ES2633453T3 - Constructos de fusión de dominios líticos y métodos de preparación y utilización de los mismos - Google Patents

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ES2633453T3 ES09704677.5T ES09704677T ES2633453T3 ES 2633453 T3 ES2633453 T3 ES 2633453T3 ES 09704677 T ES09704677 T ES 09704677T ES 2633453 T3 ES2633453 T3 ES 2633453T3
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Abstract

Constructo de fusión que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que dicho primer dominio consiste en una secuencia de 15 a 20 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA; o una secuencia de 15 a 20 aminoácidos con una secuencia de aminoácidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA, que presenta uno de los residuos K sustituido por cualquiera de un residuo F o L, uno de los residuos F sustituido por cualquiera de un residuo K, A o L, o uno de los residuos A sustituido por cualquiera de un residuo K, F o L; y en el que dicho segundo domino comprende una fracción de unión.

Description

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DESCRIPCION
Constructos de fusion de dominios liticos y metodos de preparacion y utilizacion de los mismos.
Campo tecnico
La invencion se define en las reivindicaciones. La invencion se refiere a constructos de fusion segun se define en las reivindicaciones, a metodos de utilizacion de dichos constructos de fusion y a utilizaciones de dichos constructos de fusion en el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, tales como las neoplasias no metastasicas y metastasicas, canceres, tumores y neoplasias malignas.
Introduccion
La necesidad de desarrollar nuevos terapeuticos para el tratamiento de tumores primarios y metastasis resulta claramente evidente al considerar la tasa de supervivencia a cinco anos de los pacientes de cancer: Solo entre 10% y 40% de los pacientes con cancer de pulmon, colorrectal, de mama y de prostata sobreviven si han sido diagnosticados con enfermedad metastasica distante. Por ejemplo, Hansel et al., Mol. Cell Endocrinol. 260262:183-9, 2007 han informado de que los canceres de mama y las metastasis de los mismos pueden destruirse con conjugados de peptidos liticos in vitro e in vivo.
Sumario
La invencion se basa, por lo menos en parte, en dominios liticos fusionados o conjugados con una fraccion de union, denominados en la presente memoria constructos de fusion. El contacto de una celula con un dominio lftico se cree que provoca la disrupcion de la membrana celular, resultando en la muerte celular. La fraccion de union dirige las celulas para la destruccion por el dominio lftico, entre ellas celulas proliferantes o hiperproliferantes no deseables o aberrantes, tales como neoplasias no metastasicas y metastasicas, canceres, tumores y neoplasias malignas. Varias celulas neoplasicas no metastasicas y metastasicas, cancerosas, tumorales y malignas sobreexpresan receptores o ligandos. Por ejemplo, muchas neoplasias no metastasicas y metastasicas, canceres, tumores y neoplasias malignas expresan receptores de hormonas (por ejemplo hormona luteinizante/gonadotropina corionica (HL/GC) u hormona liberadora de hormona lutenizante (HLHL, etc.), factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos, etc., que pueden utilizarse como fraccion de union del constructo de fusion.
Los constructos de fusion pueden disenarse con diana en cualquier celula o poblacion celular que exprese el sitio de union de la fraccion de union. Pueden unirse fracciones de union, tales como ligandos, anticuerpos y fragmentos de los mismos, factores de crecimiento, citocinas, etc., a un dominio lftico, proporcionando la eliminacion dirigida de las celulas que expresan o contienen receptores, antfgenos, anticuerpos, ligandos, etc., reduciendo o inhibiendo de esta manera la proliferacion o crecimiento celular.
Los constructos de fusion no requieren la division de las celulas para eliminar las celulas diana. Ademas, no es probable que los constructos de fusion resulten inmunogenos debido a que puede conseguirse que sean de tamano relativamente pequeno. Ademas, los constructos de fusion eliminan celulas resistentes a multiples farmacos.
Ademas, los constructos de fusion presentan una actividad citotoxica mayor (IC50 baja) en terminos de actividad anti-proliferativa celular o actividad de eliminacion y baja actividad hemolftica (HA50), de manera que la proporcion IC50 : HA50 (IC50/HA50) es mas bajo que la de otros compuestos con dichas actividades. Por ejemplo, los constructos de fusion pueden presentar una mayor actividad anti-proliferativa celular que Phor21-pGC-Ala, Phor21-GSGGS-pGC-Ala, Phor21-ASAAS-pGC-Ala o Phor 14-pGC-Ala, tal como determina un valor de IC50 mas bajo; presentan una proporcion IC50/HA50 que Phor21-pGC-Ala, Phor21-GSGGS-pGC-Ala, Phor21-ASAAS-pGC- Ala o Phor14-pGC-Ala, o presentan una proporcion IC50/HA50 inferior a aproximadamente 0,02, 0,01 o 0,005.
Segun la invencion, que se da a conocer en las reivindicaciones, se proporcionan constructos de fusion que incluyen un primer y un segundo dominios segun se define en las reivindicaciones. En la presente memoria se describe ademas un constructo de fusion que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos que incluye una secuencia peptfdica seleccionada de entre, por ejemplo, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. En la presente memoria se describe ademas un constructo de fusion que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D- aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. En la presente memoria se describe todavfa adicionalmente un constructo de fusion
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que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre , KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que consiste en una secuencia de 1 a 25 L- o D- aminoacidos (por ejemplo una fraccion de direccionamiento o de union) diferente de dicho primer dominio.
En la presente memoria se proporcionan ademas peptidos aislados y purificados que incluyen o que consisten en un primer dominio. Un peptido aislado o purificado puede ser KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF o
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA. Un peptido aislado o purificado puede ser KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF o KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA que presenta uno o mas de los residuos K sustituidos con cualquiera de entre un residuo F o L, uno o mas de los residuos F sustituidos por cualquiera de entre los residuos K, A o L, o uno o mas de los residuos A sustituidos por cualquiera de entre los residuos K, F o L.
Entre los constructos de fusion se incluyen una fraccion de union que se une a un receptor, ligando o a un antfgeno. Una fraccion de union incluye ademas un ligando, antfgeno o anticuerpo. Entre los ligandos se incluyen, o consisten en, una molecula que se une a un receptor, tal como un agonista o antagonista de receptor. Una fraccion de union puede incluir o consiste en una estructura lineal o cfclica.
Entre los ejemplos no limitativos especfficos de fracciones de union se incluyen uno o mas aminoacidos (por ejemplo peptidos, polipeptidos o protefnas), acidos nucleicos y carbohidratos. Entre las clases no limitativas especfficas de fracciones de union se incluyen hormonas, analogos de hormona y fragmentos de hormonas y analogos de hormonas, factores de crecimiento, citocinas, anticuerpos, etc. que se unen a un receptor. Entre los ejemplos no limitativos especfficos de hormonas se incluyen una hormona liberadora de gonadotropina o su analogo, cadena beta de la hormona luteinizante, hormona luteinizante, gonadotropina corionica, subunidad beta de la gonadotropina corionica, hormona estimulante de los melanocitos, estradiol, dietilestilbesterol, lactoferrina, dopamina, somatostatina o sus analogos, hormona folfculo-estimulante (FSH, por sus siglas en ingles), glucocorticoide, estrogeno, testosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, deshidroepiandrosterona, androgenos, progesterona, hormona estimulante del tiroides (TSH, por sus siglas en ingles), insulina, catecolaminas, hormona adrenocorticotropica (ACTH, por sus siglas en ingles), angiotensina, hormona antidiuretica, calcitonina, colecistoquinina, bombesina, hormona liberadora de corticotrofina, gastrina, grelina, glucagon, hormona liberadora de hormona del crecimiento y sus analogos, inhibina, orexina, peptido KiSS (GPR54), kisspeptina, prolactina, hormona liberadora de prolactina, hormona del crecimiento, Her2/neu, folato, vitamina H, ferritina, hormona paratiroidea, relaxina, secretina, hormona liberadora de tirotropina, endotelina, renina, lipotropina, melatonina, etc. Son ejemplos no limitativos especfficos de factores de crecimiento, el factor de crecimiento epidermico (FCE), los factores 1 y 2 de crecimiento similares a la insulina (FCI-1, FCI-2), el factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV), el factor de crecimiento nervioso (FCN), el factor de crecimiento fibroblastico (FCF), factores alfa y beta de crecimiento transformante (FCT-a y FCT-p), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (FCDP), el factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), la ceruloplasmina, etc. Son clases no limitativas especfficas de citocinas o ligandos, las interleucinas (por ejemplo la interleucina 2 o la interleucina 17, CD154, ligando Fas, etc.), los factores de necrosis tumoral (FNT), los interferones, etc.
Las fracciones de union pueden expresarse opcionalmente sobre una celula. Entre las celulas que expresan una fraccion de union (por ejemplo un receptor, ligando, antfgeno o anticuerpo) o que pueden ser dianas segun los metodos descritos en la presente memoria se incluyen las celulas hiperproliferativas. Entre las celulas que expresan un receptor, un ligando o un antfgeno, o que pueden ser diana segun los metodos descritos en la presente memoria se incluyen ademas celulas de mama, ovaricas, uterinas, cervicales, prostaticas, testiculares, pancreaticas, de la piel, sangufneas, adrenales, pituitarias y endometriales. Son clases no limitativas especfficas de fracciones de union que se expresan sobre una celula, los receptores de hormonas, las citocinas, los factores de crecimiento (por ejemplo los receptores de FCE, Her2/neu y ROR1), la ferritina, los receptores de transferrina, las moleculas de adhesion celular, etc. Son ejemplos no limitativos especfficos de antfgenos que se expresan sobre las celulas proliferantes que pueden ser diana de anticuerpos o fragmentos de los mismos, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, receptores de tipo inmunoglobulina, etc.) Entre los antfgenos adicionales se incluyen, por ejemplo, el antfgeno especffico de la prostata (AEP), el antfgeno membranal especffico de la prostata (AMEP), el antfgeno carcinoembrionario (ACE), la alfa-fetoprotefna (AFP), el antfgeno 125 del cancer (AC-125) y otras moleculas de receptores que se unen a los ligandos dados a conocer en la presente memoria.
El primer y segundo dominios pueden incluir o consistir de un aminoacido o una secuencia de aminoacidos. En aspectos particulares, un primer o segundo dominio presenta aproximadamente 1 a 10, 10 a 20, 15 a 20 (es decir, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoacidos), 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o mas residuos aminoacidos.
En un aspecto particular, un primer dominio incluye o consiste en una estructura alfa-helicoidal anfipatica. En aspectos particulares adicionales, un segundo dominio incluye o consiste en una secuencia de aminoacidos
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indicada como SYAVALSAQAALARR o QHWSYGLRPG.
El primer y segundo dominios pueden situarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal uno respecto a otro. De esta manera, el primer dominio (de peptido lftico) puede situarse en el extremo NH-terminal respecto al segundo dominio (fraccion o ligando de union) o el segundo dominio (fraccion o ligando de union) puede situarse en el extremo C-terminal respecto al primer dominio (peptido lftico).
El primer y segundo dominios pueden incluir o consistir de uno o mas D-aminoacidos. En aspectos particulares, un primer dominio presenta un D-aminoacido, por ejemplo en cualquier residuo K, F o A.
El primer y segundo dominios pueden unirse mediante un enlace covalente. Por ejemplo, puede unirse un primer y un segundo dominios mediante un peptido o un conector no peptfdico. En aspectos particulares, el primer y segundo dominios se unen mediante una secuencia peptfdica que presenta entre aproximadamente 1 a 25 residuos aminoacidos o que presenta una cadena lineal de carbonos. En aspectos mas particulares, el primer y segundo dominios se unen mediante una secuencia peptfdica que incluye o consiste en uno o mas residuos aminoacidos A, S o G. En aspectos particulares adicionales, el primer y segundo dominios se unen mediante una secuencia peptfdica que incluye o que consiste en GSGGS, ASAAS o CCCCCC.
El primer y segundo dominios incluyen o consisten ademas de dominios adicionales. De esta manera, en diversos aspectos, un constructo de fusion incluye un tercer, cuarto, quinto, sexto o septimo dominio, etc.
Entre los constructos de fusion se incluyen o consisten en formas aisladas o purificadas. Entre los constructos de fusion se incluyen o consisten ademas de una mezcla. Entre dichas mezclas se incluyen composiciones tales como una mezcla de constructo de fusion y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable apropiado para la administracion o en contacto in vivo con un sujeto, o una mezcla de constructo de fusion y un agente antiproliferativo celular o inmunoestimulador.
Entre los constructos de fusion se incluyen o consisten en una forma de administracion unitaria. Un constructo de fusion puede ser una dosis unitaria en una cantidad eficaz para tratar un sujeto que presenta una proliferacion celular no deseable o un trastorno hiperproliferativo. Un constructo de fusion puede ser una dosis unitaria en una cantidad eficaz para tratar un sujeto que presenta una neoplasia, tumor o cancer. Un constructo de fusion puede ser una dosis unitaria en una cantidad eficaz para reducir la fertilidad en un sujeto.
Los constructos de fusion pueden incluirse en kits, opcionalmente con instrucciones para la practica de un metodo. Un kit puede incluir un constructo de fusion e instrucciones para reducir o inhibir la proliferacion celular, reducir o inhibir la proliferacion de una celula hiperproliferativa, reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral o de cancer, tratar un sujeto que presenta un trastornos hiperproliferativo, tratar un sujeto que presenta una neoplasia, tumor o cancer, o reducir la fertilidad de un animal.
Segun la invencion se proporcionan ademas acidos nucleicos que codifican constructos de fusion segun la reivindicacion 6, item (b). En la presente memoria se describe ademas un constructo de fusion que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos que incluye una secuencia peptfdica seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK,
KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. En la presente memoria se describe ademas acido nucleico codificante de un constructo de fusion que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK,
KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. En la presente memoria se describe ademas un acido nucleico que codifica un constructo de fusion que incluye un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF,
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una secuencia de 1 a 25 L- o D-aminoacidos (por ejemplo una fraccion de direccionamiento o de union) diferente de dicho primer dominio.
Los acidos nucleicos pueden incluirse en un vector, tal como un vector de expresion que, al expresarse en una celula, codifica un constructo de fusion. Las celulas huesped pueden transformarse con un acido nucleico en un vector, de manera que la celula exprese un constructo de fusion codificado por el acido nucleico.
Los constructos de fusion resultan utiles para, entre otras cosas, reducir o inhibir la proliferacion celular, reducir o inhibir la proliferacion celular, reducir o inhibir la proliferacion de una celula hiperproliferante, reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna y tratar la proliferacion celular no deseable o aberrante, tal como celulas hiperproliferantes o trastornos hiperproliferativos. Entre los ejemplos no limitativos de
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trastornos hiperproliferativos se incluyen la hiperplasia benigna, neoplasias no metastasicas y metastasicas, los tumores de cancer y las neoplasias malignas (por ejemplo un tumor solido o lfquido, el mieloma, el linfoma, la leucemia, el carcinoma, el sarcoma, el melanoma, neural, reticuloendotelial y hematopoyetico).
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir la proliferacion celular, metodos para reducir o inhibir la proliferacion celular, metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula hiperproliferativa y metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular, poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular, poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula hiperproliferante, y poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna.
Segun la exposicion, se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir selectivamente la proliferacion de una celula que expresa un receptor o antfgeno, para reducir o inhibir selectivamente la proliferacion de una celula hiperproliferativa que expresa un receptor o antfgeno y de reducir o inhibir selectivamente la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna que expresa un receptor o antfgeno segun las reivindicaciones. Dicho metodo incluye poner en contacto una celula con el constructo de fusion en cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular, en el que la fraccion de union de dicho peptido se une al receptor, ligando o antfgeno expresado por la celula, poner en contacto una celula con el constructo de fusion en cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula hiperproliferativa, en la que la fraccion de union de dicho peptido se une al receptor, ligando o antfgeno expresado por la celula hiperproliferativa y poner en contacto una celula con el constructo de fusion en cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna, en la que la fraccion de union de dicho constructo de fusion se une al receptor, ligando o antfgeno expresado por la celula.
Entre las celulas que son diana segun los metodos de la invencion se incluyen celulas que expresan un receptor o un antfgeno, tal como un receptor hormonal, por ejemplo una hormonal esteroidea sexual o gonadal o un receptor de hormona esteroidea sexual o gonadal. Entre las celulas que son diana segun los metodos de la invencion se incluyen ademas celulas que expresan un receptor que se une a la hormona liberadora de gonadotropina I, la hormona liberadora de gonadotropina II, la hormona liberadora de hormona luteinizante III de lamprea, la cadena beta de la hormona luteinizante, la hormona luteinizante, la gonadotropina corionica, la subunidad beta de la gonadotropina corionica, la hormona estimulante de melanocitos, el estradiol, el dietilestilbesterol, la dopamina, la somatostatina, la hormona folfculoestimulante (HFE), los glucocorticoides, los estrogenos, la testosterona, la androstenediona, la dihidrotestosterona, la deshidroepiandrosterona, la progesterona, los androgenos, la prolactina, la hormona liberadora de prolactina, la hormona antidiuretica, las angiotensinas, las catecolaminas, el factor de crecimiento epidermico (FCE), los factores 1 y 2 de crecimiento similares a la insulina (FCI-1 y FCI-2), hormona del crecimiento (HC), Her2/neu, vitamina H, folato, transferrina, hormona estimulante del tiroides (HET), hormona paratiroidea (HPT), endotelina, bombesina, renina, lipotropina, hormona melatonina, relaxina, secretina, hormona del crecimiento, factor de crecimiento vascular endotelial (FCVE), peptido intestinal vasoactivo, lactoferrina, una integrina (por ejemplo la integrina alfa-5 beta 3 o la integrina alfa-5 beta 1), el factor de crecimiento nervioso, factores alfa y beta de crecimiento transformante (FCT- a y p), factor de crecimiento de hepatocitos (FCH), factor de crecimiento fibroblastico (FCF), CD-33, CD19, cD20, CD40, ROR1, FCI-1, antfgeno carcinoembrionario (ACE), alfa-fetoprotefna (AFP), antfgeno especffico de la prostata (AEP), antfgeno membranal especffico de la prostata (AMEP), antfgeno del cancer 125 (AC-125), interleucina 17, Cd 154, receptor de interleucina 2 soluble (IL-2), tirosinasa, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, glucoprotefna (gp) 75, gp100, beta-catenina, PrAmE, MUM-1, ZFP161, ubiquitina-1, HOX-B6, YB-1, osteonectina, ILF3, acido folico o un derivado de los mismos, un elemento de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT), FNT-alfa, FNT-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41BB, factor alfa de crecimiento transformante, factor beta de crecimiento transformante, insulina, ceruloplasmina, HIV-tat, un peptido o protefna que comprende un motivo de secuencia RGD, un monosacarido, disacarido, oligosacarido, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa o acido acetilneuramfnico.
Entre los metodos que tambien se describen en la presente memoria se incluyen, entre otros, poner en contacto un sujeto que requiere la inhibicion, reduccion o prevencion de la proliferacion, supervivencia, diferenciacion, muerte o actividad de celulas, tal como celulas hiperproliferantes o una celula indeseablemente proliferante. Entre los sujetos ejemplificativos se incluyen un sujeto que presenta o esta en riesgo de presentar una proliferacion celular no deseable o aberrante, un sujeto que presenta o que esta en riesgo de presentar una hiperplasia benigna o una neoplasia no metastasica o metastasica, cancer, tumor o afeccion maligna (por ejemplo un tumor solido o lfquido, mieloma, linfoma, leucemia, carcinoma, sarcoma, melanoma, neoplasia neural, reticuloendotelial y hematopoyetica).
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos de tratamiento de un sujeto que presenta un trastorno hiperproliferativo y metodos de tratamiento de un sujeto que presenta una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna (metastastica, no metastasica o benigna). El metodo puede incluir administrar en el sujeto una cantidad
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del constructo de fusion suficiente para tratar el trastorno hiperproliferativo y administrar en el sujeto una cantidad del constructo de fusion suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligna.
Entre los metodos se incluyen el tratamiento de un sujeto que presenta o esta en riesgo de presentar una metastasis. Por ejemplo, una cantidad de un constructo de fusion eficaz para reducir o inhibir la extension o diseminacion de un tumor, cancer o neoplasia a otros sitios, localizaciones o regiones dentro del sujeto. Un metodo puede reducir o inhibir la metastasis de un tumor o cancer primario a uno o mas otros sitios, la formacion o el establecimiento de una metastasis en uno o mas otros sitios, localizaciones o regiones, reduciendo o inhibiendo de esta manera la recafda del tumor o cancer o la progresion del tumor o cancer. Un metodo puede reducir o inhibir el crecimiento, proliferacion, movilidad o invasividad de las celulas tumorales o cancerosas que potencialmente o actualmente desarrollan metastasis (por ejemplo celulas tumorales diseminadas); puede reducir o inhibir la formacion o el establecimiento de metastasis surgidas de un tumor o cancer primario; puede reducir o inhibir el crecimiento o la proliferacion de una metastasis en uno o mas otros sitios, localizaciones o regiones diferentes del tumor o cancer primario tras la formacion o el establecimiento de la metastasis, o puede reducir o inhibir la formacion o el establecimiento de metastasis adicionales tras la formacion o establecimiento de la metastasis. Un metodo puede reducir o inhibir la recafda o la progresion de la neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligna.
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir la metastasis de una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna a otros sitios, o la formacion o establecimiento de neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna metastasico en otros sitios alejados de una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna primario. Un metodo puede incluir la administracion en un sujeto de una cantidad del constructo de fusion suficiente para reducir o inhibir la metastasis de una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna a otros sitios, o la formacion o establecimiento de neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna metastasico en otros sitios alejados de una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna primario.
La neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligno tratable segun la exposicion incluye una masa de celulas solida, celulas hematopoyeticas o un carcinoma, sarcoma (por ejemplo linfosarcoma, liposarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma o fibrosarcoma), linfoma, leucemia, adenoma, adenocarcinoma, melanoma, glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, mesotelioma; neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna reticuloendotelial, linfatico o hematopoyetico (por ejemplo mieloma, linfoma o leucemia).
La neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna tratable segun la exposicion puede encontrarse presente o afectar a un pulmon (cancer pulmonar de celulas pequenas o cancer pulmonar de celulas no pequenas), tiroides, cabeza o cuello, nasofaringe, garganta, nariz o senos nasales, cerebro, columna, mama, glandula adrenal, glandula pituitaria, tiroides, linfa, gastrointestinal (boca, esofago, estomago, duodeno, fleon, yeyuno (intestino delgado), colon y recto), tracto genitourinario (utero, ovario, cuello uterino, endometrio, vejiga, testfculo pene y prostata), rinon, pancreas, hfgado, hueso, medula osea, linfa, sangre, musculo, piel o neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna de celulas madre.
Los metodos pueden ponerse en practica con otros tratamientos o terapias (por ejemplo reseccion quirurgica, radioterapia, terapia de radiacion ionizante o qufmica, quimioterapia, inmunoterapia, terapia termica (hipertermia) local o regional o vacunacion). Dichos tratamientos o terapias pueden administrarse antes o de manera sustancialmente contemporanea (separadamente o en una mezcla) o tras la administracion de un constructo de fusion. Un metodo puede incluir la administracion de un tratamiento o terapia antiproliferativo celular, antineoplasico, antitumoral, anticancer o potenciador inmunologico. Un metodo puede incluir la administracion de un agente alquilante, antimetabolito, extracto vegetal, alcaloide vegetal, nitrosourea, hormona, analogo de nucleosido o nucleotido, ciclofosfamida, azatioprina, ciclosporina A, prednisolona, melfalan, clorambucilo, mecloretamina, busulfan, metotrexato, 6-mercaptopurina, tioguanina, 5-fluorouracilo, citosina arabinosido, 5- azacitidina (5-AZC) y compuestos relacionados con la 5-azacitidina, bleomicina, actinomicina D, mitramicina, mitomicina C, carmustina, lomustina, semustrina, estreptozotocina, hidroxiurea, cisplatino, carboplatino, oxiplatino, mitotano, procarbacina, dacarbacina, taxol, vinblastina, vincristina, doxorrubicina o dibromomanitol, inhibidores de topoisomerasa (irinotecan, topotecan, etoposido y teniposido), gemcitabina, pemetrexed, etc. Entre las terapias celulares o inmunologicas se incluyen linfocitos, celulas plasmaticas, macrofagos, celulas dendrfticas, celulas T, celulas NK o celulas B, un anticuerpo, un factor de crecimiento celular, un factor de supervivencia celular, un factor de diferenciacion celular, una citocina o una quimiocina (son ejemplos las interleucinas IL-2, IL-1 a, IL-1p, IL-3, IL-6, IL-7, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (FECGM), IFN-y, IL-12, FNT-a, FNT-p, MIP-1a, MIP-1 p, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, eotaxina-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3a, PARC, TARC, CKp, CKp6, CKp7, CKp8, CKp9, CKp11, CKp12, C10, IL-8, GROa, GROp, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIp-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1, o linfotactina), etc.
Los agentes adicionales aplicables a constructos de fusion son farmacos dirigidos o agentes biologicos, tales como anticuerpos o moleculas pequenas. Entre los ejemplos no limitativos de anticuerpos monoclonales se
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incluyen el rituximab (Rituxan®), el trastuzumab (Herceptin), el bevacizumab (Avastin), el cetuximab (Erbitux), el alemtuzumab (Campath), el panitumumab (Vectibix), el ibritumomab tiuxetan (Zevalin), el tositumomab (Bexxar) etc., los cuales pueden utilizarse en combinacion con, entre otros, un constructo de fusion descrito en la presente memoria. Otros farmacos dirigidos que son aplicables a la utilizacion con los constructos de fusion son el imatinib (Gleevec), el gefitinib (Iressa), el bortzomib (Velcade), el lapatinib (Tykerb), el sunitinib (Sutent), el sorafenib (Nevaxar), el nilotinib (Tasigna), etc.
Los metodos descritos en la presente memoria incluyen proporcionar un beneficio al sujeto. Un metodo de tratamiento puede resultar en una destruccion parcial o completa de la masa, volumen, tamano o numero celular neoplasico, tumoral, canceroso o maligno, mediante la estimulacion, induccion o incremento de la necrosis, lisis o apoptosis de las celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas o malignas, mediante la reduccion del volumen o masa celular de la neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligna, mediante la inhibicion o prevencion de la progresion de un incremento del volumen, masa, tamano o numero celular de la neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligna, o mediante la prolongacion del periodo de vida; resulta en la reduccion o disminucion de la severidad, duracion o frecuencia de un sfntoma adverso o complicacion asociado o causado por la neoplasia, tumor, cancer o neoplasia maligna; resulta en la reduccion o la disminucion del dolor, incomodidad, nauseas, debilidad o apatfa, o resulta en mayores niveles de energfa, apetito, mayor movilidad o bienestar psicologico.
