ES2820734T3

ES2820734T3 - Liposomas que comprenden criptandos de europio y su uso

Info

Publication number: ES2820734T3
Application number: ES14779079T
Authority: ES
Inventors: Matthew J Allen
Original assignee: Wayne State University
Current assignee: Wayne State University
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2014-03-11
Publication date: 2021-04-22
Anticipated expiration: 2034-03-11
Also published as: WO2014164712A1; EP2968150B1; US11185599B2; EP2968150A1; US20200023082A1; US20220047726A1; EP2968150A4; US20160022842A1

Abstract

Composición que comprende: un liposoma; un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma, incluyendo el complejo de metal europio un ion de metal europio y un ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos, incluyendo el complejo de metal europio Eu2+; y si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga, pudiendo cambiarse el ion de metal europio de un estado de oxidación 2+ a un estado de oxidación 3+ cuando se encapsula en el liposoma.

Description

DESCRIPCIÓN

Liposomas que comprenden criptandos de europio y su uso

El campo de la invención se refiere a la formación y usos de europio.

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional estadounidense n.° 61/776.354 presentada el 11 de marzo de 2013, correspondiente a la publicación US20160022842A1.

Campo técnico

En al menos un aspecto, la presente invención se refiere a agentes de contraste para obtención de imágenes por resonancia magnética.

Antecedentes

El poder de la obtención de imágenes por resonancia magnética (IRM) reside en la capacidad para determinar información anatómica con una alta resolución (<1 mm3). También puede obtenerse información molecular con IRM usando complejos paramagnéticos sensibles (agentes de contraste) que alteran las intensidades de señal del protón de agua en respuesta a acontecimientos químicos. Algunos agentes de contraste responden a cambios en el pH, la temperatura o la concentración de ion de metal; actividad enzimática; la presencia de radicales libres, antioxidantes, diésteres de fosfato u oxígeno singlete; o cambios en la presión parcial de oxígeno. Resultan de particular interés las dianas que provocan cambios en el comportamiento redox porque están asociadas con cáncer, inflamación y enfermedades cardiovasculares. Por tanto, los agentes de contraste sensibles que seleccionan como diana cambios redox tienen el potencial de mejorar en gran medida las capacidades de diagnóstico de IRM. Sin embargo, una limitación crítica de agentes de contraste sensibles que dificulta su uso in vivo es que la determinación de información molecular requiere conocimiento sobre la concentración de los agentes de contraste, lo cual es extremadamente difícil de medir in vivo. Algunos sistemas han logrado independencia de la concentración en IRM potenciada por contraste mediante técnicas radiométricas (tasas de relajación longitudinal frente a transversal), técnicas de transferencia de saturación por intercambio químico radiométricas (CEST), o el uso de modos de detección ortogonales con un agente multimodal. Sin embargo, ningún sistema notificado responde a acontecimientos de oxidación generales basándose en potenciales redox ajustables. Un metal ideal para una respuesta redox multimodal ajustable es Eu porque los estados de oxidación de Eu2+ y Eu3+ potencian de manera diferente imágenes ponderadas en Ti y de CESt en IRM. Además, Eu2+ tiene un potencial de oxidación ajustable y funciona mejor que agentes de contraste de acortamiento de T¹clínicamente aprobados a intensidades de campo magnético ultraaltas.

Por consiguiente, existe una necesidad de agentes de contraste mejorados para la obtención de imágenes por resonancia magnética.

Sumario

En al menos una realización, la presente invención proporciona una composición de contraste para IRM. La composición incluye un liposoma y un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma. El complejo de metal europio incluye un ion de metal europio y un ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos y si es necesario contraiones para mantener la neutralidad de carga (es decir, equilibra una carga del ion de metal europio y el ligando multidentado), pudiendo cambiarse el ion de metal europio entre un estado de oxidación 2+ y 3+. La presente realización proporciona ventajosamente un agente de contraste de modo doble sensible a la oxidación porque potenciará o bien imágenes ponderadas en T1 o bien imágenes de CEST dependiendo del estado de oxidación de Eu.

La invención se define por las reivindicaciones. Cualquier objeto que se encuentre fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con fines de información. Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento de un cuerpo humano o animal mediante terapia.

Se proporciona un liposoma que comprende un complejo de metal europio que tiene la fórmula (VIII):

en la que:

c es la carga de la combinación del átomo de metal europio y el ligando multidentado;

Xp representa un número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga;

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, alquilo C^1-12, alquinilo C^1-12, alquenilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, nitro, ciano, o arilo C^6-14, heteroarilo C^5-14o anillos de 5 y 6 miembros formados combinando R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes, =O combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, =S combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, o =NR combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono;

R es H o alquilo C^1-12; y

R⁴, R⁵, R6, R⁷son, cada uno independientemente, hidrógeno, ciano, nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH², arilo C^6-15, arilo C^6-18carboxilado, heteroarilo C^5-15, heteroarilo C^5-18carboxilado, alquilo C^1-12, fenilo, fenilo carboxilado, alquilo C^2-12carboxilado, -CO²H, -CH²CO²H,

y R8, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹²son, cada uno independientemente, H o CO²H. Ventajosamente, el compuesto VIII es útil como agente de contraste para IRM tanto si está encapsulado en un liposoma como si no.

En otra realización, se proporciona un método de obtención de imágenes por resonancia magnética de un órgano o una estructura de órgano en un sujeto. El método incluye una etapa de administrar una composición de liposoma al sujeto. La composición de liposoma incluye un liposoma y un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma. El complejo de metal europio incluye un ion de metal europio y un primer ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos y uno o más contraiones que equilibran una carga del ion de metal europio. Se captan imágenes de un órgano en el sujeto mediante obtención de imágenes por resonancia magnética.

El documento WO2011090977 describe un método de formación de un complejo de Eu(II) acuoso estable frente a la oxidación mediante síntesis de ligandos que se coordinan con metales grandes, suaves, ricos en electrones tales como Eu(II). El complejo puede usarse para una variedad de fines, algunos de los cuales incluyen, pero no se limitan a, transferencia de saturación por intercambio químico paramagnético, como diagnóstico médico, como semiconductor y para su uso en la formación de materiales.

El documento WO2006032705 describe un compuesto de agente de contraste para obtención de imágenes de CEST en el que dicho agente de contraste comprende un sistema de encapsulación de reserva de protones que contiene una reserva de protones desplazados móviles de agua.

El documento WO0160417 describe un sistema de conjugador que comprende liposomas con ionóforos y con disolución de quelante y radionúclido(s) de emisión de partículas alfa ubicado(s) dentro del liposoma. Además, se describe el método para la preparación de este tipo de liposomas radiactivos, así como el uso del sistema y un kit para preparar el sistema.

También se tuvo en cuenta el documento XP055279859 (es decir, JOEL GARCIA et al, “Physical Properties of Eu2+-Containing Cryptates as Contrast Agents for Ultrahigh-Field Magnetic Resonance Imaging”, EUROPEAN JOURNAL OF INORGANIC CHEMISTRY, DE, (20120208), vol. 2012, n.° 12, doi: 10.1002/ejic.201101166, ISSN 1434-1948, páginas 2135 - 2140 - http://dx.doi.org/10.1002/ejic.201101166), que describe estabilidades cinéticas y las denominadas “relaxividades” de una serie de criptatos que contienen Eu2+, para desarrollar agentes de contraste positivos eficaces para la obtención de imágenes por resonancia magnética, a partir de criptatos que contienen Eu2+. El cambio en la tasa de relajación longitudinal de protones de agua en presencia de Ca2+, Mg2+ y Zn2+, demostró que la estructura de criptato se ve influida por la estabilidad. Dos de los criptatos estudiados eran inertes frente a la transmetalación en presencia de los iones endógenos. Se encontró que la relaxividad de criptato era superior a intensidades de campo ultraaltas (7 y 9,4 T) con respecto a intensidades de campo clínicamente relevantes (1,4 y 3 T). La eficiencia de estos criptatos disminuyó a medida que aumentó la temperatura. Una variación del pH no proporcionó ningún cambio significativo en la eficacia de los criptatos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 proporciona una representación esquemática de la oxidación de Eu(2.2.2)2+ encapsulado en liposoma (potenciación de T1, presente en CEST) para formar un liposoma relleno con Eu3+ (silenciado en T1, potenciación de CEST aumentada). En la parte derecha hay una representación de la bicapa fosfolipídica liposomal con óvalos como moléculas de colesterol. Por motivos de claridad, sólo se muestra un complejo en cada liposoma y no se dibujan las moléculas de agua coordinadas;

la figura 2 proporciona potenciales de oxidación para diversos complejos de europio/criptando;

