC TACGAAGCTC CCCTCGGATA CAGCATTGAA 2 40 GACGTTAGAC CACACGGTGG AATCAAGAAG TTCAGATCTG CTGCCTACTC CAACTGCGTT 3 00 CGTAAACCAT CCTGAGTTCT GCTGAATTCC GTTTTTCCTG CGCACCGAGA TCCTTAGTTT 3 60 TCTATAATTT TTACTGTGTC TTTTTTCTTT AGTACTCTAC TTTCCTCGTT CTCTCGTTCA 4 20 ATCTCTCAAC ATTAGTAACT TCCTTTTAAG AAAAGATGAC GTTTCCTACC TCTGCAATCG 4 80 GATTTGAAGG CTATGAAAAG AGGCTTGAAG TATCATTCTT TGAGCCCGGC ATTTTTGCTG 5 40 ACCCAAGGGG CATGGGCCTT CGTGCTTTGT CCAAGGCACA ACTAGATGAA ATTCTGACAT 6 00 TAGCCGAGTG CACCATTGTT GATTCTTTGT CCAATGACTA TCTTGATTCA TATGTCCTTT 6 60 CGGAGTCGAG CCTCTTTGTC TACCCATACA AGTTCATCAT CAAAACTTGC GGCACTACTA 7 20 AGCTGCTTCT GTCTATTCCA GCTCTGATAA AGTTGGCTGA TTCTCTATCC CTTAATGTGA 7 80 AATCTGTGAG GTACACTCGT GGAAGCTTTA TCTTTCCTGG TGCCCAGTCT TTTCCCCATC 8 40 GCAGCTTCTC TGAGGAAGTT GCTGTTCTTG ATGGCTACTT GGCCAAGCTT GGCCTCCATG 9 00 GCTCTGCTTA TGTGATGGGA AGTCCTGATG AGACAAGGAA ATGGCACGTT TACTCTGCCT 9 60 GTGCCAAAAT GGGTAGCCGA AGCTACAATC CCGTCTATAC TCTGGAGATG TGCATGACTG 10 20 GCTTAGACAA GGAGAAGGCG TCTGTCTTCT TCAAAACAGA CACAAGTTCT GCTGCTGCAA 10 80 TGACTGAAAA CTCCGGTATC AGGAAGATCC TTCCGAAATC TGATATATGC GACTTTGAGT 11 40 TTGACCCATG TGGGTATTCC ATGAATGCTA TTGAAGGAGA TGCGGAGTCT ACCATCCATG 12 00 TCACTCCAGA AGAAGGGTTT AGCTATGCAA GCTTTGAAGC AGCTGGTTAT GAATTGGACG 12 60 ACCTGGACCT GTGTAAGGTG ATTGGGAGGG TGCTGGCATG CTTCCAGCCA TCTGATTTCT 13 20 CTGTTGCCCT CCACTCAGAT GTGGTCGGTG AGGATCTGAA AGATTTACTG TGCCTGGACC 13 80 TGAAGGGGTA CGAGGGTGGA GAGAAGAGCT GTGAAATGCT TGGGGAAAAT GGATCCGTCA 14 40 TCTATCAGAG CTTTAAGAAT AGAGGAGATT ATGCGTCATC TCCAAGGTCA ATCCTCATGA 15 00 AATGCTGTTG GAGAGAGGAC GAGGCGGACG AGGAAGTTGA GAAGTAGTAG TAGTTACTTA 15 60 CTTTCAACTT TTGCTGCGTT TTATCTTTTA ATACTATAGT ATCTTCGGGG TCGTTCTGTT 16 20 CTGTGCTGTT CTGTTC TTTC ATTATGTCCT TTTGTGTTGT TTCCTTTGCG AATAATAATT 16 80 CCCAGGTGGG GATGGTAGGC TGTCGTGTCC TGTCCTGGAG AGTCTATCGT CTGATGTTAT 17 40 TATGATCATC AAACTATATA ATGATAATAT CGTATTTCCT TATTTAAAAA AAAAAAAAAA AAA 00 AAAAAAAAAA
【００８８】 配列番号：８ 配列の長さ：３６３ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：クロダネカボチャ（Cucurbita ficifolia Bouche） 組織の種類：根 直接の起源 ライブラリー名：低温誘導した根由来ｃＤＮＡライブラリー クローン名：ＦＳＡＭ２４ 配列： Met Thr Phe Pro Thr Ser Ala Ile Gly Phe Glu Gly Tyr Glu Lys Arg 5 10 15 Leu Glu Val Ser Phe Phe Glu Pro Gly Ile Phe Ala Asp Pro Arg Gly 20 25 30 Met Gly Leu Arg Ala Leu Ser Lys Ala Gln Leu Asp Glu Ile Leu Thr 35 40 45 Leu Ala Glu Cys Thr Ile Val Asp Ser Leu Ser Asn Asp Tyr Leu Asp 50 55 60 Ser Tyr Val Leu Ser Glu Ser Ser Leu Phe Val Tyr Pro Tyr Lys Phe 65 70 75 80 Ile Ile Lys Thr Cys Gly Thr Thr Lys Leu Leu Leu Ser Ile Pro Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Leu Ala Asp Ser Leu Ser Leu Asn Val Lys Ser Val Arg 100 105 110 Tyr Thr Arg Gly Ser Phe Ile Phe Pro Gly Ala Gln Ser Phe Pro His 115 120 125 Arg Ser Phe Ser Glu Glu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Lys 