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir la fertilidad de un animal; metodos de tratamiento o reduccion de la endometriosis, la hiperplasia prostatica benigna, fibromas o polipos. Un metodo puede incluir administrar en el animal (por ejemplo un mamffero, tal como un ser humano) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para reducir la fertilidad; administrar en el animal (por ejemplo un mamffero, tal como un ser humano) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar o reducir la endometriosis; administrar en el animal (por ejemplo un mamffero, tal como un ser humano) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar o reducir la hiperplasia prostatica benigna, y administrar en el animal (por ejemplo un mamffero, tal como un ser humano) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar o reducir los fibromas o polipos.
Entre los sujetos tratables segun los metodos se incluyen mamfferos. Un sujeto puede ser un ser humano. Descripcion de los dibujos
La figura 1 representa que HLHL-Phor21 elimina las celulas de cancer mas rapidamente que Phor21-pGC- ala. Se incubaron celulas humanas de cancer de mama con Phor21-pGC-ala o HLHL-Phor21.
La figura 2 representa la citotoxicidad para las celulas MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de los constructos de fusion pGC-ala que presentaban 21 (Phor21), 18 (Phor18 (338983)=ClIP71) y 15 (Phor15) aminoacidos en su dominio lftico, en comparacion con Phor21-pGC-ala.
La figura 3 representa la citotoxicidad para las celulas MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de los constructos de fusion pGC-ala y HLHL. Los constructos de fusion que eran mas toxicos para las celulas MDA-MB- 435S.luc que Phor21-pGC-ala se listan a la derecha de la figura.
La figura 4 representa la citotoxicidad para las celulas MDA-MB-435S.luc (IC50 micromolar) de los constructos de fusion HLHL. Los constructos de fusion eran: 323033=Phor21-pGC-ala, 337479=HLHL-Phor21, 337480=Phor21-HLHL, 338611=D-ala-Phor21-HLHL, 338612=Phor18-ASAAS-HLHL, 338613=Phor18-HLHL, 339385=D-ala-Phor18-HLHL y 339347=Phor18-Lupron.
La figura 5 representa la actividad hemolftica aguda (HA50 micromolar) de los constructos de fusion con pGC-ala y con HLHL para los globulos rojos en comparacion con Phor21-pGC-ala. Todos los constructos de fusion presentaron una actividad hemolftica significativamente inferior que Phor21-pGC-ala, excepto HLHL- Phor21, Phor21-HLHL y Phor18-Lupron (QHWSY(D-Leu)LRPNEt = Lupron).
La figura 6 representa una comparacion entre citotoxicidad y actividad hemolftica. Los peptidos indicados con flechas resultan mas toxicos para las celulas que Phor21-pGC-ala.
La figura 7 es una descripcion general del programa de tratamiento.
Las figuras 8A-8J son un resumen de las condiciones tumorales durante el tratamiento y al final del estudio con 3 conjugados de pGC en comparacion con Phor21 no conjugado, Phor18 no conjugado (338983)=(CLIP71) y un conjugado (KKKFAFA)3 (338984). Codigos de los constructos de fusion: 33=Phor21 p-CG-ala; 76=Phor18-pGC-ala; 81=D-ala-Phor21-pGC-ala; 85=D-ala-Phor18-HLHL; 47=Phor18- Lupron; 13=Phor18-HLHL; 11=D-ala-Phor21-HLHL; 12=Phor18-ASAAS-HLHL; 71=Phor15-pGC-ala y 74=Phor15-C6-pGC-ala, seguidos de las cantidades del constructo utilizadas en el estudio.
Las figuras 9A-9H representan el volumen tumoral de los grupos de tratamiento en comparacion los valores
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con solucion salina y de linea base para: A) Phor21-pGC-ala (33); B) D-ala-Phor21-HLHL (11); C) Phor18- Lupron (47); D) Phor18-ASAAS-HLHL (12); E) Phor18-HLHL (13); F) (KKKFAFA)3-HLHL; G) D-ala-Phor18- HLHL (85) en los periodos de tiempo indicados hasta los 30 dfas, y H) en comparacion con la linea base.
Las figuras 10A-10E representan un resumen de las condiciones tumorales al final del estudio con 5 conjugados HLHL en comparacion con Phor21-pGC-ala para: A) pesos de tumor, B) cambio de los pesos de tumor en comparacion con la linea base, C) numero total de celulas tumorales vivas, D) cambios en el numero total de celulas tumorales vivas en comparacion con la linea base, y E) pesos corporales. 338614 = (KKKFAFA)a HLHL, 338612=Phor18-ASAAS-HLHL, 338613=Phor18-HLHL y 339385=D-ala-Phor18-HLHL.
La figura 11 representa celulas de cancer ovarico (OVCAR 3) que son resistentes a multiples farmacos, incubadas con concentraciones crecientes de Phor21-pGC-ala en presencia de doxorrubicina a las cantidades indicadas y potenciacion de la muerte celular por un factor de 200 a la concentracion mas alta de doxorrubicina mediante la combinacion.
La figura 12 representa la citotoxicidad para celulas CHO (de ovario de hamster chino) y TM4 en comparacion con las celulas MDA-MB-435S.luc con HLHL y Phor21 y constructos de fusion de pGC y de Phor21. Las celulas TM4 eran negativas para receptores de HLHL; las celulas CHO eran negativas para receptor de CG y las celulas mDA-MB-435S.luc expresaban tanto receptores de HLHL como de GC.
Descripcion detallada
La invencion se basa por lo menos en parte en un constructo de fusion que incluye una parte lftica de un primer dominio unida o fusionada con una segunda parte de union a dominio segun las reivindicaciones. En una configuracion tfpica, un primer dominio de constructo de fusion incluye una parte lftica que resulta directa o indirectamente toxica para la celula, que de esta manera puede reducir la proliferacion o supervivencia celular, o estimular, inducir, incrementar o potenciar la muerte, eliminacion o apoptosis celular, y un segundo dominio del constructo de fusion que incluye una parte con diana en la celula, denominada entidad fraccion de union.
En la presente memoria se proporcionan ademas constructos de fusion que incluyen o que consisten en un primer dominio "lftico" y que incluyen o consisten en un segundo dominio "de direccionamiento" o "de union". Un constructo de fusion puede incluir un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos que incluye una secuencia peptfdica (seleccionada de entre aminoacidos tales como lisina=K, fenilalanina=F y alanina=A), por ejemplo, KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK,
KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. Un constructo de fusion puede incluir un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. Un constructo de fusion puede incluir un primer dominio que incluye o que consiste en una secuencia de un primer dominio que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF,
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que consiste en una secuencia de 1 a 25 L- o D-aminoacidos (por ejemplo una fraccion de direccionamiento o de union) diferente de dicho primer dominio.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "fusion" o "quimerico" y variaciones gramaticales de los mismos, utilizados en referencia a un constructo, se refieren a que el constructo contiene partes o secciones que se derivan o se obtienen o se afslan, o se basan o han sido modeladas siguiendo dos entidades moleculares diferentes que son distintas una de otra y que tfpicamente no coexisten naturalmente. Es decir, por ejemplo, una parte del constructo de fusion incluye o consiste en una parte lftica y una segunda parte del constructo incluye o consiste en una parte de direccionamiento, tal como una fraccion que presenta capacidad de union, siendo el primer y el segundo dominios estructuralmente diferentes. Un constructo de fusion tambien puede denominarse "conjugado", en el que el conjugado incluye o consiste en una parte lftica de primer dominio y un segundo dominio fraccion de direccionamiento o de union.
Entre los primeros dominios o los segundos dominios de los constructos de fusion se incluyen o consisten en secuencias de aminoacidos (peptidos, polipeptidos, protefnas o lectinas), acidos nucleicos (ADN o ARN) y carbohidratos (sacaridos, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa, acido acetilneuramfnico, etc.). Las expresiones "secuencia de aminoacidos", "protefna", "polipeptido" y "peptido" se utilizan intercambiablemente en la presente memoria para referirse a dos o mas aminoacidos o "residuos" unidos covalentemente mediante un enlace amida o equivalente. Las secuencias de aminoacidos pueden unirse mediante enlaces qufmicos no naturales y no amidas, incluyendo, por ejemplo, las formadas con glutaraldehfdo, esteres de N- hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales o N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). Entre los enlaces no amida
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se incluyen, por ejemplo, cetometileno, aminometileno, olefina, eter, tioeter y similares (ver, por ejemplo, Spatola, Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 7, paginas 267 a 357, 1983, "Peptide and Backbone Modifications", Marcel Decker, NY).
Entre los primeros y segundos dominios de un constructo de fusion o quimera se incluyen secuencias de L- aminoacidos, secuencias de D-aminoacidos y secuencias de aminoacidos con mezclas de L-aminoacidos y D- aminoacidos. Las secuencias de aminoacidos de los primeros y segundos dominios pueden ser una estructura lineal o cfclica conjugada con una fraccion diferente (por ejemplo tercer, cuarto, quinto, sexto, septimo, etc. dominios), formar enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares y tambien formar multfmeros u oligomeros de orden superior con la misma o diferente secuencia de aminoacidos, u otras moleculas.
Las longitudes ejemplificativas de los constructos de fusion presentan una longitud de entre aproximadamente 5 y 15, de entre 20 y 25, de entre 25 y 50, de entre 50 y 100, de entre 100 y 150, de entre 150 y 200, o de entre 200 y 300 o mas residuos aminoacidos. Un primer o segundo dominio puede incluir o consistir de una secuencia de aminoacidos de entre aproximadamente 1 y 10, de entre 10 y 20, de entre 15 y 20, de entre 20 y 30, de entre 30 y 40, de entre 40 y 50, de entre 60 y 70, de entre 70 y 80, de entre 80 y 80, de entre 90 y 100 o mas residuos. Un primer dominio puede consistir de una secuencia de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 28 o mas residuos aminoacidos.
Los primeros dominios de constructo de fusion, solos o en combinacion con un segundo dominio, opcionalmente forman una helice alfa anfipatica. Una helice alfa anfipatica contiene mayoritariamente aminoacidos hidrofilos en un lado de la helice alfa y en el otro lado contiene mayoritariamente aminoacidos hidrofobos. Debido a que la helice alfa realiza un giro completo cada 3,6 residuos, la secuencia de aminoacidos de una helice alfa anfipatica alterna entre residuos hidrofilos e hidrofobos cada 3 a 4 residuos. Se predice que un patron o motivo repetido PNNPNNP forma una helice alfa anfipatica en la que P representa un residuo aminoacido de carga positiva y N es un residuo aminoacido neutro. Un patron de repeticion PNNPNNP proporciona un sitio de union cationico para el peptido lftico a una membrana celular cargada negativamente y un sitio hidrofobo para la interaccion/penetracion membranaria. Por lo tanto, los constructos de fusion incluyen primeros dominios con uno o mas patrones o motivos de repeticion PNNPNNP no interrumpidos, o uno o mas patrones o motivos repetidos PNNPNNP interrumpidos, los cuales pueden formar una helice alfa anfipatica. Por ejemplo, una secuencia de 15 o 18 residuos aminoacidos, tal como KFAKFAKKFAKFAKK y KFAKFAKKFAKFAKKFAK, presenta motivos repetidos PNNPNNP no interrumpidos e interrumpidos.
Un segundo dominio de constructo de fusion, tal como una fraccion de direccionamiento o de union, incluye o consiste en un ligando, anticuerpo (o un fragmento de union a antfgeno del mismo), antfgeno, integrina, receptor de integrina (por ejemplo protefnas o peptidos que contiene un motivo de secuencia "RGD" y componentes que pueden encontrarse presentes en la matriz extracelular (MEC), tal como mono-, di- u oligo-sacaridos, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa y acido acetilneuramfnico), factor de crecimiento, citocina, quimiocina y fracciones de direccionamiento y de union que se unen a receptores, anticuerpos, antfgenos, integrinas, receptores de integrina (por ejemplo protefnas o peptidos que contienen motivo de secuencia "RGD" y componentes que pueden encontrarse presentes en la matriz extracelular (MEC), tales como mono-, di- u oligo- sacaridos, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa y acido acetilneuramfnico), receptores de factor de crecimiento, receptores de citocina y receptores de quimiocina.
Un "receptor" tfpicamente se encuentra presente sobre (por ejemplo un receptor de membrana) o dentro de una celula. Un receptor puede asociarse a la superficie de la membrana celular o cruzar la membrana celular. Por ejemplo, una protefna receptora puede presentar un dominio transmembranario que cruza la membrana celular, opcionalmente con una parte que es citoplasmatica o extracelular, o ambos. Por lo tanto, entre los receptores se incluyen receptores nativos intactos de longitud completa que contienen una parte extracelular, transmembranaria o citoplasmatica, asf como formas truncadas o fragmentos de los mismos (por ejemplo una parte extracelular, transmembranaria o citoplasmatica o subsecuencia del receptor, solo o en combinacion). Por ejemplo, un receptor soluble tfpicamente no presenta region transmembranaria y opcionalmente tambien puede no presentar la totalidad o una parte de la region extracelular o citoplasmatica (en caso de encontrarse presentes en el receptor nativo). Dichas formas y fragmentos de receptor truncado pueden conservar por lo menos una union parcial al ligando.
Los dominios de fraccion de direccionamiento y de union de los constructos de fusion incluyen o consisten en cualquier entidad que se une a un receptor, denominado ligando de receptor, de manera especffica o no especffica. Por lo tanto, entre los ejemplos no limitativos de fracciones de direccionamiento y de union se incluyen hormonas, analogos de hormona, un fragmento de una hormona o analogo de hormona que se une a un receptor de hormona, un factor de crecimiento, un analogo de factor de crecimiento, un fragmento de un factor de crecimiento o un analogo de factor de crecimiento que se une a un receptor, un receptor de hormona o un ligando que se une a una hormona o a un receptor de hormona, y fracciones de direccionamiento y de union que se unen a una hormona, un analogo de hormona, un fragmento de una hormona o analogo de hormona que se une a un receptor de hormona, un receptor de hormona o un ligando que se une a una hormona o a un receptor de hormona, factor de crecimiento, analogo de factor de crecimiento, un fragmento de un factor de crecimiento o un analogo de factor de crecimiento que se une a un receptor, un receptor de factor de crecimiento o un ligando
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que se une a un factor de crecimiento o a un receptor de factor de crecimiento, etc.
Entre las hormonas ejemplificativas utiles como fracciones de union se incluyen la hormona I liberadora de gonadotropina, la hormona II liberadora de gonadotropina, la hormona liberadora de hormona luteinizante III de lamprea, cadena beta de la hormona luteinizante, hormona luteinizante (HL), gonadotropina corionica (GC), subunidad beta de la gonadotropina corionica (p- o beta-GC), hormona estimulante de los melanocitos, estradiol, dietilestilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona folfculoestimulante (HFE), glucocorticoides, estrogenos, tesosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, deshidroepiandrosterona, progesterona, androgenos y derivados de los mismos. Entre los receptores hormonales utiles como fracciones de union se incluyen el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina I, el receptor de la hormona liberadora de gonadotropina II, el receptor de la hormona liberadora de hormona luteinizante III de lamprea, el receptor de hormona liberadora de hormona lutenizante, el receptor de gonadotropina corionica, el receptor de hormona estimulante de melanocitos, el receptor de estradiol, el receptor de dopamina, el receptor de somatostatina, el receptor de la hormona folfculoestimulante (HFE), el receptor del factor de crecimiento epidermico (FCE), el receptor de la hormona del crecimiento (HC), el receptor de Her2-neu, el receptor de la hormona glucocorticoide, el receptor de estrogeno, el receptor de testosterona, el receptor de progesterona y el receptor de androgenos.
Entre los factores de crecimiento ejemplificativos se incluyen el factor de crecimiento epidermico (FCE), la hormona del crecimiento (HC) y Her2-neu. Entre los receptores de factor de crecimiento ejemplificativos se incluyen el receptor del factor de crecimiento epidermico (FCE), la hormona del crecimiento (HC) y Her2-neu, FCI-I.
Entre los ejemplos no limitativos especfficos de fracciones de direccionamiento o de union se incluyen HLHL, fragmentos funcionales (de union) de HLHL, analogos de HLHL y pGC, fragmentos funcionales (de union) de pGC y analogos de pGC. HLHL es un ligando totalmente funcional y puede inducir efectos farmacologicos mediante la interaccion de ligando y receptor, tal como la activacion de rutas de transduccion de senales. pGC- ala es un fragmento de GC_h que puede unirse a la membrana celular sin inducir ningun efecto farmacologico. Los ejemplos no limitativos especfficos de fracciones de direccionamiento o de union incluyen o consisten en una secuencia de aminoacidos dentro de, o que se indica como: SYAVALSAQAALARR, SYAVALSAQAALARRA, que son fragmentos de pGC, y QHWSYGLRPG, que es una secuencia de HLHL.
Entre las fracciones de direccionamiento y de union se incluyen ademas antfgenos de ligandos que se expresan exclusiva o preferentemente en celulas neoplasicas, tumorales o cancerosas, y vasos linfaticos o sangufneos asociados a celulas neoplasicas, tumorales o cancerosas. Dichos antfgenos pueden denominarse convenientemente "antfgenos asociados a tumor" o "AAT" e incluyen el antfgeno carcinoembrionario (ACE), la alfa-fetoprotefna (AFP), el antfgeno especffico de la prostata (AEP), el antfgeno de membrana especffico de la prostata (AMEP), CA-125 (cancer ovarico epitelial residual), el receptor de la interleucina-2 (IL-2), RAGE-1, la tirosinasa, MAGE-1, MAgE-2, NY-ESO-1, Melan-A/MART-1, la glucoprotefna (gp) 75, gp100, la beta-catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, la ubiquilina-1, HOX-B6, YB-1, la osteonectina e ILF3, IGF-1, entre otros. Otros antfgenos que pueden ser diana son: CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, receptores de tipo inmunoglobulina, etc).
Entre las fracciones de direccionamiento y de union se incluyen adicionalmente la transferrina, el acido folico y derivados del mismo (por ejemplo el folato) y los elementos de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT) y los receptores de FNT, tales como FNT-alfa, FNT-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT y 41BB.
Los constructos de fusion en los que un segundo dominio incluye o consiste en un dominio de direccionamiento o de union pueden unirse a una celula que produce o expresa un antfgeno, receptor o ligando, anticuerpo o antfgeno o AAT al que se una el segundo dominio. Entre los ejemplos no limitativos de celulas se incluyen las celulas hiperproliferativas y las celulas que muestran una hiperproliferacion aberrante o no deseable. En ejemplos no limitativos particulares, entre dichas celulas se incluyen las celulas neoplasicas, cancerosas, tumorales y malignas no metastasicas y metastasicas, asf como las celulas neoplasicas, cancerosas, tumorales y malignas diseminadas y las celulas neoplasicas, cancerosas, tumorales y malignas latentes. Las celulas que expresan un antfgeno, receptor, ligando, integrina, AAT, etc., a niveles elevados respecto a las celulas normales o no hiperproliferantes proporcionan selectividad para dichas celulas. De esta manera, una fraccion de direccionamiento o de union puede unirse a un antfgeno, receptor, ligando, integrina o AAT que es expresada o producida por una celula hiperproliferante (por ejemplo neoplasias, canceres, tumores y neoplasias malignas no metastasicas y metastasicas, y celulas neoplasicas, cancerosas, tumorales y malignas diseminadas y latentes), pero que no se expresa detectablemente o que se produce o se expresa a niveles relativamente inferiores en celulas normales o no hiperproliferantes, presentando de esta manera como diana preferente las celulas hiperproliferantes. Entre los tipos ejemplificativos no limitativos de celulas y tejidos que expresan un antfgeno, receptor, ligando, integrina o AAT se incluyen celulas de mama, ovario, utero, cuello uterino, prostata, testfculo, glandulas adrenales, pituitaria, pancreas, hfgado, gastrointestinales, piel, musculo o endometrio.
Entre los ejemplos adicionales de fracciones de union se incluyen anticuerpos y fragmentos de anticuerpo. Un "anticuerpo" se refiere a cualquier molecula de inmunoglobulina monoclonal o policlonal, tal como IgM, IgG, IgA,
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IgE, IgD y cualquier subclase de las mismas. Son subclases ejemplificativas de IgG, IgGi, IgG2, IgG3 e IgG4. Entre los anticuerpos se incluyen los producidos o expresados sobre celulas, tales como las celulas B. Un fragmento o subsecuencia de anticuerpo se refiere a una parte de un anticuerpo de longitud completa que conserva una capacidad de union a antfgeno por lo menos parcial en comparacion con un anticuerpo de longitud completa. Entre los fragmentos de anticuerpo ejemplificativos se incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, Fv de cadena sencilla (scFv), Fv unidos mediante disulfuro (sdFv), Vl, Vh, (Fab3) triespecfficos, (Fab2) biespecfficos, diacuerpo ((Vl-Vh)2 o (Vh-Vl)2), triacuerpo (trivalente), tetracuerpo (tetravalente), minicuerpo ((scFv-Ch3)2), Fv de cadena sencilla biespecffico (Bis-scFv), IgGdeltaCH2, scFv-Fc, (scFv)2-Fc, u otro fragmento de union a antfgeno de una inmunoglobulina intacta.
Entre los constructos de fusion se incluyen aquellos con un primer dominio en el extremo amino-terminal y un segundo dominio en el extremo carboxilo-terminal. Entre los constructos de fusion se incluyen ademas aquellos con un primer dominio en el extremo carboxilo-terminal y un segundo dominio en el extremo amino-terminal. En el caso de que se encuentren presentes dominios adicionales (por ejemplo tercer, cuarto, quinto, sexto, septimos dominios, etc.), se situa un primer dominio en el extremo NH2-terminal respecto a un segundo dominio, o se situa un segundo dominio en el extremo NH2-terminal respecto a un primer dominio.
Tambien se encuentran incluidas las subsecuencias y sustituciones de aminoacidos de las diversas secuencias indicadas en la presente memoria, tales como KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, o una fraccion de union. Una subsecuencia de un primer o segundo dominio puede presentar por lo menos 5 a 10, 10 a 15, 15 a 20, 20 a 25, 25 a 30, 30 a 35 o mas residuos aminoacidos.
En la presente memoria se describen ademas modificaciones o variaciones, tales como sustituciones, adiciones o eliminaciones de un primer o segundo dominio, o en ambos dominios. De esta manera, un constructo de fusion que incluye un primer o segundo dominio de secuencia peptfdica puede incorporar cualesquiera sustituciones de aminoacidos conservadoras o no conservadoras, con la condicion de que dichas sustituciones no destruyan la actividad (lftica o de union) del primer o segundo dominio. De esta manera, por ejemplo una parte lftica modificada (primer dominio) puede conservar por lo menos una actividad lftica parcial, tal como la eliminacion o apoptosis celular, de un primer dominio no modificado y una fraccion de union modificada o mimetica de la misma puede conservar una actividad de union por lo menos parcial de una fraccion de union no modificada.
Una "sustitucion conservadora" es una sustitucion de un aminoacido por un residuo biologica, qufmica o estructuralmente similar. Biologicamente similar se refiere a que la sustitucion es compatible con una actividad biologica, por ejemplo la actividad lftica. La expresion estructuralmente similar se refiere a que los aminoacidos presentan cadenas laterales de longitud similar, tales como alanina, glicina o serina, o presentan un tamano similar, o se mantiene la estructura de un primer o segundo dominio o un dominio adicional, tal como una helice alfa anfipatica. La expresion similitud qufmica se refiere a que los residuos presentan la misma carga o ambos son hidrofilos o hidrofobos. Entre los ejemplos particulares se incluyen la sustitucion de un residuo hidrofobo, tal como isoleucina, valina, leucina o metionina por otro residuo hidrofobo, o la sustitucion de un residuo polar por otro residuo polar, tal como la sustitucion de arginina por lisina, de acido glutamico por acido aspartico o de glutamina por asparagina, o de serina por treonina, etc. Pueden utilizarse ensayos rutinarios para determinar si una variante de constructo de fusion presenta actividad, por ejemplo actividad lftica o actividad de union.
Entre los ejemplos especfficos se incluyen una sustitucion o eliminacion de uno o mas residuos aminoacidos (por ejemplo 1 a 3, 3 a 5, 5 a 10, 10 a 20 o mas) de un primer o segundo dominio de peptido. Un constructo de fusion modificado puede presentar una secuencia peptfdica con una identidad de 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, o superior respecto a una secuencia de referencia (por ejemplo un primer dominio, tal como KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA o KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, o un segundo dominio, tal como una fraccion de union).
Un constructo de fusion puede incluir un primer dominio de peptido que incluye o consiste en 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos L- o D-aminoacidos que incluyen un peptido seleccionado de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que presentan uno o mas de los residuos K sustituidos por un residuo F o L, uno o mas de los residuos F sustituidos por un residuo K, A o L, uno o mas de los residuos A sustituidos por un residuo K, F o L. Un constructo de fusion incluye un primer dominio de peptido que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que presenta uno o mas de los residuos K sustituidos por un residuo F o L, uno o mas de los residuos F sustituidos por un residuo K, A o L, o uno o mas de los residuos A sustituidos por un residuo K, F o L, y un segundo dominio de peptido que incluye o consiste en una fraccion de union. Un constructo de fusion puede incluir o consistir de un primer dominio de peptido que consiste en una secuencia de L- o D-aminoacidos seleccionada de entre
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KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK que presenta uno o mas de los residuos K sustituidos por un residuo F o L, uno o mas de los residuos F sustituidos por un residuo K, A o L, o uno o mas de los residuos A sustituidos por un residuo K, F o L, y un segundo dominio de peptido que consistfa de una secuencia de 1 a 25 L- o D-aminoacidos (por ejemplo la fraccion de union) diferente del primer dominio.
El termino "identidad" y "homologfa" y variaciones gramaticales de los mismos se refieren a que dos o mas entidades referenciadas son iguales. De esta manera, en el caso de que dos secuencias de aminoacidos sean identicas, presentan la misma secuencia de aminoacidos. La expresion "areas, regiones o dominios de identidad" se refiere a que una parte de dos o mas entidades referenciadas son iguales. De esta manera, en el caso de que dos secuencias de aminoacidos sean identicas u homologos a lo largo de una o mas regiones de la secuencia, comparten identidad en dichas regiones. El termino "complementario", utilizado en referencia a una secuencia de acidos nucleicos se refiere a que las regiones referenciadas son 100% complementarias, es decir, muestran 100% de apareamiento de bases sin no correspondencias.
Debido a la variacion en la cantidad de conservacion de las secuencias entre protefnas estructural y funcionalmente relacionadas, el nivel de identidad de secuencia requerido para conservar una funcion o actividad (por ejemplo lftica o de union) depende de la protefna, de la region y funcion o actividad de dicha region. Por ejemplo, para una secuencia de peptido lftico, pueden encontrarse presentes multiples patrones o motivos repetidos de secuencias PNNPNNP, aunque no resulta necesario que se encuentren presentes uno o mas patrones o motivos repetidos de secuencia PNNPNNP interrumpidos o no interrumpidos.
