FR2767336A1 - Vecteurs recombinants, polynucleotide codant pour un polypeptide pd428 de 12kd de mycobacteries appartenant au complexe de mycobacterium tuberculosis et applications au diagnostic et a la prevention de la tuberculose - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet de nouveaux vecteurs recombinants se réplicant chez les mycobactéries, des procédés de criblage incluant lesdits vecteurs, des polypeptides, dont le polypeptide DP428, et leur séquence nucléique, correspondant à des polypeptides exportés retrouvés dans les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis.L'invention concerne également des procédés et des kits de détection de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique utilisant lesdits polypeptides, leurs anticorps spécifiques ou lesdits polynucléotides, ainsi que des compositions immunogènes ou vaccinales pour la prévention et/ou le traitement d'infections provoquées par des mycobactéries appartenant audit complexe, en particulier la tuberculose.

Description

l 2767336 Vecteurs recombinants, polynucléotide codant pour un polypeptide

DP428 de 12kD de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis et applications au

diagnostic et à la prévention de la tuberculose.

L'invention a pour objet de nouveaux vecteurs recombinants de criblage, de clonage et/ou d'expression se réplicant chez les mycobactéries. L'invention concerne également un polypeptide, dénommé DP428, d'environ 12kD correspondant à une protéine exportée retrouvée dans les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis. L'invention vise aussi un polynucléotide comprenant une séquence codant pour ce polypeptide. Elle concerne également l'utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci et des polynucléotides codant pour ces derniers pour la réalisation de moyens de détection in vitro de la présence d'une mycobactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique. L'invention vise enfin l'utilisation du polypeptide ou de fragments de celui-ci ainsi que des polynucléotides codant pour ces derniers en tant que moyens destinés à la préparation d'une composition immunogène, susceptible d'induire une réponse immunitaire dirigée contre les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, ou d'une composition vaccinale pour la prévention et/ou le traitement d'infections provoquées par des mycobactéries appartenant audit complexe, en particulier la tuberculose. 3M Le genre Mycobacterium, qui comprend au moins 56 espèces différentes, inclut des pathogènes humains majeurs tels que M. leprae et M. tuberculosis, les agents responsables de la lèpre et de la tuberculose, qui restent des problèmes graves de santé

publique dans le monde entier.

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La tuberculose continue d'être un problème de santé publique dans le monde. Aujourd'hui, cette maladie est la cause de 2 à 3 millions de morts dans le monde et environ 8 millions de nouveaux cas sont observés chaque année (Bouvet, 1994). Dans les pays développés M. tuberculosis est la cause la plus commune des infections mycobactériennes. En France il apparaît environ 10 000 nouveaux cas par an et parmi les maladies à déclaration obligatoire c'est la tuberculose qui comprend le plus grand nombre de cas. La vaccination par le BCG (Bacille de Calmette et Guérin), une souche avirulente dérivée de M. bovis et qui est très utilisé comme vaccin contre la tuberculose, est loin d'être efficace au sein de toutes les populations. Cette efficacité varie environ de 80% dans les pays occidentaux comme l'Angleterre, à 0% en Inde (résultats du dernier essai de vaccination à Chingleput., publiés en 1972 dans Indian J. Med. Res.). De plus, l'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes aux antituberculeux et le risque accru chez les patients immunodéprimés, patients atteints du SIDA, de développer une tuberculose, rendent nécessaire la mise au point de méthodes rapides, spécifiques et fiables pour le diagnostic de la tuberculose. Par exemple, une étude épidémiologique réalisée en Floride, et dont les résultats ont été publiés en 1993 dans AIDS thérapies, a montré que 10% des malades atteints de SIDA sont atteint de tuberculose au moment du diagnostic du SIDA ou 18 mois avant celui-ci. Chez ces malades, la tuberculose apparaît dans 60% des cas sous une forme disséminée donc non repérable par les critères de diagnostic classiques

comme la radiographie pulmonaire ou l'analyse de crachats.

Actuellement, une certitude sur le diagnostic apporté par la mise en évidence de bacilles cultivables dans un prélèvement provenant du malade n'est obtenue que pour moins de la moitié des cas de tuberculose, même dans les cas de tuberculose pulmonaire. Le diagnostic de la tuberculose et des autres mycobactéries apparentées est donc difficile à réaliser, et cela pour différentes raisons: les mycobactéries sont souvent présentes en faible quantité, leur temps de génération est très

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long (24h pour M. tuberculosis) et leur culture est difficile.

(Bates et al., 1986).

D'autres techniques sont utilisables en clinique, pour identifier une infection mycobactérienne: a). L'identification directe des microorganismes au microscope; cette technique est rapide, mais ne permet pas l'identification de l'espèce mycobactérienne observée et manque

de sensibilité (Bates, 1979).

Les cultures, lorsqu'elles sont positives, ont une spécificité approchant 100% et permettent l'identification de

l'espèce mycobactérienne isolée; néanmoins, comme précisé ci-

dessus, la croissance des mycobactéries in vitro est longue (ne peut être réalisée qu'en 3 à 6 semaines de cultures répétées

(Bates, 1979; Bates et al., 1986)) et coûteuse.

b). Les techniques sérologiques peuvent s'avérer utiles dans certaines conditions, mais leur utilisation est parfois limitée par leur sensibilité et/ou leur spécificité faibles

(Daniel et al., 1987).

c). La présence de mycobactéries au sein d'un échantillon biologique peut aussi être déterminée par hybridation moléculaire avec de l'ADN ou de l'ARN en utilisant des sondes d'oligonucléotides spécifiques des séquences recherchées (Kiehn et al., 1987; Roberts et al., 1987; Drake et al., 1987). Plusieurs études ont montré l'intérêt de cette

technique pour le diagnostic des infections à mycobactéries.

Les sondes utilisées sont constituées d'ADN, d'ARN ribosomique ou de fragments d'ADN mycobactériens non caractérisés et provenant de banque de gènes. Le principe de ces techniques repose sur le polymorphisme des séquences nucléotidiques des fragments utilisés ou sur le polymorphisme des régions avoisinantes. Dans tous les cas, elles nécessitent l'utilisation de cultures et ne sont pas applicables

directement sur les échantillons biologiques.

La faible quantité de mycobactéries présentes au sein d'un >t échantillon biologique et en conséquence la quantité faible d'ADN cible à détecter dans cet échantillon peut nécessiter le recours à une amplification spécifique in vitro de l'ADN cible

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avant sa détection à l'aide de la sonde nucléotidique et en utilisant des techniques d'amplification in vitro telles que la PCR (amplification en chaîne à la polymérase L'amplification spécifique de l'ADN par la technique PCR peut constituer la première étape d'un procédé de détection de la présence d'un ADN mycobactérien dans un échantillon biologique, la détection proprement dite de l'ADN amplifié étant effectuée dans un second temps à l'aide d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement à l'ADN

amplifié.

Un test de détection de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, par hybridation sandwich (test utilisant une sonde de capture et une sonde de détection) a été décrit par Chevrier et al. en 1993. le complexe de Mycobacterium tuberculosis est un groupe de mycobactéries qui comprend M. bovis-BCG, M. bovis, M.

tuberculosis, M. africanum et M. microti.

Un procédé de détection de faibles quantités de mycobactéries, appartenant au complexe tuberculosis, par amplification génique et hybridation directement sur des échantillons biologiques a été mis au point. Ledit procédé utilise la séquence d'insertion IS6110 (Brevet européen EP 0 490 951 BU). Thierry et al. ont décrit en 1990 une séquence spécifique du complexe Mycobacterium tuberculosis et nommée IS 6110. Certains auteurs ont proposé d amplifier spécifiquement l'ADN provenant de Mycobacterium en utilisant des amorces nucléiques dans une méthode d'amplification, telle que la réaction de polymérase en chaîne (PCR). Patel et al. ont décrit en 1990 l'utilisation de plusieurs amorces nucléiques choisies à partir d'une séquence connue en tant que sonde dans l'identification de M. tuberculosis. Cependant, la longueur des fragments obtenue en utilisant ces amorces était différente de la longueur théorique attendue et plusieurs fragments de taille variable étaient obtenus. De plus, les auteurs ont observé 3> l'absence d'hybridation des produits amplifiés avec le plasmide

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ayant servi à déterminer les amorces. Ces résultats indiquent que ces amorces ne seraient pas appropriées dans la détection de la présence de M. tuberculosis dans un échantillon biologique et confirment la nature critique du choix des amorces. La même année, J.L. Guesdon et D. Thierry ont décrit une méthode de détection de M. tuberculosis, de grande sensibilité, par amplification d'un fragment d'ADN de M. tuberculosis localisé au sein de la séquence IS6110 (Brevet européen EP 461 045) à l'aide d'amorces générant des fragments () d'ADN amplifié de longueur constante, même lorsque le choix des amorces conduisait à l'amplification de fragments longs (de l'ordre de 1000 à 1500 bases) o le risque d'interruption de la polymérisation est élevée en raison des effets de la structure secondaire de la séquence. D'autres amorces spécifiques de la

séquence IS6110 sont décrites dans le brevet européen N EP-

0490 951.

Les inventeurs ont montré (résultats non publiés) que certains isolats cliniques de Mycobacterium tuberculosis étaient exempts de la séquence d'insertion IS6110 et ne pouvaient donc être détectés à l'aide des oligonucléotides spécifiques de cette séquence pouvant conduire ainsi à des résultats de diagnostic faussement négatifs. Ces résultats confirment une observation similaire faite par Yuen et al. en 1993. L'impossibilité de détecter ces souches pathogènes potentiellement présentes dans un échantillon biologique prélevé sur un patient est ainsi susceptible de conduire à des

difficultés voire des erreurs de diagnostic.

M. bovis et M. tuberculosis, les agents causals de la

tuberculose, sont des bactéries facultatives intracellulaires.

Ces agents ont développé des mécanismes pour assurer leur survie et leur réplication à l'intérieur du macrophage, un des types cellulaires qui est supposé éradiquer l'invasion par des microorganismes. Ces agents sont capables de moduler l'évolution normale de leur phagosome et de les empêcher de se différencier en un compartiment acide riche en hydrolase (5, 6,

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23, 26). Cependant, cette modulation n'est possible que si la bactérie est vivante au sein du phagosome, suggérant que des composés synthétisés de manière active et/ou sécrétés à l'intérieur de la cellule font partie de ce mécanisme. Des protéines exportées sont probablement impliquées dans ce mécanisme. En dépit des problèmes majeurs de santé liés à ces organismes pathogènes, on sait peu de choses sur leurs protéines exportées et/ou sécrétées. Des analyses en SDS-PAGE de filtrat de culture de M. tuberculosis montrent au moins 30 protéines sécrétées (1,19,38). Certaines d'entre elles ont été

caractérisées, leurs gènes clonès et séquences (7,35,37).

D'autres, bien qu'il s'agisse d'antigènes immunodominants d'importance majeure pour induire une immunité protectrice (2,21), ne sont pas totalement identifiés. En outre, il est [5 probable que de nombreuses protéines exportées restent fixées sur la membrane cellulaire et par conséquent ne soient pas présentes dans les surnageants de culture. Il a été montré que les protéines localisées à la surface externe de diverses bactéries pathogènes, telles que l'invasine de 103 kDa de Yersina Pseudotuberculosis (14) ou l'internaline de 80 kDa de Listeria monocytoqenes (10) jouent un rôle important dans les interactions avec les cellules hôtes et par conséquent, dans la

pathogénicité comme dans l'induction de réponses protectrices.

Ainsi, une protéine liée à la membrane pourrait être importante pour l'infection à M. tuberculosis comme pour l'induction de réponse protectrice contre cette infection. Ces protéines pourraient revêtir un intérêt certain pour la préparation de vaccins. Récemment, il a été décrit l'adaptation aux mycobactéries d'une méthodologie génétique pour l'identification et la sélection phénotypique de protéines exportées (15). Cette méthode utilise la phosphatase alkaline (PhoA) périplasmique d'E. coli. Un vecteur plasmidique a été construit permettant la fusion de gènes entre un gène PhoA tronquée et des gènes codant pour des protéines exportées (3, 11).

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Par cette méthode, il a pu être identifier un gène de M. tuberculosis (erp (2)) présentant des homologies avec une protéine exportée de 28 kDa de M. leprae, qui est une cible fréquente des réponses humorales de la forme lépromateuse de la lèpre, et avec une protéine présentant des motifs aminoacides

caractéristiques de la désaturase de plante (des).

Cependant, cette méthode génétique d'identification de protéines exportées ne permet pas d'évaluer facilement l'expression intracellulaire des gènes correspondants. Une telle évaluation est d'une importance primordiale à la fois pour la sélection de bons candidats vaccins et pour la compréhension des interactions entre les bactéries et leurs cellules hôtes. L'induction de l'expression de facteur de

virulence par contact de cellule cible pathogène a été décrite.

C'est le cas par exemple pour le facteur de virulence Yops (18) de Yersina pseudotuberculosis. Shigella par contact avec les cellules cibles relargue les protéines Ipa dans le milieu de culture, et Salmonella synthétise de nouvelles structures de surface. Compte tenu de ce qui précède, il existe aujourd'hui un grand besoin de développer de nouveaux vaccins contre les mycobactéries pathogène ainsi que de nouveaux tests de diagnostic spécifiques, fiables et rapides. Ces développements nécessitent la mise au point d'outils spécifiques encore plus performants permettant, d'une part, d'isoler ou d'obtenir des séquences de nouveaux polypeptides spécifiques, notamment immunogènes, et, d'autre part, de mieux comprendre le mécanisme des interactions entre les bactéries et leurs cellules hôtes comme notamment l'induction de l'expression de facteur de virulence. Ceci est précisément l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont défini et réalisé dans ce but de nouveaux vecteurs permettant le criblage, le clonage et/ou l'expression de séquences d'ADN de mycobactéries afin d'identifier parmi ces séquences, des acides nucléiques codant

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pour des protéines d'intérêt, de préférence des protéines exportées, pouvant être localisées sur la membrane bactérienne et/ou sécrétes, et d'identifier parmi ces séquences celles qui

sont induites ou réprimées lors de l'infection.

