ES2881383T3 - Células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras y procedimientos - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la prevención de una infección causada por un patógeno o la toxicidad de la exposición a una toxina, la composición comprende células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras (IP-MSC) que expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno o toxina; las IP-MSC se transfectan con uno o más vectores episomales que codifican múltiples polipéptidos inmunorreactivos expresables que se dirigen específicamente al patógeno o toxina; en la que cada polipéptido inmunorreactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una región de unión a antígeno de un anticuerpo neutralizante específico para un antígeno producido por el patógeno o específico para la toxina, o una secuencia de aminoácidos de una variante de la secuencia de la región de unión a antígeno que comprende una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la misma y que comparte al menos alrededor del 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la región de unión a antígeno; estando la secuencia de la región de unión al antígeno o la variante de la misma dispuesta para unirse específicamente al patógeno o la toxina y neutralizarlos; y en la que el vector episomal incluye opcionalmente un gen de apoptosis inducible, en la que los polipéptidos inmunorreactivos se seleccionan entre un anticuerpo de longitud completa, un fragmento variable monocatenario de anticuerpo (ScFV), un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo monovalente (Fab) un fragmento divalente de unión a antígeno del anticuerpo (F(ab')2), un diacuerpo y un triacuerpo, y opcionalmente en la que las IP-MSC también expresan uno o más agentes inmunomoduladores, en la que el uno o más agentes inmunomoduladores se seleccionan entre interleucinas e interferones; opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno viral, un patógeno bacteriano, un patógeno parasitario unicelular o un patógeno parasitario multicelular; opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno viral seleccionado del grupo que consiste en: un adenovirus; un papilomavirus; un hepadnavirus; un parvovirus; un poxvirus; un virus de Epstein-Barr; un citomegalovirus (CMV); un virus del herpes simple; un roseolovirus; un virus de la varicela zoster; un filovirus; un paramixovirus un ortomixovirus; un rabdovirus; un arenavirus; un coronavirus; un enterovirus humano; un virus de la hepatitis A; un rinovirus humano; un virus de la poliomielitis; un retrovirus; un rotavirus; un flavivirus; un hepacivirus; y un virus de la rubeola; opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno bacteriano de un género seleccionado del grupo que consiste en: Bacillus; Bordetella; Borrelia; Brucella; Burkholderia; Campylobacter; Chlamydia, Chlamydophila; Clostridium; Corynebacterium; Enterococcus; Escherichia; Francisella; Haemophilus; Helicobacter; Legionella; Leptospira; Listeria; Mycobacterium; Mycoplasma; Neisseria; Pseudomonas; Rickettsia; Salmonella; Shigella; Staphylococcus; Streptococcus; Treponema; Vibrio ; y Yersinia; opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno parasitario seleccionado del grupo que consiste en: Acanthamoeba; Anisakis; Ascaris lumbricoides; Balantidium coli; Cestoda (tenia); niguas; Cochliomyia hominivorax; Entamoeba histolytica; Fasciola hepatica; Giardia lamblia; Anquilostoma; Leishmania; Linguatula serrata, Parásito hepático; Loa loa; Paragonimus (Gripe del pulmón); Oxiuros; Plasmodium falciparum; Schistosoma; Strongyloides stercoralis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma ; Whipworm; y Wuchereria bancrofti; y opcionalmente, en la que el vector episomal comprende un casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBVNA1).

Description

DESCRIPCIÓN

Células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras y procedimientos

Campo de la invención

La presente divulgación se refiere a una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento o la prevención de una infección causada por un patógeno o de la toxicidad derivada de la exposición a una toxina, la composición que comprende células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras (IP-MSC) que expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno o toxina. Esta divulgación también se refiere a las células madre mesenquimales (MSC) primarias para la entrega de polipéptidos que son inmunorreactivos contra agentes patológicos tales como patógenos y toxinas, así como los procedimientos para la preparación de tales MSC y el despliegue de dichas MSC contra agentes patológicos.

Incorporación al listado de secuencias

La información de la secuencia biológica para esta solicitud está incluida en un archivo de texto ASCII con el nombre de archivo "TU-491-SEQ.txt", creado el 11 de marzo de 2013, y con un tamaño de archivo de 12.954 bytes.

Antecedentes

Las células madre mesenquimales (MSC) son células progenitoras multipotentes únicas que actualmente se están explotando como vectores de terapia génica para una variedad de afecciones, incluyendo el cáncer y las enfermedades autoinmunes. Aunque las MSC son conocidas predominantemente por sus propiedades antiinflamatorias durante el trasplante alogénico de MSC, existen pruebas de que las MSC pueden realmente promover la inmunidad adaptativa en determinados contextos. Las MSC se han identificado en una gran variedad de tejidos, como la médula ósea, el tejido adiposo, la placenta y la sangre del cordón umbilical. El tejido adiposo es una de las fuentes más ricas conocidas de MSC.

Las MSC se han trasplantado con éxito en huéspedes alogénicos en una variedad de entornos clínicos y preclínicos. Estas MSC de donantes suelen promover la inmunotolerancia, incluida la inhibición de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) que puede desarrollarse tras un trasplante de células o tejidos de un donante no compatible con el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). La disminución de los síntomas de EICH tras la transferencia de MSC se ha debido a la inhibición directa por parte de las MSC de la proliferación de células T y B, la citotoxicidad de las células asesinas naturales en reposo y la maduración de las células dendríticas (DC). Al menos un estudio ha informado de la generación de anticuerpos contra las MSC alogénicas trasplantadas. Sin embargo, la capacidad de prevenir la EICH también sugiere que las MSC que expresan antígenos extraños podrían tener una ventaja sobre otros tipos de célulasfes decir, DC) durante una vacunación celular al inducir selectivamente respuestas inmunitarias sólo contra el antígeno o antígenos extraños expresados por las MSC y no específicamente contra las MSC del donante.

También se ha explorado el uso de MSC modificadas in vivo para mejorar las propiedades inmunomoduladoras de las MSC. Las MSC transducidas para sobreproducir IL-10 suprimieron la artritis inducida por colágeno en un modelo de ratón (Choi et al., 2008). Además, las MSC que expresan péptido similar al glucagón-1 trasplantadas en un modelo de ratón con enfermedad de Alzheimer provocaron una disminución de la deposición de A-beta en el cerebro (Klinge et al., 2011). En un modelo de ratón con osteopenia, los ratones que recibieron MSC transducidas que tenían una sobreexpresión estable de la proteína morfogenética ósea tuvieron una mayor densidad ósea (Kumar et al., 2010). En un modelo de rata de lesión medular, las ratas tratadas con MSC que sobreexpresan de forma estable el factor neurotrófico derivado del cerebro tuvieron un mejor resultado general que las ratas a las que se les administró únicamente MSC (Sasaki et al., 2009). Por último, en un modelo de rata para la obstrucción de la salida de la vejiga, las ratas que recibieron MSC transducidas con una sobreexpresión estable del factor de crecimiento de los hepatocitos tuvieron una menor acumulación de colágeno en la vejiga (Song et al., 2012). Estos estudios indican que las MSC modificadas son un vehículo útil y factible para la expresión y el suministro de proteínas dirigidas a diversas enfermedades y tejidos.

Las MSC se han estudiado como vehículo de entrega de terapias anticancerígenas debido a su tendencia innata a alojarse en microambientes tumorales, y se revisa a fondo en (Loebinger y Janes, 2010). Las MSC también se han utilizado para promover la apoptosis de las células tumorales mediante la expresión de IFNa o IFN^y (Li et al., 2006; Ren et al., 2008). Además, recientemente se han explorado las MSC para la prevención e inhibición de la carcinogénesis y la metástasis. Un estudio realizado por Wei et a l. examinó el uso de MSC inmortalizadas por el virus del papiloma humano (VPH) que expresan las proteínas E6/E7 del VPH, combinadas con una vacuna de proteína de fusión E7 modificada en un modelo tumoral de ratón en el que se administraron células de fibrosarcoma metastásico (Wei et al., 2011). Este grupo descubrió que sólo los ratones que fueron inmunizados tanto con las MSC que expresan E7 como con la vacuna de proteína E7 modificada mostraron una disminución del crecimiento del tumor, y una respuesta de anticuerpos específicos contra E7. Los ratones que recibieron las MSC o la vacuna proteica sola no fueron capaces de suscitar una respuesta anti-E7 ni de inhibir el crecimiento tumoral del sarcoma metastásico. Aunque se determinó previamente que estas MSC inmortalizadas no eran carcinogénicas, persistieron en los ratones más de 21 días, a diferencia de las MSC primarias (es decir, las no inmortalizadas), que sólo son detectables durante un tiempo muy corto tras su administración (Gao et al., 2001; Abraham et al., 2004; Ohtaki et al., 2008; Prockop, 2009). Por lo tanto, puede haber resultados imprevistos a largo plazofes decir, superar la competencia con las MSC endógenas y las diferentes capacidades inmunomoduladoras, que no se evaluaron en este estudio) con el uso de MSC inmortalizadas, incluso si resultan ser no malignas. Otros estudios han indicado que las MSC inmortalizadas pueden volverse carcinogénicas, por lo que deben estudiarse cuidadosamente para determinar si su uso es realmente seguro. Las MSC primarias no inmortalizadas trasplantadas sólo persisten como máximo unos días in vivo (Gao et al., 2001; Abraham et al., 2004; Ohtaki et al., 2008; Prockop, 2009).

Aunque las MSC se promocionan principalmente por sus propiedades inmunosupresoras, varios informes publicados también han demostrado directamente que las MSC promueven la inmunidad adaptativa. En cocultivos, las MSC aumentaron la proliferación de células B, la expresión de IL-6 y la formación de células plasmáticas secretoras de IgG in vitro; estas respuestas de las células B pudieron aumentar aún más con las MSC combinadas con un agonista de los TLR (lipopolisacárido o ADN CpG). Las MSC pulsadas con toxoide tetánico promovieron la proliferación y la expresión de citoquinas (IL-4, IL-10, IFN^y) de una línea de células T CD4 específicas de toxoide tetánico. Del mismo modo, las MSC cultivadas en proporciones bajas (1:100) con linfocitos en presencia de antígeno mejoraron la proliferación de linfocitos y la formación del subconjunto CD4 Th17, que fue parcialmente dependiente de IL-6 y TGFp. También se ha descubierto que las MSC expresan el MHC-I y el antígeno cruzado para la expansión de las células T CD8 tanto in vitro como in vivo.

También se ha descubierto que la inmunorregulación de las MSC depende de señales externas. En presencia de citoquinas inflamatorias o estimulantes, la terapia con MSC, que antes era supresora, puede convertirse en inmunoestimuladora. Por ejemplo, las MSC tratadas con moléculas específicas de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) pueden volverse anti o proinflamatorias, dependiendo del PAMP con el que sean tratadas in vitro. Durante la artritis inducida por colágeno, un escenario de enfermedad inflamatoria, el trasplante de MSC alogénicas supuestamente aumentó las respuestas inmunitarias Th1 y la secreción de IL-6, que fue imitada in vitro por la estimulación directa de TNFa de las MSC. La administración de MSC también exacerbó la artritis inducida por colágeno y amplió la secreción de IL-6 e IL-17 por parte de los esplenocitos. El pretratamiento de las MSC con IFNy (dentro de un rango moderado) supuestamente regula la expresión de MHC-I y II y mejora la capacidad de fagocitosis y presentación de antígenos, estimulando así la proliferación de células T CD4 y CD8+ y la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) antitumorales.

