ES2896935T3 - Nuevas plantas de pepino con un hábito de crecimiento compacto - Google Patents

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Abstract

Planta de pepino del tipo de pepino largo que comprende el gen compacto obtenible a partir de semillas depositadas bajo el número NCIMB 41266 en forma heterocigota, cuya planta de pepino -debido a la expresión de este gen compacto- se diferencia del tipo de planta de pepino largo que carece del gen compacto, por presentar una combinación de las siguientes características fenotípicas: brotes laterales más cortos, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas, flores más pequeñas y frutos más cortos, y en la que el gen compacto está flanqueado por el marcador AFLP E14/M61_M873.6, amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 8, y el marcador AFLP E19/M50_M280.2, amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 9.

Description

DESCRIPCIÓN
Nuevas plantas de pepino con un hábito de crecimiento compacto
Campo de la invención
La presente invención se refiere a la modificación del genoma del pepino, que llega a expresarse como una nueva característica de las plantas de pepino, especialmente de Cucumis sativus spp. sativus, más particularmente del tipo de pepino largo, y sobre todo del pepino holandés, que comprende el gen compacto tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. Las plantas de acuerdo con la invención son preferentemente indeterminadas, en lugar de determinadas, y no son de tipos enanos. Este nuevo tipo de planta necesita menos mano de obra en la producción de pepinos, a la vez que proporciona más frutos por planta. En una de las realizaciones de la invención se puede obtener una mayor densidad de plantas en el cultivo del pepino. Las plantas de acuerdo con la invención son muy adecuadas para el sistema de cultivo en altura, que está ganando terreno en el cultivo estándar del pepino (Boonekamp, 2006; Honkoop, 2006). El tipo más compacto y abierto de las plantas de pepino de acuerdo con la invención es una gran ventaja en el cultivo en altura y/o la cosecha mecánica de la fruta. En una realización específica de la presente invención, las nuevas plantas de pepino compacto tienen, en comparación con el tipo habitual de pepino largo (tal como las variedades de referencia Korinda o Sabrina), entrenudos más cortos (y una longitud de tallo más corta por cada 15 entrenudos), brotes laterales más cortos, hojas más pequeñas y oscuras que permanecen verdes durante más tiempo, hojas menos "abultadas" (más planas), flores más pequeñas, una orientación más horizontal de las hojas, frutos más cortos y, sobre todo, una tasa de crecimiento más lenta. Esta nueva combinación de características es muy valiosa para el desarrollo de variedades comerciales de pepino, especialmente de pepinos largos e indeterminados. Estas características son estadísticamente diferentes del tipo de pepino largo normal en las plantas de pepino heterocigotas y homocigotas para el gen que confiere las características, denominado en el presente documento "gen compacto". Estas características se deben a la expresión de un único locus genético, con una herencia intermedia monogénica, es decir, las características son más pronunciadas en la planta homocigótica que en la heterocigótica, donde dan un fenotipo "intermedio". Este locus genético puede demostrarse y controlarse con la ayuda de marcadores AFLP de flanqueo en la descendencia obtenida al hibridar una planta de pepino que comprende este locus genético con una planta de tipo pepino corto o de tipo pepinillo que no contiene este locus genético, y el locus genético en cuestión puede introducirse por hibridación, en toda planta que pueda hibridarse con una planta de pepino de acuerdo con la presente invención, opcionalmente tras el rescate de embriones y/o el uso de otros procedimientos empleados para obtener híbridos con estas especies o especies afines, tal como las plantas de la especie Cucumis sativus . Así, tanto la selección fenotípica (de las características conferidas por el gen compacto) como la selección con marcadores moleculares pueden utilizarse para detectar y/o transferir el gen compacto a las plantas de la especie Cucumis sativus y para generar plantas con un fenotipo compacto homocigótico o heterocigótico (intermedio). El gen puede introducirse en cualquier variedad o línea de cultivo de pepino, en una realización especialmente en variedades o líneas de pepino largo, y su expresión puede así cambiar el fenotipo de la variedad/línea de una planta cerrada de crecimiento rápido a una planta de crecimiento lento que tenga las características compactas conferidas por el gen. Este gen, por lo tanto, abre la posibilidad de cultivar variedades de pepino largo en cultivos de altura, reduciendo el coste y la mano de obra, y aumentando la densidad de plantas y el rendimiento de los frutos. Las plantas de pepino de acuerdo con la invención son preferentemente indeterminadas, ya que así los frutos pueden cosecharse durante un largo período.
Comparación con la técnica anterior
La planta habitual de pepino cultivada (Cucumis sativus L.) se ha desarrollado a partir de la planta original de pepinillo/ pepino silvestre mediante el fitomejoramiento y es fenotípicamente idéntica de manera esencial a esta última. El fitomejoramiento ha producido el tipo de pepino común, que sólo tiene flores femeninas. El fruto del pepino crece sin ningún tipo de polinización o fertilización, por lo que es partenocárpico. Los frutos del pepino común, destinados a ser utilizados por el consumidor como verdura, sólo contienen algunas semillas finas y sueltas. Los pepinillos, los pepinos largos, los pepinos cortos, los minipepinos, los pepinos snack, los pepinos Beith Alpha y los pepinos de corte pertenecen a la especie Cucumis sativus. Los calabacines, melones, calabazas y patissons (calabacines de crema) pertenecen a la familia de las plantas tipo pepino o Cucurbitaceae, junto con el propio pepino. La mayoría de las variedades actuales de pepino son híbridos (F1), obtenidos por el cruce de dos líneas parentales genéticamente diferentes.
El cultivo del pepino es una operación agrícola muy intensiva que requiere mucho cuidado y trabajo si se quiere obtener el mejor rendimiento. En los Países Bajos, Canadá y los países limítrofes se cultiva durante todo el año, principalmente en invernaderos. Para garantizar un alto rendimiento de la fruta, las hojas sobrantes deben eliminarse a tiempo, para que no se pierda energía en el crecimiento vegetativo superfluo, y la planta se mantenga lo suficientemente abierta para facilitar el trabajo en esta. Además, una planta abierta mejora la calidad de la fruta. Sin embargo, hay que mantener un número suficiente de hojas para garantizar una fotosíntesis, una evaporación y una respiración óptimas en la planta.
El tipo habitual de planta de pepino que produce el tipo habitual de pepino largo presenta pocas variaciones en sus características, concretamente en la tasa de crecimiento, la longitud de los brotes laterales, el tamaño de las hojas, el color de las hojas, la retención del color verde por las hojas, la longitud internodal, el tamaño de las flores, la longitud de los frutos y su tasa de crecimiento. En la Tabla 1 se indican las características típicas de las plantas, las hojas, las flores y los frutos en el invernadero, aquí para el cultivar Korinda, del tipo de pepino largo.
En el procedimiento habitual (tradicional) utilizado actualmente para el cultivo de pepinos en invernaderos, el tallo principal de la planta se conduce hasta un alambre de hierro horizontal que se suspende a una altura de unos dos metros sobre el suelo. Cuando la planta alcanza esta altura y se adhiere al alambre, se "remata" eliminando su punto de crecimiento para poner fin a la proliferación, con lo que comienzan a desarrollarse los brotes laterales. Estos brotes laterales se dejan crecer hacia abajo hasta una altura de aproximadamente 1 metro por encima del suelo, y luego se les quitan los puntos de crecimiento. A continuación, se produce la floración y el desarrollo de los frutos tanto en el tallo como en los brotes laterales o zarcillos, pero los frutos de los zarcillos se desarrollan más tarde que los del tallo. Los frutos se recolectan aproximadamente 6 semanas después de la siembra. Esto se conoce como el procedimiento tradicional de cultivo.
Durante el período de cultivo, las plantas necesitan un cuidado intensivo en forma de fertilización correcta, riego, control climático, control de enfermedades y eliminación de las hojas sobrantes, amarillas o muertas, para asegurar el mejor rendimiento y una alta calidad del producto. Las condiciones de crecimiento de las plantas están, por tanto, totalmente controladas, lo que reduce el impacto de los factores ambientales en el fenotipo de la planta. Debido a este intenso trabajo y a los costosos invernaderos utilizados, se trata de un procedimiento de cultivo relativamente costoso. Por lo tanto, se buscan constantemente formas de reducir el trabajo y aumentar y acelerar la producción de pepinos de manera que se mantenga o incluso se mejore la calidad de la fruta. En un intento, por ejemplo, no se permite el crecimiento de zarcillos laterales y toda la cosecha procede del tallo. Este enfoque, denominado cultivo en altura, requiere menos trabajo y proporciona un mayor rendimiento de productos cualitativamente mejores. Sin embargo, las variedades actuales no son muy adecuadas para este procedimiento, porque crecen demasiado, debido a su rápido crecimiento y a sus largos entrenudos. El carácter compacto de las plantas descritas en el presente documento permite desarrollar plantas o variedades de pepino más adecuadas para este tipo de nuevos cultivos. Otro avance se refiere al uso de robots recolectores, tal como los ya existentes ideados por el Green Vision Service at the University and Research Centre de Wageningen, en los Países Bajos (véase http://www.greenvision.wur.nl/). Dado que las nuevas plantas compactas de acuerdo con la invención tienen hojas horizontales más pequeñas, sus frutos son más visibles y fáciles de recoger por estos robots que en el caso del tipo de planta habitual, lo que aumenta considerablemente el rendimiento cuando se utiliza un robot recolector.
Además, los pepinos que comprenden el gen compacto de acuerdo con la invención en la forma heterocigótica (que tiene un fenotipo compacto intermedio), pueden plantarse con una mayor densidad de tallos, ya sea teniendo más plantas por m2 al principio, o permitiendo posteriormente que se desarrollen más tallos durante el cultivo, como es bien conocido en el campo de la producción de pepinos. En el cultivo en altura de pepinos largos en los Países Bajos, es posible una densidad de tallos de alrededor de 2,6-2,8 plantas por m2en condiciones ideales, en comparación con una densidad de tallos de aproximadamente 2,2 plantas (o tallos) por m2 en el cultivo en altura actual de pepinos largos en los Países Bajos bajo condiciones ideales. Así, en una realización de la invención, las plantas de pepino de acuerdo con la invención, tal como se establece en la reivindicación 1 o 2, se cultivan a una densidad de tallos de más de 2,2 plantas (o tallos) por m2, preferentemente de aproximadamente 2,6-2,8 tallos por m2. En una forma de la invención, al menos aproximadamente 20 %, preferentemente al menos aproximadamente 22 %, 23 % o 24 % más de tallos por m2 pueden ser utilizados en el cultivo en altura en el caso de las plantas más compactas (en comparación con el pepino tradicional que carece del gen compacto de acuerdo con la invención, tal como Korinda o Sabrina), tal como las plantas que son heterocigotas para el gen compacto de acuerdo con la invención.
En la técnica anterior, se cultiva al aire libre un tipo de pepinillo (pepino para encurtir) que tiene hojas pequeñas con un mayor número de brotes laterales por planta (ramificación múltiple), habiendo sido identificada esta planta en Arkansas y designada como H-19 o Arkansas Little Leaf (Protección de variedades vegetales de EE. UU. No.
8900073). Se ha establecido que el fenotipo de las hojas más pequeñas de estas plantas de pepinillos cortos se debe a un único gen recesivo (Wehner et a/., 1987; Goode et a/., 1980). Este fenotipo no está disponible para el cultivo del pepino largo habitual, tal como el pepino largo holandés. Al tratarse aquí de un gen recesivo, no son posibles formas intermedias de este fenotipo, a diferencia de lo que ocurre con las plantas de acuerdo con la presente invención. Se ha comprobado que la calidad de los frutos de estos pepinos de hoja pequeña es inferior a la de las líneas ensayadas, que tenían hojas normales (Schultheis et a/., 1998). Además, las plantas de acuerdo con la invención no son de ramificación múltiple como se ve en la Hoja Pequeña.
También se han descrito en la técnica anterior las llamadas plantas de pepino "compactas", que comprenden la mutación cp o cp2 (Kauffman y Lower, 1976 y Kubicki et al., 1986). A pesar del mismo nombre, estas dos mutaciones genéticas se encuentran en diferentes loci del genoma que el presente gen compacto y expresan características diferentes que el gen compacto de la presente invención. En contraste con el presente gen compacto, que es monogénico intermedio (expresando un fenotipo compacto cuando es homocigoto pero un fenotipo compacto intermedio cuando es heterocigoto véase la Tabla 1, tipo de planta heterocigoto), cp y cp2 son homocigotos recesivos, expresando entrenudos más cortos sólo cuando están presentes dos copias del alelo mutante y teniendo un fenotipo "normal" cuando el alelo mutante está en forma heterocigoto. Los heterocigotos del gen compacto de la presente invención son, por tanto, fenotípicamente muy diferentes de los heterocigotos de cp o cp2: los heterocigotos de cp o cp2 muestran un fenotipo normal (no compacto o de tipo silvestre). Se ha descrito que el mutante cp2 produce "formas intermedias", pero sólo cuando es homocigoto (cp2/cp2) y sólo en interacción con otra mutación llamada bu (bushy). Además, al comparar las características de las plantas compactas homocigotas y las plantas cp o cp2 homocigotas, éstas difieren en sus características fenotípicas. Las plantas homocigóticas cp2/cp2 tienen una longitud de cepa principal menor que 50 cm (15-35 cm), y representan, por tanto, tipos enanos, no aptos para el cultivo tradicional o en altura, que necesita tallos mucho más largos (preferentemente más de 100 cm a los 50 días de la siembra, bajo condiciones estándar de invernadero de verano holandés para la producción continua de fruta. Las plantas homocigóticas cp/cp son plantas "extremadamente enanas" (que tiene una longitud de tallo menor que 35 cm), que tampoco son aptas para el cultivo tradicional o en altura. La mutación cp también está asociada a efectos negativos, tal como la reducción de la calidad de la fruta (color más claro, fruta algo más pequeña, cavidades de la semilla más grandes que los cultivares comerciales aceptables que carecen de la mutación cp (véase Kauffman y Lower, 1976, página 151, último párrafo).