130 135 140 Leu Gly Leu His Gly Ser Ala Tyr Val Met Gly Ser Pro Asp Glu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Trp His Val Tyr Ser Ala Cys Ala Lys Met Gly Ser Arg Ser 165 170 175 Tyr Asn Pro Val Tyr Thr Leu Glu Met Cys Met Thr Gly Leu Asp Lys 180 185 190 Glu Lys Ala Ser Val Phe Phe Lys Thr Asp Thr Ser Ser Ala Ala Ala 195 200 205 Met Thr Glu Asn Ser Gly Ile Arg Lys Ile Leu Pro Lys Ser Asp Ile 210 215 220 Cys Asp Phe Glu Phe Asp Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Ala Ile Glu 225 230 235 240 Gly Asp Ala Glu Ser Thr Ile His Val Thr Pro Glu Glu Gly Phe Ser 245 250 255 Tyr Ala Ser Phe Glu Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Asp Asp Leu Asp Leu 260 265 270 Cys Lys Val Ile Gly Arg Val Leu Ala Cys Phe Gln Pro Ser Asp Phe 275 280 285 Ser Val Ala Leu His Ser Asp Val Val Gly Glu Asp Leu Lys Asp Leu 290 295 300 Leu Cys Leu Asp Leu Lys Gly Tyr Glu Gly Gly Glu Lys Ser Cys Glu 305 310 315 320 Met Leu Gly Glu Asn Gly Ser Val Ile Tyr Gln Ser Phe Lys Asn Arg 325 330 335 Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Pro Arg Ser Ile Leu Met Lys Cys Cys Trp 340 345 350 Arg Glu Asp Glu Ala Asp Glu Glu Val Glu Lys 355 360SEQ ID NO: 8 Sequence length: 363 Sequence type: amino acid Number of chains: single-chain Topology: linear Sequence type: protein Origin Organism name: Cucurbita ficifolia Bouche Tissue type : Root Direct Origin Library name: cDNA library derived from cold-induced root Clone name: FSAM24 Sequence: Met Thr Phe Pro Thr Ser Ala Ile Gly Phe Glu Gly Tyr Glu Lys Arg 5 10 15 Leu Glu Val Ser Phe Phe Glu Pro Gly Ile Phe Ala Asp Pro Arg Gly 20 25 30 Met Gly Leu Arg Ala Leu Ser Lys Ala Gln Leu Asp Glu Ile Leu Thr 35 40 45 Leu Ala Glu Cys Thr Ile Val Asp Ser Leu Ser Asn Asp Tyr Leu Asp 50 55 60 Ser Tyr Val Leu Ser Glu Ser Ser Leu Phe Val Tyr Pro Tyr Lys Phe 65 70 75 80 Ile Ile Lys Thr Cys Gly Thr Thr Lys Leu Leu Leu Ser Ile Pro Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Leu Ala Asp Ser Leu Ser Leu Asn Val Lys Ser Val Arg 100 105 110 Tyr Thr Arg Gly Ser Phe Ile Phe Pro Gly Ala Gln Ser Phe Pro His 115 120 125 Arg Ser Phe Ser Glu Glu Val Ala Val Leu Asp Gly Tyr Leu Ala Lys 130 135 140 Leu Gly Leu His Gly Ser Ala Tyr Val Met Gly Ser Pro Asp Glu Thr 145 150 155 160 Arg Lys Trp His Val Tyr Ser Ala Cys Ala Lys Met Gly Ser Arg Ser 165 170 175 Tyr Asn Pro Val Tyr Thr Leu Glu Met Cys Met Thr Gly Leu Asp Lys 180 185 190 Glu Lys Ala Ser Val Phe Phe Lys Thr Asp Thr Ser Ser Ala Ala Ala 195 200 205 Met Thr Glu Asn Ser Gly Ile Arg Lys Ile Leu Pro Lys Ser Asp Ile 210 215 220 Cys Asp Phe Glu Phe Asp Pro Cys Gly Tyr Ser Met Asn Ala Ile Glu 225 230 235 240 Gly Asp Ala Glu Ser Thr Ile His Val Thr Pro Glu Glu Gly Phe Ser 245 250 255 Tyr Ala Ser Phe Glu Ala