la figura 3 proporciona ejemplos específicos de criptandos y tiacriptandos que son útiles como ligandos multidentados en la formación de complejos de europio;

la figura 4 proporciona rutas de síntesis para formar criptandos que son útiles como ligandos multidentados en la formación de complejos de europio;

la figura 5 proporciona ejemplos específicos de criptandos y tiacriptandos que son útiles como ligandos multidentados en la formación de complejos de europio;

la figura 6 proporciona espectros de CEST con ajuste lorentziano (7 T, temperatura ambiental) de liposomas antes (línea discontinua) y después (línea continua) de la exposición al aire. Se ajustó la referencia de agua en volumen a 0 ppm y se calcularon intensidades de señal a partir de imágenes in vitro después de una saturación previa de 2 s con un impulso de radiofrecuencia de 17 pT de desde 5 hasta -5 ppm en incrementos de 0,2 ppm;

la figura 7 proporciona MTRasim frente al desplazamiento de frecuencia de saturación previa para liposomas antes (línea discontinua) y después (línea continua) de la exposición al aire. Se calculó la MTRasim usando funciones lorentzianas ajustadas;

la figura 8 proporciona imágenes de modelo de RM (diámetro de tubo de 5 mm, 7 T y temperatura ambiental) de agua, liposomas no oxidados que contienen Eu2+ y liposomas oxidados que contienen Eu3+. La fila superior contiene imágenes ponderadas en 71, y la fila inferior contiene mapas de CESt generados restando la saturación previa a 1,2 ppm a partir de la saturación previa a -1,2 ppm y dividiendo la diferencia entre la saturación previa a -1,2 ppm; y

la figura 9 proporciona una representación gráfica de T1 frente al tiempo del complejo que contiene EuII de ligando 4 (3 mM) en ausencia (□) y presencia (o) de glutatión (325 mM).

Descripción detallada

Ahora se hará referencia en detalle a composiciones, realizaciones y métodos actualmente preferidos de la presente invención que constituyen los mejores modos de poner en práctica la invención actualmente conocidos por los inventores. Las figuras no están necesariamente a escala. Sin embargo, debe entenderse que las realizaciones dadas a conocer son simplemente a modo de ejemplo de la invención que puede implementarse de formas diversas y alternativas.

Excepto en los ejemplos, o cuando se indique expresamente lo contrario, debe entenderse que todas las cantidades numéricas en esta descripción que indican cantidades de material o condiciones de reacción y/o uso están modificadas por el término “aproximadamente” al describir el alcance más amplio de la invención. Generalmente se prefiere la práctica dentro de los límites numéricos mencionados. Además, a menos que se mencione expresamente lo contrario: los valores en porcentaje, “partes de” y valores de razón son en peso; la descripción de un grupo o clase de materiales como adecuados o preferidos para un fin dado en relación con la invención implica que mezclas de dos cualesquiera o más de los elementos del grupo o clase son igualmente adecuados o preferidos; la descripción de constituyentes en términos químicos se refiere a los constituyentes en el momento de la adición a cualquier combinación especificada en la descripción, y no excluye necesariamente interacciones químicas entre los constituyentes de una mezcla una vez mezclados; la primera definición de un acrónimo u otra abreviatura se aplica a todos los usos posteriores en el presente documento de la misma abreviatura y se aplica, cambiando lo que sea necesario, a variaciones gramaticales normales de la abreviatura inicialmente definida; y, a menos que se mencione expresamente lo contrario, la medición de una propiedad se determina mediante la misma técnica que la mencionada anterior o posteriormente para la misma propiedad. A menos que se mencione lo contrario, todos los grupos R incluyen H, alquilo C^1-12, alquinilo C^1-12, alquenilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, nitro, ciano, o arilo C^6-14o heteroarilo C^5-14.

También debe entenderse que esta invención no está limitada a las realizaciones específicas y los métodos descritos a continuación, ya que, evidentemente, los componentes y/o condiciones específicos pueden variar. Además, la terminología usada en el presente documento se usa únicamente con el fin de describir realizaciones particulares de la presente invención y no se pretende que sea limitativa de ninguna manera.

Debe indicarse que, tal como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, la forma en singular “un”, “una” y “el/la” comprende referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, se pretende que la referencia a un componente en singular comprenda una pluralidad de componentes.

A lo largo de la totalidad de esta solicitud, cuando se hace referencia a publicaciones, las divulgaciones de esas publicaciones en su totalidad describen completamente el estado de la técnica a la que se refiere esta invención.

El término “ liposoma” tal como se usa en el presente documento se refiere a vesícula encerrada en membrana preparada de manera artificial compuesta por bicapas de compuestos anfífilos, que se caracterizan por tener un grupo hidrófilo y uno hidrófobo en la misma molécula. Los liposomas incluyen de una a varias de estas bicapas.

El término “alquilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye radicales de hidrocarburo monovalentes, saturados, C^1-12, que tienen restos lineales o ramificados, incluyendo, pero sin limitarse a, metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, terc-butilo y similares.

El término “alquenilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye grupos alquilo C^2-12, tal como se definió anteriormente, que tienen al menos un doble enlace carbono-carbono, tales como -CH2-CH=CH2.

El término “alquinilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye grupos alquilo C^2-12, tal como se definió anteriormente, que tienen al menos un triple enlace carbono-carbono, tales como -CH²CECH.

El término “alquilenilo”, tal como se usa en el presente documento, a menos que se indique lo contrario, incluye radicales de hidrocarburo divalentes, saturados, C^1-12, que tienen restos lineales o ramificados.

El término “criptando” tal como se usa en el presente documento significa un ligando multidentado de poliazo-poliéter bi y policíclico, en el que átomos de nitrógeno de tres coordinaciones proporcionan los vértices de una estructura tridimensional.

El término “tiacriptando” tal como se usa en el presente documento significa un criptando con al menos un átomo de oxígeno sustituido por un átomo de azufre.

El término “carboxilado” tal como se usa en el presente documento significa que un resto químico está sustituido con CO²H (o CO²-).

El término “sujeto” se refiere a un ser humano o animal, incluyendo todos los mamíferos tales como primates (particularmente primates superiores), oveja, perro, roedores (por ejemplo, ratón o rata), cobaya, cabra, cerdo, gato, conejo y vaca.

En una realización, se proporciona una composición útil para aplicaciones de obtención de imágenes por resonancia magnética. La composición incluye una pluralidad de liposomas, complejos de metal europio (Eu) dispuestos dentro de los liposomas. Cada complejo de metal europio incluye un ion de metal europio y un primer ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos. La composición también incluye, si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga (por ejemplo, uno o más contraiones que equilibran la carga del ion de metal europio y el ligando multidentado). El átomo de metal europio tiene normalmente una carga formal de 2 o 3 dependiendo del estado de oxidación. Dependiendo de los sustituyentes en el ligando multidentado, el ligando también puede tener una carga formal en condiciones fisiológicas. Por ejemplo, los carboxilatos pueden tener una carga negativa en condiciones fisiológicas. Los contraiones hacen que el complejo de metal europio sea neutro. Los ejemplos de contraiones cuando la combinación de átomo de metal europio y ligando multidentado es positiva incluyen, pero no se limitan a, haluro, hidróxido, bicarbonato, fosfato y similares. Los ejemplos de contraiones cuando la combinación de átomo de metal europio y ligando multidentado es negativa incluyen, pero no se limitan a, iones de metales alcalinos (por ejemplo, Na+, K+), H+, otros iones de metales y similares. La figura 1 ilustra un liposoma 10 que encapsula complejo 12 de metal europio. Sorprendentemente, los iones de metal europio pueden cambiarse entre un estado de oxidación 2+ y 3+ incluso cuando están encapsulados en el liposoma tal como se ilustra en la figura 1. La oxidación de Eu2+ para dar Eu3+ proporciona modos ortogonales de detección mediante IRM. El cambio de estado de oxidación Eu2+/3+ ofrece una plataforma ideal para la potenciación de contraste sensible al oxígeno. En las variaciones y refinamientos expuestos a continuación, cambios en la estructura de ligando hicieron que el potencial de oxidación correspondiente de Eu2+ pudiera ajustarse a lo largo de un intervalo fisiológicamente relevante. Por ejemplo, la figura 2 proporciona el potencial de oxidación para varios complejos demostrando de ese modo la durabilidad y estabilidad de estos compuestos. La encapsulación de los complejos de metal europio en liposomas proporciona ventajosamente obtención de imágenes de diagnóstico independiente de la concentración de estados patológicos con actividad redox usando la química de Eu.