Las vacunas suelen ser un medio eficaz y rentable de prevenir las enfermedades infecciosas. Las vacunas han demostrado un potencial transformador en la erradicación de una enfermedad devastadora, la viruela, al tiempo que ofrecen la posibilidad de controlar otras enfermedades, como la difteria, la poliomielitis y el sarampión, que antes causaban una morbilidad y mortalidad generalizadas. El desarrollo de las vacunas implica el ensayo de una versión atenuada o inactivada del patógeno o la identificación de un componente patógenofes decir, vacunas de subunidades, toxoides y partículas similares a virus) que provoque una respuesta inmunitaria que proteja a los receptores de la enfermedad cuando se expongan al patógeno real. En un mundo ideal, una sola vacuna podría dirigirse a todos los principales patógenos humanos (versátiles), provocar una fuerte inmunidad protectora contra estos patógenos sin inducir efectos secundarios no deseados, y seguir siendo bastante económica de producir por dosis. En el caso de los virus o de las proteínas producidas por la célula huésped, la producción de vacunas que incluye el procesamiento postraduccional humano, imitando la infección natural, probablemente resultará superior a los sistemas de expresión bacterianos o de otro tipo.

Los enfoques tradicionales de las vacunas han fracasado hasta ahora en proporcionar protección contra el VIH, la tuberculosis, la malaria y muchas otras enfermedades, como el dengue, el herpes e incluso el resfriado común. Las razones por las que los enfoques tradicionales de las vacunas no han tenido éxito en estas enfermedades son complejas y variadas. Por ejemplo, el VIH integra genomas provirales funcionales en el ADN de las células huésped, estableciendo así la latencia o la persistencia. Una vez establecida la latencia/persistencia, no ha sido posible erradicar el VIH, ni siquiera con la terapia antirretroviral altamente activa.

Los enfoques de inmunización alternativos más recientes incluyen vacunas de ADN y celulares. Las vacunas de ADN implican la transfección de células en el lugar del tejido donde se va a vacunar con un plásmido que codifica el antígeno y que permite a las células locales (por ejemplo, los miocitos) producir el antígeno de la vacuna in situ. Las vacunas celulares utilizan la transferencia directa de células presentadoras de antígeno del huésped prepulsadas o transfectadas (por ejemplo, células dendríticas, DC) que expresan o presentan el antígeno de la vacuna. La ventaja de estos enfoques es que los antígenos de las vacunas se producen in vivo y están fácilmente disponibles para el procesamiento inmunológico. A pesar de los numerosos informes sobre el éxito de las pruebas preclínicas, ambos enfoques se han topado con obstáculos. Los estudios de vacunación con ADN en humanos muestran una escasa eficacia, que se ha relacionado con las diferencias innatas entre los ratones y los humanos (Cavenaugh et al., 2011; Wang et al., 2011). Las estrategias de vacunación con DC han mostrado un éxito clínico limitado para las vacunas terapéuticas contra el cáncer y tienen altos costes de producción debido a la necesaria adaptación individual (Bhargava et al., 2012; Palucka y Banchereau, 2012).

El documento US 2007/196365 describe variantes de cadena pesada de inmunoglobulina expresadas en células mesenquimales y usos terapéuticos de las mismas. El documento US 2007/160585 describe un remedio para la enfermedad priónica que contiene una célula madre mesenquimal como ingrediente activo y un procedimiento de producción del mismo. Yan et al., (Mol. Pharmaceutics, 2013, 10, 1, 142-151) describe las células madre mesenquimales del cordón umbilical humano como vehículos de administración de la proteína de fusión TRAIL específica de CD20 contra el linfoma no Hodgkin. El documento US 7101704 describe una célula madre mesenquimal y/o una célula del linaje de los adipocitos que (i) ha sido modificada para tener al menos un antígeno exógeno unido a al menos una molécula de superficie primaria de dicha célula de manera que dicho al menos un antígeno puede iniciar una respuesta inmunitaria y (ii) también expresa al menos una molécula coestimuladora. Ren et al., (Stem Cells, 2013, 26, 2332-2338) describen el potencial terapéutico de las células madre mesenquimales productoras de interferón-a en un modelo de metástasis pulmonar de melanoma en ratón. Wei et al., (Mol. Thera., 2011, 19, 12, 2249-2257) describe una plataforma inmunoterapéutica que utiliza células madre mesenquimales dirigidas a tumores y una vacuna proteica. El documento US 2005/058983 describe un anticuerpo humano, y una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la proteína gp120 del VIH-1 y que tiene actividad neutralizadora del VIH-1. El documento US 2010/226912 describe el uso de células madre embrionarias derivadas de aves en la producción de glicoproteínas como los anticuerpos. Tomchuck et al., (Cell. Infectados. Microbiol, 2012, 2, 140) describe las células madre mesenquimales como plataforma de vacunas. El documento US 2008/014205 describe procedimientos para identificar, producir y diseñar anticuerpos neutralizantes contra los virus de la gripe A. Balyasnikova et al., (J Tissue Eng. Regen. Med., 2010, 4, 247-258) describe la modificación genética de células madre mesenquimales para que expresen un anticuerpo monocatenario contra el EGFRvIII en la superficie celular. Compte et al., (Stem Cells, 2009, 27, 753-760) describen la inmunoterapia tumoral utilizando células madre mesenquimales humanas modificadas genéticamente y cargadas en andamios de matriz extracelular sintética. Frank et al., (Stem Cells, 2010, 28, 2084-2087) describen las células madre como una plataforma emergente para la terapia del cáncer con anticuerpos.

Otra limitación de la tecnología de vacunas actual es el tiempo que conlleva el desarrollo de una vacuna contra un patógeno dado. Esto es especialmente problemático en el caso de la exposición a nuevos patógenos emergentes y a patógenos y toxinas liberados deliberada o accidentalmente, donde se necesitan medios de protección rápida para contener dichos patógenos emergentes y amenazas biológicas. Los procedimientos y las MSC transfectadas episomalmente que se describen en este documento responden a estas necesidades.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la prevención de una infección causada por un patógeno o de la toxicidad de la exposición a una toxina, comprendiendo la composición células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras (IP-MSC) que expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno o a una toxina; las IP-MSC se transfectan con uno o más vectores episomales que codifican múltiples polipéptidos inmunorreactivos expresables que se dirigen específicamente al patógeno o a la toxina; donde cada polipéptido inmunorreactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una región de unión a antígeno de un anticuerpo neutralizante específico para un antígeno producido por el patógeno o específico para la toxina, o una secuencia de aminoácidos de una variante de la secuencia de la región de unión a antígeno que comprende una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la misma y que comparte al menos alrededor del 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la región de unión a antígeno; la secuencia de la región de unión al antígeno o la variante de la misma está dispuesta para unirse específicamente al patógeno o a la toxina y neutralizarlos; y en el que el vector episomal incluye opcionalmente un gen de apoptosis inducible, en el que los polipéptidos inmunorreactivos se seleccionan entre un anticuerpo de longitud completa, un fragmento variable monocatenario de anticuerpo (ScFV), un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo monovalente (Fab) un fragmento divalente de unión a antígeno del anticuerpo (F(ab')2), un diacuerpo y un tricuerpo, y opcionalmente en el que las IP-MSC también expresan uno o más agentes inmunomoduladores, en el que el o los agentes inmunomoduladores se seleccionan entre interleucinas e interferones; opcionalmente, donde el patógeno es un patógeno viral, un patógeno bacteriano, un patógeno parasitario unicelular o un patógeno parasitario multicelular; opcionalmente, donde el patógeno es un patógeno viral seleccionado del grupo que consiste en: un adenovirus; un papilomavirus; un hepadnavirus; un parvovirus; un virus de la viruela; un virus de Epstein-Barr; un citomegalovirus (CMV); un virus del herpes simple; un roseolovirus; un virus de la varicela zoster; un filovirus; un paramixovirus; un ortomixovirus; un rabdovirus; un arenavirus un coronavirus; un enterovirus humano; un virus de la hepatitis A; un rinovirus humano; un virus de la poliomielitis; un retrovirus; un rotavirus; un flavivirus; un hepacivirus; y un virus de la rubeola; opcionalmente, el patógeno es un patógeno bacteriano de un género seleccionado del grupo que consiste en: Bacillus; Bordetella; Borrelia; Brucella; Burkholderia; Campylobacter; Chlamydia, Chlamydophila; Clostridium; Corynebacterium; Enterococcus; Escherichia; Francisella; Haemophilus; Helicobacter; Legionella; Leptospira; Listeria; Mycobacterium; Mycoplasma; Neisseria; Pseudomonas; Rickettsia; Salmonella; Shigella; Staphylococcus; Streptococcus; Treponema; Vibrio; y Yersinia; opcionalmente, el patógeno es un patógeno parasitario seleccionado del grupo que consiste en: Acanthamoeba; Anisakis; Ascaris lumbricoides; Balantidium coli; Cestoda (lombriz solitaria); niguas; Cochliomyia hominivorax; Entamoeba histolytica; Fasciola hepatica; Giardia lamblia; Anquilostoma; Leishmania; Linguatula serrata ; Loa loa; Paragonimus (lombriz pulmonar); Oxiuros; Plasmodium falciparum; Schistosoma; Strongyloides stercoralis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma; Whipworm; y Wuchereria bancrofti; y opcionalmente, el vector episomal comprende un casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBVNA1).

En una realización de la invención, la IP-MSC puede expresar episomalmente de 2 a aproximadamente 100 de los polipéptidos inmunorreactivos.

En otra realización de la invención, el uno o más agentes inmunomoduladores pueden seleccionarse entre IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IFNa, IFNp e IFNw.

En otra realización de la invención, uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos pueden comprender una secuencia de aminoácidos de la variante de la región de unión al antígeno, y en la que las sustituciones de la secuencia de aminoácidos de la variante comprenden sustituciones conservativas.

En una realización de la invención, uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos pueden comprender una secuencia de aminoácidos de la variante de la región de unión al antígeno, y en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comparte al menos alrededor del 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de la región de unión al antígeno.

En otra realización de la invención, el antígeno puede ser seleccionado del grupo que consiste en: Glicoproteína 1 (gp1) del virus de Lassa (LASV); glicoproteína 2 (gp2) del LASV; proteína asociada a la nucleocápside (NP) del lAsV; proteína L del LASV; proteína Z del LASV; hemaglutinina 1 de la gripe (HA1); hemaglutinina 2 de la gripe (HA2); neuraminidasa de la gripe (NA); La proteína S del virus del SARS; la GP2 del virus del Ébola; la proteína de fusión 1 (F1) del virus del sarampión; la proteína transmembrana (TM) del VIH-1; la glicoproteína 41 (gp41) del VIH-1; la glicoproteína 120 (gp120) del VIH-1; la glicoproteína de envoltura 1 (E1) del virus de la hepatitis C (VHC); la glicoproteína de envoltura 2 (E2) del VHC; Proteína de la nucleocápside del VHC (p22); glicoproteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental (VNO) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis japonesa (VEJ) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la fiebre amarilla (VFA) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (VET) (E); glicoproteína de envoltura 1 (E1) del virus de la hepatitis G (HGV); proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (RSV); proteína gD del virus del herpes simple 1 (HSV-1); proteína gG del HSV-1; proteína gD del HSV-2; proteína gG del HSV-2; proteína del núcleo del virus de la hepatitis B (HBV); Glicoproteína 125 (gp125) del virus de Epstein-Barr (VEB); factor de ensamblaje de la proteína de la membrana externa bacteriana BamA; proteína del módulo de ensamblaje de la translocación bacteriana TamA; proteína del dominio de la proteína asociada al transporte de polipéptidos bacterianos; antígeno de superficie bacteriana D15; proteína protectora del ántrax; factor letal del ántrax; factor de edema del ántrax; Salmonella typhii S1Da; Salmonella typhii SIDb; toxina del cólera; proteína de choque térmico del cólera; antígeno S de Clostridium botulinum ; toxina botulínica; Yersina pestis F1; antígeno V de Yersina pestis ; Yersina pestis YopH; Yersina pestis YopM; Yersina pestis YopD; Factor de activación del plasminógeno de Yersina pes tis (Pla); Proteína del circunsporozoito de Plasmodium (CSP); Proteína de superficie del esporozoito de Plasmodium (SSP2/TRAP); Antígeno 1 del estadio hepático de Plasmodium (LSA1); La proteína exportada 1 (EXP 1) de Plasmodium ; el antígeno de unión a eritrocitos 175 (EBA-175) de Plasmodium; el antígeno protector rico en cisteína (cyRPA) de Plasmodium; la proteína de choque térmico 70 (hsp70) de Plasmodium; la Sm29 de Schistosoma; y la proteína de transducción de la señal 14-3-3 de Schistosoma .

