ES2966050T3 - Hidrolizado de proteínas de pescado en polvo y composición que comprende dicho polvo para su uso como medicamento - Google Patents

Abstract

Se proporciona un proceso de hidrólisis enzimática para producir un polvo de hidrolizado de proteína de pescado. Además, se proporciona el desuso del polvo de hidrolizado de proteína de pescado obtenido y una composición que comprende dicho polvo como medicamento, preferiblemente para la profilaxis o el tratamiento del daño oxidativo del sistema nervioso central y gastrointestinal. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Hidrolizado de proteínas de pescado en polvo y composición que comprende dicho polvo para su uso como medicamento

Campo de la invención:

Esta invención se relaciona con un proceso enzimático de la hidrólisis para producir un polvo del hidrolizado de la proteína de pescados. Además, la invención se refiere al polvo de hidrolizado de proteína de pescado obtenido por el proceso y a una composición que comprende dicho polvo para su uso como medicamento. Esta invención se refiere a un hidrolizado de proteína de pescado y sus péptidos constituyentes destinados a regular la función de los genes protectores de la oxidación humana, que proporcionan protección contra el daño oxidativo en diversos órganos y tejidos. Más concretamente, esta invención se refiere a uno o más compuestos peptídicos con actividad reguladora de los genes protectores de la oxidación incorporados a una formulación oral. Esta invención también se refiere a un método para proteger el sistema gastrointestinal y el sistema nervioso central del daño oxidativo, que comprende la ingestión oral de una cantidad eficaz del hidrolizado de proteína de pescado o de uno o más de sus péptidos constituyentes. La invención se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

Antecedentes de la invención:

La regulación ascendente/descendente de uno o más genes relacionados con el estrés oxidativo se ha propuesto como un posible mecanismo que puede conferir citoprotección a los tejidos expuestos a lesiones oxidativas. Aunque el oxígeno molecular es esencial para la supervivencia de casi todos los eucariotas, su procesamiento en condiciones fisiológicas genera especies reactivas de oxígeno (ROS) como peróxido de hidrógeno, superóxido, peroxinitrito y radicales hidroxilo, como subproductos metabólicos. En ausencia de un mecanismo de defensa adecuado, la acumulación de ROS y electrófilos provoca daños en la membrana celular y el ADN, mutagenicidad, degeneración de los tejidos, envejecimiento prematuro, muerte celular apoptótica y cánceres [Ward, J. F. (1994). The complexity of DNA damage: relevance to biological consequences. Int. J. Radiat Biol. 66, 427-432; Goetz, M. E., y Luch, A. (2008)Reactive species: A cell damaging routing assisting to Chemical carcinogens.Cancer Lett. 266, 73-83; Strassburg, C. P., Manns, M. P., y Tukey, R. H. (1997) Differential Down-Regulation of the UDP-Glucuronosyl transferase 1A LocusIs an Early Event in Human Liver and Biliary Cancer.Cancer Res. 57, 2979-2985].

Para combatir este estrés oxidativo, las células de mamíferos han desarrollado una serie de activaciones genéticas defensivas inducibles, que conducen a una neutralización de los eventos de estrés oxidativo, una reducción de ROS y, por tanto, una mayor supervivencia celular. [Dhakshinamoorthy, S., Long, D. J., Jaiswal, A. K. (2000)Antioxidant Regulation of Genes Encoding Enzymes That Detoxify Xenobiotics and Carcinogens.Curr. Top. Cell Regul. 36, 201 216; Jaiswal, A. K. (2000)Regulation of genes encoding NAD(P)H: quinone oxidoreductases.Free Radic Biol. Med.

29, 254-262].

Entre las enzimas con propiedades antioxidantes, capaces de inactivar las ERO e impedir las reacciones iniciadas por éstas, se encuentran las superóxido dismutasas, la catalasa y la glutatión peroxidasa. Pertenecen al grupo denominado enzimas antioxidantes de fase 1 "directas". [Auten, R. L., O'Reilly, M. A., Oury, T. D., Nozik-Grayck, E., y Whorton, M. H. (2006)Transgenic extracellular superoxide dismutase protects postnatal alveolar epithelial proliferation and development during hyperoxia.Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L32-40].

Las enzimas desintoxicantes (conjugantes) de fase 2 se clasifican como antioxidantes "indirectos" por su papel en el mantenimiento del equilibrio redox y la homeostasis de los tioles. Contribuyen a la biosíntesis, al reciclaje de tioles y facilitan la excreción de metabolitos secundarios oxidados y reactivos (quinonas, epóxidos, aldehídos y peróxidos) mediante reacciones de reducción/conjugación durante el proceso de desintoxicación de xenobióticos. [Talalay, P., Holtzclaw, W. D., y Dinkova-Kostova, A. T. (2004)Importance of Phase 2 gene regulation in protection against electrophile and reactive oxygen toxicity and carcinogensis. Adv. Enzyme Regul. 44, 335-367].

Las enzimas de fase 2 con capacidad antioxidante incluyen las isozimas de la glutatión S-transferasa y la NADP(H): quinina oxidorreductasa (NQO1), la glutamil cisteína ligasa (GCLC) y la UDP- glucuronosiltransferasa (UGT).

Las vías de transducción de señales responsables de detectar el estrés oxidativo y activar los genes de defensa apropiados aún no se conocen por completo en los mamíferos. El factor de transcripción factor nuclear eritroide 2-relacionado (Nrf2), que se activa por ROS, parece ser un regulador clave en la regulación de genes de estrés oxidativo. Nrf2 es miembro de la familia Cap'n'Collar de proteínas bZIP y reconoce el elemento de respuesta antioxidante (ARE) en el promotor de sus más de 2000 genes diana. En condiciones basales normales, Nrf2 está unida a su inhibidor, la proteína Keapl asociada al citoesqueleto, que reprime a Nrf2 facilitando su degradación proteasomal. [Itoh, K., Wakabayashi, N., Katoh, Y., Ishii, T., Igarashi, K., Engel, J. D., y Yamamoto, M. (1999) Keapl reprime la activación nuclear de los elementos de respuesta antioxidante por Nrf2 mediante la unión al dominio aminoterminal Neh2. Genes Dev. 13, 76-86] Tras el tratamiento con antioxidantes, Nrf2 se libera de Keapl y se transloca al núcleo, seguido de heterodimerización con otros factores de transcripción, como Jun y Maf pequeño [Venugopal, R., y Jaiswal, A. K. (1998) Nrf2 y Nrfl en asociación con proteínas Jun regulan la expresión mediada por elementos de respuesta antioxidante y la inducción coordinada de genes que codifican enzimas desintoxicantes. Oncogene 17, 3145-3156; Nguyen, T., Sherratt, P. J., y Pickett, C. B. (2003)Regulatory mechanisms controlling gene expression mediated by the antioxidant response element. Annu. Rev. Pharmacol.Toxicol. 43, 23 3-260] e inicia la regulación al alza de los genes antioxidantes.