Ala Gly Tyr Glu Leu Asp Asp Leu Asp Leu 260 265 270 Cys Lys Val Ile Gly Arg Val Leu Ala Cys Phe Gln Pro Ser Asp Phe 275 280 285 Ser Val Ala Leu His Ser Asp Val Val Gly Glu Asp Leu Lys Asp Leu 290 295 300 Leu Cys Leu Asp Leu Lys Gly Tyr Glu Gly Gly Glu Lys Ser Cys Glu 305 310 315 320 Met Leu Gly Glu Asn Gly Ser Val Ile Tyr Gln Ser Phe Lys Asn Ar g 325 330 335 Gly Asp Tyr Ala Ser Ser Pro Arg Ser Ile Leu Met Lys Cys Cys Trp 340 345 350 Arg Glu Asp Glu Ala Asp Glu Glu Val Glu Lys 355 360
【００８９】 配列番号：９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTTTTGGATG GAGTGATTCA 20SEQ ID NO: 9 Sequence length: 20 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: GTTTTGGATG GAGTGATTCA 20
【００９０】 配列番号：１０ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GTGAATCTCA GCGTTGTA 18SEQ ID NO: 10 Sequence length: 18 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: GTGAATCTCA GCGTTGTA 18
【００９１】 配列番号：１１ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TATGTGCTGT CTGAGTCGAG C 21SEQ ID NO: 11 Sequence length: 21 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: TATGTGCTGT CTGAGTCGAG C 21
【００９２】 配列番号：１２ 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GCTAAACCCA TCTTCAGGGG T 21SEQ ID NO: 12 Sequence length: 21 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: GCTAAACCCA TCTTCAGGGG T 21
【００９３】 配列番号：１３ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： GGGCTKGGAR TSGACTAY 18SEQ ID NO: 13 Sequence length: 18 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: GGGCTKGGAR TSGACTAY 18
【００９４】 配列番号：１４ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： KCCRTCRCTG TCRCASGT 18SEQ ID NO: 14 Sequence length: 18 Sequence type: nucleic acid Number of strands: single-stranded Sequence type: other nucleic acid Synthetic DNA sequence: KCCRTCRCTG TCRCASGT 18
【図１】キュウリ‘四葉’とクロダネカボチャの根の成
長に及ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 1 is a diagram showing the effect of temperature on root growth of cucumber 'four leaves' and black squash squash.
【図２】キュウリ‘四葉’とクロダネカボチャの根のプ
トレシン濃度に及ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 2 is a graph showing the effect of temperature on putrescine concentrations in the roots of cucumber 'four leaf' and black squash.
【図３】キュウリ‘四葉’とクロダネカボチャの根のス
ペルミジン濃度に及ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 3 is a graph showing the effect of temperature on the spermidine concentration in the roots of cucumber 'four-leaf' and black squash.
【図４】キュウリ‘四葉’とクロダネカボチャの根のス
ペルミン濃度に及ぼす温度の影響を示す図である。FIG. 4 is a graph showing the effect of temperature on the spermine concentration in the roots of cucumber 'four-leaf' and black squash.
【図５】クロダネカボチャの各組織におけるＣｆＳＰＤ
１遺伝子の発現結果を示す図である。FIG. 5: CfSPD in each tissue of black squash
It is a figure which shows the expression result of one gene.