En otra realización de la invención, la IP-MSC puede expresar un polipéptido inmunorreactivo que comprende una secuencia de región de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno del virus de Lassa y lo neutraliza.

En una realización de la invención, las IP-MSC pueden prepararse a partir de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea o de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo.

En otra realización de la invención, el vector episomal puede comprender un casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBVNA1) y el origen de replicación OriP.

En otra realización de la invención, el vector episomal puede codificar un gen de apoptosis inducible.

En una realización de la invención, la activación del gen de apoptosis inducible puede ser controlada por un sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina.

La presente divulgación proporciona células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras (IP-MSC), que expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno (por ejemplo, una especie infecciosa de virus, bacteria o parásito) o una toxina, así como procedimientos de preparación y uso de las IP-MSC. Las IP-MSC se transfectan con uno o más vectores episomales que codifican dos o más (por ejemplo, de 2 a unos 100) polipéptidos inmunorreactivos expresables (por ejemplo, anticuerpos completos, fragmentos de anticuerpos variables de cadena simple (ScFV), fragmentos de anticuerpos Fab o F(ab')² , diacuerpos, tricuerpos y similares). Opcionalmente, la IP-MSC puede expresar uno o más polipéptidos inmunomoduladores, por ejemplo, una citoquina como una interleucina (por ejemplo, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9 e IL-12), un interferón (por ejemplo, IFNa, IFNp o IFNw), y similares, que pueden aumentar la eficacia de los polipéptidos de unión a antígeno para neutralizar el patógeno o la toxina. Cada polipéptido inmunorreactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una región de unión al antígeno de o de un anticuerpo neutralizante (por ejemplo, un anticuerpo nativo de un sujeto expuesto) específico para un antígeno producido por el patógeno o específico para la toxina, o comprende una secuencia de aminoácidos de una variante de la región de unión al antígeno que incluye una o más sustituciones (por ejemplo, sustituciones conservadoras) en la secuencia de aminoácidos de la misma, y que preferentemente comparte al menos un 50% de identidad de secuencia (por ejemplo, al menos un 60, 70, 80, 90 o 95% de identidad de secuencia) con la región de unión al antígeno nativa. Cada péptido de la región de unión al antígeno o su variante está dispuesto y orientado para unirse específicamente al patógeno o la toxina y neutralizarlos.

Como se describe en el presente documento, las IP-MSC expresan, por ejemplo, al menos 2, 3, 4, 5 o 6 polipéptidos inmunorreactivos, o hasta aproximadamente 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 polipéptidos inmunorreactivos, que se dirigen específicamente al patógeno o la toxina. Por ejemplo, cada polipéptido inmunorreactivo puede dirigirse y unirse específicamente a una proteína o fragmento de la misma de un organismo patógeno, o a una toxina (por ejemplo, ricina, abrina, toxina del ántrax, toxina botulínica), que puede ser producida por un organismo in situ o puede encontrarse en una forma químicamente aislada o purificada.

Las IP-MSC son útiles para generar inmunidad pasiva contra o tratar una infección por el patógeno o la exposición a la toxina (por ejemplo, por neutralización). Las IP-MSC pueden proporcionarse en un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, un tampón, como una solución salina tamponada con fosfato, o cualquier otro material tamponado adecuado para mantener las MSC primarias transfectadas viables) para su uso como composición farmacéutica para tratar o prevenir una enfermedad infecciosa causada por el patógeno o mejorar los efectos deletéreos de una toxina. Como se describe en el presente documento, las IP-MSC comprenden MSC derivadas de la médula ósea. Las IP-MSC comprenden células MSC adiposas, células MSC placentarias o células MSC de sangre de cordón umbilical.

Las IP-MSC descritas en la presente memoria son particularmente útiles para la protección pasiva temporal contra patógenos y toxinas, al menos en parte, porque las MSC primarias son células hipoinmunogénicas que generalmente no son el objetivo del sistema inmunitario. Así, las IP-MSC son toleradas por el sujeto tratado, permitiendo que las células sobrevivan durante un tiempo suficiente para que los polipéptidos inmunorreactivos se expresen, produzcan y liberen para unirse y neutralizar un organismo patógeno o una toxina a la que el sujeto haya estado o pueda estar expuesto. Además, las MSC primarias suelen tener un tiempo de vida limitado en el organismo, lo que mejora la posibilidad de que se produzcan efectos secundarios no deseados a largo plazo del tratamiento con las MSC (por ejemplo, carcinogenicidad), lo que puede ser un problema con las MSC inmortalizadas.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1 proporciona una ilustración esquemática de un anticuerpo IgG de longitud completa, un ScFV, un diacuerpo en tándem y un tricuerpo.

FIG. 2 ilustra esquemáticamente un vector episomal para transfectar MSC primarias como se describe en el presente documento (Panel A); y un vector bicistrónico utilizado para transfectar MSC adiposas humanas para expresar MAb anti-LASV humano GP19.7E (Panel B).

FIG. 3 ilustra las secuencias de nucleótidos de las cadenas pesadas de MAb anti-LASV IgG humana GP10.4B (SEQ ID NO: 1) y MAb anti-LASV humano GP19.7E (SEQ ID NO: 1).

FIG. 4 ilustra las secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras de MAb anti-LASV IgG humana GP10.4B (SEQ ID NO: 3) y MAb anti-LASV humano GP19.7E (SEQ ID NO: 4).

FIG. 5 ilustra las secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera de MAb anti-LASV IgG humana GP10.4B (HC: SEQ ID NO: 5; LC: SEQ ID NO: 7) y MAb anti-LASV humano GP19.7E (HC: SEQ ID NO: 6; LC: SEQ ID NO: 8).

FIG. 6 proporciona un gráfico del porcentaje de supervivientes frente al día posterior a la infección por el LASV para cobayas tratados con MAb anti-LASV IgG humano GP10.4B y MAb anti-LASV humano GP19.7E, en comparación con cobayas de control tratadas con medio sin anticuerpos.

Descripción detallada

Las células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras descritas en el presente documento expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno o toxina de interés. Cada polipéptido inmunorreactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una región de unión al antígeno de un anticuerpo neutralizante específico para un antígeno producido por el patógeno o específico para la toxina, o una secuencia de aminoácidos de una variante de la región de unión al antígeno que comprende una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la misma y que comparte al menos un 50% de identidad de secuencia con la región de unión al antígeno. La región de unión al antígeno o su variante está dispuesta y orientada para unirse específicamente al patógeno o la toxina y neutralizarlos, esdecir, cuando las IP-MSC entran en contacto con el patógeno o la toxina, por ejemplo, cuando las IP-MSC se administran a un sujeto y éste se expone al patógeno o la toxina. Las sustituciones en la variante pueden comprender o consistir en sustituciones conservadoras o, en algunos casos, sustituciones no conservadoras que aumentan la afinidad de unión o la selectividad de unión de la variante en relación con la región de unión al antígeno nativa, o que mejoran, aumentan o afectan de forma deseable a una o más propiedades de los polipéptidos inmunorreactivos, como una propiedad física, química o conformacional.

La IP-MSC puede utilizarse potencialmente contra cualquier patógeno o toxina para la que puedan identificarse anticuerpos neutralizantes. Las IP-MSC y los procedimientos descritos en la presente memoria son particularmente útiles para proporcionar una inmunidad pasiva relativamente rápida, pero a corto plazo (por ejemplo, hasta uno o dos meses) contra un patógeno o toxina. Dichos patógenos incluyen virus, bacterias, parásitos (unicelulares y pluricelulares) y otros similares. Por ejemplo, el IP-MSC puede utilizarse como agente protector en caso de liberación deliberada o accidental de un patógeno o toxina. Además, la IP-MSC contra determinados virus patógenos (por ejemplo, LASV, virus del Ébola, virus del Dengue), bacterias (Rickettsia typhi, Neisseria meningitidis, Borrelia spp., Vibrio cholerae , y similares) o parásitos (por ejemplo, Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Schistosoma , y similares) pueden utilizarse como protección temporal para los sujetos que viajan a zonas donde los patógenos son endémicos, o para la prevención de infecciones comúnmente adquiridas por los pacientes en los hospitales (por ejemplo, Staphylococcus Aureus resistente a la meticilina, Psuedomonas Aeruginosa, Enterococos resistentes a la vancomicina, Streptococcus pneumoniae , y similares).

Un factor importante que contribuye a las terapias diseñadas en torno a las MSC es la facilidad de aislamiento y expansión de las MSC en cultivo. En teoría, una sola cosecha de MSC de la médula ósea puede producir suficientes MSC para miles de aplicaciones clínicas, debido a su inherente capacidad de expansión (Newman et al., 2009). Este potencial de expansión mejora en gran medida la capacidad de fabricación GMP del uso de MSC para aplicaciones clínicas y tiene menores costes de producción en comparación con otros tipos de células.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido inmunorreactivo" y sus variaciones gramaticales se refieren a un polipéptido que incluye un péptido que codifica una región de unión al antígeno de un anticuerpo neutralizante contra el patógeno o la toxina de interés, o una variante de la región de unión al antígeno que conserva la especificidad para el patógeno o la toxina, pero difiere de una estructura nativa del anticuerpo por la presencia de una o más sustituciones (por ejemplo, una sustitución conservadora) en la secuencia de aminoácidos de la región nativa de unión al antígeno. Ejemplos no limitantes de polipéptidos inmunorreactivos incluyen anticuerpos de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgG), fragmentos de unión a antígeno de dichos anticuerpos de longitud completa y otros polipéptidos que incluyen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de dichos anticuerpos dispuestos y orientados para unirse a un antígeno. Los fragmentos funcionales de anticuerpos que se unen al antígeno incluyen los polipéptidos Fab, F(ab')2, Fv, ScFv, diacuerpo y tricuerpo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "región de unión a antígeno" se refiere al sitio de un anticuerpo que se une a un antígeno. La región de unión al antígeno está compuesta por los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena ligera (V^h y V^l), cada uno de los cuales incluye cuatro regiones marco conservadas (FR) y tres CDR. Las CDR varían en su secuencia y determinan la especificidad del anticuerpo frente a un antígeno concreto. Los dominios V^h y V^l forman juntos el sitio que se une específicamente a un antígeno particular.

Los fragmentos de anticuerpos Fab (fragmentos de unión a antígeno) son polipéptidos inmunorreactivos que comprenden dominios monovalentes de unión a antígeno de un anticuerpo compuesto por un polipéptido que consiste en una región variable de cadena pesada (V^h) y una porción de región constante de cadena pesada 1 (C^h1) y un polipéptido que consiste en una porción variable de cadena ligera (V^l) y una porción constante de cadena ligera (C^l), en la que las porciones CL y CH1están unidas entre sí, preferentemente por un enlace disulfuro entre residuos Cys.

Un fragmento de anticuerpo Fv es un dímero que contiene los dominios V^h y V^l.

Un fragmento F(ab')2 está compuesto por dos polipéptidos de tipo Fab unidos por un puente disulfuro entre las porciones CH1de los mismos.

Un ScFV ("fragmento variable monocatenario" o "anticuerpo monocatenario") es un polipéptido inmunorreactivo que comprende péptidos V^l y V^h unidos por un péptido de enlace flexible, generalmente hidrofílico, de longitud suficiente (generalmente de unos 15 aminoácidos) para permitir que el V^l y el V^h se asocien en una configuración de unión al antígeno. Un péptido de enlace flexible común es (Gly4Ser)3. Opcionalmente, la asociación de la V^h y la V^l puede ser estabilizada por uno o más enlaces disulfuro intermoleculares.