El grado de identidad entre dos secuencias puede determinarse utilizando un programa informatico y un algoritmo matematico conocido de la tecnica. Dichos algoritmos que pueden calcular el porcentaje de identidad de secuencias (homologfa) generalmente consideran los huecos de secuencia y las no correspondencias dentro de la region de comparacion. Por ejemplo, un algoritmo de busqueda BLAST (por ejemplo BLAST 2.0) (ver, por ejemplo Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990), disponible publicamente en el NCBI) presenta los parametros de busqueda ejemplificativos siguientes: No correspondencia -2; apertura de hueco 5; extension de hueco 2. Para las comparaciones de secuencias polipeptfdicas, tfpicamente se utiliza un algoritmo BLASTP en combinacion con una matriz de puntuacion, tal como PAM100, PAM250, BLOSUM62 o BLOSUM50. FASTA (por ejemplo FASTA2 y FASTA3) y los programas de comparacion de secuencias SSEARCH tambien se utilizan para cuantificar el grado de identidad (Pearson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185, 2000, y Smith et al., J. Mol. Biol. 147:195, 1981). Tambien se han desarrollado programas para cuantificar la similitud estructural de las protefnas utilizando el mapeado topologico basado en Delaunay (Bostick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 304:320, 2003).
Pueden unirse residuos individuales y primer y segundo dominios, y dominios adicionales, mediante un enlace covalente o no covalente. Son ejemplos no limitativos de enlaces covalentes, los enlaces amida, los enlaces qufmicos no naturales y no amida, que incluyen, por ejemplo, glutaraldehfdo, esteres de N-hidroxisuccinimida, maleimidas bifuncionales, N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC) o N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC). Entre los grupos de union alternativos a los enlaces amida se incluyen, por ejemplo, cetometileno (por ejemplo, -C(=O)- CH2- para -C(=O)-NH-), aminometileno (CH2-NH), etileno, olefina (CH=cH), eter (CH2-O), tioeter (CH2-S), tetrazol (CN4-), tiazol, retroamida, tioamida o ester (ver, por ejemplo, Spatola (1983), Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 7, paginas 267 a 357, "Peptide and Backbone Modifications," Marcel Decker, NY).
El primer y segundo dominios pueden fusionarse o unirse de manera inmediatamente contigua entre sf mediante un enlace covalente o no covalente. El primer y segundo dominios pueden estar separados por una region intermedia, tal como una bisagra, espaciador o conector situado entre el primer y segundo dominios. El primer y segundo dominios pueden unirse mediante una cadena de carbonos. Entre las cadenas multicarbono se incluyen acidos carboxflicos (por ejemplo acidos dicarboxflicos), tales como acido glutarico, acido succfnico y acido adfpico.
El primer y segundo dominios pueden unirse mediante un aminoacido, un peptido o una bisagra, espaciador o conector situado entre el primer y segundo dominios. Las secuencias de bisagra, espaciador o conector peptfdico pueden presentar cualquier longitud, aunque tfpicamente estan comprendidas entre aproximadamente 1 y 10, 10 y 20, 20 y 30, 30 y 40 o 40 y 50 residuos aminoacidos. Una bisagra, espaciador o conector peptfdico situado entre el primer y segundo dominios puede presentar 1 a 25 residuos L- o D-aminoacidos, o 1 a 6 residuos L- o D- aminoacidos. Entre los residuos aminoacidos particulares que se incluyen en las secuencias situadas entre el primer y segundo dominios se incluyen uno o mas de entre los residuos aminoacidos C, A, S o G. Entre los ejemplos no limitativos especfficos de los peptidos situados entre el primer y segundo dominios se incluyen una secuencia dentro de, o indicada como: GSGGS, ASAAS o CCCCCC. Los derivados de aminoacidos y peptidos pueden situarse entre el primer y el segundo dominios. Un ejemplo no limitativo especffico de un derivado aminoacido es un derivado de lisina, o un conector de 6 carbonos, tal como el acido a-amino-caproico.
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Los constructos de fusion con o sin una bisagra, espaciador o conector, o un tercer, cuarto, quinto, sexto, septimo, etc. dominio pueden estar compuestos totalmente de aminoacidos naturales o sinteticos, de aminoacidos no naturales o de analogos de aminoacidos, o pueden incluir formas derivatizadas. Un constructo de fusion puede incluir en el primer o segundo dominios, uno o mas D-aminoacidos sustituidos por L- aminoacidos, mezclas de D-aminoacidos y L-aminoacidos, o una secuencia compuesta enteramente de residuos D-aminoacidos.
Los constructos de fusion pueden contener cualquier combinacion de componentes estructurales no naturales, que tfpicamente son de tres grupos estructurales: a) grupos de enlace de residuos diferentes de los enlaces de enlace amida naturales ("enlace peptfdico"), b) residuos no naturales en lugar de residuos aminoacidos naturales, o c) residuos que inducen una mimetizacion estructural secundaria, es decir, que inducen o estabilizan una estructura secundaria, por ejemplo una conformacion de helice alfa. Entre los constructos de fusion se incluyen estructuras cfclicas, tales como un enlace amida extremo-con-extremo entre los extremos amino- y carboxi-terminales de la molecula o uno o mas enlaces disulfuro intra- o intermoleculares. Los constructos de fusion pueden modificarse in vitro o in vivo, por ejemplo pueden modificarse postraduccionalmente para incluir, por ejemplo, residuos de sacarido o carbohidrato, grupos fosfato, acidos grasos, lfpidos, etc.
Entre los ejemplos especfficos de una adicion se incluyen un tercer, cuarto, quinto, sexto o septimo dominio. Por lo tanto, entre los constructos de fusion con un primer y un segundo dominios se incluyen uno o mas dominios adicionales (tercer, cuarto, quinto, sexto, septimo, etc.) unidos covalentemente a los primeros para proporcionar una funcion o actividad diferente o complementaria. Entre los dominios adicionales ejemplificativos se incluyen dominios que facilitan el aislamiento, que incluyen, por ejemplo, peptidos quelantes de metales, tales como tramos polihistidina y modulos de histidina-triptofano que permiten la purificacion sobre metales inmovilizados, dominios de protefna A que permiten la purificacion sobre inmunoglobulina purificada, y dominios utilizados en el sistema de purificacion por extension/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, WA). La inclusion opcional de una secuencia escindible, tal como Factor Xa o enteroquinasa, entre un dominio de purificacion y el constructo de fusion puede utilizarse para facilitar la purificacion. Por ejemplo, un vector de expresion puede incluir una secuencia de acidos nucleicos codificante de un constructo de fusion unida a seis residuos de histidina seguido de una tiorredoxina y un sitio de corte de enteroquinasa. Los residuos de histidina facilitan la deteccion y la purificacion del constructo de fusion, mientras que el sitio de corte de enteroquinasa proporciona un medio para purificar el constructo a partir del resto de la protefna (ver, por ejemplo, Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441, 1993).
La actividad de un constructo de fusion puede resultar afectada por diversos factores y, por lo tanto, los constructos de fusion pueden disenarse u optimizarse considerando uno o mas de dichos factores. Entre dichos factores se incluyen, por ejemplo, la longitud del constructo de fusion, que puede afectar a la toxicidad para las celulas. En particular, se ha observado una citotoxicidad incrementada al comparar Phor21-pGC-ala y Phor21 con Phor14-pGC-ala. La actividad de eliminacion celular de los dominios peptfdicos lfticos formados de helice alfa tambien puede depender de la estabilidad de la helice. Las bisagras y espaciadores pueden afectar a la interaccion membranaria del primer dominio y a la estructura helicoidal del dominio lftico del peptido. Por ejemplo, los constructos de fusion mas cortos, tales como los constructos de menos de 21 aminoacidos que incluyen opcionalmente un espaciador o bisagra, pueden mostrar una citotoxicidad incrementada debido a la estabilidad incrementada de la helice. En particular, los espaciadores tales como ASAAS y el acido 6- aminocaproico tienden a incrementar la toxicidad de los constructos de fusion mas cortos. La carga de los dominios del peptido lftico, que esta determinada en parte por los residuos aminoacidos particulares presentes en el dominio, tambien afecta a la potencia de eliminacion celular.
La posicion de la fraccion de union respecto al dominio lftico (extremo N- o C-terminal) tambien puede afectar a la actividad de eliminacion celular de los constructos de fusion. Por ejemplo, una fraccion de union situada en el extremo C-terminal respecto al dominio lftico presentaba una mayor actividad de eliminacion celular que si se encontraba situada en el lado N-terminal respecto al dominio lftico.
La semivida in vivo del constructo de fusion puede incrementarse mediante la construccion de dominios peptfdicos del constructo de fusion con uno o mas aminoacidos no naturales o derivados. Por ejemplo, los constructos de fusion con D-aminoacidos (por ejemplo hasta el 30% o mas de todos los residuos son D- enantiomeros) son resistentes a la proteolisis serica y, por lo tanto, pueden ser activos durante un tiempo mas prolongado, incrementando de esta manera la potencia in vivo. Ademas, la construccion de dominios peptfdicos de constructo de fusion con uno o mas aminoacidos no naturales o derivados puede reducir la actividad hemolftica. Dichos constructos de fusion con D-enantiomeros tambien presentan una mayor tendencia a ser monomericos en solucion: no se agregan de manera significativa.
En la presente memoria se proporcionan ademas constructos de fusion que presentan mayor actividad anti- proliferativa celular que uno o mas de entre Phor21-pGC-ala, Phor21-GSGGS-pGC-ala, Phor21-ASAAS-pGC-ala o Phor14-pGC-ala, segun se determino a partir de un valor de IC50 mas bajo, que representa la cantidad de constructo de fusion requerida para conseguir citotoxicidad celular. En la presente memoria se proporcionan ademas constructos de fusion que presentan menos actividad hemolftica, tal como representa la proporcion IC50/HA50 (actividad hemolftica), que Phor21-pGC-ala, Phor21-GSGGS-pGC-ala, Phor21-ASAAS-pGC-ala o
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Phor14-pGC-ala. En la presente memoria se proporcionan ademas constructos de fusion que presentan una actividad hemolftica, tal como representa una IC50/HA50 (actividad hemolftica) inferior a aproximadamente 0,2, 0,01 o 0,005. Las condiciones de ensayo representativas para determinar la citotoxicidad celular y la actividad hemolftica se indican en el Ejemplo 1.
Los peptidos y peptidomimeticos pueden producirse y aislarse utilizando metodos conocidos de la tecnica. Los peptidos pueden sintetizarse, completamente o en parte, utilizando metodos qmmicos conocidos de la tecnica (ver, por ejemplo, Caruthers, 1980, Nucleic Acids Res. Symp. Ser. 215; Horn, 1980, y Banga, A.K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems, 1995, Technomic Publishing Co., Lancaster, PA). La smtesis de peptidos puede llevarse a cabo utilizando diversas tecnicas de fase solida (ver, por ejemplo, Roberge Science 269:202 (1995); Merrifield, Methods Enzymol. 289:3, 1997) y la smtesis automatica puede llevarse a cabo utilizando, por ejemplo, el sintetizador de peptidos ABI 431 A (Perkin Elmer) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los peptidos y mimeticos de peptidos tambien pueden sintetizarse utilizando metodologfas combinatorias. Pueden sintetizarse residuos y polipeptidos sinteticos que incorporan mimeticos, utilizando una diversidad de procedimientos y metodologfas conocidas de la tecnica (ver, por ejemplo, Organic Syntheses Collective Volumes, Gilman et al. (editores), John Wiley & Sons, Inc., NY). Pueden producirse peptidos modificados mediante metodos de modificacion qmmica (ver, por ejemplo, Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440, 1997; Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373, 1995, y Blommers, Biochemistry 33:7886, 1994.
En la presente memoria se proporcionan ademas acidos nucleicos codificantes de los constructos de fusion indicados en la presente memoria y vectores que incluyen acidos nucleicos que codifican los constructos de fusion. Un acido nucleico puede codificar un constructo de fusion que incluye un primer dominio que consiste en una secuencia de 12, 13, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 residuos aminoacidos que incluye una secuencia pepridica seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF,
KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en un dominio de direccionamiento o de union. Un acido nucleico puede codificar un constructo de fusion que incluye un primer dominio que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que incluye o que consiste en una fraccion de direccionamiento o de union. Un acido nucleico puede codificar un constructo de fusion que incluye o que consiste en un primer dominio que consiste en una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF, KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA y
KFAKFAKKFAKFAKKFAKFAKKFAKFAK, y un segundo dominio que consiste en una secuencia de 1 a 25 aminoacidos (por ejemplo una fraccion de direccionamiento o de union) diferente de dicho primer dominio.
El acido nucleico, que en la presente memoria tambien puede denominarse gen, polinucleotido, secuencia de nucleotidos, cebador, oligonucleotido o sonda, se refiere a poftmeros que contienen purina y pirimidina naturales o modificados de cualquier longitud, polirribonucleotidos o polidesoxirribonucleotidos o poliribo- polidesoxirribonucleotidos mixtos y formas a-anomericas de los mismos. Los dos o mas poftmeros que contienen purina y pirimidina se unen ripicamente mediante un enlace fosfoester o analogo de los mismos. Los terminos pueden utilizarse intercambiablemente para referirse a todas las formas de acidos nucleicos, incluyendo acido desoxirribonucleico (ADN) y acido ribonucleico (ARN). Los acidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla, de doble cadena o triplex, lineales o circulares. Entre los acidos nucleicos se incluyen ADN genomico, ADNc y antisentido. El acido nucleico ARN puede ser ARNm, ARNr, ARNt o antisentido procesado o no procesado. Entre los acidos nucleicos se incluyen nucleotidos naturales, sinteticos ademas de analogos y derivados.
Como consecuencia de la degeneracion del codigo genetico, entre los acidos nucleicos se incluyen secuencias degeneradas con respecto a secuencias codificantes de los constructos de fusion indicados en la presente memoria. De esta manera, se proporcionan secuencias de acidos nucleicos degeneradas codificantes de constructos de fusion.
Los acidos nucleicos pueden producirse utilizando cualquiera de entre una diversidad de metodos estandares de clonacion y smtesis qmmica conocidos, y pueden alterarse deliberadamente mediante mutagenesis dirigida a sitio u otras tecnicas recombinantes conocidas por el experto en la materia. La pureza de los polinucleotidos puede determinarse mediante secuenciacion, electroforesis en gel y espectrometria de UV.
Los acidos nucleicos pueden insertarse en un constructo de acidos nucleicos en el que la expresion del acido nucleico esta influida o regulada por un "elemento de control de la expresion", denominado en la presente memoria "casete de expresion". La expresion "elemento de control de la expresion" se refiere a uno o mas elementos de secuencia de acidos nucleicos que regulan o influyen sobre la expresion de una secuencia de acidos nucleicos a la que se encuentra operablemente ligada. Un elemento de control de la expresion puede incluir, segun resulte apropiado, promotores, intensificadores, terminadores de transcripcion, silenciadores genicos, un codon de inicio (por ejemplo ATG) delante de un gen codificante de protema, etc.
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Un elemento de control de la expresion operablemente ligado a una secuencia de acidos nucleicos controla la transcripcion y, segun resulte apropiado, la traduccion de la secuencia de acidos nucleicos. La expresion “operablemente ligado” se refiere a una yuxtaposicion, en la que los componentes referenciados se encuentran en una relacion que les permite funcionan de la manera pretendida. Tfpicamente, los elementos de control de la expresion estan yuxtapuestos en el extremo 5' o 3' de los genes, aunque tambien pueden ser intronicos.
Entre los elementos de control de la expresion se incluyen elementos que activan la transcripcion constitutivamente, que son inducibles (es decir, requieren una senal externa para la activacion) o desreprimibles (es decir, requieren una senal para desactivar la transcripcion; en el caso de que la senal ya no se encuentre presente, la transcripcion se encuentra activada o "desreprimida"). Se incluyen ademas en los casetes de expresion indicados en la presente memoria, elementos de control suficientes para convertir la expresion genica en controlable para los tipos celulares o tejidos especfficos (es decir, elementos de control especfficos de tejido). Tfpicamente, dichos elementos se situan cadena arriba o cadena abajo (es decir, en posicion 5' y 3') respecto a la secuencia codificante. Los promotores generalmente se situan en posicion 5' respecto a la secuencia codificante. Los promotores producidos mediante tecnicas de ADN recombinante o sinteticas pueden utilizarse para proporcionar la transcripcion de los polinucleotidos indicados en la presente memoria. El termino "promotor" se refiere a un elemento de secuencia mfnimo suficiente para dirigir la transcripcion.
Pueden insertarse acidos nucleicos en un plasmido para la propagacion en una celula huesped y para la manipulacion genetica posterior, si se desea. Un plasmido es un acido nucleico que puede propagarse establemente en una celula huesped; los plasmidos pueden contener opcionalmente elementos de control de la expresion para regular la expresion del acido nucleico. En la presente memoria se utiliza un vector sinonimamente con plasmido y puede incluir tambien un elemento de control de la expresion para la expresion en una celula huesped. Los plasmidos y vectores generalmente contienen por lo menos un origen de replicacion para la propagacion en una celula y un promotor. Por lo tanto, los plasmidos y vectores resultan utiles para la manipulacion genetica de acidos nucleicos codificantes de constructo de fusion, produciendo constructos de fusion o acidos nucleicos antisentido, y expresando los constructos de fusion en celulas y organismos huesped, por ejemplo.
Entre los promotores de los sistemas bacterianos se incluyen los promotores de T7 y los inducibles, tales como pL del bacteriofago A, plac, ptrp, ptac (promotor hfbrido ptrp-lac) y promotores sensibles a tetraciclina. Entre los promotores de sistemas de celulas de insecto se incluyen los promotores constitutivos o inducibles (por ejemplo ecdisona). Entre los promotores constitutivos de celulas de mamffero se incluyen SV40, RSV, virus del papiloma bovino (VPB) y otros promotores vfricos, o promotores inducibles derivados del genoma de celulas de mamffero (por ejemplo el promotor de la metalotionefna IIA o el promotor de choque termico) o de virus de mamffero (por ejemplo el promotor tardfo adenovfrico o la repeticion terminal larga del virus del tumor mamario de raton inducible). Alternativamente, un genoma retrovfrico puede modificarse geneticamente para la introduccion y direccion de la expresion de un constructo de fusion en celulas huesped apropiadas.
Entre los sistemas de expresion se incluyen ademas vectores disenados para la utilizacion in vivo. Entre los ejemplos se incluyen vectores adenovfricos (patentes US n° 5.700.470 y n° 5.731.172), vectores adenoasociados (patente US n° 5.604.090), vectores de virus del herpes simple (patente US n° 5.501.979), vectores retrovfricos (patentes US n° 5.624.820, n° 5.693.508 y n° 5.674.703), vectores VPB (patente US n° 5.719.054) y vectores CMV (patente US n° 5.561.063).
Entre los vectores levadura se incluyen promotores constitutivos e inducibles (ver, por ejemplo, Ausubel et al., en: Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, cap. 13, ed., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, 1988; Grant et al. Methods in Enzymology, 153:516, 1987, eds. Wu y Grossman; Bitter Methods in Enzymology, 152:673, 1987, eds. Berger & Kimmel, Acad. Press, N.Y. y Strathern et al., The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces (1982), eds. Cold Spring Harbor Press, vols. I y II). Puede utilizarse un promotor de levadura constitutivo, tal como ADH o LEU2 o un promotor inducible, tal como GAL (R. Rothstein en: DNA Cloning, A Practical Approach, vol.11, cap. 3, ed. D.M. Glover, IRL Press, Wash., D.C., 1986). Los vectores que facilitan la integracion de las secuencias foraneas de acidos nucleicos en un cromosoma de levadura, mediante recombinacion homologa por ejemplo, son conocidos de la tecnica. Los cromosomas artificiales de levadura (YAC, por sus siglas en ingles) tfpicamente se utilizan en el caso de que los polinucleotidos insertados sean excesivamente grandes para vectores mas convencionales (por ejemplo de mas de aproximadamente 12 Kb).
Los vectores de expresion tambien pueden contener un marcador seleccionable que confiere resistencia a una presion selectiva o marcador identificable (por ejemplo la beta-galactosidasa), permitiendo de esta manera seleccionar, cultivar y expandir las celulas que poseen el vector. Alternativamente, puede encontrarse un marcador seleccionable sobre un segundo vector que se cotransfecta en la celula huesped con el primer vector que contiene un acido nucleico codificante del constructo de fusion.
Entre los sistemas de seleccion se incluyen, aunque sin limitacion, el gen de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Cell 11:223, 1977), gen de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (Szybalska et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:2026, 1962) y adenina fosforibosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22:817, 1980),
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genes que pueden utilizarse en las celulas tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Ademas, puede utilizarse la resistencia a antimetabolitos como la base para la seleccion para dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981); el gen gpt, que confiere resistencia al acido micofenolico (Mulligan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981); gen neomicina, que confiere resistencia al aminoglucosido G-418 (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1, 1981); el gen puromicina y el gen higromicina, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre et al., Gene 30:147, 1984). Entre los genes seleccionables adicionales se incluye trpB, que permite que las celulas utilicen el indol en lugar del triptofano; hisD, que permite que las celulas utilicen el histinol en lugar de la histidina (Hartman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047, 1988), y ODC (ornitina descarboxilasa), que confiere resistencia al inhibidor de la ornitina descarboxilasa, 2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO (McConlogue (1987) en: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory).
Tambien se proporcionan celulas huesped que expresan constructos de fusion y las celulas huesped transformadas con acidos nucleicos codificantes de constructos de fusion y vectores, incluyendo un acido nucleico que codifica el constructo de fusion. Una celula huesped puede ser una celula procariotica. Una celula huesped puede ser una celula eucariotica. En diversos aspectos, la celula eucariotica es una levadura o una celula de mamffero (por ejemplo humana, de primate, etc.).
Tal como se utiliza en la presente memoria, una "celula huesped" es una celula en la que se introduce un acido nucleico que puede propagarse, transcribirse o expresarse el constructo de fusion codificado. La expresion incluye ademas cualquier progenie o subclones de la celula huesped. Entre las celulas huesped se incluyen celulas que expresan un constructo de fusion y celulas que no expresan constructo de fusion. Las celulas huesped que no expresan un constructo de fusion se utilizan para propagar un acido nucleico o vector que incluye un acido nucleico codificante de un constructo de fusion o antisentido.
Entre las celulas huesped se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, microorganismos tales como bacterias y levaduras, y celulas vegetales, de insecto y de mamffero. Por ejemplo, las bacterias transformadas con vectores de expresion de acidos nucleicos de bacteriofago recombinantes, acidos nucleicos plasmfdicos o acidos nucleicos cosmfdicos; levaduras transformadas con vectores de expresion de levadura recombinantes, sistemas de celulas vegetales infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo virus del mosaico de la coliflor, VMCo; virus del mosaico del tabaco, VMT) o transformadas con vectores de expresion plasmfdicos recombinantes (por ejemplo plasmido Ti); sistemas de celulas de insecto infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo baculovirus) o sistemas de celulas animales infectadas por vectores de expresion vfricos recombinantes (por ejemplo retrovirus, adenovirus o virus Vaccinia) o sistemas de celulas animales transformadas y manipuladas para la propagacion o expresion transitoria o estable.
Entre los constructos de fusion, acidos nucleicos codificantes de constructos de fusion, vectores y celulas huesped que expresan constructos de fusion o transformadas con acidos nucleicos codificantes de constructos de fusion y antisentido se incluyen formas aisladas y purificadas. El termino "aislado", utilizado como modificador de una composicion indicada en la presente memoria, se refiere a que la composicion ha sido creada por la mano del ser humano o que se encuentra separada, de manera sustancialmente completa o por lo menos en parte, del medio in vivo natural. Generalmente, una composicion aislada se encuentra sustancialmente libre de uno o mas materiales con los que se asocia normalmente en la naturaleza, por ejemplo uno o mas de entre protefnas, acidos nucleicos, lfpidos, carbohidratos y membranas celulares. El termino "aislado" no excluye formas ffsicas alternativas de la composicion, tales como multfmeros/oligomeros, variantes, modificaciones o formas derivadas, o formas expresadas en celulas huesped producidas por el ser humano. El termino "aislado" tampoco excluye formas (por ejemplo formulaciones farmaceuticas y composiciones de combinacion) en las que se encuentran combinaciones dentro de las mismas, cualquiera de las cuales es producida por la mano del ser humano.
Una composicion "aislada" tambien puede "purificarse" en el caso de que se encuentre libre de algunos, de un numero sustancial, de la mayorfa o de todos los materiales con los que se asocia tfpicamente en la naturaleza. De esta manera, un constructo de fusion aislado que tambien es sustancialmente puro, no incluye polipeptidos o polinucleotidos presentes entre millones de otras secuencias, tales como protefnas de una biblioteca de protefnas o acidos nucleicos en una biblioteca genomica o de ADNc, por ejemplo. Una composicion "purificada" puede combinarse con otra u otras moleculas.
En la presente memoria se proporcionan ademas mezclas de constructos de fusion y composiciones de combinacion. Una mezcla puede incluir uno o mas constructos de fusion y un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable. Una mezcla puede incluir uno o mas constructos de fusion y un tratamiento o agente anti-proliferativo celular, antitumoral, anticancer o antineoplasico. Una mezcla puede incluir uno o mas constructos de fusion y un agente inmunopotenciador. Se proporcionan ademas combinaciones, tales como uno o mas constructos de fusion en un portador o excipiente farmaceuticamente aceptable, con uno o mas de entre un agente o tratamiento antiproliferativo celular, antitumoral, anticancer o antineoplasico, y un tratamiento o agente inmunopotenciador.
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Los constructos de fusion indicados en la presente memoria, tales como polipeptidos que presentan una secuencia de aminoacidos que incluye un primer dominio litico y un segundo dominio de fraccion de union, pueden utilizarse para dirigir las celulas a la lisis, a la muerte celular o a la apoptosis. Dichas celulas pueden ser dianas selectivamente. Por ejemplo, una celula que expresa un receptor, ligando, antfgeno o anticuerpo puede ser la diana de un constructo de fusion y, de esta manera, resultar eliminada preferentemente respecto a celulas que expresan menos del receptor, ligando, antfgeno o anticuerpo.
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula, y metodos para reducir o inhibir la proliferacion celular. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular.
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula hiperproliferativa, y metodos para reducir o inhibir la proliferacion de las celulas hiperproliferativas. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula hiperproliferativa o celulas hiperproliferativas con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion.
Se proporcionan ademas metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, cancerosa, tumoral y maligna no metastasica o metastasica. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula neoplasica, cancerosa, tumoral o maligna con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion celular.
Se proporcionan todavfa adicionalmente metodos para reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, cancerosa, tumoral y maligna no metastasica o metastasica latente o que no se divide. Un metodo puede incluir poner en contacto una celula neoplasica, cancerosa, tumoral o maligna latente o que no se divide con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula latente o que no se divide.