Normalmente, cada liposoma incluye un fosfolípido tal como diésteres de ácidos grasos de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o esfingomielina. Un fosfolípido particularmente útil es 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina. En muchas variaciones útiles, la composición también incluye un portador acuoso farmacéuticamente aceptable tal como un tampón acuoso. En un refinamiento, los liposomas tienen un diámetro promedio de menos de aproximadamente 200 nm. En todavía otros refinamientos, los liposomas tienen un diámetro promedio de menos de aproximadamente, en orden creciente de preferencia, 200 nm, 150 nm, 130 nm, 120 nm y 100 nm. En aún otros refinamientos, los liposomas tienen un diámetro promedio mayor de aproximadamente, en orden creciente de preferencia, 40 nm, 50 nm, 60 nm, 70 nm y 80 nm.

El complejo de metal europio puede incluirse en los liposomas mediante cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica para incluir fármacos en liposomas. Se exponen ejemplos de tales técnicas en J.S. Dua et al., Liposome: Methods of Preparation and Applications, International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, vol. III / número II / abril-junio (2012), pág. 14-20. En general, se combina una disolución acuosa del complejo de metal europio expuesto anteriormente con un precursor de formación de liposoma o un liposoma previamente formado dando como resultado la inclusión del complejo en la cavidad del liposoma. Los métodos específicos para formar los liposomas e incorporar el complejo de metal europio en el liposoma incluyen, pero no se limitan a, el método de método de hidratación de película delgada, el método de inyección de éter, método de inyección de etanol, método de retirada de detergente y similares. En un refinamiento, los liposomas son unilamelares. En otro refinamiento, los liposomas son multilamelares. En algunos refinamientos, los liposomas incluyen además un compuesto anfífilo adicional tal como colesterol.

En una variación, el ligando multidentado es un 2.2.2-criptando sustituido, un 2.2.2-criptando no sustituido, un 2.2.2-tiacriptando sustituido o un 2.2.2-tiacriptando no sustituido. Debe indicarse que los complejos de metal europio usados en el presente documento son estables frente a la oxidación en medio acuoso dependiendo el grado de estabilización de los sustituyentes en el criptando. En esta variación, el ligando multidentado se describe de manera general mediante la fórmula I:

en la que:

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, alquilo C^1-12, alquinilo C^1-12, alquenilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, nitro, ciano, o arilo C^6-14, heteroarilo C^5-14o anillos de 5 y 6 miembros formados combinando R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes, =O combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, =S combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, o =NR combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono; y

R es H o alquilo C^1-12. Debe apreciarse que según esta terminología los R¹pueden ser diferentes unos de otros, los R²pueden ser diferentes unos de otros y los R³pueden ser diferentes unos de otros. En un refinamiento, R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes forman un grupo fenilo. En otro refinamiento, R¹, R²o R³son, cada uno independientemente, H, fenilo o bifenilo. En algunos refinamientos, R²y R³son hidrógeno y uno de los R¹no es hidrógeno. En otros refinamientos, R²y R³son hidrógeno y dos de los R¹no son hidrógeno. Se exponen ejemplos de criptandos y tiacriptandos y complejos de europio que incluyen estos restos que son útiles en las composiciones de la presente invención en el documento US20130078189 y en J. Garcia etal., Physical Properties of Eu2+-Containing Cryptates as Contrast Agents for Ultrahigh-Field Magnetic Resonance Imaging, Eur. J. Inorg. Chem. 2012, 2135-2140.

La figura 3 proporciona ejemplos específicos de criptandos y tiacriptandos que son útiles como ligandos multidentados en la presente invención. Las figuras 4 y 5 proporcionan rutas de síntesis para preparar algunos de los complejos de Eu de la presente realización. La siguiente fórmula proporciona una representación del complejo de Eu con el ligando de fórmula I:

en la que c es la carga de la combinación del átomo de metal europio y el ligando multidentado. En un refinamiento, c es desde -3 hasta 3. Cuando el ligando multidentado es neutro, c es 2 o3. Xp representa un número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga. X es un contraión tal como se expuso anteriormente y p es el número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga. Normalmente, p es un número entero de desde 0 hasta 3.

En una variación de la presente realización, la composición incluye además un antioxidante. La inclusión de un antioxidante limita la toxicidad de complejos de metal europio y mejora la estabilidad (es decir, estabilidad oxidativa). Pueden usarse estudios tanto in vitro (ensayos basados en T1 en el aire) como in vivo (ensayos de dosis máxima tolerada acoplados con estudios de biodistribución) para evaluar la toxicidad de los complejos. Los ejemplos de antioxidantes incluyen, pero no se limitan a, glutatión, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol, S-adenosilmetionina, ditiocarbamato, dimetilsulfóxido, cisteína, metionina, cisteamina, oxo-tiazolidin-carboxilato, ácido timonácico, malotilato, 1,2-ditiol-3-tiona, 1,3-ditiol-2-tiona, lipoamida, sulfarlem, oltipraz, taurina, N-acetilcisteína y combinaciones de los mismos.

Se describen ejemplos adicionales del ligando multidentado mediante las siguientes fórmulas:

en las que Y, Z, Y1 e Y2 son, cada uno independientemente, O o S; X1, X2, X3 son independientemente nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH²o CH²CO²H; y R, R' son independientemente nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH²o CH²CO²H.

Otro ejemplo del ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

en la que

Otro ejemplo del ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

en las que x e y son 0, 1,2 o 3 con la condición de que la suma de x e y es 3.

En otra realización, se proporciona un compuesto útil como agente de contraste para IRM que tiene la fórmula II:

en la que:

n, o son, cada uno independientemente, 1 o 2;

L¹es un criptando o tiacriptando que se une a Eu;

L²es un ligando multidentado que se une a Gd;

X es un contraión tal como se expuso anteriormente y p es el número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga. Normalmente, p es un número entero de desde 0 hasta 3; y

Sp es un resto separador que proporciona separación entre Eu y Gd. Normalmente, Sp incluye -(CH²)n-, alquilenilo C²-¹², alquinilo C^2-12, arilo C^6-12, heteroarilo C^5-12, grupos urea (-NHCO-NH-), grupos tiourea (-NHCSNH-), grupos carbamato (-NHCOO-), grupos amina C^1-10, grupos ^{O h ,}grupos NH, grupos alquenilo C^1-10y combinaciones de los mismos en los que n es de 1 a 12. En un refinamiento, el compuesto que tiene la fórmula (II) está dispuesto con un liposoma tal como se expuso anteriormente.

Los ejemplos de Sp incluyen:

-(CH²)n-HNCONH-, -(CH²)n-HNCSNH- y -(CH²)n-. En una variación, Li se describe mediante la siguiente fórmula:

siendo al menos un R¹, R²o R³un enlace con Sp o teniendo un enlace con Sp. Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S; R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, alquilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, nitro, ciano, o arilo C^6-14, heteroarilo C^5-14o anillos de 5 y 6 miembros formados combinando R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes, =O combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, =S combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, o =NR combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono; y R es H o alquilo C^1-12. En un refinamiento, R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes forman un grupo fenilo. En otro refinamiento, R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, fenilo o bifenilo. En una variación, L²incluyen una pluralidad de grupos que tienen la fórmula IV:

En un refinamiento, L²incluye un resto que tiene la siguiente fórmula:

Ejemplos específicos de compuestos que tienen la fórmula (II) son los siguientes compuestos:

Debe apreciarse que los compuestos de la presente realización pueden funcionar como agentes de “campo universal” que funcionan en instrumentos tanto de campo bajo como de campo alto.

En otra realización, se proporciona un complejo de metal europio que comprende un ion de metal europio, un compuesto multidentado que tiene la fórmula VIII y, si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga:

El complejo de metal europio se representa mediante la siguiente fórmula:

en la que:

c es la carga de la combinación del átomo de metal europio y el ligando multidentado. En un refinamiento, c es desde -3 hasta 3. Cuando el ligando multidentado es neutro, c es 2 o 3. Xp representa un número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga. X es un contraión tal como se expuso anteriormente y p es el número de contraiones necesarios para la neutralidad de carga. Normalmente, p es un número entero de desde 0 hasta 3;

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

R es H o alquilo C^1-12. En un refinamiento, R¹, R²o R³en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes forman un grupo fenilo. En otro refinamiento, R¹, R²o R³son, cada uno independientemente, H, fenilo o bifenilo; y

R8, R⁹, R¹⁰, R¹¹, R¹²son, cada uno independientemente, H o CO²H. Debe apreciarse que estos compuestos pueden encapsularse en liposomas tal como se expuso anteriormente. Refinamientos de la presente realización son útiles como agentes de obtención de imágenes de T1 de “campo ultraalto”.