Tal como se utiliza en el presente documento y como se entiende comúnmente en la técnica, el término "diabodia" se refiere a un polipéptido inmunorreactivo que comprende (a) dos ScFV unidos entre sí por un péptido corto o un enlace entre dos ScFV (p. ej, entre las porciones V^l) para formar un ScFV dimérico en tándem o (b) un complejo que comprende dos polipéptidos similares a ScFV en el que el péptido de enlace es demasiado corto para permitir la interacción directa entre la V^l y la V^h de la misma cadena polipeptídica, de modo que dos de estas moléculas se ven obligadas a asociarse intermolecularmente como un dímero. Los dos dominios de unión al antígeno del diacuerpo pueden ser específicos para el mismo antígeno o para dos antígenos diferentes.

Tal como se utiliza en el presente documento y como se entiende comúnmente en la técnica, el término "tricuerpo" se refiere a un polipéptido inmunorreactivo que comprende tres dominios de unión a antígeno similares al ScFV. Estructuralmente, un tricuerpo es un dímero compuesto por dos cadenas polipeptídicas unidas por un puente disulfuro, en el que el primer polipéptido comprende un ScFV unido a un dominio Vl adicional a través de una cadena polipeptídica C^l , y el segundo polipéptido comprende un ScFV unido a un dominio V^h adicional a través de una cadena polipeptídica C^h1. El puente disulfuro se forma entre un residuo de Cys en el CLy un residuo de Cys en el C^h1, de forma que el V^l adicional del primer polipéptido se asocia con el V^h adicional del segundo polipéptido en una configuración de unión a antígeno, de forma que el tricuerpo en su conjunto incluye tres dominios de unión a antígeno. Los tres dominios de unión al antígeno del anticuerpo pueden ser específicos para el mismo antígeno o para dos o tres antígenos diferentes.

LA FIG. 1 ilustra de forma esquemática un anticuerpo IgG de longitud completa, un ScFV, un diacuerpo de tipo tándem y un tricuerpo como se ha comentado anteriormente.

El uso de los términos "un" y "una" y "el" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las reivindicaciones siguientes) debe interpretarse que abarca tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto. Las expresiones "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" deben interpretarse como términos abiertosfes decir, con el significado de "que incluye, pero no se limita a") a menos que se indique lo contrario. La recitación de rangos de valores en el presente documento tiene la mera intención de servir como método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango, a menos que se indique lo contrario en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la especificación como si se recitara individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento pueden realizarse en cualquier orden adecuado, a menos que se indique lo contrario o que el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje ejemplar (por ejemplo, "como") que se proporciona en el presente documento, tiene por objeto simplemente iluminar mejor la invención y no supone una limitación del alcance de la misma, a menos que se reivindique de otro modo. Ningún lenguaje en la especificación debe ser interpretado como indicando cualquier elemento no reclamado como esencial para la práctica de la invención.

Preferiblemente, los polipéptidos inmunoprotectores comparten al menos un 50% de identidad de secuencia con la región de unión al antígeno de un anticuerpo natural (nativo) (por ejemplo, al menos un 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 o 99% de identidad de secuencia con la región de unión al antígeno del anticuerpo natural). Tal y como se utilizan en la presente memoria, los términos "anticuerpo natural", "anticuerpo nativo" y sus variaciones gramaticales se refieren a un anticuerpo específico para el patógeno o la toxina de interés, que se identifica a partir de una muestra de sangre de un sujeto expuesto al patógeno o la toxina.

Entre los ejemplos no limitantes de patógenos virales que pueden ser blanco de los polipéptidos inmunoprotectores producidos por la IP-MSC descrita en el presente documento se incluyen: adenovirus; papilomavirus; hepadnavirus (por ejemplo, hepatitis B); parvovirus; virus de la viruela (por ejemplo, virus de la viruela, virus de la vaccinia); virus de Epstein-Barr; citomegalovirus (CMV); virus del herpes simple; rosolovirus; virus de la varicela zoster; filovirus (por ejemplo, virus del Ébola y virus de Marburgo); paramixovirus (por ejemplo, virus del sarampión, virus de las paperas, virus Nipah, virus Hendra, virus respiratorio sincitial humano (RSV), virus de la parainfluenza, virus de la enfermedad de Newcastle y metapneumovirus humano); ortomixovirus (por ejemplo, la gripe A, la gripe B y la gripe C); los rabdovirus (por ejemplo, el Lyssavirus, también conocido como virus de la rabia); los arenavirus (por ejemplo, el virus de Lassa); los coronavirus (síndrome respiratorio agudo severo (SARS)); los enterovirus humanos; el virus de la hepatitis A; los rinovirus humanos; el virus de la poliomielitis; los retrovirus (por ejemplo, virus de la inmunodeficiencia humana 1 (VIH-1)); rotavirus; flavivirus, (por ejemplo, el virus del Nilo Occidental, el virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla); hepacivirus (por ejemplo, el virus de la hepatitis C); y el virus de la rubéola. Ejemplos no limitantes de patógenos bacterianos que pueden ser blanco de los polipéptidos inmunoprotectores producidos por la IP-MSC descrita en el presente documento incluyen cualquier especie bacteriana patógena de un género seleccionado entre: Bacillus; Bordetella; Borrelia; Brucella; Burkholderia; Campylobacter; Chlamydia, Chlamydophila; Clostridium; Corynebacterium; Enterococcus; Escherichia; Francisella; Haemophilus; Helicobacter; Legionella; Leptospira; Listeria; Mycobacterium; Mycoplasma; Neisseria; Pseudomonas; Rickettsia; Salmonella; Shigella; Staphylococcus; Streptococcus; Treponema; Vibrio ; y Yersinia.

Ejemplos no limitantes de patógenos parasitarios que pueden ser objetivo de los polipéptidos inmunoprotectores producidos por la IP-MSC descrita en el presente documento incluyen parásitos unicelulares y multicelulares, tales como: Acanthamoeba; Anisakis; Ascaris lumbricoides; Balantidium coli; Cestoda (tenia); niguas; Cochliomyia hominivorax; Entamoeba histolytica; Fasciola hepatica; Giardia lamblia; Anquilostoma; Leishmania; Linguatula serrata; Loa loa; Paragonimus (luciérnaga pulmonar); Oxiuros; Plasmodium falciparum; Schistosoma; Strongyloides stercoralis, Tenia, Toxoplasma gondii; Tripanosoma ; tricocéfalos; y Wuchereria bancrofti.

Entre los ejemplos no limitantes de antígenos víricos a los que pueden dirigirse los polipéptidos inmunoprotectores producidos por la IP-MSC descrita en la presente memoria se incluyen polipéptidos de la gripe como la hemaglutinina 1 (HA1), la hemaglutinina 2 (HA2) y la neuraminidasa (NA); polipéptidos del virus de Lassa (LASV) como la glicoproteína 1 (gp1) del LASV, la glicoproteína 2 (gp2) del LASV, la proteína asociada a la nucleocápside (NP) del LASV, la proteína L del LASV y la proteína Z del ^lA^sV; Polipéptidos del virus del SARS, como la proteína S del virus del SARS; polipéptidos del virus del Ébola, como la GP2 del virus del Ébola polipéptidos del virus del sarampión, como la proteína de fusión 1 (F1) del virus del sarampión; polipéptidos del VIH-1, como la proteína transmembrana (TM) del VIH, la glicoproteína 41 (gp41) del VIH, la glicoproteína 120 (gp120) del VIH; polipéptidos del virus de la hepatitis C (VHC), como la glicoproteína de envoltura 1 (E1) del VHC, la glicoproteína de envoltura 2 (E2) del VHC y la proteína de la nucleocápside (p22) del VHC; Polipéptidos del virus del Nilo Occidental (VNO), como la glicoproteína de envoltura (E) del VNO; polipéptidos del virus de la encefalitis japonesa (VEJ), como la glicoproteína de envoltura (E) del VEJ; polipéptidos del virus de la fiebre amarilla (VFA), como la glicoproteína de envoltura (E) del VFA; polipéptidos del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBEV), como la glicoproteína de envoltura (E) del TBEV; polipéptidos del virus de la hepatitis G (HGV), como la glicoproteína de envoltura 1 (E1) del HGV polipéptidos del virus respiratorio sincitial (VRS), como la proteína de fusión (F) del VRS; polipéptidos del virus del herpes simple (VHS), como la proteína gD del VHS-1, la proteína gG del VHS-1, la proteína gD del VHS-2 y la proteína gG del VHS-2; polipéptidos del virus de la hepatitis B (VHB), como la proteína central del VHB; y polipéptidos del virus de Epstein-Barr (VEB), como la glicoproteína 125 (gp125) del VEB.

Entre los ejemplos no limitantes de antígenos bacterianos a los que pueden dirigirse los polipéptidos inmunoprotectores producidos por el IP-MSC descrito en la presente memoria se incluyen factor de ensamblaje de la proteína de la membrana externa BamA; proteína del módulo de ensamblaje de la translocación TamA; proteína del dominio de la proteína asociada al transporte de polipéptidos; antígeno de superficie bacteriano D15 de una amplia variedad de especies bacterianas; polipéptidos de Bacillus anthracis como la proteína protectora del ántrax, el factor letal del ántrax y el factor del edema del ántrax; Polipéptidos de Salmonella typhii como S1Da y S1Db; polipéptidos de Vibrio cholerae como la toxina del cólera y la proteína de choque térmico del cólera; polipéptidos de Clostridium botulinum como el antígeno S y la toxina botulínica; y polipéptidos de Yersina pestis como F1, antígeno V, YopH, YopM, YopD y el factor de activación del plasminógeno (Pla).

Entre los ejemplos no limitantes de antígenos del parásito que pueden ser el objetivo de los polipéptidos inmunoprotectores producidos por la IP-MSC descrita en el presente documento se incluyen polipéptidos de malaria (Plasmodium ) como la proteína del circunsporozoito (CSP), la proteína de superficie del esporozoito (SSP2/TRAP), el antígeno de la fase hepática 1 (LSA1), la proteína exportada 1 (EXP 1), el antígeno de unión a eritrocitos 175 (EBA-175), el antígeno protector rico en cisteína (cyRPA) y la proteína de choque térmico 70 (hsp70) de Plasmodium ; y polipéptidos de Schistosoma como Sm29 y la proteína de transducción de la señal 14-3­ 3.

Preferiblemente, las IP-MSC se administran por vía parenteral (por ejemplo, inyección o infusión intravenosa, subcutánea o intramuscular). La IP-MSC puede formularse como una solución, suspensión o emulsión en asociación con un vehículo portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, agua estéril, solución salina, solución de dextrosa, solución salina tamponada con fosfato y materiales similares adecuados para la administración de células madre vivas). Opcionalmente, se pueden incluir en el portador aditivos que mantengan la isotonicidad (por ejemplo, manitol) o la estabilidad química (por ejemplo, conservantes).

Tal como se utiliza en el presente documento, una "dosis terapéuticamente eficaz" es una cantidad (por ejemplo, el número de IP-MSC) tal que, cuando se administran, las IP-MSC dan lugar a una reducción o eliminación de los síntomas de la enfermedad ya presentes (por ejemplo, entre unas cien mil y unos cien millones de células). La dosis y el número de dosis (por ejemplo, dosis única o múltiple) administradas a un sujeto variarán en función de diversos factores, como la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), el alcance de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado, la identidad y el número de polipéptidos antigénicos expresados por la IP-MSC, y otros aspectos similares. El ajuste y la manipulación de los rangos de dosis establecidos, así como los procedimientos in vitro e in vivo para determinar la eficacia terapéutica de la IP-MSC en un individuo, están bien dentro de la capacidad de aquellos con conocimientos ordinarios en las artes médicas.