【図６】クロダネカボチャの各組織におけるＣｆＳＡＭ
１遺伝子の発現結果を示す図である。FIG. 6: CfSAM in each tissue of black squash
It is a figure which shows the expression result of one gene.
【図７】クロダネカボチャの各組織におけるＣｆＡＤＣ
１遺伝子の発現結果を示す図である。FIG. 7: CfADC in each tissue of black squash
It is a figure which shows the expression result of one gene.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:01） ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI theme coat ゛ (Reference) // (C12N 1/21 C12R 1:01)
Claims (29)
トレス遭遇時に発現量が変化することを特徴とする単離
された植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子。1. An isolated plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene, wherein the expression level of polyamine metabolism in a plant changes when a low-temperature stress is encountered.
子である請求項１記載の植物由来のポリアミン代謝関連
酵素遺伝子。2. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, which is a gene encoding spermidine synthase.
コードする遺伝子である請求項１記載の植物由来のポリ
アミン代謝関連酵素遺伝子。3. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, which is a gene encoding S-adenosylmethionine decarboxylase.
子である請求項１記載の植物由来のポリアミン代謝関連
酵素遺伝子。4. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, which is a gene encoding arginine decarboxylase.
よび配列番号７のいずれかに記載される塩基配列を含有
する請求項１記載の植物由来のポリアミン代謝関連酵素
遺伝子。5. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, which comprises the nucleotide sequence of any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, and SEQ ID NO: 7.
よび配列番号８のいずれかに記載されるアミノ酸配列を
コードする請求項１記載の植物由来のポリアミン代謝関
連酵素遺伝子。6. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, which encodes the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 8.
いずれかに記載の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺
伝子。7. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to any one of claims 1 to 6, wherein the plant is a dicotyledonous plant.
いずれかに記載の植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺
伝子。8. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, wherein the plant is a Cucurbitaceae plant.
項１〜６のいずれかに記載の植物由来のポリアミン代謝
関連酵素遺伝子。9. The plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, wherein the plant is a black squash plant.
代謝関連酵素遺伝子を部分的に置換もしくは削除するか
または他の遺伝子を挿入もしくは付加した遺伝子であっ
て、請求項１記載の植物由来のポリアミン代謝関連酵素
遺伝子と同様の作用効果を有する遺伝子。10. The plant-derived polyamine according to claim 1, which is a gene obtained by partially substituting or deleting the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1, or inserting or adding another gene. A gene having the same effect as a metabolic enzyme gene.
代謝関連酵素遺伝子を部分的に置換もしくは削除するか
または他の遺伝子を挿入もしくは付加した遺伝子であっ
て、請求項５記載の植物由来のポリアミン代謝関連酵素
遺伝子と同様の作用効果を有する遺伝子。11. The plant-derived polyamine according to claim 5, which is a gene obtained by partially substituting or deleting the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 5, or inserting or adding another gene. A gene having the same effect as a metabolic enzyme gene.
代謝関連酵素遺伝子とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得ることを特徴とする遺伝子。12. A gene capable of hybridizing with the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1 under stringent conditions.
代謝関連酵素遺伝子とストリンジェントな条件下でハイ
ブリダイズし得ることを特徴とする遺伝子。13. A gene capable of hybridizing with the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 5 under stringent conditions.
代謝関連酵素遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ。14. An antisense DNA against the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1.
代謝関連酵素遺伝子に対するアンチセンスＤＮＡ。15. An antisense DNA against the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 5.
代謝関連酵素遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ。16. An antisense RNA against the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1.
代謝関連酵素遺伝子に対するアンチセンスＲＮＡ。17. An antisense RNA against the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 5.
代謝関連酵素遺伝子含むことを特徴とする組換えプラス
ミド。18. A recombinant plasmid comprising the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 1.
由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子含むことを特徴と
する組換えプラスミド。19. A recombinant plasmid comprising the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to any one of claims 2 to 4.
ポリアミン代謝関連酵素遺伝子含むことを特徴とする組
換えプラスミド。20. A recombinant plasmid comprising the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 5 or 6.
来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子含むことを特徴とす
る組換えプラスミド。21. A recombinant plasmid comprising the plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene according to claim 10 or 11.
含むことを特徴とする形質転換体。A transformant comprising the recombinant plasmid according to claim 18.