Se proporcionan adicionalmente metodos para reducir o inhibir selectivamente la proliferacion de una celula (por ejemplo una celula hiperproliferativa) que expresa un receptor, ligando, anticuerpo o antfgeno. Un metodo puede incluir poner en contacto la celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de una celula (por ejemplo la celula hiperproliferativa), en la que la fraccion de union de dicho peptido se une al receptor, ligando, anticuerpo o antfgeno expresado por la celula.
Se proporcionan todavfa adicionalmente metodos para reducir o inhibir selectivamente la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna que expresa un receptor, ligando, anticuerpo o antfgeno. Un metodo puede incluir poner en contacto la celula con un constructo de fusion en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna, en la que la fraccion de union de dicho constructo de fusion se une al receptor, ligando, anticuerpo o antfgeno expresado por la celula.
La expresion "puesta en contacto" se refiere a la union o interaccion directa o indirecta entre dos o mas entidades (por ejemplo un constructo de fusion y una celula). La puesta en contacto tal como se utiliza en la presente memoria incluye en solucion, en fase solida, in vitro, ex vivo, en una celula e in vivo. Puede hacerse referencia a la puesta en contacto in vivo como administrar o administracion.
Las celulas que deben ser dianas para reducir o inhibir la proliferacion, no selectivamente o selectivamente, incluyen celulas que expresan cualquier molecula a la que se une la fraccion de union del constructo de fusion. Entre las celulas ejemplificativas se incluye una celula que expresa un receptor (por ejemplo un receptor hormonal, un receptor de factor de crecimiento, un receptor de citocina, un receptor de quimiocina), ligando (por ejemplo una hormona, factor de crecimiento, citocina o quimiocina) o anticuerpo o un antfgeno, o una integrina o receptor de integrina (peptidos que contiene motivo de secuencia "RGD") o un componente presente en la matriz extracelular (MEC), tal como mono-, di- u oligo-sacaridos, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa, acido acetilneuramfnico, peptidos que contienen el motivo de secuencia "RGD", etc.
Entre las celulas diana se incluyen celulas que expresan una hormona esteroidea sexual o gonadal o un receptor de hormona esteroidea sexual o gonadal. Entre las celulas diana se incluyen ademas celulas que expresan un receptor que se une a la hormona liberadora de gonadotropina I, la hormona liberadora de gonadotropina II, la hormona liberadora de hormona lutenizante III de lamprea, la hormona luteinizante, la gonadotropina corionica, la hormona estimuladora de melanocitos, el estradiol, el dietilestilbesterol, la dopamina, la somatostatina, la hormona folfculoestimulante (HFE), los glucocorticoides, el estrogeno, la testosterona, la androstenediona, la dihidrotestosterona, la deshidroepiandrosterona, la progesterona, los androgenos, el factor de crecimiento epidermico (FCE), Her2/neu, la vitamina H, el acido folico o un derivado del mismo (por ejemplo folato), la transferrina, la hormona estimulante del tiroides (HET), la endotelina, la bombesina, la hormona del crecimiento, el peptido intestinal vasoactivo, la lactoferrina, una integrina (por ejemplo la integrina alfa-5 beta-3 o alfa-5 beta- 1), el factor de crecimiento nervioso, CD19, CD20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70,
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CD154, los receptores de tipo inmunoglobulina, ROR1, FCI-I, el antfgeno carcinoembrionario (ACE), el antfgeno especffico de la prostata (AEP), el antfgeno membranario especffico de la prostata (AMEP), el factor alfa de crecimiento transformante, el factor beta de crecimiento transformante, el factor de crecimiento similar a la insulina, el factor de crecimiento endotelial vascular, la insulina, ceruloplasmina o VIH-tat.
Entre las celulas diana se incluyen celulas que expresan un receptor que se une a una hormona esteroidea sexual o gonadal o a un receptor de hormona esteroidea sexual o gonadal. Entre las celulas diana se incluyen ademas celulas que expresan un receptor que se une a la hormona liberadora de gonadotropina I, la hormona liberadora de gonadotropina II, la hormona liberadora de hormona lutenizante III de lamprea, la cadena beta de la hormona luteinizante, la hormona luteinizante, la gonadotropina corionica, la subunidad beta de la gonadotropina corionica, la hormona estimuladora de melanocitos, el estradiol, el dietilestilbesterol, la dopamina, la somatostatina, la hormona folfculoestimulante (HFE), los glucocorticoides, el estrogeno, la testosterona, la androstenediona, la dihidrotestosterona, la deshidroepiandrosterona, la progesterona, los androgenos, el factor de crecimiento epidermico (FCE), Her2/neu, la vitamina H, el acido folico o un derivado del mismo (por ejemplo folato), la transferrina, la hormona estimulante del tiroides (HET), la endotelina, la bombesina, la hormona del crecimiento, el peptido intestinal vasoactivo, la lactoferrina, una integrina (por ejemplo la integrina alfa-5 beta-3 o la integrina alfa-5 beta-1), el factor de crecimiento nervioso, CD19, Cd20, CD23, CD27, CD28, CD30, CD33, CD40, CD52, CD56, CD70, CD154, los receptores de tipo inmunoglobulina, ROR1, FCI-I, el antfgeno carcinoembrionario (ACE), el antfgeno especffico de la prostata (AEP), el antfgeno membranario especffico de la prostata (AMEP), el factor alfa de crecimiento transformante, el factor beta de crecimiento transformante, la insulina, la ceruloplasmina, VIH-tat o un analogo del mismo (por ejemplo mifepristona, flutamida, lupron, zxoladex, suprelina, synatel triptorelina, buserelina, centrorelix, ganirelix, abarelix, antida, teverelix o degarelix (Fe200486)).
Las celulas que deben ser dianas para reducir o inhibir la proliferacion, no selectiva o selectivamente, incluyen adicionalmente celulas que expresan "antfgenos asociados a tumor", tales como el antfgeno carcinoembrionario (ACE), la alfa-fetoprotefna (AFP), el antfgeno especffico de la prostata (AEP), el antfgeno membranal especffico de la prostata (AMEP), CA-125 (cancer ovarico epitelial residual), el receptor soluble de la interleucina-2 (IL-2), RAGE-1, la tirosinasa, MAGE-1, MAGE-2, NY-EsO-1, Melan-A/MART-1, la glucoprotefna (gp) 75, gp100, la beta- catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, la ubiquilina-1, HOX-B6, YB-1, la osteonectina e iGF-1. Entre las celulas que deben ser dianas para reducir o inhibir la proliferacion, no selectiva o selectivamente, se incluyen adicionalmente celulas que expresan transferrina, acido folico y derivados del mismo (por ejemplo folato) y un elemento de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT) o tales como FNT-alfa, FNT-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT y 41BB, y receptores de los mismos.
Los constructos de fusion y metodos descritos en la presente memoria tambien son aplicables al tratamiento de la proliferacion celular no deseable o aberrante y los trastornos hiperproliferativos. De esta manera, en la presente memoria tambien se proporcionan metodos de tratamiento de la proliferacion celular no deseable o aberrante y de los trastornos hiperproliferativos. Un metodo puede incluir administrar en un sujeto (que requiere tratamiento) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar la proliferacion celular no deseable o aberrante o el trastorno hiperproliferativo.
La expresion "trastorno hiperproliferativo" se refiere a cualquier supervivencia, crecimiento o proliferacion celular no deseable o aberrante (por ejemplo no experimentar la muerte celular programada o apoptosis). Entre dichos trastornos se incluyen las hiperplasias benignas, las neoplasias no metastasicas y metastasicas, los canceres, los tumores y las neoplasias malignas. La proliferacion celular no deseable o aberrante y los trastornos hiperproliferativos pueden afectar a cualquier celula, tejido u organo en un sujeto. La proliferacion celular no deseable o aberrante y los trastornos hiperproliferativos pueden encontrarse presentes en un sujeto localmente, regionalmente o sistemicamente. Un trastorno hiperproliferativo puede aparecer a partir de una multitud de tejidos y organos, incluyendo, aunque sin limitacion, mama, pulmon (por ejemplo celulas pequenas o celulas no pequenas), tiroides, cabeza y cuello, cerebro, nasofaringe, garganta, nariz o senos nasales, organos linfoides, glandula adrenal, glandula pituitaria, tiroides, linfa, gastrointestinal (boca, esofago, estomago, duodeno, fleon, yeyuno (intestino delgado), colon y recto), tracto genitourinario (utero, ovario, vagina, cuello del utero, endometrio, tubos de Falopio, vejiga, testfculos, pene y prostata), rinones, pancreas, hfgado, huesos, medula osea, linfa, sangre, musculo, piel y celulas madre, que pueden metastizar o no a otros sitios, regiones o localizaciones secundarios.
Los constructos de fusion y metodos descritos en la presente memoria tambien son aplicables a tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia no metastasicos de origen en cualquier celula, organo o tejido. Dichos trastornos pueden afectar practicamente cualquier tipo celular o de tejido, por ejemplo el carcinoma, el sarcoma, el melanoma, y los trastornos neoplasicos reticuloendotelial o hematopoyetico (por ejemplo el mieloma, el linfoma o la leucemia).
Tal como se utiliza en la presente memoria, los terminos "neoplasia" y "tumor" se refieren a una celula o poblacion de celulas el crecimiento, proliferacion o supervivencia de las cuales es superior al crecimiento, proliferacion o supervivencia de una celula correspondiente normal, por ejemplo un trastorno de la proliferacion o
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diferenciacion celular. Un tumor es una neoplasia que se ha formado como una masa o crecimiento diferenciado. Un "cancer" o "afeccion maligna" se refiere a una neoplasia o tumor que puede invadir espacios, tejidos u organos contiguos. Una "metastasis" se refiere a una neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna que se ha diseminado o extendido a partir de su sitio primario a uno o mas sitios, localizaciones o regiones secundarios dentro del sujeto, en el que los sitios, localizaciones o regiones son diferentes del tumor o cancer primario.
Entre las celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas y malignas (metastasicas o no metastasicas) se incluyen las celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas y malignas latentes o residuales. Dichas celulas tfpicamente consisten en celulas tumorales remanentes que no se estan dividiendo (parada en G0-G1). Estas celulas pueden persistir en un sitio primario o como celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas o malignas diseminadas, en forma de enfermedad residual minima. Dichas celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas o malignas latentes no manifiestan sintomas pero pueden desarrollar sintomas graves y la muerte una vez estas celulas latentes proliferan. Los metodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para reducir o inhibir la proliferacion de celulas neoplasicas, tumorales, cancerosas o malignas latentes, que a su vez pueden inhibir o reducir la recaida tumoral o del cancer, o la metastasis o progresion tumoral o del cancer.
En la presente memoria se proporcionan ademas metodos de tratamiento de un sujeto que presenta un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico. Un metodo puede incluir administrar en un sujeto (que requiere tratamiento) una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar (por ejemplo para reducir o inhibir la proliferacion) el tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico.
El tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico puede encontrarse en cualquier estadio, por ejemplo temprano o avanzado, tal como un tumor en estadio I, II, III, IV o V. El tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastastico o no metastasico puede haber sido sometido a un tratamiento anterior o encontrarse estabilizado (sin progresion) o en remision.
En terminos de metastasis, los metodos descritos en la presente memoria pueden utilizarse para reducir o inhibir la metastasis de un tumor o cancer primario a otros sitios, o la formacion o establecimiento de tumores o canceres metastasicos a otros sitios distales respecto al tumor o cancer primario, inhibiendo o reduciendo de esta manera la recaida del tumor o cancer o la progresion del tumor o cancer. De esta manera, entre los metodos descritos en la presente memoria se incluyen, entre otros, 1) reducir o inhibir el crecimiento, proliferacion, movilidad o invasividad de las celulas tumorales o cancerosas que potencialmente o actualmente desarrollan metastasis (por ejemplo celulas tumorales diseminadas, CTD), 2) reducir o inhibir la formacion o el establecimiento de metastasis surgidas de un tumor o cancer primario a otro u otros sitios, localizaciones o regiones diferentes del tumor o cancer primario, 3) reducir o inhibir el crecimiento o la proliferacion de una metastasis en otro u otros sitios, localizaciones o regiones diferentes del tumor o cancer primario tras la formacion o el establecimiento de la metastasis, y 4) reducir o inhibir la formacion o el establecimiento de metastasis adicionales despues de la formacion o establecimiento de la metastasis.
Las celulas de un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico pueden encontrarse agregadas en una masa celular "solida" o dispersas o difusas. Un tumor "solido" se refiere a un cancer, neoplasia o metastasis que tfpicamente se agrega y forma una masa. Entre los ejemplos no limitativos se incluyen tumores viscerales, tales como melanomas, cancer de mama, pancreatico, uterino y ovarico, cancer testicular, incluyendo los seminomas, el cancer gastrico o de colon, los hepatomas, los carcinomas adrenal, renal y de vejiga, los canceres de pulmon, y de cabeza y cuello, y los tumores/canceres cerebrales.
Entre los carcinomas, que se refieren a neoplasias malignas de tejido epitelial o endocrino, se incluyen los carcinomas del sistema respiratorio, los carcinomas del sistema gastrointestinal, los carcinomas del sistema genitourinario, los carcinomas testiculares, los carcinomas de mama, los carcinomas prostaticos, los carcinomas del sistema endocrino y los melanomas. Entre los carcinomas ejemplificativos se incluyen los que forman a partir del utero, cuello uterino, pulmon, prostata, mama, cabeza y cuello, colon, pancreas, testfculos, adrenales, rinones, esofago, estomago, hfgado y ovarios. El termino incluye ademas los carcinosarcomas, por ejemplo incluyendo los tumores malignos compuestos de tejidos carcinomatosos y sarcomatosos. El adenocarcinoma incluye el carcinoma de un tejido glandular, o en el que el tumor forma una estructura similar a una glandula.
Los sarcomas se refieren a tumores malignos de origen en celulas mesenquimales. Entre los sarcomas ejemplificativos se incluyen, por ejemplo, el linfosarcoma, el liposarcoma, el osteosarcoma, el condrosarcoma, el leiomiosarcoma, el rabdomiosarcoma y el fibrosarcoma.
Entre las neoplasias neurales se incluyen el glioma, el glioblastoma, el meningioma, el neuroblastoma, el retinoblastoma, el astrocitoma y el oligodendrocitoma.
Un "tumor lfquido", que se refiere a neoplasias que se encuentran dispersas o difusas de manera natural, ya que tfpicamente no forman una masa solida. Entre los ejemplos particulares se incluyen la neoplasia del sistema reticuloendotelial o del sistema hematopoyetico, tales como linfomas, mielomas y leucemias. Entre los ejemplos no limitativos de leucemias se incluyen los mielomas linfoblastico, mieloblastico y multiple agudo y cronico.
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Tfpicamente, dichas enfermedades surgen de leucemias agudas pobremente diferenciadas, por ejemplo la leucemia eritroblastica y la leucemia megacarioblastica aguda. Entre los trastornos mieloides especfficos se incluyen, aunque sin limitacion, la leucemia promieloide aguda (LPMA), la leucemia mielogena aguda (LMA) y la leucemia mielogena cronica (LMC). Entre las neoplasias malignas linfoides se incluyen, aunque sin limitacion, la leucemia linfoblastica aguda (LLA), que incluye la LLA de linaje B y la LLA de linaje T, leucemia linfocftica cronica (LLC), la leucemia prolinfocftica (LPL), la leucemia de celulas pilosas (LCP) y la macroglobulinemia de Waldenstrom (MW). Entre los linfomas malignos especfficos se incluyen el linfoma no de Hodgkin y variantes, los linfomas de celulas T perifericos, la leucemia/linfoma de celulas T adultas (LCT), el linfoma de celulas T cutaneas (LCTC), la leucemia linfocftica granular grande (LGG), la enfermedad de Hodgkin y la enfermedad de Reed- Sternberg.
Tal como se da a conocer en la presente memoria, la proliferacion celular no deseable o aberrante o los trastornos hiperproliferativos pueden producirse en el utero, las mamas, la vagina, el cuello uterino y los tubos de Falopio. La endometriosis se produce cuando las celulas del utero crecen fuera del utero y en otras regiones, tales como los ovarios, la vejiga o el intestino. Los fibromas y polipos pueden afectar al utero, las mamas, la vagina, el cuello uterino y los tubos de Falopio.
De esta manera, en la presente memoria se proporcionan ademas metodos de tratamiento de la endometriosis y de los fibromas y polipos. Un metodo puede incluir la administracion en el sujeto de una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar la endometriosis. Un metodo puede incluir la administracion en el sujeto de una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar un fibroma o polipo.
Entre las celulas diana se incluyen las celulas que participan o que resultan necesarias para la reproduccion o la fertilidad. De esta manera, en la presente memoria se proporcionan ademas metodos para reducir la fertilidad de un animal. Un metodo puede incluir la administracion en el sujeto de una cantidad de un constructo de fusion suficiente para reducir la fertilidad o para reducir la probabilidad de embarazo o para reducir la produccion de esperma en un mamffero macho.
Tal como se da a conocer ademas en la presente memoria, la proliferacion celular no deseable o aberrante o los trastornos hiperproliferativos pueden producirse en la prostata. De esta manera, en la presente memoria se proporcionan ademas metodos de tratamiento de la hiperplasia prostatica benigna o de la neoplasia prostatica metastasica. Un metodo puede incluir la administracion en el sujeto de una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar la hiperplasia prostatica benigna o la neoplasia prostatica metastasica.
Cualquier composicion, tratamiento, protocolo, terapia o regimen con actividad o efecto antiproliferativo celular puede combinarse con un constructo de fusion o utilizarse en combinacion en un metodo descrito en la presente memoria. Por lo tanto, entre los constructos de fusion y metodos descritos en la presente memoria se incluyen los tratamientos, protocolos y terapias antiproliferativos, antitumorales, anticancer, antineoplasicos y antimetastasicos, que incluyen cualquier otra composicion, tratamiento, protocolo o regimen terapeutico que inhibe, reduce, retrasa, enlentece, disminuye o evita un trastorno hiperproliferativo, tal como el crecimiento, progresion, metastasis, proliferacion o supervivencia tumoral, cancerosa, maligna o neoplasica, o agravamiento in vitro o in vivo. Entre los ejemplos no limitativos particulares de una terapia antiproliferativa (por ejemplo tumoral) se incluyen la quimioterapia, la inmunoterapia, la radioterapia (ionizante o qufmica), la terapia termica local (hipertermia), la reseccion quirurgica y la vacunacion. Puede administrarse un constructo de fusion antes, de manera sustancialmente contemporanea o posteriormente a la administracion del tratamiento o terapia antiproliferativo celular, antineoplasico, antitumoral, anticanceroso, antimetastasico o inmunopotenciador. Puede administrarse un constructo de fusion en forma de composiciones de combinacion con el tratamiento o terapia antiproliferativo celular, antineoplasico, antitumoral, anticanceroso, antimetastasico o inmunopotenciador, tumor metastasico o no metastasico, cancer, afeccion maligna o neoplasia.
Entre las composiciones, terapias, protocolos o tratamientos antiproliferativos, antineoplasicos, antitumorales, anticancerosos y antimetastasicos se incluyen los que evitan, alteran, interrumpen, inhiben o retrasan la progresion del ciclo celular o la proliferacion celular; los que estimulan o potencian la apoptosis o la muerte celular, inhiben la sfntesis o el metabolismo de los acidos nucleicos o las protefnas, inhiben la division celular, o disminuyen, reducen o inhiben la supervivencia celular, o la produccion o utilizacion de un factor de supervivencia celular, factor de crecimiento o ruta de senalizacion (extracelular o intracelular) necesario. Entre los ejemplos no limitativos de clases de agente qufmico que presentan actividades antiproliferativa celular, antineoplasica, antitumoral, anticancerosa y antimetastasica se incluyen los agentes alquilante, los antimetabolitos, los extractos vegetales, los alcaloides vegetales, las nitrosoureas, las hormonas y los analogos de nucleosidos y nucleotidos. Entre los ejemplos especfficos de farmacos que presentan actividades antiproliferativa celular, antineoplasica, antitumoral, anticancerosa y antimetastasica se incluyen la ciclofosfamida, la azatioprina, la ciclosporina A, la prednisolona, el melfalan, el clorambucilo, la mecloretamina, el busulfan, el metotrexato, la 6-mercaptopurina, la tioguanina, el 5-fluorouracilo, el citosina arabinosido, la AZT, la5-azacitidina (5-AZC) y los compuestos relacionados con la 5-azacitidina, tales como la decitabina (5-aza-2'- desoxicitidina), la citarabina, la 1-beta-D-arabinofuranosil-5-azacitosina y la dihidro-5-azacitidina, la bleomicina, la actinomicina D, la mitramicina, la mitomicina C, la carmustina, la lomustina, la semustina, la estreptozotocina, la
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hidroxiurea, el cisplatino, el mitotano, la procarbazina, la dacarbazina, el taxol, la vinblastina, la vincristina, la doxorrubicina y el dibromomanitol, etc.
Los agentes adicionales que son aplicables con constructos de fusion y metodos son conocidos de la tecnica y pueden utilizarse. Por ejemplo, pueden administrate agentes biologicos, tales como anticuerpos, factores de crecimiento celular, factores de supervivencia celular, factores de diferenciacion celular, citocinas y quimiocinas. Entre los ejemplos no limitativos de anticuerpos monoclonales se incluyen el rituximab (Rituxan®), el trastuzumab (Herceptin), el bevacizumab (Avastin), el cetuximab (Erbitux), el alemtuzumab (Campath), el panitumumab (Vectibix), el ibritumomab tiuxetan (Zevalin), el tositumomab (Bexxar) etc., los cuales pueden utilizarse en combinacion con, entre otros, un constructo de fusion descrito en la presente memoria. Otros farmacos dirigidos aplicables a la utilizacion con constructos de fusion son el imatinib (Gleevec), el gefitinib (Iressa), el bortzomib (Velcade), el lapatinib (Tykerb), el sunitinib (Sutent), el sorafenib (Nevaxar), el nilotinib (Tasigna) etc. Entre los ejemplos no limitativos de factores de crecimiento celular, factores de supervivencia celular, factores de diferenciacion celular, citocinas y quimiocinas se incluyen IL-2, IL-1 a, IL-1P, IL-3, IL-6, IL-7, el factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos (FECGM), IFN-y, IL-12, FNT-a, FNT-P, MIP-1a, MIP- 1P, RANTES, SDF-1, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, eotaxina, eotaxina-2, I-309/TCA3, ATAC, HCC-1, HCC-2, HCC-3, LARC/MIP-3a, PARC, TARC, CKp, CKP6, CKP7, CKP8, CKP9, CKP11, CKP12, C10, IL-8, GROa, GROP, ENA-78, GCP-2, PBP/CTAPIIIP-TG/NAP-2, Mig, PBSF/SDF-1 y la linfotactina.
Entre los ejemplos no limitativos adicionales se incluyen los tratamientos y terapias inmunopotenciadores, que incluyen las terapias celulares. En particular, entre los tratamientos y terapias inmunopotenciadores se incluyen la administracion de linfocitos, celulas plasmaticas, macrofagos, celulas dendrfticas, celulas NK y celulas B.
Se proporcionan metodos de tratamiento de un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, metodos de tratamiento de un sujeto que requiere de tratamiento debido a que presenta o esta en riesgo de presentar un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, y metodos para incrementar la eficacia o para mejor una terapia antiproliferativa, antitumoral, anticancerosa, antineoplasia o antineoplasia maligna. Un metodo puede incluir la administracion en un sujeto que presenta o esta en riesgo de presentar un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, una cantidad del constructo de fusion suficiente para tratar el tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastastico o no metastasico; administrar en el sujeto una cantidad de un constructo de fusion suficiente para tratar el sujeto, y administrar en el sujeto que presenta o que ha presentado un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, una cantidad de un constructo de fusion suficiente para incrementar la eficacia de la terapia antiproliferativa, antitumoral, anticancerosa, antineoplasia o antineoplasia maligna.
Los metodos descritos en la presente memoria pueden ponerse en practica antes (es decir, profilacticamente), concurrentemente o despues de obtener evidencia de la presencia de proliferacion celular no deseable o aberrante o antes de iniciarse un trastorno, enfermedad o condicion hiperproliferativo (por ejemplo uno o mas sfntomas). La administracion de un constructo de fusion antes, concurrentemente o inmediatamente despues del desarrollo de un sfntoma de proliferacion celular no deseable o aberrante o un trastorno hiperproliferativo puede reducir la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de uno o mas sfntomas de la proliferacion celular no deseable o aberrante o del trastorno, enfermedad o condicion hiperproliferativo en el sujeto. Ademas, la administracion de un constructo de fusion antes, concurrentemente o inmediatamente despues del desarrollo de uno o mas sfntomas de la proliferacion celular no deseable o aberrante o del trastorno, enfermedad o condicion hiperproliferativa puede inhibir, reducir o evitar la extension o diseminacion de las celulas
hiperproliferativas (por ejemplo la metastasis) a otros sitios, regiones, tejidos u organos en el sujeto, o el
establecimiento de las celulas hiperproliferativas (por ejemplo la metastasis) en otros sitios, regiones, tejidos u organos en el sujeto.
Los constructos de fusion y los metodos descritos en la presente memoria, tales como los metodos de tratamiento, pueden proporcionar un beneficio o mejora terapeutico detectable o medible en el sujeto. Un beneficio o mejora terapeutico es cualquier beneficio medible o detectable, objetivo o subjetivo, transitorio, temporal o a mas largo plazo, para el sujeto, o la mejora de la condicion, trastorno o enfermedad, un sfntoma adverso, consecuencia o causa subyacente, de cualquier grado, en un tejido, organo, celula o poblacion celular del sujeto. Entre los beneficios y mejoras terapeuticos se incluyen, aunque sin limitacion, la reduccion o
disminucion de la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de uno o mas sfntomas o
complicaciones asociados a un trastorno, enfermedad o condicion, o una causa subyacente o efecto consiguiente del trastorno, enfermedad o condicion. Por lo tanto, los constructos de fusion y metodos descritos en la presente memoria incluyen proporcionar un efecto o mejora terapeutico en el sujeto.
En un metodo descrito en la presente memoria en el que el beneficio o mejora terapeutico es un resultado deseado, puede administrarse un constructo de fusion descrito en la presente memoria en una cantidad suficiente o eficaz en el sujeto que lo requiere. Una "cantidad suficiente" o "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad que proporciona, en una o multiples dosis, sola o en combinacion con otra u otras composiciones (agentes terapeuticos tales como un farmaco quimioterapeutico o inmunoestimulador) o agentes de tratamientos, protocolos o regfmenes terapeuticos, una respuesta detectable de cualquier duracion de tiempo (a largo o corto
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plazo), un resultado deseado o un beneficio para el sujeto de cualquier grado medible o detectable o durante cualquier duracion de tiempo (por ejemplo durante horas, dfas, meses, anos o la curacion). Las dosis o "cantidad suficiente" o "cantidad eficaz" para el tratamiento (por ejemplo para proporcionar un beneficio o mejora terapeutico) tfpicamente resultan eficaces para mejorar un trastorno, enfermedad o condicion, o uno, multiples o todos los sfntomas adversos, consecuencias o complicaciones del trastorno, enfermedad o condicion, en un grado medible, aunque reduciendo o inhibiendo la progresion o el agravamiento del trastorno, enfermedad o condicion o de un sfntoma, se considera un resultado satisfactorio.