L'invention vise aussi de nouveaux polypeptides et de nouveaux polynucléotides de mycobactéries ayant pu être isolés au moyen des vecteurs précédents et susceptibles d'entrer dans la réalisation de compositions pour la détection d'une infection par des mycobactéries, ou pour la protection contre

une infection due à des mycobatéries.

L'invention a donc pour objet un vecteur recombinant de criblage, de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce 1J qu'il se réplique chez des mycobactéries et en ce qu'il contient: 1) un réplicon fonctionnel chez les mycobactéries; 2) un marqueur de sélection; 3) une cassette reporteur comprenant: a) un site de clonage multiple (polylinker), b) éventuellement un terminateur de transcription actif chez les mycobactéries, en amont du polylinker, c) une séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'expression, d'exportation et/ou de sécrétion de protéine, ladite séquence nucléotidique étant dépourvue de son codon d'initiation et de ses séquences de régulation, et d) une séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'activité de promoteurs contenus dans ( le même fragment, ladite séquence nucléotidique étant pourvue

de son codon d'initiation.

Le marqueur d'exportation et/ou de sécrétion est une séquence de nucléotides dont l'expression suivie de l'exportation et/ou de la secrétion dépend des éléments de

régulation qui contrôlent son expression.

Par "séquences ou éléments de régulation de l'expression

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de la production de polypeptides et de sa localisation'', on entend une séquence promotrice de la transcription, une séquence comprenant le site de liaison au ribosome (RBS), les séquences responsables de l'exportation et/ou la sécrétion telles que la séquence dite séquence signale. Un premier marqueur intéressant d'exportation et/ou d'expression est une séquence codante issue du gêne phoA. Le cas échéant, elle est tronquée de telle façon que l'activité phosphatase alcaline est cependant susceptible d'être restaurée lorsque la séquence codante tronquée est placée sous le

contrôle d'un promoteur et d'éléments de régulation appropriés.

D'autres marqueurs d'exposition, d'exportation et/ou de sécrétion peuvent être utilisés. On citera à titre d'exemples une séquence du gène 3-agarase, de la nucléase d'un

staphylocoque ou d'une P-lactamase.

Parmi les marqueurs intéressants d'activité de promoteurs contenus dans le même fragment, on préfère une séquence codante issue du gêne luc de luciférase de luciole pourvue de son codon d'initiation. D'autres marqueurs d'activité de promoteurs contenus dans le même fragment peuvent être utilisés. On citera à titre d'exemples une séquence du gène de la GFP (Green Fluorescent Protein). Le terminateur de transcription doit être fonctionnel chez les mycobactéries. Un terminateur avantageux est à cet égard le terminateur du coliphage T4 (tT4). D'autres terminateurs appropriés pour la réalisation de l'invention peuvent être isolés en utilisant la technique présentée dans les exemples,

par exemple au moyen du vecteur cassette.

Un vecteur particulièrement préféré pour la réalisation de l'invention est un plasmide choisi parmi les plasmides suivants déposés à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Paris, France): a) pJEVDa déposé à la CNCM sous le N 1-1797, le 12/12

1996,

b) pJEVDb déposé à la CNCM sous le N 1-1906, le 25

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juillet 1997, c) pJEVDc déposé à la CNCM sous le N 1-1799, le 12/12 1996,

d) pJEVD/M. tuberculosis déposé à la CNCM sous le N 1-

1907, le 25 juillet 1997.

Pour la sélection, ou l'identification de séquences d'acides nucléiques de mycobactéries codant pour des polypeptides susceptibles d'être incorporés dans des I( compositions immunogènes, ou antigéniques pour la détection d'une infection, ou susceptibles d'induire ou de réprimer un facteur de virulence de mycobactéries, le vecteur de l'invention comprendra, en l'un des sites de clonage multiple du polylinker, une séquence de nucléotides d'une mycobactérie chez laquelle on détecte la présence de séquences correspondant à des polypeptides exportés et/ou sécrétés pouvant être induits ou réprimés lors de l'infection, ou encore exprimés ou produits de façon constitutive, leurs séquences promotrices et/ou régulatrices associées susceptibles de permettre ou de 2() favoriser l'exportation et/ou la sécrétion desdits polypeptides d'intérêt, ou tout ou partie de gènes d'intérêt codant pour

lesdits polypeptides.

De préférence, cette séquence est obtenue par fragmentation physique ou par digestion enzymatique de l'ADN génomique ou de l'ADN complémentaire d'un ARN d'une

mycobactérie et de préférence d'une mycobactérie pathogène.

Selon un premier mode de réalisation de l'inventionr la digestion enzymatique de l'ADN génomique ou de 1'ADN

complémentaire est effectuée à partir de M. tuberculosis.

3() De préférence cet ADN est digéré avec une enzyme telle

que sau3A, BclI,BglII.

D'autres enzymes de digestion telles que ScaI, ApaI, SacII, KDnI ou encore des nucléases ou des polymérases, peuvent naturellement être mises en oeuvre, dès lors qu'elles permettent l'obtention de fragments dont les extrémités peuvent être insérées dans l'un des sites de clonage du polylinker du

vecteur de l'invention.

il 2767336 Le cas échéant, des digestions avec différentes enzymes

seront effectuées simultanément.

Des vecteurs recombinants préférés pour la réalisation de l'invention sont choisis parmi les vecteurs recombinants suivants déposés à la CNCM: a) p6D7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I--1814, b) p5A3 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1815, c) p5F6 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1816, d) p2A29 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1817,

e) pDP428 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-

1818, f) p5B5 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1819, g) plC7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1820, h) p2D7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1821,

i) plB7 déposé le 31 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1843.

Parmi les plus préférés, on préfère le vecteur recombinant pDP428 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1818, Les vecteurs de l'invention peuvent également être utilisés pour déterminer la présence de séquences d'intérêt, de préférence correspondant à des protéines exportées et/ou sécrétées, et/ou capables d'être induites ou réprimées lors de l'infection, notamment lors de la phagocytose par les macrophages, pJEVD et selon ce qui a été exposé précédemment, chez des mycobactéries telles que M. africanum, M. bovis, M. avium ou M. leprae dont on aura traité l'ADN ou l'ADNc avec des

enzymes déterminées.

3) L'invention à également pour objet un procédé de criblage de séquences de nucléotides issues de mycobactéries pour déterminer la présence de séquences correspondant à des polypeptides exportés et/ou sécrétés pouvant être induits ou réprimés lors de l'infection, leurs séquences promotrices et/ou 3 régulatrices associées susceptibles notamment de permettre ou de favoriser l'exportation et/ou la sécrétion desdits polypeptides d'intérêt, ou tout ou partie de gènes d'intérêt

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codant pour lesdits polypeptides, caractérisé en ce qu'il met

en oeuvre un vecteur recombinant selon l'invention.

L'invention concerne aussi un procédé de criblage, selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) la digestion des séquences d'ADN de mycobactéries par au moins une enzyme déterminée et la récupération des fragnents de digestion obtenus; b) l'insertion des fragments de digestion dans un site de () clonage compatible avec l'enzyme de l'étape a) du polylinker d'un vecteur selon l'invention; c) si besoin, l'amplification du fragment de digestion contenu dans le vecteur, par exemple par réplication de ce dernier après insertion du vecteur ainsi modifié dans une cellule déterminée, par exemple E coli; d) la transformation des cellules hôtes par le vecteur amplifié à l'étape c), ou en l'absence d'amplification, par le vecteur de l'étape b); e) la culture des cellules hôtes transformées dans un milieu permettant la mise en évidence du marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou du marqueur d'activité de promoteurs contenu dans le vecteur; f) la détection des cellules hôtes positive::...O.s (colonies positives) pour l'expression du marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou du marqueur d'activité de promoteurs; g) l'isolement de l'ADN des colonies positives et l'insertion de cet ADN dans une cellule identique à celle de l'étape c); h) la sélection des insertions contenues dans le vecteur, permettant l'obtention de clones positifs pour le marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou pour le marqueur d'activité de promoteurs; i) l'isolement et la caractérisation des fragments d'ADN

de mycobactéries contenues dans ces insérats.

La mise en oeuvre de ce procédé permet la construction de banques d'ADN comportant des séquences correspondant à des

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polypeptides susceptibles d'être exportés et/ou sécrétés, et/ou susceptibles d'être induits ou réprimés lors de l'infection lorsqu'ils sont produits au sein de mycobactéries recombinantes. L'étape i) du procédé peut comprendre une étape de séquençage des insertions sélectionnées. De préférence, dans le procédé selon l'invention, le vecteur utilisé est choisi parmi les plasmides pJEVDa (CNCM, N I-1797),pJEVDb (CNCM, N 1-1906), pJEVDc (CNCM, N 1-1799) ou pJEVD/M. tuberculosis (CNCM, N I-1907, 1907), et la digestion des séquences d'ADN de mycobactéries est effectuée au

moyen de l'enzyme sau3A.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le procédé de criblage est caractérisé en ce que les séquences de mycobactéries sont issues d'une mycobactérie pathogène, par exemple de M. tuberculosis, M. bovis, M. avium, M. africanum ou

M. leprae.

L'invention comprend également une banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactérie, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé comprenant les étapes a), b) et c) du procédé précédent selon l'invention, de préférence une banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactéries pathogènes, de préférence de mycobactéries appartenant au groupe du complexe Mycobacterium tuberculosis, de préférence de Mycobacterium

tuberculosis.

L'invention à également pour objet les séquences nucléotidiques de mycobactéries sélectionnées après la

réalisation du procédé selon l'invention ci-dessus décrit.

Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, des séquences préférées sont par exemple les fragments d'ADN de mycobactéries de séquence SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9 ou SEQ ID N 10,

contenus respectivement dans les vecteurs p6D7 (CNCM, N I-

1814), p5A3 (CNCM, N I-1815),p5F6 (CNCM, N I-1816), p2A29 (CNCM, N I-1817), p5B5 (CNCM, N I-1819),plC7 (CNCM, N I-1820),

p2D7 (CNCM,N I-1821) et plB7(CNCM, N I-1843).

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On préfére également les séquences nucléiques SEQ ID N 11

et SEQ ID N 24.

Lorsque la séquence codante issue du gène marqueur d'exportation et/ou de sécrétion est une séquence issue du gène phoA, l'exportation et/ou la sécrétion du produit du gène phoA, le cas échéant tronqué, n'est obtenue que lorsque cette séquence est insérée en phase avec la séquence ou élément de régulation de l'expression de la production de polynucléotides et sa localisation placée en amont, qui contient les éléments contrôlant l'expression, l'exportation et/ou la sécrétion issus

de séquence de mycobactéries.

Les vecteurs recombinants de l'invention peuvent bien entendu comprendre des sites de clonage multiples décalés de un ou deux nucléotides par rapport à un vecteur selon l'invention, permettant ainsi d'exprimer le polypeptide correspondant au fragment d'ADN de mycobactérie inséré et susceptible d'être traduit selon l'un des trois cadres de

lecture possibles.

() Par exemple les vecteurs préférés pJVEDb et pJVEDc de l'invention se distinguent du vecteur préféré pJVEDa par un décalage respectif de un et de deux nucléotides au niveau du

site de clonage multiple.

Ainsi, les vecteurs de l'invention sont capables d'exprimer chacun des polypeptides susceptibles d'être codés par fragment d'ADN de mycobactérie inséré. Cesdits polypeptides, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être codés par ledit fragment d'ADN et en ce qu'ils sont susceptibles d'être exportés et/ou sécrétés, et/ou induits ou

3(0 réprimés lors de l'infection, font partie de l'invention. L'invention a aussi pour objet des mycobactéries recombinantes contenant

un vecteur recombinant selon l'invention décrit précédemment. Une mycobactérie préférée est

une mycobactérie du type M. smeqmatis.

M. smeqmatis permet avantageusement de tester l'efficacité de séquences de mycobactéries, pour le contrôle de l'expression, de l'exportation et/ou de la sécrétion, et/ou de

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l'activité de promoteurs d'une séquence donnée, par exemple d'une séquence codant pour un marqueur tel que la phosphatase

alcaline et/ou la luciférase.

Une autre mycobactérie préférée est une mycobactérie du type M. bovis, par exemple la souche BCG utilisée actuellement

pour la vaccination contre la tuberculose.

Une autre mycobactérie préférée est une souche de M. tuberculosis, M. bovis ou M.africanum possédant potentiellement

tous les systèmes de régulation appropriés.

Les inventeurs ont ainsi caractérisé un polynucléotide constitué par une séquence de nucléotides présente chez toutes les souches testées de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis. Ce polypeptide, dénommé DP428 contient un cadre ouvert de lecture (ORF) codant pour un polypeptide d'environ 12 kD. Ce poids moléculaire(PM) correspond au PM théorique de la protéine mature obtenue après clivage de la séquence signale, le PM de la protéine ou polypeptide DP428 étant d'environ 10 kD après ancrage potentiel au peptidoglycane et coupure potentielle entre S et G du motif

LPISG.