Las condiciones estándar de los invernaderos de verano holandeses, o las condiciones de los invernaderos de verano holandeses, son las que utilizan habitualmente los criadores de pepinos holandeses en verano. Evidentemente, estas condiciones pueden variar de acuerdo con las preferencias del criador, de las inversiones realizadas, de los recursos disponibles, etc., pero dichas variaciones no afectan a las características genéticas compactas, que siempre se identificarán claramente mediante los procedimientos y/o marcadores descritos en el presente documento. En una realización de la invención, las condiciones estándar de los invernaderos de verano holandeses, tal y como se utilizan en el presente documento, son:
Tras la siembra (el 4 de julio) en vermiculita a 28 °C, las plantas se trasplantan en bloques de lana de roca en un vivero con 13-17 plts/m2 habituales, con una temperatura de aproximadamente 21 °C.
Aproximadamente 21-23 días después de la siembra, los bloques se plantan en un invernadero holandés sobre placas de lana de roca, donde se añaden agua y nutrientes por goteo. La EC del agua es de aproximadamente 2,0 (mS/m) con un pH de aproximadamente 5,5. Dependiendo de las condiciones meteorológicas, la EC puede aumentar hasta 3,0. En los Países Bajos, estas condiciones pueden variar de un cultivador a otro. La temperatura en el invernadero se fija preferentemente en una temperatura de aproximadamente 21 °C durante el día y de 18-18,5°C durante la noche. Debido a la mayor radiación, la temperatura puede aumentar, pero preferentemente no más de 28 °C (por ventilación, por refrigeración por agua en el cristal del techo o por sombreado con pantallas). La densidad de plantas es preferentemente de 1,4 plantas/m2.
Las plantas se enrollan alrededor de un manto vertical a un cable horizontal a aproximadamente 2,0-2,2 m de altura. Allí se rematan las plantas y crecerán 2 laterales desde la parte superior hacia abajo. De forma estándar, se eliminan todos los laterales del tronco principal, excepto los últimos 2 o 3 laterales.
Las primeras 4-5 axilas estarán libres de frutos. En las siguientes axilas preferentemente 1 fruto se seguirá desarrollando hasta llegar a un fruto maduro. En la parte superior de la planta, justo debajo del alambre, a veces los cultivadores mantienen hasta 3 nodos con 2 frutos en la axila.
Después de cosechar frutos maduros de aproximadamente 400-450 gramos en el tallo principal, los cultivadores siguen cosechando frutos en los brotes laterales.
Bajo las condiciones mencionadas, las plantas empezarán a producir a los 16-19 días de su trasplante en el invernadero sobre las placas.
Si el gen compacto es el mismo que otro gen que confiere la misma pluralidad de características (que es poco probable que exista) puede establecerse comprobando el alelismo del rasgo. Por ejemplo, se cruzan dos plantas fenotípicamente similares o idénticas (por ejemplo, una con el gen compacto y otra en la que se va a comprobar la presencia del gen compacto) y se analiza la progenie F1 y/o F2 para comprobar la segregación de las características. Alternativamente, la herencia del gen que se va a probar se determina observando la progenie y determinando la segregación mendeliana del fenotipo. Un gen que se hereda de forma recesiva no puede ser lo mismo que un gen que se hereda de forma intermedia o un gen con herencia dominante.
Se observa que ninguna de las plantas de pepino definidas en la reivindicación 1 o 2 son plantas "enanas" (que no serían adecuadas para el cultivo tradicional o en altura), sino que son plantas que siguen siendo altas en comparación con la misma planta que carece del gen compacto de acuerdo con la invención, es decir, las plantas compactas de acuerdo con la invención son mucho más altas que las plantas "enanas". "Las plantas "enanas", tal y como se utilizan en el presente documento, se definen como aquellas que tienen un tallo principal menor que 50 cm durante todo su ciclo de vida y, por lo tanto, también a los 50 días de la siembra bajo condiciones normales de crecimiento. Kauffman y Lower (1979, líneas 2-5) afirman que las plantas compactas determinadas miden 12 cm o menos a las 8 semanas. Por el contrario, las plantas de acuerdo con la invención no son plantas "enanas" y comprenden una longitud de tallo mayor que 50 cm, preferentemente mayor que 70 cm, 80 cm, 90 cm o 100 cm a los 50 días de la siembra, cuando se cultivan bajo condiciones de invernadero estándar, tal como las condiciones de invernadero de verano holandés. La altura también puede medirse y compararse a los 15 entrenudos cuando se cultivan bajo las mismas condiciones (por ejemplo, las condiciones de invernadero de verano holandés descritas en los Ejemplos), por lo que las plantas de acuerdo con la invención son mucho más altas que las plantas cp o cp2 y comprenden una longitud de tallo a los 15 entrenudos (medida desde el sustrato) de más de 50 cm, preferentemente mayor que 80, 90 o 100 cm. Véase también la Tabla 1, en la que los valores medios de la longitud del tallo a los 15 entrenudos para las plantas de pepino fueron: 147 cm para las plantas de pepino normales, 126 cm para las plantas compactas heterocigotas y 109 cm para las plantas compactas homocigotas (74 % del valor de las plantas normales).
Sumario
La presente invención se refiere a plantas de pepino del tipo de pepino largo que comprenden el gen compacto tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas en su genoma en forma heterocigota, en cuyo caso la expresión de este gen compacto (heterocigota) asegura que estas plantas se diferencian del tipo habitual de plantas de pepino, tal como el tipo habitual de pepino largo (por ejemplo, el cultivar Korinda o Sabrina), al mostrar una combinación de las siguientes características fenotípicas cuando se cultivan bajo las mismas condiciones (por ejemplo, condiciones de invernadero de verano holandés): brotes laterales más cortos, entrenudos más pequeños, hojas más pequeñas, flores más pequeñas, frutos más cortos y, sobre todo, una tasa de crecimiento más lenta, brotes laterales más cortos, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas y quebradizas, hojas de color verde más oscuro y menos "abultadas" (menos tuberculadas), un follaje más horizontal, flores más pequeñas y frutos más cortos que pesan menos (véase también la Tabla 1). Estas plantas con el gen compacto son del tipo de pepino largo, tal como las plantas híbridas de pepino largo que comprenden el gen compacto en forma heterocigota. Dicho híbrido se produce, por ejemplo, cruzando dos líneas parentales preferentemente homocigóticas, por ejemplo, una línea o variedad de pepino largo normal (que carece del gen compacto) con una planta que comprende el gen compacto en forma homocigótica. El gen compacto también puede introducirse en plantas que carecen del gen compacto cruzando dicha planta con una planta que tenga el gen compacto en forma heterocigótica y seleccionando la progenie híbrida que comprende el gen compacto (utilizando la selección fenotípica y/o de marcadores como se describe en el presente documento). Véase también la Tabla 1 para las diferencias fenotípicas medias entre el pepino normal (tipo largo), las plantas compactas heterocigotas y las compactas homocigotas.
Una forma descrita en el presente documento se refiere a una de las plantas de pepino mencionadas anteriormente en la que el gen compacto imparte las siguientes características: a) en el caso de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto, el área del limbo de la décima hoja verdadera 39 o 35 días después de la siembra es como máximo el 50 %, preferentemente como máximo el 40 %, del área del limbo de las plantas de pepino del tipo habitual de pepino (por ejemplo cultivar Korinda) 39 o 35 días después de la siembra, b) en el caso de plantas con el gen compacto en estado homocigoto, la anchura máxima de los pétalos 39 o 45 días después de la siembra es como máximo el 75 %, preferentemente como máximo el 70 %, de la anchura máxima de los pétalos del tipo habitual de pepino 39 o 45 días después de la siembra, c) en el caso de plantas con el gen compacto en estado homocigoto, la longitud de los brotes laterales 56 días después de la siembra es como máximo el 60 %, d) en el caso de las plantas con el gen compacto en estado homocigoto, el número de entrenudos de los brotes laterales 56 días después de la siembra es como máximo el 70 %, preferentemente como máximo el 60 %, del número de entrenudos de los brotes laterales 56 días después de la siembra del tipo habitual de plantas de pepino.
Una forma descrita en el presente documento se refiere a una de las plantas de pepino mencionadas anteriormente en la que el gen compacto imparte las siguientes características: a) en el caso de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto, la longitud del tallo a los 15 entrenudos (por ejemplo, aproximadamente 56 días después de la siembra) es como máximo el 85 %, preferentemente como máximo el 80 % o el 75 %, de la longitud del tallo de las plantas de pepino del tipo habitual de pepino (por ejemplo, cultivar Korinda) (por ejemplo, 56 días después de la siembra), b) en el caso de plantas con el gen compacto en estado homocigoto, la anchura de la hoja (por ejemplo, 35 días después de la siembra) es como máximo 70 %, preferentemente como máximo el 60 %, de la anchura de la hoja del tipo habitual de pepino (por ejemplo 35 días después de la siembra) y c) en el caso de plantas con el gen compacto en estado homocigoto, la longitud de la hoja (por ejemplo, 35 días después de la siembra) es como máximo el 75 %, preferentemente como máximo el 70 % o el 65 %, de la longitud de la hoja del tipo habitual de pepino (por ejemplo, 35 días después de la siembra).
En una realización de la invención, se proporcionan plantas de pepino de tipo largo que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica y comprenden la siguiente combinación (complejo) de características compactas (con base en valores medios de al menos aproximadamente 10 o más plantas y comparadas con plantas de control cultivadas al mismo tiempo bajo las mismas condiciones): la longitud media del tallo desde el sustrato hasta el 15vo entrenudo es igual o menor que 95 %, preferentemente igual o menor que 90 % o 88 % de la longitud media del tallo de una planta de pepino normal (por ejemplo, larga) que carece del gen compacto; la longitud media del entrenudo es igual o menor que 90 %, más preferentemente igual o menor que 85 % de la longitud media del entrenudo de una planta de pepino normal (por ejemplo, larga) que carece del gen compacto; la longitud media de los entrenudos es igual o menor que 90 %, más preferentemente igual o menor que 85 % de la longitud media de los entrenudos de una planta de pepino normal (por ejemplo, largo) que carece del gen compacto; la longitud media de las hojas es igual o menor que 95 %, preferentemente el 93 % o el 91 % de la planta de pepino normal (por ejemplo, larga); la longitud media de la hoja es igual o menor que 95 %, preferentemente 88 o 87 % de la planta de pepino normal (por ejemplo, largo) que carece del gen compacto; área media del limbo es igual o menor que 90 %, preferentemente el 85 o el 80 % de la planta de pepino normal (por ejemplo, larga) que carece del gen compacto. Además de lo anterior, las plantas de acuerdo con la invención que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica pueden comprender las siguientes características: la orientación de las hojas es más horizontal que en el tipo de pepino normal (por ejemplo, largo), teniendo una puntuación de al menos 4, preferentemente 4,5 o más en una escala de 1-9, siendo 1 colgando verticalmente y 9 horizontal; el color de la hoja es más oscuro que en el tipo de pepino normal (por ejemplo, largo), teniendo una puntuación de al menos 5, preferentemente al menos 6, 6,5 o 7 en una escala del 1-9, siendo 1 claro y 9 verde oscuro; el color de la hoja también puede determinarse midiendo el contenido de clorofila como se describe en los ejemplos (el contenido medio de clorofila de las hojas obtenidas de una planta que tiene el gen compacto en forma heterocigótica es mayor que en el tipo de pepino normal y tiene una concentración de 3.000 (tres mil) pg/gramo o más utilizando la extracción de etanol como se describe en los ejemplos, es decir, una concentración de al menos 105 %, preferentemente al menos 108 %, 110 %, más preferentemente al menos 115 %, 120 % o 130 % de la concentración de clorofila de hojas de la misma edad y cultivadas en las mismas condiciones pero sin el gen compacto); las flores son más pequeñas, en el sentido de que la longitud de los pétalos es igual o menor que 85 %, preferentemente al 82 %, más preferentemente al 80 % de los pétalos del tipo de pepino normal (por ejemplo, largo) que carece del gen compacto y el ancho del pétalo es igual o menor que 80 %, preferentemente el 75 %, el 74 % o el 70 % del ancho del pétalo del tipo pepino normal (por ejemplo, largo ); la longitud de la fruta también se reduce en comparación con el tipo de pepino normal (p. ej., largo), que tiene una longitud igual o menor que 95 %, preferentemente 90 %, más preferentemente 89 % del fruto de pepino normal (por ejemplo, largo) que carece del gen compacto.
También se proporcionan aquí semillas, frutos cosechados y partes de plantas (cultivos de células o tejidos, polen, flores, etc.) de dichas plantas. En una realización, las plantas con las características compactas intermedias mencionadas anteriormente se obtienen a partir de semillas depositadas bajo el número de acceso 41266 del NCIMB (pepino de tipo largo, homocigoto para el gen compacto), cruzando una planta cultivada a partir de dichas semillas (o una planta derivada de estas, por ejemplo, mediante autofecundación) con una planta de pepino de tipo largo que carece del gen compacto y recogiendo las semillas híbridas de dicho cruce. Se entiende que se pueden realizar muchos cruces y/o autofecundaciones diferentes para introducir el gen compacto en forma heterocigota en una planta de pepino de tipo largo para generar un híbrido que comprenda el gen compacto en forma heterocigota y que tenga un fenotipo "compacto intermedio" y buenas características agronómicas. Cualquier híbrido de este tipo queda englobado en el presente documento. La selección de los híbridos que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica puede realizarse fenotípicamente (con base en las características fenotípicas compactas) y/o utilizando marcadores moleculares, tales como los marcadores AFLP descritos en el presente documento o derivados de los marcadores descritos u otros marcadores AFLP polimórficos entre una planta de pepino que carece del gen compacto y una planta de pepino que comprende el gen compacto, que están vinculados al gen compacto. Los marcadores AFLP divulgados en la presente solicitud no son polimórficos en los tipos de pepino largo, de modo que la selección de un tipo de pepino largo que comprenda el gen compacto en forma heterocigota implica cruzar dicha planta (o una planta que se sospecha que es heterocigota) con un pepino corto o un pepinillo (ambos carentes del gen compacto) y analizar la progenie de dicho cruce (por ejemplo, la generación F1 y/o f2) con uno o más marcadores AFLP vinculados al locus compacto y/o marcadores derivados de éstos. Este análisis puede utilizarse para verificar que el gen compacto está presente en forma heterocigótica en el pepino largo utilizado como padre en el cruce con el pepino corto o pepinillo.