El termino "aliviar" se refiere a cualquier mejora objetiva o subjetiva detectable en la condicion del sujeto. Una mejora detectable incluye una reduccion subjetiva u objetiva en la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de un sfntoma causado o asociado a un trastorno, enfermedad o condicion, una mejora en una causa
subyacente o una consecuencia del trastorno, enfermedad o condicion, o una reversion del trastorno,
enfermedad o condicion.
Por lo tanto, el tratamiento puede resultar en la inhibicion, reduccion o prevencion de un trastorno, enfermedad o condicion, o un sfntoma o consecuencia asociado, o causa subyacente; en la inhibicion, reduccion o prevencion de la progresion o el agravamiento de un trastorno, enfermedad, condicion, sfntoma o consecuencia, o causa subyacente, o en el deterioro adicional o incidencia de uno o mas sfntomas adicionales del trastorno,
enfermedad, condicion o sfntoma. De esta manera, un resultado de tratamiento exitoso conduce a un "efecto
terapeutico" o "beneficio" o la inhibicion, reduccion o prevencion de la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de uno o mas sfntomas o causas subyacentes o consecuencias de una condicion, trastorno, enfermedad o sfntoma en el sujeto. Por lo tanto, los metodos de tratamiento que afectan a una o mas causas subyacentes de la condicion, trastorno, enfermedad o sfntoma se consideran beneficiosos. La estabilizacion o la inhibicion de la progresion o agravamiento de un trastorno o condicion tambien es un resultado de tratamiento exitoso.
Por lo tanto, un beneficio o mejora terapeutico no es necesario que sea la eliminacion completa de algun, la mayor parte o la totalidad de los sfntomas, complicaciones, consecuencias o causas subyacentes asociadas a la condicion, trastorno o enfermedad. De esta manera, se consigue un resultado final satisfactorio en el caso de que se produzca una mejora gradual de la condicion del sujeto, o una reduccion parcial de la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion, o la inhibicion o reversion de uno o mas sfntomas, complicaciones, consecuencias o causas subyacentes adversos asociados, el agravamiento o la progresion (por ejemplo la estabilizacion de uno o mas sfntomas o complicaciones de la condicion, trastorno o enfermedad) de una o mas manifestaciones o caracterfsticas fisiologicas, bioqufmicas o celulares del trastorno o enfermedad, durante un periodo de tiempo corto o largo (horas, dfas, semanas, meses, etc.).
Un metodo de tratamiento puede resultar en la destruccion parcial o completa de un tumor, cancer, masa celular , volumen, tamano o numero de celulas maligno o neoplasico metastasico o no metastasico; resulta en la estimulacion, induccion o incremento de la necrosis, lisis o apoptosis del tumor, cancer o celula neoplasica metastasico o no metastasico; resulta en la reduccion del volumen, tamano o masa celular del tumor, cancer o afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico; resulta en la inhibicion o la prevencion de la progresion o en un incremento del volumen, masa, tamano o numero celular del tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico; resulta en la inhibicion o reduccion de la extension o diseminacion de las celulas hiperproliferantes (por ejemplo metastasis) a otros sitios (secundarios), regiones, tejidos u organos en un sujeto, o en el establecimiento de celulas hiperproliferativas (por ejemplo la metastasis) a otros sitios, regiones, tejidos u organos (secundarios) en el sujeto, o resulta en una prolongacion del periodo de vida del sujeto. Un metodo de tratamiento puede resultar ademas en la reduccion o disminucion de la gravedad, duracion o frecuencia de un sfntoma adverso o complicacion asociado o causado por un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico.
Una cantidad suficiente o una cantidad eficaz puede ser proporcionada, aunque no resulta necesario, en una unica administracion y puede, aunque no resulta necesario, administrarse sola o en combinacion con otra composicion (por ejemplo un agente quimioterapeutico o inmunopotenciador o inmunoestimulador), tratamiento, protocolo o regimen terapeutico. Por ejemplo, la cantidad puede incrementarse proporcionalmente segun indique la necesidad del sujeto, el estado del trastorno, enfermedad o condicion tratado o los efectos secundarios del tratamiento. Ademas, una cantidad suficiente o una cantidad eficaz podrfa no resultar suficiente o eficaz en el caso de que se administre en una o multiples dosis sin una segunda composicion (por ejemplo un agente quimioterapeutico o inmunoestimulador), tratamiento, protocolo o regimen terapeutico, ya que las dosis, cantidades o duraciones adicionales superiores a dichas dosis o composiciones (por ejemplo agentes quimioterapeuticos o inmunoestimuladores), tratamientos, protocolos o regfmenes terapeuticos adicionales pueden incluirse con el fin de considerarse eficaces o suficientes en un sujeto dado. Entre las cantidades consideradas suficientes se incluyen ademas las cantidades que resultan en una reduccion de la utilizacion de otro tratamiento, regimen terapeutico o protocolo.
Una cantidad suficiente o una cantidad eficaz no es necesario que resulte eficaz en todos y cada uno de los sujetos tratados profilactica o terapeuticamente ni en una mayorfa de los sujetos tratados en un grupo o
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poblacion dado. Tal como resulta tfpico para los metodos de tratamiento o terapeuticos, algunos sujetos muestran una respuesta mayor o menos a un tratamiento, regimen terapeutico o protocolo dado. Una cantidad suficiente o una cantidad eficaz se refiere a la suficiencia o eficacia en un sujeto particular, no en un grupo o en la poblacion general. Dichas cantidades dependeran en parte de la condicion tratada, tal como el tipo o estadio de la proliferacion celular no deseable o aberrante o el trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico), el efecto terapeutico deseado, asf como el sujeto individual (por ejemplo la biodisponibilidad en el sujeto, el genero, la edad, etc.).
Entre los ejemplos no limitativos particulares de beneficio o mejora terapeutica para la proliferacion celular no deseable o aberrante, tal como un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico) se incluyen una reduccion del tamano, masa o volumen celular, la inhibicion de un incremento del tamano, masa o volumen celular, un enlentecimiento o inhibicion del agravamiento o progresion, la estimulacion de la necrosis, lisis o apoptosis celular, la reduccion o inhibicion del caracter maligno o metastasis de la neoplasia o tumor, la reduccion de la mortalidad y la prolongacion de la duracion de vida del sujeto. De esta manera, la inhibicion o el retraso de un incremento del tamano, masa, volumen o metastasis celular (estabilizacion) puede incrementar la duracion de vida (reducir la mortalidad) aunque sea solo por unos cuantos dfas, semanas o meses, aunque no se haya producido la eliminacion completa del tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico. Entre los sfntomas adversos y complicaciones asociados a un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico) que pueden reducirse o disminuirse se incluyen, por ejemplo, el dolor, las nauseas, la incomodidad, la falta de apetito, la apatfa y la debilidad. Por lo tanto, una reduccion de la incidencia, frecuencia, gravedad, progresion o duracion de un sfntoma de proliferacion celular no deseable o aberrante, tal como un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico), tal como una mejora en la sensacion subjetiva (por ejemplo un mayor nivel de energfa, apetito, menores nauseas, movilidad mejorada o bienestar psicologico, etc.), son todos ejemplos de beneficio o mejora terapeutica.
Por ejemplo, una cantidad suficiente o eficaz de un constructo de fusion se considera que presenta un efecto terapeutico en el caso de que la administracion resulte en una menor necesidad de farmaco quimioterapeutico, radiacion o inmunoterapia para el tratamiento de la proliferacion celular no deseable o aberrante, tal como un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico).
El termino "sujeto" se refiere a animales, tfpicamente a animales mamfferos, tales como seres humanos, primates no humanos (simios, gibones, chimpances, orangutanes y macacos), animales domesticos (perros y gatos), animales de granja (caballos, vacas, cabras, ovejas y cerdos) y animales experimentales (ratones, ratas, conejos y cobayas). Entre los sujetos se incluyen modelos animales de enfermedad, por ejemplo modelos animales de proliferacion celular no deseable o aberrante, tal como un trastorno hiperproliferativo (por ejemplo un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico) para el analisis de los constructos de fusion in vivo.
Entre los sujetos apropiados para el tratamiento se incluyen los que presentan o estan en riesgo de presentar un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, los sujetos que se encuentran bajo terapia antiproliferativa (por ejemplo para tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico), asf como los que ya han sido sometidos, incluyendo sujetos en los que el tumor se encuentra en remision. Los sujetos "en riesgo" tfpicamente presentan factores de riesgo asociados a una proliferacion celular no deseable o aberrante, el desarrollo de hiperplasia (por ejemplo un tumor).
Entre los ejemplos particulares de sujetos en riesgo o de sujetos candidatos se incluyen aquellos con celulas que expresan un receptor, ligando, antfgeno o anticuerpo al que se puede unir un constructo de fusion, en particular en el que las celulas que son diana para necrosis, lisis, eliminacion o destruccion expresan un numero o cantidades mayores de receptor, ligando, antfgeno o anticuerpo que las celulas no diana. Dichas celulas pueden ser dianas selectivas o preferentes para la necrosis, lisis o eliminacion.
Entre los sujetos en riesgo se incluyen ademas los que son candidatos y los que han sido sometidos a reseccion quirurgica, quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia ionizante o qufmica, terapia termica (hipertermia) local o regional, o vacunacion. Por lo tanto, la exposicion es aplicable al tratamiento de un sujeto que esta en riesgo de un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico o una complicacion asociada a un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, por ejemplo debido a la reaparicion o nuevo crecimiento de un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico despues de un periodo de estabilidad o remision.
Entre los factores de riesgo se incluyen genero, estilo de vida (dieta, tabaquismo), ocupacion (personal medico y clfnico, trabajadores agrfcolas y ganaderos), factores medioambientales (exposicion a carcinogenos), historia familiar (trastornos autoinmunitarios, diabetes, etc.), predisposicion genetica, etc. Por ejemplo, entre los sujetos en riesgo de desarrollar melanoma se incluyen el exceso de exposicion solar (radiacion ultravioleta), la piel clara,
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el numero elevado de nevus (nevus displasico), el fenotipo del paciente, la historia familiar o una historia de un melanoma anterior. Por lo tanto, los sujetos en riesgo de desarrollar cancer pueden identificarse a partir del estilo de vida, la ocupacion, los factores medioambientales, la historia familiar y los cribados geneticos para genes asociados a tumor, eliminaciones genicas o mutaciones genicas. Los sujetos en riesgo de desarrollar cancer de mama no presentan Brcal, por ejemplo. Los sujetos en riesgo de desarrollar cancer de colon presentan formacion de polipos a edad temprana o con frecuencia elevada, o genes supresores tumorales eliminados o mutados, tal como el gen poliposis adenomatosa coli (APC), por ejemplo.
Entre los sujetos se incluyen ademas los excluidos de otros tratamientos. Por ejemplo, determinados sujetos podrfan no ser buenos candidatos para la reseccion quirurgica, la quimioterapia, la inmunoterapia, la radioterapia ionizante o qufmica, la terapia termica (hipertermia) local o regional, o la vacunacion. De esta manera, entre los sujetos candidatos para el tratamiento tal como se indica en la presente memoria se incluyen los que no son candidatos a reseccion quirurgica, quimioterapia, inmunoterapia, radioterapia ionizante o qufmica, terapia termica (hipertermia) local o regional, o vacunacion.
Los constructos de fusion pueden formularse en una forma de dosis unitaria o forma de administracion unitaria. Un constructo de fusion puede encontrarse en una cantidad eficaz para tratar un sujeto que presenta una proliferacion celular no deseable o aberrante o un trastorno hiperproliferativo. Un constructo de fusion puede encontrarse en una cantidad eficaz para tratar un sujeto que presenta un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico. Un constructo de fusion puede encontrarse en una cantidad eficaz para reducir la fertilidad en el sujeto. Las dosis unitarias ejemplificativas son de aproximadamente 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 o 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000 o 5.000 a 50.000 ng, y de aproximadamente 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 o 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000 o 5.000 a 50.000 pg.
Las composiciones y metodos indicados en la presente memoria pueden ponerse en contacto o proporcionarse in vitro, ex vivo o in vivo. Las composiciones pueden administrarse para proporcionar el efecto deseado en forma de una sola o multiples dosis, por ejemplo en una cantidad eficaz o suficiente. Las dosis ejemplificativas son de aproximadamente 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 o 2.500 a 5.000, 5.000 a 25.000 pg/kg o de aproximadamente 50 a 500, 500 a 5.000, 5.000 a 25.000 o 25.000 a 50.000 ng/kg, y de aproximadamente 25 a 250, 250 a 500, 500 a 1.000, 1.000 a 2.500 o 2.500 a 5000, 5.000 a 25.000, 5.000 a 50.000 pg/kg, en dfas consecutivos, o en dfas alternativos o intermitentemente. Puede administrarse una sola o multiples dosis en dfas consecutivos, en dfas alternativos o intermitentemente.
Las composiciones pueden administrarse, y los metodos ponerse en practica, mediante la administracion sistemica, regional o local, por cualquier via. Por ejemplo, un constructo de fusion puede administrarse sistemica, regional o localmente, por via intravenosa, oral (por ejemplo mediante ingestion o inhalacion), intramuscular, intraperitoneal, intradermica, subcutanea, intracavitaria, intracraneal, transdermica (topica), parenteral, por ejemplo transmucosal o rectalmente. Las composiciones y metodos indicados en la presente memoria, incluyendo las formulaciones farmaceuticas, pueden administrarse mediante un sistema de administracion (micro)encapsulado o empaquetarse en un implante para la administracion.
En la presente memoria se proporcionan ademas constructos de fusion y metodos en los que los constructos de fusion se incluyen en composiciones farmaceuticas. Una composicion farmaceutica se refiere a portadores, diluyentes o excipientes "farmaceuticamente aceptables" y "fisiologicamente aceptables". Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "farmaceuticamente aceptable" y "fisiologicamente aceptable" en referencia a portadores, diluyentes o excipientes incluye solventes (acuosos o no acuosos), detergentes, soluciones, emulsiones, medios de dispersion, recubrimientos, agentes isotonicos y promotores o retardantes de la absorcion, compatibles con la administracion farmaceutica y con los demas componentes de la formulacion. Dichas formulaciones pueden encontrarse contenidas en un comprimido (recubierto o no), capsula (dura o blanda), microperla, emulsion, polvos, granulos, cristales, suspension, jarabe o elixir.
Las composiciones farmaceuticas pueden formularse para ser compatibles con una via de administracion en particular. Las composiciones para la administracion parenteral, intradermica o subcutanea pueden incluir un diluyente esteril, tal como agua, solucion salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sinteticos. La preparacion puede contener uno o mas conservantes para impedir el crecimiento de microorganismos (por ejemplo agentes antibacterianos tales como el alcohol bencflico o los metilparabenos; antioxidantes, tales como el acido ascorbico o el bisulfito sodico; agentes quelantes, tales como el acido etilen- diamina-tetraacetico; tampones, tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de la tonicidad, tal como cloruro sodico o dextrosa).
Entre las composiciones farmaceuticas para la inyeccion se incluyen soluciones acuosas (en caso de ser solubles en agua) y dispersiones esteriles, y polvos esteriles para la preparacion extemporanea de soluciones o dispersiones inyectables esteriles. Para la administracion intravenosa, entre los portadores adecuados se incluyen solucion salina fisiologica, agua bacteriostatica, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) o solucion salina tamponada con fosfato (SSTF). El portador puede ser un solvente o medio de dispersion que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo glicerol, propilenglicol y polietilenglicol) y mezclas adecuadas de los
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mismos. La fluidez puede mantenerse, por ejemplo mediante la utilizacion de un recubrimiento, tal como lecitina, o mediante la utilizacion de surfactantes. Entre los agentes antibacterianos y antifungicos se incluyen, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, acido ascorbico y timerosal. La inclusion de un agente que retrasa la absorcion, por ejemplo monoestearato de aluminio y gelatina, puede prolongar la absorcion de las composiciones inyectables.
Se conocen de la tecnica formulaciones y sistemas de administracion farmaceuticos adicionales y son aplicables en los metodos indicados en la presente memoria (ver, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990, 18a ed., Mack Publishing Co., Easton, PA; The Merck Index, 1996, 12a ed., Merck Publishing Group, Whitehouse, NJ; Pharmaceutical Principles of Solid Dosage Forms, Technonic Publishing Co., Inc., Lancaster, Pa., 1993, y Poznansky, et al., Drug Delivery Systems, R. L. Juliano, ed., Oxford, N.Y. 1980, paginas 253 a 315).
En la presente memoria se proporcionan ademas kits que incluyen constructos de fusion indicados en la presente memoria, composiciones de combinacion y formulaciones farmaceuticas de los mismos, empaquetados en material de envasado adecuado. Un kit opcionalmente incluye una etiqueta o un prospecto en el envase que incluye una descripcion de los componentes o instrucciones para la utilizacion in vitro, in vivo o ex vivo, de los componentes en el mismo. Entre las instrucciones ejemplificativas se incluyen instrucciones para reducir o inhibir la proliferacion celular, para reducir o inhibir la proliferacion de celulas no deseables o aberrantes, tal como una celula hiperproliferante, para reducir o inhibir la proliferacion de un tumor metastasico o no metastasico, cancer, celula maligna o neoplasica, para tratar un sujeto que presenta un trastorno hiperproliferativo, para tratar un sujeto que presenta un tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasico o no metastasico, o para reducir la fertilidad de un animal.
Un kit puede contener una coleccion de dichos componentes, por ejemplo dos o mas constructos de fusion solos o en combinacion con otra composicion terapeuticamente util (por ejemplo un farmaco antiproliferativo o inmunopotenciador).
La expresion "material de envasado" se refiere a una estructura ffsica que aloja los componentes del kit. El material de envasado puede mantener la esterilidad de los componentes y puede realizarse en un material utilizado comunmente para dichos fines (por ejemplo papel, fibra corrugada, vidrio, plastico, hoja de aluminio, ampollas, viales, tubos, etc.).
Los kits indicados en la presente memoria pueden incluir etiquetas o prospectos. Las etiquetas o prospectos incluyen "material impreso", por ejemplo papel o carton, o separado o fijo a un componente, un kit o material de envasado (por ejemplo una caja) o fijo a una ampolla, tubo o vial que contiene un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir adicionalmente un medio legible por ordenador, tal como un disco (por ejemplo un disquete, disco duro o disco ZIP), un disco optico tal como CD- o DVD-ROM/RAM, DVD, MP3, cinta magnetica o un medio de almacenamiento electrico, tal como RAM y ROM o hfbridos de los mismos, tal como medio de almacenamiento magnetico/optico, medio FLASH o tarjetas tipo memoria.
Las etiquetas o prospectos pueden incluir informacion identificativa de uno o mas componentes en los mismos, cantidades de las dosis, farmacologfa clfnica del principio o principios activos, incluyendo el mecanismo de accion, la farmacocinetica y la farmacodinamica. Las etiquetas o prospectos pueden incluir informacion identificativa del fabricante, numeros de lote, ubicacion del fabricante y fecha.
Las etiquetas o prospectos pueden incluir informacion sobre una condicion, trastorno, enfermedad o sfntoma para el que puede utilizarse un componente del kit. Las etiquetas o prospectos pueden incluir instrucciones para el profesional clfnico o para un sujeto, a fin de que utilice uno o mas de los componentes del kit en un metodo, protocolo de tratamiento o regimen terapeutico. Las instrucciones pueden incluir cantidades de dosis, frecuencias o duraciones, e instrucciones para la puesta en practica de los metodos, protocolos de tratamiento o regfmenes terapeuticos indicados en la presente memoria. Entre las instrucciones ejemplificativas se incluyen instrucciones para el tratamiento de una proliferacion celular no deseable o aberrante, celulas y trastornos hiperproliferativos (por ejemplo tumor, cancer, afeccion maligna o neoplasia metastasica o no metastasica). Por lo tanto, los kits indicados en la presente memoria pueden incluir adicionalmente etiquetas o instrucciones para la practica de cualquiera de los metodos tambien descritos en la presente memoria, incluyendo los metodos de tratamiento.
Las etiquetas o prospectos pueden incluir informacion sobre cualquier beneficio que pueda proporcionar un componente, tal como un beneficio profilactico o terapeutico. Las etiquetas o prospectos pueden incluir informacion sobre potenciales efectos secundarios adversos, tales como advertencias para el sujeto o profesional clfnico respecto a situaciones en las que no resultana apropiada la utilizacion de una composicion particular. Tambien podrfan producirse efectos secundarios adversos en el caso de que el sujeto haya utilizado, utilice en el futuro o este utilizando actualmente una o mas medicaciones que podrfan resultar incompatibles con la composicion, o en el caso de que el sujeto haya sido sometido, se someta en el futuro o actualmente se encuentre sometido a otro protocolo de tratamiento o regimen terapeutico que resulte incompatible con la composicion y, por lo tanto, las instrucciones podrfan incluir informacion sobre dichas incompatibilidades.
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Los kits indicados en la presente memoria pueden incluir adicionalmente otros componentes. Cada componente del kit puede encerrarse dentro de un envase individual y la totalidad de los diversos envases pueden encontrarse dentro de un unico embalaje. Los kits indicados en la presente memoria pueden disenarse para el almacenamiento en trio. Los kits indicados en la presente memoria pueden disenarse ademas para contener celulas huesped que expresan los constructos de fusion indicados en la presente memoria o que contienen acidos nucleicos coditicantes de los constructos de fusion. Las celulas en el kit pueden mantenerse bajo condiciones de almacenamiento apropiadas hasta que las celulas esten listas para ser utilizadas. Por ejemplo, un kit que incluye una o mas celulas puede contener un medio de almacenamiento celular apropiado de manera que las celulas puedan descongelarse y cultivarse.
Tal como se utilizan en la presente memoria, las formas singulares "un", "una", "el" o "la" incluyen los reterentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, la reterencia a "un constructo de fusion" o un "dominio lftico" incluye una pluralidad de dichos constructos de fusion o dominios lfticos, etc.
Tal como se utilizan en la presente memoria, los valores numericos o intervalos numericos incluyen los numeros enteros dentro de dichos intervalos y las fracciones de los valores de los numeros enteros en los intervalos a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De esta manera, por ejemplo, la referenda a un intervalo 90-100%, incluye 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 97%, etc., asf como 91,1%, 91,2%, 91,3%, 91,4%, 91,5%, etc., 92,1%, 92,2%, 92,3%, 92,4%, 92,5%, etc.
Los ejemplos siguientes estan destinados a ilustrar el alcance de la invencion segun las reivindicaciones
Ejemplos
Ejemplo 1
Los estudios iniciales inclufan el cribado in vitro de 28 peptidos de dominio lftico que contenfan diferentes secuencias de bisagra entre la fraccion peptido lftico y los ligandos, que contenfan 30% de D-aminoacidos (enantiomeros D), que presentaban una longitud de 18 y 15 aminoacidos para la fraccion peptido lftico y contenfan una secuencia bisagra o sus enantiomeros D. Se estudio la introduccion de acido a-aminocaproico como espaciador en analogos Phor21 de los aminoacidos 21, 18 y 15. Los ligandos seleccionados para el estudio inclufan pGC-ala, un fragmento de 15 aminoacidos de la fraccion de union de la cadena beta de la gonadotropina corionica y HLHL, un decapeptido que representa un ligando totalmente funcional.
Ejemplo 2
El presente ejemplo describe el cribado para toxicidad celular (IC50) y actividad hemolftica que utiliza una lfnea celular humana de cancer de mama.
Se estudiaron dieciocho constructos de fusion conjugados con pGC-ala y ocho con HLHL y se compararon con Phor21-pGC-ala y con Phor21 y Phor18 no conjugados (338913)=peptidos CLIP71. La lfnea celular humana de cancer de mama MDA-MB-435S.luc, que sobreexpresa los receptores de la gonadotropina corionica (GC) y de la hormona liberadora de hormona lutenizante (HLHL) se utilizaron para el cribado en los pases 248 a 252. La lfnea celular MDA-MB-435S.luc se construyo a partir de la lfnea celular MDA-MB-435S, obtenida de la American Type Cell Culture Collection mediante transfeccion estable por lipofeccion con el plasmido PRC/CMV-luc que contenfa el gen de luciferasa de Photinus pyralis y un gen de resistencia a antibioticos. La lfnea celular establemente transfectada se selecciono con G418 y los clones con el nivel de expresion mas alto del gen luciferasa se sometieron a ensayo para la expresion de receptor de HL y HLHL.
Las celulas MDA-MB-435S.luc se cultivaron en medio L15 de Leibovitz, suero de feto bovino al 10%, 0,01 mg/ml de insulina bovina, 100 lU/ml de penicilina y 100 pg/ml de estreptomicina. Las celulas se cultivaron en matraces de cierre hermetico. Las incubaciones se llevaron a cabo utilizando placas de 96 pocillos a razon de 10.000 celulas en cada pocillo. Las celulas se sembraron tfpicamente en placas de 96 pocillos y se sustituyo el medio tras 48 horas de incubacion. Cada ensayo se llevo a cabo a concentraciones crecientes, dosis de 0, 0,001, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 y 100 micromolar de conjugado de dominio de union a peptido lftico. Cada conjugado de dominio de union a peptido lftico proporcionado en forma liofilizada se disolvio fresco en solucion salina y se anadio a las celulas. La duracion de la incubacion tfpicamente fue de 24 h y los ensayos de viabilidad celular se llevaron a cabo utilizando ensayos de conversion a formazan (ensayo MTT). Los controles contenfan solucion salina o Triton al 0,1% como referenda para 0% y 100% de muerte celular, respectivamente.
Se procesaron los datos y se analizaron utilizando el software Graph Pad Prizm 4™ (Graph Pad Prizm, Inc). Se determino el analisis estadfstico para la significancia mediante una prueba t de Student de dos colas. Se llevo a cabo cada estudio hasta alcanzar una N de por lo menos 8.
Se constato el efecto de incrementar la longitud del constructo de fusion (Javadpour et al., J. Med. Chem. 39:3107, 1996, Javadpour y Barkeley, Biochemistry 36:9540, 1997; Leuschner y Hansel, Current Pharmaceutical
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Design 10:2299, 2004, y Leuschner y Hansel, Biol. Reprod. 73:255, 2005). Los peptidos liticos conjugados en el extremo C-terminal con pGC-ala mostraron una toxicidad creciente a mayor longitud del constructo. Las IC50 de peptidos de diversa longitud: 14 aminoacidos (Phor14): 5,74; 15 aminoacidos (Phor15): 1,92; 18 aminoacidos (Phor18=CLIP71): 1,09; 21 aminoacidos (Phor21) 2,31 y 28 aminoacidos (Phor28): 1,36 pM (Tabla 3).