Ce polynucléotide inclut, d'une part, un cadre ouvert de lecture correspondant à un gène de structure et, d'autre part, les signaux de régulation de l'expression de la séquence codante en amont et en aval de cette dernière.Le polypeptide DP428 est composé d'un peptide signal, d'une région centrale hydrophile et d'une région C-terminale hydrophobe. Cette dernière se termine par deux résidus arginines (R),signal de rétention, et est précédé par un motif LPISG qui rappelle le

motif LPXTG d'ancrage au peptidoglycane (Schneewind et al).

Par gène de structure aux fins de la présente invention, on entend un polynucléotide codant pour une protéine, un polypeptide ou encore un fragment de ces derniers, ledit polynucléotide ne comprenant que la séquence correspondant au cadre ouvert de lecture (ORF), ce qui exclut les séquences du côté 5' du cadre ouvert de lecture (ORF) qui dirigent

l'initiation de la transcription.

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Ainsi, l'invention concerne un polynucléotide de séquence

SEQ ID N 01.

Plus particulièrement, l'invention concerne un polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi: a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 01 ou SEQ ID N 2, b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou c), e) un fragment de polynucléotide défini en a), b), c) ou d),

et comportant au moins 8 nucléotides.

On entend par séquence nucléotidique, polynucléotide ou acide nucléique, selon la présente invention, aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de

transcription desdits ADN.

Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N01 ou d'une partie de la SEQ ID N01, et dont

l'orientation est inversée.

Par pourcentage d'homologie au sens de la présente invention, on entend un pourcentage d'identité entre les bases des deux polynucléotides homologues, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. ) Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien

de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires.

A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes:

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l'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 C, en présence de tampon commercialisé sous le nom de rapid-hyb buffer par Amersham (RPN 1636) et 100

Mg/ml d'ADN de E.coli.

Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être les suivantes: - deux lavages de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - deux lavages de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un ) tampon 2 x SSC et 0,1% SDS; - un lavage de 10 min, préférentiellement à 65 C, dans un

tampon de 0,1 x SSC et 0,1% SDS.

1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M citrate de Na et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02% Ficoll, 0,02%

de polyvinylpyrrolidone et 0,02% de sérum albumine bovine.

Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 8 nucléotides, de préférence au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides consécutifs de

2() laséquence dont il est issu.

Pour les conditions de mise en oeuvre des enzymes de restriction dans le but d'obtenir des fragments nucléotidiques des polynucléotides selon l'invention, on se référera

avantageusement à l'ouvrage de Sambrook de 1989.

Avantageusement, un polynucléotide de l'invention contiendra au moins une séquence comprenant l'enchaînement de nucléotides allant du nucléotide en position nt 964 au

nucléotide nt 1234 du polynucléotide de séquence SEQ ID N 01.

La présente invention a également pour objet un 3) polypeptide issu d'une mycobactérie, caractérisé en ce qu'il est présent uniquement chez les mycobactéries appartenant au

complexe de Mycobacterium tuberculosis.

La présente invention a aussi pour objet un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N01 ou SEQ ID N 2. L'invention concerne également un polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi:

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a) un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 1 ou SEQ

ID N 2,

b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a), c) un fragment d'au moins 5 acides aminés d'un polypeptide défini en a)ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en

a), b), ou c).

Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport au polypeptide naturel DP428, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80%, de préférence 90%, d'homologie avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, sont remplacés par des acides aminés " équivalents ". L'expression acide aminé " équivalent " vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés immunogènes des peptides correspondants. En d'autres termes, les acides aminés équivalents seront ceux qui permettent l'obtention d'un 2 polypeptide de séquence modifiée qui permet l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide de séquence

SEQ ID N 2 ou l'un de ses fragments ci-dessus définis.

Ces aminoacyles équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacyles auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'immunogénicité croisée auxquels les différents

peptides sont susceptibles de donner lieu.

A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptible d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'immunogénicité des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de

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l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans

les mêmes conditions.

) Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide présentant au moins une des caractéristiques des polypeptides selon l'invention, notamment en ce qu'il est: - capable d'être exporté et/ou sécrété par une mycobactérie, et/ou d'être induit ou réprimé lors de l'infection par la mycobactérie; et/ou - capable d'induire, de réprimer ou de moduler, directement ou indirectement, un facteur de virulence de mycobactérie; et/ou - capable d'induire une réaction d'immunogénicité dirigée contre les mycobactéries; et/ou - capable d'être reconnu par un anticorps spécifique de mycobactérie. Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 5 acides aminés, de

préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés.

Un polypeptide de l'invention, ou un de ses fragments, tels que définis précédemment, est susceptible d'être reconnu spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients infectés par des mycobactéries appartenant au complexe

de Mycobcaterium tuberculosis.

Font ainsi partie de l'invention les fragments du polypeptide DP428 de séquence ID N 01 ou ID N 2, qui peuvent être obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, telle que la trypsine ou la chymotrypsine ou la 3(0 collagénase, ou par un réactif chimique, tel que le bromure de cyanogène (CnBr) ou encore en plaçant le polypeptide DP428 dans

un environnement très acide, par exemple à pH 2,5.

Des fragments peptidiques préférés selon l'invention, pour une utilisation en diagnostic ou en vaccination, sont les fragments contenus dans des régions du polypeptide DP428 susceptibles d'être naturellement exposées au solvant et de présenter ainsi des propriétés d'immunogénicité importante. De

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tels fragments peptidiques peuvent être préparés indifféremment par synthèse chimique, à partir d'hôtes transformés par un vecteur d'expression selon l'invention contenant un acide nucléique permettant l'expression desdits fragments, placé sous le contrôle des éléments de régulation et/ou d'expression

appropriés ou encore par clivage chimique ou enzymatique.

Une analyse de l'hydrophilicité du polypeptide DP428 a été réalisée à l'aide du logiciel DNA StriderTM (commercialisé par le CEA Saclay), sur la base d'un calcul du caractère

hydrophile de la région codante pour le DP428 de la SEQ ID N 2.

Les résultats de cette analyse sont présentés à la figure 4, o sont détaillés, pour chacun des acides aminés (AA) de position ,72,99 et 107, définie dans la SEQ ID N 2, l'indice d'hydrophilicité. Plus l'indice d'hydrophilicité est élevé, plus l'acide aminé considéré est susceptible d'être exposé au solvant dans la molécule native, et est en conséquence susceptible de présenter un degré d'antigénicité élevé. Ainsi, un enchaînement d'au moins sept acides aminés possédant un indice élevé d'hydrophilicité (>0,3) peut constituer la base de la structure d'un peptide candidat immunogène selon la présente invention. L'invention concerne également les séquences d'acide nucléique utilisable comme sonde ou amorce, caractérisées en ce que lesdites séquences sont choisies parmi les séquences

d'acide nucléique de polynucléotides selon l'invention.

L'invention concerne en outre l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique de polynucléotides selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de

séquence d'acide nucléique.

3() Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés pour sélectionner des amorces nucléotidiques,

notamment pour la technique PCR.

Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être 3> amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4 683 202. Ces amorces oligodésoxyribonucléotidiques ou oligoribonucléotidiques ont

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avantageusement une longueur d'au moins 8 nucléotides, de préférence d'au moins 12 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 20 nucléotides. On préférera en particulier des amorces d'une longueur comprise entre 8 et 30 et de préférence 12 et 22 nucléotides. L'une des deux amorces est complémentaires du brin (+) [amorce aller] de la matrice et

l'autre amorce est complémentaire du brin (-) [amorce retour].

Il est important que les amorces ne possèdent pas de structure

secondaire ou de séquence complémentaire l'une de l'autre.

D'autre part, la longueur et la séquence de chaque amorce doivent être choisies de manière à ce que les amorces ne s'hybrident pas avec d'autres acides nucléiques provenant de cellules procaryotes ou eucaryotes, en particulier avec les acides nucléiques provenant de mycobactéries n'appartenant pas In au complexe Mycobacterium tuberculosis, ni avec l'ADN ou l'ARN humain pouvant éventuellement contaminer l'échantillon biologique. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une électrophorèse capillaire, ou encore après une technique chromatographique (filtration sur gel, chromatographie hydrophobe ou chromatographie échangeuse d'ions). La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides

contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification.

Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés. Parmi les polynucléotides selon l'invention, utilisables comme amorces nucléotidiques, on préfère: SEQ ID N 25 et SEQ

ID N 26.

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Parmi les polynucléotides selon l'invention, utilisables comme sondes nucléotidiques, on préfère le fragment polynucléotidique comprenant les nucléotides 964 à 1234 de SEQ

ID N01.

Ces sondes et amplicons peuvent être marqués ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives,

telles que des enzymes ou des éléments fluorescents..

L'invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide

d'amorces selon l'invention.

D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternatives

à la PCR.

La technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) est une technique d'amplification isotherme dont le principe est fondé sur la capacité d'une enzyme de restriction de couper l'un des deux brins de son site de reconnaissance qui se trouve sous une forme hemiphosphorothioate et sur la propriété d'une ADN polymérase d'initier la synthèse d'un nouveau brin d'ADN à partir de l'extrémité 3'OH créée par l'enzyme de restriction et de déplacer le brin préalablement

synthétisé qui se trouve en aval.

Les polynucléotides de l'invention, en particulier les amorces selon l'invention, peuvent également être mis en oeuvre dans d'autres procédés d'amplification d'un acide nucléique cible, tels que: - la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989; - la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990; - la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991;

- la technique TMA (Transcription Mediated Amplification).

n Les polynucléotides de l'invention peuvent aussi être employés dans des techniques d 'amplification ou de modification de l'acide nucléique servant de sonde, telles que:

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- la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable; - la technique de RCR (Repair Chain Reaction), décrite par Segev en 1992; - la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990; - la technique d'amplification à la Qbeta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al.

ainsi que par Stone et al. en 1996.

Dans le cas o le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de i'ARN contenu dans l'échanillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé

d'amplification ou de détection selon l'invention.

La sonde de détection sera choisie de telle manière à ce qu'elle hybride avec l'amplicon généré. Une telle sonde de détection aura avantageusement pour séquence une séquence d'au moins 12 nucléotides, en particulier d'au moins 15

nucléotides, et de préférence moins de 200 nucléotides.

Des sondes nucléotidiques selon l'invention sont spécifiques pour détecter les mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, plus précisément du fait que ces mycobactéries possèdent dans leur génome au moins une copie de polynucléotides selon l'invention. Par les sondes spécifiques selon l'invention, on entend particulièrement tout oligonucléotide hybridant avec la séquence nucléotidique d'un polypeptide selon l'invention, plus particulièrement tout oligonucléotide hybridant avec la séquence SEQ ID N01 codant pour le polypeptide DP428 de M. tuberculosis, et ne présentant pas de réaction d'hybridation croisée ou d'amplification (PCR)

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avec des séquences présentes chez des mycobactéries

n'appartenant pas au complexe de Mycobacterium tuberculosis.

Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN de polynucléotide selon l'invention, dans des conditions d'hybridation de forte stringence telles que données sous forme

*d'exemple précédemment.

Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sondes, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif (32p, 35S, 3H, I) ou par une molécule non-radioactive (biotine, acétylaminofluorène, digoxigénine, 5-bromo-désoxyuridine, fluorescéine) pour obtenir des sondes utilisables pour de

nombreuses applications.

Des exemples de marquages non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français N 78.10975 ou

par Urdea et al. ou par Sanchez-Pescador et al. en 1988.

Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR 2 422 956 et FR 2 518 755. La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de mycobactéries sur un support (tel que nitrocellulose, nylon, polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la

fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).

3() Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent

possible une amplification du signal radioactif ou non-

radioactif. Un système d'amplification répondant à la définition ci-dessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché (" branched DNA ") telles que celles décrites par Urdea et al. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de

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sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou l'ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN " branché " présentant une structure ramifiée. L'ADN branché, à son tour, est capable de fixer des sondes oligonucléotidiques qui sont elles-mêmes couplées à des molécules de phosphatase alcaline. Puis l'activité de cette enzyme est mise en évidence grâce à un

substrat chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-

phosphate. Selon un autre mode avantageux de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite " sonde de capture ", est immobilisée sur un support de manière covalente ou non covalente et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester. Si nécessaire, le support solide est séparé de l'échantillon et le duplex formé entre la sonde de capture et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite " sonde de détection ", marquee

par un élément facilement détectable.

Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen N EP-0305929 (Millipore Corporation) ou

encore par d'autres procédés.

Un mode de préparation approprié des acides nucléiques de l'invention comportant au maximum 200 nucléotides (ou 200 pb s'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: - la synthèse d'ADN en utilisant la méthode automatisée des bétacyanethylphosphoramidite décrite en 1986, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique par

hybridation avec une sonde appropriée.

Un mode de préparation, par voie chimique, d'acides nucléiques selon l'invention de longueur supérieure à 200

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nucléotides (ou 200 pb lorsqu'il s'agit d'acides nucléiques bicaténaires) comprend les étapes suivantes: - l'assemblage d'oligonucléotides synthétisés chimiquement, pourvus à leur extrémité de sites de restrictions différents, dont les séquences sont compatibles avec l'enchaînement en acides aminés du polypeptide naturel selon le principe décrit en 1983, - le clonage des acides nucléiques ainsi obtenus dans un vecteur approprié et la récupération de l'acide nucléique

recherché par hybridation avec une sonde appropriée.

Les sondes nucléotidiques utilisées pour la récupération

de l'acide nucléique recherché dans les procédés sus-

mentionnés, sont constituées généralement de 8 à 200 nucléotides de la séquence de polypeptide selon l'invention et sont susceptibles de s'hybrider avec l'acide nucléique recherché dans les conditions d'hybridation définies précédemment. La synthèse de ces sondes peut être effectuée selon la méthode automatisée des béta cyanethylphosphoramidites

décrite en 1986.

Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être mises en oeuvre au sein d'un dispositif de détection comprenant une banque matricielle d'oligonucléotides. Un exemple de réalisation d'une telle banque matricielle peut consister en une matrice d'oligonucléotides sondes fixés sur un support, la séquence de chaque sonde d'une longueur donnée étant située en décalage d'une ou plusieurs bases par rapport à la sonde précédente, chacune des sondes de l'arrangement matriciel étant ainsi complémentaire d'une séquence distincte de l'ADN ou l'ARN cible à détecter et chaque sonde de séquence connue étant fixée en une position prédéterminée du support. La séquence cible à détecter peut être avantageusement marquée radioactivement ou non radioactivement. Lorsque la séquence cible marquée est mise en contact avec le dispositif matriciel, celle-ci forme des hybrides avec les sondes de séquences 3 complémentaires. Un traitement à la nucléase, suivi d'un lavage, permet d'éliminer les hybrides sondes-séquence cible qui ne sont pas parfaitement complémentaires. Du fait de la

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connaissance précise de la séquence d'une sonde à une position déterminée de la matrice, il est alors possible de déduire la

séquence nucléotidique de la séquence d'ADN ou d'ARN cible.

Cette technique est particulièrement efficace lorsque sont utilisées des matrices de sondes oligonucléotidiques de grande taille. Une alternative à l'utilisation d'une séquence cible marquée peut consister en l'utilisation d'un support permettant une détection " bioélectronique " de l'hybridation de la séquence cible sur les sondes du support matrice, lorsque que ledit support est constitué ou comprend un matériau capable d'agir, par exemple, en tant que donneur d'électrons aux positions de la matrice auxquelles un hybride a été formé. Un tel matériau donneur d'électron est par exemple de l'or. La détection de la séquence nucléotidique de l'ADN ou ARN cible

est alors déterminée par un dispositif électronique.

Un exemple de réalisation d'un biocapteur, tel que défini

ci-dessus, est décrit dans la demande de brevet européen N EP-

0721 016 au nom de Affymax technologies N.V. ou encore dans le

brevet américain N US 5.202.231 au nom de Drmanac.

L'invention a aussi pour objet les polynucléotides hybrides résultant: soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou ADNc) provenant d'un échantillon

biologique avec une sonde ou une amorce selon l'invention.

- soit de la formation d'une molécule hybride entre un ARN ou un ADN (ADN génomique ou ADNc) provenant d'un échantillon biologique avec un fragment nucléotidique amplifié à l'aide

d'un couple d'amorces selon l'invention.

3(0 Par ADNc au sens de la présente invention, on entend une molécule d'ADN obtenue en faisant agir une enzyme de type transcriptase inverse sur une molécule d'ARN, en particulier une molécule d'ARN messager (ARNm), selon les techniques

décites dans Sambrook et al. en 1989.

3D La présente invention a également pour objet une famille de plasmides recombinés, caractérisés en ce qu'ils contiennent au moins une séquence nucléotidique de polynucléotide selon

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l'invention. Selon un mode de réalisation avantageux dudit plasmide, il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID N01 ou

un fragment de celle-ci.

Un autre objet de la présente invention est un vecteur pour le clonage,l'expression et/ou l'insertion d'une séquence, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique de polynucléotide selon l'invention en un site non essentiel pour sa réplication, le cas échéant sous le contrôle d'éléments de régulation susceptibles d'intervenir dans l'expression du

polypeptide DP428, chez un hôte déterminé.

Des vecteurs particuliers sont par exemple des plasmides,

des phages, des cosmides, des phagemides, des YAC.

Ces vecteurs sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques

de l'invention.

L'invention comprend également les cellules hôtes

transformées par un vecteur selon l'invention.

De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide

recombinant selon l'invention.

Une cellules hôte préférée selon l'invention est une mycobactérie appartenant à une souche de M. tuberculosis, M.bovis ou M.africanum possédant potentiellement tous les

systèmes de régulation appropriés.

> Il est aujourd'hui facile de produire des protéines ou polypeptides en quantité relativement importante par génie génétique en utilisant comme vecteurs d'expression des plasmides, des phages, des phagemides. Tout ou partie du gène DP428, ou tout polynucléotide selon l'invention, peut être (30 inséré dans un vecteur d'expression approprié pour produire in vitro un polypeptide selon l'invention, notamment le polypeptide DP428. Ledit polypeptide pourra être fixé sur une microplaque pour développer un test sérologique destiné à rechercher, dans un but de diagnostic, les anticorps

spécifiques chez les patients atteints de tuberculose.

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Ainsi, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention comprenant les étapes suivantes: - le cas échéant, l'amplification préalable suivant la technique PCR de la quantité de séquences de nucléotides codant pour ledit polypeptide à l'aide de deux amorces d'ADN choisies de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 premiers nucléotides de la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 derniers nucléotides (ou s'hybride avec ces 10 à 25 derniers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, ou inversement de manière à ce que l'une de ces amorces soit identique aux 10 à 25 derniers nucléotides de ladite séquence, tandis que l'autre amorce est complémentaire des 10 à 25 premiers nucléotides (ou s'hybride avec les 10 à 25 premiers nucléotides) de ladite séquence nucléotidique, suivie de l'introduction desdites séquences ainsi amplifiées dans un vecteur approprié, - la mise en culture, dans un milieu de culture approprié, d'un hôte cellulaire préalablement transformé par un vecteur approprié contenant un acide nucléique selon l'invention comprenant la séquence nucléotidique codant pour ledit polypeptide, et - la séparation, à partir du susdit milieu de culture, dudit

polypeptide produit par ledit hâte cellulaire transformé.

L'invention a aussi pour objet un polypeptide, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par un procédé de

l'invention tel que décrit précédemment.

Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en

solution homogène ou en phase solide.

Par exemple, on aura recours à la technique de synthèse en

solution homogène décrite par Houbenweyl en 1974.

Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les aminoacyles successifs dans

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l'ordre requis, ou à condenser des aminoacyles et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs aminoacyles dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces aminoacyles ou fragments, à l'exception des

fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-

versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides. En variante, on pourra avoir recours à des réactions de couplage mettant en jeu des réactifs de couplage classique,

du type carbodiimide, tels que par exemple la 1-éthyl-3-(3-

diméthyl-aminopropyl)-carbodiimide. Lorsque l'aminoacyle mis en oeuvre possède une fonction acide supplémentaire (notamment dans le cas de l'acide glutamique), ces fonctions seront protégées, par exemple par

des groupes t-butylester.

Dans le cas de la synthèse progressive, acide aminé par acide aminé, la synthèse débute de préférence par la condensation de l'amino-acide C-terminal avec l'aminoacide qui correspond à l'aminoacyle voisin dans la séquence désirée et

ainsi de suite, de proche en proche, jusqu'à l'acide aminé N-

terminal. Selon une autre technique préférée de l'invention, on a

recours à celle décrite par Merrifield.

Pour fabriquer une chaîne peptidique selon le procédé de Merrifield, on a recours à une résine polymère très poreuse, sur laquelle on fixe le premier acide aminé C-terminal de la 3() chaîne. Cet acide aminé est fixé sur la résine par l'intermédiaire de son groupe carboxylique et se fonction amine

est protégée, par exemple par le groupe t-butyloxycarbonyle.

Lorsque le premier acide aminé C-terminal est ainsi fixé sur la résine, on enlève le groupe protecteur de la fonction

amine en lavant la résine avec un acide.

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Dans le cas o le groupe protecteur de la fonction amine est le groupe tbutyloxycarbonyle, il peut être éliminé par

traitement de la résine à l'aide d'acide trifluoroacétique.

On couple ensuite le deuxième acide aminé qui fournit le second aminoacyle de la séquence recherchée, à partir du résidu aminoacyle C- terminal sur la fonction amine déprotégée du premier acide aminé C- terminal fixé sur la chaîne. De préférence, la fonction carboxyle de ce deuxième acide aminé est activée, par exemple par la dicyclohexylcarbodiimide, et la

fonction amine est protégée, par exemple par le t-

butyloxycarbonyle. On obtient ainsi la première partie de la chaîne peptidique recherchée, qui comporte deux acides aminés, et dont la fonction amine terminale est protégée. Comme précédemment, on déprotège la fonction amine et on peut ensuite procéder à la fixation du troisième aminoacyle, dans des conditions analogues

à celles de l'addition du deuxième acide aminé C-terminal.

On fixe ainsi, les uns après les autres, les acides aminés qui vont constituer la chaîne peptidique sur le groupe amine chaque fois déprotégé au préalable de la portion de la chaîne

peptidique déjà formée, et qui est rattachée à la résine.

Lorsque la totalité de la chaîne peptidique désirée est formée, on élimine les groupes protecteurs des différents acides aminés constituant la chaîne peptidique et on détache le peptide de la résine, par exemple à l'aide d'acide fluorhydrique. De manière préférentielle, lesdits polypeptides susceptibles d'être obtenus par un procédé de l'invention tel que décrit précédemment comprendront une région exposée au

solvant et auront une longueur d'au moins 20 acides aminés.

Selon un autre mode de réalisation de l'invention, lesdits polypeptides sont spécifiques de mycobactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis et ne sont donc pas reconnus par des

anticorps spécifiques d'autres protéines de mycobactéries.

L'invention est en outre relative à des polypeptides hybrides présentant au moins un polypeptide selon l'invention

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et une séquence d'un polypeptide susceptible d'induire une réponse

immunitaire chez l'homme ou l'animal.

Avantageusement, le déterminant antigénique est tel qu'il est susceptible d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire, comme par exemple les déterminants antigéniques de protéines immunogènes sélectionnées par exemple parmi ESAT 6 et DES de 45/47 kD de Mycobacterium tuberculosis. Un tel déterminant pourra comprendre un polypeptide selon l'invention sous forme glycosylée utilisé en vue d'obtenir des compositions immunogènes susceptibles d'induire la synthèse d'anticorps dirigés contre des épitopes multiples. Lesdits polypeptides glycosylés font également partie de l'invention. Ces molécules hybrides peuvent être constituées en partie d'une molécule porteuse de polypeptide selon l'invention associée à une partie, en particulier un épitope de la toxine diphtérique, la toxine tétanique, un antigène de surface du virus de l'hépatite B (brevet FR 79 21811), l'antigène VP1 du virus de la poliomyélite ou toute autre toxine ou

antigène viral ou bactérien.

Avantageusement, un antigène bactérien tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de la protéine immunogène de 45/47 kD de M. tuberculosis

(demande internationale PCT/FR 96/0166).

Un antigène viral, tel que défini ci-dessus, sera préférentiellement une protéine de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite, par exemple la protéine de surface de l'hépatite B sous l'une de ses formes S, SpréS1, S-préS2 ou S-préS2-préSl ou encore une protéine d'un virus de l'hépatite A, ou d'une hépatite non-A, non-B, tel qu'un virus de l'hépatite

C, E ou delta.

Plus particulièrement, un antigène viral tel que défini ci-dessus sera tout ou partie de l'une des glycoprotéines codées par le génome du virus HIV-1 (brevets GB 8324800, EP 84401834 ou EP 85905513) ou du virus HIV-2 (EP 87400151), et en particulier tout ou partie d'une protéine

sélectionnée parmi gag, pol, nef ou env de HIV-1 ou de HIV-2.

Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des ADN hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes

codant pour des protéines de fusion décrite par Minton en 1984.

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Les polynucléotides hybrides codant pour un polypeptide hybride ainsi que les polypeptides hybrides selon l'invention caractérisés en ce qu'il s'agit de protéines recombinantes obtenues par l'expression desdits

polynucléotides hybrides, font également partie de l'invention.

Les polypeptides selon l'invention peuvent avantageusement être mis en oeuvre dans un procédé de détection in vitro d'anticorps dirigés contre lesdits polypeptides, notamment le polypeptide DP428, et ainsi contre une bactérie du complexe M. tuberculosis dans un échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) susceptible de les contenir, ce procédé comprenant la mise en contact de cet échantillon biologique avec un polypeptide selon l'invention dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre ledit polypeptide et les anticorps éventuellement présents dans

l'échantillon biologique, et la détection in vitro des complexes antigène-

anticorps éventuellement formés.

De préférence, l'échantillon biologique est constitué par

un fluide, par exemple un sérum humain ou animal.

Toute procédure classique peut être mise en oeuvre pour

réaliser une telle détection.

A titre d'exemple, une méthode préférée met en jeu des processus immunoenzymatiques selon la technique ELISA, par

immunofluorescence, ou radio-immunologique (RIA) ou équivalent.

Ainsi, l'invention concerne également les polypeptides selon l'invention, marqués à l'aide d'un marqueur adéquat tel

que du type enzymatique, fluorescent, radioactif.

De telles méthodes comprennent par exemple les étapes suivantes: - dépôt de quantités déterminées d'une composition polypeptidique selon l'invention dans les puits d'une plaque de microtitration, - introduction dans lesdits puits de dilutions croissantes du sérum devant être analysé, - incubation de la microplaque, - introduction dans les puits de la plaque de microtitration d'anticorps marqués dirigés contre des immunoglobulines humaines ou animales, le marquage de ces anticorps ayant été réalisé à l'aide d'une enzyme sélectionnée parmi celles qui sont capables d'hydrolyser un substrat en modifiant

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l'absorption des radiations de ce dernier, au moins à une longueur d'onde déterminée, par exemple à 550 nm, -détection, en comparaison avec un témoin de contrôle, de la

quantité de substrat hydrolysé.