Una "dosis profiláctica" es una cantidad (por ejemplo, el número de IP-MSC) tal que, cuando se administra, las MSC previenen la infección por el patógeno del que se derivó el polipéptido expresado por las IP-MSC (por ejemplo, entre unas cien mil y unos cien millones de células). La dosis y el número de dosis (por ejemplo, dosis única o múltiple) administradas a un sujeto variarán en función de diversos factores, como la vía de administración, las condiciones y características del paciente (sexo, edad, peso corporal, salud, tamaño), el alcance de los síntomas, los tratamientos concurrentes, la frecuencia del tratamiento y el efecto deseado, la identidad y el número de polipéptidos antigénicos expresados por la IP-MSC, y otros aspectos similares. El ajuste y la manipulación de los rangos de dosis establecidos, así como los procedimientos in vitro e in vivo para determinar la eficacia profiláctica de la IP-MSC en un individuo, están bien dentro de la capacidad de aquellos con conocimientos ordinarios en las artes médicas.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "transfectado episomalmente" y sus variaciones gramaticales se refieren a la transfección no integradora con ADN episomal exógeno (por ejemplo, un plásmido u otro vector episomal) para producir una célula con ADN cromosómico inalterado, en la que el polipéptido codificado por el ADN se expresa en un episoma dentro de la MSC, es decir, sin integración genómica del ^a Dⁿ exógeno. Tal y como se utiliza en este documento, el término "episoma" y sus variaciones gramaticales se refieren a moléculas de ADN circulares cerradas que se replican en el núcleo, y pretende abarcar los plásmidos exógenos introducidos en la MSC. Preferiblemente, las MSC primarias se transfectan con un plásmido que codifica el polipéptido antigénico, y preferiblemente también codifica elementos reguladores (por ejemplo, un promotor) para facilitar la expresión episomal del polipéptido antigénico. Opcionalmente, las MSC también pueden ser transfectadas episomalmente con un gen de apoptosis inducible para inducir la muerte celular (apoptosis) cuando se activa por una señal adecuada (por ejemplo utilizando la activación transcripcional controlada por tetraciclina, también denominada "Tet-on y Tetoff", en la que se utiliza tetraciclina o doxiciclina para activar la transcripción del gen apoptótico), de modo que la IP-MSC pueda ser eliminada del sujeto si se desea o es necesario (por ejemplo, si se producen efectos secundarios no deseados). El término "vector episomal" se refiere a un vector de expresión que comprende un plásmido u otro ADN circular que codifica el polipéptido antigénico.

Las MSC primarias pueden ser transfectadas episomalmente por cualquier metodología adecuada. Por ejemplo, la MSC primaria puede ser transfectada con un plásmido que codifica el polipéptido antigénico utilizando la electroporación, la lipofección y similares. La electroporación es el procedimiento preferido para la transfección, a diferencia de otros enfoques de transfección que utilizan lípidos catiónicosf es decir, la lipofección), ya que puede haber lípidos residuales después de la transfección que pueden no ser eliminados completamente al procesar las MSC para su entrega, y pueden dar lugar a efectos secundarios imprevistos.

Ejemplos no limitantes de vectores episomales adecuados para su uso como vectores no integradores para la transfección de células eucariotas (por ejemplo, MSC primarias) incluyen vectores basados en el virus simio 40, vectores basados en el virus de Epstein-Barr, vectores basados en el virus del papiloma, vectores basados en el virus BK, y similares, que son bien conocidos en el arte de la genética molecular.

También se describe en la presente memoria un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad patógena o mejorar la exposición a una toxina, utilizando las IP-MSC descritas en la presente memoria. Un procedimiento comprende los pasos de: identificar opcionalmente anticuerpos neutralizantes contra el patógeno o la toxina identificados a partir de una muestra de sangre de uno o más supervivientes de la enfermedad patógena o la exposición a la toxina; transfectar células madre mesenquimales primarias con uno o más vectores episomales que codifican al menos dos polipéptidos inmunorreactivos que comprenden una región de unión a antígeno de un anticuerpo neutralizante específico para el patógeno o la toxina (por ejemplo, un anticuerpo identificado en la etapa (a)), o que codifica una variante de la región de unión al antígeno, para producir IP-MSC que expresan los polipéptidos inmunorreactivos; y administrar las IP-MSC a un sujeto expuesto o en riesgo de estar expuesto al patógeno o toxina. La variante, si se utiliza, incluye una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la región de unión al antígeno, preferiblemente comparte al menos un 50% de identidad de secuencia con la región de unión al antígeno del anticuerpo neutralizante.

Selección y diseño de anticuerpos y moléculas inmunitarias.

Métodos avanzados para el transporte de células inmunitarias de los supervivientes de la exposición a agentes patógenos o toxinas. El aislamiento y la crioconservación de las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) a partir de muestras de sangre deben preservar la integridad de tantas células B como sea práctico, para asegurar la eventual recuperación y caracterización de las especificidades abundantes y raras. Como prueba de concepto, los pacientes convalecientes de la fiebre de Lassa (FL) en los centros de investigación clínica de África Occidental (Hospital Gubernamental de Kenema, Sierra Leona, y Hospital Docente Especializado de Irrua, Nigeria) son identificados mediante modernos inmunodiagnósticos basados en proteínas recombinantes. La sangre completa se extrae tras el consentimiento informado, y las PBMC se aíslan en salas de cultivo celular especializadas y totalmente equipadas. Las PBMC se criopreservan utilizando tampones establecidos (RPMI/20%FBSA/10%DMSO) y procedimientos (velocidad de enfriamiento de aproximadamente -1°C/min hasta una temperatura final de aproximadamente -80 °C, >5x106 células/vial) que generan cultivos celulares altamente viables tras la descongelación. Las muestras se transportan rápidamente a Estados Unidos en contenedores criogénicos aprobados por la IATA para su posterior procesamiento. El número y el porcentaje de células B antes de la crioconservación se evalúan in situ mediante citometría de flujo cuantitativa (con la ayuda de un citómetro BD ACCURIC6 altamente portátil), determinando el número total de PBMC, y específicamente de células B (CD19+, CD20+), células T (CD3+, CD 4+, CD 8+), células NK (CD16+, CD 56+) y monocitos (CD14+, CD 16+) de cada procedimiento de aislamiento. El procedimiento se repite tras la descongelación para determinar las tasas de pérdida de PBMC y subconjuntos celulares. Se pueden emplear procedimientos similares para identificar otros anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos contra la gripe, producidos por PBMC de sujetos con infecciones recientes documentadas. Cuando sea apropiado, como en el caso de la gripe, la crioconservación podría obviarse, permitiendo el aislamiento de células B a partir de extracciones de sangre fresca.

Metodología para la determinación rápida del microbioma en un paciente índice convaleciente de un patógeno o toxina. Para demostrar que la plataforma de administración de genes MSC puede desplegarse rápidamente como un cortafuegos para un grupo de alto riesgo (combatientes, primeros intervinientes, etc.) contra una enfermedad altamente transmisible, se utiliza como modelo un nuevo patógeno identificado en Sierra Leona o Nigeria. Esto reproduce o simula estrechamente el escenario de un paciente accesible unas 2 o 3 semanas después de la exposición a un patógeno o toxina (por ejemplo, de origen conocido o desconocido), así como a patógenos o toxinas liberados deliberada o accidentalmente.

La metagenómica microbiana, la caracterización imparcial de los ácidos nucleicos microbianos, puede identificar rápidamente patógenos infecciosos en pacientes convalecientes de amenazas biológicas desconocidas. Los microbios presentes en las muestras clínicas suelen identificarse mediante cultivo o mediante enfoques moleculares específicos, como la PCR o la captura de antígenos. El cultivo requiere mucho tiempo y muchos microbios simplemente no pueden cultivarse in vitro. Los enfoques dirigidos también son desventajosos porque requieren un conocimiento a priori del organismo. Alrededor del 30% de las lecturas microbianas de las muestras de fiebre de origen desconocido (FUO) de Sierra Leona y Nigeria no tienen ninguna coincidencia en la base de datos GENBANK. La tecnología descrita en este documento es sensiblefes decir, capaz de detectar un patógeno de bajo número de copias en una mezcla diversa de microbios endógenos) y escalablefes decir, capaz de estudiar un gran número de muestras de pacientes rápidamente). Se desarrollan procedimientos moleculares mejorados para construir bibliotecas de secuenciación de Illumina utilizando cantidades de ARN por debajo del nanogramo. Los procedimientos actuales de construcción de bibliotecas se amplían para poder procesar cientos de muestras en paralelo. Se desarrolla una línea bioinformática que puede identificar rápidamente todos los microbios presentes en conjuntos masivos de datos de secuenciación de nueva generación. Con estos procedimientos, se ensambla un genoma completo de un virus desconocido en unos 2 días y de una bacteria desconocida en unos 4 días.

Programas informáticos para identificar los determinantes de virulencia de los patógenos fpor ejemplo, glicoproteínas o toxinas de entrada viral). Los factores de virulencia se refieren a las proteínasfes decir, los productos génicos) que permiten a un microorganismo establecerse en el ser humano y aumentar su potencial para causar enfermedades. Se ha desarrollado una línea bioinformática y computacional que puede identificar rápidamente factores de virulencia de organismos previamente desconocidos a partir de grandes conjuntos de datos metagenómicos, que aprovecha varias bases de datos de factores de virulencia disponibles públicamente (MvirDB , Tox-Prot, SCORPION, los factores de virulencia PRINTS, VFDB, TVFac, Islander, ARGO y un subconjunto de VIDA) y permite la identificación rápida (en pocas horas) de factores de virulencia para datos de secuencias genómicas recién completadas. Se realizan experimentos para confirmar la capacidad del programa de identificar correctamente los factores de virulencia que pueden ser objeto de anticuerpos protectores.

Anticuerpos protectores. Las células B se enriquecen mediante el agotamiento de las células no B de las PBMC utilizando un separador MACS (Miltenyi Biotec) y perlas magnéticas recubiertas con, por ejemplo, aCD2, CD4, CD11b, CD16, CD36, aIgE, CD235a y similares. Los linfocitos B circulantes de memoria específicos de antígeno que se unen a determinantes de virulencia recombinantes marcados con fluorocromos (por ejemplo, el GP del LASV o la hemaglutinina del virus de la gripe, HA) se clasifican mediante citometría de flujo y se depositan directamente en placas de 96 pocillos en densidades de células individuales. El ARN se aísla a partir de células individuales (Norgen Biotek, Qiagen) y se transcribe inversamente en ADNc, con la posterior amplificación de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina. Los oligos diseñados a medida permiten la clonación directa de los genes de las cadenas pesadas y ligeras en vectores patentados para su expresión como anticuerpos monoclonales humanos completos (CHOLCelect™, patente estadounidense US 8076102, Luis M Branco et al.), o rediseñados como cadena única, diacuerpos o tricuerpos para su rápida expresión y purificación a partir de cultivos de E. coli. Para identificar rápidamente los anticuerpos potencialmente protectores se utilizan ensayos ELISA de unión a determinantes de virulencia (GP o HA) o de neutralización de patógenos (basados en pseudopartículas). Los anticuerpos con las propiedades deseadas se clonan en el vector de expresión policlonal descrito en este documento, y se prueban como especificidades únicas en ensayos de neutralización de virus vivos para verificar la potencia en un sistema biológico in vitro más relevante.

Procedimientos para evitar la formación de anticuerpos quiméricos no clasificados. Para garantizar el desarrollo de la plataforma más aplicable, protectora y resistente a los mutantes de escape, se implementa un diseño de anticuerpos oligoclonales. Para ello, cada anticuerpo que muestra propiedades neutralizantes se prueba en versiones de longitud completa y de cadena única (ScFV). Muchas ScFV conservan las propiedades de las IgG enteras de origen debido a la representación fiel de las CDR cruciales de unión al antígeno. Alternativamente, las combinaciones de diacuerpos y triacuerpos pueden incorporarse a plataformas de vectores de expresión para su uso terapéutico. Este enfoque oligoclonal de IgG/ScFV evitará la formación de cadenas pesadas y ligeras inapropiadamente mezcladas cuando se exprese más de un anticuerpo dentro de una sola MSC. Como se describe en el presente documento, se consigue un nivel deseado de potencia terapéutica integrando varios ScFV y un anticuerpo de longitud completa para el que se pueden identificar funciones efectoras o que perdió potencia al convertirse en una variante de cadena única.

Selección y Diseño de Construcciones de Ácidos Nucleicos.