En otra realización, se proporciona un complejo de metal europio que comprende un ion de metal europio, un compuesto multidentado que tiene la fórmula IX y, si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga:

El complejo de metal europio se representa mediante la siguiente fórmula:

en la que:

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, alquilo C^1-12, alquinilo C^1-12, alquenilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, nitro, ciano, o arilo C^6-14, heteroarilo C^5-14o anillos de 5 y 6 miembros formados mediante R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes, =O combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, =S combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, o =NR combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono; y

R es H o alquilo C^1-12. En un refinamiento, R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes forman un grupo fenilo. En otro refinamiento, R¹, R²o R³son, cada uno independientemente, H, fenilo o bifenilo. Debe apreciarse que estos compuestos pueden encapsularse en liposomas tal como se expuso anteriormente.

En otra realización, se proporciona un complejo de metal europio que comprende un ion de metal europio, un compuesto multidentado que tiene la fórmula X y, si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga:

El complejo de metal europio se representa mediante la siguiente fórmula:

en la que:

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

En otra realización, un método de obtención de imágenes por resonancia magnética de un órgano o una estructura de órgano en un sujeto. Pueden detectarse complejos basados en Eu2+ encapsulados dentro de liposomas con obtención de imágenes por RM ponderada en T¹convencional mientras que la oxidación para dar Eu3+ dará como resultado un agente de contraste que puede detectarse con obtención de imágenes por transferencia de saturación por intercambio químico paramagnética (PARACEST). El método incluye una etapa de administrar una composición de liposoma al sujeto y después tomar imágenes del órgano de interés en el sujeto mediante obtención de imágenes por resonancia magnética. La composición de liposoma incluye un liposoma; y un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma. El complejo de metal europio incluye un ion de metal europio y un primer ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos, y uno o más contraiones que equilibran la carga del ion de metal europio. Los detalles del liposoma, el complejo de metal europio y los ligandos multidentados se expusieron anteriormente. En un refinamiento, la obtención de imágenes por resonancia magnética es obtención de imágenes ponderada en T1. En otro refinamiento, la obtención de imágenes por resonancia magnética es mediante transferencia de saturación por intercambio químico (CEST) y, en particular, PARACEST. En todavía otro refinamiento, el método realiza un seguimiento de la migración del agente de contraste con obtención de imágenes ponderada en T¹y después, tras la desaparición de la potenciación de T1, se cambia el modo de detección de obtención de imágenes a CEST. En estos refinamientos, la presencia de CEST indicará oxidación, y una ausencia de potenciación de CEST indicará aclaramiento del agente de contraste. Además, puede usarse potenciación de CEST para indicar uno o más estados patológicos específicos porque el potencial de oxidación, y por consiguiente la pérdida de potenciación de T1, de Eu2+ puede ajustarse mediante modificaciones en la estructura de ligando. En general, la obtención de imágenes por resonancia magnética implica posicionar el sujeto en un campo magnético que tiene normalmente un gradiente espacial. Se aplica un impulso electromagnético (es decir, impulso de radiofrecuencia) al sujeto haciéndose variar la frecuencia a lo largo de una región en la que resuenan los átomos de hidrógeno. A la frecuencia de resonancia para los átomos de hidrógeno de agua en la región espacial que está explorándose, se produce absorción monitorizándose la señal posteriormente emitida para proporcionar la imagen ponderada en T¹. En la obtención de imágenes de CEST, los átomos de hidrógeno para agua en los liposomas se llevan hasta la saturación mediante el impulso electromagnético aplicado. La magnetización resultante se transfiere a moléculas de agua móviles fuera de los liposomas monitorizándose la emisión desde los átomos de hidrógeno sobre estas moléculas de agua móviles para proporcionar los datos requeridos para la obtención de imágenes de CEST.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas dadas a conocer en los ejemplos representan técnicas y composiciones que los inventores han descubierto que funcionan bien en la puesta en práctica de realizaciones dadas a conocer en el presente documento, y por tanto puede considerarse que constituyen modos preferidos para su puesta en práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente divulgación, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones específicas que se dan a conocer y obtener un resultado igual o similar.

Las composiciones expuestas anteriormente usan liposomas porque su cavidad interna acuosa puede encapsular agentes de contraste solubles en agua para mejorar la sensibilidad de CEST aumentando la razón de protones de agua químicamente desplazados (dentro de los liposomas) con respecto a protones de agua en volumen (fuera de los liposomas) (Aime, S.; Castelli, D. D.; Terreno, E. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5513-5515). La composición de liposoma se adaptó a partir de un informe que usó 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina y colesterol (Gianolio, E.; Porto, S.; Napolitano, R.; Baroni, S.; Giovenzana, G. B.; Aime, S. Inorg. Chem. 2012, 51, 7210-7217), y se caracterizaron los liposomas usando dispersión de luz dinámica. El diámetro promedio medido antes y después de la exposición al aire fue de 110 ± 7 y 106 ± 7 nm, respectivamente, en el que el error es el error estándar calculado a partir de los valores de índice de polidispersidad promedio. El valor de índice de polidispersidad de liposoma promedio antes y después de la exposición al aire fue de 0,14 ± 0,01 y 0,10 ± 0,06, respectivamente, en el que el error de índice de polidispersidad es el error estándar a un intervalo de confianza del 95%. Estos datos de distribución de tamaño indican que el tamaño de liposoma promedio no era diferente antes y después de la oxidación (prueba de la t de Student) y, por consiguiente, no se veía afectado por la formación intraliposomal de Eu3+.

Para evaluar la respuesta de los presentes liposomas, se midieron suspensiones de liposomas que contenían Eu(2.2.2)2+ antes y después de la exposición al aire y se observó un alargamiento de T¹tras la exposición al aire (0,4 y 2,8 s antes y después de la exposición al aire, respectivamente, 24°C, 11,7 T, Eu 45 mM). Esta observación concuerda correctamente con la naturaleza de acortamiento de T¹de Eu(2.2.2)2+ (Garcia, J.; Neelavalli, J.; Haacke, E. M.; Allen, M. J. Chem. Commun. 2011, 47, 12858-12860 y Garcia, J.; Kuda-Wedagedara, A. N. W.; Allen, M. J. Eur. J. Inorg. Chem. 2012, 2012, 2135-2140) e indica que la oxidación para formar Eu3+ provocó el alargamiento observado de T¹. Además, los datos sugieren que la tasa de intercambio de agua entre agua intraliposomal y en volumen es suficientemente rápida como para una potenciación de contraste positiva.

Para caracterizar el comportamiento de modo doble de liposomas que contienen Eu, se midió la respuesta antes y después de la exposición al aire usando intensidades de imágenes in vitro en función del desplazamiento de frecuencia de saturación previa a 7 T. Se ajustaron los datos de intensidad con una función lorentziana usando ajustes de mínimos cuadrados para el agua en volumen de referencia a 0 ppm (figura 6). Se usó ajuste lorentziano porque las imágenes de muestra se adquirieron simultáneamente y las señales de agua en volumen no estaban centradas en 0 ppm, probablemente debido a faltas de homogeneidad en el campo magnético. Resulta interesante que no se observó la saturación de la señal de agua en volumen después de la exposición al aire. El espectro de CEST reveló que los liposomas antes y después de la exposición al aire de 24 horas tenían protones de agua intraliposomal intercambiables a 1,4 y 1,2 ppm, respectivamente, con respecto al agua en volumen. Una posible explicación para la observación de CEST tanto antes como después de la oxidación es que una diferencia de osmolalidad entre agua intraliposomal y en volumen provocó una contracción osmótica de los liposomas. La osmolalidad intraliposomal influye en el desplazamiento químico de protones de agua intraliposomal, y este fenómeno se ha demostrado para liposomas que contienen Gd3+.