L'invention concerne également un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par une mycobactérie appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis, comprenant: - un polypeptide selon l'invention, - les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique,

- les réactifs permettant la détection des complexes antigène-

anticorps produits par la réaction immunologique, ces réactifs peuvent également porter un marqueur, ou être susceptibles d'être reconnus à leur tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o le polypeptide selon l'invention n'est pas marqué, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par un polypeptide selon l'invention, - le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée

d'anticorps reconnus par un polypeptide selon l'invention.

Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement les polypeptides selon l'invention. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un () animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un

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polypeptide selon l'invention, des anticorps contenus dans le sérum de patients infectés par une mycobactérie appartenant au

complexe Mycobacterium tuberculosis.

L'invention a également pour objet des anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, ou anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître

spécifiquement un polypeptide selon l'invention.

Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention tel qu'u marquage de type

enzymatique, fluorescent ou radioactif.

L'invention vise en outre un procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique (tissu ou fluide biologique) prélevé chez un individu avec un anticorps mono ou polyclonal selon l'invention, dans des conditions permettant une réaction immunologique in vitro entre lesdits anticorps et les polypeptides spécifiques des mycobactéries du complexe de Mycobacterium tuberculosis éventuellement présents dans l'échantillon biologique, et

b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.

Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire ou kit pour le diagnostic in vitro sur un échantillon biologique, de la présence de souches de mycobactéries appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis, de préférence M. tuberculosis, caractérisé en ce qu'il comprend: - un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'invention, le cas échéant marqué; 3 - le cas échéant, un réactif pour la constitution du milieu propice à la réalisation de la réaction immunologique;

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- un réactif permettant la détection des complexes antigène-

anticorps produits par la réaction immunologique, ce réactif pouvant également porter un marqueur, ou être susceptible d'être reconnu à son tour par un réactif marqué, plus particulièrement dans le cas o ledit anticorps monoclonal ou

polyclonal n'est pas marqué.

- le cas échéant, des réactifs pour effectuer la lyse des

cellules de l'échantillon testé.

I () La présente invention a également pour objet un procédé de détection et d'identification rapide de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) Isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de 1'ARN de l'échantillon biologique; b) Amplification spécifique de l'ADN des mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis à l'aide 2() d'amorces selon l'invention;

c) Analyse des produits d'amplification.

Ceux-ci peuvent être analysés par différentes méthodes.

Deux méthodes d'analyse sont données à titre d'exemple ci-

dessous: - Analyse électrophorétique en gel d'agarose des produits d'amplification. Si l'on observe la présence d'un fragment d'ADN migrant à l'endroit attendu, on peut conclure que l'échantillon analysé contenait de l'ADN de mycobactéries appartenant au complexe tuberculosis, ou 3() Analyse par la technique d'hybridation moléculaire en utilisant une sonde nucléique selon l'invention. Cette sonde sera avantageusement marquée par un élément non radioactif

(sonde froide) ou radioactif.

Aux fins de la présente invention, on entendra par " ADN de l'échantillon biologique " ou " ADN contenu dans l'échantillon biologique ", soit l'ADN présent dans

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1 échantillon biologique considéré, soit l'ADNc obtenu après l'action d'une enzyme de type transcriptase inverse sur l'ARN

présent dans ledit échantillon biologique.

Un autre but de la présente invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention avec un échantillon biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, ou l'ADNc obtenu par transcription inverse de l'ARN de l'échantillon biologique, ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN ou l'ADNc d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b) Détection de l'hybride formé entre la sonde

oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.

2() L'invention vise également un procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon l'invention immobilisée sur un support, avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; 3() b) Mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique marquée selon

l'invention.

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Selon un mode de réalisation avantageux du procédé de détection défini précédemment, celui-ci est caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique est préalablement amplifié à l'aide d'un couple d'amorces selon l'invention. Une autre forme de mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention consiste en un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un couple d'amorces selon l'invention, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation desdites amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b) Amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde

oligonucléotidique selon invention.

L'invention a aussi pour objet un procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique par déplacement de brin, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec deux couples d'amorces selon l'invention spécifiquement destinées à l'amplification de type SDA décrites ci-dessus, l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;

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b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde

oligonucléotidique selon l'invention.

L'invention concerne aussi un nécessaire ou kit pour la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, destiné à la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Une sonde oligonucléotidique selon l'invention; b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de 1'ADN (ADN génomique, ADN plasmidique ou ADNc) d'une bactérie

du complexe Mycobacterium tuberculosis.

L'invention a aussi pour objet un kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon l'invention; b) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation,selon l'invention. c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'invention ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de

l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis.

L'invention concerne encore un kit ou nécessaire pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un couple d'amorces selon l'invention;

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b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN; c) Eventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde

oligonucléotidique selon l'invention.

Un autre objet de la présente invention concerne une composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend

polypeptide selon l'invention.

Une autre composition immunogène selon l'invention est caractérisé en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides selon l'invention et/ou une ou plusieurs protéines hybrides

selon l'invention.

Selon un mode de réalisation avantageux, la composition immunogène cidessus définie est constitutive d'un vaccin, lorsqu'elle est présentée en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants de l'immunité tels que l'alun ou un représentant de la famille des muramyl peptides ou encore l'adjuvant incomplet

de Freund.

(0 Aujourd'hui, divers types vaccins sont disponibles pour protéger l'homme contre des maladies infectieuses: micro-organismes vivants atténués (M. bovis - BCG pour la tuberculose), micro-organismes inactivés (virus de la grippe), des extraits acellulaires (Bordetella pertussis pour la coqueluche), protéines recombinées (antigène de surface du virus de l'hépatite B), des polyosides (pneumocoques). Des

vaccins préparés à partir de peptides de synthèse ou de micro-

organismes génétiquement modifiés exprimant des antigènes hétérologues sont en cours d'expérimentation. Plus récemment encore, des ADN plasmidiques recombinés portant des gènes codant pour des antigènes protecteurs ont été proposés comme stratégie vaccinale alternative. Ce type de vaccination est réalisé avec un plasmide particulier dérivant d'un plasmide de E. coli qui ne se réplique pas in vivo et qui code uniquement pour la protéine vaccinante. Les principaux composants fonctionnels de ce plasmide sont: un promoteur fort (par exemple celui du CMV), un site de clonage approprié

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pour insérer le gène d'intérêt, une séquence de terminaison-

polyadénylation, une origine de réplication procaryote pour produire le plasmide recombiné in vitro et un marqueur de sélection (par exemple le gène de résistance à l'ampicilline) pour faciliter la sélection des bactéries qui contiennent le plasmide. Des animaux ont été immunisés en injectant simplement l'ADN plasmidique nu dans le muscle. Cette technique conduit à l'expression de la protéine vaccinale in situ et à une réponse immunitaire de type cellulaire (CTL) et de type humoral (anticorps). Cette double induction de la réponse immunitaire est l'un des principaux avantages de la technique de vaccination avec de l'ADN nu. Huygen et al. (1996) et Tascon et al. (1996) ont réussi a obtenir une certaine protection contre M. tuberculosis en injectant des plasmides recombinés contenant des gènes de M. leprae (hsp65, 36kDa pra) comme inserts. M. leprae est l'agent responsable de la lèpre. L'utilisation d'un insert spécifique de M. tuberculosis comme par exemple tout ou partie du gène DP428, objet de la présente invention conduirait probablement à une meilleure protection contre la tuberculose. Tout ou partie du gène DP428, ou tout polynucléotide selon l'invention, peut être facilement inséré dans les plasmides vecteurs V1J (Montgomery et al, 1993), pcDNA3 (Invitrogen, R & D Systems) ou pcDNA1/Neo (Invitrogen) qui possèdent les caractéristiques

nécessaires pour une utilisation vaccinale.

L'invention vise ainsi une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels queprécédemment définis en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et,

(30 le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité.

L'invention vise aussi une composition vaccinale destinée à l'immunisation de l'homme ou l'animal à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou l'hépatite, caractérisée en ce qu'elle comprend un ou plusieurs polypeptides hybrides tels que précédemment définis en

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association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible et,

le cas échéant, un ou plusieurs adjuvants de l'immunité.

Avantageusement, dans le cas d'une protéine hybride entre un polypeptide selon l'invention et l'antigène de surface de l'hépatite B, la composition vaccinale sera administrée, chez l'homme, à raison de 0,1 à 1 ug de protéine hybride purifiée par kilogramme du poids du patient, de préférence 0,2 à 0,5 gg/kg de poids du patient, pour une dose destinée à une administration donnée. Dans le cas de patients atteints de troubles du système immunitaire, en particulier les patients immunodéprimés, chaque dose injectée contiendra préférentiellement la moitié de la quantité pondérale de la protéine hybride contenue dans une dose destinée à un patient

n'étant pas affecté de troubles du système immunitaire.

De préférence, la composition vaccinale sera administrée à plusieurs reprises, de manière étalée dans le temps, par voie intradermique ou sous-cutanée. A titre d'exemple, trois doses telles que définies ci-dessus seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au

temps tO + 1 an.

Alternativement, trois doses seront respectivement administrées au patient au temps tO, au temps tO + 1 mois et au

temps tO + 6 mois.

Chez la souris, chez laquelle une dose pondérale de la composition vaccinale comparable à la dose utilisée chez l'homme est administrée, la réaction anticorps est testée par prélèvement du sérum suivi d'une étude de la formation d'un complexe entre les anticorps présents dans le sérum et l'antigène de la composition vaccinale, selon les techniques

( usuelles.

L'invention concerne également une composition immunogène caractérisée en ce qu 'elle comprend un polynucléotide ou un vecteur d'expression selon l'invention, en association avec un

véhicule permettant son administration à l'homme ou l'animal.

L'invention a encore pour objet un vaccin destiné à l'immunisation à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide ou

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un vecteur d'expression selon l'invention, en association avec

un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

De telles compositions immunogènes ou vaccinales sont notamment décrites dans la demande internationale N WO /11092 (Vical Inc.) et également dans la demande

internationale N WO 95/11307 (Institut Pasteur).

Le polynucléotide constitutif de la composition immunogène ou de la composition vaccinale selon l'invention peut être injecté à l'hôte après avoir été couplé à des composés qui favorisent la pénétration de ce polynucléotide à l'intérieur de la cellule ou son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules polymères, comme décrit dans la demande internationale N WO 94/27238 (medisorb Technologies

International).

Selon un autre mode de réalisation de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide, de préférence un ADN, est complexé avec du DEAE-dextran (Pagano et al., 1967) ou avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., 1989), avec des lipides (Felgner et al., 1987) ou encore encapsulés dans des liposomes (Fraley et

al., 1980).

Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de la composition immunogène et/ou vaccinale selon l'invention, le polynucléotide selon l'invention peut être introduit sous la

forme d'un gel facilitant sa transfection dans les cellules.

Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-Llysine et de lactose, comme décrit par Midoux en 1993, ou encore le Poloxamer 407TM, comme décrit par Pastore en 1994. Le polynucléotide ou le vecteur selon l'invention peuvent aussi être en suspension dans une solution tampon ou être

associés à des liposomes.

Avantageusement, un tel vaccin sera préparé conformément à la technique décrite par Tacson et al. ou Huygen et al. en 1996 dû ou encore conformément à la technique décrite par Davis et al.

dans la demande internationale N WO 95/11307 (Whalen et al.).

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Un tel vaccin sera avantageusement préparé sous la forme d'une composition contenant un vecteur selon l'invention, placée sous le contrôle d'éléments de régulation permettant son

expression chez l'homme ou l'animal.

Pour réaliser un tel vaccin, le polynucléotide selon l'invention est tout d'abord sous-cloné dans un vecteur d'expression approprié, plus particulièrement un vecteur d'expression contenant des signaux de régulation et d'expression reconnus par les enzymes des cellules eucaryotes et contenant également une origine de réplication active chez les procaryotes, par exemple chez E. coli, qui permet son amplification préalable. Puis le plasmide recombinant purifié obtenu est injecté à l'hôte, par exemple par voie intramusculaire. On pourra par exemple utiliser, en tant que vecteur d'expression in vivo de l'antigène d'intérêt, le plasmide pcDNA3 ou le plasmide pcDNA1/neo, tous les deux commercialisés par Invitrogen (R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). On peut aussi utiliser le plasmide VlJns.tPA, décrit par Shiver et al.

en 1995.

Un tel vaccin comprendra avantageusement, outre le vecteur recombinant, une solution saline, par exemple une solution de

chlorure de sodium.

Une composition vaccinale telle que définie ci-dessus sera par exemple administrée par voie parentérale ou par voie intramusculaire. D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants:

FIGURES

Fiqure 1: lA. la construction pJVED: Plasmid navette( pouvant se

i5 multiplier chez les mycobactéries ainsi que chez E.coli).

avec un gène de résistance à la kanamycine (issu de Tn903)

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* comme marqueur de sélection. Le gène phoA tronqué(A phoA)

et le gène luc forment un opéron synthetique.

lB. Séquence de la jonction entre phoA et luc.

Fiqure 2: Activités Luc et PhoA de M. smegmatis recombinant contenant le pJVED avec différents fragments

nucléotidiques comme décrits en exemple.

Figure 3: Hybridation génomique (Southern blot) de l'ADN génomique de différentes espèces mycobactériennes à l'aide de la

sonde correspondant aux fragments XXXXX de la séquence ID.

Fiqure 4: Représentation de l'hydrophobicité (Kyte et Doolitle) de la séquence codante du DP428 avec sa représentation schématique. Le motif LPISG précède immédiatement la région C-terminale hydrophobe. La séquence se termine par

deux arginines.