含むことを特徴とする形質転換体。23. A transformant comprising the recombinant plasmid according to claim 19.
含むことを特徴とする形質転換体。24. A transformant comprising the recombinant plasmid according to claim 20.
含むことを特徴とする形質転換体。A transformant comprising the recombinant plasmid according to claim 21.
る植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換されたことを特徴とする微生物。26. A microorganism characterized by being transformed with a plasmid containing a plant-derived polyamine metabolism-related enzyme gene whose expression level changes upon encountering low-temperature stress.
はアグロバクテリウム（Agrobacterium）属細菌である
請求項２６記載の形質転換された微生物。27. The transformed microorganism according to claim 26, wherein the transformed microorganism is a bacterium belonging to the genus Escherichia coli or Agrobacterium.
る植物由来のポリアミン代謝関連酵素遺伝子を含むプラ
スミドで形質転換されたことを特徴とする植物。28. A plant which has been transformed with a plasmid containing a polyamine metabolism-related enzyme gene derived from a plant whose expression level changes upon encountering low-temperature stress.
である請求項２８記載の形質転換された植物。29. The transformed plant according to claim 28, wherein the transformed plant is Arabidopsis thaliana.
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002023974A1 (en) * | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Toyobo Research Center Co., Ltd. | Plant having improved tolerance to various environmental stresses, method of constructing the same and polyamine metabolism-relating enzyme gene |
| WO2003084314A1 (en) * | 2002-04-08 | 2003-10-16 | Toyobo Research Center Co., Ltd. | Plant with improved organogenesis and method of constructing the same |
| JP2004180588A (en) * | 2002-12-03 | 2004-07-02 | Toyobo Research Center Co Ltd | Plant with improved resistance to environmental stress, and method for creating the same |
| JP2007000021A (en) * | 2005-06-21 | 2007-01-11 | Toyobo Co Ltd | Plant improved in resistance to environmental stress by polyamine metabolism control and method for preparing the same |
| JP2007291027A (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
| JP2011239786A (en) * | 2011-08-09 | 2011-12-01 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
| JP2012006954A (en) * | 2011-08-09 | 2012-01-12 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
-
2000
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Cited By (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7238861B2 (en) | 2000-09-20 | 2007-07-03 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plant having improved tolerance to various environmental stresses, method of constructing the same and polyamine metabolism-relating enzyme gene |
| US7888554B2 (en) | 2000-09-20 | 2011-02-15 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plants having improved tolerance to various types of environmental stress, their production, and polyamine metabolism-related enzyme genes |
| WO2002023974A1 (en) * | 2000-09-20 | 2002-03-28 | Toyobo Research Center Co., Ltd. | Plant having improved tolerance to various environmental stresses, method of constructing the same and polyamine metabolism-relating enzyme gene |
| CN100389200C (en) * | 2002-04-08 | 2008-05-21 | 东洋纺织株式会社 | Plant with improved organogenesis and method of constructing the same |
| US7446242B2 (en) | 2002-04-08 | 2008-11-04 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same |
| EP2064943A3 (en) * | 2002-04-08 | 2009-06-24 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same |
| WO2003084314A1 (en) * | 2002-04-08 | 2003-10-16 | Toyobo Research Center Co., Ltd. | Plant with improved organogenesis and method of constructing the same |
| US8053629B2 (en) | 2002-04-08 | 2011-11-08 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | Plants with improved morphogenesis and method of constructing the same |
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| JP2004180588A (en) * | 2002-12-03 | 2004-07-02 | Toyobo Research Center Co Ltd | Plant with improved resistance to environmental stress, and method for creating the same |
| JP4649816B2 (en) * | 2002-12-03 | 2011-03-16 | 東洋紡績株式会社 | Plants with improved environmental stress resistance and methods for producing the same |
| JP2007000021A (en) * | 2005-06-21 | 2007-01-11 | Toyobo Co Ltd | Plant improved in resistance to environmental stress by polyamine metabolism control and method for preparing the same |
| JP2007291027A (en) * | 2006-04-26 | 2007-11-08 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
| JP2011239786A (en) * | 2011-08-09 | 2011-12-01 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
| JP2012006954A (en) * | 2011-08-09 | 2012-01-12 | Toyobo Co Ltd | Method for preparing polyamine composition from plant |
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