Se realizó un análisis de asimetría de razón de transferencia de magnetización (MTRasim, figura 7) porque las señales intercambiables parecían solaparse parcialmente con la señal de agua en volumen. El análisis de MTRasim elimina el efecto de la saturación directa de agua en volumen para revelar asimetrías en el espectro de CEST. Se calcularon valores de MTRasim a partir del ajuste lorentziano usando (S-A“ - SA“ )/S⁰, donde S-A“ y SA“ son las intensidades de señal de agua en volumen a los desplazamientos de frecuencia negativo y positivo, respectivamente, con respecto a la frecuencia de protón en volumen ajustada a la referencia de 0 ppm; y S⁰es la intensidad de señal de agua en volumen después de la saturación previa a -5 ppm. El espectro de MTRasim confirmó la existencia de reservas intercambiables de protones de agua intraliposomal y también reveló la potenciación de CEST aumentada para liposomas después de la exposición al aire. Una explicación para la CEST aumentada después de la exposición al aire es que la presencia de Eu3+ desplazó químicamente los protones de agua intraliposomal y aumentó la potenciación de CEST. Otra posible explicación es que la oxidación para dar Eu3+ redujo la osmolalidad intraliposomal, lo cual contrajo los liposomas y aumentó la intensidad de CEST. Esta explicación concuerda con las presentes observaciones porque la contracción de liposomas mediante un gradiente de presión osmótica no se detecta fácilmente mediante dispersión de luz dinámica. Esta última explicación se basa en que la estabilidad cinética de Eu(2.2.2)3+ es inferior a la de Eu(2.2.2)2+. Por consiguiente, Eu3+ está probablemente presente como mezcla de especies dentro de los liposomas que incluyen Eu(2.2.2)3+, Eu3+ acuoso y complejos de fosfato. Una tercera explicación posible para el cambio en la CEST observada es que la presencia de múltiples especies que contienen Eu3+ alteró la permeabilidad al agua de la membrana de liposoma aumentando la potenciación de CEST después de la exposición al aire. Actualmente están realizándose investigaciones que exploran estas tres posibilidades, lo cual también puede explicar la saturación incompleta de agua en volumen después de la exposición al aire.

Para visualizar la naturaleza de las respuestas de Eu2+/3+, se adquirieron imágenes in vitro de suspensiones de los liposomas antes y después de la exposición al aire (figura 8). Las imágenes ponderadas en T1 confirmaron una potenciación de contraste positiva para los liposomas que contienen Eu(2.2.2)2+ y también revelaron que no había ninguna diferencia en la intensidad de señal entre el agua y los liposomas que contienen Eu3+ oxidados al intervalo de confianza del 95% (prueba de la t de Student). Para cuantificar la potenciación de CEST, se usaron las intensidades de imágenes de modelo para calcular el % de CEST definido como (1 - Mactivada/Mdesactivada) x 100, donde Mactivada y Mdesactivada son las intensidades de señal promedio en las posiciones de resonancia activada y desactivada. El mapa de CEST confirmó la presencia de agua intraliposomal intercambiable antes y después de la oxidación y que el % de CEST aumentó desde el 52% hasta el 77% después de la exposición al aire. Estos datos demuestran una clara respuesta de modo doble y revelan el estado de oxidación de Eu sin conocimiento sobre su concentración. Con esta demostración de obtención de imágenes ortogonales claras, se prevé realizar el seguimiento de la migración del agente de contraste con obtención de imágenes ponderada en T¹. Tras la desaparición de la potenciación de T1, el modo de detección de obtención de imágenes se cambiará a CEST. La presencia de CEST indicará la oxidación, y una ausencia de potenciación de CEST indicará el aclaramiento del agente de contraste. Además, puede usarse potenciación de CEST para indicar uno o más estados patológicos específicos porque el potencial de oxidación, y por consiguiente la pérdida de potenciación de T1, de Eu2+ puede ajustarse mediante modificaciones en la estructura de ligando. Por consiguiente, los presentes datos in vitro proporcionan un fuerte infraestructura para optimizar el presente sistema para la obtención de imágenes in vivo.

Para demostrar que los liposomas no lixiviaban Eu, se filtraron los liposomas oxidados y se midió que la concentración de Eu del filtrado estaba por debajo del límite de detección (<66 nM) de la espectroscopía de emisión óptica con plasma acoplado de manera inductiva.

En conclusión, las realizaciones de la invención proporcionan el primer agente de contraste de modo doble sensible a la oxidación para IRM basado en la química redox de Eu. La potenciación del contraste en modos de obtención de imágenes ortogonales permite la detección de estados de oxidación de Eu sin conocimiento sobre la concentración de agente de contraste. Por estos motivos, se espera que este sistema abra la puerta para la obtención de imágenes moleculares usando el cambio redox de Eu2+/3+.

Procedimientos experimentales

Los productos químicos comercialmente disponibles fueron de una pureza de calidad para reactivo o mejor y se usaron sin purificación adicional a menos que se indique lo contrario. Se purificó el agua usando un sistema de purificación de agua PURELAB Ultra Mk2 (ELGA) y se desgasificó antes de su uso. Se realizaron análisis mediante espectroscopia de RMN y espectroscopía de emisión óptica con plasma acoplado de manera inductiva (ICP-OES) en el Lumigen Instrument Center en el departamento de química de la universidad estatal Wayne. Se realizó la obtención de imágenes de modelo in vitro en el hospital Henry Ford.

Se obtuvieron medidas de T¹de recuperación de inversión usando un espectrofotómetro Varian VNMRS 500 (499,48 MHz, 11,7 T) antes de la exposición al aire o después de 24 h de exposición al aire. Se añadió óxido de deuterio (NaCl a 300 mOsm) para realizar suspensiones de liposoma de D²O al 5% (v/v) con el fin de bloqueo y compensación.

Se realizaron exploraciones de IRM con un explorador de IRM para animales pequeño 7 T Varian (299,44 MHz, 7,0 T) equipado con un imán con cavidad de 12 cm y una bobina de tipo jaula de cuadratura de transmisión/recepción realizada de manera interna de 38 mm de diámetro. Las muestras incluyeron liposomas que no se expusieron al aire, liposomas que se expusieron al aire durante 24 h y agua. Se adquirieron las imágenes ponderadas en T¹a temperatura ambiental (tiempo de eco: 11 ms; tiempo de repetición: 320 ms; siete segmentos de imagen a un grosor de 1 mm; campo de visión de 24 * 24 mm2; y cuatro promedios). Se midieron los efectos del Eu3+ encapsulado en liposoma (transferencia de saturación por intercambio químico, CEST) a temperatura ambiental con los mismos parámetros que los usados en un estudio de IRM de CEST anterior. Se aplicó una secuencia de impulsos de IRM de RARE con un factor de RARE de 8 (tiempo de repetición/tiempo de eco, 4,0 s/11 ms) con un poder de saturación de 17 pT durante 2 s. Se requirieron un total de 64 s para adquirir una única imagen de RM con 128 * 128 pixeles que cubrió un campo de visión de 24 * 24 mm2, un único segmento con un grosor de 1 mm, y un único promedio. Se midió la señal de agua para cada modelo cuando se aplicó saturación entre 5 y -5 ppm en incrementos de 0,2 ppm para medir el efecto de CEST de los liposomas, y se adquirió la figura 4 en el documento a 1,2 ppm (SA“ ) y -1,2 ppm (S'A“ ).

Se convirtieron archivos de formato de datos flexible (FDF) de Varian en archivos de formato de archivo de imágenes con etiqueta (TIFF) con un código MATLAB. Se procesaron los archivos TIFF para producir espectros de transferencia de saturación por intercambio químico (CEST) midiendo intensidades de pixel con ImageJ 1.47. Se realizó un análisis de asimetría de razón de transferencia de magnetización (MTRasim) del ajuste lorentziano porque la señal de protón intraliposomal intercambiable se solapó parcialmente con la señal de protón de agua en volumen. Se calculó MTRasim usando la ec. 1.4

En la ec. 1, S-A“ y SA“ son las intensidades de señal de agua en volumen a los desplazamientos de frecuencia negativo y positivo, respectivamente, con respecto a la frecuencia de protón de agua en volumen ajustada a la referencia de 0,00 ppm; y S⁰es la intensidad de señal de agua en volumen después de la saturación previa a -5 ppm. Se calculó el porcentaje de CEST (% de CEST) usando la ec. 2.5

ec. 2 % de CEST = ( l — Mactímda ) 100

En la ec. 2, Mactivada y Mdesactivada son las intensidades de señal promedio (calculadas con ImageJ) del mismo segmento de tubo de modelo a 360 Hz (1,2 ppm) y -360 Hz (-1,2 ppm), respectivamente. La imagen de CEST se creó restando el segmento de TIFF a 360 Hz (1,2 ppm) del segmento idéntico a -360 Hz (-1,2 ppm) y se dividió la diferencia entre el segmento a 360 Hz (-1,2 ppm). La barra de escala del % de CEST se creó calibrando el intervalo de píxeles de la imagen de CEST hasta el valor de % de CEST máximo obtenido a partir de la ec. 2 usando un ajuste lineal.

Se obtuvieron datos de dispersión de luz dinámica usando un instrumento Malvern Zetasizer Nano-ZS (ZEN3600) que funcionaba con un láser con una longitud de onda de 633 nm. Se retiró el polvo a partir de muestras filtrando a través de filtros hidrófilos de 0,2 pm (Millex-LG, SLLGR04NL). Se prepararon muestras de liposoma para experimentos de dispersión de luz diluyendo (1:10) suspensiones de liposoma purificadas en solución salina tamponada con fosfato iso-osmolar [PBS; Na2HPO4 (29 mM), NaH2PO4 (46 mM), NaCl (57 mM) y KCl (2,1 mM); pH 7,0]. Para mediciones de tamaño de liposoma sin exposición al aire, se rellenaron cubetas estancas al aire en una caja de guantes bajo una atmósfera de Ar.