Diseño del vector para permitir niveles y duración de expresión suficientes para la protección contra la exposición. Se utiliza un episoma circular multicopia, no infeccioso y no integrativo, para expresar fragmentos de anticuerpos de cadena simple completamente humanos, IgG de longitud completa u otros polipéptidos inmunorreactivos contra múltiples (potencialmente cientos) proteínas bacterianas, virales, fúngicas o parasitarias o toxoides proteicos simultáneamente (véase la FIG. 1, que ilustra las IgG, los ScFV, los diabodiodes y los inmunomoduladores de tipo tribal). Como se describe en la presente memoria, el episoma se basa en componentes derivados del casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBNA1) y del origen de replicación OriP. Estos son preferentemente los únicos componentes del VEB que se utilizan, por lo que no se replican ni se ensamblan los virus. Este sistema da lugar a una persistencia extracromosómica estable y a una expresión génica ectópica a largo plazo en las células madre mesenquimales. En los procedimientos descritos en el presente documento, los ScFV u otros polipéptidos inmunorreactivos se expresan efectivamente en las MSC y se secretan a partir de ellas en cantidades protectoras. Se ha expresado un anticuerpo neutralizador del LASV de longitud completa en hADMSC como prueba de concepto. La capacidad de los episomas basados en el VEB para introducir y mantener fragmentos de ADN genómico humano muy grandes (>300 kb) en las células humanas es otra ventaja significativa de los procedimientos descritos en la presente memoria. Esta característica permite la clonación de docenas de elementos de expresión en un vector capaz de replicarse en bacterias, apto para la purificación a gran escala, la transfección en hMSC y la replicación como plásmido episomal. Los niveles de expresión de los polipéptidos inmunorreactivos (por ejemplo, los ScFV) son de aproximadamente 10 pg/célula/día para cada polipéptido inmunorreactivo, preferiblemente niveles de expresión de 5 pg/célula/día. Una infusión con alrededor de 1x1011 MSC con una tasa de productividad de 10 pg/célula/día para cada polipéptido inmunorreactivo genera alrededor de 1 gramo de polipéptido soluble por día, equivalente a un nivel de 15 mg/ml en la circulación de un adulto de 75 Kg, que es un nivel de dosis terapéutico adecuado. Los promotores y otros elementos reguladores se utilizan para impulsar la expresión de cada tipo de molécula inmunomoduladora.

Varios informes en la literatura apuntan a un patrón no clásico de expresión de promotores bien caracterizados en MSC. El promotor del gen inmediato mayor del citomegalovirus humano (CMV-MIE) es uno de los promotores más potentes que se conocen, y un elemento importante en la generación de líneas celulares de mamíferos estables productoras de proteínas recombinantes de varios gramos por litro. Sin embargo, el CMV-MIE se transcribe relativamente poco en las MSC. Por el contrario, los promotores EF1A, UBC y CAGG han demostrado altos niveles de expresión en MSC sin signos evidentes o silenciamiento del promotor. Los vectores episomales utilizados en los procedimientos descritos en la presente memoria pueden incluir cualquiera de estos promotores. FIG. 2, Panel A, proporciona una ilustración esquemática de un ejemplo representativo y no limitante de un vector episomal pEBV MSC. También se proporcionan vectores de expresión sin marcadores de selección de antibióticos para la expansión de plásmidos en E. coli. La naturaleza replicativa del plásmido episomal impide su linealización con una endonucleasa de restricción que interrumpa el marco de lectura abierto del gen de resistencia a los antibióticos. Por lo tanto, es concebible que los reordenamientos genéticos den lugar a la expresión de un gen de resistencia a los antibióticos, dando lugar potencialmente a efectos secundarios indeseables mediados por la resistencia a los antibióticos en los seres humanos en casos seleccionados. Este escenario puede evitarse sustituyendo los genes de resistencia a los antibióticos por marcadores metabólicos seleccionables para el crecimiento y la propagación de plásmidos en las cepas de E. coli, si es necesario o se desea.

Diseño de elementos reguladores para niveles de expresión dirigidos de moléculas terapéuticas individuales y de oclusión. Los elementos reguladores del vector se utilizan para acomodar los niveles secretados deseados y los niveles séricos de cada molécula inmunomoduladora de interés. La expresión de anticuerpos de longitud completa, ScFV u otros polipéptidos inmunorreactivos se benefician de promotores fuertes (por ejemplo, CMV, EF1A, CAGG, etc.) para alcanzar niveles séricos terapéuticos en menos de un día después de la administración de MSC. Otras moléculas inmunomoduladoras, como las citoquinas, suelen ser expresadas y secretadas a bajos niveles y de forma transitoria por las MSC. Para dar cabida a la flexibilidad requerida en los niveles dispares y el momento de la expresión, tales genes son impulsados desde promotores basales bajos (es decir, TK), o a través de la inducción controlada de un promotor Tet on/off. El sistema promotor de Tet se beneficia del uso de análogos de antibióticos inocuos como la anhidrotetraciclina, que activa el promotor de Tet a concentraciones de 2 registros más bajas que con la tetraciclina, no da lugar a una desregulación de la flora intestinal, no provoca resistencia a los antibióticos policétidos y no presenta actividad antibiótica. La anhidrotetraciclina es totalmente soluble en agua y puede administrarse en raciones para potenciar la activación de genes seleccionados en las MSC transfectadas. La toxicidad potencial de la anhidrotetraciclina, el primer producto de descomposición de la tetraciclina en el cuerpo humano, puede evitarse mediante la administración de otros análogos, como la doxiciclina, un análogo de la tetraciclina aprobado por la FDA que también activa el sistema promotor Tet on/off. Este sistema se emplea preferentemente en el diseño de un "interruptor de muerte" a prueba de fallos mediante la regulación estricta de la expresión inducible de un potente gen pro-apoptótico (por ejemplo, Bax) para iniciar la apoptosis dirigida de las MSC transfectadas en caso de efectos secundarios adversos o cuando se haya alcanzado el punto final terapéutico deseado. Los recientes avances en el sistema Tet-on han dado lugar a una represión mucho mayor de la fuga del promotor y a la capacidad de respuesta a Dox a concentraciones hasta 100 veces menores que en el sistema Tet original (Tet-On Advanced™, Tet-On 3G™). Los marcadores seleccionables por fármacos no se utilizan para mantener la estabilidad del vector en las MSC transfectadas: Vectores basados en el VEB, que se sabe que se replican y se retienen en las células hijas a una tasa del 90 - 92% por ciclo celular.

Estudios de seguridad/inmunogenicidad de los vectores. Dado que los episomas no producen virus replicantes y que las células en las que se expresan no producen moléculas MHC en cantidades significativas, los episomas no dan lugar a una inmunidad derivada del vector que impida un uso posterior de la plataforma en un individuo. Esto puede confirmarse mediante el diseño de un ensayo sensible para detectar las respuestas inmunitarias (ELISA de anticuerpos y ensayos basados en células T) a los componentes derivados del casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (VEB), y al fondo m Sc (tipificación HLA). Se realizan estudios genéticos para investigar las tasas de integración del VEB en el cromosoma de la célula huésped (FISH, Southern blot, qPCR), y para medir la naturaleza replicativa transitoria del vector. Se ha informado de que los vectores del VEB conservan entre el 90 y el 92% de replicación por ciclo celular en ausencia de un marcador seleccionable. Una tasa de replicación decreciente contribuye a la eliminación del vector del sistema huésped. La compartimentación de las MSC inyectadas se evalúa en primates no humanos (NHP) mediante el seguimiento de células marcadas con fluorescencia y precargadas con colorantes permeables a la membrana celular (CMFDA verde, CMTMR naranja) que al esterificarse dejan de atravesar la bicapa lipídica y se vuelven altamente fluorescentes. Estas mediciones se realizan en secciones de tejido recién preparadas (ganglios linfáticos, hígado, bazo, músculo, cerebro, páncreas, riñón, intestino, corazón, pulmón, ojo, tejido reproductivo masculino y femenino) o mediante escáneres de cuerpo entero. Se procesan secciones de tejido adicionales para el aislamiento de ADN y ARN para el análisis de las secuencias del vector y los transcritos correspondientes. El diseño de oligos específicos para cada polipéptido inmunorreactivo, citoquina y transcripción de cierre permite la evaluación de la expresión génica individual en todos los tejidos. Algunos promotores se transcriben más activamente en unos tejidos que en otros, lo que exige evaluar tanto la localización preferente de las MSC en los tejidos periféricos tras la inyección y la residencia de las MSC como la correspondiente actividad transcripcional de los genes recombinantes. Para ello, se pueden incluir dos etiquetas de ácidos nucleicos artificiales "de código de barras", una específica para los transcritos de ARN impulsados por el Tet on/off, y la otra para el ADN del vector episomal. Estas etiquetas permiten una rápida identificación de las secuencias únicas entre el genoma y el transcriptoma de los PSN y de los humanos (véase la FIG. 2).

Selección y diseño de la estrategia de entrega.

MSC como vehículos de entrega transitoria de moléculas terapéuticas. Las MSC son aptas para la electroporación a gran escala, con una eficacia de hasta el 90%. MaxCyte, Inc. (Gaithersburg, MD) comercializa el "Sistema de transfección a gran escala MaxCyte® VLX™, un instrumento de tamaño reducido y fácil de usar, diseñado específicamente para la transfección transitoria de volúmenes extremadamente grandes en un entorno de transfección estéril y cerrado. Utilizando la tecnología de electroporación de flujo, el MAXCYTE VLX puede transfectar hasta 2x1011 células en menos de 30 minutos con una alta viabilidad celular y eficiencia de transfección en un entorno de transfección estéril y cerrado. Este sistema, que cumple con las normas cGMP, es útil para la producción rápida de proteínas recombinantes, desde el banco hasta los pilotos cGMP y la fabricación comercial". Las MSC pueden crecer en medios químicamente definidos (CD), en entornos de cultivo celular a gran escala. Los recientes avances en ingeniería de bioprocesamiento han dado lugar al rápido desarrollo de formulaciones de CD que admiten la expansión a gran escala de MSC sin pérdida de características pluripotentes y la retención de la estabilidad genética. Las MSC derivadas del tejido adiposo pueden obtenerse fácilmente a partir de procedimientos de liposucción, con un procedimiento medio que produce alrededor de 1x108 MSC, proporcionando así un número suficiente de células para su expansión ex vivo antes del almacenamiento (aproximadamente 25 duplicaciones, >3x1015 células) con una vida útil restante y un número de duplicaciones (aproximadamente 25) suficientes para mantener la expresión y la entrega de moléculas terapéuticas in vivo durante varias semanas después de la infusión. Las MSC suelen presentar tasas de duplicación de 48 a 72 horas, por lo que pueden tener una vida útil in vivo de 50 a 75 días. La tasa de recambio de las MSC infundidas puede evaluarse midiendo los niveles circulantes de productos transgénicos, y mediante la detección de secuencias del VEB por qPCR en sangre, aspirados nasales y orina, en humanos. La eliminación completa de las MSC tras el periodo de tiempo terapéutico deseado puede lograrse induciendo la autodestrucción mediante la expresión inducible controlada de genes pro-apoptóticos incorporados al vector de expresión. También pueden evaluarse los niveles de polipéptidos inmunorreactivos circulantes derivados de las MSC u otros inmunomoduladores tras la inyección, así como la autoinmunidad inducida por el vector o las respuestas a la EICH en los PSN. En los seres humanos, pueden medirse otros marcadores asociados a las respuestas inmunitarias autoinmunes o alogénicas, como los biomarcadores de lesión hepática (ALT, AST), hepática (ALB, BIL, GGT, ALP, etc.) y de función renal (BUN, CRE, urea, electrolitos, etc.).

Aislamiento, caracterización y generación de bancos de MSC para uso terapéutico. La falta de expresión de antígenos del linaje linfático distingue a las MSC de las células hematopoyéticas, las células endoteliales, los progenitores endoteliales, los monocitos, las células B y los eritroblastos. Las MSC primarias no son inmortales y, por tanto, están sujetas al "límite de Hayflick" de unas 50 divisiones para las células primarias. Sin embargo, la capacidad de expansión es enorme, ya que una célula puede producir hasta unas 1015 células hijas. Además, las MSC tienen una baja variabilidad entre lotes. Se pueden generar bancos de células de gran tamaño capaces de proteger rápidamente a millones de personas en riesgo mediante la agrupación de un gran número de MSC derivadas de tejido adiposo de donantes preseleccionadas: 100 donantes a 1x108 células/donante x 25 generaciones ex vivo = unas 3x1017 células; a unas 1x1011 células/infusión = unos 3 millones de dosis. Se pueden utilizar dos enfoques en la generación de bancos de MSC terapéuticas: (1) Aislamiento, expansión, pruebas, generación de bancos, seguido de transfección, recuperación y administración; y (2) aislamiento, expansión, pruebas, transfección, generación de bancos para generar células listas para ser administradas tras la descongelación y una breve recuperación.