Un marcador "derivado" de un marcador AFLP es un marcador molecular que sigue acoplado al locus genético compacto y que se encuentra en una región de flanqueo dentro de 5 kb, preferentemente dentro de 4, 3, 2, 1, 0,5 kb, o menos, del marcador AFLP original o dentro de la propia secuencia del marcador AFLP original. Así, se puede desarrollar un marcador derivado utilizando el marcador AFLP original y/o la secuencia del marcador AFLP original. Por ejemplo, el marcador AFLP puede secuenciarse (por ejemplo, la banda del marcador de ADN puede obtenerse del gel y secuenciarse) y puede identificarse un polimorfismo con la secuencia del marcador AFLP o flanqueando la secuencia del marcador AFLP a ambos lados (por ejemplo, dentro de aproximadamente 1, 2, 3, 4 o 5 kb de la secuencia original del marcador AFLP). El polimorfismo así identificado se detecta entonces mediante un ensayo de detección molecular. Por ejemplo, un marcador AFLP puede secuenciarse y convertirse en un marcador CAPS (secuencia polimórfica amplificada escindida), detectable en un ensayo CAPS, cuyas técnicas son bien conocidas en la técnica (Véase Akopyanz et al., Nucleic Acid Research, 20:6221-6225 (1992) y Konieczny & Ausubel, The Plant Journal, 4:403-410 (1993)) o en un marcador indel (inserción/deleción). Un ensayo CAPS implica la amplificación del locus marcador por PCR seguida de la digestión con enzimas de restricción. Un marcador AFLP también puede convertirse en un marcador STS o en un marcador/ensayo SNP utilizando procedimientos conocidos en la técnica, o en cualquier otro marcador molecular derivado. Siempre que se haga referencia a los marcadores AFLP en el presente documento, se entiende que los marcadores derivados de los mismos están incluidos como una realización, incluso si los marcadores derivados no se mencionan explícitamente.
En una forma de la invención, se proporciona una planta de pepino del tipo de pepino largo en la que -debido a la presencia heterocigótica del gen compacto- la progenie obtenida por autopolinización tiene una población segregada con una proporción de aproximadamente 1:21 entre las plantas del tipo habitual de pepino largo que carecen del gen compacto, las plantas del tipo heterocigoto (compacto intermedio) y las plantas de crecimiento compacto que son homocigotas para el gen compacto, o una población que se divide en aproximadamente el 50 % de plantas del tipo habitual de pepino que carecen del gen compacto y aproximadamente el 50 % de plantas de crecimiento compacto que son homocigotas para el gen compacto, tras la producción de haploides dobles de la planta que es heterocigota para el gen compacto. La invención también se refiere a las plantas anteriores en las que las características fenotípicas del gen compacto tienen una herencia intermedia monogénica.
Como se ha mencionado anteriormente, la invención también abarca plantas de pepino heterocigotas (por híbridas) del tipo de pepino largo que comprenden el gen compacto tal como se establece en la reivindicación 1, en las que la presencia del gen compacto puede demostrarse cruzando estas plantas con plantas de pepinillo o de pepino corto y analizando las plantas F1 resultantes (y/o las plantas F2) con la ayuda del procedimiento AFLP y mediante el uso de al menos marcadores AFLP, que flanquean el gen compacto, especialmente los marcadores AFLp E14/M61_M873.6 y E19/M50_M280.2, en los que la población F2 segregante obtenida de las plantas F1 autógamas, en las que se ha demostrado que el gen compacto presenta una cosegregación de las características compactas con estos marcadores AFLP. Así, las plantas F1 obtenidas de un cruce entre un pepino compacto heterocigoto y un pepinillo o un pepino corto segregarán 1:1 para las características compactas heterocigotas : características normales y los marcadores cosegregarán con las características compactas. Las familias F2 obtenidas por autofecundación de las plantas F1 compactas heterocigotas segregarán 1:2:1 para las características homocigotos compactos: heterocigotos compactos: normales y los marcadores cosegregarán con las características compactas.
Un marcador que "flanquea" el locus del gen compacto ("marcador de flanqueo") se refiere a un marcador situado a ambos lados del locus del gen compacto, es decir, un marcador que está a un lado del locus o al otro lado del locus. Preferentemente, se utiliza un par de marcadores de flanqueo en cualquiera de los procedimientos de selección o detección asistida por marcadores descritos en el presente documento, con un marcador de flanqueo en un lado y el otro en el otro lado del locus. Sin embargo, también se puede utilizar un único marcador de flanqueo. En la Figura 1, por ejemplo, E14/M61 - M873.6 y E19/M50 - M280.2 son un par de marcadores de flanqueo, situados a una distancia de 0,05 cM y 0,67 cM, respectivamente.
Los aspectos que describen los marcadores AFLP específicos ligados al gen compacto son también aplicables a otros marcadores AFLP que son polimórficos entre las plantas que comprenden el gen compacto y las plantas que carecen del mismo y que están ligados al locus compacto, así como a los marcadores derivados de éstos. Estos otros marcadores AFLP polimórficos pueden, por ejemplo, encontrarse haciendo diferentes poblaciones segregantes, y/o seleccionando más combinaciones de cebadores AFLP, identificando marcadores polimórficos y mapeando los marcadores cerca del locus compacto. Los marcadores AFLP ligados al locus compacto y que son polimórficos entre el pepino largo y las plantas que comprenden el locus compacto pueden, por lo tanto, ser encontrados, y utilizados como se describe en el presente documento, por ejemplo, para transferir el gen compacto a otra planta o para detectar el gen compacto en las plantas. Esto sólo es posible mediante el uso de las plantas compactas de acuerdo con la invención y, por lo tanto, no era posible basarse en el material de la técnica anterior.
En una forma de la invención, las plantas resultantes del tipo habitual de pepino con las que se comparan las plantas de acuerdo con la invención incluyen aproximadamente 25 % de plantas sin crecimiento compacto, en una población segregante 1:2:1 generada por la autofecundación de una planta que es heterocigota para el gen compacto; o aproximadamente 50 % de plantas sin crecimiento compacto tras la producción de haploides dobles de una planta que es heterocigota para el gen compacto. En una de las realizaciones de la invención, las plantas del tipo de pepino habitual pertenecen a la variedad Sabrina o Korinda. Así, una planta sospechosa de ser heterocigótica para el gen compacto puede ser analizada/identificada/seleccionada mediante a) la autofecundación de dicha planta y el análisis de las plantas autofecundadas para una relación de segregación 1:2:1 de las características homocigóticas compactas: heterocigóticas compactas: normales, como se ha descrito anteriormente, o b) produciendo dobles haploides (DH) a partir de la planta y analizando la segregación 1:1 de las características normales : homocigóticas compactas en las plantas DH.
También se describen en el presente documento plantas de pepino homocigotas para el gen compacto y que muestran características compactas. Dichas plantas son adecuadas para introducir el gen compacto en cualquier otra planta de pepino mediante cruce y selección y para detectar la presencia del gen compacto en una planta. En un aspecto descrito en el presente documento, las plantas homocigóticas para el gen compacto son plantas de, o derivadas de, las semillas del tipo de pepino largo depositadas bajo NCIMB 41266 (que son homocigóticas para el gen compacto). Las plantas homocigotas para el gen compacto son preferentemente del tipo de pepino largo, pero también pueden ser de otros tipos de pepinos (cortos o pepinillos, etc.).
La presente invención también se refiere a cualquiera de las plantas del tipo de pepino largo mencionadas anteriormente, que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica, que pueden derivarse de las semillas depositadas en NCIMB Ltd. con el número 41266 (semillas de plantas del tipo de pepino largo que son homocigóticas para el gen compacto) de acuerdo con el Tratado de Budapest por la empresa Nunza B.V. (ahora llamada Nunhems B.V.) el 29 de marzo de 2005, siendo la dirección de NCIMB Ltd. Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen AB21 9YA, Escocia. Esto no se limita a las plantas con todo el conjunto de las características fenotípicas y genotípicas de las plantas que se cultivan a partir de estas semillas depositadas. La presente invención también se refiere a las semillas, células o tejidos de una de las plantas anteriores que comprenden el gen compacto en su genoma, así como a las plantas cultivadas a partir de las semillas anteriores y de las semillas, células o tejidos de estas plantas que poseen las características compactas y son heterocigotas para el gen compacto según la invención.
La presente invención también describe plantas de pepino y partes de plantas depositadas bajo el número NCIMB 41266 y cubre plantas de pepino y partes de plantas del tipo de pepino largo derivadas de las mismas y que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica. Así, el gen compacto se puede obtener del depósito de semillas y se puede transferir a otras plantas de pepino cruzando una planta de dicho depósito (o una planta obtenida por cruce y/o autofecundación de una planta de dicho depósito) con otra planta de pepino y obteniendo una progenie de dicho cruce. Las plantas que comprenden el gen compacto pueden obtenerse, por lo tanto, a partir de las semillas depositadas a través de la cría convencional y cualquier planta descrita en el presente documento se obtiene preferentemente a través de la cría convencional y no a través de la transformación de plantas (es decir, las plantas no son transgénicas). Las plantas de pepino que comprenden el gen compacto en forma heterocigota y que se derivan/derivables del NCIMB 41266 son pepinos largos y son preferentemente indeterminados en su crecimiento.
El gen compacto es el gen que está flanqueado por los marcadores AFLP E14/M61_M873.6 y/o E19/M50_M280.2 en el caso de hibridación entre plantas cultivadas a partir de semillas depositadas bajo el número NCIMB 41266 por una parte, y plantas de pepino corto o pepinillo por otra parte, especialmente en el caso de hibridación con plantas de una línea o variedad de pepino corto, tal como por ejemplo Manar F1.
La presente invención también describe un procedimiento para cruzar cualquiera de las plantas anteriores que comprenden el gen compacto en forma homocigota o heterocigota con otras plantas de pepino para introducir el gen compacto en otras plantas de la especie Cucumis sativus. En un aspecto descrito en el presente documento, las plantas a las que se ha transferido el gen compacto se seleccionan fenotípicamente con base en una o más características del gen compacto. La progenie puede ser una progenie directa del cruce (F1) o una progenie obtenida por autofecundación y/o cruce posterior. En otro aspecto descrito, la transferencia puede llevarse a cabo adicionalmente o únicamente, y/o en la que se comprueba la presencia del gen compacto en la progenie, con la ayuda de un proceso técnico en el que se utiliza al menos un marcador polimórfico AFLP, o un marcador derivado del mismo, que flanquea el gen compacto, en el caso de hibridación con una planta de pepino o pepinillo corto, o en el que se utiliza un proceso microbiológico de preparación de haploides dobles o un cultivo celular in vitro .
Así, se describe en el presente documento un procedimiento para introducir el gen compacto en una planta de la especie Cucumis sativus, y/o para generar semillas híbridas de la especie Cucumis sativus, que comprende los pasos de:
(a) proporcionar una planta de Cucumis sativus que carezca del gen compacto, por ejemplo, una línea o variedad de pepino largo normal;
(b) cruzar la planta de a) con una planta de Cucumis sativus que contenga el gen compacto, por ejemplo, en forma homocigótica,
(c) obtener las semillas híbridas de dicho cruce.
Opcionalmente, el análisis fenotípico de las características del gen compacto puede llevarse a cabo en los pasos (a), (b) y/o (c). Opcionalmente, también se puede llevar a cabo el análisis de marcadores AFLP, realizando cruces de prueba con pepino corto o pepinillo y analizando la presencia/ausencia de los marcadores en la progenie de dichos cruces.
También se describe en el presente documento un procedimiento para determinar si una planta comprende el gen compacto en forma homocigótica o heterocigótica, que comprende los pasos de:
(a) cruzar la planta que se sospecha que contiene el gen compacto con una planta de pepino corto o pepinillo (que carece del gen compacto) para obtener plantas F1, o autofecundar una planta que se sospecha que comprende el gen compacto para obtener plantas S1;
(b) analizar la progenie F1 o S1 obtenida en a) con uno o más marcadores AFLP o derivados de ellos, (c) autofecundar la progenie F1 o S1 que comprenda el gen compacto obtenido a partir de a) para obtener plantas F2 o S2 y analizar las plantas F2 o S2 obtenidas con uno o más marcadores AFLP o derivados de ellos, y
(d) con base en la cosegregación de los marcadores AFLP y las características compactas en el paso b) y/o c), concluir si la planta original comprendía el gen compacto en forma homocigótica o heterocigótica.
En otro aspecto descrito en el presente documento, se proporciona un procedimiento alternativo, que es idéntico al procedimiento anterior, pero en el que se omite el paso b).
Los marcadores AFLP utilizados son los descritos en el presente documento, es decir, los marcadores vinculados al gen compacto.
El procedimiento anterior implica que los fenotipos de la planta también se analizan en los pasos b y c, es decir, que se determina la presencia o ausencia de características compactas.
Si la planta original es heterocigótica para el gen compacto, la F1 segregará 1:1 para las plantas que comprendan marcadores AFLP vinculados al gen compacto (y que tengan características compactas heterocigóticas) y para las plantas que carezcan de los marcadores AFLP (y que carezcan de características compactas). La F2 obtenida por autofecundación de una planta que comprende el gen compacto segregará entonces 1:2:1, para plantas que comprenden el gen compacto en forma homocigota (y que comprenden los marcadores AFLP y las características compactas): plantas que comprenden el gen compacto en forma heterocigota (y que comprenden los marcadores AFLP y las características compactas) (en forma intermedia)) : plantas que carecen de los marcadores AFLP y de las características compactas). Asimismo, si la planta original es heterocigótica para el gen compacto, la S1 segregará 1:2:1 (1 homocigótico compacto : 2 heterocigotos compactos : 1 no compacto/normal).
Si la planta original es homocigótica para el gen compacto, todas las plantas F1 serán heterocigóticas, comprendiendo los marcadores AFLP y las características compactas, y la F2 segregará 1:2:1 como se ha descrito anteriormente. Si la planta original es homocigótica para el gen compacto, todas las plantas S1 serán también homocigóticas.
También se describe un procedimiento para producir semillas de una planta híbrida de pepino utilizando una de las plantas anteriores que comprenden el gen compacto en el estado homocigoto, en cuyo híbrido el gen compacto está presente en el estado heterocigoto, y especialmente un procedimiento que implica el uso de un cultivo celular in vitro , abarcando también las plantas, los frutos y las semillas de plantas híbridas de acuerdo con la invención que comprenden el gen compacto.