Se adquirieron medidas de ICP-OES en un espectrómetro Jobin Yvon Horiba Ultima. Se diluyeron todas las muestras con HNO³al 2%, que también se usó para muestras de blanco durante la calibración. Se creó la curva de calibración usando la intensidad de emisión de Eu a 381,965 nm para un intervalo de concentración de 1-10 ppm (diluido a partir de disolución estándar Alfa Aesar Specpure AAS, Eu2O3 en HNO³al 5%, 1000 pg/ml) y se diluyeron todas las muestras para que se encontraran dentro de este intervalo.

Preparación de la disolución de hidratación

Se preparó la disolución de hidratación agitando una disolución acuosa de EuCl²y 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano (criptando) durante 12 h bajo una atmósfera de Ar seguido por un tratamiento final con tampón fosfato.6 Para tener en cuenta la pérdida de fosfato durante la etapa de precipitación de este experimento, se preparó una disolución madre de PBS con una alta concentración de fosfato (1 M). El propósito de la alta concentración de fosfato era garantizar que no se perdía la capacidad de tamponamiento de PBS tras la precipitación de fosfato en presencia de Eu3+ sin complejar en las muestras expuestas a oxígeno y para mantener la osmolalidad fisiológica (300 mOsm). Se preparó esta disolución de PBS en una caja de guantes bajo una atmósfera de Ar disolviendo fosfato de sodio dibásico anhidro (42,6 g, 0,300 mol), fosfato de sodio monobásico monohidratado (27,6 g, 0,200 mol), cloruro de sodio (22,3 g, 0,381 mol) y cloruro de potasio (1,01 g, 13,6 mmol) en H²O (500 ml). Se llevó el pH de la disolución resultante a 7,0 con la adición de hidróxido de sodio sólido (3,87 g, 96,8 mmol).

A un vial de vidrio de 4 ml equipado con una barra de agitación magnética se le añadieron EuCh acuoso (261,4 pl, 206,6 mM, 1 equiv) y criptando acuoso (207,7 pl, 260,0 mM, 1 equiv) bajo una atmósfera de Ar. Se agitó la disolución incolora, transparente resultante durante 12 h antes de la adición de PBS [60 pl; Na2HPO4 (383 mM), NaH2PO4 (617 mM), NaCl (762 mM), KCl (27,2 mM); pH 7,0] y agua (670,9 pl) para llevar el volumen total a 1,20 ml. Tras la adición de PBS, se formó una suspensión ligeramente turbia que se agitó durante 1 h y después se filtró a través de un filtro hidrófilo de 0,2 pm. Se determinó la concentración de Eu del filtrado incoloro y transparente mediante ICP-OES. Se usó este filtrado para la preparación de liposomas.

Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas mediante la técnica de hidratación de película delgada (Liu, G.; Liang, Y.; Bar-Shir, A.; Chan, K. W. Y.; Galpoththawela, C. S.; Bernard, S. M.; Tse, T.; Yadav, N. N.; Walczak, P.; McMahon, M. T.; Bulte, J. W. M.; van Zijl, P. C. M.; Gilad, A. A. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 16326-16329). A un vial de 4 ml se le añadieron 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (22,0 mg, 2,89 pmol, 1,4 equiv), colesterol (8,0 mg, 2,1 pmol, 1 equiv) y cloroformo (1 ml) para producir una disolución incolora y transparente. Se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar una película visible sobre el fondo del vial. Bajo una atmósfera de Ar, se colocaron la disolución de hidratación (1,15 ml) y el vial que contenía la película delgada lipídica en un baño de agua a 55°C durante 30 min, y después se añadió la disolución de hidratación al vial que contenía la película delgada. Se agitó la suspensión blanca resultante a 55°C durante 1 h. Se logró la extrusión de la suspensión usando una miniextrusora y un bloque térmico (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE.UU.) calentado hasta 55°C (4 pases a través de un filtro de policarbonato de 0,2 pm seguido por 15 pases a través de un filtro de policarbonato de 0,1 pm). Después de la extrusión, se dejó enfriar la suspensión hasta temperatura ambiental dentro de la caja de guantes llena de Ar durante 1 h.

Se retiró el criptato que contenía Eu2+ no encapsulado a partir de la suspensión de liposoma una caja de guantes llena de Ar mediante filtrado por centrifugación (celulosa regenerada Amicon Ultra, punto de corte de peso molecular de 3.000). Se filtró la suspensión de liposoma en alícuotas porque el volumen de la suspensión superaba el volumen del filtro de centrifugación. Cuando el volumen de suspensión en el filtró alcanzó 0,3 ml después de la centrifugación, se llevó el volumen a 0,5 ml con la adición de PBS iso-osmolar (300 mOsm) preparada mediante dilución de la disolución de PBS descrita anteriormente. Se recogieron las fracciones filtradas por centrifugación hasta que ya no podía detectarse Eu mediante ICP-OES (14 fracciones).

La figura 9 muestra una representación gráfica de T¹frente al tiempo del complejo que contiene EuII de ligando 4 (3 mM) en ausencia (□) y presencia (o) de glutatión (325 mM). Se prepararon muestras en una caja de guantes en ausencia de oxígeno molecular y después se vertieron en un tubo de r Mn en el aire fuera de la caja de guantes en el tiempo = 0. El vertido permitió que se airearan las muestras. Se mantuvieron las muestras a 37°C y se expusieron al aire durante la duración del experimento. La oxidación de Eu2+ para dar Eu3+ da como resultado un aumento del T¹de la disolución. Las barras de error representan el error estándar de la media de muestras preparadas de manera independiente. Estos datos demuestran que el antioxidante glutatión aumenta la semivida de oxidación del complejo que contiene EuII de ligando 4 en aproximadamente 4 horas.

Estos resultados demuestran la estabilidad oxidativa in vivo y respaldan el desarrollo de agentes de contraste positivos para IRM de intensidad de campo ultraalta usando complejos basados en Eu2+. Estas sondas, basadas en la estabilización de Eu2+, serán significativas porque se espera que permitan el uso de intensidades de campo ultraaltas para estudios de obtención de imágenes que se llevan a cabo de manera rutinaria a 1,5 y 3 T, así como nuevos estudios que requieran tanto obtención de imágenes de alta resolución como potenciación de contraste. En particular, las composiciones de la invención son útiles a campos magnéticos de más de 3 T (por ejemplo, de 7 a 11 T). La presente invención representa la primera etapa hacia el uso de los complejos como agentes de contraste a intensidades de campo ultraaltas en investigación preclínica y medicina de diagnóstico. Posteriormente, se espera que estos agentes de contraste mejorado faciliten una detección más temprana de la enfermedad cuando se usan en combinación con IRM de intensidad de campo superior, y diagnósticos más tempranos corresponden a tasas superiores de tratamiento satisfactorio. Además, los agentes de contraste basados en EuII permitirán una mejor monitorización de las terapias, especialmente cuando tanto la alta resolución como la potenciación de contraste son vitales para el éxito.

Procedimiento general para la síntesis de criptatos que contienen Eu1 a partir de ligandos

Se mezcla una disolución acuosa desgasificada de EuCl²(1 equiv) con una disolución acuosa desgasificada de u criptando (2 equiv). Se agita la mezcla resultante durante 12 horas a temperatura ambiental bajo Ar. Se añade PBS desgasificada (10*) para hacer que toda la mezcla de reacción sea 1* en PBS y se continúa la agitación durante 30 min. Se verifica la concentración de Eu en la disolución resultante mediante ICP-EM.