Se determino el efecto de la posicion de la fraccion de union (N- o C-terminal). Brevemente, se estudiaron los constructos de fusion Phor21-pGC-ala (extremo C-terminal), pGC-ala Phor21 (extremo N-terminal), HLHL- Phor21 (extremo N-terminal) y Phor21-HLHL (extremo C-terminal). Las IC50 de los peptidos: Phor21-pGC-ala: 2,3 pM, para pGC-ala-Phor21: 4,7 pM, para HLHL-Phor21: 2,65 pM, y para Phor21-HLHL: 1,71 pM. Los datos demuestran que la posicion C-terminal de las fracciones de union pGC-ala y HLHL muestra una mayor toxicidad que el caso en que la fraccion de union se situa en el extremo N-terminal.
El receptor de HLHL se encuentra presente en muchos canceres humanos (ver la Tabla 1). Se comparo la actividad de HLHL como fraccion de union con la de pGC-ala como fraccion de union.
Se compararon las toxicidades de HLHL-Phor21 y Phor21-pGC-ala en celulas humanas de cancer de mama MDA-MB-435S.luc in vitro tras 2 o 24 horas de incubacion. Los datos indican que HLHL-Phor21 elimino las celulas mas rapidamente que Phor21-pGC-ala, induciendo HLHL-Phor21 la eliminacion celular dentro de las primeras 2 horas (figura 1).
Tabla 1: receptores de HL y de HLHL en canceres humanos
Tipo de cancer
Receptores de LH Receptores de HLHL
Mama
72% 52%
Prostata
100% 86%
Ovarico
40% 80%
Endometrial
17% 80 %
Pancreatico
N.D. 68%
Pulmon
Si N.D.
Melanoma
68% Si
Cerebro
N.D. Si
Colon
N.D. Si
Oral
N.D. Si
La introduccion de secuencias de bisagra, espaciador o conector entre el dominio lftico y la fraccion de union resulto en peptidos con mayor potencia que Phor21-pGC-ala para la eliminacion celular (Figura 2, Tabla 2). Mientras que la introduccion de las secuencias de bisagra o espaciadores en el constructo de fusion Phor21- pGC-ala no modifico la actividad de eliminacion celular, el efecto de ASAAS como secuencia de bisagra incremento significativamente la toxicidad de los peptidos liticos con 15 aminoacidos del conjugado de pGC; este efecto no se observo en el caso del peptido Phor18-HLHL conjugado con pGC-ala y HLHL y Phor18-ASAAS- HLHL, que resultaron igualmente eficaces in vitro (Tabla 2, figura 2). Se observo un efecto similar al sustituir la secuencia de bisagra por un espaciador de 6 carbonos, el acido alfa-amino-caproico (Tabla 2). La sustitucion de alanina por glicina en la segunda secuencia de bisagra (GSGGS) resulto en una actividad significativamente inferior, sugiriendo que la glicina podria haber presentado un efecto desestabilizador de la helice (figura 2, Tabla 2).
Tabla 2: efecto de la longitud del peptido de los peptidos conjugados con pGC-ala
Peptido
Ninguno [IC50 pM] GSGGS [IC50 pM] ASAAS [IC50 pM] Acido aminocaproico [IC50 pM]
Phor21
2,3 3,27 2,77 2,75
Phor18
1,09* 2,32 2,07 NA
Phor15
1,92 2,96 1,48* 1,31*
Phor14
6,72 NA NA NA
Peptidos conjugados con HLHL
Peptido
Ninguno [IC50 pM] ASAAS [IC50 pM]
Phor21,
1,31 NA
Phor18
0,87 0,89
Para determinar el efecto de las sustituciones de D-aminoacidos, se sintetizo el constructo de fusion Phor21- pGC-ala en forma de enantiomero D (en lo sucesivo en la presente memoria denominado D-Ala-Phor21-pGC- ala). Dicho constructo de fusion mostraba una toxicidad comparable para las celulas de cancer de mama MDA- MB-435S.luc in vitro (Phor21-pGC-ala 2.31 pM, D-ala-Phor21-pGC-ala 2,15 pM (Tabla 3); D-ala-Phor18-pGC-ala era 1,4 veces mas potente que Phor21-pGC-ala (IC50 1,6 pM), la contrapartida con HLHL era significativamente
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mas potente que el enantiomero D (Phor21-HLHL (IC5ode 1,31 pM) comparado con D-ala-Phor21-HLHL, con una IC50 de 0,75 pM, D-Phor18-HLHL con una IC50 de 1,42 pM y Phor18-Lupron con una IC50 de 1,95 pM.
Los valores de IC50 para pGC-ala y peptidos lfticos conjugados con HLHL en celulas de cancer de mama MDA- MB-435S.luc se resumen en la Tabla 3 y en la figura 3. Brevemente, los peptidos con IC50 significativamente inferior que Phor21-pGC-ala (2,31±0,16) eran: Phor28-pGC-ala (1,36 ±0,09 pM; p<0,0001), Phor15-ASAAS- pGC-ala (1,48±0,24 pM; p<0,005), Phor15-C6-pGC-ala (1,31 ±0,17 pM; p<0,004) (C6=6 acido aminocaproico), Phor18-pGC-ala (1,09±0,17 pM; p<0,0001), Phor21-HLHL (1,31±0,1 pM; p<0,0001), D-ala-Phor21-HLHL (0,75±0,1 pM; p<0,0001), Phor18-ASAAS-HLHL (0,88±0,12 pM; p<0,0001), Phor18-HLHL (0,87±0,11 pM; p<0,0001), (KKKFAFA)3-HLHL (0,78±0,21 pM; p<0,0004) y D-ala-Phor18-HLHL (1,42±0,08 pM; p<0,004).
Los constructos de fusion de HLHL eran en general mas potentes (mas toxicos y de accion mas rapida, figura 1) que los constructos de fusion pGC-ala. Brevemente, Phor21-HLHL, D-ala-Phor21-HLHL, Phor18-ASAAS-HLHL, Phor18-HLHL y el peptido de control 338614 ((KKKFAFA)3=peptido inactivo) eran significativamente mas toxicos para las celulas humanas de cancer de mama que Phor21-pGC-ala (p<0,003). Todos los constructos de fusion de HLHL eran aproximadamente igual de eficaces, excepto HLHL-Phor21, que era significativamente menos potente al situar la fraccion de union en el lado C-terminal de la parte lftica. D-ala-Phor18-HLHL era igualmente eficaz que Phor21-HLHL; Phor18-Lupron era menos toxico, pero comparable a Phor21-pGC-ala (figura 4, Tabla 3; Lupron es QHWSY(D-Leu)LRPNEt).
Los constructos de fusion presentaban valores de IC50 significativamente inferiores que Phor21-HLHL (1,34±0,1 pM) eran: D-ala-Phor21-HLHL (0,75±0,12 pM; p< 0,002), Phor18-ASAAS-HLHL (0,88±0,11 pM; p<0,0001), Phor18-HLHL (0,87±0,12 pM; p<0,004) y (KKKFAFA)3-HLHL (0,78±0,21 pM; p<0,04). Al comparar los mismos constructos de fusion con las fracciones de union pGC-ala y HLHL, en todos los casos los constructos de fusion de HLHL eran significativamente mas toxicos que sus contrapartidas con pGC-ala.
Tabla 3: peptidos citolfticos y conjugados de peptidos - resumen de caracterfsticas de IC^n y HA^n en celulas MDA-MB-435S.luc
ID de peptido
Descripcion Contenido de peptido [%1 IC50 [pM] HA50 [pM] IC50/HA50
337464
Phor14-pGC-ala 84,9 6,74±1,7** * 1203±586 0,005
323033
Phor21-pGC-ala 85,3 2,31±0,16 73,44±6,9 0,03
337465
Phor28-pGC-ala 85,1 1,36±0,09* **
337466
Phor21-GSGGS-pGC-ala 84,6 3,27±0,45 153,6±2,5 0,02
337467
Phor18-GSGGS-pGC-ala 87,6 2,32±0,44 723,6±219 0,003
337468
Phor15-GSGGS-pGC-ala 85,7 2,6±0,43
337469
Phor21-ASAAS-pGC-ala 83,5 2,77±0,18 72±8,9 0,037
337470
Phor18-ASAAS-pGC-ala 86,6 2,07±0,2 578±241 0,0036
337471
Phor15-ASAAS-pGC-ala 86,2 1,48±0,24* * 421±110 0,0035
337472
Phor21-C6-pGC-ala 85 2,25±0,3
337473
Phor18-C6-pGC-ala 84,3 3,9±0,9
337474
Phor15-C6-pGC-ala 87,5 1,31 ±0,17*** No lftico 0
323033
Phor21-pGC-ala 85,3 2,31±0,16
337476
Phor18-pGC-ala 84,1. 1,09±0,17* ** 169,8±24 0,006
337477
Phor15-pGC-ala 85,9 1,92±0,43
337478
pGC-ala-Phor21 84 4,75±1,1
337479
HLHL-Phor21 87,3 2,65±0,12 33±3,6 0,08
337480
Phor21-HLHL 82,4 1,31 ±0,1 ** * 25±4.3 0,07
337481
(D Ala)-Phor21-pGC-ala 82,7 2,15±0,26 No lftico 0
338982
Phor21, 77,9 1,5±0,2 N=8 No lftico 0
338983
Phor18 75,3 2,06±0,5 N=16 No lftico 0
338984
(KKKFAFA)3-pGC-ala 83,8 4,4±2,0 N=29 No lftico 0
338611
(D Ala)-Phor21-HLHL 85,1 0,75±0,1 N=8** 672,9±155 0,001
338612
Phor18-ASAAS-HLHL 78,9 0,88±0,12 N=36*** 410,1±42 0,002
338613
Phor18-HLHL 81,4 0,87±0,11 N=17** 297,9±35 0,003
338614
(KKKFAFA)3-HLHL 81,4 0,78±0,21 N=12*** 95,7±46,7 0,008
337476
Phor18-pGC-ala V04099X1 84,2 1,22±0,16 N=16*** 169,8±24 0,006
339385
D-ala-Phor18-HLHL 65,5 1,42±0,08 No lftico 0
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N=8***
339347
Phor18-Lupron 83,2 1,95±0,1 N=8 21±1,2 0,09
Significancia en comparacion con Phor21-pGC-ala (323033) *** p<0,0005
, ** p<0,005, * p<0,05
Se estudiaron las actividades hemolfticas agudas de 21 constructos de fusion, entre ellos Phor18-Lupron y D-ala- Phor18-HLHL. Se resumen los resultados en las figuras 5 y 6 y en la Tabla 3.
Se determino la actividad hemolftica en placas de 96 pocillos utilizando una dilucion seriada de peptidos expuestos a 0,5% de globulos rojos humanos. Los controles eran solucion salina (ninguna muerte de GR) o Triton X100 al 0,1% (100% de lisis de GR). Las concentraciones de peptidos se encontraban comprendidas entre 0 y 100 pM. Las incubaciones se llevaron a cabo durante 2 h.
Para determinar la IC50 de diversos constructos de fusion de diferentes lfneas celulares humanas de cancer en comparacion con el cisplatino, se evaluaron las IC50 de los constructos de fusion tal como en la Tabla 3. Se muestran los resultados a continuacion.
Valores de IC5n TuMI en lfneas celulares humanas de cancer en comparacion con el cisplatino
Lfnea celular
Cisplatino Phor18-HLHL D-ala-Phor18- HLHL Phor18-pGC D-ala- Phor18pGC-ala
MDA-MB- 435S.luc
no determinado 0,86±0,16 1,42±0,08 1,35±0,15 1,6±0,16
MDA-MB-231
HCT 5,5±1,2 33,7±6,7 6,1±0,6 20,5±7,2
AN3-CA,
11,85±0,16 3,8±0,08 40,6±0,15 22,15±0,16 36,8±0,16
OVCAR-3,
184±0,16 3±0.5 13,8±0,3 8,8±0,4 11,6±0,3
SKOV-3,
321±10 11,8±0,3 19,2±0,2 10,9±0,6 18,9±0,4
LNCaP
19,9±1,4 1,55±0,08 5,0±0,15 10,05±0,16 15,5±0,16
Lfneas celulares de cancer de mama: MDA-MB-435S.luc, MDA-MB-231 Lfneas celulares de cancer ovarico: OVCAR-3, SKOV-3 Lfnea celular de cancer de prostata: LNCaP Lfnea celular de cancer endometrial: AN3-CA
Los datos en general indican actividades hemolfticas muy bajas para los constructos de fusion estudiados, excepto para Phor21-HLHL, HLHL-Phor21 y Phor18-Lupron. Bajo condiciones similares, los constructos de fusion siguientes no mostraban ninguna actividad hemolftica (ver la figura 5): Phor15-acido aminocaproico-p-CG- ala (337474), D-ala-Phor21 p-CG-ala (337481) > 150,000 pM, Phor21, Phor 18 no conjugado = CLIP71, (KKKFAFA)3-pGC-ala, Phor 21 (338982), Phor18 = CLIP71 (338983), D-ala-Phor18-HLHL (339385) y (KKKFAFA)3-HLHL (338984). Los enantiomeros D-aminoacidos no presentaban actividad hemolftica medible.
Los constructos de fusion con actividades hemolfticas <50 pM eran los siguientes: Phor21-HLHL (25 pM), HLHL- Phor21 (33 pM) y Phor18-Lupron (21 pM).
Los constructos de fusion con actividades >100 pM eran los siguientes: Phor18-p-CG-ala (337476) y Phor18- HLHL (338613).
Los constructos de fusion con actividades hemolfticas de 50 a 100 pM eran los siguientes: (KKKFAFA)3-HLHL (95 pM), Phor21-pGC-ala y Phor21-ASAAS-pGC-ala presentaban una HA50 similar de 70 pM.
Los constructos de fusion con actividades hemolfticas de 400 a 1.300 pM eran los siguientes: Phor14-pGC-ala (337464), Phor18 GSGGS p-CG-ala (337467), Phor18 ASAAS p-CG-ala, (337470), Phor15 ASAAS p-CG-ala (337471), D-ala-Phor21-HLHL (338611) y Phor18-ASAAS-HLHL (338612).
Un criterio clfnicamente significativo es la proporcion entre la toxicidad celular (IC50) y la actividad hemolftica (HA50), es decir IC50/HA50 (figura 6, Tabla 3). Se llevaron a cabo estudios in vivo utilizando un constructo de fusion a una concentracion maxima de 10 pM que es varios factores inferior a los valores de HA50 medidos para la mayorfa de constructos de fusion.
Los conjugados de HLHL con D-ala-Phor21, Phor18-ASAAS D-ala-Phor18 y Phor18 presentaban proporciones IC50/HA50 muy bajas, de entre 0,001 y 0,006 (comparar con Phor21-pGC-ala, 0,03). La toxicidad para las celulas MDA-MB-435S.luc era significativamente mas elevada en comparacion con Phor21-pGC-ala: D-ala)Phor21- HLHL es 3 veces mas toxico que Phor21-pGC-ala, y Phor18-HLHL y Phor18-ASAAS-LHR eran 2 veces mas potentes, D-ala-Phor18-HLHL era 1,5 veces mas potente (figura 6).
En resumen, los constructos de fusion evaluados mediante criterios de toxicidad incrementada y menor actividad hemolftica (proporcion IC50/HA50) serfan: Phor18-pGC-ala, Phor18-ASAAS-pGC-ala, Phor15-ASAAS-pGC-ala,
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Phorl 5-C6-pGC-ala, D-ala-Phor21-HLHL, Phor18-HLHL, Phorl 8-ASAAS-HLHL y D-ala-Phor18-HLHL.
Ejemplo 3
El presente ejemplo describe estudios in vivo en un modelo de xenoinjerto de raton del cancer de mama con diversos tipos y dosis de constructos de fusion de pGC y HLHL.
En ratones Nu/Nu hembra se inyecto por via subcutanea una suspension de MDA-MB-435S.luc/Matrigel HC 6 (1x10 celulas). Se muestra el programa de tratamiento en la figura 7. Brevemente, el tratamiento se inicio el dfa 13 despues de la inyeccion de celulas tumorales y se continuo los dfas 19 y 25. Los tratamientos fueron: control de solucion salina, Phor21 (5 mg/kg), Phor18 (5 mg/kg), (KKKFAFA)3 peptido-pGC-ala (5 mg/kg), Phor21-pGC- ala (0,01, 1 y 5 mg/kg), Phor18-pGC-ala (0,01, 1 y 5 mg/kg), D-ala-Phor21-pGC-ala (0,01 y 5 mg/kg), lfnea base de 8 a 12 ratones por grupo, 14 grupos. Las dosis para las inyecciones semanales fueron de 5, 1 y 0,01 mg/kg de peso corporal, dada una inyeccion unica de bolo.
Todos los grupos de ratones toleraron bien las inyecciones. Unicamente un raton murio en cada inyeccion, 337476 a la dosis de 5 mg/kg. La muerte era un suceso agudo. Sobrevivieron todos los ratones en otros grupos de tratamiento. Ningun raton murio como consecuencia de la inyeccion mas de 10 minutos despues de la misma.
En la figura 8 se ilustra el efecto de las inyecciones de peptido citolftico sobre los tumores primarios. Brevemente, las figuras 8A-8C muestran el volumen tumoral durante el curso del estudio para cada peptido individual. Las figuras 8D-8G muestran las caracterfsticas del tumor en el momento de la necropsia: volumen tumoral (D), peso tumoral (E), celulas tumorales vivas (F) y condiciones tumorales (G).
Se calculo la eficacia del tratamiento como la diferencia entre las mediciones al inicio del tratamiento y la medicion al final del estudio (figura 8H-8I). La figura 8J muestra el peso corporal de los ratones en el momento de la necropsia. Se determino la viabilidad de las celulas en los tumores al final del estudio al medir los tumores para la actividad de luciferasa.
El volumen tumoral se redujo significativamente en todos los animales tratados con peptidos que contenfan pGC como ligando (II A), p<0,05 en comparacion con la lfnea base (excepto para 323033) a una concentracion de 0,01 mg/kg y (KKKFAFA)3-pGC-ala, Phor21 y Phor18 no conjugado = controles CLIP71. Los volumenes tumorales se redujeron significativamente en comparacion con los controles de solucion salina en todos los grupos de tratamiento excepto (KKKFAFA)3-pGC-ala, Phor21 y Phor18, que resultaron ineficaces para reducir el volumen del xenoinjerto.
Los pesos tumorales tambien se redujeron significativamente (p<0,001) en todos los grupos de tratamiento con peptidos conjugados con pGC en comparacion con animales tratados con solucion salina o peptidos (KKKFAFA)3. La viabilidad de las celulas tumorales, medida a partir de la actividad de la luciferasa, se correlacionaba bien con los cambios observados en los pesos tumorales y los volumenes tumorales.
La eficacia del tratamiento, medida como reduccion del peso tumoral o celulas tumorales viables, en comparacion con los valores de la lfnea base, mostro una respuesta al tratamiento dependiente de la concentracion para 323033 y 337476. 337481 mostro consistentemente una reduccion de la carga tumoral y de las celulas tumorales vivas a las dosis de 0,01, 1 y 5 mg/kg. 323033 resulto mas eficaz a la dosis de 1 mg/kg en comparacion con 5 mg/kg (los presentes inventores ya habfan observado este hecho en experimentos anteriores), pero solo era significativamente diferente respecto a los controles de solucion salina a la dosis mas baja aplicada. Los constructos de fusion 337476 y 337481 resultaron significativamente mas eficaces a las dosis de 5 y 0,01 mg/kg en comparacion con 323033 (p<0,0001) en la reduccion de las cargas tumorales y las celulas tumorales viables (p<0,004) a niveles inferiores a los valores de lfnea base. El constructo de fusion 337481 no mostro dependencia de la concentracion y resulto ser el mas eficaz de entre todos los constructos sometidos a ensayo.
Se observaron tumores qufsticos en los ratones tratados con los constructos de fusion 337476 y 337481 que se produjo en el 80% a 90%, aunque solo en el 30% en el grupo de tratamiento de 323033 a 1 mg/kg (no se observo formacion de quites en dicho modelo de xenoinjerto. Los quistes consistfan de capsulas llenas de lfquido). Aunque no esta claro, se ha planteado que los tumores qufsticos se producen en el caso de que las celulas sean rapidamente eliminadas en un tumor en crecimiento rapido. Los quistes se encontraban presentes en xenoinjertos de tumor prostatico tratados con Phor21.
Los resultados de la analftica qufmica sangufnea y de recuento sangufneo completo para los grupos de tratamiento revelaron que en ningun caso alteraron los tratamientos las funciones hepatica, renal y cardfaca. El recuento plaquetario y los recuentos de leucocitos y hematfes se encontraban dentro de los intervalos normales, indicando que el tratamiento no eliminaba especfficamente las celulas tumorales y no provocaba anemia a la concentracion dada ni afectaba a cualquier otra funcion corporal vital observable. Los constructos de fusion resultaron bien tolerados, sin efectos secundarios a largo plazo.
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Basandose en los datos de eficacia con tumores in vivo anteriormente proporcionados, Phor18-pGC-ala (337476) y D-ala-Phor21-pGC-ala (337481) resultaron significativamente mas potentes que Phor21-pGC-ala (323033) de referencia con respecto a la reduccion del peso tumoral (p<0,0001) y a la destruccion de celulas tumorales viables (p<0,004) en comparacion con los valores de la lfnea base. Ninguno de los constructos de fusion causo hemolisis in vivo y no mostro efectos secundarios persistentes a la dosis mas alta utilizada (5 mg/kg). Resulta posible que la eficacia tumoral de Phor18-pGC-ala sea mas elevada con multiples inyecciones incluso a la dosis mas baja.
Para los constructos de fusion con HLHL, se utilizo el modelo de xenoinjerto de raton para el cancer de mama. Brevemente, ratones Nu/Nu hembra, cepa exocriada, de 5 semanas de edad (Charles River) recibieron una inyeccion subcutanea de una suspension de MDA-MB-435S.luc (1x106 celulas). El tratamiento se inicio el dfa 21 despues de la inyeccion de celulas tumorales y se continuo los dfas 26 y 29. Las dosis para las inyecciones semanales fueron de constructo de fusion fueron 2, 0,2 y 0,02 mg/kg de peso corporal, proporcionadas en forma de una inyeccion unica de bolo. Los ratones fueron necropsiados 34 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales. Los valores de lfnea base de los pesos tumorales se obtuvieron mediante el sacrificio de 8 ratones al inicio del tratamiento. Se recolectaron los tumores primarios, hfgado, rinones, pancreas, corazon, pulmones y bazo y se prepararon para la evaluacion histologica en formalina. Se registraron los pesos tumorales en el momento de la necropsia; parte de los tumores se congelo a -80°C para la determinacion en ensayo de luciferasa.
Los grupos de tratamiento inclufan un control de solucion salina, Phor21-pGC-ala - 323033 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg), D-ala-Phor21-HLHL -338611 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg), (KKKFAFA)3 HLHL - 338614 (5 mg/kg), Phor18-HLHL - 338613 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg), Phor18-ASAAS-HLHL -338612 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg), D-ala-Phor18-HLHL - 339385 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg) y Phor18-Lupron - 339347 (0,02, 0,2 y 2 mg/kg), lfnea base 12 ratones en cada grupo.
Todos los grupos de ratones toleraron bien las inyecciones. Solo murieron dos ratones durante la segunda y tercera inyecciones con Phor18-ASAAS-HLHL a la dosis de 2 mg/kg (estos ratones procedfan de la misma jaula) La muerte era un suceso agudo. Sobrevivieron todos los ratones en otros grupos de tratamiento. Ningun raton murio como consecuencia de la inyeccion mas de 10 minutos despues de la misma.
La figura 9 resume los efectos de las inyecciones de constructo de fusion sobre los tumores primarios como medidas del volumen durante el curso del estudio para cada constructo individual. En todos los grupos, los volumenes tumorales se redujeron durante el tratamiento excepto para los ratones tratados con el conjugado (KKKFAFA)3-HLHL o en el control de solucion salina, en los que se observo un crecimiento tumoral exponencial. El volumen tumoral registrado tras 30 dfas de tratamiento mostro una reduccion (p<0,01) en comparacion con la lfnea base para todos los constructos de fusion, registrando los volumenes tumorales mas pequenos en los grupos de tratamiento con Phor18-ASAAS-HLHL y Phor18-HLHL.
En la figura 10 se resumen las caracterfsticas de los tumores en el momento de la necropsia: (A) peso tumoral, (B) cambios en los pesos tumorales en comparacion con la lfnea base, (C) numero total de celulas tumorales vivas, (D) cambios en el numero total de celulas tumorales vivas en comparacion con la lfnea base, y (E) pesos corporales en la lfnea base y en el momento de la necropsia. Se determino la viabilidad de las celulas tumorales al final del estudio al medir los tumores para la actividad de luciferasa. Se calculo la eficacia del tratamiento como la diferencia entre las mediciones al inicio del tratamiento y la medicion al final del estudio (figuras 10B y 10D).
Los pesos tumorales y el numero total de celulas tumorales vivas se redujeron significativamente en todos los animales en todos los grupos de tratamiento, incluso a la dosis mas baja de 0,02 mg/kg al administrar conjugados de HLHL, en comparacion con el control de solucion salina y con el peptido conjugado (KKKFAFA)3- HLHL (p<0,0001). Se redujeron significativamente los pesos tumorales totales en comparacion con la lfnea base en todos los animales tratados con 2 mg/kg de peptidos que contenfan HLHL y a las dosis de 0,02, 0,2 y 2 mg/kg para D-ala-Phor18-HLHL (A) (p<0,05).
Las concentraciones siguientes resultaron en pesos tumorales similares a los de la lfnea base: Phor21-pGC-ala - 323033) a las dosis de 0,02 mg/kg (p<0,07) y 0,2 (p<0,06); Phor18-Lupron a las dosis de 0,2 y 0,02 mg/kg, Phor18-HLHL a la dosis de 0, 2 mg/kg y D-ala-Phor21-HLHL a la dosis de 0,2 mg/kg. Al comparar los pesos tumorales totales a la dosis de 0,02 mg/kg de Phor21-pGC-ala, Phor18-ASAAS-HLHL y D-ala Phor18-HLHL, se observo que eran superiores a la dosis de 0,02 mg/kg (p<0,05).
Se determino el numero de celulas tumorales vivas y se represento graficamente en la figura 10C como el numero total de celulas tumorales vivas y en la figura 10D como los cambios en las celulas tumorales vivas en comparacion con la lfnea base. La viabilidad celular, medida a partir de la actividad de la luciferasa, se correlacionaba con los cambios observados de peso tumoral y volumen tumoral excepto para Phor18-ASAAS- HLHL y Phor18-HLHL, en los que se observo una reduccion de las celulas tumorales vivas. Los tratamientos con D-ala-Phor18-HLHL (339385) y Phor18-ASAAS-HLHL (338612) fueron superiores al tratamiento con Phor21- pGC-ala a la dosis de 2 mg/kg (p<0,04).