Fiqure 5: Illustre la séquence SEQ ID N01 correspondant à l'insert

du vecteur pDP428 (déposé à la CNCM sous le N 1-1818).

Fiqure 6: Illustre la séquence SEQ ID N 2 correspondant à la région

incluant le gène codant pour le DP428 (région soulignée).

La figure fait apparaître que le DP428 fait probablement partie d'un opéron comprenant au moins trois gènes. La région doublement encadrée inclut probablement les régions promotrices. La région simplement encadrée correspond au motif LPISG rapellant le motif LPXTG décrit chez les Gram positifs

comme permettant l'ancrage aux peptidogluconnes.

Figure 7: Illustre la séquence SEQ ID N 3 correspondant à l'insert

du vecteur p6D7 (déposé à la CNCM sous le N 1-1814).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible.

Fiqure 8:

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Illustre la séquence SEQ ID N 4 correspondant à l'insert

du vecteur p5A3 (déposé à la CNCM sous le N 1-1815).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 9: Illustre la séquence SEQ ID N 5 correspondant à l'insert

du vecteur p5F6 (déposé à la CNCM sous le N 1-1816).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Figure 10: Illustre la séquence SEQ ID N 6 correspondant à l'insert

du vecteur p2A29 (déposé à la CNCM sous le N 1-1817).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure: Illustre la séquence SEQ ID N 7 correspondant à l'insert

du vecteur p5B5 (déposé à la CNCM sous le N 1-1819).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 12: Illustre la séquence SEQ ID N 8 correspondant à l'insert

du vecteur plC7 (déposé à la CNCM sous le N 1-1820).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 13: Illustre la séquence SEQ ID N 9 correspondant à l'insert

du vecteur p2D7 (déposé à la CNCM sous le N 1-1821).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. 3() Fiqure 14: Illustre la séquence SEQ ID N 10 correspondant à l'insert

du vecteur plB7 (déposé à la CNCM sous le N 1-1843).

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 15:

Illustre la séquence SEQ ID N 11.

47 2767336

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 16:

Illustre la séquence SEQ ID N 12.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 17:

Illustre la séquence SEQ ID N 13.

A,B et C représentent les trois phases de lecture

possible.

Fiqure 18:

Illustre la séquence SEQ ID N 14.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 19:

Illustre la séquence SEQ ID N 15.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 20:

Illustre la séquence SEQ ID N 16.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 21:

Illustre la séquence SEQ ID N 17.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 22:

Illustre la séquence SEQ ID N 18.

A,B et C représentent les trois phases de lecture

possible.

Fiqure 23:

Illustre la séquence SEQ ID N 19.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 24:

Illustre la séquence SEQ ID N 20.

48 2767336

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 25:

Illustre la séquence SEQ ID N 21.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Figure 26:

Illustre la séquence SEQ ID N 22.

A,B et C représentent les trois phases de lecture

possible.

Fiqure 27:

Illustre la séquence SEQ ID N 23.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 28:

Illustre la séquence SEQ ID N 24.

A,B et C représentent les trois phases de lecture possible. Fiqure 29: Illustre les séquences SEQ ID N 25 et SEQ ID N 26 représentant un couple d'amorces utilisées pour amplifier spécifiquement par PCR la région correspondant aux

nucléotides 964 à 1234 inclus dans la séquence SEQ ID N 01.

EXEMPLES

Matériel et méthodes 3( Cultures bactériennes, plasmides et milieux de cultures Les cultures bactériennes et plasmides utilisées dans ces exemples sont regroupées dans le tableau 1. E. coli a été cultivé sur milieu liquide ou solide Luria-Bertani (LB). M. smegmatis a été cultivé sur milieu liquide Middlebrook 7H9 (Difco) additionné de dextrose albumine (ADC), 0,2 % de

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glycérole et 0,05 % de Tween, ou sur milieu solide L. Si nécessaire, l'antibiotique kanamycine a été rajouté à une concentration de 20 ig/ml1. Les clones bactériens présentant une activité PhoA ont été détectés sur de l'agar LB contenant du 5-bromo-4-chloro-3-indolyle phosphate (X- P, à 40 gg/ml- 1). Manipulation d'ADN et séquençage Les manipulations d'ADN et les analyses par Southern blot ont été effectuées en utilisant les techniques standard (Sambrook, 1989). Les séquences d'ADN double brun ont été déterminées avec un kit de séquençage Taq Dye Deoxy Terminator Cycle (Applied Biosystems), dans un Système 9600 GeneAmp PCR (Perkin-Elmer), et après migration sur un système d'analyse ADN

modèle 373 (Applied Biosystems).

Constructions des plasmides Le plasmide pJVEDa a été construit à partir de pLA71, plasmide de transfert comportant le gène phoA tronqué et placé en phase avec BlaF. pLA71 a été coupé avec les enzymes de restriction KpnI et NotI, retirant ainsi phoA sans toucher le promoteur de BlaF. Le gène luc codant pour la luciférase de luciole a été amplifié à partir de pGEM-luc et un site de liaison du ribosome a été rajouté. phoA a été amplifié à partir de pJEM11. Les fragments amplifiés ont été coupés avec PstI et ligaturés ensemble. Les oligodéoxynucléotides utilisés sont les suivants: pPV.luc.Fw: 5'GACTGCTGCAGAAGGAGAAGATCCAAATGG3' luc.Bw: 5'GACTAGCGGCCGCGAATTCGTCGACCTCCGAGG3' pJEM.phoA.Fw: 5'CCGCGGATCCGGATACGTAC3'

phoA.Bw: 5'GACTGCTGCAGTTTATTTCAGCCCCAGAGCG3'.

Le fragment ainsi obtenu a été réamplifié en utilisant les oligonucléotides complémentaires de ses extrémités, coupé avec KpnI et NotI, et intégré dans pLA71 coupé avec les mêmes

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enzymes. La construction résultante a été électroporée dans E. coli DH5c et M. smnegmatis mc2 155. Un clone M. smegmatis émettant de la lumière et présentant une activité phoA a été sélectionné et appelé pJVED/blaF. L'insert a été retiré en utilisant BamHI et la construction refermée sur elle-même, reconstruisant ainsi le pJVEDa. Afin d'obtenir le pJVEDb,c, le multisite de clonage a été coupé avec ScaI et KpnI et refermé en enlevant un (pJVEDb) ou deux (pJVEDc) nucléotides du site SnaBI. Après fusion six cadres de lecture ont pu ainsi être obtenus. L'insert du pJVED/hsp18 a été obtenu par amplification en chaîne par polymérase (ACP) de pPM1745 (Servant, 1995) en utilisant des oligonucléotides de la séquence: 18.Fw: 5'GTACCAGTACTGATCACCCGTCTCCCGCAC3' 18.Back: AGTCAGGTACCTCGCGGAAGGGGTCAGTGCG3' Le produit a été coupé avec KpnI et ScaI, et ligaturé à pJVEDa, coupé avec les mêmes enzymes, quittant ainsi le pJVED/hspl8. Le pJVED/P19kDa et le pJVED/erp furent construits en coupant avec BamHI l'insert de pExp410 et pExp53 2) respectivement, et en les insérant dans le site BamHI du

multisite de clonage de pJVEDa.

Mesure de l'activité phosphatase alkaline M. smegmatis ont été cultivés dans un milieu LB additionnés de 0,05 % de Tween 80 (Aldrich) et de kanamycine (20 gg/ml- 1) à 370C pendant 24 heures. L'activité de la phosphatase alkaline a été mesurée par la méthode de Brockman

() et Heppel (Brockman, 1968) dans un extrait soniqué, avec p-

nitrophénylphosphate comme substrat de la réaction. La quantité de protéines a été mesurée par essai Bio-Rad. L'activité phosphatase alkaline est exprimée en unité arbitraire (densité

optique à 420 nm x Mg de protéines- 1 x minutes- 1).

l 2767336 Mesure de l'activité luciférase M. smegmatis a été cultivé dans un milieu LB additionné de 0,05 % de Tween 80 (Aldrich) et de kanamycine (20 kg/ml- 1) à 37 C pendant 24 heures et utilisé en pleine croissance exponentielle (DO à 600 nm comprise entre 0,3 et 0,8). Les aliquots de suspensions bactériennes ont été brièvement soniqués et l'extrait cellulaire a été utilisé pour mesurer l'activité de la luciférase. 25 gl de l'extrait soniqué ont été mélangés avec 100 p1 de substrat (système d'essai luciférase Promega) automatiquement dans un luminomètre et la lumière émise exprimée en ULR (Unités Lumineuses Relatives). Les bactéries ont été comptées par dilutions sérielles de la suspension d'origine sur milieu agar LB kanamycine et l'activité de la luciférase exprimée en ULR/lg de protéines

bactériennes ou en ULR/103 bactéries.

Construction de banques génomiques de M. tuberculosis Les banques ont été obtenues en utilisant

essentiellement pJVEDa,b,c précédemment décrit.

Préparation de macrophages issus de la moelle osseuse et infection par M. smegmatis recombinants Les macrophages issus de la moelle osseuse ont été préparés comme décrits par Lang, 1991. En résumé, les cellules de la moelle osseuse ont été prélevés du fémur de souris C57BL/6 agée de 6 à 12 semaines (Iffa-Credo, France). Les cellules en suspensions ont été lavées et resuspendues dans du DMEM enrichi avec 10 % de sérum foetal de veau, 10 % de milieu

L-cell conditionné et 2 mM de glutamine, sans antibiotiques.

106 cellules ont été ensemencées sur des plaques 24 puits Costar à fond plat dans 1 ml. Après quatre jours à 37 C dans une atmosphère humide à 10 % de teneur en C02, les macrophages ont été rincés et réincubés pendant deux à quatre jours

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supplémentaires. Les cellules d'un puits contrôle ont été lysées avec du triton x 100 à 0,1 % dans l'eau et les noyaux

énumérés. Environ 5 x 105 cellules adhérentes ont été comptées.

Pour l'infection, M. smegmatis portant les différents plasmides a été cultivé en pleine phase exponentielle (DO600nm entre 0,4 et 0,8) et dilué jusqu'à une DO de 0,1 puis 10 fois dans un milieu pour macrophage. 1 ml a été ajouté à chaque puits et les

plaques ont été centrifugées et incubées quatre heures à 37 C.

Après trois lavages, les cellules ont été incubées dans un milieu contenant de l'amykacine pendant deux heures. Après trois nouveaux lavages, les cellules infectées adhérentes ont été incubées dans un milieu macrophage pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été lysées dans 0,5 ml de tampon de lyse (Promega). 100 4l ont été soniqués et la lumière émise a été mesurée sur 25 Hm. Simultanément, les bactéries ont été énumérées par étalement sur L-agar-kanamycine (20 gg/ml- 1). La

lumière émise est exprimée en ULR/103 bactéries.

Analyses des banques de données Les séquences nucléotidiques ont été comparées à EMBL et GenBank en utilisant l'algorithme FASTA et les séquences protéiques ont été analysées par similitude grâce aux banques de données PIR et Swiss Prot en utilisant l'algorithme BLAST Exemple 1: Les vecteurs pJVED Les vecteurs pJVED (Figure lA) sont des plasmides portant un gène phoA tronqué de E. coli dépourvu de codon d'initiation, de séquence signal et de séquence régulatrice. Le site multiple de clonage (SMC) permet l'insertion de fragments des gènes codants pour d'éventuelles

protéines exportées ainsi que leurs séquences de régulation.

Dès lors, la protéine de fusion peut être produite et présenter une activité phosphatase alcaline si elle est exportée. Seules les fusions en phase pourront être productives. Ainsi, le SMC a

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été modifié de sorte que les fusions peuvent être obtenues dans six phases de lecture. En aval de phoA, le gène luc de la luciférase de luciole a été inséré. Le gène complet avec le codon d'initiation mais sans qu'aucun promoteur n'ait été utilisé devrait ainsi s'exprimer avec phoA comme dans un opéron synthétique. Un nouveau site de liaison des ribosomes a été

inséré huit nucléotides en amont du codon d'initiation de luc.

Deux terminateurs transcriptionnels sont présents dans les

vecteurs pJVED, un en amont du SMC et un second en aval de luc.

Ces vecteurs sont des plasmides de transfert E. coli-

mycobacterium avec un gène de résistance à la kanamycine comme

marqueur de sélection.

phoA et luc fonctionnent comme dclans un opéron, mais

l'exportation est nécessaire pour l'activité phoA.

Quatre plasmides ont été construits par insertion dans le SMC de fragments d'ADN d'origine diverse: Dans la première construction nommée pJVED/blaF, le fragment de 1,4 kb provient du plasmide déjà décrit pLA71 (Lim, 1995). Ce fragment issu du gène P-lactamase (blaF) de M. fortuitum D216 (Timm, 1994) inclut le promoteur muté hyperactif, le segment codant pour 32 acides aminés de la séquence signal et les 5 premiers acides aminés de la protéine mature. Ainsi cette construction inclut le promoteur le plus fort connu chez mycobacterium et les éléments nécessaires à l'exportation de la protéine de la fusion phoA. Par conséquent, on peut attendre de cette construction une forte émission de

lumière et une bonne activité phoA.

Dans une deuxième construction nommée pJVED/hspl8, un fragment de 1,5 kb a été cloné à partir du plasmide déjà décrit pPM1745 (Servant, 1995). Ce fragment inclut les nucléotides codants pour les dix premiers acides aminés de la protéine de choc thermique de 18 kb issue de Streptomyces albus (heat shock protein 18, HSP 18), le site de liaison du ribosome, le promoteur et, en amont, des sites régulateurs contrôlant son

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expression. Cette protéine appartient à la famille de alpha-

crystalline de HSP à faible poids moléculaire (Verbon, 1992).