En un aspecto descrito en el presente documento, se divulga un procedimiento para introducir el gen compacto en una planta de la especie Cucumis sativus, y/o para generar semillas híbridas de la especie Cucumis sativus, comprendiendo dicho procedimiento los pasos de:
(a) proporcionar una planta de Cucumis sativus que carezca del gen compacto, por ejemplo, una línea o variedad de pepino largo normal;
(b) cruzar la planta de (a) con una planta de Cucumis sativus que contenga el gen compacto en forma homocigótica,
(c) obtener las semillas F1 de dicho cruce,
(d) generar plantas doblemente haploides (DH) a partir de dichas semillas F1 o plantas F1 mediante cultivo celular in v itro ,
(e) seleccionar las plantas doblemente haploides que sean homocigotas para el gen compacto y descartar las plantas DH que carezcan del gen compacto
(f) utilizar las plantas DH como progenitoras en un cruce con una planta que carezca del gen compacto para producir un híbrido que comprenda el gen compacto en forma heterocigótica.
En otro aspecto descrito en el presente documento, las técnicas in vitro se utilizan para mantener y/o multiplicar las plantas de acuerdo con la invención que comprenden el gen compacto en forma heterocigótica, por ejemplo, para evitar la multiplicación mediante semillas y/o para multiplicar híbridos idénticos mediante técnicas in v itro . Estos procedimientos implican, por ejemplo, la propagación clonal o vegetativa de las plantas de acuerdo con la invención, utilizando, por ejemplo, técnicas de cultivo de células o tejidos. Por lo tanto, se incluyen en el presente documento los cultivos de células o tejidos in vitro de explantes de plantas que comprenden el gen compacto, así como una pluralidad de plantas reproducidas clonal o vegetativamente, que comprenden el gen compacto, así como semillas, frutos, flores y tejidos de dichas plantas. Las técnicas in vitro son conocidas en la técnica, véase, por ejemplo, Mohammadi y Sivritepe (2007, J of Biol. Sciences 7: 653-657), Ahmad y Anis (2005, Turk J Botany 29: 237-240) o Handley y Chambliss (1979, HortScience 14:22-23).
También se describe un procedimiento en el que al menos uno (o al menos 2, 3, 4, 5, 6 o los 7) de los marcadores AFLP E14/M61_M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47_M411.0 y/o E16/M47_M402.9, y especialmente los marcadores AFLP E19/M50_M280.2 y/o E14/M61_M873.6, o los marcadores derivados de ellos, se utilizan para detectar la presencia del gen compacto en plantas, frutos, semillas, tejidos o células vegetales en diversas etapas del proceso de fitomejoramiento, así como para cubrir dicho procedimiento para la detección de la presencia del gen compacto en material biológico (por ejemplo, ADN) procedente de plantas, semillas, células o tejidos.
Además, una de las formas de la invención se refiere a un procedimiento para el cultivo de plantas de pepino por el procedimiento de cultivo en alto, en el que las plantas de pepino en cuestión son las establecidas en la reivindicación 1 o 2, y donde hay al menos 20 % más de tallos por m2 que en el cultivo habitual de pepinos.
Descripción detallada
La invención se refiere a plantas de pepino del tipo de pepino largo con un gen específico, denominado en el presente documento "gen compacto", tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas, que se expresa en el fenotipo compacto (heterocigoto u homocigoto) mediante la formación de plantas con una tasa de crecimiento más lenta y una hoja que es más pequeña y más oscura y que permanece verde durante más tiempo que en el caso del fenotipo de la planta de pepino habitual que carece de este gen, tal como los tipos de pepino largo normales (por ejemplo, cultivar Korinda), cuando se cultivan bajo las mismas condiciones ambientales. Las hojas de este "tipo compacto" son más frágiles que las del tipo habitual, por lo que se rompen más fácilmente por las nervaduras. Sin embargo, las hojas rotas permanecen verdes y sanas, a diferencia de las hojas dañadas del tipo habitual de planta, que se vuelven amarillas y se arrugan antes. Además, las hojas del tipo compacto son horizontales y no caen como en el caso del tipo de pepino habitual. El fenotipo compacto permite por tanto una mejor ventilación a través de la planta, y su estructura abierta hace que las plantas y los frutos sean más visibles y por tanto más fáciles de trabajar. También las flores son más pequeñas, con pétalos más cortos y estrechos (véase también la Fig. 2). Las plantas tienen también brotes laterales más cortos y una longitud de entrenudos menor que las plantas que carecen del gen compacto. Las plantas del fenotipo compacto homocigoto son en sí mismas menos adecuadas para el cultivo comercial estándar de pepinos largos, porque crecen más lentamente, pero son muy útiles para otros tipos de cultivo y para la creación de plantas híbridas (heterocigotas) de pepino largo que presentan las características fenotípicas del gen compacto (llamadas "características compactas") en la forma intermedia. En el cultivo comercial, se utilizan principalmente plantas híbridas (heterocigotas para el gen compacto) que se obtienen cruzando dos líneas parentales genéticamente diferentes. Si se utiliza una línea parental en la que el gen compacto está presente en el estado homocigoto y se hibridan/cruzan estas plantas con otra línea parental en la que el gen compacto está ausente (tal como una variedad o línea de pepino largo normal), se obtienen plantas híbridas heterocigotas que presentan la combinación única de "características compactas" en una expresión intermedia (el fenotipo "compacto heterocigoto o intermedio"), obteniendo así plantas híbridas con, por ejemplo, frutos más grandes y un crecimiento más rápido que las plantas del tipo "compacto homocigoto", pero con, por ejemplo, entrenudos más cortos que las plantas del tipo habitual que carecen del gen compacto en su genoma. Véanse las Fig. 2a, 2b y 2c, donde el centro de cada una de las figuras representa la planta intermedia heterocigótica. El uso de las plantas de acuerdo con la invención también puede dar un mayor rendimiento del fruto. Debido a su especial combinación de características, las plantas híbridas heterocigotas de acuerdo con la invención tienen un crecimiento óptimo, lo que permite un cultivo menos intensivo en mano de obra por el procedimiento habitual (invernadero), además de que el rendimiento es elevado, al igual que la calidad de los pepinos obtenidos.
Esta combinación óptima de características, que se debe a la expresión del gen compacto de acuerdo con la invención, no se conoce en el caso del tipo de pepino largo habitual. Los híbridos anteriores formados con tipos de plantas de "pepino corto" y con pepinillos no han dado lugar todavía a este tipo de planta única (véase también la Tabla 2 en los Ejemplos). Es difícil transferir una característica deseada de una planta a otra mediante la hibridación en el fitomejoramiento sin transferir algunas otras características no deseadas, que están acopladas a las deseadas. A menudo es imposible o particularmente difícil eliminar estas características indeseables mediante retrocruzamiento y selección. La invención aquí descrita es única, ya que se ha desarrollado en las plantas sin ninguna característica negativa acoplada, y con una base genética sencilla.
El gen compacto también puede ser introducido en otras plantas o puede ser combinado con otras características útiles producidas por un gen o unos pocos genes. Por ejemplo, es posible crear híbridos entre plantas que comprenden el gen compacto y otras plantas de pepino cruzando plantas con las plantas de acuerdo con la invención y plantas de pepino que comprenden, por ejemplo, resistencia al mildiu (Sphaerotheca fuliginea (Schlecht. ex Fr.) y/o Erysiphe cichoracearum (Dc . ex Mérat emend. Salm), también llamada la enfermedad blanca), con el fin de producir híbridos resistentes con las características compactas de acuerdo con la invención, teniendo una resistencia total o una resistencia parcial (intermedia) a la enfermedad. Por ejemplo, el gen compacto también puede introducirse en plantas de pepino que tengan plena resistencia al mildiu, sin que se produzca necrosis durante el cultivo de invierno, como se describe en la Solicitud de patente europea EP 1,433,378. También es posible obtener plantas híbridas compactas heterocigotas con resistencia al virus del amarillamiento de las venas del pepino (CVYV) (tal como la resistencia presente en la variedad de referencia Tornac), y/o con resistencia al virus del trastorno de retraso del crecimiento del pepino (CYSDV), véase, por ejemplo, el documento PE 1.317.558 o la Publicación PCT WO 2007/05,301. Además, es posible obtener plantas híbridas compactas heterocigotas con tolerancia o resistencia a Didymella bryoniae (mancha negra o Mycosphaerella - van Steekelenburg, 1986), o con una o más resistencias a patógenos, utilizando especies de pepino conocidas, como se menciona en el Protocolo de la CPVO en los puntos 44-51 del Anexo 1 (véase la bibliografía).
Las siguientes definiciones se incluyen aquí para explicar la invención y ayudar a la interpretación de las reivindicaciones y la descripción, pero no pretenden limitar el alcance de la protección legal con base en esta solicitud.
Los "marcadores moleculares" son marcadores con base en el ADN vinculados a un gen, alelo o locus del genoma, que se detectan mediante procedimientos moleculares y cuya presencia es indicativa de la presencia del gen, alelo o locus, tal como los marcadores con base en la hibridación de ácidos nucleicos (por ejemplo, marcadores RFLP por ejemplo, marcadores RFLP) o en la amplificación por PCR (tal como los marcadores RAPd , los marcadores AFLP, los marcadores de polimorfismo de un solo nucleótido o SNP, o los marcadores de sitio marcado por secuencia o STS) o combinaciones de PCR y análisis de enzimas de restricción (tales como los marcadores CAPS),
Los "marcadores AFLP" o marcadores de polimorfismo de longitud de fragmento amplificado son marcadores moleculares bien conocidos en la técnica, que pueden detectarse mediante el análisis AFLP, haciendo uso de enzimas de restricción y pares de cebadores que comprenden una secuencia complementaria a los adaptadores utilizados, una secuencia específica de la enzima, más uno, dos o tres nucleótidos selectivos, como se describe en Vos et al. (1995). Véase también los Ejemplos. La amplificación da lugar, por ejemplo, a una banda de ADN de un determinado tamaño en un gel de poliacrilamida cuando se amplifica el ADN molde que comprende el marcador (región de ADN vinculada al gen), mientras que puede no haber ninguna banda de ese tamaño cuando se utiliza el ADN molde de una planta en la que la secuencia del marcador es diferente (en cuyo caso puede decirse que el marcador está "ausente"). El tamaño de la banda polimórfica (marcador) se indica en el nombre del marcador, así como las enzimas de restricción y los cebadores utilizados.
El término "que comprende" debe interpretarse como que especifica la presencia de las partes, pasos o componentes indicados, pero no excluye la presencia de una o más partes, pasos o componentes adicionales.
El "fenotipo" es la apariencia observable de la planta que resulta de la interacción entre el genotipo de la planta y su entorno. Incluye todas las características morfológicas y fisiológicas observables de la planta.
El "genotipo" es la totalidad de la información genética hereditaria de un organismo, que llega a expresarse en el fenotipo de una manera particular, en parte bajo la influencia de factores ambientales.
"Planta de pepino", tal como se utiliza aquí, denota una planta, semilla o embrión o cualquier otra parte de la planta de la especie Cucumis sativus L. El término "fruto del pepino" se utiliza para referirse específicamente a la fruta. Este fruto del pepino puede ser un pepinillo, un pepino largo, corto, mini-(pepino Beith Alpha) o un midipepino. La presente invención también se refiere a los frutos de pepino cosechados de las plantas de acuerdo con la invención, así como a cualquier uso y procesamiento de los mismos. Una planta de pepino puede ser una planta cultivada o una línea de mejora, pero preferentemente no es una planta o una accesión silvestres o una introducción vegetal (PI) / accesión de banco de genes.
La "planta de pepino habitual" del "tipo de planta de pepino habitual" o del tipo de pepino "normal" es una planta de pepino como la definida anteriormente, pero que carece del gen compacto de acuerdo con la invención en su genoma y que carece de las características compactas (véase más adelante). El gen compacto puede introducirse en una planta tan habitual mediante cruces y selección (fenotípica y/o con base en marcadores). Los ejemplos de la planta de pepino habitual son los tipos de pepino largo, tal como los cultivares Korinda o Sabrina y otros. Las semillas que dan lugar a la planta tipo Korinda (híbrido F1) han sido depositadas por el solicitante Nunhems B.V. en el NCIMB (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) bajo el Tratado de Budapest con el número de acceso NCIMB 41585 el 233 de septiembre de 2008. Korinda es un tipo de planta de pepino disponible al público y bien conocido por el criador de pepinos, pero únicamente por precaución, el solicitante ha depositado semillas de Korinda.
Una planta "que carece del gen compacto" o "sin el gen compacto" se denomina en el presente documento como una planta que no comprende el alelo (mutante) del gen compacto de acuerdo con la invención (como, por ejemplo, el que se puede obtener de las plantas derivadas de las semillas del NCIMB 41266) en su genoma, que cuando está presente de otro modo en el genoma en una o dos copias da lugar a las "características compactas" (homocigóticas o heterocigóticas) de la planta (como se define más adelante). En cambio, dicha planta "que carece del gen compacto" comprende (dos copias) del alelo "tipo silvestre" del gen compacto, lo que da lugar a un fenotipo "normal", tal como por ejemplo en el cultivar Korinda. El alelo "tipo salvaje" es, por tanto, el alelo del gen que se encuentra en las plantas de pepino normales y que da lugar al fenotipo normal del pepino (no compacto) cuando está presente en forma homocigótica.
Los términos "cultivar" (abreviado como "cv") y "variedad" se utilizan en el presente documento como sinónimos.
La "línea" o "línea de cría" es un grupo de plantas con un genotipo y fenotipo muy similares. Puede estar formada por la descendencia de una planta después de algunas generaciones obtenida por autofecundación o por multiplicación vegetativa utilizando células vegetales, cultivos celulares o cultivos de tejidos, o produciendo líneas DH a partir de una planta de pepino.
La "selección fenotípica" se refiere a la selección de plantas con base en una o más características fenotípicas, tales como características morfológicas y/o fisiológicas, por ejemplo, una o más características compactas pueden ser seleccionadas fenotípicamente.
La "selección con base en marcadores moleculares" se refiere a la selección de plantas con base en uno o más marcadores moleculares. Por ejemplo, la transferencia del gen compacto de una planta a otra puede realizarse con la ayuda de uno o más marcadores moleculares vinculados al gen, y/o la presencia o ausencia del gen compacto en una planta puede determinarse con la ayuda de uno o más marcadores moleculares vinculados al gen.
"Hibridación" o "hibridización" se refiere en el presente documento al cruce de plantas (polinización cruzada de una planta con otra y obtención de progenie de la planta polinizada); en el contexto de los ácidos nucleicos, se refiere a la unión molecular de un ácido nucleico con un ácido nucleico complementario.