Ligando multidentado que tiene la fórmula VI:

Se disolvió GdCl3-6H2O (63,4 mg, 0,171 mmol) en agua (2 ml) y se ajustó el pH a pH 6 usando NaOH. Después se añadió la disolución de metal a una disolución que contenía 1 (103 mg, 0,159 mmol) en agua (4 ml), se ajustó el pH a 6 usando NaOH. Se purgó la mezcla de reacción con argón y se dejó agitar a temperatura ambiental durante 24 h. Se realizó la diálisis usando una membrana de 100-500 Da. Se cambió el agua de diálisis tres veces a lo largo del transcurso de 10 h. Después se transfirió la disolución desde la membrana de diálisis hasta un matraz y se eliminó el disolvente a presión reducida. Después se midió que un rendimiento bruto era de 134 mg y se disolvió parte de este compuesto (5,2 mg, 0,0075 mmol) en tampón de carbonato (pH 9,8, 3 ml, 0,5 M). Se añadió la disolución resultante a una disolución que contenía el criptando sustituido con amina (ligando 36 de la figura 3, 4,8 mg, 0,011 mmol) en el mismo tampón de carbonato (2 ml). A lo largo de toda la combinación de las dos disoluciones, se monitorizó el pH mediante papel indicador de pH y se mantuvo entre 9 y 10. Se dejó agitar la disolución de reacción a temperatura ambiental durante 11 h. Se realizó la diálisis usando una membrana de 100-500 Da, incluyendo el cambio del agua de diálisis 3 veces a lo largo del transcurso de 24 h. Se transfirió la mezcla a un matraz y se eliminó el disolvente a presión reducida, midiéndose que el rendimiento bruto resultante era de 5,5 mg. Un análisis de cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de la conjugación resultante usando una columna de PFPP mostró una elución entre 3,156 y 3,174 minutos usando un gradiente del 0-95% (la rampa comenzó a los 20 minutos, alcanzó el 95% a los 22 minutos y disminuyó a los 26 minutos y alcanzó de nuevo el 0% a los 28 minutos). Este complejo puede mezclarse con un equivalente de EuCh para producir un complejo de metal europio.

5.6- (4-Fluorobenzo)-4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacos-5-ano (ligando 4 de la figura 3):

Se añadieron 2,0 g de 4-fluorocatecol (1 equiv, 15,6 mmol) en 20 ml de acetona a una disolución de éster metílico de bromo (3 equiv, 4,4 ml, 46,8 mmol) y carbonato de potasio (3 equiv, 6,5 g, 46,8 mmol) en 100 ml de acetona durante un periodo de 10 min bajo una atmósfera de Ar mientras se sometía a reflujo y se calentó la mezcla resultante a reflujo durante 18 h bajo una atmósfera de Ar. Después de la reacción, se eliminó el exceso de K²CO³para proporcionar una disolución de color rojo pálido que se secó a presión reducida, y se disolvió el aceite bruto en acetato de etilo y se lavó tres veces con 15 ml de agua. Se secó la fase orgánica resultante a presión reducida para proporcionar 3,75 g de un sólido en polvo de color amarillo pálido (rendimiento del 88%). Se añadió este material (3,57 g) de éster metílico de ácido 4-fluorocatecol-o,o-diacético (13,1 mmol) y 1,43 g de Dowex50WX8-200 a 120 ml de agua y se calentó a reflujo a 110°C durante 24 h bajo una atmósfera de Ar sin agitación. Se filtró la mezcla resultante y se lavó la resina con MeOH. Se secó el filtrado a presión reducida para proporcionar un sólido en polvo de color amarillo pálido, del que se disolvieron 0,40 g (1,8 mmol) en cloruro de tionilo (5,0 ml, 68 mmol) bajo Ar y se calentaron a reflujo durante 4 h. Se eliminó el exceso de cloruro de tionilo a presión reducida y se disolvió el residuo en tolueno anhidro (25 ml). Se añadieron simultáneamente (50 ml/h) la disolución resultante y una disolución de 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazaciclooctadecano (0,32 g, 1,2 mmol, 1,0 equiv) y trietilamina (0,50 ml, 3,3 mmol, 2,4 equiv) en tolueno anhidro (25 ml) a un matraz independiente que contenía tolueno anhidro (60 ml) a 0-5°C bajo una atmósfera de Ar. Se agitó la disolución durante 12 h a temperatura ambiental. Se filtró una suspensión naranja formada y se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un sólido marrón. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 9:1) y proporcionó 0,220 g (54%) de un sólido amarillo esponjoso. Se disolvió el compuesto (0,10 g, 0,21 mmol, 1 equiv) en 8,25 ml de THF anhidro y a esto se le añadieron 6,5 ml de BH³-THF, disolución 1 M (6,4 mmol, 30 equiv) lentamente mientras se agitaba bajo atmósfera de Ar a 0-5°C. Cuando se realizó la adición, se calentó la disolución a reflujo durante 24 h. Después se trató la disolución en primer lugar con HCl 6 M (8,25 ml) y en segundo lugar con agua (8,25 ml) y se calentó a reflujo durante 6 h. Después se basificó la disolución con NH⁴OH y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se separó la sal por filtración y se secó de nuevo. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 8:1) para proporcionar 0,220 g (54%) de 1, un sólido de color amarillo pálido.

5.6- (4-Clorobenzo)-4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacos-5-ano (ligando 32 de la figura 3):

Se añadió una disolución de 0,924 g de 4-clorocatecol (1 equiv, 6,92 mmol) en 10 ml de acetona a una disolución de éster metílico de bromo (3 equiv, 1,95 ml, 20,76 mmol) y carbonato de potasio (3 equiv, 2,827 g, 20 mmol) en 50 ml de acetona durante un periodo de 10 min bajo Ar a reflujo y se calentó la mezcla resultante a reflujo durante 30 h bajo una atmósfera de Ar. Después de la reacción, se separó por filtración el exceso de K²CO³y se secó a presión reducida. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo 1:1) produciendo 1,800 g (98%) de un sólido amarillo. Se añadieron el material resultante (1,05 g, 3,46 mmol) y 0,541 g de Dowex50WX8-200 a 40 ml de agua y se calentó a reflujo durante 19 h bajo una atmósfera de Ar sin agitación. Se filtró la mezcla resultante y se lavó la resina con MeOH. Se secó el filtrado a presión reducida para proporcionar un sólido en polvo de color amarillo pálido, 0,93 g (98%). Se disolvió parte de este material (0,344 g, 1,31 mmol) en cloruro de tionilo (5,0 ml, 68 mmol) bajo Ar y se calentó a reflujo durante 4 h. Se eliminó el exceso de cloruro de tionilo a presión reducida y se disolvió el residuo en tolueno anhidro (20 ml). Se añadieron simultáneamente (50 ml/h) la disolución resultante y una disolución de 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazaciclooctadecano (0,340 g, 1,31 mmol, 1,0 equiv) y trietilamina (0,6 ml, 3,93 mmol, 3,0 equiv) en tolueno anhidro (20 ml) a un matraz independiente que contenía tolueno anhidro (60 ml) a 0-5°C bajo una atmósfera de Ar. Se agitó la disolución durante 16 h a temperatura ambiental. Se formó una suspensión naranja y se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un sólido amarillo. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 8:1) para proporcionar 0,380 g (60%) de un aceite de color amarillo pálido. Se disolvió el compuesto (0,380 g, 0,78 mmol, 1 equiv) en 20 ml de THF anhidro y a esto se le añadieron 20,0 ml de BH³-THF 1 M (23,41 mmol, 30 equiv) lentamente mientras se agitaba bajo una atmósfera de Ar a 0-5°C. Cuando se realizó la adición, se calentó la disolución hasta temperatura ambiente y se calentó a reflujo durante 30 h. Después se trató la disolución en primer lugar con HCl 6 M (20 ml) y en segundo lugar con agua (20 ml) y se calentó a reflujo durante otras 6 h. Después se basificó la disolución con NH⁴OH y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se separó la sal por filtración y se secó de nuevo. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 8:1) para proporcionar 0,136 g (38%) de un sólido blanco.

5.6- (4-Bromobenzo)-4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacos-5-ano (ligando 33 de la figura 3)