Para la caracterización, el banco de células maestras puede someterse a pruebas de esterilidad, micoplasma, pruebas de agentes adventicios in vitro e in vivo , pruebas de retrovirus, identidad celular, microscopía electrónica y una serie de ensayos de PCR de virus específicos (la FDA exige 14 en sus documentos de orientación de 1993 y 1997, y esa lista se ha ampliado con varios virus recomendados además, principalmente virus de polioma). Con el posible uso inicial de suero en condiciones de cultivo primario, se pueden realizar pruebas para el panel 9CFR de virus bovinos. Si las células entran en contacto con productos porcinos durante las manipulaciones normales, es preferible que también se realicen pruebas de detección de virus porcinos.

Farmacocinética/farmacodinámica (PK/PD). Una de las limitaciones del uso de las MSC para la reparación de tejidos ha sido la incapacidad de las células para colonizar permanentemente los órganos tras su expansión ex vivo y su reinyección en la persona de la que se derivaron. Las MSC circulan durante un periodo de tiempo limitado (por ejemplo, varias semanas o meses), tanto si se inyectan en individuos con MHC compatible como si no. Esta carencia particular en el desarrollo de una plataforma universal de administración de genes de MSC adultas es una ventaja en los procedimientos descritos en este documento. El perfil farmacocinético (PK) de cada transgén expresado en MSC transfectadas puede ser evaluado en NHP para cada plataforma de vector de entrega de ingeniería desarrollada. Es deseable que se realice un estudio PK de dosis única en monos cynomolgus, con MSC transfectadas administradas por vía intravenosa. En un estudio de este tipo se administran por vía intravenosa (i.v.) a 2 monos machos y 2 hembras una dosis alta (unas 10¹¹ células), una dosis intermedia (unas 10⁸ células) y una dosis baja (unas 10⁵ células) de MSC. Los criterios de valoración que se evaluarán son: observaciones en la jaula, peso corporal, consumo cualitativo de alimentos, oftalmología, electrocardiograma, patología clínica (por ejemplo, hematología, química, coagulación, análisis de orina); inmunología (por ejemplo, inmunoglobulinas y leucocitos periféricos como células B, células T y monocitos); inmunogenicidad; patología macroscópica (por ejemplo, necropsia y pesos de órganos seleccionados); histopatología; unión de tejidos; y farmacocinética. Las concentraciones séricas de cada anticuerpo recombinante pueden ser monitoreadas durante 9 semanas con ELISA de tipo sándwich calificado que utiliza reactivos de captura y detección específicos para el anticuerpo (anti-id marcado con HRP) en los días 1, 3, 6, 12, 24, 36, 48 y 63. Los análisis de PK pueden realizarse mediante procedimientos no compartimentales utilizando el software WINNONLIN (Pharsight Corp.). Los parámetros farmacocinéticos de cada anticuerpo pueden expresarse como concentración sérica máxima (Cmáx), concentración sérica normalizada por dosis (Cmáx/D), área bajo la curva de concentración-tiempo desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUCo_~), área bajo la curva de concentración-tiempo normalizada por la dosis desde el tiempo 0 hasta el infinito (AUCo-~/D), aclaramiento corporal total (CL), volumen de distribución en estado estable (Vss), volumen aparente de distribución durante la fase terminal (Vz), semivida de la fase de eliminación terminal (ti/2,term) y tiempo medio de residencia (MRT). La circulación periférica y la compartimentación de las MSC inyectadas pueden evaluarse en los PSN mediante el seguimiento de las células marcadas con fluorescencia y precargadas con colorantes CMFDA o CMTMR permeables a la membrana celular, como se ha descrito anteriormente, en secciones de tejido recién preparadas o mediante escáneres de todo el cuerpo. Las secuencias de ADN de los vectores y los transcritos pueden controlarse mediante qPCR, como se ha indicado anteriormente.

Reutilización. Existe una amplia bibliografía que destaca la ausencia de rechazo contra las MSC in vivo. No obstante, este fenómeno puede evaluarse en los PSN con múltiples inyecciones de MSC singénicas modificadas con vectores de ADN homólogos y heterólogos, seguidas de un perfil inmunológico de las respuestas alogénicas. Por ejemplo, un grupo de NHP puede ser inyectado con un bolo de MSC singénicas transfectadas con un vector episomal que exprese anticuerpos contra el LASV, y otro con un vector similar que exprese anticuerpos contra la gripe. La respuesta inmunitaria a la plataforma de MSC y a los componentes del vector puede evaluarse semanalmente a lo largo de 77 días, durante los cuales debería ser detectable cualquier respuesta inmunológica. La seguridad e inmunogenicidad en NHP tras la activación del mecanismo de cierre por la administración de doxiciclina u otros análogos de la tetraciclina puede evaluarse de forma similar. Tras la administración de un régimen de doxiciclina, las respuestas inmunológicas adversas a los componentes del vector y a la plataforma de entrega de las MSC pueden evaluarse de forma similar, por ejemplo, primero a diario durante las dos primeras semanas y luego semanalmente durante 77 días más. Se pueden rastrear otros marcadores de muerte celular apoptótica mediante ensayos establecidos, como el aumento de la deshidrogenasa láctica (LDH) y las caspasas en suero, y la fosfatidilserina (PS) en las MSC circulantes. Si no se detecta una respuesta inmunológica al vector y a las MSC después de este periodo de 77 días, los PSN pueden ser reinyectados con MSC homólogas, un grupo con MSC transfectadas con un vector homólogo, mientras que el otro grupo recibirá un vector de ADN heterólogo. Los vectores homólogos y heterólogos tendrán el mismo fondo, pero con diferentes repertorios de anticuerpos recombinantes. Este enfoque puede demostrar la inmunogenicidad contra las MSC y el vector de ADN de expresión, independientemente del repertorio de anticuerpos recombinantes. El plazo de 77 días para la evaluación de las reacciones inmunológicas contra la plataforma MSC se ha elegido basándose en los estudios toxicocinéticos de dosis múltiples con anticuerpos humanos en monos cynomolgus que muestran una reducción media de 5000 veces en los niveles séricos máximos del anticuerpo recombinante administrado a 10 mg/Kg durante este plazo. En estos estudios, algunos NHP pueden desarrollar respuestas de anticuerpos antihumanos alrededor de 50 a 60 días después de la primera administración, mientras que algunos animales pueden no desarrollar nunca una respuesta humoral detectable a la IgG heteróloga.

Transporte de MSC. De forma deseable, las MSC pueden transportarse en un dispositivo que permita el transporte en cadena caliente (37 °C) de las MSC modificadas genéticamente, lo que permite eliminar el transporte en cadena fría, con una mayor capacidad de muestreo y tecnologías de monitorización celular, como los dispositivos de MicroQ Technologies. Estos dispositivos mantienen temperaturas cálidas precisas desde unas 24 hasta unas 168 horas, lo que permite un tiempo suficiente para el despliegue de una terapéutica lista para usar en cualquier parte del mundo. Se puede introducir una capacidad adicional para el almacenamiento y el transporte de las células encapsuladas, y se pueden preparar cápsulas capaces de soportar el intercambio de gases, según sea necesario. El tiempo transcurrido desde la encapsulación hasta la administración tendrá en cuenta los cambios metabólicos en las IP-MSC, la tasa de crecimiento celular, los cambios en la viabilidad y cualquier otro cambio en el producto que afecte al rendimiento.

Demostración de la inmunidad protectora transitoria.

Estudios de la exposición en macacos infundidos con MSC que expresan anticuerpos protectores. Los macacos Cynomolgus son infundidos con MSCs de macacos que expresan anticuerpos de cadena simple anti-LASV GP, luego desafiados por inyección IM con 1000 unidades formadoras de placas (pfu) del virus LASV (cepa Josiah), y evaluados como se describe por Geisbert et al. Los animales que presentan signos clínicos compatibles con la fibrosis quística terminal son sacrificados. Tras la provocación, se procesan las muestras biológicas para medir la viremia mediante la prueba de la placa y la RT-PCr . Se secuenciará el ARN viral para identificar si se producen mutaciones específicas en el gen GPC tras la terapia en NHPs. De los animales que sucumben a la exposición, se toman diversas muestras biológicas, como tejidos, sangre y otros fluidos corporales, para su histopatología, inmunohistoquímica, aislamiento del virus y detección del genoma. Los macacos supervivientes son monitorizados en busca de respuestas humorales a los antígenos virales mediante la realización de una serie de ensayos Westernblot y ELISA para detectar evidencias de cualquier respuesta de anticuerpos a las principales proteínas estructurales virales (G1, G2, NP, Z). Para los estudios de provocación en humanos se utilizan estudios similares con construcciones de MSC que expresan anticuerpos protectores contra el virus de la gripe.

Los siguientes ejemplos no limitantes se proporcionan para ilustrar ciertas características y aspectos del IP-MSC y los procedimientos descritos en el presente documento.

Ejemplo 1. Anticuerpos neutralizantes del virus de Lassa (LASV).

Se recogieron unos treinta mililitros de sangre total de adultos supervivientes confirmados de la fiebre de Lassa (FL) de Sierra Leona no antes de las 8 semanas siguientes al alta hospitalaria, y hasta varios meses de convalecencia. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de las muestras de sangre mediante centrifugación en gradiente de Ficoll, se criopreservaron y se transportaron en cargadores secos a Estados Unidos. Los cultivos de las PBMC se sembraron a bajas densidades en placas de 96 pocillos y se estimularon con R848 e interleucina-2 (IL-2) para la activación policlonal de las células B. Los sobrenadantes de los pocillos que mostraban el crecimiento de las colonias después de la estimulación se analizaron para determinar la unión de IgG humana a las placas de ELISA recubiertas con las proteínas NP, GPC (GP1+GP2), GP1 o Z expresadas recombinantemente. Los clones con reactividad significativa se ampliaron, se clonaron y se volvieron a analizar. Se aisló el ARN de clones de células B que producen IgG específicas para las proteínas del LASV. Los genes humanos de la cadena ligera (LC) y de la cadena pesada (HC) de la IgG se amplificaron mediante RT-PCR y se clonaron en vectores de expresión lineal monocatenarios. Las células HEK-293T fueron co-transfectadas con construcciones LC y HC emparejadas para evaluar la expresión de anticuerpos monoclonales humanos (huMAbs) individuales de LASV y para purificar pequeñas cantidades de anticuerpos para estudios preliminares de caracterización in vitro.

Las PBMC congeladas enviadas desde Sierra Leona tenían una excelente viabilidad y altas frecuencias de células B de memoria productoras de anticuerpos. Se aislaron más de 75 clones de células B independientes a las glicoproteínas de diferentes pacientes. Se determinaron los perfiles de unión y especificidad de los huMAbs específicos de la GPC del LASV en ensayos de inmunoprecipitación y ELISA.

Ensayo de neutralización de reducción de placas del LASV (PRNT). El virus de Lassa (cepas Josiah, GA391 y 803213, para las que existen y están disponibles buenos modelos de cobaya) puede preincubarse con varias diluciones (por ejemplo, de unos 10 pM a unos 300 nM) de cada MAb antes de la infección de las células Vero o Vero E-6. El virus puede eliminarse después de la infección lavando dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y puede añadirse a cada cultivo un medio celular con superposición de agarosa al 0,5%. Las placas pueden contarse unas 48 horas después tras la tinción con rojo neutro. El nivel de inhibición se representa entonces frente a la concentración y se puede calcular un IC50 (cantidad de proteína necesaria para bloquear el 50% de la entrada).