Una "planta transformada" es una planta en la que se introduce un gen quimérico homólogo o heterólogo por medio de una transformación como se conoce en la técnica. En cambio, las plantas no transformadas no comprenden genes quiméricos en su genoma. Las plantas de pepino de acuerdo con la invención son preferentemente plantas no transformadas, obtenibles mediante cría convencional, en las que el gen compacto se ha introducido sin procedimientos de transformación y en las que la planta no comprende todos o parte de vectores o genes quiméricos.
La "variedad vegetal" es un grupo de plantas dentro del mismo taxón botánico de la calidad más baja conocida, que (independientemente de que se cumplan o no las condiciones para el reconocimiento de los derechos del criador de plantas) puede definirse sobre la base de la expresión de las características que resultan de un determinado genotipo 0 de una combinación de genotipos, puede distinguirse de cualquier otro grupo de plantas por la expresión de al menos una de esas características, y puede considerarse como una entidad, porque puede multiplicarse sin ningún cambio. Por lo tanto, el término "variedad vegetal" no puede utilizarse para designar un grupo de plantas, aunque sean del mismo tipo, si todas se caracterizan por la presencia de 1 locus o gen (o una serie de características fenotípicas debidas a este único locus o gen), pero que por lo demás pueden diferir enormemente entre sí en lo que respecta a los demás loci o genes. Las plantas del tipo compacto, es decir, las plantas que comprenden el gen compacto de acuerdo con la invención y que pueden derivarse de las semillas de referencia depositadas bajo el número NCIMB 41266, incluyen muchas plantas de pepino diferentes, con características fenotípicas y composición genotípica muy diferentes en comparación con las de las semillas depositadas, pero tal grupo de plantas fenotípicamente diferentes con una sola característica compartida (el gen compacto) no entra en la definición anterior de variedad vegetal. Por lo tanto, la viabilidad técnica de la fabricación de plantas de pepino que comprenden las características compactas no se limita a una sola variedad de pepino, sino que puede aplicarse a cualquier variedad de pepino.
Las características fenotípicas de las plantas de acuerdo con la invención y que se deben a la presencia del gen compacto se denominan aquí "características compactas", y las plantas que contienen estas características se denominan por tanto "plantas compactas", "tipos compactos" o "tipos de plantas compactas". Estas plantas pueden ser homocigóticas o heterocigóticas para el gen compacto y se denominan respectivamente plantas "homocigóticas compactas", tipos compactos o tipo de planta compacta, y plantas "heterocigóticas compactas" o "compactas intermedias", tipos compactos o tipos de planta compacta.
Un gen monogénico "recesivo" sólo tiene dos expresiones fenotípicas, el fenotipo dominante (por el que las plantas homocigóticas y heterocigóticas para el gen tienen todas el mismo fenotipo dominante) y el fenotipo recesivo (por el que las plantas homocigóticas para el alelo recesivo expresan el fenotipo recesivo). En cambio, un gen monogénico "intermedio" tiene tres expresiones fenotípicas, por lo que las plantas homocigóticas recesivas tienen una expresión fuerte de las características fenotípicas, las plantas homocigóticas dominantes tienen una expresión débil de las características fenotípicas y las plantas heterocigóticas tienen características fenotípicas que se sitúan entre los valores fuertes y débiles. Para evitar dudas, la expresión "se encuentra en el medio" no indica que las puntuaciones (medias) se encuentren en el medio de los extremos, sino que las puntuaciones (medias) se encuentran por debajo de la puntuación más alta y por encima de la puntuación más baja.
La "expresión intermedia" o "fenotipo intermedio / expresión fenotípica" de las características compactas se refiere a las características compactas que comprenden las plantas que comprenden el gen compacto en forma heterocigota, que se encuentran entre las características compactas mostradas por las plantas homocigotas para el gen compacto y las plantas que carecen del gen compacto. Por ejemplo, la longitud de los entrenudos de los heterocigotos compactos es más corta que en las plantas que carecen del gen compacto, pero más larga que en los homocigotos compactos. Véase también el cuadro 1.
"Locus" es el lugar del genoma donde se encuentra un determinado gen.
"F1, F2, etc." se refiere a la sucesión de generaciones emparentadas obtenidas tras el cruce de dos plantas o líneas parentales. Las plantas cultivadas a partir de semillas que se obtienen tras el cruce de dos plantas parentales se denominan plantas "F1" o híbridas. La autofecundación de estas plantas F1 da lugar a una generación F2, etc.
Los "haploides duplicados" (o DH) son plantas obtenidas mediante un proceso técnico (in vitro) para duplicar el genoma de las células haploides (tal como el polen, las células de microsporas o los óvulos) de una planta, y regenerar plantas diploides a partir de ellas, como se conoce en la técnica anterior (por ejemplo, en la a patente estadounidense 5.492.827 o de la publicación de Gémes-Juhász et al., 2002).
Los términos "híbridos", "híbridos F1" o "plantas híbridas" se utilizan para designar la semilla y las plantas cultivadas a partir de esa semilla obtenidas mediante la hibridación de dos líneas parentales genéticamente diferentes. Las plantas híbridas F1 se caracterizan por la segregación de las características típicas en la siguiente generación, es decir, en la generación F2. Por lo tanto, estas características son genéticamente inestables en los híbridos. Los procedimientos para desarrollar híbridos son bien conocidos en el estado de la técnica (véase, por ejemplo, el procedimiento descrito en la Patente de EE. UU. 4.822.949). Si, por ejemplo, se cruza una línea parental femenina del tipo habitual de pepino que carece del gen compacto con una línea parental masculina que comprende el tipo compacto en forma homocigota (o viceversa, si se cruza una línea parental femenina que comprende el gen compacto en forma homocigota con un macho que carece del gen compacto), se obtienen híbridos F1 con una expresión intermedia de las características compactas, que son de gran interés en el cultivo comercial de pepinos, tal como el pepino largo, más especialmente en el caso del cultivo en altura.
Las "variedades o líneas de pepinos cortos" o "plantas o tipos de pepinos cortos", tal como se utilizan aquí, se caracterizan por frutos verdes sin, o prácticamente sin, el típico "cuello" (véase la explicación en el punto 23 del Anexo 1 del Protocolo de CPVO en la bibliografía), con una longitud de aproximadamente 15-20 cm, con una piel del fruto lisa o ligeramente acanalada y con formación de frutos partenocárpicos. Las hojas son generalmente de tamaño medio o grande. Ejemplos de los tipos de variedades de pepinos cortos son las variedades Alamir y Turbulence, o las plantas de pepino que reciben una puntuación de 1-6 por la longitud del fruto de acuerdo con el protocolo de la CPVO (véase el Punto 19 del Anexo 1 de este protocolo). Otros ejemplos de variedades de pepinos cortos son: Manar, Beit Alpha, Maximum, Saric, Tornac, Kian, Arabella, Melita, Isatis, Vitara.
Las "variedades o líneas de pepinillos" o "plantas de pepinillos", tal y como se utilizan aquí, se caracterizan por sus frutos de color verde medio, a veces con una punta jaspeada ligeramente más clara, que tienen una longitud de aproximadamente 12-15 cm, y una piel espinosa con verrugas, pero a menudo sin nervaduras. Las hojas son generalmente pequeñas o medianamente grandes. Ejemplos de tipos de pepinillos son las variedades Capra y Delphina.
Las "variedades o líneas de pepino largo" o "plantas de pepino largo" o "tipos de pepino largo", tal como se utilizan en el presente documento, se caracterizan por frutos de aproximadamente 30-37 cm de longitud (o más, por ejemplo 40 cm, 42 cm o más) con algo de cuello y una piel ligeramente acanalada de color verde medio, y con formación de frutos partenocárpicos. Las hojas son generalmente grandes o muy grandes. Ejemplos de tipos de pepinos largos son las variedades Sabrina y Korinda, o las plantas de pepino que reciben una puntuación de 7 a 9 por la longitud del fruto de acuerdo con el protocolo de la CPVO (véase el Punto 19 del Anexo 1 de este protocolo). Otras variedades de pepino largo son, por ejemplo, Bodega, Bolonia, Kamaro, Flamingo, Discover, Kalunga, Kasja, Logica, Millagon. Nicola, Milika, Manuela, Frida, Activa, Alaya, Savanna, Sienna, Bella, Sheila, Bornand.
En una realización de la invención el gen compacto está presente en las plantas de pepino largo, especialmente en las plantas de pepino indeterminado. Los pepinos "indeterminados" son pepinos en los que el crecimiento de la planta no se interrumpe debido a que la yema simpodial se convierte en tejido floral, es decir, las plantas siguen creciendo en longitud durante todo el ciclo de vida y también siguen produciendo frutos durante todo el tiempo (es decir, a diferencia de las plantas de pepino determinadas, no llegan a fructificar todas a la vez). En una realización particular de la invención, el gen compacto está presente en las plantas de pepino largo, especialmente en las plantas de pepino largo aptas para el cultivo comercial, particularmente en invernaderos. En una forma de la invención, este cultivo en invernadero es un cultivo en altura. En otro aspecto descrito, el gen compacto de acuerdo con la invención está presente en plantas de pepino que no contienen el locus de Little Leaf(//), presente en el tipo H-19 o Arkansas Little Leaf, siendo dichas plantas de pepino especialmente adecuadas para el cultivo comercial en invernadero del pepino largo, más concretamente por cultivo en altura. En otro aspecto descrito, el gen compacto de acuerdo con la invención está presente en plantas de pepino que no contienen el locus cp o cp-2.
El "gen compacto" es una característica genética situada en un determinado locus del genoma del pepino, que llega a expresarse en el fenotipo de la planta compacta mediante la formación de las características típicas compactas definidas en el presente documento, en comparación con, por ejemplo, el tipo de pepino largo habitual (tal como las plantas de un tipo de pepino largo habitual, por ejemplo, la variedad Korinda).
El término "características compactas" utilizado aquí denota la totalidad de las características fenotípicas de los rasgos que se deben a la presencia en el genoma de la planta del gen compacto de acuerdo con la invención (en forma homocigota o heterocigota). En una forma de la invención, varias de estas características se heredan junto con el gen compacto a las generaciones siguientes. Las características compactas homocigóticas dan lugar a plantas aún más compactas con pétalos y hojas más pequeños y frutos más cortos que el gen compacto heterocigótico. Más concretamente, las características compactas comprenden una combinación de las siguientes características fenotípicas (estadísticamente significativas) (véase también la Tabla 1), que se confieren en un grado fuerte o intermedio cuando se introducen en el pepino largo normal que carece del gen: una longitud de tallo más corta a los 15 entrenudos, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas, flores más pequeñas y frutos más cortos. En una forma de la invención, las características compactas abarcan una combinación de las siguientes características: una longitud de tallo más corta en 15 entrenudos, una tasa de crecimiento más lenta, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas, más horizontales (erectas), más planas (menos abultadas o tuberculadas), de color verde más oscuro y más quebradizas (pueden romperse más rápidamente), flores más pequeñas, frutos más pequeños y más ligeros, y especialmente las características que son evidentes en las plantas que son homocigotas para el gen compacto (tal como las plantas homocigotas cultivadas a partir de las semillas depositadas con el número NCIMB 41266, o las plantas doblemente haploides que son homocigotas para el gen compacto y que se obtienen a partir de una planta que es heterocigota para el gen compacto), cuyas plantas tienen una longitud de tallo significativamente más corta a los 15 entrenudos, brotes laterales más cortos, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas, flores más pequeñas y frutos más cortos -todo ello en comparación con las plantas del tipo silvestre (es decir, sin el gen compacto)tal como las plantas del tipo habitual de pepino, donde se tiene , por ejemplo, aproximadamente 25 % de las plantas sin crecimiento compacto en una población segregante 1:2:1 tras la autofecundación de una planta que es heterocigota para el gen compacto, o aproximadamente 50 % de las plantas sin crecimiento compacto, obtenidas tras la producción de haploides dobles a partir de una planta que es heterocigota para el gen compacto. "Aproximadamente 25 % de las plantas" y "aproximadamente 50 % de las plantas" es bien entendido por la persona experta que tiene conocimientos de genética y herencia como una referencia a la segregación mendeliana de una determinada característica. En una población de 100 plantas que segregan para un determinado carácter en una proporción de 1:2:1, es decir, aproximadamente 25% : aproximadamente 50% : aproximadamente 25% de las plantas tienen un fenotipo normal : compacto intermedio : compacto, se entiende que no es necesario que exactamente 25, 50 y 25 plantas tengan los fenotipos descritos, ya que los factores genéticos y no genéticos pueden influir en la segregación mendeliana, pero que estadísticamente aproximadamente 25 %, 50 % y 25 % sean de los fenotipos mencionados.
Las características del gen compacto mencionadas anteriormente son, por lo tanto, una serie de características fenotípicas que se heredan con el gen compacto y, por lo tanto, se introducen en una planta en la que se introduce el gen compacto. La fuerza de las características depende de si el gen compacto está presente en forma homocigótica o heterocigótica. Las características compactas se comparan, por tanto, entre el pepino normal (que carece del gen compacto) y un pepino que comprende el gen compacto en forma homocigota o heterocigota, o entre una planta que comprende el gen compacto en forma homocigota y una planta que comprende el gen compacto en forma heterocigota. Se entiende que la comparación de dichas características siempre implica la comparación de los valores medios de un número de plantas cultivadas bajo las mismas condiciones (por ejemplo, al menos 10, 15, 20 o más plantas) para tener en cuenta cualquier variación entre plantas.
Las plantas que son homocigotas para el gen compacto descrito en el presente documento se identifican más fácilmente por sus pronunciadas características compactas que son significativamente diferentes de las de las plantas del tipo silvestre (las que no tienen el gen compacto, por ejemplo la variedad Korinda), especialmente en lo que respecta a la longitud del tallo en 15 entrenudos (significativamente más corta que la del tipo silvestre en estado homocigoto), la longitud y la anchura de las hojas (significativamente más pequeñas que en el tipo silvestre en estado homocigoto), el área del limbo de la hoja (significativamente más pequeña que en el tipo silvestre en estado homocigoto), la longitud y la anchura de los pétalos (significativamente menores que en el tipo silvestre en estado homocigoto), el peso de los frutos (significativamente menores que en el tipo silvestre en estado homocigoto), la longitud de los frutos (significativamente menores que en el tipo silvestre en estado homocigoto) y el número de entrenudos en los brotes laterales (significativamente menores que en el tipo silvestre en estado homocigoto). Las Figuras 2A, 2B y 2C adjuntas muestran las diferencias fenotípicas claramente reconocibles entre el pepino largo normal (ejemplificado por la variedad Korinda), y las plantas compactas heterocigotas y homocigotas en cuanto a la longitud de los frutos, el tamaño de las hojas y el tamaño de las flores.