La expresión génicain vitrose ha utilizado para comprender el papel de los antioxidantes en muchas enfermedades. Se utilizó la expresión génica para mostrar 200 genes oxidativos expresados de forma diferencial en sujetos con EPOC (trastorno pulmonar obstructivo crónico) en comparación con fumadores sanos, y los cambios significativos en los genes de respuesta oxidante observados in vivo se reprodujeron in vitro utilizando células epiteliales bronquiales primarias de los mismos donantes. [Pierrou, S., Broberg, P., O'Donnell, R.A., Pawlowski, K., Virtala, R., Lindqvist, E. (2007)Expression of Genes Involved in Oxidative Stress Responses in Airway Epithelial Cells of Smokers with Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Am. J. of Respiratory and Critical Care Medicine,175(6), 577-587]. También se ha estudiado la expresión génica in vitro en células endoteliales de la córnea humana (HCECs) para ver si el daño oxidativo nuclear del ADN aumenta con la edad y si las HCECs responden a este daño regulando al alza su expresión de genes de estrés oxidativo y de señalización del daño del ADN de forma dependiente de la edad. [Joyce, N.C., Harris, D.L., Zhu, C.C.Age-Related Gene Response of Human Corneal Endothelium to Oxidative Stress and DNA Damage(2011) Cornea, 52(3), 1641-1649]. Cuatro de los 84 genes protectores de la oxidación analizados mostraron una diferencia estadísticamente significativa relacionada con la edad en su expresión.

Los estudios también han demostrado que la dieta puede desempeñar un papel en la regulación de los genes protectores de la oxidación. En un estudio reciente cuyo objetivo era identificar marcadores moleculares de enfermedades relacionadas con la dieta en respuesta a la alimentación, se evaluaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) como sistema modelo in vitro como fuente de ARN fácilmente disponible para discernir firmas de expresión génica en relación con el tratamiento personalizado de la obesidad. Se recogieron PBMC de hombres obesos antes y después de una dieta hipocalórica (LCD) de 8 semanas para perder peso. Los cambios en la expresión génica antes y después de la LCD se validaron mediante qRT-PCR y mostraron una disminución en algunos genes específicos de estrés oxidativo e inflamación. [Crujeiras, A., Parra, D., Milagro, F., Goyenechea, E., Larrarte, E., Margareto, J., Martinez, A. (2008)Differential Expression of Oxidative Stress and Inflammation Related Genes in Peripheral Blood Mononuclear Cells in Response to a Low-Calorie Diet: Un Estudio Nutrigenómico. OMICS: A Journal of Integrative Biology,12(4), 1-12].

Los siguientes documentos divulgan procesos para producir un hidrolizado de proteína de pescado en polvo y el hidrolizado de pescado en polvo obtenido. Sin embargo, las etapas de los procesos y el polvo obtenido son diferentes, por lo que también lo es la actividad biológica; CN106282285 A; Ahn Chang-Bum et al"Antioxidant and antiinflammatory peptide fraction from salmon by-products protein hydrolysates by peptic hydrolysis",Food Research International, vol. II. 49, n° 1, 1 de noviembre de 2012 y Morales-Medina R et al "Multiobjective optimization of the antioxidant activities of horse mackerel hydrolysates produced with protease mixtures",Process Biochemistry, Elsevier Ltd, GB, vol. 52, 11 de noviembre de 2016.

No se ha descrito ninguna regulación de los genes protectores de la oxidación por hidrolizados de proteínas ingeridos por vía oral y, en particular, por hidrolizados de proteínas de pescado. La cavidad bucal y el tracto gastrointestinal, que son los principales lugares de entrada de xenobióticos, están continuamente expuestos a una amplia gama de compuestos con capacidad ROS. El metabolismo posterior de la mucosa puede dar lugar a metabolitos con mayor toxicidad, lo que aumenta la susceptibilidad de la cavidad oral y el tracto gastrointestinal a los metabolitos oxidativos, la toxicidad química y la posible colitis necrotizante. Este daño oxidativo también puede observarse como efecto secundario en el tejido nervioso como parte del sistema nervioso central.

La regulación al alza de los genes protectores de la oxidación es una diana biológica viable que podría conferir un efecto protector en el tracto gastrointestinal y el sistema nervioso central que puede utilizarse junto con tratamientos médicos en el control de enfermedades inflamatorias intestinales (EII) como la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn y enfermedades degenerativas del SNC como el Parkinson, la esclerosis múltiple y el Alzheimer.

En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de desarrollar un tratamiento ingerible para la protección oxidativa de diversos órganos y tejidos, cuando se toma por vía oral. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona otras ventajas relacionadas.

Sumario de la invención:

La invención se define únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención proporciona un hidrolizado de proteína de pescado en polvo y sus péptidos constituyentes para uso oral en la regulación de la función de los genes protectores de la oxidación humana, que proporcionan protección contra el daño oxidativo en diversos órganos y tejidos. El hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención incluye uno o más compuestos peptídicos con actividad reguladora de los genes protectores de la oxidación incorporados en una formulación oral.

El hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención posee una eficacia mejorada para proteger el sistema gastrointestinal y el sistema nervioso central del daño oxidativo. Las composiciones que comprenden el hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención pueden contener opcionalmente antioxidantes o eliminadores de radicales libres seleccionados entre vitamina E, vitamina A, aceite de té de árbol, extracto de té verde, butilhidroxil anisol (BHA), butilhidroxil tolueno (BHT) y ácido ferúlico o derivados de los mismos, y similares.

Las composiciones que comprenden el hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención pueden comprender además un ingrediente alimentario aceptable adecuado para su uso en dichas preparaciones, dicho ingrediente puede incluir aromatizantes, emulsionantes, tensioactivos, emolientes, aceites esenciales, agentes gelificantes, humectantes, colorantes y similares.

Además, la composición que comprende el hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención puede presentarse en forma de polvo o solución que facilite la administración oral para bebés, niños, adultos y ancianos que puedan tener dificultades para tragar.

También se divulga un método para tratar enfermedades gastrointestinales y del sistema nervioso central potencialmente causadas por daños oxidativos en los órganos y tejidos afectados. La composición según la presente invención puede utilizarse para proteger el sistema nervioso gastrointestinal y central del daño oxidativo, ingiriendo por vía oral una cantidad eficaz del hidrolizado de proteína de pescado o de uno o más de sus péptidos constituyentes.