Son homologue issu de M. leprae, l'antigène de 18 kDa, est déjà connu pour être induit durant la phagocytose par un macrophage murin de la lignée cellulaire J-774 (Dellagostin, 1995). Dans des conditions de culture standard, le pJVED/hspl8, montre une

faible activité luc et aucune activité phoA.

Dans une troisième construction, nommée pJVED/Pl9kDa, l'insert issu de pExp410 (Lim, 1995) a été coupé et cloné dans 1) le SMC de pJVEDa. Ce fragment inclut les nucléotides codants pour les 134 premiers acides aminés de la protéine connue de M. tuberculosis 19 kDa et de ses séquences régulatrices. Comme cela a pu être mis en évidence, cette protéine est une lipoprotéine glycosilée (Garbe, 1993; Herrmann, 1996). Une partie de cette lipoprotéine a été fusionnée avec une protéine A de surface issue de Borrelia burgdorferi pour construire un vaccin recombinant de M. bovis BCG capable d'induire une forte réponse immunitaire (Stover, 1993). Sur la figure 2, on observe, pour cette construction, une bonne activité luc 2(0 correspondant à un promoteur fort, mais l'activité phoA est, de loin, la plus forte des quatre constructions. L'activité phoA élevée de cette protéine de fusion avec une lipoprotéine s'explique par le fait qu'elle reste attachée à la paroi

cellulaire par son extrémité N-terminal.

Dans la quatrième et dernière construction nommée pJVED/erp l'insert provient de pExp53 (Lim, 1995) et a été cloné dans le SMC de pJVEDa. pExp53 est le plasmide initial sélectionné pour son activité phoA et contenant une partie du gène erp de M. tuberculosis qui code pour un antigène de 28 kDa. Ce dernier inclut la séquence signal, une partie de la protéine mature et, en amont du codon d'initiation, le site de liaison de ribosome. Le promoteur a été cartographié. Une boîte fer (iron box) putative du type fur est présente dans cette

région et encadre la région -35 du promoteur (Berthet, 1995).

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Comme prévu (figure 2) cette construction présente une bonne émission lumineuse et une bonne activité phoA. Le fait que cette protéine de fusion, contrairement à la fusion avec la lipoprotéine de 19 kDa, ne semble pas attachée à la paroi cellulaire n'exclut pas que la protéine native y soit associée. De plus, l'extrémité C-terminal de erp est absente de la

protéine de fusion.

Exemple 2: Construction d'une banque d'ADN génomique de M. tuberculosis dans les vecteurs pJVEDs et identification d'un des membres de ces banques, (DP428), induit au cours de la phagocytose par les macrophages murins dérivés de la moelle osseuse. Les différentes constructions sont testées pour leur capacité à évaluer l'expression intracellulaire des gènes identifiés par l'expression de phoA. Dans cet objectif, l'activité luc est exprimée en URL pour 103 bactéries en

culture axénique dans des conditions intracellulaires.

L'induction ou la répression suivant la phagocytose par les macrophages murins dérivés de la moelle osseuse peut être

évaluée convenablement par la mesure des activités spécifiques.

Les résultats de deux expériences distinctes sont présentés

dans le tableau 2.

Le plasmide pJVED/hspl8 a été utilisé comme contrôle positif pour l'induction durant la phase de croissance intracellulaire. Malgré que l'induction du prometteur par le chauffage de la bactérie à 42 C n'ait pas été concluant la phagocytose de la bactérie conduit clairement à une augmentation de l'activité du promoteur. Dans toutes les expériences, l'activité luc intracellulaire a été fortement induite, augmentant de 20 à 100 fois l'activité basale

initialement faible (Servant, 1995).

Le plasmide pJVED/blaF a été utilisé comme contrôle de la modulation non spécifique au cours de la phagocytose. De 3 faibles variations ont pu être mises en évidence, probablement dues à des changements de conditions de cultures. Quoi qu'il en

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soit, ces faibles variations ne sont pas comparables à

l'induction observée avec le plasmide pJVED/hspl8.

Tous les membres de la banque d'ADN ont été testés par mesure de l'activité du promoteur durant la croissance intracellulaire. Parmi eux, le DP428 est fortement induit au

cours de la phagocytose (tableau 1).

TABLEAU 1 (cf. après les exemples).

Exemple 3: La séquence complète du gène DP428 et de ses

régions flanquantes.

Une sonde de la région codante de DP428 a été obtenue par ACP, et utilisée pour hybrider l'ADN génomique de différentes espèces de mycobactéries. D'après les résultats de la figure 3, le gène est présent uniquement dans les

mycobactéries du complexe de M. tuberculosis.

L'analyse de la séquence montre que DP428 fait partie d'un opéron. La séquence codante et les régions flanquantes ne présentent aucune homologie avec des séquences connues déposées

dans les banques de données.

D'après la séquence codante, ce gène code pour une

protéine de 10 kDa avec un peptide signal, une extrémité C-

terminal hydrophobe terminée par deux arginines et précédée par un motif LPISG semblable au motif connu LPXTG. Ces deux arginines pourraient correspondre à un signal de rétention et la protéine DP428 pourrait être accrochée par ce motif à des peptidoglycanes comme cela a déjà été décrit chez d'autres

bactéries Gram+.

Le mécanisme de survie et de croissance intracellulaire des mycobactéries est complexe et les relations intimes entre la bactérie et la cellule hôte restent inexpliquées. Quel que soit le mécanisme, la croissance et la survie intracellulaire des mycrobactéries dépend de facteurs produits par la bactérie et capables de moduler la réponse de l'hôte. Ces facteurs peuvent être des molécules exposées à la surface cellulaire telle que LAM ou des protéines associées à la surface

cellulaire, ou des molécules activement secrétées.

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D'un autre côté, intracellulairement, les bactéries

elles-mêmes doivent faire face à un environnement hostile.

Elles semblent y répondre par des moyens proches de ceux mis en oeuvre dans les conditions de stress, par l'induction de protéines de choc thermique (Dellagostin, 1995), mais aussi par induction ou la répression de différentes protéines (Lee, 1995). En utilisant une méthodologie dérivée de la PCR, Plum et Clark-curtiss (Plum, 1994) ont montré qu'un gène de M. avium inclu dans un fragment d'ADN de 3 kb, est induit après la phagocytose par des macrophages humains. Ce gène code pour une protéineputative exportée comprenant une séquence leader mais ne présentant pas d'homologie significative avec les séquences proposées par les banques de données. L'induction, pendant la phase de croissance intracellulaire, d'une protéine de choc thermique de faible poids moléculaire issue de M. leprae a également été mise en évidence (Dellagostin, 1995). Dans une autre étude, les protéines bactériennes de M. tuberculosis ont été métaboliquement marquées pendant la phase de croissance intracellulaire ou bien dans des conditions de stress et séparées par électrophorèse sur gel à deux dimensions: 16

protéines de M. tuberculosis ont été induites et 28 reprimées.

Les mêmes protéines sont mises en jeu au cours de stress provoqué par un faible pH, un choc thermique, H202, ou au cours

de la phagocytose par des monocytes humains de la lignée THP1.

Quoi qu'il en soit, le comportement des protéines induites et réprimées était unique dans chaque condition (Lee, 1995). Pris ensemble, ces résultats indiquent qu'un dialogue moléculaire subtile est mis en place entre les bactéries et leurs hôtes cellulaires. De ce dialogue dépend probablement le sort de

l'organisme intracellulaire.

Dans ce contexte, l'induction de l'expression de DP428 pourrait être d'une importance majeure, indiquant un rôle important de cette protéine dans la survie et la croissance intracellulaire. La méthode utilisée dans ces expériences pour évaluer

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l'expression intracellulaire des gènes présente l'avantage d'être simple comparée aux autres techniques comme la technique décrite par Mahan et ai. (Mahan, 1993) adaptée aux mycobactéries et proposée par Bange et ai. (Bange, 1996), ou la méthode substractive basée sur l'ACP décrite par Plum et Clark- curtiss (Plum, 1994). Il existe indiscutablement une variabilité comme le montre la comparaison des différentes expériences. Bien que provoquer l'induction ou la répression soit suffisant il est désormais possible de l'évaluer fournissant ainsi un outil supplémentaire d'études physiologiques des protéines exportées identifiées par fusion

avec phoA.

Exemple 4:

Recherche d'une modulation de l'activité des promoteurs lors des phases intramacrophagiques Des macrophages de moelle osseuses de souris sont préparés comme décrit par Lang et Antoine(Réf. 13). Les bactéries de M. segmentis recombinantes, dont on a déterminé l'activité luciférase par 103 bactéries comme précédemment, sont incubées à 37 C sous atmosphère humidifiée et enrichie en CO2 à 5%-, pendant 4 heures en présence de ces macrophages de telle manière qu'elles soient phagocytées. Après rinçage pour éliminer les bactéries extracellulaires restantes, on ajoute au milieu de culture de l'amikacine (100 gg/ml) pendant deux heures. Après un nouveau rinçage, le milieu est remplacé par un milieu de culture (DMEM enrichi de 10% de sérum de veau et 2mM de glutamine) sans antibiotiques. Après une nuit d'incubation comme précédemment, les macrophages sont lysés à froid (4 C) à l'aide d'un tampon de lyse (cell lysis buffer, Promega), et l'activité luciférase par 103 bactéries déterminée. Le rapport des activités à la mise en culture et après une nuit donne le

coefficient d'induction.

(D coIlstruct /% recovery RLU/1031bacteria RLU/103bacteria indluction ecxtrnacclluIlair intracellular pJVED/blaF* 0.5 1460 1727 1.2 pJVED/hIspl 8 0.6 8 57 7.1 pJVED/DI'428 0.7 0.06 18 300 colistrUlCt (Yo recovexcry RLU/103bacteria RLLU/103bacteria induction extracellular intracellular C5713L/6 Bialb/C C5713L/6 Balb/C C5713L/6 Balb/C pJVED/bl!al: 7 1.1 662 250 911 0.54 1.4 pJVED/hsp18 6.7 1.7 164 261 325 1.6 2 pJ VED/Dl'128 1.6 2.1 0.08 1.25 3.3 15.6 41

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67 2767336

Claims (65)

Revendications

1. Vecteur recombinant de criblage, de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce qu'il se réplique chez des mycobactéries et en ce qu'il contient: 1) un réplicon fonctionnel chez les mycobactéries; 2) un marqueur de sélection; 3) une cassette reporteur comprenant: a) un site de clonage multiple (polylinker), b) éventuellement un terminateur de transcription actif chez les mycobactéries, en amont du polylinker, c) une séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'expression, d'exportation et/ou de sécrétion de protéine, ladite séquence nucléotidique étant dépourvue de son codon d'initiation et de ses séquences de régulation, et d) une séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'activité de promoteurs contenus dans le même fragment, ladite séquence nucléotidique étant pourvue

de son codon d'initiation.

2. Vecteur recombinant selon la revendication 1, caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'expression, d'exportation et/ou de sécrétion de protéine est une séquence codante issue du géne phoA de la

phosphatase alcaline.

3. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 et 2,

caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'expression, d'exportation et/ou de sécrétion de protéine est une séquence codante du gène

de la 5-agarase, de la nucléase d'un staphylocoque ou de la -

lactamase d'une mycobactérie.

4. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 3,

caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'activité de promoteurs

68 2767336

contenus dans le même fragment est une séquence codante issue

du gêne luc de la luciférase de luciole.

5. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 4,

caractérisé en ce que la séquence nucléotidique codante issue d'un gène codant pour un marqueur d'activité de promoteurs contenus dans le même fragment est une séquence codante issue

du gène GFP de la Green Fluorescent Protein.

6. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 5,

caractérisé en ce que le terminateur de transcription actif chez les mycobactéries est le terminateur du coliphage T4 (tT4).

7. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 6,

caractérisé en ce qu'il est un plasmide choisi parmi les plasmides suivants déposés à la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Paris, France): a) pJEVDa déposé à la CNCM sous le N 1-1797, le 12/12

1996,

b) pJEVDb déposé à la CNCM sous le N 1-1906, le 25 juillet 1997, c) pJEVDc déposé à la CNCM sous le N 1-1799, le 12/12 1996,

d) pJEVD/M. tuberculosis déposé à la CNCM sous le N 1-

1907, le 25 juillet 1997.

8. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 7,

caractérisé en ce qu'il comprend en l'un des sites de clonage du polylinker une séquence d'acide nucléique de mycobactérie chez laquelle on détecte un polypeptide susceptible d'être exporté et/ou sécrété, et/ou d'être induit ou réprimé lors de l'infection par ladite mycobactérie ou encore produit de façon constitutive, ainsi que les séquences promotrices et/ou régulatrices associées susceptibles de permettre ou de favoriser l'exportation et/ou la sécrétion dudit polypeptide,

ou tout ou partie de gène codant pour ledit polypeptide.

69 2767336

9. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 8,

caractérisé en ce que la séquence d'acide nucléique de mycobactérie qu'il contient est obtenue par digestion enzymatique de l'ADN génomique ou de l'ADN complémentaire d'un ARN d'une mycobactérie pathogène.

10. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 9,

caractérisé en ce que ladite mycobactérie pathogène est M. tuberculosis.