En un aspecto descrito en el presente documento, una planta que es homocigota para el gen compacto se caracteriza por una combinación de las siguientes características compactas típicas , en comparación -bajo las mismas condiciones de cultivo (con siembra preferentemente en verano, es decir bajo condiciones de invernadero de verano holandés, pero posiblemente a lo largo de todo el año) - con una planta que no tiene el gen compacto (denominada aquí planta de control, tal como las variedades de pepino o las líneas del mismo tipo que carecen del gen), con base en los valores medios de las mediciones realizadas en al menos 20 plantas de cada tipo, es decir, las plantas compactas homocigóticas, por un lado, y las plantas de control, por otro:
- la anchura máxima de la décima hoja verdadera 39 o 35 días después de la siembra de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto es como máximo el 70%, preferentemente como máximo el 60% de la anchura de la décima hoja en las plantas de control 39 o 35 días después de la siembra;
- el área del limbo de la hoja (0,5 veces la anchura máxima de la hoja por la mayor longitud de la hoja desde el punto más bajo del lóbulo de la hoja hasta la punta de la misma) en la décima hoja verdadera 39 o 35 días después de la siembra de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto es como máximo el 50 %, preferentemente como máximo el 40 %, del área del limbo de la hoja en las plantas de control 39 o 35 días después de la siembra
- la anchura máxima de los pétalos 39 o 45 días después de la siembra de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto es como máximo el 75 %, preferentemente como máximo el 70 %, de la anchura máxima de los pétalos de las plantas de control 39 o 45 días después de la siembra
- la longitud de los brotes laterales 56 días después de la siembra de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto es como máximo el 60 %, preferentemente como máximo el 50 %, de la longitud de los brotes laterales 56 días después de la siembra de las plantas de control (la longitud se toma desde el punto donde el brote lateral se une al tallo principal hasta el final del brote lateral) y
- el número de entrenudos en los brotes laterales 56 días después de la siembra de las plantas con el gen compacto en el estado homocigoto es como máximo el 70 %, preferentemente como máximo el 60 %, del número de entrenudos en los brotes laterales 56 días después de la siembra de las plantas de control.
Una planta de control utilizada en la prueba comparativa anterior puede ser, por ejemplo una planta derivada que no contenga el gen compacto y que, por ejemplo, se seleccione de una población segregante tras la autopolinización de una planta que sea heterocigótica para el gen compacto, o puede ser una planta de la población de aproximadamente el 50 % de haploides dobles (DH) procedente de una planta que sea heterocigótica para el gen compacto (sin el gen compacto), o bien una planta de pepino que sea representativa del mismo tipo de planta de pepino sin el gen compacto, por ejemplo, una planta del tipo de pepino largo, tal como una planta de las variedades de pepino Korinda o Sabrina.
Por lo tanto, las plantas con el gen compacto siempre pueden ser identificadas con base en la combinación única de las características fenotípicas obvias mencionadas anteriormente en las plantas que son homocigotas para el gen compacto. Hacer que la planta sea homocigota para el gen compacto es un procedimiento estándar en la técnica anterior, al igual que es una práctica estándar obtener plantas que son heterocigotas para el gen compacto a partir de una planta que es homocigota para este gen. Estas plantas compactas heterocigotas del tipo pepino largo son el objeto de la presente invención.
Las características fenotípicas de una planta, tal como el tamaño de las hojas, pueden mostrar algunas diferencias de acuerdo con el procedimiento de cultivo y los factores ambientales (por ejemplo, la temperatura, la luz, la humedad y la cantidad de nutrientes), por lo que es obvio que preferentemente se utilicen las mismas condiciones de cultivo, por ejemplo, se puede utilizar el procedimiento estándar/tradicional de cultivo de pepinos o el procedimiento de cultivo en alto, para una comparación entre el tipo silvestre (que carece del gen compacto) y las plantas heterocigotas de acuerdo con la invención y/o las plantas homocigotas descritas en el presente documento, todas ellas cultivadas bajo las mismas condiciones.
Las características compactas pueden identificarse, por ejemplo, en plantas híbridas, heterocigotas para el gen compacto, comparando las características de las plantas derivadas obtenidas tras la autopolinización o tras la formación de un doble haploide, partiendo de una planta sospechosa de contener el gen compacto, y estableciendo que las características compactas se transmiten conjuntamente de acuerdo con el patrón esperado de las plantas heterocigotas, homocigotas y silvestres (que carecen del gen compacto) de acuerdo con la herencia monogénica e intermedia. En la hibridación mutua (o autopolinización) de plantas homocigóticas, no hay segregación de características, pero la herencia de las características compactas puede seguir demostrándose aquí tras la autopolinización de plantas obtenidas por el cruce de una planta homocigótica para el gen compacto con plantas (homocigóticas) del tipo silvestre, tal como las plantas de pepino largo conocidas en la técnica anterior, por ejemplo, las plantas de la variedad Korinda.
Tal como se utiliza en el presente documento, el locus del gen compacto es el locus que -tras la introducción en las plantas de pepino corto o pepinillo por hibridación- está flanqueado por el marcador AFLP E14/M61_M873.6 (en aproximadamente 0,05 cM) y E19/M50_M280.2 (en aproximadamente 0,67 cM), más concretamente en la hibridación de plantas cultivadas a partir de las semillas depositadas con el número 41266 del NCIMB con plantas de pepino corto o pepinillo, por ejemplo, plantas de pepino corto del tipo Manar F1.
Lo que indica la presencia del gen compacto de acuerdo con la invención en la planta heterocigótica es la segregación de las características compactas en una proporción de 1:21 después de la autofecundación de una planta de pepino heterocigota, con aproximadamente 25 % del tipo compacto homocigota, aproximadamente 50 % del tipo compacto heterocigota y aproximadamente 25 % del tipo silvestre (que no tiene características compactas ni gen compacto), o en una proporción de 1:1 en los haploides duplicados, donde aproximadamente 50 % de los DH son homocigotos para el gen compacto y el otro 50 % aproximadamente son homocigotos para el tipo silvestre (es decir, sin el gen compacto). Esto puede establecerse mediante el análisis de los marcadores AFLP de los híbridos formados con un pepino corto o una planta de pepinillo, como se describe a continuación, si estas características compactas cosegregan con los marcadores AFLP especificados que flanquean el gen compacto en un híbrido formado con el pepino corto o la planta de pepinillo. En esta comparación fenotípica de las plantas de pepino segregadas, se utilizan, por supuesto, las mismas condiciones de crecimiento y se realizan las mismas mediciones y observaciones comparativas en los mismos momentos. Si se incluyen plantas de control adicionales, pueden elegirse entre plantas del tipo habitual de pepino largo, tal como plantas de la variedad Sabrina o Korinda, especialmente plantas de la variedad Korinda. La autofecundación de una planta que carece del gen compacto dará lugar a que toda la progenie carezca de la pluralidad de características compactas.
Los marcadores AFLP aquí descritos pueden utilizarse para establecer que las plantas en cuestión contienen el gen compacto. Esto puede hacerse con base en la cosegregación de las características compactas, con un determinado locus en el genoma del pepino (según lo determinado por los marcadores AFLP descritos en el presente documento) después de la hibridación de la planta que se va a analizar con una planta de pepino corto o de pepinillo y el análisis de marcadores y/o fenotípico en la generación F1 y/o F2 obtenida. El análisis de marcadores no es un paso esencial debido a las características fenotípicas compactas claramente observables, mostradas en la Figura 2 e indicadas en las Tablas 1 y 2.
Para el análisis de los marcadores, una planta de pepino posiblemente híbrida sospechosa de ser heterocigota para el gen compacto se cruza con una planta de pepinillo o de pepino corto. La mayoría de las variedades o líneas de pepino corto y pepinillo pueden utilizarse para este fin, siempre que los marcadores AFLP puedan emplearse en ese fondo. Para facilitar el fenotipado, lo mejor es utilizar plantas de pepino corto o pepinillo de una línea homocigótica con un fenotipo lo más diferente posible al de la planta compacta de acuerdo con la invención con la que se cruza (por ejemplo, un tipo de pepino corto de hojas grandes con hojas de color claro). Son especialmente adecuados los tipos de pepino corto que se identifican al menos por el marcador AFLP E16/M47_M426.1, por ejemplo, plantas de la bien conocida variedad de pepino corto Manar F1, o plantas homocigóticas con un fenotipo similar al de la variedad Manar F1.
En esta hibridación entre una planta de pepino posiblemente híbrida (que es heterocigota para el gen compacto) y una planta de pepinillo o pepino corto, las características compactas están presentes en una proporción de 1:1, con aproximadamente el 50 % de las plantas que tienen las características compactas (y los marcadores AFLP de flanqueo), y el resto no. Tras la autopolinización de las plantas con las características compactas obtenidas de esta hibridación con una planta de pepinillo o de pepino corto, se obtiene una planta F2, que muestra una segregación en una proporción 1:21 entre las plantas que son homocigotas para el gen compacto o las características compactas (y comprenden los marcadores AFLP de flanqueo), las plantas que son heterocigotas para el gen compacto o las características compactas (y comprenden los marcadores AFLP de flanqueo), y las plantas del tipo silvestre, que carecen del gen compacto o de las características compactas , (y carecen de los marcadores AFLP de flanqueo) siempre que la planta original (híbrida) fuera efectivamente heterocigota para el gen compacto.
El análisis de marcadores con al menos uno de los marcadores AFLP E14/M61_M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47_M411.0 y/o E16/M47_M402.9, y mejor aún con el marcador E14/M61_M873.6 y/o E19/M50_M280.2, puede entonces llevarse a cabo para el genotipado de estas plantas. Al comparar el análisis fenotípico (la segregación de características compactas fenotípicas) con el análisis genético (segregación de al menos uno de los marcadores en la hibridación del pepino corto o del pepinillo), se trata de establecer la cosegregación de las características compactas de acuerdo con la invención con los marcadores AFLP que se produce si el gen compacto de acuerdo con la invención está presente en estas plantas.
Varias de las características fenotípicas de las plantas compactas de acuerdo con la invención (las características compactas) son heredadas conjuntamente por los descendientes de las plantas compactas. La cosegregación de uno o más de los marcadores AFLP (tal como uno de los marcadores AFLP mostrados en la Figura 1) con el fenotipo compacto indica la presencia del gen compacto en las plantas.
Como resultado de un mayor trabajo de fitomejoramiento, el gen compacto se introduce además en otros fondos genéticos mediante hibridación. Es posible que las características compactas sean menos fáciles de detectar fenotípicamente en las plantas e híbridos que son heterocigotos para el gen compacto. Sin embargo, el gen compacto siempre puede identificarse con base en la segregación mencionada de las características compactas tras la autofecundación de plantas que son heterocigotas para el gen compacto, o tras la formación de haploides dobles. Este análisis fenotípico puede confirmarse con el análisis anterior de marcadores . La combinación de varias características compactas en plantas que son homocigotas para el gen compacto puede ser establecida en una población segregante por cualquier persona con competencia ordinaria que se dedique al cultivo de pepinos. Las plantas que contienen el gen compacto siempre pueden ser reconocidas de esta manera.
En un aspecto descrito en el presente documento, el gen compacto está presente en el estado homocigoto. Dichas plantas son muy útiles como líneas parentales para la producción de plantas híbridas de pepino, que comprenden el gen compacto en estado heterocigoto y tienen un fenotipo intermedio.
En una realización específica de la presente invención, el gen compacto está presente en el estado heterocigoto si se hibrida una planta del tipo compacto homocigoto con una planta sin el gen compacto (por ejemplo, una planta del tipo pepino largo habitual). La hibridación del tipo compacto homocigoto con otras plantas representa otras divulgaciones específicas que son diferentes de la realización presentada en los ejemplos.
La presente divulgación también divulga el uso del gen compacto en otras variedades y líneas de pepino o en otras plantas del género Cucumis introduciendo este gen compacto en otras plantas por hibridación utilizando los procedimientos generales bien conocidos (tal como por ejemplo la selección recurrente, el rescate de embriones, etc.), siendo las plantas receptoras, por ejemplo, otras plantas de la especie Cucumis sativus, especialmente plantas del tipo pepino largo.
La presente divulgación también describe la detección y el seguimiento de esta característica compacta en los diversos productos de hibridación y etapas del proceso de fitomejoramiento con la ayuda de al menos uno de los marcadores AFLP E14/M61_M873.6, E19/M50_M280.2, E24/M49_M211.5, E17/M54_M179.0, E16/M47_M426.1, E16/M47_M411.0 y/o E16/M47_M402.9, especialmente con el marcador E14/M61_M873.6 y/o E19/M50_M280.2, o marcadores derivados de éstos (tal como el STS, el SNP u otros marcadores derivados de al menos uno de estos marcadores AFLP) tras la introducción con base en la hibridación en pepinos cortos o pepinillos, como se ha descrito anteriormente. La presente divulgación también describe kits que contienen dichos marcadores. La técnica AFLP y los marcadores AFLP se describen detalladamente en el documento EP 0,534,858 B1y el contenido de ese documento y las definiciones dadas allí en la Sección 5.1 en las páginas 4-6 también pueden utilizarse para los fines de la presente invención. En resumen, el uso de los marcadores AFLP comprende los siguientes pasos: a) proporcionar el ADN genómico de las plantas de pepino que se van a analizar, b) restringir el ADN genómico de cada planta con dos enzimas de restricción, tal como en este caso EcoRI y MseI, c) ligar adaptadores a ambos extremos de los fragmentos restringidos, siendo los adaptadores específicos para las enzimas de restricción utilizadas, es decir adaptadores EcoRI y MseI, d) amplificar un subconjunto de los fragmentos de restricción mediante PCR, utilizando las combinaciones de cebadores descritas para los marcadores (por ejemplo, el par de cebadores E14 y M61 para amplificar una banda de aproximadamente 873 bases o el par de cebadores E19 y M50 para amplificar una banda de aproximadamente 280 bases si el gen compacto está presente en el ADN de la planta). Los cebadores AFLP comprenden una parte complementaria a la secuencia adaptadora (secuencia central) y una parte de la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción, y contienen además 1, 2 o 3 nucleótidos selectivos. E14 y E15, por ejemplo, contienen 2 nucleótidos selectivos, mientras que M61 y M50 contienen 3 nucleótidos selectivos. Las secuencias de cebadores y adaptadores AFLP son conocidas en la técnica.