Dos huMAbs del LASV identificados, designados como GP10.4B y GP19.7E, mostraron neutralización del virus in vitro en el ensayo de neutralización por reducción de placas (PRNT) del LASV. La GP19.7E fue significativamente más potente que la 10.4B. Los huMAbs GP10.4B y GP19.7E también mostraron un potencial de neutralización significativo contra el LASV vivo. Las secuencias de nucleótidos de la cadena pesada (HC) y de la cadena ligera (LC) de GP10.4B y GP19.7E se muestran en la FIG. 3 (HC) y FIG. 4 (LC). Las secuencias de aminoácidos correspondientes se muestran en la FIG. 5.

Ejemplo 2. Preparación de MSC primarias inmunoprotectoras que expresan un polipéptido inmunorreactivo anti-LASV.

Las MSC derivadas de tejido adiposo se sembraron en placas de 6 pocillos a una densidad de aproximadamente 1 millón de células/pocillo en medio de Eagle modificado alfa (MEM alfa) suplementado con 10% de FBS. Al día siguiente, las células se transfectaron con LIPOFECTAMINA 2000 (Invitrogen) o PEI (Polyplus) y una construcción pCMVintA_17HSD:huMAb 19.7E de acuerdo con las recomendaciones del fabricante: Los genes de los anticuerpos de cadena ligera y pesada de huMAbs GP19.7E fueron rediseñados con secuencias Kozak óptimas y UTRs deconvertidas, y clonados en un vector de expresión de mamíferos bicistrónico (FIG, 3, Panel B), en tándem y en orientaciones opuestas. En células HEK-293T/17 transfectadas transitoriamente, las construcciones génicas de orientación opuesta dieron lugar a niveles de anticuerpos secretados más altos que los de sus homólogos en tándem. Se generó una línea celular NS0 que expresa huMAb GP19.7E mediante transfección con construcciones genéticas de anticuerpos opuestos. Unas 48 horas después de la transfección, se recogieron los sobrenadantes y se diluyeron en serie en 1x PBS/0,1% BSA/0,1% TWEEN-20 para el ELISA. Utilizando este procedimiento, las Ms C adiposas produjeron unos 60 ng/ml de anticuerpo GP19.7E, frente a una señal indetectable para un control de vector vacío.

Ejemplo 3. Inmunidad protectora contra el LASV mediante la administración de múltiples anticuerpos neutralizantes contra el LASV.

Para demostrar la actividad inmunoterapéutica de los huMAbs IgG anti-LASV, se inyectó a cobayas de raza con una dosis única de aproximadamente 30 mg/Kg y 15 mg/Kg de MAb GP19.7E y MAb GP10.4B, respectivamente, el mismo día de la provocación con LASV. El LASV Josiah se adaptó a cobayas de raza, dando lugar a un modelo uniformemente letal por vía intraperitoneal (i.p.). Estos conejillos de indias de raza externa mostraron signos clínicos de la enfermedad similares a los observados en los conejillos de indias de la cepa 13 y en los seres humanos. Todos los cobayas de control inyectados con diluyente sin anticuerpos sucumbieron con los signos típicos de la fiebre de Lassa al día 16 del experimento (FIG. 6). Los cobayas tratados con huMAb fueron seguidos hasta los 21 días. Ninguno de estos animales tratados con huMAb murió o mostró signos de fiebre de Lassa. Estos resultados demuestran que el tratamiento con esta combinación de huMAbs específicos de la glicoproteína del virus de Lassa no se limitó a prolongar la supervivencia, sino que proporcionó una protección completa contra los efectos letales del virus de Lassa.

En el presente documento se describen aspectos preferidos de esta invención, incluyendo el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de estas realizaciones preferidas pueden resultar evidentes para aquellos con conocimientos ordinarios en la materia al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los artesanos expertos empleen dichas variaciones según convenga, y los inventores pretenden que la invención se practique de forma distinta a la descrita específicamente en el presente documento. Por lo tanto, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia recitada en las reivindicaciones que se adjuntan al presente documento según lo permita la legislación aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las posibles variaciones de los mismos está comprendida en la invención, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o se contradiga claramente por el contexto.

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Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica para su uso en el tratamiento de la prevención de una infección causada por un patógeno o la toxicidad de la exposición a una toxina, la composición comprende células madre mesenquimales primarias inmunoprotectoras (IP-MSC) que expresan episomalmente múltiples polipéptidos inmunorreactivos que se dirigen específicamente a un patógeno o toxina; las IP-MSC se transfectan con uno o más vectores episomales que codifican múltiples polipéptidos inmunorreactivos expresables que se dirigen específicamente al patógeno o toxina; en la que cada polipéptido inmunorreactivo comprende una secuencia de aminoácidos de una región de unión a antígeno de un anticuerpo neutralizante específico para un antígeno producido por el patógeno o específico para la toxina, o una secuencia de aminoácidos de una variante de la secuencia de la región de unión a antígeno que comprende una o más sustituciones en la secuencia de aminoácidos de la misma y que comparte al menos alrededor del 50% de identidad de secuencia con la secuencia de la región de unión a antígeno; estando la secuencia de la región de unión al antígeno o la variante de la misma dispuesta para unirse específicamente al patógeno o la toxina y neutralizarlos; y en la que el vector episomal incluye opcionalmente un gen de apoptosis inducible, en la que los polipéptidos inmunorreactivos se seleccionan entre un anticuerpo de longitud completa, un fragmento variable monocatenario de anticuerpo (ScFV), un fragmento de unión a antígeno de anticuerpo monovalente (Fab) un fragmento divalente de unión a antígeno del anticuerpo (F(ab')²), un diacuerpo y un triacuerpo, y opcionalmente en la que las IP-MSC también expresan uno o más agentes inmunomoduladores, en la que el uno o más agentes inmunomoduladores se seleccionan entre interleucinas e interferones;

opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno viral, un patógeno bacteriano, un patógeno parasitario unicelular o un patógeno parasitario multicelular;

opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno viral seleccionado del grupo que consiste en: un adenovirus; un papilomavirus; un hepadnavirus; un parvovirus; un poxvirus; un virus de Epstein-Barr; un citomegalovirus (CMV); un virus del herpes simple; un roseolovirus; un virus de la varicela zoster; un filovirus; un paramixovirus un ortomixovirus; un rabdovirus; un arenavirus; un coronavirus; un enterovirus humano; un virus de la hepatitis A; un rinovirus humano; un virus de la poliomielitis; un retrovirus; un rotavirus; un flavivirus; un hepacivirus; y un virus de la rubeola;

opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno bacteriano de un género seleccionado del grupo que consiste en: Bacillus; Bordetella; Borrelia; Brucella; Burkholderia; Campylobacter; Chlamydia, Chlamydophila; Clostridium; Corynebacterium; Enterococcus; Escherichia; Francisella; Haemophilus; Helicobacter; Legionella; Leptospira; Listeria; Mycobacterium; Mycoplasma; Neisseria; Pseudomonas; Rickettsia; Salmonella; Shigella; Staphylococcus; Streptococcus; Treponema; Vibrio ; y Yersinia; opcionalmente, en la que el patógeno es un patógeno parasitario seleccionado del grupo que consiste en: Acanthamoeba; Anisakis; Ascaris lumbricoides; Balantidium coli; Cestoda (tenia); niguas; Cochliomyia hominivorax; Entamoeba histolytica; Fasciola hepatica; Giardia lamblia; Anquilostoma; Leishmania; Linguatula serrata, Parásito hepático; Loa loa; Paragonimus (Gripe del pulmón); Oxiuros; Plasmodium falciparum; Schistosoma; Strongyloides stercoralis; Toxoplasma gondii; Trypanosoma ; Whipworm; y Wuchereria bancrofti; y

opcionalmente, en la que el vector episomal comprende un casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBVNA1).

2. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que las IP-MSC expresan episomalmente de 2 a aproximadamente 100 de los polipéptidos inmunorreactivos.

3. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el uno o más agentes inmunomoduladores se seleccionan entre IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-9, IL-12, IFNa, IFNp e IFNw.

4. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos comprenden una secuencia de aminoácidos de la variante de la región de unión al antígeno, y en la que las sustituciones de la secuencia de aminoácidos de la variante comprenden sustituciones conservativas.

5. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que uno o más de los polipéptidos inmunorreactivos comprenden una secuencia de aminoácidos de la variante de la región de unión al antígeno, y en la que la secuencia de aminoácidos de la variante comparte al menos aproximadamente un 80 % de identidad de secuencia con la secuencia de la región de unión al antígeno.

6. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el antígeno se selecciona del grupo que consiste en: Glicoproteína 1 (gp1) del virus de Lassa (LASV); glicoproteína 2 (gp2) del LASV; proteína asociada a la nucleocápside (NP) del LASV; proteína L del LASV; proteína Z del LASV; hemaglutinina 1 de la gripe (HA1); hemaglutinina 2 de la gripe (HA2); neuraminidasa de la gripe (NA); La proteína S del virus del SARS; la GP2 del virus del Ébola; la proteína de fusión 1 (F1) del virus del sarampión; la proteína transmembrana (TM) del VIH-1; la glicoproteína 41 (gp41) del VIH-1; la glicoproteína 120 (gp120) del VIH-1; la glicoproteína de envoltura 1 (E1) del virus de la hepatitis C (VHC); la glicoproteína de envoltura 2 (E2) del VHC; Proteína de la nucleocápside del VHC (p22); glicoproteína de la envoltura del virus del Nilo Occidental (VNO) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis japonesa (VEJ) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la fiebre amarilla (VFA) (E); glicoproteína de la envoltura del virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (VET) (E); glicoproteína de envoltura 1 (E1) del virus de la hepatitis G (HGV); proteína de fusión (F) del virus respiratorio sincitial (RSV); proteína gD del virus del herpes simple 1 (HSV-1); proteína gG del HSV-1; proteína gD del HSV-2; proteína gG del HSV-2; proteína del núcleo del virus de la hepatitis B (HBV); Glicoproteína 125 (gp125) del virus de Epstein-Barr (VEB); factor de ensamblaje de la proteína de la membrana externa bacteriana BamA; proteína del módulo de ensamblaje de la translocación bacteriana TamA; proteína del dominio de la proteína asociada al transporte de polipéptidos bacterianos; antígeno de superficie bacteriana D15; proteína protectora del ántrax; factor letal del ántrax; factor de edema del ántrax; Salmonella typhii S1Da; Salmonella typhii S1Db; toxina del cólera; proteína de choque térmico del cólera; antígeno S de Clostridium botulinum ; toxina botulínica; Yersina pestis F1; antígeno V de Yersina pestis ; Yersina pestis YopH; Yersina pestis YopM; Yersina pestis YopD; Factor de activación del plasminógeno de Yersina pes tis (Pla); Proteína del circunsporozoito de Plasmodium (CSP); Proteína de superficie del esporozoito de Plasmodium (SSP2/TRAP); Antígeno 1 del estadio hepático de Plasmodium (LSA1); La proteína exportada 1 (EXP 1) de Plasmodium ; el antígeno de unión a eritrocitos 175 (EBA-175) de Plasmodium; el antígeno protector rico en cisteína (cyRPA) de Plasmodium; la proteína de choque térmico 70 (hsp70) de Plasmodium; la Sm29 de Schistosoma ; y la proteína de transducción de la señal 14-3-3 de Schistosoma.

7. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que las IP-MSC expresan un polipéptido inmunorreactivo que comprende una secuencia de región de unión a antígeno que se une específicamente a un antígeno del virus de Lassa y lo neutraliza.

8. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que las IP-MSC se preparan a partir de células madre mesenquimales derivadas de la médula ósea o de células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo.

9. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que el vector episomal comprende un casete de expresión del antígeno nuclear 1 del virus de Epstein-Barr (EBVNA1) y el origen de replicación OriP.

10. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que el vector episomal codifica un gen de apoptosis inducible.

11. La composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 10, en la que la activación del gen de apoptosis inducible está controlada por un sistema de activación transcripcional controlado por tetraciclina.