Descripción detallada de la invención:

Antes de describir en detalle la presente invención, debe entenderse que la terminología empleada en el presente documento tiene por objeto describir únicamente realizaciones particulares y no pretende ser limitativa. Debe tenerse en cuenta que, tal como se utiliza en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el", "la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Por "salmónidos" se entiende cualquier pez de la familia Salmonidae. El término "hidrolizado de proteínas de pescado" utilizado en el presente documento designa los péptidos resultantes de la hidrólisis enzimática de cualquier organismo de pescado o partes del mismo. El término "hidrólisis enzimática" utilizado aquí significa el proceso de utilizar enzimas proteasas, tanto naturales como artificiales, fijas o libres, endo y exo, para hidrolizar proteínas en aminoácidos constituyentes, péptidos y oligopéptidos. Los términos "endo y exo", tal como se utilizan aquí, significan enzimas proteasas que hidrolizan proteínas a partir de enlaces de aminoácidos internos y enlaces de aminoácidos terminales, respectivamente. En lo sucesivo, los términos hidrolizado de proteínas e hidrolizado de proteínas en polvo se utilizarán indistintamente.

De acuerdo con la presente invención, se proporciona un hidrolizado de proteína de pescado en polvo y una composición que comprende dicho polvo, para uso oral, para proteger el sistema gastrointestinal y nervioso central del daño oxidativo.

El hidrolizado de proteínas de pescado comprende uno o varios compuestos peptídicos bioactivos, en particular uno o varios péptidos capaces de regular la expresión de uno o varios genes protectores contra la oxidación que confieren protección a los sistemas gastrointestinal y nervioso central.

Se ha descrito el uso de hidrolizados de proteínas para suministrar proteínas fácilmente digeribles y biodisponibles. Sin embargo, no se ha descrito el uso de dichos hidrolizados de proteínas para aumentar específicamente la protección frente al daño oxidativo. Más concretamente, no se ha descrito en la bibliografía la administración oral de péptidos activos a través de un hidrolizado de proteínas en el tracto gastrointestinal que puedan regular los genes protectores frente a la oxidación, como los presentes en la vía Nrf2.

Así, un aspecto de la presente invención está dirigido a proporcionar un hidrolizado de proteína de pescado que modifique la regulación de los genes protectores de la oxidación, como los que se encuentran en la cascada Nrf2, para proporcionar protección de los sistemas gastrointestinal y nervioso central, de modo que el sujeto que está siendo tratado con dicho hidrolizado obtenga el máximo beneficio de eficacia mejorada.

El hidrolizado en polvo o la composición según la presente invención comprende un hidrolizado de proteínas de pescado que contiene uno o más péptidos preparados en polvo y administrados por vía oral como solución en agua o cualquier otro alimento líquido como zumos, leche o bebidas gaseosas.

Los expertos en la materia saben que un hidrolizado de proteínas puede obtenerse por medios ácidos, básicos y enzimáticos, y que el hidrolizado de proteínas resultante tendrá características y componentes diferentes. Además, la hidrólisis por medios enzimáticos dará lugar a diferentes constituyentes peptídicos y éstos dependerán de la fuente proteica original y de las enzimas utilizadas. A efectos de la presente invención, la hidrólisis se limita a la hidrólisis enzimática, la fuente de proteínas se limita al pescado y las enzimas se limitan a las enzimas proteasas. La fuente de proteínas preferida es el pescado de la familia de los salmónidos, en particular los recortes de salmón(salmo salar),cabezas, espinas dorsales, cola y piel que resultan tras el proceso de fileteado. Las enzimas preferidas son endo y exo proteasas procedentes de fuentes microbianas y con un número DAPU (unidades de proteasa alcalina detergente) entre 200 y 1000 ml/g o una actividad de proteasa natural medida entre 100.000 y 500.000 PC/g.

Se ha descubierto sorprendentemente que el proceso de hidrólisis enzimática según la invención proporciona un hidrolizado de proteína de pescado y un polvo de hidrolizado de proteína de pescado que son biológicamente activos y pueden utilizarse como medicamento.

Así, un aspecto de la presente invención se dirige a un proceso de hidrólisis enzimática para producir un hidrolizado de proteína de pescado en polvo, que comprende los pasos consecutivos de:

i) mezcla de material de proteína de pescado molido con agua y calentamiento;

ii) añadir enzima endopeptidasa a la mezcla de i) y agitar;

iii) añadir enzima exopeptidasa en forma de carboxipeptidasa a la mezcla de ii) y agitar;

iv) detener la hidrólisis enzimática mediante inactivación por calor;

v) la fracción de hidrolizado de pescado y el material sólido restante se separan por filtración; y

vi) concentrar y secar la fracción s de hidrolizado de pescado para obtener un hidrolizado de proteínas de pescado en polvo.

El material proteínico de pescado puede proceder de cualquier pez, preferiblemente de la familia de los salmónidos, en particular del salmón(salmo salar).El material proteínico puede ser cualquier material de pescado, como músculo, recortes, cabezas, espinas dorsales, cola y piel resultantes del proceso de fileteado o cualquier combinación de los mismos.

La trituración del material proteínico de pescado puede realizarse por cualquier procedimiento conocido. La proporción entre la masa de pescado triturada y el agua puede estar comprendida entre 1:0,5 y 1:5, preferiblemente 1:1 en peso.

La endopeptidasa (primera enzima) utilizada puede ser cualquier endopeptidasa o una combinación de ellas. Las endopeptidasas preferidas son la pepsina y la tripsina o cualquier combinación de ellas.

La exopeptidasa (segunda enzima) utilizada se selecciona del grupo de las carboxipeptidasas, y puede utilizarse cualquier carboxipeptidasa o combinación de las mismas. La cantidad de enzimas endopeptidasa y exopeptidasa añadidas puede estar comprendida entre el 0,05 y el 1% en peso/peso de la masa de pescado.

Una realización del proceso según la invención comprende además una tercera etapa de hidrólisis consistente en añadir una enzima proteasa derivada deaspergillus oryzaea la mezcla de la etapa iii) anterior. La tercera enzima proteasa puede añadirse en una proporción del 0,01 al 0,1% en peso/peso de la masa de pescado.

La temperatura de las etapas de hidrólisis enzimática se ajusta a una temperatura conveniente a la que las enzimas seleccionadas sean activas. Preferiblemente, el intervalo de temperatura de las etapas de hidrólisis, es decir, las etapas i) - iv), es de 35 °C - 60 °C, más preferiblemente de 50 °C. La duración de la acción de la primera, segunda y tercera enzimas puede ser de 10 a 30 minutos para cada una. El hidrolizado de proteínas obtenido sometiendo la mezcla de hidrolizado a una adición secuencial de una primera, segunda y tercera enzimas proporciona un hidrolizado apetecible y biológicamente activo. El hidrolizado de proteínas obtenido sometiendo la mezcla de hidrolizado sólo a una primera y segunda enzimas proporciona un hidrolizado menos apetecible, pero aun biológicamente activo.