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La eficacia del tratamiento medida como reduccion del peso tumoral o de las celulas tumorales viables en comparacion con los valores de lmea base mostro una respuesta al tratamiento dependiente de la concentracion para todos los constructos de fusion excepto para D-ala-Phor21-HLHL con respecto a los pesos tumorales y las celulas tumorales vivas. D-ala-Phor18-HLHL mostro consistentemente una reduccion de los pesos tumorales y de las celulas tumorales vivas a las dosis de 0,02, 2 y 2 mg/kg. Los constructos de fusion mas eficaces en el presente experimento en la reduccion del numero de celulas tumorales vivas y pesos tumorales a la dosis de 2 mg/kg fueron Phor18-ASAAS-HLHL (338612) y D-ala-Phor18-HLHL (339385) Phor18-ASAAS-HLHL y D-ala- Phor18-HLHL eran superiores a las dosis de 2 y 0,02 mg/kg de Phor21-pGC-ala (p<0,05). Phor18-Lupron era menos eficaz para reducir el peso tumoral y las celulas tumorales vivas.
Los resultados de la analftica qmmica sangumea y de recuento sangumeo completo para los grupos de tratamiento revelaron que en ningun caso alteraron los tratamientos las funciones hepatica, renal y cardfaca. El recuento plaquetario y los recuentos de leucocitos y hematfes se encontraban dentro de los intervalos normales, indicando que el tratamiento no eliminaba espedficamente las celulas tumorales y no provocaba anemia a la concentracion dada ni afectaba a cualquier otra funcion corporal vital observable. Se observaron niveles de potasio elevados 1,5 veces respecto a los controles de solucion salina en ratones inyectados con Phor18-Lupron, Phor18-HLHL y D-ala-Phor21-HLHL. Los constructos de fusion resultaron bien tolerados, sin efectos secundarios a largo plazo.
Basandose en los datos de eficacia con tumores in vivo anteriormente proporcionados, Phor18-ASAAS-HLHL (338612) y D-ala-Phor18-HLHL (339385) resultaron significativamente mas potentes que Phor21-pGC-ala de referencia con respecto a la reduccion del peso tumoral (p<0,05) y a la destruccion de celulas tumorales viables (p<0,04). Igual de eficaz que Phor21-pGC-ala resultaron D-ala-Phor21-HLHL y Phor18-HLHL. Ninguno de los constructos de fusion causo la hemolisis in vivo u otros efectos secundarios. Resulta posible que la eficacia de Phor18-ASAAS-HLHL (338612) y D-ala-Phor18-HLHL (339385) sea mas elevada con multiples inyecciones incluso a la dosis mas baja.
Ejemplo 4
El presente ejemplo describe la expresion in vitro e in vivo de receptores y estudios de especificidad.
Se analizo la densidad de expresion de los receptores de LH tanto antes como despues del tratamiento con el fin de determinar si el tratamiento resultaba en la regulacion negativa de la expresion de los receptores. Inmunocitoqmmica en comparacion con los ensayos de transferencia western y RIA para la cuantificacion. Determinacion de receptores de LH y HLHL en celulas MDA-MB-435S-luc, CHO y TM4 utilizando IHQ con portaobjetos con camara y tecnicas de transferencia western. El mismo numero de pase de cada lmea celular se sometio a ensayo para la sensibilidad al peptido lttico CG y al peptido lftico HLHL.
Se analizo la especificidad de los constructos de fusion de receptores de LH en celulas MDA-MB-435S.luc (receptores tanto de HLHL como de CG), TM4 (sin receptores de HLHL) y CHO (sin receptores de CG). Los datos de IC50 mostraron una reduccion significativa de la sensibilidad en celulas TM4 para HLHL-Phor21 (10,9 pM), mientras que las celulas CHO mostraban una sensibilidad reducida a Phor21-pGC-ala (24,6 pM) en comparacion con las celulas MDA-MD-435S.luc cells (2,3 pM) (figura 12).
Se midio la expresion de los receptores in vivo en relacion al tratamiento de constructo de fusion. Se midio la expresion de los receptores in vivo al inicio y al final del tratamiento de constructo de fusion.
Ejemplo 5
El presente ejemplo describe el tratamiento de combinacion con constructos de fusion y un agente quimioterapeutico.
Se llevaron a cabo estudios preliminares con lmeas celulares de cancer ovarico (celulas OVCAR-3, resistentes a multiples farmacos), incubadas durante 48 h con Phor21-pGC-ala y doxorrubicina. Se determino la viabilidad celular como reduccion de formazan. Una reduccion de IC50 con un tratamiento de doxorrubicina creciente en incubacion simultanea con Phor21-pGC-ala. La reduccion fue de 10 pM a 0,9 a 0,3 a 0,05 pM a concentraciones de doxorrubicina de 0, 0,5, 2 y 10 pg/ml (figura 11). El tratamiento con Phor21-pGC-ala potencio la respuesta a la doxorrubicina. Los datos demostraron que Phor21-pGC-ala resulta mas eficaz (13 veces mas) en el caso de que las celulas se coincuben con doxorrubicina.
El pretratamiento de las celulas cancerosas con doxorrubicina o cisplatino, seguido del tratamiento con constructos de fusion con LH o HLHL en presencia y en ausencia de LH o HLHL mostrara si la citotoxicidad de las celulas frente al constructo resulta alterada.
Se sometio a ensayo la eficacia in vivo del tratamiento de combinacion en un modelo de tumor xenoinjertado
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(MDA-MB-435S). Los ratones fueron tratados con una combinacion de un constructo de fusion y un farmaco quimioterapeutico y se compararon con los controles apropiados. Los ratones fueron tratados segun el programa estandar utilizado para el farmaco y se trataron una vez a la semana durante 3 semanas con el constructo de fusion.
Los conjugados de fusion presentaban un elevado margen de seguridad considerando parametros tales como la actividad hemolftica, la dosis maxima tolerada (DMT) (hasta 16-25 mg/kg) en comparacion con la dosis antitumoral eficaz (0,02 o 0,01 mg/kg). El margen de seguridad para Phor21-pGC-ala era de 16, mientras que puede alcanzarse un valor de 800 para Phor21-pGC-ala y para Phor18-HLHL. En contraste, el margen de seguridad para Phor1,8-Lupron era de solo 8.
La tabla 6, a continuacion, es un resumen de los conjugados segun diversos criterios.
Peptido
Factor de incremento de actividad in vitro1 Actividad hemolftica [pM]2 IC50/HA50 Rendimien to in vivo en comparaci on con 334 MTD mg/kg5 Clasificaci on del rendimient o
Phor21-pGC-ala (33)
1 73,4 0,03 1 16
D-ala-Phor18-HLHL (85)
1,5 No lftico 0 Superior 25 14
Phor 18-pGC-ala (76)
2,11 169 0,006 Superior 16 13
Phor18-HLHL (13)
2,65 297 0,003 1 16 13
D-ala-Phor21-pGC-ala (81)
1 No lftico 0 Superior 8 11*
Phor18-ASAAS-HLHL (12)
2,62 410 0,002 Superior Sin datos 11
D-ala-Phor21-HLHL (11)
3,08 672 0,001 1 Sin datos 10a
Phor18-Lupron (47)
1 21 0,04 Menor 16 5
71
1,6 421 0,003 Sin datos Sin datos
74
1,8 No lftico 0 Sin datos Sin datos
Codigo de clasificacion:
Puntos asignados: 1 2 3 Actividad in vitro 1x 2x 3x HA50 < 50 50-100 > 100 IC50 /HA50 <0,03 <0,006 <0,004 Eficacia in vivo
En comparacion con 33, igual mejor DMT comparado con 33, igual mejor
1) IC50 de 33 era de 2,31 pM, valores expresados como IC50 de 33/IC50 del peptido.
2) Actividad hemolftica expresada como HA50 [pM].
3) El rendimiento in vivo se refiere a la significancia de la reduccion del peso tumoral y la reduccion de las celulas tumorales vivas vs. Los valores de lfnea base en comparacion con los mismos parametros del peptido 33.
4) Dosis inyectada que resulta en una supervivencia de 66,6% (aguda y 8 a 14 dfas despues de la inyeccion).
Codigos de los peptidos:
33=Phor21pGC-ala 76=Phor18-pGC-ala 81=D AlaPhor21-pGC-ala 85=D AlaPhor18-HLHL 47=Phor18-Lupron 13=Phor18-HLHL 11=D ala Phor21-HLHL 12=Phor18-ASAAS-HLHL 71=Phor15-pGC-ala 74=Phor15-C6-pGC-ala
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Ejemplo 6
El presente ejemplo describe estudios cineticos in vitro con el peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phor18-HLHL (338613)) en diversas lmeas celulares de cancer.
Los farmacos quimioterapeuticos estandares interaction mediante intercalado de ADN, interaccion con los microtubulos o son inhibidores de las rutas de transduccion de senales. Por lo tanto, su mecanismo de accion determinar el marco temporal necesario para destruir las celulas diana. La cinetica para que la doxorrubicina in vitro destruya las celulas de cancer de mama humanas, tales como MDA-MB-435S, se ha informado que llega a ser de tan solo 4 horas y otros tratamientos estandares de cuidado pueden tardar incluso mas tiempo. El mecanismo de accion mas comun en la destruccion de las celulas de cancer es la apoptosis. Debido a que es un proceso reversible y debido a la aparicion de resistencias a multiples farmacos (RMf), la accion de las bombas de Pgp que exportan moleculas de farmaco en las celulas de cancer MDR, los tratamientos del estandar de cuidado pueden resultar ineficaces.
En contraste con los farmacos quimioterapeuticos, la accion membranaria directa puede destruir las celulas de cancer en minutos. Entre los compuestos activos en membranas, tales como los peptidos lfticos cationicos, se incluyen Phor18-HLHl (338613) (KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG).
Para determinar la cinetica de la citotoxicidad se llevaron a cabo estudios de curso temporal detallados utilizando Phor18-HLHL (338613) en comparacion con la fraccion peptido lttico no dirigida Phor18=CLIP71 (338983) en diversas lmeas celulares que expresaban receptores de la diana HLHL a diversos niveles. Las membranas de las lmeas celulares no cancerosas son neutras y resistentes a los peptidos citolfticos, en contraste con las lmeas celulares de cancer, las cuales presentan un elevado contenido en acido fosfatfdico en su membrana externa.
Las lmeas celulares de cancer de mama estudiadas eran MDA-MB-435S (negativa para el receptor alfa de estrogenos), MCF-7 y T47D (positivas para el receptor alfa de estrogenos), las lmeas celulares de cancer ovarico (OCAR-3 y SKOV-3), el cancer de prostata (LNCaP), la lmea celular epitelial mamaria no maligna MCF-10A y la lmea celular fibroblastica de raton NIH:3T3. Tambien se evaluo el papel del direccionamiento a receptores de HLH sobre la eficacia de Phor18-HLHL (338613).
Se sembraron celulas en placas de 96 pocillos a una densidad de 10.000 celulas/pocillo. Se inicio el tratamiento tras 48 h mediante la adicion de Phor18-HLHL (338613) (APC 338613, Lote n° P080401) o Phor18 = CLIP71 (APC 338983, Lote n° WO8033C1) a las siguientes concentraciones: 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 5, 10, 50 y 100 pM. Los controles conteman solucion USP salina o TritonX-100TM al 0,1% como referencia para 0% y 100% de muerte celular, respectivamente. Las incubaciones se terminaron retirando el medio de cultivo tras 2 minutos, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 2 horas, 6 horas, 24 y 48 horas. Se evaluo la viabilidad celular mediante el ensayo de conversion del formazan (ensayo de MTT, CellTiter 96 Aqueous One, Promega n° G3582). Se determino la conversion del formazan utilizando un espectrofotometro de microplacas BioRad Benchmark Plus a dos longitudes de onda, 490/630 nm, a temperatura ambiente.
Se calcularon los datos como fraccion de la absorcion en los pocillos que conteman TritonX-100TM, que representaba 100% de muerte celular, frente a 0% de muerte celular en los pocillos que conteman solucion salina. Se determino la citotoxicidad como IC50 utilizando GraphPad Prism version 5.01 para Windows, GraphPad Software, San Diego, California, USA, segun el programa para la respuesta sigmoidal a las dosis con pendiente variable utilizando valores de restriccion de 0% y 100%. Se compararon y se analizaron 4 pocillos de cada juego individual de dos placas de 96 pocillos. Se determino el analisis estadfstico para la significancia mediante una prueba t de Student de dos colas.
En celulas MDA-MB-435S (p250), Phor18-HLHL (338613) mostro la eficacia maxima tras 1 hora de incubacion, mientras que las incubaciones con CLIP71 resultaron en valores de IC50 de 100, 109, 171, 145, 148, 86, 54,5, 55,1 (24 horas) y de 3 [pM] (48 horas) (p<0,005) a medida que se incrementaba el tiempo de incubacion. Phor18- HLHL (338613) es un agente de accion rapida (1,2 pM, 0,5 horas y 0,6 pM tras 1 hora) en comparacion con el peptido lttico no conjugado CLIP71 (>100 pM).
En celulas MCF-7 (p152), Phor18-HLHL (338613) mostro la eficacia maxima tras 1 hora de incubacion, mientras que las incubaciones con CLIP71 resultaron en valores de IC50 de 92, 95, 50 y 22 [pM] (p<0,005) a medida que se incrementaba el tiempo de incubacion. Phor18-HLHL (338613) es un agente de accion rapida (3,4 a 1,8 pM) en comparacion con CLIP71, que no esta conjugado.
En celulas OVCAR-3 (p47), Phor18-HLHL (338613) mostro la eficacia maxima tras 1 hora de incubacion, mientras que las incubaciones con Phor18=CLIP71 no conjugado (33 incubaciones) resultaron en valores de IC50 de 337, 126, 85,5, 52,5, 22,9 y 23,1 [pM] (p<0,005) a medida que se incrementaba el tiempo de incubacion. Phor18-HLHL (338613) es un agente de accion rapida con valores de IC50 de 6,7, 5,6, 5,3, 1,6, 1,5, 0,5 y 0,5 [pM] (p<0,005) a medida que se incrementa el tiempo de incubacion. Los datos cineticos rapido sugieren que Phor18- HLHL (338613) y cLiP71 eliminan las celulas mediante un mecanismo de accion diferente e incrementan la
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eficacia del farmaco.
En celulas SKOV-3 (p40), Phor18-HLHL (338613) mostro la eficacia maxima (11,5 nM) tras 24 horas de incubacion, mientras que las incubaciones con CLIP71 resultaron en valores de IC50 de 86, 96, 53 y 50 [pM] (p<0,005) a medida que se incrementaba el tiempo de incubacion. Phor18-HLHL (338613) no es una diana apropiada para las celulas SKOV-3 ya que estas celulas no presentan receptores de HLHL funcionales.
Todas las lfneas celulares que presentaban receptores de HLHL funcionales, tales como las celulas de cancer de mama (MDA-MB-435 y MCF-7) y OVCAR-3 tratadas con Phor18-HLHL (338613) demostraron el efecto maximo (IC50 en pM) en la primera 0,5-1 hora de incubacion. En contraste, se requirio una incubacion de 24 horas para el efecto maximo de CLIP71. Se obtuvieron resultados similares para las lfneas celulares que presentaban receptores de HLHL funcionales, tales como T47D y LNCaP. En las lfneas celulares que no presentaban receptores de HLHL funcionales (SKOV-3 y HEK 1A), Phor18-HLHL (338613) y Clip71 mostraron una toxicidad similar, con valores de IC50 de 10,3 frente a 11,8 pM tras incubaciones de 24 horas. La lfnea celular no cancerosa 3T3 era altamente resistente a Phor18-HLHL (338613) y a CLIP71, con valores de IC50 >40 pM para CLIP-71 y >10 pM para Phor18-HLHL (338613).
Estos resultados indican que la utilizacion de HLHL como diana potencia la eficacia de CLIP71 y que las lfneas celulares no cancerosas son resistentes a la destruccion por peptidos cationicos citolfticos. Phor18-LH (338613) mostraba una notable potencia en la destruccion de las celulas de cancer mediante un mecanismo focalizado en los receptores en menos de 1 hora. Phor18-HLHL (338613) resulto eficaz en minutos y presenta las ventajas sobre la quimioterapia estandar de que depende de la incorporacion intracelular y la interferencia con rutas metabolicas y la maquinaria de proliferacion para resultar eficaz. Ademas, Phor18-HLHL (338613) es capaz de actuar sobre celulas de cancer resistentes a multiples farmacos.
Ejemplo 7
El presente ejemplo incluye datos que indican un mecanismo de accion probable del peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phor18-HLHL (338613)) sobre las celulas de cancer de mama in vitro.
Con el fin de demostrar un posible mecanismo de accion in vitro, se llevo a cabo un estudio de microscopfa de fluorescencia con la lfnea celular humana de cancer de mama MDA-MB-435 que sobreexpresa los receptores de HLHL. Brevemente, se sembraron celulas humanas de cancer de mama (MDA-MB-435, pase n° 252) en placas de cultivo. Se introdujeron los marcadores siguientes antes de anadir EP100: Se utilizo DRAQ5™ (Alexis Corporation) - azul - para la tincion del nucleo y MitoTracker® Red CMXRos (M7512) (Molecular Probes, Inc. OR) para visualizar las mitocondrias intactas. Las membranas celulares se tineron con conjugados de germen de trigo y Alexa Fluor verde (Molecular Probes, Inc., OR).
En primer lugar las celulas se cargaron con pigmento Mitotracker, siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se anadio Phor18-HLHL (338613) reconstituido en solucion salina a una concentracion final de 10 pM y se incubo durante 5 a 10 minutos. Las placas de cultivo con solo solucion salina sirvieron de controles. Se elimino el sobrenadante y las celulas remanentes se prepararon para la obtencion de imagenes de microscopfa de fluorescencia.
Una evaluacion de microscopfa de fluorescencia de celulas de cancer de mama MDA-MB-435 que presentaban receptores de HLHL funcionales in vitro tras la exposicion a Phor18-HLHL (338613) revelo la desintegracion de la membrana plasmatica tras 5 minutos de exposicion a Phor18-HLHL (338613) (10 pM). Estas observaciones sugieren que Phor18-HLHL (338613) destruyo la membrana plasmatica, conduciendo a la muerte de la celula en minutos.
Una evaluacion de microscopfa de fluorescencia de celulas SKOV-3 (p41) y MDA-MB-435S (p250) en cultivos incubados durante 30 minutos con 2 pM de Phor18-HLHL (338613), FITC revelo que en celulas sKoV-3 no se producfa incorporacion intracelular, no se producfan evaginaciones de la membrana ("blebbing") y se retuvo el pigmento en las mitocondrias. En contraste, en las celulas MDA-MB-435S, la incorporacion intracelular de Phor18-HLHL (338613) FITC era visible en 30 minutos, asf como la formacion extensiva de evaginaciones membranales que conducfan a la formacion de vesfculas de la membrana externa y desvanecimiento del pigmento mitocondrial. Estas observaciones sugieren que la muerte celular se produjo en minutos.
En minutos, Phor18-HLHL (338613) destruyo las celulas que presentaban receptores de HLHL funcionales. Phor18-HLHL (338613) destruyo las celulas de cancer mediante la desintegracion de la membrana plasmatica externa, conduciendo a necrosis. El mecanismo de accion sugiere fuertemente una accion rapida de Phor18- HLHL (338613) con la membrana plasmatica de las celulas que presentan la diana funcional. Las celulas que eran negativas para receptores de HLHL no eran una diana y permanecieron intactas.
Estos datos demuestran las elevadas especificidad y eficacia de Phor18-HLHL (338613) como farmaco
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anticancer. Phor18-HLHL (338613) resulto eficaz en minutos y presento importantes ventajas respecto a la quimioterapia estandar, que requiere incorporacion intracelular e interferencia con las rutas metabolica y la maquina de proliferacion para resultar eficaz. Ademas, Phor18-HLHL (338613) fue capaz de actuar sobre celulas de cancer resistentes a multiples farmacos.
Ejemplo 8
El presente ejemplo incluye estudios que demuestran que el peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phor18-HLHL (338613)) era eficaz contra el cancer en modelos de xenoinjerto.
Se llevaron a cabo estudios de eficacia in vivo como monoterapia, o como terapia de combinacion con tratamientos del estandar de cuidado en ratones desnudos portadores de xenoinjertos de cancer de mama humano: Xenoinjertos de MDA-MB-435S.luc (s.c.), MCF-7 (positivo para el receptor alfa de estrogenos) y de cancer ovarico humano: Xenoinjertos OVCAR-3, (s.c.), cancer de prostata humano: PC-3 (negativo para receptores de androgenos). Se inyecto Phor18-HLHL (338613) disuelto en solucion salina (0,02, 0,2 y 2 mg/kg) una o dos veces a la semana durante 3 semanas como inyeccion unica de bolo en la vena lateral de la cola.
Se llevaron a cabo terapias de combinacion de PHO18-HLHL (338613) en modelos de xenoinjerto de cancer de mama MCF-7.
Los ratones fueron sacrificados una semana despues de la ultima inyeccion y se extrajo sangre para el panel quimico, y se registraron los pesos tumorales y los pesos corporales. Parte de los tumores se fijo en formalina al 10% tamponada con PBS, para la evaluacion histologica. Los diversos estudios de xenoinjertos in vivo se resumen en la Tabla 7.
Tabla 7: estudios de xenoinjertos
Modelo de xenoinjerto
Regimen y duracion del tratamiento Mediana de peso tumoral vs linea base p<0,05 Mediana de peso tumoral vs solucion salina p<0,05
OVCAR-3
1X3 sem., 20 d 0,2 mg/kg 0,2, 2 mg/kg
MDA-MB-435S.luc
1X3 sem. 22 d 0,02, 2 mg/kg 0,02, 0,2, y 2 mg/kg
MDA-MB-435S.luc
1X3 sem. 22 d 0,002 mg/kg 0,0002 mg/kg
PC-3 MCF-7
1X3 sem. 21 d 2x 3 sem., 19 d 0,2 0,002, 0,02, 0,2 mg/kg 0,02 mg/kg retardo del crecimiento
Observaciones
Necrosis en tumores tratados, reduccion de receptores de HLHL
Necrosis y reduccion de receptores de HLHL
Necrosis en tumores tratados 0,02 y 0,2
Para determinar la dosis eficaz minima necesaria para reducir los pesos del xenoinjerto de MDA-MB-435S en un regimen de dosis unica, se inyectaron (s.c.) ratones Nu/Nu hembra, cepa exocriada, edad: 5 semanas (Charles River) en la region interescapular con una suspension de MDA-MB-435S (pase n° 249)/Matrigel (2,4x106 celulas/raton) [Leuschner 2006]. Phor18-HLHL (338613) (ID 338613 lote n° P080401) (0,00002, 0,0002, 0,002, 0,02, 0,2 y 1 mg/kg) y Phor18 no conjugado=CLIP71 (APC 338983, lote n° WO8033C1) mas HLHL (0,2/0,122 mg/kg, ([D-Trp6]-HLHL; Sigma L9761, lote n° 037K1103) que se reconstituyeron en USP-solucion salina antes de la administracion. Las dosis se administraron en forma de inyeccion intravenosa de bolo unico en la vena lateral de la cola una vez a la semana durante 3 semanas.
Cada grupo consistia en 16 ratones, que recibieron una inyeccion a la semana durante 3 semanas. Se sacrifico un grupo de 16 ratones en el momento de iniciar el tratamiento, que sirvieron de linea base. Las inyecciones de solucion salina sirvieron de grupos de control. Durante todo el estudio se registraron los volumenes tumorales dos veces a la semana.
El tratamiento se inicio el dia 16 despues de la inyeccion de celulas tumorales, tras el establecimiento de los tumores, y continuo los dias 23 y 30. Todos los ratones remanentes fueron necropsiados 37 dias despues de la inyeccion de celulas tumorales.
Se determino la respuesta al tratamiento a partir de los pesos tumorales y el cambio en los mismos en el momento de la necropsia en comparacion con los controles de solucion salina y el tratamiento no dirigido de CLIP71. Se recolectaron los tumores primarios, se pesaron y se prepararon para la evaluacion histologica mediante fijacion con formalina con formalina tamponada con PBS al 10%. La evaluacion estadistica de las tablas de datos se llevo a cabo en GraphPad Prizm 4 y se calcularon las significancias mediante la prueba de rangos con signos de Wilcoxon.
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Los volumenes y pesos tumorales se incrementaron en los controles de solucion salina y en los ratones tratados con CLIP71 mas HLHL. Los volumenes y pesos tumorales se redujeron significativamente en comparacion con los controles de solucion salina tratados con 0,0002 mg/kg de Phor18-HLHL (338613). El tratamiento con una dosis de Phor18-HLHL (338613) de tan solo 0,002 mg/kg redujo significativamente el volumen y peso tumorales en comparacion con la lfnea base (p<0,0002).
La evaluacion histologica de secciones tumorales de ratones xenoinjertados con MDA-MB-435S tenidos con hematoxilina/eosina de ratones tratados mostro celulas tumorales viables en el control de solucion salina y en ratones tratados con CLIP71/HLHL. En contraste, se puso de manifiesto necrosis significativa en los tumores procedentes de ratones tratados con Phor18-HLHL (338613) a dosis de tan solo 0,0002 mg/kg. El peptido lftico cationico no dirigido CLIP71 no redujo los pesos tumorales ni destruyo tejido tumoral.
Phor18-HLHL (338613) resulto altamente eficaz en la reduccion de los pesos tumorales de xenoinjertos de MDA- MB-4355 a una dosis de tan solo 0,002 mg/kg, conduciendo a necrosis de los tejidos tumorales tratados. El tratamiento no focalizado con peptido citolfticos resulto ineficaz.
Con el fin de determinar la dosis eficaz minima necesaria para reducir los pesos de los xenoinjertos de MDA-MB- 435S en un regimen de multiples dosis, se inyectaron (s.c.) ratones Nu/Nu hembra, cepa exocriada, edad: 8 semanas (Charles River) en la region interescapular con una suspension de MDA-MB-435S (pase n° 253)/Matrigel (2x106 celulas/raton) tal como se ha indicado anteriormente. Phor18-HLHL (338613) (ID 338613 lote n° P080401) (0,002 y 0,2 mg/kg) se reconstituyo en solucion salina USP antes de la administracion. Las dosis se administraron como inyeccion intravenosa de bolo unico en la vena lateral de la cola los dias 15, 16, 17, 20, 21, 22, 23, 27, 28, 29, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 40, 41 y 42 despues de la inoculacion de las celulas tumorales. Las inyecciones de solucion salina sirvieron de grupos de control.