Los siguientes ejemplos se dan para ilustrar una de las realizaciones de la invención sin pretender restringir el alcance de la protección, que se especifica en las reivindicaciones adjuntas.
Figuras
Figura 1 muestra un mapa genético del locus compacto, denominado en el presente documento "locus 4001" (véase el ejemplo 2). Se muestra el mapa genético del locus 4001, con marcadores AFLP EcoRI/MseI en este, que pueden utilizarse para detectar la presencia del gen compacto en la hibridación de plantas con una planta de pepino o pepinillo corto. Las distancias genéticas se basan en la población F2 compuesta por 4.180 individuos resultantes de la hibridación de una planta 4001 (homocigota para el gen compacto) con Manar F1 (pepino corto).
Figura 2 muestra una comparación de los frutos, las flores y las hojas de las plantas obtenidas bajo las mismas condiciones de cultivo (siempre retiradas 35-40 días después de la siembra), siendo la hoja número 15 en todos los casos. Figura 2a muestra una comparación de frutos típicos cosechados de plantas homocigóticas para el gen compacto (izquierda), de plantas heterocigóticas para el gen compacto (centro) y de plantas de control del tipo Korinda, que carecen del gen compacto (derecha). Figura 2b muestra una comparación de hojas y flores típicas extraídas de plantas que eran homocigóticas para el gen compacto (derecha), de plantas que eran heterocigóticas para el gen compacto (centro) y de plantas de control del tipo Korinda (izquierda). Figura 2c muestra una comparación detallada de los pétalos de las flores típicas extraídas de plantas que eran homocigóticas para el gen compacto (derecha), de plantas que eran heterocigóticas para el gen compacto (centro) y de plantas de control de la variedad Korinda (izquierda).
Figura 3 muestra la absorción de clorofila (Fig. 3a) y la concentración de clorofila (pg/g) en muestras de hojas de plantas homocigóticas para el gen compacto (muestras 1 y 4), plantas heterocigóticas para el gen compacto (muestras 2, 5 y 6) y en plantas de pepino normales (muestras 3 y 7).
Ejemplos
Ejemplo 1 - Análisis del fenotipo de las plantas compactas
Se encontró inesperadamente una planta más compacta con un fenotipo desviado en una población híbrida F1 al cultivar el pepino largo holandés en los Países Bajos. Esta planta se denominó "tipo 4001", y el locus responsable de la misma se llamó "locus 4001". Se estableció que, en comparación con otras plantas de pepino largas como las de la variedad Korinda, por ejemplo, el crecimiento de las plantas compactas era moderado, y su tallo principal crecía lentamente, principalmente porque sus entrenudos eran más cortos. Las hojas de esta planta más compacta eran notablemente más pequeñas y oscuras que las de la variedad habitual de pepino largo. El follaje de las plantas más compactas era más horizontal y las hojas estaban menos abultadas, es decir, eran más planas. Las plantas más compactas tenían una estructura vegetal notablemente más abierta que la variedad habitual de pepino largo. Sus frutos eran más cortos y pesaban menos que en las plantas del tipo pepino largo.
El análisis de una población de estas plantas, obtenida por la autofecundación de plantas que eran heterocigotas para el locus 4001 (también llamado locus compacto) mostró que las características compactas segregaban de la manera esperada de la herencia monogénica e intermedia. Además del tipo intermedio heterocigoto, también había plantas que eran homocigotas para las características compactas típicas descritas anteriormente, tal como un crecimiento muy compacto, hojas pequeñas, frutos y entrenudos cortos.
Se comprobó que el patrón de segregación de las plantas era el siguiente:
aproximadamente el 25 % de ellas eran plantas compactas homocigóticas
aproximadamente el 50 % de ellas eran plantas compactas intermedias heterocigotas aproximadamente el 25% de ellas eran plantas de pepino largas normales.
Esta relación de segregación mendeliana de 1:2:1 apunta a la segregación de un gen en un solo locus, con la expresión fenotípica intermedia del genotipo heterocigoto. Las semillas de las plantas homocigóticas del tipo 4001 (Cucumis sativus ssp. sativus) fueron depositadas el 29 de marzo de 2005 por la empresa Nunza B.V. (cuyo nombre ha sido cambiado desde entonces a Nunhems B.V.) en el NCIMB (dirección: Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, AB21 9YA, Escocia) con el número NCIMB 41266 de acuerdo con el Tratado de Budapest. Cuando proceda, el Solicitante pide que las muestras de este material biológico y cualquier material derivado del mismo sólo se entreguen a un experto designado de acuerdo con la Regla 32(1) del EPC o la legislación relacionada de los países/regiones o tratados que tengan regulaciones similares, hasta la mención de la concesión de la patente, o durante 20 años a partir de la fecha de presentación si la solicitud es rechazada, retirada o se considera retirada.
En las células haploides, por ejemplo, el polen, las células de microspora o los óvulos de las plantas de pepino que son heterocigotos para el gen compacto, el gen compacto debe estar presente o ausente. El análisis de los haploides dobles (abreviados aquí como DH) obtenidos a partir de plantas que eran heterocigotas para el gen compacto dio efectivamente el siguiente resultado:
aproximadamente el 50 % de los DH exhibieron el tipo de planta compacta homocigota debido a la presencia del gen compacto en el estado homocigota y
aproximadamente el 50 % de los DH exhibieron el tipo de planta normal, debido a la ausencia del gen de las características compactas. Estas plantas son homocigotas para el tipo de pepino largo normal.
En la relación de segregación de los haploides dobles, sólo se dan los 2 genotipos homocigotos diferentes, en una proporción 1:1. Esto indica que se trata definitivamente de un único locus, y muy probablemente de una característica monogénica.
Para aumentar el valor agrícola de otros cultivares de pepino, se produjeron híbridos entre plantas compactas homocigóticas y diversas plantas de pepino del tipo largo. Los tipos largos que se utilizaron fueron tipos largos aptos para condiciones de primavera, verano y otoño y tipos largos con diversas resistencias a enfermedades (con resistencia intermedia o resistencia al oídio (Sphaerotheca fuliginea y/o Erisyphe cichoracearum); con resistencia al CVYV, CMV y/o CYSDV). Estos híbridos y su posterior selección dieron lugar, por ejemplo, a plantas que tenían una mayor resistencia a las enfermedades y daban frutos más largos que las plantas compactas homocigotas, pero que seguían conteniendo el gen compacto y tenían una forma de planta más abierta. Los híbridos producidos, por tanto, contenían el fenotipo compacto intermedio y eran adecuados para el cultivo tradicional en invernadero o el cultivo en altura. Por lo tanto, todas estas plantas derivadas en diferentes antecedentes genéticos tenían características útiles y mostraban las características compactas favorables.
El producto específico anterior en estado homocigoto y el producto específico en estado heterocigoto se compararon para una serie de características relevantes con el tipo de pepino largo habitual, utilizando la variedad Korinda como ejemplo, y los resultados se muestran en la Tabla 1.
La Tabla 1 muestra una comparación entre el tipo de pepino largo habitual (tipo normal de la variedad Korinda), el "tipo compacto" homocigoto y el tipo intermedio heterocigoto para los rasgos que son claramente característicos de estos tipos de plantas. Las semillas de estos ensayos comparativos que dieron los resultados en cuestión se sembraron el 4 de julio de 2005. Las plántulas se transfirieron a macetas de lana de roca el 8 de julio de 2005 en un invernadero de vivero perteneciente a la empresa Nunhems en Nunhem, Países Bajos, donde prevalecían las condiciones prácticas normales utilizadas por los productores de pepinos. El 26 de julio de 2005, las plantas jóvenes de pepino se trasladaron a un invernadero de producción de pepinos con macetas de lana de roca y nutrientes estándar para pepinos. La densidad de plantas era de aproximadamente 1,2 plantas per m2. Las plantas se hicieron crecer hasta el alambre de la forma habitual. Se fijaron a ella y se "remataron" allí, tras lo cual se retuvieron los 3 brotes laterales superiores y se les dejó crecer. Se limpiaron las 6 primeras axilas inferiores del tallo principal (sin ningún fruto), tras lo cual se mantuvieron 2 frutos (en la 7a/8a axila) y luego se volvieron a limpiar algunas axilas, para que los frutos inferiores pudieran desarrollarse fácilmente. Las observaciones que se presentan a continuación se realizaron en al menos 20 plantas de cada tipo, y los valores medios resultantes de las mediciones se recogen en la Tabla 1.
Las fechas en las que se realizaron las mediciones enumeradas en la Tabla 1 también se indican en la tabla. Dado que estos valores absolutos varían con el tiempo y el lugar de las mediciones u observaciones, también se indican los porcentajes relativos al tipo normal para los valores medidos y calculados obtenidos para el tipo heterocigoto y el tipo compacto.
Explicación de los términos utilizados en el cuadro 1
Código CBP: La numeración de acuerdo con el protocolo CPVO (véase la bibliografía)
Tipo de (tipo de observación)
observador:
M = Medida en centímetros (cm), gramos (g) o números
C = Cálculo, V = Observación visual
% de N: El valor observado para el tipo compacto heterocigoto u homocigoto, expresado
como porcentaje del valor obtenido para el tipo normal o silvestre
LSD: Diferencia menos significativa de acuerdo con la prueba pareada de Scheffe
(1953, 1959) con un valor de probabilidad del 0,5 % y del 0,1 % o un nivel de fiabilidad del 95 % o del 99 %, respectivamente.
Dif. significativa. NS = no significativo
* = significativo al nivel del 5%
** = altamente significativo al nivel del 1%
N/H = entre el tipo normal y el heterocigoto
N/C = entre el tipo normal y el homocigoto compacto
H/C = entre el tipo compacto heterocigoto y el homocigoto
Descripción de las características enumeradas en la Tabla 1
Plantas
Rata de crecimiento: longitud del tallo 44 días después de la siembra, medida desde el sustrato
Longitud del tallo con 15 entrenudos: longitud del tallo medida desde el sustrato sobre 15 entrenudos
Longitud del brote lateral: longitud entre el punto de unión del tallo principal y la punta del brote lateral 56 días después de la siembra
Número de entrenudos del brote lateral: número total de entrenudos del brote lateral 56 o 66 días después de la siembra
Hojas
Hoja 1: la 10ma hoja (altura de aproximadamente 1-1,5 m)
Hoja 2: la 11va hoja (altura de aproximadamente 1-1,5 m)
Longitud: la mayor longitud de la hoja desde el punto más bajo del lóbulo de la hoja hasta la punta de la hoja (diferente de la longitud de la hoja utilizada en el Protocolo de CPVO)
Anchura: la máxima anchura de la hoja (véase el Protocolo de CPVO en la bibliografía, y concretamente el texto del punto No.11 en "Explanations and Methods" del Anexo 1)Relación
longitud/anchura: la longitud de la hoja dividida por su anchura
Área del limbo de la hoja: 0,5 veces la anchura de la hoja por la longitud de la hoja, en cm2 Orientación: 1 es colgado verticalmente, 9 es horizontal
Intensidad del color verde: 1 es verde claro, 9 es verde oscuro
Abultado: 1 es muy desigual, 9 es una hoja plana
Fragilidad: una medida de la facilidad para romper la hoja con la mano; 1 es flexible, 9 es frágil
Flores
Longitud de los pétalos: longitud máxima de los pétalos desde el punto de unión hasta la punta
Anchura de los pétalos: anchura máxima de los pétalos Relación
Longitud/anchura de los pétalos: longitud de los pétalos dividida por su anchura
Frutas
Peso: peso medio de 2 frutos por planta en gramos, dividido por 2
Longitud: la longitud medida desde la inserción del pedúnculo en el fruto hasta la inserción de la flor en el fruto
Dado que las características compactas son tan evidentes, la Tabla 2 muestra los datos obtenidos mediante una comparación de las características visuales del tipo de pepino normal (largo) (utilizando Korinda como ejemplo), el tipo de pepino corto, el pepinillo y el tipo compacto (homocigoto). El cuadro 2 presenta un estudio de las diferencias y similitudes entre todos estos tipos de pepinos. La última columna da el solapamiento entre el tipo compacto homocigoto y el pepino (C/G) y entre el tipo compacto y el pepino corto (C/Sh). Como muchas de estas características no se superponen, se tiene aquí una clara ilustración de la combinación única de las características del tipo compacto. En la escala visual utilizada para este fin, 1 es la forma de expresión más baja o corta, y 9 es la forma de expresión más alta o larga, siendo las abreviaturas las mismas que en la Tabla 1.
En las primeras mediciones realizadas en estas plantas, también se encontró una diferencia significativa en el contenido de clorofila de las hojas de las plantas compactas homocigotas en comparación con el pepino largo normal (utilizando Korinda como ejemplo), lo que explica el color verde más oscuro de las hojas de las plantas con el gen compacto.
Para determinar el contenido de clorofila, se muestrearon aleatoriamente tres discos de hojas (tamaño de disco número 6) por muestra de hoja de plantas compactas homocigotas (muestras 1 y 4), plantas compactas heterocigotas (muestras 2, 5 y 6) y plantas de pepino largo normal ( muestras 3 y 7) cultivadas bajo condiciones de invernadero de verano holandesas estándar, a los 65 días después de la siembra. Los discos se colocaron en 5 ml de etanol y se diluyeron 1 vez. Se midió la absorción a 665 nm, cuyos resultados se muestran en la figura 3a. La absorción se convirtió en concentración de clorofila por gramo de tejido foliar mediante la siguiente conversión:
Concentración clorofila (ng/ml) = 25,13 x A665 x factor de dilución
Concentración clorofila (ng/ml) = 25,13 X A665 corregido x extracto de volumen x factor/masa de dilución Las concentraciones de clorofila de las muestras se muestran en la Figura 3b.