11. Vecteur recombinant selon l'une des revendications 1 à 9,

caractérisé en ce que ladite mycobactérie pathogène est choisie parmi M. africanum, M. bovis, M. avium ou M. leprae

12. Vecteur recombinant selon la revendications 10,

caractérisé en ce qu'il est un plasmide choisi parmi les plasmides suivants déposés à la CNCM: a)p6D7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1814, b)p5A3 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1815, c)p5F6 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1816, d)p2A29 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1817, e)pDP428 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1818, f)p5B5 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1819, g)plC7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1820, h)p2D7 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1821,

i)plB7 déposé le 31 janvier 1997 à la CNCM sous le N I-1843.

13. Vecteur recombinant selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pDP428 déposé le 28 janvier 1997

à la CNCM sous le N I-1818.

14. Procédé de criblage de séquences de nucléotides issues de mycobactéries pour déterminer la présence de séquences correspondant à des polypeptides exportés et/ou sécrétés 3' pouvant être induits ou réprimés lors de l'infection, leurs séquences promotrices et/ou régulatrices associées susceptibles notamment de permettre ou de favoriser

2767336

l'exportation et/ou la sécrétion desdits polypeptides d'intérêt, ou tout ou partie de gènes d'intérêt codant pour lesdits polypeptides, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre un

vecteurselon l'une des revendications 1 à 13.

15. Procédé de criblage selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a)la digestion des séquences d'ADN de mycobactéries par au moins une enzyme déterminée et la récupération des fragnents de digestion obtenus; b) l'insertion des fragments de digestion dans un site de clonage compatible avec l'enzyme de l'étape a) du polylinker

d'un vecteur selon l'une des revendications 1 à 13;

c) si besoin, l'amplification du fragment de digestion contenu dans le vecteur, par exemple par réplication de ce dernier après insertion du vecteur ainsi modifié dans une cellule déterminée, de préférence E coli; d) la transformation de cellules hôtes par le vecteur amplifié à l'étape c), ou en l'absence d'amplification, par le vecteur de l'étape b); e) la culture de cellules hôtes transformées dans un milieu permettant la mise en évidence du marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou du marqueur d'activité de promoteurs contenu dans le vecteur; f) la détection des cellules hôtes positives (colonies positives) pour l'expression du marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou du marqueur d'activité de promoteurs; g) l'isolement de 1'ADN des colonies positives et l'insertion de cet ADN dans une cellule identique à celle de l'étape c); h) la sélection des insertions contenues dans le vecteur, permettant l'obtention de clones positifs pour le marqueur d'exportation et/ou de sécrétion, et /ou pour le marqueur d'activité de promoteurs; i)l'isolement et la caractérisation des fragments d'ADN de mycobactéries contenues dans ces insérats, et l'étape i) du procédé pouvant comporter en outre une étape de séquençage des

71 2767336

insertions sélectionnées.

16. Banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactérie, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par un procédé selon la revendication 14 et/ou un procédé comprenant les étapes a) et b), ou a), b) et c) du procédé selon la

revendication 15.

17. Banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactérie selon la revendication 16, caractérisée en ce que

ladite mycobactérie est une mycobactérie pathogène.

18. Banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactérie selon la revendication 17, caractérisée en ce que ladite mycobactérie est une mycobactérie appartenant au groupe

du complexe Mycobacterium tuberculosis.

19. Banque d'ADN génomique ou d'ADNc complémentaire d'ARNm de mycobactérie selon la revendication 18, caractérisée en ce que

ladite mycobactérie est Mycobacterium tuberculosis.

20. Séquence nucléotidique de mycobactérie susceptible d'être

sélectionnée par un procédé selon l'une des revendications 14

et 15.

21. Séquence nucléotidique de mycobactérie selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences de fragments d'ADN de mycobactéries de séquence SEQ ID N 3, SEQ ID N 4, SEQ ID N 5, SEQ ID N 6, SEQ ID N 7, SEQ ID N 8, SEQ ID N 9 ou SEQ ID N 10, contenus respectivement dans les vecteurs p6D7 (CNCM, N I-1814), p5A3 (CNCM, N I-1815),p5F6 (CNCM, N I-1816), p2A29 (CNCM, N I- 1817),

p5B5 (CNCM, N I-1819),plC7 (CNCM, N I-1820), p2D7 (CNCM,N I-

1821) et plB7 (CNCM sous le N I-1843).

3-

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22. Séquence nucléotidique de mycobactérie selon la revendication 20 caractérisée en ce qu'elle est choisie parmi les séquences de fragments d'ADN de mycobactéries de

séquence nucléiques SEQ ID N 11 et SEQ ID N 24.

23. Polypeptide susceptibles d'être codés par une séquence

nucléotidique de mycobactérie selon l'une des revendications 20

à 22. 24. Mycobactérie recombinantes caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur recombinant selon l'une des

revendications 1 à 13.

25. Polynucléotide de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID N 2.

26. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi: a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID N 2, b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'homologie avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou c), e) un fragment d'au moins 8 nucléotides consécutifs d'un

polynucléotide défini en a), b), c) ou d).

27. Polynucléotide selon l'une des revendications 25 et 26,

3() caractérisé en ce que sa séquence nucléique est spécifique de séquence de mycobactéries appartenant au complexe de

Mycobacterium tuberculosis.

28. Polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N01 ou SEQ

ID N 2.

73 2767336

29. Polypeptide caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi: a) un polypeptide de séquence d'acides aminés SEQ ID N 01 ou SEQ

ID N 2,

b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a), c) un fragment d'au moins 5 acides aminés d'un polypeptide défini en a)ou b), d) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en

a), b), ou c).

30. Polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un

polypeptide selon l'un des revendications 28 et 29.

31. Séquence d'acide nucléique utilisable comme amorce, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi les séquences d'acide nucléique de polynucléotide selon l'une des

revendications 25 à 27,et 30.

32. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 31, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi les

séquences suivantes: SEQ ID N 25 et SEQ ID N 26.

33. Séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications

31 et 32 pour la détection et/ou l'amplification de séquences

nucléiques.

34. Séquence d'acide nucléique utilisable comme sonde, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi les

séquences d'acide nucléique selon l'une des revendications 25 à

(0 27, et 30.

35. Séquence d'acide nucléique selon la revendication 34, caractérisée en ce qu' elle est marquée par un composé

radioactif ou par un composé non radioactif.

lq

74 2767336

36. Séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications

34 et 35, caractérisée en ce que celle-ci est immobilisée sur

un support, de manière covalente ou non-covalente.

37. Séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications

34 à 36 pour la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques.

38. Séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications

34 à 37, caractérisée en ce que ladite séquence est choisie parmi les séquences suivantes: du nucléotide 924 au nucléotide

1234 inclus dans SEQ ID N 01.

39. Vecteur recombinant de clonage, d'expression et/ou d'insertion caractérisé en ce qu'il contient une séquence d'acide nucléique de polynucléotide selon l'une des

revendications 25 à 27, et 30.

40. Vecteur recombinant selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il s'agit du plasmide pDP428 déposé le 28 janvier 1997

à la CNCM sous le N I-1818.

41. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée

par un vecteur recombinant selon l'une des revendications 39 et

40. 42. Cellule hôte selon la revendication 41, caractérisée en ce qu'elle s'agit de la souche de E. coli transformée par le plasmide pDP428 déposé le 28 janvier 1997 à la CNCM sous le

N I-1818.

43. Polypeptide recombinant, caractérisé en ce qu'il est obtenu à partir d'une cellule hâte recombinant selon l'une des

revendications 41 et 42.

2767336

44. Polypeptide hybride, caractérisé en ce qu'il comporte au moins la séquence d'un polypeptide selon l'une des

revendications 28, 29 et 43 et une séquence d'un polypeptide

susceptible d'induire une réponse immunitaire chez l'homme ou l'animal. 45. Polypeptide hybride selon la revendication 44, caractérisé en ce que le polypeptide susceptible d'induire une réponse immunitaire contient au moins un déterminant antigénique

capable d'induire une réponse humorale et/ou cellulaire.

46. Polypeptide hybride selon l'une des revendications 44 et

, caractérisé en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de protéines immunogènes sélectionnées par exemple parmi ESAT6 et DES de 45/47 kD de

Mycobacterium tuberculosis.

47. Polypeptide hybride selon l'une des revendications 44 et

, caractérisé en ce que le déterminant antigénique correspond à un déterminant antigénique de l'antigène de surface ou d'enveloppe d'un virus de l'hépatite ou de l'antigène VP1 du

virus de la poliomyélite.

48. Polypeptide hybride selon l'une des revendications 44 et

45, caractérisé en ce que le déterminant antigénique est constitué de tout ou partie d'une protéine sélectionnée parmi

les protéines gag, pol, nef ou env de HIV-1 ou HIV-2.

49. Polynucléotide codant pour un polypeptide hybride selon

l'une des revendications 44 à 48.

50. Polypeptide hybride selon l'une des revendications 44 à 48

caractérisée en ce qu'il s'agit d'une protéine recombinante obtenue par l'expression d'un polynucléotide selon la

revendication 49.

51. Procédé pour la détection in vitro d'anticorps dirigés contre une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans

76 2767336

un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un

polypeptide selon l'une des revendications 28, 29 et 43;

b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé. 52. Kit pour le diagnostic in vitro d'une infection par une mycobactérie appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis, comprenant:

a) un polypeptide selon l'une des revendications 28, 29

et 43; b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique; d) le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin négatif) dépourvu d'anticorps reconnus par ledit polypeptide; e) le cas échéant, un échantillon biologique de référence (témoin positif) contenant une quantité prédéterminée

d'anticorps reconnus par ledit polypeptide.

53. Anticorps mono- ou polyclonaux, leurs fragments, ou anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'une des

revendications 28, 29 et 43.

54. Anticorps selon la revendication 53, caractérisé en ce

qu'il s'agit d'un anticorps marque.

55. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: 3'5 a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un

anticorps selon l'une des revendications 53 et 54;

b) Mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.

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56. Kit pour la détection spécifique de la présence d'un antigène d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un anticorps polyclonal ou monoclonal selon l'une des

revendications 53 et 54;

b) les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) les réactifs permettant la détection des complexes

antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.

57. Procédé de détection et d'identification rapide de M. tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) Isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique; b) Amplification spécifique de l'ADN des mycobactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis à l'aide

2() d'amorces selon l'une des revendications 31 à 33;

c) Analyse des produits d'amplification.

58. Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique selon

l'une des revendications 34 à 38 avec un échantillon

biologique, l'ADN contenu dans l'échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b)Détection de l'hybride formé entre la sonde

oligonucléotidique et l'ADN de l'échantillon biologique.

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59. Procédé pour la détection spécifique de bactéries appartenant au complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support selon la revendication 36 avec un échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de la sonde à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b) Mise en contact de l'hybride formé entre la sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans l'échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN de l'échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec la sonde, avec une sonde oligonucléotidique

marquée selon la revendication 35.

60. Procédé de détection selon la revendication 59, caractérisé en ce que, préalablement à l'étape a), l'ADN de l'échantillon biologique, ou 1'ADNc obtenu par transcription inverse de 1'ARN de l'échantillon, est amplifié à l'aide d'un couple d' amorces

selon l'une des revendications 31 à 33.

61. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec un

couple d'amorces selon l'une des revendications 31 à 33, l'ADN

contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis;

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c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par les amorces, par exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde

oligonucléotidique marquée selon la revendication 35.

62. Procédé pour la détection spécifique de la présence d'une bactérie appartenant au complexe de Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) Mise en contact de l'échantillon biologique avec deux

couples d'amorces selon l'une des revendications 31 à 33,

l'ADN contenu dans l'échantillon ayant été, le cas échéant, préalablement rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant une hybridation des amorces à l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; b) amplification de l'ADN de la bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis; c) mise en évidence de l'amplification de fragments d'ADN correspondant au fragment encadré par lesdites amorces, par

exemple par électrophorèse sur gel ou au moyen d'une sonde oligonucléotidique marquée selon la revendication 35.

63. Kit pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Une sonde oligonucléotidique selon l'une des

revendications 34 à 38;

b) Les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des

revendications 31 à 33 ainsi que les réactifs nécessaires à

une réaction d'amplification de l'ADN (ADN génomique, plasmidique ou ADNc) d'une bactérie du complexe Mycobacterium

tuberculosis.

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64. Kit ou nécessaire pour la détection de la présence d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, selon la revendication 36; b) Une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation,

selon l'une des revendications 34 à 38.

c) Le cas échéant, un couple d'amorces selon l'une des

revendications 31 à 33 ainsi que les réactifs nécessaires à

une réaction d'amplification de l'ADN d'une bactérie du

complexe Mycobacterium tuberculoses.

65. Kit pour l'amplification de l'ADN d'une bactérie du complexe Mycobacterium tuberculosis présent dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) Un couple de fragments d'acide nucléique selon l'une

des revendications 31 à 33;

b) Les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN; c) Eventuellement un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde

oligonucléotidique selon l'une des revendications 34 à 38.

66. Composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend

un ou plusieurs polypeptides selon l'une des revendications 28,

29 et 43 et/ou un ou plusieurs polypeptides hybrides selon

l'une des revendications 44 à 50.

67. Vaccin caractérisé en ce qu'il contient un ou plusieurs

polypeptides selon l'une des revendications 28, 29 et 43 et/ou

un ou plusieurs polypeptides hybrides selon l'une des

revendications 44 à 50, en association avec un véhicule

pharmaceutiquement compatible et, le cas échéant un adjuvant de

l'immunité approprié.

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68. Vaccin destiné à l'immunisation à l'encontre d'une infection bactérienne ou virale, telle que la tuberculose ou

l'hépatite, comprenant un vecteur selon la revendication 39 ou un polynucléotide selon la revendication 49, en associationO avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.