Cada grupo de tratamiento consistia en 16 ratones. Durante todo el estudio se registraron los volumenes tumorales dos veces a la semana. La necropsia final se llevo a cabo el dia 45 despues de la inyeccion de celulas tumorales. Se reanudaron las inyecciones debido a la oclusion de la vena de la cola en la mayoria de los ratones. En el punto final del estudio se determino el peso corporal, y los pesos de los tumores y estos se fijaron en formalina al 10% tamponada con fosfato.
El tratamiento con Phor18-HLHL (338613) mediante multiples inyecciones intravenosas resulto en la regresion tumoral a ambos niveles de dosis. Se observaron ratones libres de tumores en ambos grupos de tratamiento: 6/23 en el grupo que recibio 0,002 mg/kg y 1/20 en el que recibio 0,2 mg/kg. Las masas residuales tipicamente consistian de Matrigel. Un raton no respondio al tratamiento en el grupo de 0,2 mg/kg.
No se observo necrosis en ninguna cola; no se encontro enrojecimiento de ninguna cola. Los pesos corporales no resultaron afectados por el tratamiento a lo largo de todo el periodo de estudio.
La supervivencia fue del 100% en los ratones tratados. En contraste, 8 ratones en el grupo de control de solucion salina fueron sacrificados el dia 30 despues de la inyeccion de celulas tumorales (antes del punto final del estudio) debido a que el volumen tumoral excedfa de 2.500 mm3.
El examen histologico de los tumores tenidos con H-E procedentes de ratones tratados con 0,002 y 0,2 mg/kg de Phor18-HLHL (338613) en un regimen de multiples inyecciones demostro la erradicacion de las celulas tumorales en los ratones tratados. En contraste, se encontraron celulas tumorales viables en los ratones de control de solucion salina.
Phor18-HLHL (338613) destruyo y redujo los pesos tumorales significativamente y extendio el periodo de vida de los ratones tratados. Los tratamientos se realizaron sin ningun efecto visible sobre el peso corporal o el examen de los organos.
Ejemplo 9
El presente ejemplo incluye una descripcion de estudios de eficacia del peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phor18-HLHL (338613)) en modelos de xenoinjerto de cancer de mama, ovario y prostata.
Los estudios in vitro descritos en la presente memoria demuestran que Phor18-HLHL (338613) es un agente de accion rapida, que elimina las celulas de cancer en minutos tras el contacto. Con el fin de determinar la eficacia de Phor18-HLHL (338613) sobre los xenoinjertos de cancer de mama en la etapa inicial del tratamiento dirigido, se estudio la cinetica de la destruccion celular por Phor18-HLHL (338613) en un modelo de xenoinjerto de cancer de mama tras una unica inyeccion de Phor18-hlhl (338613).
Brevemente, se inyectaron (s.c.) ratones Nu/Nu hembra, cepa exocriada, edad: 5 semanas (Charles River) en la
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region interescapular con una suspension de MDA-MB-435S (pase n° 249)/Matrigel (2,4x106 celulas/raton) tal como es indica en el Ejemplo 10. Phor18-HLHL (338613) (iD 338613 lote n° P080401) (0,2 y 2 mg/kg) se reconstituyo en solucion salina USP antes de la administracion. Las dosis se administraron en forma de inyeccion intravenosa de bolo unico en la vena lateral de la cola.
Los ratones fueron sacrificados 1, 2 y 16 horas despues del tratamiento con Phor18-HLHL (338613) o solucion salina. En el punto final del estudio se determino el peso corporal y los pesos de los tumores y estos se fijaron en formalina al 10% tamponada con fosfato.
La evaluacion histologica de secciones tumorales tenidas con H-E de tumores mostraron celulas tumorales viables con multiples figuras mitoticas en los ratones tratados con solucion salina. El tratamiento con Phor18- HLHL (338613) tanto a la dosis de 0,2 como de 2 mg/kg mostro la destruccion de los tumores de los xenoinjertos de MDA-MB-435S en tan solo 1 hora tras la inyeccion.
Phor18-HLHL (338613) destruyo los tumores tan solo 1 h despues de la administracion, sugiriendo un mecanismo de accion rapida que provoca la muerte celular mediante necrosis. Estos datos confirman que Phor18-HLHL (338613) actua mediante su contacto membranario con celulas tumorales presentadoras de receptores de HLHL.
Para determinar la eficacia de Phor18-HLHL (338613) sobre xenoinjertos de cancer ovarico que son similares a la enfermedad humana, se llevaron a cabo estudios con dosis unica y con multiples dosis. En el presente estudio se utilizo el modelo de xenoinjerto de la lfnea celular humana de cancer ovarico OVCAR-3 que presenta receptores de HLHL funcionales. OVCAR-3 representa un modelo de xenoinjerto de crecimiento lento y secreta el marcador tumoral (antfgeno de cancer 125, o CA125). Puede utilizarse la secrecion del mismo como respuesta del tratamiento y es una medida de la actividad del farmaco.
El objetivo del presente estudio de xenoinjerto era someter a ensayo Phor18-HLHL (338613) en un modelo de cancer ovarico con el fin de determinar si Phor18-HLHL (338613) resultaba eficaz in vivo en modelos de tumor de crecimiento lento resistentes a multiples farmacos en forma de inyecciones semanales individuales. Brevemente, ratones Nu/Nu hembra, cepa consangufnea, de 5 semanas de edad (Harlan-Sprague Dawley) recibieron una inyeccion subcutanea de una suspension de celulas NIH:OVCAR-3/Matrigel (4,6x106 celulas/raton). El tratamiento se inicio el dfa 33 despues de la inyeccion de celulas tumorales, tras el establecimiento de los tumores, y continuo los dfas 41 y 47. Las dosis para las 3 inyecciones semanales fueron de 0,02, 0,2 y 2 mg/kg de peso corporal, administradas en forma de una inyeccion intravenosa de bolo unico por la vena lateral de la cola administrada una vez a la semana durante tres semanas, los dfas 33, 41 y 47. Las necropsias se llevaron a cabo el dfa 52. Los datos se presentaron como medias ± SEM. Las flechas muestran la administracion.
Los grupos de tratamiento inclufan el control de solucion salina (N=10), Phor18-HLHL (338613) (338613, V09108X1) (0,02 (N=10), 0,2 (N=10) y 2 mg/kg (N=9), y Phor18 no conjugado=CLIP71 (APC 338983, lote n° V04004X1) (2 mg/kg (N=10)), cisplatino/CP en solucion salina (Calbiochem, n° de cat. 232120, D0005495) (10 mg/kg, 3qd (N=10), lfnea de base (N=9).
Se sacrifico un grupo de 9 ratones portadores tumorales el dfa 33 y sirvio de grupo de lfnea base. Todos los ratones fueron necropsiados 51-52 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales. Se registraron los volumenes tumorales y los pesos corporales dos veces a la semana durante el estudio y ademas se llevo a cabo el examen veterinario general de los ratones.
Se recolectaron los tumores primarios, hfgados, rinones, pancreas, corazones, pulmones y bazos, fijados en formalina y preparados para la evaluacion histologica. Se midieron los pesos tumorales en el momento de la necropsia; parte de los tumores se congelo a -80°C para la determinacion en ensayo de receptores de LH/CG y de HLHL.
Como biomarcador de la actividad de farmaco, se determino CA125 en el suero, recolectado de cada raton individual en el momento de la necropsia utilizando un inmunoensayo ligado a enzima para la determinacion cuantitativa del antfgeno de cancer ovarico CA125 (kit de ensayo Genway, Biotech, Inc., San Diego, CA, n° de catalogo 40-052-115009, n° BC-1013, segun el fabricante).
Se evaluaron los niveles de los receptores de HLHL a partir de tumores fijados en formalina. Se llevo a cabo el analisis cuantitativo de las imagenes de inmunoperoxidasa utilizando el sistema complementario de analisis de imagenes asistido por ordenador de Ventana (VIAS,) funcionalmente conectado con un microscopio interactivo (Axio Imager). Se llevo a cabo el analisis cuantitativo con el programa para la cuantificacion del receptor de Her2/neu que inclufa los analisis morfometrico y colorimetrico. Se informaron los resultados de estado de los receptores como porcentaje de celulas que mostraban tincion positiva de los receptores de HLHL segun los criterios siguientes: 0: no inmunorreactivo, 1+: 1% a 25% positivas, 2+: 26% a 50% positivas, 3+: 51% a 75 % positivas.
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Todos los grupos de ratones toleraron bien las inyecciones. Un raton murio durante la primera inyeccion con Phor18-HLHL (338613) a la dosis de 2 mg/kg. La muerte fue un suceso agudo relacionado con el procedimiento y no con el tratamiento. Sobrevivieron todos los ratones en los demas grupos de tratamiento. Ningun raton murio como consecuencia de la inyeccion mas de 10 minutos despues de la misma.
Los volumenes tumorales se redujeron durante el tratamiento con Phor18-HLHL (338613). En contraste, en ratones tratados con CLIP71, cisplatino o en controles de solucion salina, se observo el crecimiento tumoral. Los volumenes tumorales registrados 42 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales mostraron reducciones (p<0,001) en comparacion con la lfnea base a concentraciones de Phor18-HLHL (338613) de tan solo 0,2 mg/kg de peso corporal.
Se determinaron las caracterfsticas de los tumores en el momento de la necropsia (mediana de pesos tumorales y cambios de la mediana de pesos tumorales en comparacion con la lfnea base). Se obtuvieron pesos tumorales reducidos en comparacion con los controles de solucion salina y Phor18 no conjugado=CLIP71 (p<0,05) en los grupos para las dosis 2 y 0,2 mg/kg de Phor18-HLHL (338613). Se encontraron ratones libres de tumores en los grupos de 0,2 y 2 mg/kg de Phor18-HLHL (338613). La respuesta al tratamiento medida como regresion tumoral en comparacion con el inicio del tratamiento era maxima en ratones tratados con Phor18-HLHL (338613) a 0,2 mg/kg (p<0,03 vs. lfnea base). El cisplatino y Phor18 no conjugado=CLIP71 no resultaron eficaces para reducir los pesos tumorales.
Los ratones tratados con controles de solucion salina, CLIP71 y cisplatino mostraron un crecimiento tumoral constante. Los niveles sericos para CA125 correspondfan a los pesos tumorales (r2=0,66). Se redujo la secrecion de CA125 en ratones tratados con Phor18-HLHL (338613) y en comparacion con los controles de solucion salina fue maxima en los ratones tratados con Phor18-HLHL (338613) a las dosis de 0,2 y 2 mg/kg (p<0,0002).
Los tamanos del tumor extrafdo de los ratones portadores de xenoinjerto de OVCAR-3 tras el tratamiento con 0,02 mg/kg de Phor18-HLHL (338613) se redujeron y estaban necroticos en comparacion con los controles de solucion salina. Los tumores tratados mostraron una reduccion de los niveles de receptores de HLHL de 1 a 2 puntos. Las secciones de tumor tenidas con hematoxilina/eosina mostraban necrosis significativa en los grupos tratados con 0,02 mg/kg de Phor18-HLHL (338613). Los ratones portadores de xenoinjerto tratados con cisplatino o CLIP71 no mostraban reduccion del volumen tumoral o de los niveles de receptores de HLHL, y mostraban celulas tumorales viables tras la evaluacion histologica.
El tratamiento con Phor18-HLHL (338613) causo la regresion tumoral, la reduccion del marcador tumoral CA125 en el plasma, la reduccion de los niveles de receptores de HLHL y la necrosis en el modelo de xenoinjerto ovarico. Por lo tanto, Phor18-HLHL (338613) resulta eficaz en la destruccion de los xenoinjertos de cancer ovarico resistentes a multiples farmacos.
Para determinar la eficacia de Phor18-HLHL (338613) sobre los xenoinjertos de cancer de prostata, se estudio el efecto de Phor18-HLHL (338613) in vivo en un modelo de xenoinjerto de crecimiento agresivo rapido. Los xenoinjertos PC-3 no tratados causaron una perdida significativa del peso en los ratones.
Brevemente, los ratones Nu/Nu macho, cepa exocriada, edad: 6 semanas (Charles River) se inyectaron subcutaneamente con una suspension de celulas PC-3/Matrigel (1x106 celulas/raton). El tratamiento se inicio el dfa 15 despues de la inyeccion de celulas tumorales, tras el establecimiento de los tumores, y continuo los dfas 22 y 29. Las dosis para las 3 inyecciones semanales fueron de 2, 0,2 y 0,02 mg/kg de peso corporal, administradas en forma de una inyeccion intravenosa de bolo por la vena lateral de la cola Los grupos de tratamiento eran el control de solucion salina (N=12), Phor18-HLHL (338613) (APC 338613 Lote n° V09108X1) (0,002 (N=12), 0,02 (N=12), 0,2 (N=12) y 2 mg/kg (N=12), y Phor18 no conjugado=CLIP71 (338983, Lote n° V04004X1) (5 mg/kg (N=12), lfnea base (N=12).
Se sacrifico un grupo de 12 ratones portadores tumorales el dfa 15 y sirvio de grupo de lfnea base. Todos los ratones fueron necropsiados 35 y 36 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales. Se registraron los volumenes tumorales y los pesos corporales dos veces a la semana durante el estudio y ademas se llevo a cabo el examen veterinario general de los ratones.
Se recolectaron los tumores primarios, hfgados, rinones, pancreas, corazones, pulmones y bazos, fijados en formalina y se prepararon para la evaluacion histologica. Se midieron los pesos tumorales en el momento de la necropsia; parte de los tumores se congelo a -80°C para la determinacion en ensayo de receptores de LH/CG y de HLHL.
Todos los grupos de ratones toleraron bien las inyecciones y todos los ratones en los grupos de tratamiento sobrevivieron. Ningun raton murio como consecuencia de la inyeccion.
Los volumenes tumorales se redujeron durante el tratamiento con Phor18-HLHL (338613) a las dosis de 0,002, 0,02, 0,2 y 2 mg/kg. En ratones tratados con CLIP71 o en controles de solucion salina, se observo crecimiento
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tumoral. Los volumenes tumorales registrados 22 dfas despues de la inyeccion de celulas tumorales mostraron reducciones (p<0,001) en comparacion con los controles de solucion salina y CLIP71 a concentraciones de Phor18-HLHL (338613) de tan solo 0,002 mg/kg de peso corporal. Los pesos tumorales se redujeron significativamente en comparacion con los controles de solucion salina y grupos de tratamiento con CLIP-71 (0,001 en todos los grupos tratados con Phor18-HLHL (338613)).
Es conocido que todos los xenoinjertos de PC-3 provocan una perdida de peso en ratones desnudos. En los ratones tratados con Phor-HLHL (338613), los volumenes tumorales se redujeron en los grupos tratados con 0,002, 0,02, 0,2 y 2 mg/kg de Phor18-HLHL (338613) en comparacion con los controles de solucion salina e inyecciones de CLIP71. La mediana de pesos tumorales en el momento de la necropsia se redujo significativamente en comparacion con los controles de solucion salina y CIP71 (p<0,001). Los ratones en los grupos controles eran caquecticos y sufrieron una perdida de peso superior a 10 g en comparacion con los ratones tratados.
Phor18-LHRH (338613) resulto eficaz en la detencion del crecimiento tumoral en xenoinjertos de PC-3 y evitaron la perdida severa de peso debido a la carga tumoral. Phor18-HLHL (338613) no conjugado resulto ineficaz.
En resumen, los estudios anteriormente proporcionados indican que el peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG (Phor18-HLHL (338613)) resulta eficaz in vivo en la destruccion de los xenoinjertos de cancer de mama, cancer ovarico y cancer de prostata. Phor18-HLHL (338613) causo necrosis tumoral en los ratones tratados, siendo evidente la necrosis incluso tan solo 1 hora despues de la inyeccion. Phor18-HLHL (338613) resulto eficaz como regimen de tratamiento semanal unico inductor de necrosis y causando una reduccion del peso tumoral. En el regimen semanal multiple, la erradicacion de los tumores resulto mas evidente, incluyendo la destruccion de las celulas tumorales residuales. Phor18-HLHL (338613) causo la destruccion de los niveles de receptores de HLHL despues del tratamiento, consistente con la destruccion de las celulas diana.

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    REIVINDICACIONES
    1. Constructo de fusion que comprende un primer dominio y un segundo dominio, en el que dicho primer
    dominio consiste en una secuencia de 15 a 20 aminoacidos con una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF y KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA; o una secuencia de 15 a 20 aminoacidos con una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, KFAKFAKKFAKFAKKFAKF y
    KFAKFAKKFAKFAKKFAKFA, que presenta uno de los residuos K sustituido por cualquiera de un residuo F o L, uno de los residuos F sustituido por cualquiera de un residuo K, A o L, o uno de los residuos A sustituido por cualquiera de un residuo K, F o L; y en el que dicho segundo domino comprende una fraccion de union.
  2. 2. Constructo de fusion segun la reivindicacion 1, en el que dicho primer dominio consiste en una secuencia de 15 o 18 aminoacidos que incluye un peptido seleccionado de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, y KFAKFAKKFAKFAKKFAK, o una secuencia de 15 o 18 aminoacidos que incluye un peptido seleccionado de entre KFAKFAKKFAKFAKK, KFAKFAKKFAKFAKKF, KFAKFAKKFAKFAKKFA, y KFAKFAKKFAKFAKKFAK, que presenta uno de los residuos K sustituido por cualquiera de un residuo F o L, uno de los residuos F sustituido por cualquiera de un residuo K, A o L, o uno de los residuos A sustituido por cualquiera de un residuo K, F o L.
  3. 3. Constructo de fusion segun la reivindicacion 1 o 2, en el que dicha fraccion de union se une a
    (a) un receptor, ligando o antfgeno; o
    (b) un receptor, ligando o antfgeno expresado sobre una celula.
  4. 4. Constructo de fusion segun la reivindicacion 3, en el que dicho ligando comprende un agonista o antagonista de receptor.
  5. 5. Constructo de fusion segun la reivindicacion 3(b), en el que dicha celula es una celula hiperproliferativa.
  6. 6. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fraccion de union comprende
    (a) un ligando, receptor o un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, o
    (b) un peptido, polipeptido, protefna, acido nucleico o carbohidrato.
  7. 7. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha fraccion de union es una hormona, un analogo de hormona, un fragmento de una hormona o analogo de hormona que se une a un receptor de hormona, un receptor de hormona o un agente que se une a una hormona o a un receptor de hormona.
  8. 8. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho segundo dominio consiste en o comprende una secuencia de aminoacidos de 1 a 10, 10 a 20, 15 a 20, 20 a 30, 30 a 40, 40 a 50, 60 a 70, 70 a 80, 80 a 90, 90 a 100 o mas aminoacidos.
  9. 9. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho segundo dominio consiste en o comprende una secuencia de aminoacidos expuesta como:
    (a) SYAVALSAQAALARR, o
    (b) QHWSYGLRPG.
  10. 10. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho primer dominio se situa en el extremo NH2 respecto a dicho segundo dominio o dicho segundo dominio se situa en el extremo NH2 respecto a dicho primer dominio.
  11. 11. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho primer dominio o dicho segundo dominio presenta uno o mas D-aminoacidos.
  12. 12. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho primer dominio forma una helice alfa anfipatica.
  13. 13. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichos primer y segundo dominios se unen mediante
    (a) un enlace covalente; o
    (b) una secuencia peptfdica que presenta de 1 a 25 residuos aminoacidos, o una cadena de carbonos lineal.
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  14. 14. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicho constructo de fusion presenta una proporcion IC50/(HA50, actividad hemolftica) inferior a aproximadamente 0,02, 0,01 o 0,005.
  15. 15. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicha fraccion de union comprende hormona I liberadora de gonadotropina, hormona II liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona luteinizante de lamprea III, cadena beta de hormona luteinizante, hormona luteinizante (HL), gonadotropina corionica (GC), subunidad beta de gonadotropina corionica (p- o beta-GC), hormona estimulante de melanocitos, estradiol, dietilestilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona folfculoestimulante (HFE), un glucocorticoide, un estrogeno, testosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, deshidroepiandrosterona, una progesterona o un androgeno.
  16. 16. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho primer dominio consiste en un peptido, KFAKFAKKFAKFAKKFAK, o un peptido, KFAKFAKKFAKFAKK, que presenta uno de los residuos K sustituido por cualquiera de un residuo F o L, uno de los residuos F sustituido por cualquiera de un residuo K, A o L, o uno de los residuos A sustituido por cualquiera de un residuo K, F o L.
  17. 17. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 o 16, en el que dicho primer dominio consiste en un peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAK, o un peptido KFAKFAKKFAKFAKK.
  18. 18. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 16 o 17, en el que dicho segundo dominio comprende hormona liberadora de hormona luteinizante (HLHL), un fragmento de union de la misma o un analogo de HLHL.
  19. 19. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 16 o 17, en el que dicho primer dominio consiste en un peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAK, y en el que dicho segundo dominio comprende o consiste en QHWSYGLRPG.
  20. 20. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, o 16 a 19, en el que dicho constructo de fusion consiste en KFAKFAKKFAKFAKKFAKQHWSYGLRPG.
  21. 21. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho segundo dominio comprende subunidad beta de gonadotropina corionica (I3GC), un fragmento de union de la misma o un analogo de UGC.
  22. 22. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, 16 o 17, en el que dicho primer dominio consiste en un peptido KFAKFAKKFAKFAKKFAK, y en el que dicho segundo dominio comprende o consiste en SYAVALSAQAALARR.
  23. 23. Composicion farmaceutica que comprende el constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
  24. 24. Molecula de acido nucleico que codifica el constructo de fusion segun la reivindicacion 6(b).
  25. 25. Celula que expresa el constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.
  26. 26. Metodo de reduccion o inhibicion selectivas de la proliferacion de una celula que expresa un receptor o antfgeno, que comprende poner en contacto la celula con el constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 en una cantidad suficiente para reducir o inhibir la proliferacion de la celula, en el que la fraccion de union de dicho peptido se une al receptor, ligando o antfgeno expresado por la celula, con la condicion de que se excluyan un metodo para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugfa o terapia y un metodo diagnostico puesto en practica en el cuerpo humano o animal.
  27. 27. Metodo segun la reivindicacion 26, en el que dicha celula es una celula hiperproliferativa.
  28. 28. Metodo segun la reivindicacion 26, en el que dicha celula es una celula neoplasica, tumoral, cancerosa o maligna.
  29. 29. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en el que la celula expresa:
    (a) una hormona o un receptor de hormona;
    (b) una hormona esteroide sexual o gonadal o un receptor de hormona esteroide sexual o gonadal, o
    (c) un receptor que se une a hormona I liberadora de gonadotropina, hormona II liberadora de gonadotropina, hormona liberadora de hormona lutenizante de lamprea III, cadena beta de hormona luteinizante,
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    hormona luteinizante, gonadotropina corionica, subunidad beta de gonadotropina corionica, hormona estimuladora de melanocitos, estradiol, dietilestilbesterol, dopamina, somatostatina, hormona folfculoestimulante (HFE), glucocorticoide, estrogeno, testosterona, androstenediona, dihidrotestosterona, deshidroepiandrosterona, progesterona, androgeno, factor de crecimiento epidermico (FCE), hormona de crecimiento (HC), Her2/neu, vitamina H, folato, transferrina, hormona estimulante del tiroides (HET), endotelina, bombesina, peptido intestinal vasoactivo, lactoferrina, una integrina, factor de crecimiento nervioso, CD-8, CD-33, CD19, CD20, CD40, ROR1, FCI-1, antfgeno carcinoembrionario (ACE), alfa- fetoprotefna (AFP), antfgeno especffico de la prostata (AEP), antfgeno de membrana especffico de la prostata (AMEP), CA 125 (cancer ovarico epitelial residual), receptor de interleucina-2 (IL-2) soluble, RAGE-1, tirosinasa, MAGE-1, MAGE-2, NY-ESO-1, melanA/MART-1, glucoprotefna (gp) 75, gp100, beta- catenina, PRAME, MUM-1, ZFP161, ubicuitina-1, HOX-B6, YB-1, osteonectina, IlF3, acido folico o un derivado del mismo, un miembro de la familia del factor de necrosis tumoral (FNT), FNT-alfa, FNT-beta (linfotoxina, LT), TRAIL, Fas, LIGHT, 41 BB, factor de crecimiento transformante alfa, factor de crecimiento transformante beta, insulina, ceruloplasmina, VIH-tat, un peptido o una protefna que comprende un motivo de secuencia RGD, un monosacarido, disacarido, oligosacarido, acido sialico, galactosa, manosa, fucosa o acido acetilneuramfnico.
  30. 30. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para la utilizacion en el tratamiento de un sujeto que presenta un trastorno hiperproliferativo.
  31. 31. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22 para la utilizacion en el tratamiento de un sujeto que presenta una neoplasia, un tumor, un cancer o una afeccion maligna.
  32. 32. Constructo de fusion para la utilizacion segun la reivindicacion 30 o 31, en el que la neoplasia, el tumor, el cancer o la afeccion maligna es:
    (a) metastasico, no metastasico o benigno; o
    (b) comprende una masa celular solida.
  33. 33. Constructo de fusion para la utilizacion segun la reivindicacion 30 o 31, en el que la neoplasia, el tumor, el cancer o la afeccion maligna comprende un carcinoma, sarcoma, linfoma, leucemia, adenoma, adenocarcinoma, melanoma, glioma, glioblastoma, meningioma, neuroblastoma, retinoblastoma, astrocitoma, oligodendrocitoma, mesotelioma, neoplasia, tumor, cancer o afeccion maligna reticuloendotelial, linfatica/o o hematopoyetica/o.
  34. 34. Constructo de fusion para la utilizacion segun la reivindicacion 33, en el que el sarcoma comprende un linfosarcoma, liposarcoma, osteosarcoma, condrosarcoma, liomiosarcoma, rabdomiosarcoma o fibrosarcoma.
  35. 35. Constructo de fusion para la utilizacion segun la reivindicacion 30 o 31, en el que la neoplasia, el tumor, el cancer o la afeccion maligna comprende una neoplasia, un tumor o un cancer de pulmon, tiroideo, cabeza o cuello, nasofaringe, garganta, nariz o senos paranasales, cerebro, columna vertebral, mama, glandula suprarrenal, glandula pituitaria, linfa, gastrointestinal (boca, esofago, estomago, duodeno, fleon, yeyuno (intestino delgado), colon, recto), aparato genitourinario (utero, ovario, cuello uterino, endometrial, vejiga, testfculo, pene, prostata), rinon, pancreas, hfgado, hueso, medula osea, sangre, musculo o piel.
  36. 36. Constructo de fusion para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35, en el que el sujeto es:
    (a) un mamffero; o
    (b) un ser humano.
  37. 37. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la utilizacion en la reduccion de la fertilidad de un animal.
  38. 38. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la utilizacion en la reduccion o el tratamiento de la endometriosis de un animal.
  39. 39. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la utilizacion en la reduccion o el tratamiento de la hiperplasia prostatica benigna.
  40. 40. Constructo de fusion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para la utilizacion en la reduccion o el tratamiento de un fibroma o polipo.
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