En caso de que la mezcla de hidrólisis se someta sólo a una primera y segunda enzimas, el tiempo de acción de una o ambas enzimas se prolonga. En una realización, el tiempo de acción de la primera, segunda y tercera enzima es de 30 min, 15 min y 10 min, respectivamente.

En otra realización, el tiempo de acción de la primera y segunda enzima es de 30 min y 25 min, respectivamente.

La hidrólisis enzimática se detiene por inactivación térmica, es decir, la temperatura de la mezcla de hidrólisis se aumenta hasta una temperatura en la que las enzimas ya no son activas. Preferiblemente, la mezcla de hidrólisis se calienta a una temperatura comprendida entre 80 °C y 95 °C, más preferiblemente a 85 °C. Para que la inactivación sea suficiente, la temperatura debe mantenerse a la temperatura de inactivación durante un tiempo suficiente, por ejemplo 15 minutos.

La separación de la fracción de hidrolizado de proteínas y el material sólido restante puede realizarse mediante cualquier técnica adecuada de filtración o centrifugación. Un ejemplo adecuado es un tamiz vibratorio con mallas de tamaño variable. Tras la filtración, la fracción de hidrolizado de proteínas de pescado se concentra y se seca para obtener el hidrolizado de proteínas de pescado en polvo final. Puede utilizarse cualquier proceso adecuado de concentración y secado. Por ejemplo, la fracción de hidrolizado se concentra hasta un 30 % de materia seca en un evaporador convencional y se seca por pulverización para obtener el contenido final de materia seca adecuado. Preferiblemente, el hidrolizado de proteínas de pescado en polvo tiene un contenido final de materia seca del 95 - 99 %, más preferiblemente del 98%.

El proceso de hidrólisis enzimática puede incluir además auxiliares tecnológicos como agentes antiespumantes o tensioactivos o cualquier combinación de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a un hidrolizado de proteína de pescado en polvo obtenible por el procedimiento según la invención.

Una ventaja del hidrolizado de proteína de pescado en polvo proporcionado según la invención es que está formado por hidrólisis enzimática utilizando enzimas proteasas microbianas no modificadas genéticamente.

Otro aspecto de la presente invención se dirige a una composición que comprende el hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la invención junto con al menos un portador o excipiente farmacológicamente aceptable para su uso como medicamento.

En una realización, la composición comprende además proteínas adicionales e hidrolizados de proteínas de fuentes animales y vegetales o cualquier combinación de las mismas.

En otra realización, la composición comprende además un antioxidante o un eliminador de radicales libres seleccionado entre vitamina E, vitamina A, aceite de té de árbol, extracto de té verde, butilhidroxil anisol (BHA), butilhidroxil tolueno (BHT), o cualquier combinación de los mismos.

En otra realización, la composición comprende además hidratos de carbono, aromas y edulcorantes.

En otra realización, la composición comprende además humectantes o emulsionantes adecuados o cualquier combinación de los mismos.

Se ha descubierto sorprendentemente que el proceso de hidrólisis enzimática según la invención proporciona un hidrolizado de proteína de pescado y un polvo de hidrolizado de proteína de pescado que son biológicamente activos y pueden utilizarse como medicamento.

Así, se da a conocer un hidrolizado de proteína de pescado en polvo o una composición según la invención, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades gastrointestinales en los que los trastornos o enfermedades gastrointestinales se seleccionan del grupo que comprende la enfermedad por reflujo gastroesofágico, la gastroenteritis, el síndrome del intestino irritable, la enterocolitis, la enfermedad celíaca y las enfermedades proctitis.

Se divulga además un hidrolizado de proteína de pescado en polvo o una composición según la invención, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades del sistema nervioso, donde el trastorno o enfermedad del sistema nervioso central se seleccionan del grupo que comprende enfermedades neurodegenerativas, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica, trastornos cerebrovasculares, enfermedades desmielinizantes y trastornos psiquiátricos.

Se divulga además un hidrolizado de proteínas de pescado en polvo o una composición según la invención, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades gastrointestinales o del sistema nervioso central mediante la modificación de la expresión de genes protectores de la oxidación.

Se divulga además un hidrolizado de proteína de pescado en polvo o una composición según la invención, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades gastrointestinales o del sistema nervioso central mediante la modificación de la expresión de genes protectores de la oxidación, en los que los genes protectores de la oxidación están presentes dentro del factor nuclear eritroide 2-relacionado con el factor 2 (Nrf2) y el conjunto regulado de genes.

Se da a conocer además un hidrolizado de proteína de pescado en polvo o una composición según la invención, para su uso en la profilaxis o el tratamiento de trastornos o enfermedades gastrointestinales o del sistema nervioso central mediante la modificación de la expresión de genes protectores de la oxidación, en la que los genes protectores de la oxidación son Apolipoproteína E, Citoglobina, Eosinófilo peroxidasa, Ferritina, Polipéptido pesado 1, Glutaminacisteína ligasa, Glutatión peroxidasa 1, glutatión sintetasa, glutatión transferasa zeta 1, hemooxigenasa 1, lectina de unión a manosa 2, metionina sulfóxido reductasa A, óxido nítrico sintasa 2, NAD(P)H deshidrogenasa quinona 1, peroxiredoxina 5, selenoproteína S, superóxido dismutasa 1, araquidonato 12-lipoxigenasa, epóxido hidrolasa 2, glutatión S-transferasa microsomal 3, mieloperoxidasa, factor citosólico de neutrófilos 1, NADPH oxidasa, peroxiredoxina 1, prostaglandina endoperóxido sintasa 2, sulfiredoxina.

Otras características de la invención llegarán a ser evidentes en el curso de las descripciones siguientes de realizaciones ejemplares, que se dan para la ilustración de la invención y no se piensan para ser limitantes de eso.

Ejemplo 1 - Preparación de hidrolizado de pescado biológicamente activo en polvo según la invención

El hidrolizado de proteína de salmón en polvo se produce por hidrólisis enzimática de la cabeza y la espina dorsal del salmón (salmo salar) tras el fileteado. Se añaden 1000 gramos de cabeza y espina dorsal molidas a 1000 ml de agua y se calienta la mezcla a 50 °C. Se añaden 10 g de una enzima endopeptidasa - pepsina - y se agita durante 30 minutos. A continuación, se añaden 10 g de una enzima exopeptidasa (carboxipeptidasa) y se agita durante 15 minutos. A continuación, se añaden 5 gramos de la enzima Flavourzyme(R) (una proteasa derivada de Aspergillus oryzae) y se agita la mezcla durante 10 minutos. A continuación, se calienta toda la mezcla a 85 °C, se mantiene a dicha temperatura durante 15 minutos y se filtra. La fracción de hidrolizado se concentra hasta un 30 % de materia seca en un evaporador convencional y se seca por pulverización para obtener el hidrolizado de proteínas de pescado en polvo según la invención como un polvo fluido de color amarillo claro con la eficacia biológica que se muestra en los ejemplos 6-11 del presente documento.