El color verde oscuro de las hojas de las plantas que comprenden el gen compacto se correlaciona de hecho con un contenido de clorofila significativamente mayor en las plantas compactas homocigóticas y heterocigóticas (más de 3.000 o 3.500 pg/gramo de hoja) en comparación con las plantas que carecen del gen compacto (menos de 3.000 pg/gramo de hoja). El contenido de clorofila de las hojas puede, por lo tanto, utilizarse también como una característica compacta para identificar las plantas de acuerdo con la invención y para diferenciar dichas plantas de las plantas normales que carecen del gen compacto.
Ejemplo 2 - Caracterización con base en marcadores de ADN
La localización del gen compacto en el genoma del pepino también puede demostrarse con la ayuda de marcadores moleculares.
El gen compacto fue mapeado mediante un análisis AFLP (véase P. Vos et al., 1995).
Para el análisis AFLP se empleó la muy utilizada combinación de enzimas de restricción EcoRI/Msel. La letra E de EcoRI y la letra M de Msel se indican en el nombre del marcador como es práctica general en la bibliografía. El código que viene después de la letra E o M corresponde a los nucleótidos selectivos en el sitio 3' terminal de los cebadores EcoRI y Msel, como es igualmente la práctica estándar (véase la lista disponible con los códigos AFLP en los sitios web www.keygene.com/keygene/pdf/KF Primer enzyme combinations. pdf y http://wheat.pw.usda.gov/ggpages/keygeneAFLPs.html).
Para la enzima de restricción EcoRI (E), por ejemplo, los nucleótidos selectivos en el extremo 3' (-3) y los códigos de cebadores correspondientes son los siguientes:
Cebadores 0 ii E00
Cebadores 1 ¡A-3 E01
¡C-3 E02
¡G-3 E03
¡T-3 E04
Cebadores 2 ¡AA-3 E11
¡AC-3 E12
¡AG-3 E13
¡AT-3 E14
¡CA-3 E15
¡CC-3 E16
¡CG-3 E17
¡CT-3 E18
¡GA-3 E19
¡GC-3 E20
¡GG-3 E21
¡GT-3 E22
¡TA-3 E23
¡TC-3 E24
¡TG-3 E25
¡TT-3 E26
Cebadores 3 ¡AAA-3 E31 ¡GAA-3 E63
(continuación)
¡AAC-3 E32 ¡GAC-3 E64
¡AAG-3 E33 ¡GAG-3 E65
¡AAT-3 E34 ¡GAT-3 E66
¡ACA-3 E35 ¡GCA-3 E67
¡ACC-3 E36 ¡GCC-3 E68
¡ACG-3 E37 ¡GCG-3 E69
¡ACT-3 E38 ¡GCT-3 E70
¡AGA-3 E39 ¡GGA-3 E71
¡AGC-3 E40 ¡GGC-3 E72
¡AGG-3 E41 ¡GGG-3 E73
¡AGT-3 E42 ¡GGT-3 E74
¡ATA-3 E43 ¡GTA-3 E75
¡ATC-3 E44 ¡GTC-3 E76
¡ATG-3 E45 ¡GTG-3 E77
¡ATT-3 E46 ¡GTT-3 E78
¡CAA-3 E47 ¡TAA-3 E79
¡CAC-3 E48 ¡TAC-3 E80
¡CAG-3 E49 ¡TAG-3 E81
¡CAT-3 E50 ¡TAT-3 E82
¡CCA-3 E51 ¡TCA-3 E83
¡CCC-3 E52 ¡TCC-3 E84
¡CCG-3 E53 ¡TCG-3 E85
¡CCT-3 E54 ¡TCT-3 E86
¡CGA-3 E55 ¡TGA-3 E87
¡CGC-3 E56 ¡TGC-3 E88
¡CGG-3 E57 ¡TGG-3 E89
¡CGT-3 E58 ¡TGT-3 E90
¡CTA-3 E59 ¡TTA-3 E91
¡CTC-3 E60 ¡TTC-3 E92
¡CTG-3 E61 ¡TTG-3 E93
¡CTT-3 E62 ¡TTT-3 E94
La misma codificación se utiliza para otras enzimas, salvo que la letra E se sustituye por una letra que hace referencia a una enzima de restricción diferente, tal como (MseI).
Junto a este código, el nombre incluye el tamaño del marcador. Por ejemplo, E14/M61-M873.6 es un marcador AFLP que forma una banda de aproximadamente 863,6 pares de bases con los cebadores E14 y M61 en AFLP. Hay que tener en cuenta que se sabe por la técnica anterior que el tamaño del marcador puede variar ligeramente con el procedimiento de detección utilizado (radiactivo frente a fluorescente). Con base en lo dicho anteriormente, una persona familiarizada con AFLP puede reproducir estos marcadores.
Para los marcadores AFLP utilizados aquí, las secuencias de los cebadores son las siguientes, en la lista de secuencias apropiada, con los nucleótidos selectivos 3' dados después de la línea vertical:
E17: 5'- GAC TGC GTA CCA ATT C|CG - 3' (SEQ ID No. 1)
E24: 5'- GAC TGC GTA CCA ATT C|TC - 3' (SEQ ID No. 2)
E14: 5'- GAC TGC GTA CCA ATT C|AT - 3' (SEQ ID No. 3)
E19: 5'- GAC TGC GTA CCA ATT C|GA - 3' (SEQ ID No. 4)
E16: 5'- GAC TGC GTA CCA ATT C|CC - 3' (SEQ ID No. 5)
M54: 5'- GAT GAG TCC TGA GTA A|CCT - 3' (SEQ ID No. 6)
M49: 5'- GAT GAG TCC TGA GTA A|CAG-3' (SEQ ID No. 7)
M61: 5'- GAT GAG TCC TGA GTA A|CTG-3' (SEQ ID No. 8)
M50: 5'- GAT GAG TCC TGA GTA A|CAT - 3' (SEQ ID No. 9)
M47: 5'- GAT GAG TCC TGA GTA A|CAA - 3' (SEQ ID No. 10)
Se llevó a cabo un cribado para el pepino largo, utilizando la estrategia de agrupamiento del análisis de segregantes en bloque (BSA) para identificar los marcadores acoplados al locus 4001. Se probaron 256 combinaciones diferentes de cebadores AFLP en poblaciones de dobles haploides y líneas endogámicas de la planta 4001. Sin embargo, no se identificaron marcadores estrechamente acoplados en el pepino largo.
A continuación, se procedió a la identificación del marcador del tipo 4001 en un antecedente diferente. El gen compacto estaba localizado en un único locus. Se trata de una característica monogénica o, -aunque es poco probable- de varios genes estrechamente acoplados. Para el mapeado fino del gen compacto (los marcadores están a poca distancia del locus), se cruzó una planta de pepino homocigota para el locus 4001 (homocigota compacto) con una planta de pepino corto. Dado que la distancia genética entre el pepinillo, el pepino corto y el pepino largo es relativamente grande, hay más marcadores presentes en los descendientes de los híbridos formados entre el pepino largo y el pepinillo o el pepino corto en la región alrededor del gen compacto. Aquí se probaron 126 individuos F2 después de la introducción con base en la hibridación en el fondo de pepino corto (autopolinización de una planta F1 de la hibridación de 4001 con Manar F1, que es un tipo de pepino corto). Se utilizaron 128 combinaciones diferentes de cebadores AFLP en el cribado de BSA. Los marcadores identificados en este proyecto se siguieron investigando, probándolos en más individuos de la misma población, concretamente en 632 individuos F2 (individuos F1 endogámicos procedentes de la hibridación de 4001 con Manar F1).
Después de este trabajo, destinado a identificar los marcadores iniciales acoplados al locus 4001, se cribó una gran población compuesta por 4.180 individuos, utilizando 2 marcadores (ensayo de genotipado SNP TaqMan® de alto rendimiento), que cubrían una región de aproximadamente 12 cM con el gen 4001 en ella. Estos marcadores son polimórficos entre el pepino largo y el corto y pueden utilizarse, en caso de hibridación entre el pepino largo y el corto, para seguir la región con el gen 4001 (el gen compacto) y para identificar recombinantes para el mapeo fino del gen. Se utilizaron dos marcadores codominantes de flanqueo, es decir, marcadores que reconocen ambos alelos (el de tipo salvaje y el 4001) y que, por tanto, pueden distinguir entre plantas con el gen 4001 en estado heterocigoto y plantas con el mismo gen en estado homocigoto, siendo las pruebas realizadas las siguientes:
MAS4: prueba con 1 marcador de flanqueo (derivado del marcador AFLP E23M49_M373.0):
GCATGCATGGACTGACTTACTAGA (cebador MAS4-f, SEQ ID No. 11) GGAGACTCACATATCTTTCTGACACA (cebador MAS4-r, SEQ ID No. 12)
Estos dos cebadores se utilizaron en la PCR, donde se añadieron las siguientes muestras etiquetadas: VIC-CTAACTGCAAAAACAATGT (esta sonda reconoce el tipo normal, que no contiene el gen compacto, y el tipo de planta compacta heterocigota, SEQ ID n° 13), y
FAM-AACTGCAAAAGCAATGT (esta sonda reconoce el tipo de planta compacta heterocigota y homocigota, SEQ ID No. 14).
MAS37: prueba con otro marcador de flanqueo (derivado del marcador AFLP E23M80_M433.3):
AGGATCACCTGATGTTCAAGGAGTA (cebador MAS37-f, SEQ ID No. 15) CGATGATAGTTGGAAGGATGGA (cebador MAS37-r, SEQ ID No. 16)
Estos dos cebadores se utilizaron en la PCR y se añadieron las siguientes sondas marcadas: VIC -TATGGACGACTTTCATGTAG (esta sonda reconoce el tipo normal (que no contiene el gen compacto) y el tipo de planta compacta heterocigota, SEQ ID No. 17) y
FAM-TGGACGACTTTGATGTAG (esta sonda reconoce el tipo de planta compacta heterocigota y homocigota, SEQ ID No. 18).
La detección se basó en las señales de las sondas, como es bien conocido en la técnica anterior para este tipo de ensayo.
Estas pruebas indican si el ADN analizado contenía el ADN de tipo silvestre homocigótico, de tipo compacto heterocigótico y de tipo compacto homocigótico para cualquiera de los 2 marcadores que flanquean el gen compacto.
Estos ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con el protocolo estándar de Applied Biosystems para la detección de recombinantes (Taqman® SNP genotyping MGB assays, véase, por ejemplo, www.appliedbiosystems.com).
Los 491 recombinantes identificados fueron investigados más a fondo, y se encontró que 137 individuos mostraban recombinación cerca del locus 4001. A continuación, se realizó un análisis de segregantes voluminosos (BSA) en 4 agrupaciónes con ventanas de cribado muy pequeñas de 2,0 y 2,4 cM, respectivamente, para identificar marcadores acoplados tanto cis (tipo 4001) como trans (tipo normal) en el dominio correspondiente. En total, se realizaron 512 combinaciones de cebadores EcoRI/MseI AFLp en los 4 agrupaciones.
Los marcadores candidatos identificados por el procedimiento BSA se mapearon determinando el genotipo de los 137 recombinantes cercanos para estos marcadores.
Todas las puntuaciones, tanto las genotípicas como las fenotípicas, se verificaron en los individuos F3, a partir de los cuales se obtuvieron las puntuaciones de la línea F3, que dieron una puntuación F2 inequívoca. La verificación del fenotipo se llevó a cabo en una selección de los 137 recombinantes cercanos. La selección consistió en 126 líneas de plantas F3. El fenotipado se realizó en 15 individuos por cada línea de plantas F3. Tras la localización precisa del locus 4001, se verificaron las puntuaciones del marcador en 64 líneas de plantas F3. Para ello, se sembraron 15 individuos por línea. De ellos, se aisló el ADN y se determinó el genotipo de 15 individuos por la línea de plantas F3 para los dos marcadores de alto rendimiento. Tras el análisis de los genotipos resultantes, se seleccionaron 4 individuos por la línea de plantas F3, en los que estaba representada cada clase genética, es decir, el homocigoto 4001, el heterocigoto 4001 y el homocigoto tipo normal. Todos los marcadores AFLP EcoRI/MseI estrechamente acoplados se probaron en estos 64 x 4 individuos, de los que se pudieron derivar un genotipo F2 fiable para los marcadores, de modo que las recombinaciones pudieran determinarse con precisión.
Para algunos de los marcadores se genotiparon 12 plantas individuales más de la línea F3 para estos marcadores con el fin de obtener una puntuación inequívoca.
Los datos obtenidos dan un mapa genético fiable del locus 4001, mostrado en la Figura 1. La localización de los marcadores AFLP encontrados indica el locus 4001 (locus compacto).
Los marcadores acoplados flanqueantes fueron así encontrados con la ayuda del procedimiento AFLP. El marcador de flanqueo E14/M61_M873.6 se encuentra en esta población a una distancia de 0,05 cM del locus compacto, y el marcador de flanqueo E19/M50_M280.2 se encuentra en esta población a una distancia de 0,67 cM del locus compacto. Estos marcadores no son polimórficos en el pepino largo.
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Claims (6)

REIVINDICACIONES
1. Planta de pepino del tipo de pepino largo que comprende el gen compacto obtenible a partir de semillas depositadas bajo el número NCIMB 41266 en forma heterocigota,
cuya planta de pepino -debido a la expresión de este gen compacto- se diferencia del tipo de planta de pepino largo que carece del gen compacto, por presentar una combinación de las siguientes características fenotípicas: brotes laterales más cortos, entrenudos más cortos, hojas más pequeñas, flores más pequeñas y frutos más cortos,
y en la que el gen compacto está flanqueado por el marcador AFLP E14/M61_M873.6, amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 3 y SEQ iD NO: 8, y el marcador AFLP E19/M50_M280.2, amplificado con el par de cebadores SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 9.
2. La planta de acuerdo con la reivindicación 1, en la que la planta de pepino es una planta indeterminada.
3. Semillas a partir de las cuales se puede cultivar una planta de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en las que dichas semillas comprenden el gen compacto en forma heterocigótica.
4. Frutos de pepino cosechados de una planta de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en los que dichos frutos comprenden el gen compacto en forma heterocigótica.
5. Procedimiento para cultivar plantas de pepino de la reivindicación 1 o 2 en el invernadero mediante el cultivo en altura de una manera menos intensiva en mano de obra, en el que se retiene al menos 20 % más de tallos per m2 que en el cultivo del tipo largo de pepino que carece del gen compacto, como la variedad Korinda.
6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que las plantas se cultivan con una densidad de tallos superior a 2,2 tallos porm2, preferentemente entre 2,6 y 2,8 tallos por m2.
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