Se añadió una disolución de 0,608 g de 4-bromocatecol (1 equiv, 3,17 mmol) en 5 ml de acetona a una disolución de éster metílico de bromo (3 equiv, 0,9 ml, 9,52 mmol) y carbonato de potasio (3 equiv, 1,32 g, 9,52 mmol) en 25 ml de acetona a lo largo de un periodo de 5 min bajo una atmósfera de Ar a reflujo y se calentó la mezcla resultante a reflujo durante 26 h bajo una atmósfera de Ar. Después de la reacción, se separó por filtración el exceso de K²CO³y se secó a presión reducida. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo 1:1) para proporcionar 0,900 g (98%) de un sólido. Se añadió este material (0,91 g, 3,15 mmol) y 0,36 g de Dowex50WX8-200 a 31 ml de agua y se calentó a reflujo durante 24 h bajo una atmósfera de Ar sin agitación. Se filtró la mezcla resultante y se lavó la resina con MeOH. Se secó el filtrado a presión reducida para proporcionar un sólido en polvo blanco 0,8 g (97%). Se disolvió parte de este material (0,29 g, 0,95 mmol) en cloruro de tionilo (5,0 ml, 68 mmol) bajo Ar y se calentó a reflujo durante 4 h. Se eliminó el exceso de cloruro de tionilo a presión reducida y se disolvió el residuo en tolueno anhidro (20 ml). Se añadieron simultáneamente (50 ml/h) la disolución resultante y una disolución de 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazaciclooctadecano (0,251 g, 0,95 mmol, 1,0 equiv) y trietilamina (0,38 ml, 2,85 mmol, 3,0 equiv) en tolueno anhidro (20 ml) a un matraz independiente que contenía tolueno anhidro (60 ml) a 0-5°C bajo una atmósfera de Ar. Se agitó la disolución durante 12 h a temperatura ambiental. Se formó una suspensión naranja y se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un sólido marrón. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Ch/metanol 8:1) para proporcionar 0,367 g (73%) de un aceite incoloro. Se disolvió el compuesto resultante (0,367 g, 0,691 mmol, 1 equiv) en 15 ml de THF anhidro y a esto se le añadieron 20,5 ml de BH³-THF 1 M (20,73 mmol, 30 equiv) lentamente mientras se agitaba bajo una atmósfera de Ar a 0-5°C. Cuando se realizó la adición, se calentó la disolución hasta temperatura ambiente y se calentó a reflujo durante 24 h. Después se trató la disolución en primer lugar con HCl 6 M (15 ml) y en segundo lugar con agua (15 ml) y se calentó a reflujo durante otras 6 h. Después se basificó la disolución con NH⁴OH y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se separó la sal por filtración y se secó de nuevo. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 8:1) para proporcionar 0,220 g (54%) de un sólido blanco.

5.6- (4-Metilbenzo)-4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacos-5-ano (ligando 35 de la figura 3)

Se añadió una disolución de 0,990 g de 4-metilcatecol (1 equiv, 7,73 mmol) en 18 ml de acetona a una disolución de éster metílico de bromo (3 equiv, 2,2 ml, 23,2 mmol) y carbonato de potasio (3 equiv, 3,21 g, 23,2 mmol) en 90 ml de acetona durante un periodo de 15 min bajo una atmósfera de Ar y a reflujo y se calentó la mezcla resultante a reflujo durante 26 h bajo una atmósfera de Ar. Después de la reacción, se separó por filtración el exceso de K²CO³y se secó a presión reducida. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (hexanos/acetato de etilo 1:1) para proporcionar 1,617 g (76%) de un aceite amarillo. Se añadió este material (6,03 mmol) y 0,870 g de Dowex50WX8-200 a 60 ml de agua y se calentó a reflujo durante 29 h bajo una atmósfera de Ar sin agitación. Se filtró la mezcla resultante y se lavó la resina con MeOH. Se secó el filtrado a presión reducida para proporcionar un sólido en polvo naranja 1,669 g (97%). Se disolvió parte de este material (0,449 g, 1,62 mmol) en cloruro de tionilo (5 ml, 68 mmol) bajo Ar y se calentó a reflujo durante 4 h. Se eliminó el exceso de cloruro de tionilo a presión reducida y se disolvió el residuo en tolueno anhidro (20 ml). Se añadieron simultáneamente (50 ml/h) la disolución resultante y una disolución de 1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazaciclooctadecano (0,425 g, 1,62 mmol, 1,0 equiv) y trietilamina (0,66 ml, 4,9 mmol, 3,0 equiv) en tolueno anhidro (20 ml) a un matraz independiente que contenía tolueno anhidro (60 ml) a 0-5°C bajo una atmósfera de Ar. Se agitó la disolución durante 18 h a temperatura ambiental. Se formó una suspensión naranja y se filtró y se eliminó el disolvente a presión reducida para proporcionar un sólido. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Ch/metanol 8:1) para proporcionar 0,480 g (64%) de un sólido de color amarillo pálido. Se disolvió el compuesto resultante (0,480 g, 1,03 mmol, 1 equiv) en 20 ml de THF anhidro y se añadieron 20 ml de BH³-THF 1 M (20,60 mmol, 20 equiv) lentamente mientras se agitaba bajo atmósfera de Ar a 0-5°C. Cuando se realizó la adición, se calentó la disolución hasta temperatura ambiente y se calentó a reflujo durante 26 h. Después se trató la disolución en primer lugar con HCl 6 M (20 ml) y en segundo lugar con agua (20 ml) y se calentó a reflujo a 90°C durante otras 14 h. Después se basificó la disolución con NH⁴OH y se eliminó el disolvente a presión reducida. Se separó la sal por filtración y se secó de nuevo. Se realizó la purificación usando cromatografía en gel de sílice (CH²Cl²/metanol 8:1) para proporcionar 0,143 g (32%) de sólido.

Complejo de europio carboxilado:

Se disuelve ácido 4-isotiocianato-1,2-bencenodicarboxílico (1 equiv) en tampón de carbonato (pH 9,8, 3 ml, 0,5 M). Se añade la disolución resultante a una disolución que contiene el criptando sustituido con amina (ligando 36 de la figura 3, 1 equiv) en el mismo tampón de carbonato (2 ml). A lo largo de toda la combinación de las dos disoluciones, se monitoriza el pH mediante papel indicador de pH y se mantiene entre 9 y 10. Se deja agitar la disolución de reacción a temperatura ambiental durante 11 h. Se realiza la diálisis usando una membrana de 100-500 Da, incluyendo el cambio del agua de diálisis 3 veces a lo largo del transcurso de 24 h. Se transfiere la mezcla a un matraz y se elimina el disolvente a presión reducida. El ligando resultante tiene la siguiente fórmula:

Se mezcla este complejo con un equivalente de EuCb para producir el complejo final.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende:

un liposoma;

un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma, incluyendo el complejo de metal europio un ion de metal europio y un ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos, incluyendo el complejo de metal europio Eu2+; y

si es necesario, contraiones para mantener la neutralidad de carga, pudiendo cambiarse el ion de metal europio de un estado de oxidación 2+ a un estado de oxidación 3+ cuando se encapsula en el liposoma. 2. Composición según la reivindicación 1, en la que el liposoma incluye un fosfolípido.

3. Composición según la reivindicación 2, en la que el fosfolípido es un diéster de ácido graso de fosfatidilcolina, etilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, ácido fosfatídico, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina o esfingomielina.

4. Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado es un 2.2.2-criptando sustituido, un 2.2.2-tiacriptando sustituido o un 2.2.2-tiacriptando no sustituido.

5. Composición según la reivindicación 1, que comprende además un antioxidante.

6. Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado se describe mediante la fórmula I:

en la que:

Y1, Y2, Y3, Y4, Y5 e Y6 son, cada uno independientemente, O o S;

R¹, R², R³son, cada uno independientemente, H, alquilo C^1-12, fluoroalquilo C^1-12, Cl, F, Br, I, N(R)², NH², CH²CO²H, nitro, ciano, o arilo C^6-14, fenilo, bibenilo, heteroarilo C^5-14o anillos de 5 y 6 miembros formados combinando R¹en átomos de carbono adyacentes o R²y R³en átomos de carbono adyacentes, =O combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, =S combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono, o =NR combinando R¹, R²o R³en el mismo átomo de carbono; y

R es H o alquilo C^1-12.

7. Composición según la reivindicación 1, el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

Y1 e Y2 son, cada uno independientemente, O o S.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

X1, X2, X3 son independientemente nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH²o CH²CO²H.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

Y es O o S.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

x, e y z son 0, 1, 2 o 3 con la condición de que la suma de x, e y z es 3.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

x e y son 0, 1, 2 o 3 con la condición de que la suma de x e y es 3.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

y

Y es O o S.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

en la que X es de 0 a 2 e Y es de 1 a 3 con la condición de que la suma de x e y es 3.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

:xx ^{r~ MT i}

y

R, R' son independientemente nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH²o CH²CO²H.

Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

Y y Z son, cada uno independientemente, O o S; y

R es nitro, Cl, F, Br, I, CH³, NH²o CH²CO²H.

16. Composición según la reivindicación 1, en la que el ligando multidentado tiene la siguiente fórmula:

17. Método de obtención de imágenes por resonancia magnética de un órgano o una estructura de órgano en un sujeto, comprendiendo el método:

a) administrar una composición de liposoma al sujeto, comprendiendo la composición de liposoma:

un liposoma; y

un complejo de metal europio dispuesto dentro del liposoma, incluyendo el complejo de metal europio un ion de metal europio y un primer ligando multidentado seleccionado del grupo que consiste en criptandos y tiacriptandos, y uno o más contraiones que equilibran una carga del ion de metal europio, incluyendo el ion de metal europio Eu2+ y pudiendo cambiarse de un estado de oxidación 2+ a un estado de oxidación 3+ cuando se encapsula en el liposoma; y

b) tomar imágenes de un órgano en el sujeto mediante obtención de imágenes por resonancia magnética.