Ejemplo 2 - Preparación de hidrolizado de pescado en polvo sin efecto biológico

El polvo de hidrolizado de proteína de salmón se produce como se expone en el ejemplo 1, salvo que la exopeptidasa utilizada es una aminopeptidasa en lugar de una carboxipeptidasa. Se obtuvo un polvo sin eficacia biológica (datos no mostrados).

En detalle: el hidrolizado de proteína de salmón en polvo se produce por hidrólisis enzimática de la cabeza y la espina dorsal del salmón (salmo salar) tras el fileteado. Se añaden 1000 gramos de cabeza y espina dorsal molidas a 1000 ml de agua y se calienta la mezcla a 50 °C. Se añaden 10 g de una enzima endopeptidasa - pepsina - y se agita durante 30 minutos. A continuación, se añaden 10 g de una enzima exopeptidasa (aminopeptidasa) y se agita durante 15 minutos. A continuación, se añaden 5 gramos de la enzima Flavourzyme(R) y se agita la mezcla durante 10 minutos. A continuación, se calienta toda la mezcla hasta 85 °C, se mantiene a dicha temperatura durante 15 minutos y se filtra. La capa acuosa se concentra hasta un 30 por ciento de materia seca en un evaporador convencional y se seca por atomización para obtener un polvo sin eficacia biológica.

Ejemplo 3 - Preparación de hidrolizado de pescado en polvo sin efecto biológico

El polvo de hidrolizado de proteína de salmón se produce como se expone en el ejemplo 1, salvo que la exopeptidasa (carboxipeptidasa) se añade antes de la endopeptidasa. Se obtuvo un polvo sin eficacia biológica (datos no mostrados).

En detalle: el hidrolizado de proteína de salmón en polvo se produce por hidrólisis enzimática de la cabeza y la espina dorsal del salmón (salmo salar) tras el fileteado. Se añaden 1000 gramos de cabeza y espina dorsal molidas a 1000 ml de agua y se calienta la mezcla a 50 °C. Se añaden 10 g de una enzima exopeptidasa -carboxipeptidasa- y se agita durante 30 minutos. A continuación, se añaden 10 g de una enzima endopeptidasa (pepsina) y se agita durante 15 minutos. A continuación, se añaden 5 gramos de la enzima Flavourzyme(R) y se agita la mezcla durante 10 minutos. A continuación, se calienta toda la mezcla a 85 °C, se mantiene a dicha temperatura durante 15 minutos y se filtra. La capa acuosa se concentra hasta un 30 por ciento de materia seca en un evaporador convencional y se seca por pulverización para obtener un polvo sin eficacia biológica.

Ejemplo 4 - Preparación de hidrolizado de pescado biológicamente activo en polvo según la invención

El polvo de hidrolizado de proteína de salmón se produce como se indica en el ejemplo 1 anterior, salvo que se omite la adición de la tercera enzima y se prolonga el tiempo de acción de la exopeptidasa. Se obtuvo un polvo con la eficacia biológica mostrada en los ejemplos 6-11 del presente documento.

En detalle: el hidrolizado de proteína de salmón en polvo se produce por hidrólisis enzimática de la cabeza y la espina dorsal del salmón (salmo salar) tras el fileteado. Se añaden 1000 gramos de cabeza y espina dorsal molidas a 1000 ml de agua y se calienta la mezcla a 50 °C. Se añaden 10 g de una enzima endopeptidasa - pepsina - y se agita durante 30 minutos. A continuación, se añaden 10 g de una enzima exopeptidasa (carboxipeptidasa) y se agita durante 25 minutos. A continuación, se calienta toda la mezcla a 85 °C, se mantiene a dicha temperatura durante 15 minutos y se filtra. La capa acuosa se concentra hasta un 30 por ciento de materia seca en un evaporador convencional y se seca por atomización para obtener el hidrolizado de proteínas de pescado en polvo según la invención como un polvo fluido de color amarillo claro con la eficacia biológica mostrada en los ejemplos 6-11 del presente documento.

Ejemplo 5 - Preparación de hidrolizado de pescado biológicamente activo en polvo según la invención

El polvo de hidrolizado de proteína de salmón se produce como se indica en el ejemplo 1 anterior, salvo que las enzimas endopeptidasas utilizadas son tripsina en lugar de pepsina. Se obtuvo un polvo con la eficacia biológica mostrada en los ejemplos 6-11 del presente documento.

En detalle: el hidrolizado de proteína de salmón en polvo se produce por hidrólisis enzimática de la cabeza y la espina dorsal del salmón (salmo salar) tras el fileteado. Se añaden 1000 gramos de cabeza y espina dorsal molidas a 1000 ml de agua y se calienta la mezcla a 50 °C. Se añaden 10 g de una enzima endopeptidasa - tripsina - y se agita durante 30 minutos. A continuación, se añaden 10 g de una enzima exopeptidasa (carboxipeptidasa) y se agita durante 15 minutos. A continuación, se añaden 5 gramos de la enzima Flavourzyme(R) y se agita la mezcla durante 10 minutos.

A continuación, se calienta toda la mezcla a 85 °C, se mantiene a dicha temperatura durante 15 minutos y se filtra. La capa acuosa se concentra hasta un 30 por ciento de materia seca en un evaporador convencional y se seca por pulverización para obtener el polvo deseado con la eficacia biológica mostrada en los ejemplos 6-11.

Mediante los ejemplos anteriores se ha demostrado sorprendentemente que la secuencia de adición de las enzimas hidrolíticas, así como la naturaleza de las enzimas, son importantes para obtener un hidrolizado en polvo biológicamente eficaz. El material proteínico de pescado se somete primero a una endopeptidasa y después a una exopeptidasa en forma de carboxipeptidasa. Se ha demostrado que la naturaleza de la endopeptidasa es de menor importancia. Opcionalmente, el hidrolizado puede someterse a una tercera proteasa derivada deaspergillus oryzaepara obtener un hidrolizado con una palatabilidad mejorada.

En los siguientes Ejemplos 6-11, se probó la actividad biológica del Hidrolizado de Proteína de Salmón en Polvo obtenido por el proceso según la invención, en adelante identificado como SPH.

Ejemplo 6

El hidrolizado de proteína de salmón en polvo (SPH) según la invención se probó en el siguiente experimento. Las células HGEPp (células epiteliales gingivales humanas primarias agrupadas) se adquirieron a CellnTec Advanced Cell Systems AG. El RNEasy Plus Micro Kit, RNase-free DNase Set, RT2Easy First Strand Kit(generador de ADN) y RT2 SYBR® Green fluor qPCR mastermix se adquirieron a Qiagen N.V., EE.UU. Losarraysde PCR RT2 profiler de estrés oxidativo (84 genes protectores) se adquirieron a Qiagen N. V., EE.UU.. Para la r T-PCR se utilizó el sistema PCR iCycler de Bio-Rad Inc., EE. UU.

Las células HGEPp primarias agrupadas se propagaron en medio de cultivo epitelial CnT-Prime proporcionado por CellnTec en placas de Petri de 100 mm recubiertas con 30 mg/ml de colágeno de cola de rata de tipo I (BD Biosciences) diluido en solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS). Se utilizó una densidad celular de 2,5x104 células/cm2 para cultivar monocapas celulares y se aclimataron durante la noche a 37°C.

Las células HGEPp se cultivaron en placas de cultivo celular Nunc™ de 4 x 60 mm, a una concentración de densidad de 2,5x104 células/cm2. Se preparó una suspensión madre de SPH 100 mM DMSO. Se prepararon otras diluciones de 25, 50 y 100 pM/ml de SPH. Todas las soluciones de dosificación contenían un 0,3% de DMSO, que está por debajo de la concentración máxima tolerada de DMSO del 0,8% para las células HGEPp.

Se seleccionaron concentraciones de células en placa de 2,5x105 /ml para obtener una absorbancia DO dentro de la porción lineal de la curva de control para ambas líneas celulares. Seis HGEPp y placas de cultivo celular se pretrataron durante 24 h con SPH a concentraciones de 25, 50 y 100 pg/mL (por duplicado) a 37°C. Una placa de cultivo celular para cada línea celular se pretrató durante 24 h con la solución en blanco DMSO a 37°C.

Se utilizó el RNeasy UCP Micro Kit para purificar el ARNm de las dos células tratadas con HGEPp. Tras descartar y lavar los tratamientos, las células se pelletearon por centrifugación durante 5 min a 1000 RPM en un tubo de centrífuga. Todo el sobrenadante se eliminó cuidadosamente por aspiración, asegurándose de que todo el medio celular se había eliminado completamente. Las células se disolvieron añadiendo 350 pl de tampón RULT con cuidado de desprender el sedimento celular del tubo, se agitaron en vórtex para mezclar bien y la mezcla se homogeneizó pasando el lisado 5 veces por una aguja de calibre 20 conectada a una jeringa sin RNasa. Se añadieron 350 pl de etanol al 70% al lisado y se mezcló de nuevo mediante pipeteo. Se transfirió la muestra, incluido cualquier precipitado que pudiera haberse formado, a una columna de centrifugación RNeasy UCP MinElute colocada en un tubo de recogida de 2 ml y se centrifugó durante 15 s a 10.000 rpm. Finalmente se eluyó con 16 pl de agua ultralimpia para obtener un eluido de ARN de 20 pl (4 pg).

Se añadió una muestra de ARN de cada uno de los siete tratamientos anteriores a 40 pl de tampón GE2 (tampón de eliminación de ADNg) y H2O libre de RNasa para obtener un volumen final de 60 pl. Se incubó a 37 °C durante 5 min y se colocó inmediatamente en hielo durante 2 min. Añadir 62 pl de la mezcla de transcriptasa inversa BC5 a cada muestra de ARN de 60 pl para obtener un volumen final de 102 pl. Incubar a 42°C durante exactamente 15 minutos y luego detener inmediatamente la reacción calentando a 95°C durante 5 minutos. La muestra está lista para la PCR.

Se utilizó RT-PCR para analizar los niveles de expresión de 84 genes relacionados con el estrés oxidativo en células HIEC-6 pretratadas con SPH a 25, 50 y 100 pg/ml durante 24 h, como se muestra en el Ejemplo 3. La expresión génica se comparó mediante valores Ct y los resultados se calcularon mediante el método a A Ct con normalización a los niveles medios de expresión de los cinco genes comunes (ACTB, B2M, GAPDH, HPRT y RPL13A).

A continuación se muestra la selección de la matriz de 96 pocillos de genes de prueba y geneshousekeeping.

ANTIOXIDANTES

Glutatión peroxidasas (GPx):

GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPX7, GSTP1, GSTZ1.

Por oxiredoxinas (TPx):

PRDX1, PRDX2, PRDX3, PRDX4, PRDX5, PRDX6.

Otras peroxidasas:

CAT, CYBB, CYGB, DU0X1, DU0X2, EPX, LPO, MGST3, MPO, PTGS1 (COXI), PTGS2 (COX2), PXDN, TPO, TTN.

Otros antioxidantes:

ALB, APOE, GSR, MT3, SOD1, SOD3, SRXN1, TXNRD1, TXNRD2, VIMP.

METABOLISMO DE LAS ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO (ROS)

Superóxido Dismutasas (SOD):

SOD1, SOD2, SOD3.

Otros genes del metabolismo del superóxido:

AL0X12, CCS, DU0X1, DU0X2, GTF2I, MT3, NCF1, NCF2, NOS2, N0X4, N0X5, PREXI, UCP2.

Otros genes del metabolismo de las especies reactivas del oxígeno (ROS):

A0X1, BNIP3, EPHX2, MPV17, SFTPD.

Genes sensibles al estrés oxidativo:

APOE, ATOX1, CAT, CCL5, CYGB, DHCR24, DU0X1, DU0X2, DUSP1, EPX, F0XM1, FT H1, GCLC, GCLM, GPX1, GPX2, GPX3, GPX4, GPX5, GPX6, GPX7, GSR, GSS, HM0X1, H SPA1A, KRT1, LPO, MBL2, MPO, MSRA, NQO1, NUDT1, OXR1, OXSR1, PDLIM1, PNKP, PRDX2, PRDX5, PRDX6, PRNP, RNF7, SCARA3, SEPPI, SIRT2, SOD1, SOD2, SQSTM1, S RXN1, STK25, TPO, TTN, TXN, TXNRD1, TXNRD2, VIMP

TRANSPORTADORES DE OXÍGENO CYGB, MB

Ejemplo 7

El hidrolizado de proteína de salmón en polvo (SPH) según la invención se probó en el siguiente experimento. Las células HIEC-6 (células epiteliales intestinales humanas) se adquirieron en el ATCC, EE.UU. El RNEasy Plus Micro Kit, el RNase-free DNase Set, el RT2 Easy First Strand Kit (generador de ADN) y la RT2 SYBR® Green fluor qPCR mastermix se adquirieron a Qiagen N.V., EE.UU.. Las matrices de PCR del perfilador RT2 de estrés oxidativo (84 genes protectores) se adquirieron a Qiagen N.V., EE.UU. A. Para la RT-PCR se utilizó el sistema de PCR iCycler de Bio-Rad Inc., EE.UU..

Las células HIEC-6 (ATCC CRL-3266) se propagaron en medio de suero reducido OptiMEM 1 (n° de catálogo 31985 de Gibco) con 20 mM de HEPES, 10 mM de GlutaMAX, 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico (EGF) y suero bovino fetal hasta una concentración final del 4%, en placas de Petri de 100 mm. Se utilizó una densidad celular de 1x105 células/cm2 para cultivar monocapas celulares y se aclimataron durante la noche a 37°C.

Las células HIEC-6 se cultivaron en placas de cultivo celular Nunc™ de 4 x 60 mm. Se preparó una suspensión madre de SPH 100 mM DMSO. Se prepararon otras diluciones de 25, 50 y 100 pM/ml de S<p>H. Todas las soluciones de dosificación contenían un 0,3% de DMSO, por debajo de la concentración máxima tolerada de DMSO del 0,8% para las células HIEC-6.

Se seleccionaron concentraciones de células en placa de 2,5 x105/ml para obtener una absorbancia DO dentro de la porción lineal de la curva de control para ambas líneas celulares. A continuación, se pretrataron seis placas de cultivo celular HIEC-6 durante 24 h con concentraciones de SPH de 25, 50 y 100 pg/mL (por duplicado) a 37°C. Una placa de cultivo celular para cada línea celular se pretrató durante 24 h con la solución en blanco DMSO a 37°C.

Se utilizó el RNeasy UCP Micro Kit para purificar el ARNm de las dos células tratadas con HGEPp. Tras descartar y lavar los tratamientos, las células se pelletearon por centrifugación durante 5 min a 1000 RPM en un tubo de centrífuga. Todo el sobrenadante se eliminó cuidadosamente por aspiración, asegurándose de que todo el medio celular se había eliminado completamente. Las células se disolvieron añadiendo 350 pl de tampón RULT con cuidado de desprender el sedimento celular del tubo, se agitaron en vórtex para mezclar bien y la mezcla se homogeneizó pasando el lisado 5 veces por una aguja de calibre 20 conectada a una jeringa sin RNasa. Se añadieron 350 pl de etanol al 70% al lisado y se mezcló de nuevo mediante pipeteo. Se transfirió la muestra, incluido cualquier precipitado que pudiera haberse formado, a una columna de centrifugación RNeasy UCP MinElute colocada en un tubo de recogida de 2 ml y se centrifugó durante 15 s a 10.000 rpm. Finalmente se eluyó con 16 pl de agua ultralimpia para obtener un eluido de ARN de 20 pl (4 pg).

Se añadió una muestra de ARN de cada uno de los siete tratamientos anteriores a 40 pl de tampón GE2 (tampón de eliminación de ADNg) y H2O libre de RNasa para obtener un volumen final de 60 pl. Se incubó a 37 °C durante 5 min y se colocó inmediatamente en hielo durante 2 min. Añadir 62 pl de la mezcla de transcriptasa inversa BC5 a cada muestra de ARN de 60 pl para obtener un volumen final de 102 pl. Incubar a 42°C durante exactamente 15 minutos y luego detener inmediatamente la reacción calentando a 95°C durante 5 minutos. La muestra está lista para la PCR. Se utilizó RT-PCR para analizar los niveles de expresión de 84 genes relacionados con el estrés oxidativo en células HIEC-6 pretratadas con SPH a 25, 50 y 100 pg/ml durante 24 h, como se muestra en el Ejemplo 3. La expresión génica se comparó mediante valores Ct y los resultados se calcularon mediante el método<a>A Ct con normalización a los niveles medios de expresión de los cinco genes comunes (ACTB, B2M, GAPDH, HPRT y RPL13A).

Ejemplo 8

Genes de estrés oxidativo no regulados

El tratamiento de células HGEPp con SPH mostró una regulación al alza con un cambio de pliegues superior a dos para dieciséis genes humanos relacionados con el estrés oxidativo - APOE, CYGB, EPX, FTHl, GCLC, GPX1, GSR, GSTZ1, HM0X1, MBL2, MSRA, NOS2, NQO1, PRDX5, SELS, SOD1, mientras que el tratamiento de las células HIEC-6 con SPH mostró una regulación al alza con un cambio de pliegues superior a dos para once genes humanos relacionados con el estrés oxidativo - APOE, EPX, FTH1, GCLC, GSS, HM0X1, MBL2, NOS2, NQO1, PRDX5, SOD1 a la concentración de 100 pM/ml de SPH (Tabla 1 y 2). Los tratamientos en blanco con DMSO no mostraron ningún cambio en la regulación de ningún gen del array. Diez genes mostraron un aumento común en ambas líneas celulares -APOE, EPX, FTH1, GCLC, HM0X1, MBL2, NOS2, NQO1, PRDX5, SOD1.

Tabla 1

Aumento de los genes relacionados con el estrés oxidativo en las células HGEPp tras el tratamiento con SPH

Tabla 2

Genes relacionados con el estrés oxidativo regulados al alza en células HIEC-6 tras el tratamiento con SPH

continuación

Genes de estrés oxidativo regulados a la baja

El tratamiento de células HGEPp con SPH mostró una regulación a la baja con un cambio de pliegues inferior al 50% para nueve genes humanos relacionados con el estrés oxidativo: ALOX12, EPHX2, MGST3, MPO, NCF1, NOX5, PRDX1, PTGS2, SRXN1, mientras que el tratamiento de las células HIEC-6 con SPH mostró una regulación a la baja con un cambio de pliegues inferior al 50% para siete genes humanos relacionados con el estrés oxidativo (ALOX12, MGST3, MPO, NCF1, N0X5, PTGS2, SRXN1) a la concentración de 100 pM/ml de SPH (Tablas 3 y 4). 4). Siete genes comunes mostraron una regulación a la baja en ambas líneas celulares: ALOX12, MGST3, MPO, NCF1, NOX5, PTGS2, SRXN1.

Tabla 3

Regulación a la baja de los genes relacionados con el estrés oxidativo en las células HGEPp tras el tratamiento con SPH.

Tabla 4

Regulación a la baja de los genes relacionados con el estrés oxidativo en las células HIEC-6 tras el tratamiento con SPH.

Genes de respuesta dependientes de la dosis

Además, dos genes regulados al alza, FTH1 y HM0X1 en las células HGEPp y tres genes regulados al alza, APOE, FTH1 y HM0X1 en las células HIEC-6 mostraron un resultado dependiente de la dosis en las dos dosis más bajas de 25 y 50 |jM/ml de tratamiento con SPH. El gen ALOX12 mostró una regulación a la baja dependiente de la dosis tanto en las células HGEP como en las HIEC-6 (Tabla 5). Ninguno de los otros genes mostró un cambio superior a dos veces en la regulación al alza ni un cambio inferior al 50% en la regulación a la baja, cuando la concentración de SPH se redujo a 50 y 25 jM/ml.

Tabla 5

Regulación génica dependiente de la dosis de SPH en células HGEP y HIEC-6

Ejemplo 9

El hierro es necesario para el crecimiento y la proliferación normal de las células. Sin embargo, un exceso de hierro es potencialmente perjudicial, ya que puede catalizar la formación de especies reactivas del oxígeno (ROS) tóxicas. Por ello, las células han desarrollado mecanismos altamente regulados para controlar los niveles de hierro intracelular. El principal de ellos es el secuestro del hierro. El gen FTH1 codifica la subunidad pesada de la ferritina, la principal proteína intracelular de almacenamiento de hierro en humanos, que secuestra el hierro libre en un estado soluble y no tóxico a partir de fuentes dietéticas de hierro. Estudios anteriores han demostrado que se produce un aumento de la síntesis de ambas subunidades de la ferritina cuando se expone al estrés oxidativo. La sobreexpresión de ferritina H o L redujo la acumulación de ROS en respuesta a un desafío oxidante.

El ejemplo 3 muestra que la regulación al alza de FTH1 no tiene por qué ser únicamente en respuesta a un desafío oxidante y puede ser inducida por péptidos activadores específicos que están presentes en el hidrolizado de proteína de salmón. Se ha demostrado que el aumento de FTH1 tiene un efecto protector en trastornos neurológicos como la enfermedad de Parkinson. (Rhodes, S.L., Ritz, B. (2008)Genetics of irnn regulation and the role of irnn in Parkinson's Disease Neurobiology of Disease,32(2), 183-195)

Ejemplo 10

La expresión del gen HM0X1 es inducida por el estrés oxidativo y parece conferir citoprotección. La enzima HO1 resultante cataliza la degradación del hemo, que produce biliverdina, hierro ferroso y monóxido de carbono. Divide el anillo hemo en el puente alfa-metileno para formar biliverdina, que es convertida en bilirrubina por la biliverdina reductasa. También se ha demostrado que el monóxido de carbono liberado por las reacciones de la hemo oxigenasa influye en el tono vascular y en la función de la óxido nítrico sintasa.

El aumento de HM0X1 observado en la presente invención en el Ejemplo 3 muestra que el hidrolizado de proteína de salmón, cuando se administra por vía enteral, tiene la capacidad de reducir el daño en el tracto gastrointestinal y utilizarse para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal neonatal, enterocolitis necrotizante (ECN). Se ha demostrado que la deficiencia de HO-1 conduce a un mayor desarrollo de ECN, mientras que la inducción de HO-1 aumentó las proporciones Treg/Teff y evitó el desarrollo de ECN en modelos animales [Schulz, S., Chisholm, K.M.,, Zhao, H., Kalish, F., Yang, Y., Wong, R.J., Stevenson, D.K. (2015)Heme oxygenase-1 confers protection and alters T-cell populations in a mouse model of neonatal intestinal inflammation. Pediatr Res.77(5), 640-648].

Los estudios también han indicado que la capacidad de regular al alza la expresión de HO-1, como muestra el hidrolizado de proteína de salmón del ejemplo 3, es un factor protector importante en muchas enfermedades, como las cardiovasculares, el trasplante renal y la enterocolitis necrotizante [Otterbein, L.E., Soares, M.P., Yamashita, K., Bach, F.H. (2003)Heme oxygenase-1: unleashing the protective properties of heme. Trends in Immunology24(8), 449 455].

Ejemplo 11

El síndrome metabólico es un término que se utiliza cuando se da la agrupación de al menos tres de las cinco afecciones médicas siguientes: obesidad abdominal (central), tensión arterial elevada, glucosa plasmática en ayunas elevada (o diabetes manifiesta), triglicéridos séricos elevados y niveles bajos de lipoproteínas de alta densidad (HDL).

La ALOX12, una enzima de tipo lipoxigenasa, está codificada por el gen ALOX12 y se caracteriza por su capacidad para metabolizar el AA en 15(S)-HETE, un agente de señalización autocrino y paracrino de tipo hormonal, implicado en la respuesta inflamatoria y el síndrome metabólico. Los niveles elevados de ALOX12 se han implicado en la diabetes tipo 1, en las células grasas del tejido adiposo blanco de pacientes diabéticos obesos y en la producción excesiva de especies reactivas del oxígeno y la inflamación [Kuhn, H., Banthiya, S., van Leyen, K. (2015,)Mammalian lipoxygenases and their biological relevance.

Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biología Molecular y Celular de los Lípidos.1851(4), 308- 330], la regulación a la baja de ALOX12 y su(s) metabolito(s) mediante SPH, como se observa en el Ejemplo 3, puede utilizarse para contribuir al retraso de la obesidad, la diabetes, la hipertensión y/o el síndrome metabólico.

En consecuencia, se puede observar que un hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la presente invención que comprende aminoácidos, péptidos, oligopéptidos exhibe una regulación ascendente significativa de varios genes protectores de la oxidación, en particular el gen FTH1 y HM0X1 y una regulación descendente de varios genes proinflamatorios, en particular el gen ALOX12, cuyos efectos combinados se sabe que confieren protección frente al daño oxidativo y cuando el hidrolizado de proteína de pescado de dicha invención se administra como una formulación oral, proporcionará protección frente a trastornos gastrointestinales y del sistema nervioso central como el síndrome del intestino irritable, la colitis, la enfermedad de Parkinson y el Alzheimer.

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un proceso de hidrólisis enzimática para producir un hidrolizado de proteína de pescado en polvo, que comprende las etapas consecutivas de:

i) mezclar subproductos triturados de material proteínico de pescado con agua y calentar;

ii) añadir enzima endopeptidasa a la mezcla de i) y agitar;

iii) añadir enzima exopeptidasa en forma de carboxipeptidasa a la mezcla de ii) y agitar;

iv) detener la hidrólisis enzimática mediante inactivación por calor;

v) la fracción de hidrolizado de pescado y el material sólido restante se separan por filtración; y

vi) concentrar y secar la fracción de hidrolizado de pescado para obtener un hidrolizado de proteínas de pescado en polvo.

2. Proceso según la reivindicación 1, en donde dicho proceso comprende además una tercera etapa de hidrólisis consistente en añadir enzima proteasa derivada deaspergillus oryzaea la mezcla de iii) y agitar.

3. Proceso según la reivindicación 1, en donde el material proteínico de pescado procede de peces, preferiblemente un salmonoide, más preferiblementesalmo salar.

4. Proceso según la reivindicación 1, en donde la endopeptidasa se selecciona del grupo que consiste en pepsina o tripsina, o cualquier combinación de las mismas.

5. Hidrolizado de proteína de pescado en polvo obtenible por el proceso según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Composición que comprende el hidrolizado de proteína de pescado en polvo según la reivindicación 5, junto con al menos un portador o excipiente farmacológicamente aceptable para su uso como medicamento.